JP2022549721A - 環状一本鎖ポリヌクレオチドを含む核酸送達ベクター - Google Patents

Abstract

本発明は、一本鎖核酸の送達のための送達ベクターに関する。該ベクターは、少なくとも３つのセクションであって、そのうちの２つは、二本鎖を形成するのに十分な相補性を有する、３つのセクション、ならびに送達される一本鎖核酸を含む介在配列からなる、閉鎖環状ポリヌクレオチドである。該二本鎖は、適切な条件下で一本鎖核酸が放出されるように標的ヌクレアーゼの認識配列を含む。【選択図】図２

Description

本発明は、一本鎖核酸、具体的には一本鎖ドナーオリゴヌクレオチドの細胞内送達または放出に関する。ここでは任意のタイプの核酸が企図されているが、一本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が好ましい場合がある。

核酸の最も柔軟な領域は、多くの場合、非塩基対であり、細胞内の重要なプロセスに関与する一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）領域および一本鎖リボ核酸（ｓｓＲＮＡ）領域を含む。

一本鎖核酸分子は、特に細胞に核酸を送達する当業者にとって興味深い。なぜなら、核酸は、トランスフェクトされた細胞内ですぐに利用可能であり、例えば、ｓｓＤＮＡ切片を露出するために適切な酵素による「巻き戻し」を必要としないからである。これらのセクションは、次いでメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などのｓｓＲＮＡへの転写、またはｓｓＤＮＡを認識する他のタンパク質との相互作用に利用可能である。

一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）は、ＤＮＡの複製、組換え、修復、転写、および転位を含む多くの生物学的プロセスにおいて不可欠な中間体である。したがって、とりわけこれらのメカニズムを利用する治療効果を有するために、細胞にｓｓＤＮＡを導入することも望ましい。ｓｓＤＮＡには多くの治療用途もある。真核細胞では、複製、転写、組換えなどの多くの細胞プロセスの結果として、ｓｓＤＮＡが頻繁に露出される。露出されたｓｓＤＮＡは、化学的侵食および核酸分解に対して脆弱であり、したがって、変異を避けるために適切に保護する必要がある。一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）はすぐにｓｓＤＮＡに結合し、関連するプロセスが完了するまで不適切な反応からｓｓＤＮＡを保護する。ただし、そのように保護されていないｓｓＤＮＡは、化学的侵食および核酸分解に対して脆弱である。

一本鎖核酸分子は、特に細胞に核酸を送達する当業者にとって興味深い。なぜなら、核酸は、トランスフェクトされた細胞内ですぐに利用可能であり、関連する遺伝情報（例えば、転写および翻訳またはゲノムへの挿入のため）を露出させるために適切な酵素による「巻き戻し」を必要としないからである。一本鎖核酸分子は、いくつかの用途、特に遺伝子導入、遺伝子編集、およびバイオセンシングに最適な送達ベクターであると考えられている。

代替的に、一本鎖核酸は、その立体構造に関連する機能、すなわち、アプタマーまたは核酸酵素（ＤＮＡザイムおよびＲＮＡザイムを含む）としての機能を有し得る。
さらに、アンチセンス用途では、細胞内の一本鎖核酸の提供が必要となる場合がある。アンチセンス療法は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などの標的配列に相補的な特定の配列を持つオリゴヌクレオチドの使用を含む。

なおもさらに、細胞内の一本鎖核酸の提供は、翻訳目的のために、すなわち、細胞内のタンパク質産生を直接指示するためのｍＲＮＡを提供するために必要とされ得る。したがって、一本鎖核酸は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡであり得る。長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、トランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、リピート関連ｓｉＲＮＡ、エンハンサーＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、核小体ＲＮＡまたは核内低分子ＲＮＡを含む、他のタイプのＲＮＡもまたベクターを利用して送達され得る。

ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡの両方のドナー配列は、効率的な遺伝子編集テンプレートとして機能する。ｓｓＤＮＡドナーテンプレートは、遺伝子編集で使用した場合、修復特異性の点で独自の利点があることが見出されており（Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｌｏｎｇ ｓｓＤＮＡ ｄｏｎｏｒｓ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ－ｂａｓｅｄ ｋｎｏｃｋ－ｉｎ；Ｈａｎ Ｌｉ，Ｋｙｌｅ Ａ．Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｖｅｒｏｎｉｃａ Ｐｅｓｓｉｎｏ，Ｂｏ Ｈｕａｎｇ，Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｓ．Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｍａｎｕｅｌ Ｄ．Ｌｅｏｎｅｔｔｉ ｂｉｏＲｘｉｖ １７８９０５）、したがって、それらの使用が望ましい。

一本鎖核酸を細胞に提供することが望ましいにもかかわらず、このアプローチにはいくつかの欠点があり得る。核酸療法の有効性は、望ましくない分解によって制限される可能性がある。化学修飾は核酸の安定性を改善することが知られているが、修飾のタイプ、位置、および数はすべて違いを生み、修飾の使用は、核酸がタンパク質に結合する能力に影響を与える可能性があるので、場合によっては修飾の数を最小化することが望ましい場合がある。

その性質上、一本鎖核酸は細胞内で急速に分解される。これは、遊離３’および５’末端が、末端を「噛み砕いて」核酸を破壊するヌクレアーゼの作用などによって酵素分解に利用可能であるためである。例えば、哺乳類細胞の主要な３’から５’ＤＮＡエキソヌクレアーゼであるＴｒｅｘ１は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に優先的に作用し、これに強く結合する。ヒトＴＲＥＸ１遺伝子の変異は、免疫の乱れを特徴とするエカルディ・グティエール症候群を引き起こす可能性がある。３’末端のヌクレオチドの修飾は、そのような分解に対する耐性を助けることが示されている。

細胞質ゾルＤＮＡは免疫刺激性であり、特に自然免疫系であることが数年前から認識されている。ＤＮＡは通常、真核細胞の核に存在し、細胞質およびエンドソームを含む非定型の場所にＤＮＡが存在すると、免疫活性化を引き起こすと理解されている。核以外のいずれかの場所にＤＮＡが存在すると、侵入する病原体のＤＮＡゲノムと誤って機能する細胞の両方を検出するＤＮＡ認識システムがトリガーされると考えられている。

多くの病原体のゲノムに豊富に存在する非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡモチーフは、免疫応答を刺激することができることが知られている。ＡＴが豊富なステムループ領域を含む特定のシグネチャーを有する一本鎖ＤＮＡも、免疫応答を活性化することが知られている。

したがって、自然免疫系によって容易に認識されないベクターで線状一本鎖核酸を送達し、次に細胞内で線状一本鎖を放出することによって、一本鎖核酸を「隠れた」方式で送達することが望ましい。

本発明者らは、標的細胞の核または他の区画などの適切な条件下で一本鎖の核酸の放出を可能にする送達ベクターを考案した。一本鎖核酸は、任意の考えられる目的のために送達され得、線状一本鎖核酸は、例えば、遺伝子編集のためのドナーとして、細胞内での翻訳のために、遺伝子発現を改変するために、アプタマーおよび核酸酵素などの実体の提供のため、またはアンチセンス用途のために望ましい。

本発明は、線状一本鎖核酸を細胞、好ましくは標的細胞に送達するための送達ベクターに関する。送達ベクターは、事実上、一本鎖核酸が配置される担体または送達ビヒクルである。細胞内のプロセスは、送達ビヒクルの構造を利用して、一本鎖核酸を放出することができる。一本鎖核酸の放出が特定の条件下または細胞型の下でのみ起こるように、構築物を操作または設計することができる。

線状一本鎖核酸のための送達ベクターの提供は、さもなければ急速に分解される実体の隠れた送達を可能にする。送達は制御または指示され得る。
一態様によれば、本発明は、
環状一本鎖ポリヌクレオチドを含む核酸送達ベクターであって、該ベクターが、
（ａ）該ポリヌクレオチドの第１のセクションおよび第３のセクションから形成される二本鎖であって、該セクションが相補的である配列を含む、二本鎖、
（ｂ）第２のセクションから形成されたループであって、該セクションが第１のセクションおよび第３のセクションを分離する、ループ、を含み、
該二本鎖が、標的ヌクレアーゼの認識配列を含む、核酸送達ベクターを提供する。

