JP7125727B1 - 核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法 - Google Patents
核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7125727B1 JP7125727B1 JP2021145726A JP2021145726A JP7125727B1 JP 7125727 B1 JP7125727 B1 JP 7125727B1 JP 2021145726 A JP2021145726 A JP 2021145726A JP 2021145726 A JP2021145726 A JP 2021145726A JP 7125727 B1 JP7125727 B1 JP 7125727B1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- acid sequence
- modifying
- region
- rna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 title claims abstract description 106
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 103
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 103
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 101
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 101
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 85
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 85
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 58
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 18
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 18
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 18
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 18
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 16
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 5
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 claims description 3
- 102100035102 E3 ubiquitin-protein ligase MYCBP2 Human genes 0.000 abstract description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 36
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 230000006870 function Effects 0.000 description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 13
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 12
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 10
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 10
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 9
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 9
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 9
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 7
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 7
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 6
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 6
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 101710159080 Aconitate hydratase A Proteins 0.000 description 4
- 101710159078 Aconitate hydratase B Proteins 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 4
- 101710105008 RNA-binding protein Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 4
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 4
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 3
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 3
- 102220605874 Cytosolic arginine sensor for mTORC1 subunit 2_D10A_mutation Human genes 0.000 description 3
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 3
- 101000615488 Homo sapiens Methyl-CpG-binding domain protein 2 Proteins 0.000 description 3
- 102100021299 Methyl-CpG-binding domain protein 2 Human genes 0.000 description 3
- 101100084449 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PRP4 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 3
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 3
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 102100033210 CUGBP Elav-like family member 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100026846 Cytidine deaminase Human genes 0.000 description 2
- 108010031325 Cytidine deaminase Proteins 0.000 description 2
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000029812 HNH nuclease Human genes 0.000 description 2
- 108060003760 HNH nuclease Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 102000008157 Histone Demethylases Human genes 0.000 description 2
- 108010074870 Histone Demethylases Proteins 0.000 description 2
- 102000003893 Histone acetyltransferases Human genes 0.000 description 2
- 108090000246 Histone acetyltransferases Proteins 0.000 description 2
- 102100023408 KH domain-containing, RNA-binding, signal transduction-associated protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 108010073062 Transcription Activator-Like Effectors Proteins 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 238000003491 array Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 108010079923 lambda Spi-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000003007 single stranded DNA break Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSXFATOLZGZLSK-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethoxy-2-(4-methyl-1,4-diazepan-1-yl)-N-[1-(phenylmethyl)-4-piperidinyl]-4-quinazolinamine Chemical compound C=12C=C(OC)C(OC)=CC2=NC(N2CCN(C)CCC2)=NC=1NC(CC1)CCN1CC1=CC=CC=C1 OSXFATOLZGZLSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010039206 Biotinidase Proteins 0.000 description 1
- 102100026044 Biotinidase Human genes 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 101150069031 CSN2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100029949 Caprin-1 Human genes 0.000 description 1
- 230000035131 DNA demethylation Effects 0.000 description 1
- 102100033672 Deleted in azoospermia-like Human genes 0.000 description 1
- 102000001477 Deubiquitinating Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010093668 Deubiquitinating Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102100029791 Double-stranded RNA-specific adenosine deaminase Human genes 0.000 description 1
- 101710093299 Double-stranded RNA-specific adenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000011787 Histone Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108010036115 Histone Methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000003964 Histone deacetylase Human genes 0.000 description 1