変性条件下では、送達ベクターは閉鎖環状ポリヌクレオチドであるため、核酸送達ベクターは一本鎖ポリヌクレオチドとして記載されている。
送達ベクターは、好ましくは、線状一本鎖核酸を送達する。該一本鎖核酸は、送達ベクターの第２のセクション内に存在し、したがって、第２のセクションの配列および線状一本鎖核酸は、実質的に同じである。線状一本鎖核酸は、任意の適切な立体構造をとり、任意の適切な配列であり得る。線状一本鎖核酸は、核酸酵素、アプタマー、ドナーテンプレートまたはアンチセンス核酸、あるいは本明細書で考察される任意の一本鎖核酸のいずれかであり得る。線状一本鎖核酸は、送達ベクターから放出されると、遊離の５’および３’末端を有する。ヌクレアーゼの性質に応じて、一本鎖核酸は、第１のセクションおよび第３のセクションのフラグメントがまだ存在している状態で放出され得る。これはＣａｓ９などのヌクレアーゼの場合であり、図１Ａおよび１Ｂに示されている。これらのフラグメントは、小さくてもよく、好ましくは１５塩基未満の長さであってもよい。

標的ヌクレアーゼは、標的特異的である任意のヌクレアーゼであり得る。送達ベクターの二本鎖は、標的ヌクレアーゼの認識部位を含む。このヌクレアーゼは、この配列を独立して認識する場合もあれば、ガイド配列の助けを必要とする場合もある。認識部位に対するヌクレアーゼの作用は、二本鎖、または少なくともその一本鎖の切断である。該切断は、平滑切断または突出切断であり得る。ヌクレアーゼは内因性または外因性であり得、後者である場合、これは細胞にも供給される。ヌクレアーゼは、細胞に別々に送達することができ、またはヌクレアーゼのｍＲＮＡ配列またはＤＮＡ遺伝子配列を送達ビヒクルに含めることによって送達することができる。後者の送達ベクターが供給された場合、事実上、それは一本鎖核酸を放出するためのそれ自体のヌクレアーゼを提供する。ヌクレアーゼは、好ましくはエンドヌクレアーゼである。ヌクレアーゼは、配列特異的な様式でホスホジエステル結合を適切に切断することができる任意の実体であり得る。

送達ベクターは細胞内で使用することができる。送達ベクターは、ゲノム編集用のドナーテンプレートを提供するために使用され得る。送達ベクターを使用して、アンチセンス核酸を細胞に送達することができる。送達ベクターを使用して、核酸酵素またはアプタマーを細胞に送達することができる。送達ベクターを使用して、任意の一本鎖ＲＮＡまたは核酸ハイブリッドを細胞に送達することができる。

本明細書で使用される場合、細胞は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞、好ましくはヒト体細胞であり得る。
別の態様によれば、本発明は、本明細書に記載の送達ベクターの使用を含む、細胞に線状一本鎖核酸を提供する方法を提供する。

別の態様によれば、本発明は、本明細書に記載の送達ベクターの使用を含む、ゲノム編集のために線状一本鎖ドナーオリゴヌクレオチドまたはテンプレートを細胞に提供する方法を提供する。

本明細書に記載の方法のいずれかを用いて、本発明の送達ベクターを細胞に導入する。送達ベクターは、化学的、物理的、またはウイルスを含む任意の好適な手段によってトランスフェクトすることができる。

本発明の構築物は、一本鎖からなる閉鎖環状ポリヌクレオチドである。該構築物の配列は、少なくとも３つのセクションに配分され得るように設計されているが、これらのセクションの境界は、ヌクレアーゼの切断部位に応じて変化して適応可能であり得る。構築物は、好ましくは、線状一本鎖核酸の送達を目的とした送達ベクターである。第１のセクションと第３のセクションには、適切なまたは生理学的な条件下で、これらのセクションが塩基対を形成し、二重構造またはステム構造を形成することができるように、いくつかの相補性が含まれている。この二本鎖は、ポリヌクレオチド内の自己相補的配列の結果である。第２のセクションは、第１のセクションと第３のセクションとの間に介在し、送達のための線状一本鎖核酸の配列を含む。この第２のセクションは、２つの相補的な配列の間に配置されるため、一般に核酸の「ループ」を形成する。このループは、二本鎖化された第１のセクションおよび第３のセクションで開始および終了する。送達ベクターが意図したように機能するために、ポリヌクレオチド内の他の配列との相補性の領域が意図的に含まれないので、それは一般に一本鎖として表されるであろう。しかしながら、一本鎖核酸は、いくつかの二次構造をとることでよく知られており、したがって、この第２のセクションは、線状核酸のセクションを含む、ヘアピン、ループ、およびシュードノットの１つ以上を含む、任意の可能な立体構造であり得る。本明細書で使用される「ループ」はまた、送達ベクターのニ本鎖部分を形成するように設計されていないポリヌクレオチドのセクションであるとみなされ得るが、これは、それが自己アニーリングを妨げるものではない。相同性アームが存在する場合、これらはさらなる二本鎖への自己アニーリングが可能である可能性がある。ループは事実上、一本鎖を放出するために処理することができる二本鎖セクションによってトラップされた、送達のための「一本鎖」配列である。「ループ」という用語が使用されているが、より大きなループ（例えば、６ヌクレオチド以上）が独自の二次構造を持っている可能性があることは明らかである。

簡単にするために、送達ベクターは、二本鎖セクションおよびループアウトされた一本鎖セクションを含む閉鎖環状ポリヌクレオチドとして図に表されている。当業者は、この構造が完全に単純化されており、ループアウトされたセクションが１つ以上の二次構造を含み得ることを理解するであろう。添付の図１Ａは、二本鎖がステムであり、残りのポリヌクレオチドがステムの一端からループアウトしている送達ベクターを示している。したがって、送達ベクターの「一本鎖」または第２のセクションは、二本鎖によって捕捉または所定の位置に保持され該二本鎖は、第１のセクションおよび第３のセクションによって形成される。送達ベクターの第２のセクションの存在のために二本鎖の間に形成されたループがあるが、このループはそれ自体の二次構造を有し得、したがって検査時に一本鎖ループとして現れないことが理解されよう。ループの配列（したがって第２のセクション）は、好ましくは、ポリヌクレオチドの第１のセクションおよび第３のセクションに対する相補性があったとしてもわずかであるように設計され得る。ポリヌクレオチドは、分子が多くのヌクレオチド単位で構成されているポリマーである。ポリヌクレオチド（送達ベクター）は、任意の好適な長さ、例えば、５０または１００残基／ヌクレオチド／塩基から１０，０００残基／ヌクレオチド／塩基までであり得る。したがって、ポリヌクレオチドは、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００残基／ヌクレオチド／塩基からのものであり得る。ポリヌクレオチドは、最大１０，０００、９，０００、８，０００、７，０００、６，０００、５，０００、４，０００、３，０００、２，０００、または１，０００残基／ヌクレオチド／塩基であり得る。ポリヌクレオチドは、これらの値の間の任意の数の残基／ヌクレオチド／塩基であり得る。

二本鎖セクションは、ヌクレアーゼの認識配列に対応するために、任意の好適な長さであり得る。二本鎖は、少なくとも４塩基対の長さである場合があるが、少なくとも５、６、７、８、９、または１０塩基対の長さである場合がある。二本鎖は実際にはもっと長く、場合によっては最大１００、２５０、５００、７５０、または１０００塩基対の長さになることがある。相補的配列のセクションは、二本鎖形成を支援するために二本鎖のヌクレアーゼ認識配列を取り囲むことができる。

ポリヌクレオチドは、任意のヌクレオチドから構成され得る。これらのヌクレオチドは、天然、修飾、または人工であり得る。ヌクレオチドを重合して、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸、グリコール核酸（ＧＮＡ）、スレオス核酸（ＴＮＡ）、それらのハイブリッドおよび混合物、およびその他の任意の人工（異種）核酸を形成することができる。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはその修飾バージョン（すなわち、骨格、糖残基または核酸塩基に修飾を有する）であることが好ましい場合がある。変更を使用する場合、これらは、必要に応じて結合またはアクティビティが損なわれないようになる。当業者は、標準的なアッセイを使用して、修飾が結合能力または活性に影響を与えるかどうかを決定する方法を知っている。

ポリヌクレオチドは環状または隣接している。したがって、ポリヌクレオチドには遊離の３’または５’末端は存在しない。
ポリヌクレオチドは、細胞に送達することが望まれる一本鎖線状核酸の配列を含む。

ポリヌクレオチドは、事実上、遊離の３’および５’末端を有する線状一本鎖核酸のための送達ビヒクルまたはベクターである。この線状一本鎖核酸は、任意の適切な長さおよび任意の配列であり得る。一本鎖核酸が二次構造を形成する傾向があるため、一本鎖核酸はヌクレオチドの長鎖として描かれているが、自己相補的領域がアニーリングし、ヘアピン、ステム、ループ、シュードノット、十字型などの二次構造となりやすい。

送達のための線状一本鎖核酸は、任意の意図された目的のためであり得る。
したがって、線状一本鎖核酸はアンチセンス分子であり得、これは、例えばＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の場合、タンパク質に翻訳されるために、該ＲＮＡ鎖が通常の方式で機能するのを防ぐために、相補的ＲＮＡ鎖と塩基対を形成する配列で設計される。

線状一本鎖核酸は、ｍＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、トランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、リピート関連ｓｉＲＮＡ、エンハンサーＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、核小体ＲＮＡまたは核内低分子ＲＮＡ、など、細胞内で機能するＲＮＡである可能性がある。

線状一本鎖核酸は、核酸酵素またはアプタマーなどの機能を有する二次構造を形成する配列を含み得る。
線状一本鎖核酸は、ゲノム編集のためのドナーテンプレートである可能性がある。これについては、以下で詳しく説明する。

線状一本鎖核酸は、本明細書で「第２のセクション」と呼ばれるポリヌクレオチドの一部である。核酸が放出されるような条件になるまで、それは送達ベクター内に効果的に抑制される。

ポリヌクレオチドの配列は、本明細書に記載の第１、第２および第３のセクションを含むように設計することができる。配列、またはヌクレオチドの順序は、二本鎖が形成されることを可能にする自己相補的配列が存在するように設計することができる。これらの自己相補的配列は明らかにポリヌクレオチドの同じ鎖上にあり、したがって、塩基対形成は、セクションが５’から３’方向の一方のセクションおよび３’から５’方向のもう一方のセクションと整列する場合にのみ可能である。当業者は、これが一本鎖ポリヌクレオチド分子で自然に起こることを理解するであろう。

相補性は、核酸塩基間の明確な相互作用によって達成される：アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）（ＲＮＡ中のウラシル（Ｕ））、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）。相補的配列などに言及する場合、これは、二本鎖、三本鎖、または他のより高次の構造の形成をもたらす、ある核酸配列と別の核酸配列とのヌクレオチド塩基対形成相互作用を指す。一次相互作用は、通常、ワトソン－クリックおよびフーグスティーン型水素結合によるヌクレオチド塩基特異的、例えば、Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、およびＧ：Ｃである。特定の実施形態では、塩基スタッキングおよび疎水性相互作用もまた、二本鎖の安定性に寄与し得る。セクションが相補的または実質的に相補的なセクションにアニーリングする条件は、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８５）ａｎｄ Ｗｅｔｍｕｒ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：３４９，１９６８に記載されているように、当技術分野でよく知られている。一般に、そのようなアニーリングまたは結合が起こるかどうかは、とりわけ、セクションおよびそれらの相補的セクションの長さ、ｐＨ、温度、一価および二価カチオンの存在、配列中のＧおよびＣヌクレオチドの比率、媒体の粘度、および変性剤の存在によって影響を受ける。このような変数は、塩基対形成またはアニーリングに必要な時間に影響を与える。したがって、好ましい条件は特定の用途に依存する。しかしながら、そのような条件は、過度の実験なしに、当業者によって日常的に決定することができる。典型的には、条件は、相補的または実質的に相補的なセクションがそれらの対応するセクションと選択的に結合またはアニーリングすることを可能にするが、ポリヌクレオチド内の他の配列に有意な程度までハイブリダイズしないように選択される。したがって、セクション１および３に存在する自己相補的配列がアニーリングおよび二本鎖を形成することができるように、適切な条件が選択される。望ましくない二本鎖形成を回避するために、これらのセクションのいずれかにアニーリングすることができる他の配列がポリヌクレオチドに含まれないことが理想的である。

ポリヌクレオチドの第１のセクションおよび第３のセクションの配列は、それらが上で考察された適切な条件下で二本鎖を形成するように設計または作成される。ヒトまたは動物の治療における使用については、生理学的条件下で二本鎖が形成される。当業者は、生理学的状態が何であるかを決定することができるであろう。これらは、一般に、人工的な実験室の条件とは対照的に、その生物または細胞システムの自然界で発生する可能性のある外部または内部環境の条件である。摂氏２０～４０度の温度範囲、１の大気圧、６～８のｐＨ、１～２０ｍＭのグルコース濃度、大気中の酸素濃度、地球の重力、電磁気学は、ほとんどの地球生物の生理学的条件の例である。

この二本鎖の安定性は、その長さ、含まれるミスマッチまたはバルジの数（特に長い二本鎖では少数が許容される場合がある）、および２つの領域の基本組成によって決まる。グアニンとシトシンとのペアリングには３つの水素結合があり、２つしかないアデニン－チミン／ウラシルのペアリングと比較してより安定している。塩基の芳香環のパイ結合を好ましい配向に整列させる塩基スタッキング相互作用も、二本鎖形成を促進する。

二本鎖は、送達ベクターの重要な処理サイトである。二本鎖は「二重鎖」核酸のセクションを提供するが、送達ベクターを形成するポリヌクレオチドの残りの部分の二次構造はより可変的である。図にステムとして示されているこの二本鎖は、ヘアピン（したがって、第１のセクションおよび第３のセクションが隣接している）、ステムループ（第４のセクションが第１のセクションと第３のセクションとの間に介在している）、またはシュードノットまたは十字形などのより複雑な構造一部を含む任意の二次構造である可能性がある。本発明に直接関連するのは、二本鎖が存在することだけである。

二本鎖の配列は、二本鎖が標的ヌクレアーゼ、好ましくはエンドヌクレアーゼの認識配列を含むように設計または作成されている。代替的に、二本鎖は、適切な実体による切断の標的となることができる部位を提供する。したがって、二本鎖は、送達のために線状一本鎖核酸を捕捉または拘束する手段を提供するだけでなく、適切な場合に、該線状一本鎖核酸を放出または送達する手段も提供する。したがって、二本鎖は、標的配列（認識配列と指定されることもある）および線状一本鎖核酸の放出を可能にするように設計された切断部位を含む。

切断部位は、二本鎖の平滑切断、または鎖の突出を伴う二本鎖の突出切断を可能にし得る。切断部位は、鎖の１つだけが切断されることを可能にし得る。好ましくは、両方の鎖が切断される。二本鎖の切断は、使用するヌクレアーゼのタイプによって決まる。当業者には、切断部位の性質に応じて、二本鎖のフラグメントが一本鎖核酸分子の３’および５’末端に存在したままである可能性があることが理解されるであろう。実際、そのようなフラグメントは図１Ａおよび１Ｂに示される（７ａおよび７ｂを参照）。そのようなフラグメントは、細胞内のヌクレアーゼによって分解され得る即時の「緩衝」部分を提供するという点で有利である可能性がある。