- 108090000353 Histone deacetylase Proteins 0.000 description 1
- 102000043851 Histone deacetylase domains Human genes 0.000 description 1
- 108700038236 Histone deacetylase domains Proteins 0.000 description 1
- 108010016918 Histone-Lysine N-Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000000581 Histone-lysine N-methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 101000944448 Homo sapiens CUGBP Elav-like family member 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000793727 Homo sapiens Caprin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000871280 Homo sapiens Deleted in azoospermia-like Proteins 0.000 description 1
- 101001082138 Homo sapiens Pumilio homolog 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 101710094958 KH domain-containing, RNA-binding, signal transduction-associated protein 1 Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 108091007494 Nucleic acid- binding domains Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 238000012157 PAR-CLIP Methods 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010043400 Protamine Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102100027352 Pumilio homolog 2 Human genes 0.000 description 1
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 1
- 238000010357 RNA editing Methods 0.000 description 1
- 230000026279 RNA modification Effects 0.000 description 1
- 108700020471 RNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102100027654 Transcription factor PU.1 Human genes 0.000 description 1
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 description 1
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108020004417 Untranslated RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000039634 Untranslated RNA Human genes 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008970 bacterial immunity Effects 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 101150055601 cops2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical class NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012938 design process Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 244000000003 plant pathogen Species 0.000 description 1
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 108010008929 proto-oncogene protein Spi-1 Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【解決手段】RNA2および融合タンパク質3を含む核酸配列改変用組成物1であって、RNAは、核酸配列4の標的部位の5’側または3’側の配列にハイブリダイズし得るハイブリダイズ領域21と、融合タンパク質をガイドするガイド領域22と、を含み、ガイド領域は、融合タンパク質と複合体を形成する認識領域23を含み、融合タンパク質は、RNAの認識領域を認識し、認識領域と複合体を形成する結合ドメイン31と(但し、結合ドメインがCasタンパク質群のRNA認識領域を含むことを除く。)、核酸配列の標的部位を改変する改変ドメイン32と、を含む核酸配列改変用組成物。
【選択図】図3
Description
RNAは、
核酸配列の標的部位の5’側または3’側の配列にハイブリダイズし得るハイブリダイズ領域と、
融合タンパク質をガイドするガイド領域と、
を含み、
ガイド領域は、融合タンパク質と複合体を形成する認識領域を含み、
融合タンパク質は、
RNAの認識領域を認識し、認識領域と複合体を形成する結合ドメインと(但し、結合ドメインがCasタンパク質群のRNA認識領域を含むことを除く。)、