標的ヌクレアーゼの認識配列は、標的ヌクレアーゼに応じて、任意の望ましい配列であり得る。
標的ヌクレアーゼは、特定の配列を認識するエンドヌクレアーゼ（ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する酵素）などのヌクレアーゼである。この認識は固有のものであるか（つまり、特定の標的または認識配列それ自体で認識する）、またはこの認識は別のエンティティ（例えばガイド核酸）によってガイドされる。固有のヌクレアーゼまたはガイド型ヌクレアーゼのいずれかの認識配列を、本発明の送達ベクターで使用することができる。

ヌクレアーゼには、特定の配列を認識する固有の能力がある場合がある。該特定の配列は、本明細書では認識配列と称される。いくつかの実施形態において、認識配列は、約４～６ヌクレオチド長のパリンドローム配列である。ほとんどのヌクレアーゼは二本鎖を不均一に切断し、相補的な一本鎖末端を残す。何百ものヌクレアーゼが知られており、各々が異なる認識配列を使用している。エンドヌクレアーゼは、その作用機序に応じて、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型の３つのカテゴリーに分類される。当業者は、特定の切断が起こることを可能にするために二本鎖に含まれる必要がある好適なヌクレアーゼおよび適切な認識配列を同定することができるであろう。

標的ヌクレアーゼ、またはプログラム可能な部位特異的ヌクレアーゼには、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびメガヌクレアーゼ（ＭＮ）が含まれる。これらのヌクレアーゼを特定の配列に標的化することはタンパク質工学を必要とするが、当業者は、特定の配列を認識および切断するヌクレアーゼを生成するためのタンパク質工学の要件を知っているであろう。このようなヌクレアーゼは、遺伝子編集に使用されている。

ヌクレアーゼはまた、認識配列にガイドされ得る。この場合の「ガイド」は、任意の好適な核酸分子またはその誘導体、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはそれらのハイブリッドであり得る。したがって、ヌクレアーゼは、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼまたはＤＮＡガイド型ヌクレアーゼであり得る。技術が進化するにつれて、人工核酸分子でもガイドされ得るヌクレアーゼが発見される可能性がある。したがって、この実施形態では、認識配列は、ガイド核酸、すなわちヌクレアーゼを正しい作用部位に動員するガイド核酸に対して相補的または実質的に相補的である。

代替的に、送達ベクター自体は、配列特異的な様式で二本鎖内で切断することができる１つ以上の自己切断ヌクレアーゼまたは他の実体を提供することができる。
現在、最もよく知られているガイド型ヌクレアーゼはＣａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）である。Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し）適応免疫システムと関連するＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ酵素である。自然界で使用されているように、Ｃａｓ９は、侵入したバクテリオファージまたは細菌プラスミドなどからの外来ＤＮＡを調査し切断する。Ｃａｓ９は、ガイドＲＮＡの２０塩基対スペーサー領域に相補的な部位をチェックすることによってこの調査を実行する。ＤＮＡ基質がガイドＲＮＡに相補的である場合、Ｃａｓ９は侵入したＤＮＡを切断する。Ｃａｓ９は、ガイドＲＮＡに相補的なほぼすべての配列を切断することができるため、近年大きな関心を集めている。Ｃａｓ９の標的特異性はガイドＲＮＡ：ＤＮＡの相補性に由来するため、適切なガイドを設計するだけで、新しいＤＮＡを標的とするＣａｓ９の操作は簡単である。Ｃａｓ９のプログラム可能な配列特異性は、多くの生物のゲノム編集および遺伝子発現制御に利用されている。ネイティブＣａｓ９には、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の２つの異なるＲＮＡが結合するガイドＲＮＡが必要である。ただし、Ｃａｓ９ターゲティングは、キメラシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡガイドの操作によって簡素化されている。Ｃａｓ９タンパク質は、ガイドＲＮＡがない場合でも不活性のままである。操作されたＣＲＩＳＰＲシステムでは、ガイド配列は、１つのテトラループおよび２つもしくは３つのステムループで構成されたＴ字型を形成する可能性のあるＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡの一本鎖で構成される。ガイド配列は、一般に約２０塩基の長さである標的ＤＮＡ配列に相補的な５’末端を持つように操作されている。Ｃａｓ９の場合、ガイド配列は１７～２４塩基の長さの範囲で機能することが示されている。

ガイドＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡは相補的な標的ＤＮＡに結合する。標的ＤＮＡ配列に直接隣接しているのはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）で、これはＣａｓ９ヌクレアーゼが標的とするＤＮＡ配列の直後にある２～６塩基対のＤＮＡ配列である。一般に、Ｃａｓ９は、ＰＡＭ配列が続かない場合、標的ＤＮＡ配列に正常に結合または切断しないと考えられている。正規のＰＡＭは配列５’－ＮＧＧ－３’であり、「Ｎ」は任意の核酸塩基およびそれに続く２つのグアニン（「Ｇ」）核酸塩基であり、これはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐＣａｓ９）のＣａｓ９ヌクレアーゼと関連しているが、異なるＰＡＭは他の細菌からのＣａｓ９オルソログと関連付けられている。５’－ＮＧＡ－３’は、ヒト細胞にとって非常に効率的な非標準的なＰＡＭである。異なるＰＡＭを認識するようにＣａｓ９を設計する試みがなされてきたため、操作されたＣａｓ９を関連するＰＡＭに一致させるだけである。

したがって、Ｃａｓ９または同様のヌクレアーゼによる標的か用の二本鎖を設計する場合、実行可能な認識および切断部位を提供するために、標的配列およびＰＡＭ配列（標的がＤＮＡである場合）の包含を考慮する必要がある。

Ｃａｓ９は変更および変異誘発の対象であり、操作されたＣａｓ９バリアントが利用可能である。バリアントの定義は以下に含まれている。
他のガイド型ヌクレアーゼ、特にＣＲＩＳＰＲシステムで使用され得るヌクレアーゼを特定するための作業が進行中である。

いくつかはすでに特定されている。これらには以下が含まれる：
Ｃａｓ１２ａ：ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａとしても知られる）からのクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート：Ｃｐｆ１は、クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型ヌクレアーゼである。Ｃｐｆ１遺伝子はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と関連付けられており、ガイドＲＮＡを使用してウイルスＤＮＡを見つけて切断するヌクレアーゼをコードしている。Ｃｐｆ１はＣａｓ９よりも小さくて単純なヌクレアーゼであり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの制限のいくつかを克服している。この酵素は、ＴリッチなＰＡＭを認識し、５’オーバーハングで切断された突出した二本鎖ＤＮＡを生成する可能性がある。

Ｃａｓ１３ａ（細菌Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉから）は、ＤＮＡではなくＲＮＡを標的とするＲＮＡガイド酵素システムであるが、ＰＡＭを必要としないようであり、代わりに、関連する可能性があるのはプロトスペーサー隣接部位（ＰＦＳ）である。

したがって、ポリヌクレオチドで形成された二本鎖は、標的ヌクレアーゼの認識配列を含む。この認識配列は、本質的に（すなわちそれ自体で）配列を認識することができるヌクレアーゼの認識配列と一致するように、またはガイド型ヌクレアーゼのガイド配列と一致するように設計することができる。後者の場合、ガイド配列も熟練したユーザーによって設計され得るので、これは、配列が一般的でないか、例えば編集中であるまたは細胞のゲノムなどの目的の細胞に見出されないことを確実にするために配列を選択するための最大の柔軟性を与える。ガイド型ヌクレアーゼを使用する場合、標的ヌクレアーゼの認識配列には、必要に応じてＰＡＭまたはＰＦＳを含める必要がある場合もある。

本発明の送達ベクターは、細胞、特に真核細胞、特にヒト細胞を含む哺乳動物細胞におけるゲノム編集または遺伝子編集の方法において有用性を有し得る。
本発明の送達ベクターを使用して、一本鎖核酸を細胞、特に真核細胞、特にヒト細胞を含む哺乳動物細胞に送達することができる。

細胞のゲノムまたは遺伝子編集を行うことが望ましい場合、当業者は、細胞に提供されなければならないいくつかの要素があることを理解している。１つ目は、ＤＮＡの所定の位置に二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入するための配列特異的ヌクレアーゼである。次に、ゲノムまたは遺伝子編集は、主に細胞にＤＳＢを修復するための外因性ドナー核酸を提供することにより、その破壊を修復する際に細胞の機構を利用する。したがって、切断部位を導入するための機構が、それを修復するために必要なドナー配列とともに導入される。

相同指向性修復（ＨＤＲ）は、二本鎖切断（ＤＳＢ）の正確な修復に必要な相同性を提供するためにテンプレートが使用される相同組換えのプロセスである。これは、ゲノムまたは遺伝子編集に利用される自然なメカニズムの１つである。

現在、外因性修復（またはドナー）テンプレートは、ほとんどの場合、合成の一本鎖ＤＮＡドナーオリゴまたはＤＮＡドナープラスミドの形態で細胞に送達することができる。しかしながら、前に考察されたように、一本鎖核酸を細胞に送達することには問題がある。一本鎖核酸が、ゲノムまたは遺伝子の編集を必要としない他の細胞にオフターゲットで送達される可能性があるという問題もある。

本発明の送達ベクターは、一本鎖線状ドナーテンプレートの使用に比べて重要な利点を有する。送達ベクターは、同じヌクレアーゼを使用してゲノムおよび送達ベクターの両方を標的とするように設計することができ、したがって、一本鎖テンプレートがゲノムまたは遺伝子編集のための正しい機構が含まれている細胞内にのみ放出されることを補償する２段階システムを提供する。したがって、一本鎖核酸ドナーテンプレートを送達するために送達ベクターを使用すべき場合、同じ技術を利用して、使用可能なドナーテンプレートを放出し、編集に必要なゲノムにＤＳＢを導入することができ、したがって標的細胞にすでに送達されたシステム上にピギーバックする。

ゲノム編集は、ゲノムのどの部分でもあり得る。「ゲノム」という用語は、一般に、生物のＤＮＡの全配列を指す。ゲノムには遺伝子が含まれている。遺伝子は、機能を持つ分子をコードするＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチドの配列である。ゲノムには、遺伝子活性を促進または阻害するＤＮＡの領域、およびタンパク質の産生および機能に影響を与えないように見える領域も含まれる。必要に応じて、これらのいずれか１つ以上を編集することができる。遺伝子の直接編集は多くの疾患および状態に治療上の影響を与える可能性があるため、遺伝子編集が主な用途である可能性がある。

送達ベクターをゲノム編集に使用する場合、ポリヌクレオチドの第２のセクションは、核酸ドナーテンプレートとしての使用に好適な配列である。ＲＮＡまたはＤＮＡテンプレートが可能であるが、現在はＤＮＡがより好ましい。したがって、ポリヌクレオチドは好ましくはＤＮＡである。一本鎖ドナーテンプレートが遺伝子編集を行うためにＨＤＲの使用を必要とする場合、通常、ドナーテンプレート内に相同性アームを含める。ＨＤＲは、切断部位に隣接する領域と十分な相同性を持つドナーテンプレートの存在に依存し、これらは相同性アームである。

ゲノム編集を成功させるために考慮すべき重要なパラメーターには、相同性アームの長さおよび相同性アームの対称性が含まれる。現在の技術を使用すると、３０、４０、および５０ヌクレオチドの相同性アーム長が最適な効率を持ち、５０または６０ヌクレオチドなどのより長い長さはより低い効率を有することが一般に認められている。相同性アームが対称的（つまり同じ長さ）であるかどうかは、ドナーテンプレートの性質によって異なる。修飾されていない一本鎖ドナーテンプレートの場合、非対称相同性アームの方が効率が高くなるが、ホスホロチオエート修飾が行われると、対称性相同性アームの方が効果的であるように見える。ゲノム編集の当業者は、それらが動作している特定の状況のためのこれらのパラメーターの最適化を知っている。

したがって、ポリヌクレオチドの第２のセクションは、挿入配列に隣接する相同性アームとして指定される配列を含み得る。挿入配列は、単一ヌクレオチド置換のための単一ヌクレオチドであり得る。挿入配列は、ゲノムの遺伝子全体または非コード領域であり得、数百ヌクレオチドの長さであり得る。ドナーテンプレートは送達ベクターを介して送達されるため、一本鎖ドナーテンプレートで以前に達成されたよりも多くのヌクレオチドを挿入配列に含めることが可能である可能性がある。したがって、挿入配列は、０ヌクレオチドの長さ～１０００ヌクレオチドの長さであり得る。挿入配列が０の場合、これを使用して、ターゲットゲノム内の単一ヌクレオチドまたはより大きな配列をノックアウトすることができる。

ＨＤＲに一本鎖ドナーテンプレートを使用すると、他のタイプのドナーテンプレートを使用するよりも効率的であることが示されている。このようなテンプレートを細胞に送達して、内因性ゲノム標的領域にＤＮＡの短い配列（ＳＮＰ、アミノ酸置換、エピトープタグなど）を挿入または変更することができる。合成ドナーテンプレートを使用する利点は、ドナーテンプレートを生成するために複製が不要であり、ヌクレアーゼに対する耐性の向上など、異なる用途の合成中に変更を追加することができることである。ドナーテンプレートは、実際に挿入用のヌクレオチドを含まない場合がある。この実施形態では、遺伝子またはヌクレオチドは、代わりにゲノムから除去される。挿入配列は、ＳＮＰを修正するための単一ヌクレオチドから遺伝子またはゲノム領域の全配列までの範囲の任意の必要な配列であり得る。挿入配列は完全に合成であるため、必要に応じて、配列を変更して機能を変更することができる。したがって、挿入配列は、ゲノム編集を実行するために必要な任意の所望の配列であり得る。ゲノム編集の当業者は、標的ヌクレアーゼが潜在的な標的細胞に対して内因性ではないことを理解し、したがって、これらは、関連するガイド配列とともに、任意の適切な方式で（遺伝的または直接）細胞に提供しなければならない。本発明の送達ベクターは、同時にまたは別々に細胞に供給され得る。任意の好適なトランスフェクション技術を使用することができる。トランスフェクションのための細胞は、生物への再移植のために単離され得るか、またはエクスビボであり得るか、またはトランスフェクションのための細胞は、インビボであり得る。ヌクレアーゼおよび任意のガイド配列は、同じベクターまたは異なるベクター上に提供され得る。ベクターは、プラスミドを含む任意の適切な核酸であり得る。可能なトランスフェクション経路には、リポフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、またはウイルスの使用が含まれる。採用される経路は、トランスフェクション用に選択された細胞、ヌクレアーゼの発現に使用されるベクターの性質、およびガイド配列によって異なる。

本発明の送達ベクターは、アンチセンス一本鎖核酸を細胞に提供するのに有用であり得る。
本発明の送達ベクターは、細胞に核酸酵素またはアプタマーを提供するのに有用であり得る。

送達ベクターがゲノム編集に使用されていない場合、細胞に提供される必要があるすべてが本発明の送達ベクターであるように、二本鎖配列は内因性ヌクレアーゼの認識配列で設計され得る。他の実施形態では、ゲノム編集に関して上で考察されたように、ヌクレアーゼが細胞に提供される。

本発明の送達ベクターは、細胞株、一次細胞、幹細胞などを含む任意の細胞に提供され得る。体細胞が好ましい。細胞は任意の生物に由来する可能性がある。送達ベクターは、エレクトロポレーション、リポフェクション、ヌクレオフェクションまたはマイクロインジェクションを含む任意の好適な手段によってトランスフェクトされ得る。ウイルス遺伝子送達法も考慮され得る。細胞は、エクスビボ、インビトロ、またはインビボでトランスフェクトされ得る。