核酸配列の標的部位を改変する改変ドメインと、
を含む
核酸配列改変用組成物。
(2)ガイド領域が、認識領域を2つ含む
上記(1)に記載の核酸配列改変用組成物。
(3)ハイブリダイズ領域の一端部に接続した第1相補領域を含み、
第1相補領域がガイド領域の一端部側と相補対を形成することで、ハイブリダイズ領域およびガイド領域が間接的に接続する
上記(1)または(2)に記載の核酸配列改変用組成物。
(4)ガイド領域が、ステムループを含む
上記(1)~(3)の何れか一つに記載の核酸配列改変用組成物。
(5)結合ドメインが、NovaのRNA結合領域を含み、
改変ドメインが、ゲノムDNAを切断するFokIの開裂領域を含む
上記(1)~(4)の何れか一つに記載の核酸配列改変用組成物。
(6)核酸配列が、ゲノムDNAである
上記(1)~(5)の何れか一つに記載の核酸配列改変用組成物。
(7)上記(1)~(6)の何れか一つに記載のRNAを転写するための鋳型となる核酸、および、
上記(1)~(6)の何れか一つに記載の融合タンパク質を翻訳するための鋳型となる核酸、
を含む
核酸配列改変用組成物。
(8)上記(1)~(6)の何れか一つに記載の核酸配列改変用組成物を形成するための、RNA。
(9)上記(7)に記載の核酸配列改変用組成物を形成するための、RNAを転写するための鋳型となる核酸。
(10)上記(1)~(6)の何れか一つに記載の核酸配列改変用組成物を形成するための、融合タンパク質。
(11)上記(7)に記載の核酸配列改変用組成物を形成するための、融合タンパク質を翻訳するための鋳型となる核酸。
(12)核酸配列の標的部位を改変する方法であって、該方法は、
上記(1)~(7)の何れか一項に記載の核酸配列改変用組成物を細胞に導入する導入工程と、
改変ドメインが核酸配列の標的部位を改変する改変工程と、
を含む
核酸配列の標的部位を改変する方法。
(13)導入工程の前に、核酸配列の標的部位の5’側または3’側の配列にハイブリダイズし得るハイブリダイズ領域を特定するハイブリダイズ領域特定工程を含む
上記(12)に記載の核酸配列の標的部位を改変する方法。
(14)一つの標的部位を改変するために必要なハイブリダイズ領域が一つである、
上記(12)または(13)に記載の核酸配列の標的部位を改変する方法。
(15)ガイド領域が、認識領域を2つ含む
上記(14)に記載の核酸配列の標的部位を改変する方法。
(16)導入工程の前に、核酸配列の改変に必要な数の融合タンパク質と複合体を形成できるように、認識領域の数およびRNA配列を少なくとも設計するガイド領域設計工程を含む、
上記(15)に記載の核酸配列の標的部位を改変する方法。
図3および図4を参照して、実施形態に係る改変用組成物1について説明する。図3Aおよび図3Bは、改変用組成物1の概略を示す概略図である。図4Aおよび図4Bは、改変用組成物1の変形例の概略を示す概略図である。なお、以下の説明において、図3Aおよび図3Bに共通する説明は、単に「図3」と記載することがある。
(1)二本鎖DNAの糖とリン酸の間のホスホジエステル結合を加水分解してヌクレオチドとするヌクレアーゼ(nuclease)
(2)二本鎖DNAの片鎖にニックを導入するニッカーゼ(nickase)
(3)DNAのメチル基(例えば、5-メチルシトシン)を脱メチル化するDNA脱メチル化酵素
(4)DNAの塩基に含まれるNH2をc=Oに変化する脱アミノ化酵素
(5)上記(3)および(4)以外のDNAが有する基を置換する酵素
(6)転写活性化因子
(7)転写抑制因子
(1-1)FokI(特許第5266210号公報;T. Sakuma et al.,“Repeating pattern of non-RVD variations in DNA-binding modules enhances TALEN activity”,Scientific Reports 3,Article number:3379 (2013))
(1-2)FirmCutヌクレアーゼ(国際公開第2020/045281号公報)
(2-1)RuvC ヌクレアーゼ・ドメイン D10A点変異(M. Jinek et al.,“A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity”, Science (2012),Vol.337,Issue 6096,pp.816-821;和研薬株式会社から入手も可能である。)
本酵素は、Cas9の10番目のアミノ酸をアスパラギン酸(D)からアラニン(A)に変えたものである。Cas9に2つあるヌクレアーゼドメインのうちRuvC様ドメインのヌクレアーゼ活性が消失するため、D10A変異体はニッカ―ゼとして作用し、二本鎖DNA切断ではなく、一本鎖DNA切断(ニック)を生じる。ダブルニッキング法では、二本鎖DNAの標的配列に対して各々の鎖まで案内する2つのsgRNAとCas9ニッカ―ゼを作用させる。
(2-2)HNH ヌクレアーゼ・ドメイン H840A点変異(上記(2-1)に記載の文献参照。和研薬株式会社から入手も可能である。)
上記(2-1)に記載の酵素は、DNAのtarget Strandのみを切断するが、(2-2)に記載の酵素はnon-target strandを切断する。
(3-1)メチル化シトシンヒドロキシラーゼTet1(S. Morita et al.,“Targeted DNA demethylation in vivo using dCas9-peptide repeat and scFv-TET1 catalytic domain fusions”, Nature Biotechnology 34,p:1060-1065 (2016))
(4-1)アデノシンデアミナーゼ(C. Li et al.,“Expanded base editing in rice and wheat using a Cas9-adenosine deaminase fusion”,Genome Biology 19,Article number:59(2018))
(4-2)シチジンデアミナーゼ(A. Komor et al.,“Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage”,nature 533,p:420-424(2016))
ヒストンアセチル基転移酵素、ヒストン脱アセチル化酵素、ヒストンリジンメチル基転移酵素、ヒストンリジン脱メチル化酵素等。