送達ベクター、したがってポリヌクレオチドは、好ましくは合成分子であり、それ自体、無細胞様式で製造される。テンプレート核酸の酵素的増幅、ａｂ－ｉｎｉｔｉｏ合成、重複テンプレートの使用、ローリングサークル増幅などを含む、特定の配列の核酸の長い一本鎖を合成するための多くの技術が知られている。二本鎖ポリヌクレオチドの鎖ストリッピングは、二本鎖をもたらすＰＣＲなどの技術に必要な場合がある。

ポリヌクレオチドの長い一本鎖が所望により得られたら、一本鎖リガーゼを使用して末端を密封することができる。これにより、一本鎖環状ポリヌクレオチドが得られる。好適なリガーゼ酵素の例には、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，ＵＳからのＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）が含まれる。化学的環化反応もまた使用され得る。後者の技術では、核酸骨格の単一のトリアゾール、アミド、またはホスホルアミデート類似体を含む環状オリゴヌクレオチドが使用される。したがって、線状前駆体は、例えば、５’アジドおよび３’－アルキン、および化学的に含まれる１，４トリアゾール結合を含むことができ、環状ポリヌクレオチドをもたらす。

一本鎖ポリヌクレオチドを単離する際、または環状化中の自由末端のアニーリングを補助する際のいずれかに、送達ベクターの調製中に固体支持体を使用することが必要な場合がある。ビオチン－ストレプトアビジンなどの結合親和性ペアは、ビーズなどの販売されている支持体で利用することができる。例えば、ポリヌクレオチドはビオチン化することができ、ストレプトアビジンはビーズ上に存在する。

当業者は、所望の配列でポリヌクレオチドを合成するために使用することができる多くの合成技術があることを理解するであろう。

変異ポリペプチド：
バリアントポリペプチドは、天然タンパク質に対して少なくとも４０％の同一性を有する配列を含む（またはそれからなる）。バリアント配列は、少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、例えば少なくとも４０、６０、１００、２００、３００、４００以上の連続したアミノ酸、あるいはバリアントの配列全体にわたってさえ、少なくとも５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％、または９９％が天然タンパク質の特定の領域に対して相同であり得る。代替的に、バリアント配列は、全長天然タンパク質に対して少なくとも５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同であり得る。通常、変異配列は、少なくとも２、５、１０、２０、４０、５０、または６０の変異（その各々が置換、挿入、または欠失である可能性がある）によって、天然タンパク質の関連領域とは異なる。本発明のプロセスで使用される変異配列は、天然タンパク質と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。

ネイティブタンパク質のバリアントには、短縮化も含まれる。バリアントが上記のように標的配列を切断することができる限り、任意の短縮化を使用することができる。切断は、通常、触媒活性に必須ではない、および／または折りたたまれたタンパク質の立体構造、特に活性部位の折り畳みに影響を及ぼさない配列を除去するために行われる。ヌクレアーゼポリペプチドの溶解性を改善するために、短縮化を選択することもできる。適切な短縮化は、Ｎ末端またはＣ末端からの様々な長さの配列を体系的に切り捨てることによって日常的に識別することができる。

天然タンパク質のバリアントはさらに、１つ以上、例えば、２、３、４、５から１０、１０～２０、２０～４０以上の、天然タンパク質の特定の領域に関するアミノ酸の挿入、置換または欠失を有するバリアントを含む。欠失および挿入は、好ましくは触媒ドメインの外側で行われる。挿入は、通常、例えば組換え発現の目的で、天然タンパク質に由来する配列のＮ末端またはＣ末端で行われる。置換はまた、典型的には、触媒活性に必須ではない、および／または折りたたまれたタンパク質の立体構造に影響を及ぼさない領域で行われる。そのような置換は、酵素の溶解性または他の特性を改善するために行うことができる。一般的には好ましくないが、置換はまた、活性部位または第２の領域、すなわち、活性部位の１つ以上のアミノ酸の位置または配向に影響を与えるかまたは接触する残基で行われ得る。これらの置換は、触媒特性を改善するために行うことができる。

置換は、好ましくは、１つ以上の保存的変化を導入し、これは、アミノ酸を、類似の化学構造、類似の化学的性質、または類似の側鎖体積の他のアミノ酸で置き換える。導入されたアミノ酸は、それらが置換するアミノ酸と同様の極性、親水性、疎水性、塩基性、酸性、中性、または電荷を有し得る。代替的に、保存的変化は、既存の芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入する可能性がある。

バリアントが、天然タンパク質に匹敵するかまたは同じ効率で上記のように核酸を切断することができるか、または実際に速度、効率、精度または送達に関して改善されることが特に好ましい。

本発明の例示的な送達ベクターの描写である。示されているのは、二本鎖を形成する第１のセクションおよび第３のセクション（１および３）であり、ヌクレアーゼの認識配列が示されている（４）。本明細書で遺伝子編集のためのドナーテンプレートを表す第２のセクション（２）は、相同性アーム（５ａおよび５ｂ）および標的配列（６）を含むことができる。 図１Ａと同じ送達ベクターを表しているが、ヌクレアーゼは標的部位で切断され、一本鎖核酸が放出される（１０）。ここで、第１のセクションおよび第３のセクション（７ａおよび７ｂ）のフラグメントが一本鎖核酸に残っていることが分かる。これらは、ヌクレアーゼの性質および二本鎖の設計方式に応じて、存在する場合と存在しない場合がある。 ガイド配列（この場合はｇＲＮＡ－１１）を使用した、Ｃａｓ９（１２）などのヌクレアーゼの二本鎖（４）への動員を表している。示されているのは、二本鎖の各鎖に１つずつ、２つの切断部位（１３ａおよび１３ｂ）である。 図１Ａとしてラベル付けされた、本発明の送達ベクターから放出された一本鎖核酸を使用する遺伝子編集の簡略化された表現である。この場合の遺伝子編集はＨＤＲを介して行われる。相同性アーム（５ａおよび５ｂ）は、ＤＳＢがすでに導入されているゲノム（２０）に含めるためにインサート（６）を整列させる上で重要な役割を果たす。配列が挿入されたゲノムも示されている（２１）。 実施例１に従って調製されたゲルの写真を示す。３つのセクションに分かれている。ゲル電気泳動は、可視化と精製のためにサイズ（塩基対の長さなど）で核酸を分離するための標準的な実験室手順である。電気泳動は、電場を使用して、負に帯電した核酸をアガロースゲルマトリックスを通して正極に向かって移動させる。短いＤＮＡフラグメントは、長いＤＮＡフラグメントよりも速くゲル内を移動する。したがって、ＤＮＡラダー（既知の長さのＤＮＡフラグメントのコレクション）と一緒にアガロースゲル上で実行することにより、ＤＮＡフラグメントのおおよその長さを決定することができる。ただし、環状核酸はゲル内で異様に動作する。セクション１では、本発明の送達ベクターの調製がゲルに適用される。送達ベクターは矢印で強調表示される。調製物中に存在する他の核酸は、原材料または副産物である。セクション２にはマーカーラダー（Ｍ）が含まれており、エキソヌクレアーゼで処理した場合のセクション１で適用した調製物の適用を示している。フリーエンドがないため、送達ベクターは影響を受けないが、他のフラグメントは分解される。ここでの送達ベクターは、ガイドＲＮＡがＣａｓ９を動員する二本鎖を含むように設計された。セクション３には、マーカーラダー（Ｍ）が含まれている。３とマークされたレーンは、ガイドＲＮＡとＣａｓ９が導入された後の調製に関するものである。ここでの矢印は、Ｃａｓ９の作用により一本鎖核酸が放出され、環状構造が開いていることを示している。 実施例２で作成および使用されたベクターのオリゴヌクレオチドを示す送達ベクターマップである。ＧＦＰ ｇＲＮＡおよびＰＡＭ、ＧＦＰからＢＦＰへの一本鎖オリゴヌクレオチドおよび様々な制限部位の配列が示されている。オリゴヌクレオチドは、２５４塩基対の長さである。ループバックおよびアニーリングを可能にするために、ｇＲＮＡおよびＰＡＭ配列がセンスおよびアンチセンス配列で存在することが分かる。ヘアピン配列も示されている。 実施例２から生成されたデータである。Ｃａｓ９を発現するＨＥＫ２９３Ｔ－ＥＧＦＰ細胞はＥＧＦＰを失っている。トランスフェクション後の指定された時点で高（４５０ｎｇ）または低（４５ｎｇ）ＢＦＰ送達ベクター（「ｍｂＤＮＡ」）のいずれかでトランスフェクトされた細胞のフローサイトメトリーによって測定された最大カウントイベントのパーセンテージとしてＧＦＰシグナルを示すヒストグラム。点線はＧＦＰ陽性シグナルの閾値を示している。各試料のＧＦＰ陰性イベントのパーセンテージが引用されている。これらは、ＧＦＰ発現対最大数のパーセンテージのプロットである。３セットのデータが表示される。最初の列は高ＢＦＰ送達ベクター（ｍｂＤＮＡ）のデータ、中央の列は低ＢＦＰ送達ベクター（ｍｂＤＮＡ）のデータ、最後の列はＣａｓ９なしのデータである。トランスフェクション後２、３、５、６および１０日間の結果が示されている。 例２から生成されたデータである。送達ベクター（ｍｂＤＮＡ）は、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＥＧＦＰ細胞でＣａｓ９を介したＥＧＦＰからＢＦＰへの変換を引き起こす。溶解した細胞の平均青色蛍光は、トランスフェクション後の示された時点で測定され、生の強度（非正規化）またはｍｂＤＮＡなしの対照（正規化）と比較してプロットされる。２つの生物学的複製のデータが示されている。トランスフェクション後２、３、５、および６日間の結果が示されている）。

ここで、本発明は、本発明の範囲を限定するものではない以下の実施例で実証される。

実施例１：
Ｃａｓ９による加工性のデモンストレーション
本発明の送達ベクターの例は、ガイドＲＮＡがＣａｓ９を動員する二本鎖を含むように設計された。ベクターはｓｓＤＮＡとして社内で生成され、図１Ａに示す立体構造にシールするためにライゲーションされた。試料（試料１）が採取された。次に、ベクターを１０ユニットのＴ５エキソヌクレアーゼ（ＮＥＢ）とともに３７℃で３時間インキュベートした。別の試料（試料２）が採取された。

ガイドＲＮＡは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔからの精製されたＣａｓ９タンパク質とともにベクターの二本鎖領域を標的とするように設計された。ｓｇＲＮＡをアニーリングした：１９．５μｌのＨ_２Ｏ、３μｌの１０倍のＣａｓ９反応バッファー、７．５μｌの１００μＭのｓｇＲＮＡを組み合わせて７５℃まで加熱し、室温まで放冷した。次に、リボ核タンパク質をＧｅｎＳｃｒｉｐｔの指示に従って調製した。０．３μｌのアニーリングしたｓｇＲＮＡ、０．５μｌのＣａｓ９タンパク質、４μｌの１０倍のＣａｓ９反応バッファー、２７．２μｌのＨ_２Ｏを組み合わせ、３７℃で１０分間インキュベートした。

次に、９００ｎｇのベクターＤＮＡを添加し、Ｈ_２Ｏで容量を４０μｌにし、反応液を３７℃で３時間インキュベートした。最終試料が採取された（試料３）。
試料１、２、および３は、ＳａｆｅＶｉｅｗで染色された０．８％アガロースＴＢＥゲル（図４：セクション１：試料１、セクション２：試料２およびセクション３：試料３）にロードされた。マーカーであるＧｅｎｅＲｕｌｅｒ１ｋｂ＋ＤＮＡラダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）もロードし、ゲルを流してバンドを分離した。

試料１は、閉じたベクター（図４、セクション１の矢印で示されている、および副産物（閉じていないベクター、構築反応のより小さな生成物）と一致するバンドを示した。試料２は、閉じたベクターに対して強いバンドを示し、エキソヌクレアーゼに対する耐性を示している。一方、開いたベクターと副産物のバンドは、ゲルの底でスミアに減少した。試料３は、Ｃａｓ９によってベクターのバンドが正常に切断されていることを示している。開いた線状部分は、カットされていない円形に拘束された場合と比較して、ゲル上でより速く、さらに遠くまで移動することができる（図４、セクション３に矢印で示される）。

配列：
送達ベクターでは、ヌクレアーゼの標的部位および二本鎖のＰＡＭ配列は次のとおりである。
ＧＴＣＡＣＣＡＡＴＣＣＴＧＴＣＣＣＴＡＧＴＧＧ（配列番号１）
ｓｇＲＮＡガイド配列は次のとおりである。
ｇｕｃａｃｃａａｕｃｃｕｇｕｃｃｃｕａｇＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号２）

実施例２：
核酸ベクターの調製
配列：
送達ベクターでは、ヌクレアーゼの標的部位および二本鎖のＰＡＭ配列は次のとおりである。
ＧＣＴＧＡＡＧＣＡＣＴＧＣＡＣＧＣＣＧＴＡＧＧ（配列番号３）
送達ベクターでは、ＨＤＲテンプレートの配列（小文字で下線付きの編集されたベースを含む）は次のとおりである。

ゲノム上のＥＧＦＰの配列（小文字で編集され、下線が引かれる塩基を含む）は次のとおりである。

ｓｇＲＮＡガイド配列は次のとおりである。
ｇｃｕｇａａｇｃａｃｕｇｃａｃｇｃｃｇｕＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号６）
配列番号７は、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡプラスミド（ここには示されていない）の配列である。

ＥＧＦＰ（ＥＧＦＰはＡｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａに由来する緑色蛍光タンパク質である）を標的とし、それをＢＦＰ（青色蛍光タンパク質）（「ＢＦＰ ｍｂＤＮＡ」）に編集するように設計されたステムを備える図５に示す送達ベクター、および標的配列を欠いた対照ベクターオリゴヌクレオチドを、Ｂｉｏｌｅｇｉｏ（Ｎｉｊｍｅｇｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から注文された。オリゴヌクレオチドをループバックおよびアニーリングさせて、次の反応で「投げ縄」のような構造を形成させた：
・８μｌオリゴ（１００μＭ）（７．５μｇ／μｌ）
・９μｌ ｄｄＨ_２Ｏ
９８℃で１０分間インキュベートした後、毎秒０．０６℃の速度で１６℃まで冷却した。

アニーリングしたオリゴヌクレオチドをライゲーションして、ベクターバックボーンのニックをシールした：
・１７μｌのアニーリングベクター
・２μｌ Ｎバッファー（１０倍）
－３００ｍＭ ＴｒｉｓｐＨ８．９
－３００ｍＭ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４
－５ｍＭ ＭｇＳＯ_４
・２μｌ ＡＴＰ（１０ｍＭ）（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＵＳ）
・１μｌ のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（４００，０００Ｕ／ｍｌ）（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＵＳ）
１６℃で７時間インキュベートした。

ライゲーションされていない一本鎖ＤＮＡを除去するために、反応液をＴ５エキソヌクレアーゼでの消化に供した：
・２０μｌライゲーションベクター
・２μｌ Ｎバッファー（１０倍－上記のとおり）
・２μｌのＴ５エキソヌクレアーゼ（１０，０００Ｕ／ｍｌ）（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＵＳ）
・１６μｌ ｄｄＨ_２Ｏ
３７℃で１２時間インキュベートした。
アニーリング、ライゲーション、Ｔ５消化したベクターを、ＰＣＲ精製キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｅｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してカラム精製した。

Ｃａｓ９遺伝子編集能力の実証
ＥＧＦＰのシングルコピーを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞株（ＨＥＫ２９３Ｔ－ＥＧＦＰ）を取得した（Ａｓｔｒｉｄ Ｇｌａｓｅｒからの親切な贈り物）。Ｃａｓ９を介した遺伝子編集によるＥＧＦＰの青色蛍光バリアント（ＢＦＰ）への変換は、一本鎖オリゴＤＮＡヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）をテンプレートとして使用するこの細胞株で以前に実証されている（Ｇｌａｓｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，５（７），ｅ３３４，参照により本明細書に組み込まれる）。