(6-1)Vp64(L. Lowder et al.,“Robust Transcriptional Activation in Plants Using Multiplexed CRISPR-Act2.0 and mTALE-Act Systems”,Molecular Plant,Volume 11,Issue 2,2018,p:245-256)
(6-2)Vp16(上記(6-1)に記載の文献参照。)
(7―1)KRAB(M. Boettcher et al.,“Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR”,Molecular Cell,2015 21;58(4):575-85)
(7-2)SRDX(L. Lowder et al.,“A CRISPR/Cas9 Toolbox for Multiplexed Plant Genome Editing and Transcriptional Regulation”,Plant Physiology,2015,169(2):971-85)
RuvC ヌクレアーゼ・ドメイン D10A点変異、HNH ヌクレアーゼ・ドメイン H840A点変異
<2つの改変ドメイン32>
FokI、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、Vp16
<4つの改変ドメイン32>
VP64
(1)Nova:5’-UCAY-3’(K. Jensen et al.,“The tetranucleotide UCAY directs the specific recognition of RNA by the Nova K-homology 3 domain”,PNAS,2000,97(11),5740-5745。以下、本論文を「非特許文献1」と記載することがある。)
なお、上記5’-UCAY-3’は、ステムループのループ部分に形成されている。
(2)上記非特許文献1のFIG.6に記載の組合せ(以下の表1参照)。
(4)RNG105(N. Shiinaet et al.,“A Novel RNA-Binding Protein in Neuronal RNA Granules:Regulatory Machinery for Local Translation”,The Journal of Neuroscience,April 27,2005・25(17):4420-4434)
(1)RNA2は、ゲノムDNA4またはRNA4とハイブリダイズするハイブリダイズ領域21と、ガイド領域22とを含む。そして、ガイド領域22は、融合タンパク質3と複合体を形成する認識領域23を1つ以上含む。したがって、図3Aおよび図3Bに示すように、改変ドメイン32が改変機能を有するのが1量体または2量体(若しくはそれ以上)を問わず、ハイブリダイズ領域21は一つでよい。そのため、ハイブリダイズ領域21の設計が容易になる。
(2)特許文献3~6に記載のCRISPR/Cas9は、ゲノムDNA4の標的部位41がPAM配列近傍に制限される。また、Cas13の場合も、RNA4の標的部位41がPFS配列の近傍に制限される。一方、第1の実施形態に係る改変用組成物1は、ゲノムDNA4またはRNA4の配列の制限を受けずに標的部位41を決めることができる。
(3)ガイド領域22に含まれる認識領域23の数を任意に設計できる。したがって、融合タンパク質3の種類に応じてガイド領域22を設計できることから、ガイド領域22の設計の自由度が向上する。
(4)融合タンパク質3は、天然タンパク質(および一部を改変したタンパク質)と異なり、結合ドメイン31として機能する領域および改変ドメイン32として機能する領域を選択して融合することで形成できる。したがって、従来の天然タンパク質(および一部を改変したタンパク質)と比較して、融合タンパク質3のサイズを小さくできる。更に、融合タンパク質3の設計の自由度が向上する。
次に、図4Aおよび図4Bを参照して、実施形態に係る改変用組成物1の変形例1を説明する。図3に示す例では、RNA2のハイブリダイズ領域21およびガイド領域22は、直接接続している。一方、図4Aおよび図4Bに示す変形例では、RNA2は、ハイブリダイズ領域21の一端部に接続した第1相補領域24を含んでいる。そして、第1相補領域24がガイド領域22の一端部側と相補対を形成することで、ハイブリダイズ領域21およびガイド領域22が間接的に接続する。
次に、実施形態に係る改変用組成物1の変形例2を説明する。上記実施形態に係る改変用組成物1および変形例1では、RNA2および融合タンパク質3で改変用組成物1を形成している。代替的に、変形例2として、RNA2を転写するための鋳型となる核酸(以下、「RNA2用鋳型」と記載することがある。)、および、融合タンパク質3を翻訳するための鋳型となる核酸(以下、「融合タンパク質3用鋳型」と記載することがある。)、を用いて改変用組成物1を形成してもよい。RNA2用鋳型および融合タンパク質3用鋳型は、DNAまたはRNAを用いることができる。RNA2用鋳型は、RNA2を転写するための配列を少なくとも含んでいればよい。また、融合タンパク質3用鋳型は、融合タンパク質3を翻訳するための配列を少なくとも含んでいればよい。RNA2用鋳型および融合タンパク質3用鋳型は、必要に応じて、プロモーターや翻訳促進用の非翻訳領域を含んでいてもよい。
次に、実施形態に係る改変用組成物1の変形例3を説明する。上記実施形態に係る改変用組成物1および変形例1では、RNA2および融合タンパク質3を組み合わせて改変用組成物1を形成している。また、変形例2では、RNA2用鋳型および融合タンパク質3用鋳型を組み合わせて改変用組成物1を形成している。代替的に、変形例3では、改変用組成物1を形成する組み合わせ要素の一方のみを提供し、別々に提供された要素を使用の際に組み合すことで、改変用組成物1を形成してもよい。
改変方法は、上記改変用組成物の実施形態および変形例で説明した改変用組成物1を細胞に導入する導入工程と、改変ドメイン32が核酸配列4の標的部位41を改変する改変工程と、を含む。
以下の手順により、改変用組成物1を作製した。
(1)融合タンパク質(FokI-Nova)の作製
融合タンパク質3として、FokI-Novaを作製した。FokI-Novaのアミノ酸配列をSEQ.ID.1(配列番号1)に示す。なお、以下の表3に示すSEQ.ID.1の内、下線部分(1行目右から7列目の“Q”~5行目左から11列目の“F”)がFokIの開裂領域(改変ドメイン32)を示し、二重下線部分(5行目左から28列目の“K”~6行目右から8列目の“G”)がNOVAのRNA結合領域(結合ドメイン31)を示し、太文字下線部分(6行目右から3列目の“P”~7行目左から4列目の“V”)がNLSを示す。その他は、リンカー配列等である。
配列番号1に示すFokI-Novaを発現するように設計した発現ベクターを発現用大腸菌へクローニングした。10ng/μLの濃度に調整した発現ベクター1μLと発現用大腸菌50μLを混合し、氷上で20分静置した。その後、42℃ 1分間処理にてヒートショックを与えた後氷上に戻した。形質転換した大腸菌全量とSOC培地250μLを混合し、37℃で1時間培養した。このうち、100μLをLBプレート(抗生物質入り)に撒いて37℃で一晩培養した。
プレートから単一のコロニーをピックアップし、37℃、overnight培養した。培養液と50%グリセロール溶液を等量混合した後、-80℃で保存した。
<試薬>
・発現用大腸菌:BL21(DE3)pLysS
・抗生物質:カナマイシン
大腸菌グリセロールストックから植菌し、10mlのLB培地(抗生物質入り)にて37℃、overnight培養した。100mLのLB培地(抗生物質入り)に、前培養液を10ml添加し、37℃にて培養した。OD=0.6付近であることを確認し、IPTGを終濃度1mMになるよう添加し、25℃でOver night培養した。菌体に5mlのタンパク質抽出試薬を加えて懸濁した。タンパク質抽出試薬、10μlのLysonase Bioprocessing Reagent(Novagen)を添加し、室温で5分攪拌した。遠心分離にて上清を可溶性画分として回収した。カラムにレジン1mlを入れ、沈降させた。保存液を流した後、平衡バッファーを10bed volumes入れ、レジンを平衡化した。
可溶性画分をカラムに加え、His-Tag融合タンパク質を結合させた。8bed volumesの平衡バッファーにてカラムを洗浄した。7bed volumesの平衡バッファー(10mM Imidazoleを含む)にてカラムを洗浄した。3bed volumesの溶出バッファーにてHis-Tag融合タンパク質を溶出した。
精製後のタンパク質を、EzApply(ATTO)と等量混合し、95℃ 5min熱処理を行い電気泳動サンプルを調整した。5-20% ポリアクリルアミドゲルにサンプルをアプライし、20mA 70min泳動した。FokI抗体を使用し、設計したサイズのFokI-Nova融合タンパク質を合成できたことを確認した。
<試薬>
・タンパク質抽出試薬:BugBuster Protein Extraction Reagent(Novagen)
・精製レジン:TALON Metal Affinity Resin(タカラバイオ)
・平衡バッファー:50mM sodium phosphate,300mM sodium chloride;pH7.4
・溶出バッファー:50mM sodium phosphate,300mM sodium chloride,150mM imidazole;pH7.4
・泳動バッファー:25mM Tris pH8.3,192mM Glycine,0.1% SDS
実施例で作製したRNA2の配列をSEQ.ID.2に示す。RNA2は、以下の手順により作製した。
(a)ハイブリダイズ領域21
pEGFP-N1(SEQ.ID.3)を鋳型に、
・Fwプライマー(eGFP Xba5P:5’-GCTCTAGAAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTC-3’:SEQ.ID.4)
・Rvプライマー(eGFP Spe3P:5’-TGACTAGTGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCT-3’:SEQ.ID.5)
を用い、290bpを増幅し、両端に制限酵素サイトを付加した。pCR2.1ベクターに、XbaIとSpeIで常法によりligationした。
なお、SEQ.ID.4および5のアンダーライン部分は、図5に示すGFPをコードするDNA配列4と相補対を形成する配列(ハイブリダイズ領域21の両端部)である。なお、図5では、紙面の都合上、配列番号の「ID.」を省略して記載する。
(b)ガイド領域22
UCAY5P(5’-TCGGATCCGCAGTCTCATCATCATTTTCATTTTGTTCGTTAGCACATTGGGCAGTCTCAT-3’:SEQ.ID.6)、および、UCAY3P(5’-GAAGATCTCAAAATGAAAATGATGATGAGACTGCCCAATGTGCTAACGAACAAAATGAAA-3’:SEQ.ID.7)をアニールし、伸長反応を行った。BamHIサイトにアニールした鋳型をBamHIとBglIIで制限酵素処理し、上記(a)の下流側に常法によりligationを行った。
(c)RNA2の合成
pCR2.1ベクターをHindIIIで制限酵素処理をおこない、in vitro Transcription T7 KitでRNAを合成した。
なお、RNA2は、認識領域23として非特許文献1のFIG.6のα2-glyR(GCAGUCUCAUCAUCAUUUUCAUUUUG:SEQ.ID.8)を、リンカーを介して2つ含む。
実施例1で作製した改変用組成物1を用い、以下の手順でGFPをコードするゲノムDNA4(SEQ.ID.9)の切断実験を行った。図5は実施例2の概略を示す図である。
(1)GFPのPCR増幅
SEQ.ID.3を鋳型にして、以下のプライマーを用い常法によりSEQ.ID.9に示すGFPのPCR産物を得た。
・Fwプライマー(5’-GTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3’:SEQ.ID.10)
・Rvプライマー(5’-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’:SEQ.ID.11)
M:100bp Marker
1:GFPのPCR産物のみ
2:GFPのPCR産物+融合タンパク質
3:GFPのPCR産物+融合タンパク質+RNA
(1)バンド抽出物の増幅
1:FwプライマーにSEQ.ID.10、RvプライマーにSEQ.ID.12を用いて、バンド抽出物を増幅した。増幅産物の長さは221bpである。
2:FwプライマーにSEQ.ID.13、RvプライマーにSEQ.ID.11を用いて、バンド抽出物を増幅した。増幅産物の長さは251bpである。
(2)SEQ.ID.3を鋳型にしたGFP断片の増幅