ＤＮＡを６ウェルプレートに播種したＨＥＫ２９３ＴまたはＨＥＫ２９３Ｔ－ＥＧＦＰ細胞に送達し、ＰＥＩｐｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（登録商標））を使用した化学トランスフェクションにより、１．５ｍｌの完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋２ｍＭグルタミン）で製造元の指示に従って増殖させた。総量２００μｌの無血清ＤＭＥＭ（４．５ｇ／ｌグルコース）中のトランスフェクション当たり１．１３μｇの全ＤＮＡおよび３．３９μｌのＰＥＩｐｒｏを使用した。反応当たり１００ｎｇのＴＩＶＡ－ｐＵＣＥＦ１α－Ｓｃａｒｌｅｔ－ＩプラスミドＤＮＡを使用して、トランスフェクション効率をモニターした。Ｃａｓ９反応では、２５０ｎｇのＣａｓ９＋ｓｇＲＮＡプラスミドが追加された。４５０ｎｇ（高）または４５ｎｇ（低）のＢＦＰまたは対照ｍｂＤＮＡのいずれかが使用された（図に示されているように）。空のプラスミドを使用して、反応を１．１３μｇのＤＮＡにした。すべてのトランスフェクションは２回行った。

細胞は、トリプシン処理によって回収される前に、示された期間成長させられた。ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｈｉｇｈ Ｗｙｃｏｍｂｅ，ＵＫ）で、トランスフェクション効率（赤色蛍光％）およびＧＦＰ強度の経時的損失をモニターした。細胞をＲＩＰＡバッファーで溶解し、タンパク質の内容物を放出した。試料全体の溶解細胞（タンパク質）の相対的な青色蛍光強度を、Ｓｐａｒｋ（登録商標）マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、３６０ｎｍで励起および４６５ｎｍで発光して測定した。

結果：
Ｃａｓ９＋ｓｇＲＮＡプラスミドおよびＢＦＰ ｍｂＤＮＡ（送達ベクター）でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ－ＥＧＦＰ細胞は、トランスフェクション後６日間でＥＧＦＰの段階的な減少を示した。６日目に、細胞の３５％～５０％がＥＧＦＰの発現を停止し（図６）、我々のシステムにおけるＣａｓ９の遺伝子ターゲティング能力を示している。大量（４５０ｎｇ）のＢＦＰ送達ベクターでトランスフェクトされた細胞は、少量（４５ｎｇ）のＢＦＰ送達ベクターを含む細胞と比較して遅い速度でＥＧＦＰを失った。この遺伝子編集率の低下は、高ｍｂＤＮＡトランスフェクションの効率がわずかに低下したことで説明され得る（低／ベクターなしの約８０％と比較して、高ＢＦＰ／対照ベクターを用いる細胞の約７０％は、トランスフェクションの４８時間後にＳｃａｒｌｅｔ－Ｉ発現を示した）。トランスフェクション後１０日目のデータで示されるように、６日目以降はＥＧＦＰのさらなる喪失は見られなかった（Ｃａｓ９を発現するＨＥＫ２９３Ｔ－ＥＧＦＰ細胞はＥＧＦＰを失っている）。トランスフェクション後の指定された時点で高（４５０ｎｇ）または低（４５ｎｇ）ＢＦＰ送達ベクターのいずれかでトランスフェクトされた細胞でフローサイトメトリーによって測定された最大カウントイベントのパーセンテージとしてＧＦＰシグナルを示すヒストグラム。点線はＧＦＰ陽性シグナルの閾値を示している。各試料のＧＦＰ陰性イベントの割合が引用されており（図６）、６日目以降はＣａｓ９活性が検出されないことを示唆している。対照的に、Ｃａｓ９を発現していない細胞は、ＥＧＦＰの低下を示さず、ＥＧＦＰの喪失がＣａｓ９媒介性であることを確認している。

使用されているように、「ｍｂＤＮＡ」はベクターであり、これがＢＦＰの送達を含むか、対照（ＢＦＰなし）であるかを示す。
成功した相同指向性組換え（ＨＤＲ）遺伝子編集イベントは、ＢＦＰ送達ベクターおよび対照ベクターの導入後２～６日目に細胞からの溶解物中の青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）強度を測定することによって特定された。トランスフェクションの２日後すぐに、対照ベクターではなくＢＦＰを含む細胞は、ベクターなしの対照と比較して、ＢＦＰシグナルの１．３倍の増加を示した（図７）。５日目に、ＢＦＰベクターが高い細胞からのＢＦＰ強度は、対照と比較して２倍高く、６日目までに、ＢＦＰベクターが低い細胞および高い細胞の両方で同じ相対レベルのＢＦＰが検出された（図７）。重要なことに、Ｃａｓ９を含まない（Ｃａｓ９なし）細胞（したがってより機能的なＥＧＦＰを発現する）はＣａｓ９をトランスフェクトした細胞と比較してＢＦＰシグナルが低いため、ＢＦＰシグナルの増加はＥＧＦＰシグナルからの干渉によって説明することができない（図７）。

要するに、我々のデータは、本発明によるＢＦＰ送達ベクターがインビボでＣａｓ９によって切断可能であり、Ｃａｓ９媒介遺伝子編集においてＨＤＲテンプレートとして使用され得る生存可能な導入遺伝子を放出することができることを実証している。

Claims (11)

1. 環状一本鎖ポリヌクレオチドを含む核酸送達ベクターであって、前記ベクターが、
   （ａ）前記ポリヌクレオチドの第１のセクションおよび第３のセクションから形成された二本鎖であって、前記セクションが相補的である配列を含む、二本鎖、
   （ｂ）第２のセクションから形成されたループであって、前記セクションが前記第１のセクションおよび前記第３のセクションを分離する、ループ、を含み、
   前記二本鎖が、標的ヌクレアーゼの認識配列を含む、核酸送達ベクター。
2. 前記ベクターが線状一本鎖核酸を送達し、前記一本鎖核酸が前記第２のセクション内に存在する、請求項１に記載の核酸送達ベクター。
3. 前記線状一本鎖核酸が、核酸酵素、アプタマー、ドナーテンプレート、ｍＲＮＡ、機能的ＲＮＡ、またはアンチセンス核酸のうちのいずれか１つ以上であり得る、請求項２に記載の核酸送達ベクター。
4. 前記線状一本鎖核酸が、前記送達ベクターから放出されると、遊離の５’および３’末端を有する、請求項２または３に記載の核酸送達ベクター。
5. 前記ベクターが、閉鎖環状ポリヌクレオチドであり、任意選択で閉鎖ＤＮＡまたは閉鎖ＲＮＡである、請求項１に記載の核酸送達ベクター。
6. 前記ヌクレアーゼが、ガイド型ヌクレアーゼであり、任意選択で遺伝子編集と関連するヌクレアーゼ、好ましくはＣａｓ９である、先行請求項のいずれか１項に記載の核酸送達ベクター。
7. 前記ヌクレアーゼが、ガイドなしで前記認識配列に結合する、請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸送達ベクター。
8. 前記ベクターが、細胞における使用のためのものである、先行請求項のいずれか１項に記載の核酸送達ベクター。
9. 請求項１～８のいずれか１項に記載の送達ベクターの前記使用を含む、線状一本鎖核酸を細胞に提供する方法。
10. ゲノム編集のために細胞に線状一本鎖ドナーテンプレートを提供する方法であって、請求項１～８のいずれか１項に記載の送達ベクターの前記使用を含み、好ましくは、前記線状一本鎖核酸がドナーテンプレートである、方法。
11. 前記ヌクレアーゼが、ガイド型ヌクレアーゼであり、任意選択でＣａｓ９またはそのバリアントである、請求項１０に記載の方法。

Images