3:FwプライマーにSEQ.ID.10、RvプライマーにSEQ.ID.12を用いて、GFP断片をコードする配列を増幅した。増幅産物の長さは221bpである。
4:FwプライマーにSEQ.ID.13、RvプライマーにSEQ.ID.11を用いて、GFP断片をコードする配列を増幅した。増幅産物の長さは251bpである。
なお、SEQ.ID.12および13の配列は以下の通りである。
・SEQ.ID.12:5’-TAGCGGCTGAAGCACTGCAC-3’
・SEQ.ID.13:5’-ACAAGCAGAAGAACGGCATCAAG-3’
Claims (16)
- RNAおよび融合タンパク質を含む核酸配列改変用組成物であって、
RNAは、
核酸配列の標的部位の5’側または3’側の配列にハイブリダイズし得るハイブリダイズ領域と、
融合タンパク質をガイドするガイド領域と、
を含み、
ガイド領域は、融合タンパク質と複合体を形成する認識領域を含み、
融合タンパク質は、
前記RNAの認識領域を認識し、認識領域と複合体を形成する結合ドメインと(但し、結合ドメインがCasタンパク質群のRNA認識領域を含むことを除く。)、
核酸配列の標的部位を改変する改変ドメインと、
結合ドメインおよび改変ドメインを連結するリンカー配列と、
を含む
核酸配列改変用組成物。 - ガイド領域が、認識領域を2つ含む
請求項1に記載の核酸配列改変用組成物。 - ハイブリダイズ領域の一端部に接続した第1相補領域を含み、
第1相補領域がガイド領域の一端部側と相補対を形成することで、ハイブリダイズ領域およびガイド領域が間接的に接続する
請求項1または2に記載の核酸配列改変用組成物。 - ガイド領域が、ステムループを含む
請求項1~3の何れか一項に記載の核酸配列改変用組成物。 - 結合ドメインが、NovaのRNA結合領域を含み、
改変ドメインが、ゲノムDNAを切断するFokIの開裂領域を含む
請求項1~4の何れか一項に記載の核酸配列改変用組成物。 - 核酸配列が、ゲノムDNAである
請求項1~5の何れか一項に記載の核酸配列改変用組成物。 - 請求項1~6の何れか一項に記載のRNAを転写するための鋳型となる核酸、および、
請求項1~6の何れか一項に記載の融合タンパク質を翻訳するための鋳型となる核酸、
を含む
核酸配列改変用組成物。 - 請求項1~6の何れか一項に記載の核酸配列改変用組成物を形成するための、RNA。
- 請求項7に記載の核酸配列改変用組成物を形成するための、RNAを転写するための鋳型となる核酸。
- 請求項1~6の何れか一項に記載の核酸配列改変用組成物を形成するための、融合タンパク質。
- 請求項7に記載の核酸配列改変用組成物を形成するための、融合タンパク質を翻訳するための鋳型となる核酸。
- 核酸配列の標的部位を改変する方法であって、該方法は、
請求項1~7の何れか一項に記載の核酸配列改変用組成物を細胞に導入する導入工程と、
改変ドメインが核酸配列の標的部位を改変する改変工程と、
を含む
核酸配列の標的部位を改変する方法。 - 導入工程の前に、核酸配列の標的部位の5’側または3’側の配列にハイブリダイズし得るハイブリダイズ領域を特定するハイブリダイズ領域特定工程を含む
請求項12に記載の核酸配列の標的部位を改変する方法。 - 一つの標的部位を改変するために必要なハイブリダイズ領域が一つである、
請求項12または13に記載の核酸配列の標的部位を改変する方法。 - ガイド領域が、認識領域を2つ含む
請求項14に記載の核酸配列の標的部位を改変する方法。 - 導入工程の前に、核酸配列の改変に必要な数の融合タンパク質と複合体を形成できるように、認識領域の数およびRNA配列を少なくとも設計するガイド領域設計工程を含む、
請求項15に記載の核酸配列の標的部位を改変する方法。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2021145726A JP7125727B1 (ja) | 2021-09-07 | 2021-09-07 | 核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法 |
JP2022123946A JP2023038910A (ja) | 2021-09-07 | 2022-08-03 | 核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法 |
PCT/JP2022/033375 WO2023038020A1 (ja) | 2021-09-07 | 2022-09-06 | 核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法 |
CN202280059262.8A CN117916370A (zh) | 2021-09-07 | 2022-09-06 | 核酸序列改变用组合物及改变核酸序列的靶部位的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2021145726A JP7125727B1 (ja) | 2021-09-07 | 2021-09-07 | 核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022123946A Division JP2023038910A (ja) | 2021-09-07 | 2022-08-03 | 核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP7125727B1 true JP7125727B1 (ja) | 2022-08-25 |
JP2023038817A JP2023038817A (ja) | 2023-03-17 |
Family
ID=83005040
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021145726A Active JP7125727B1 (ja) | 2021-09-07 | 2021-09-07 | 核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法 |
JP2022123946A Pending JP2023038910A (ja) | 2021-09-07 | 2022-08-03 | 核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022123946A Pending JP2023038910A (ja) | 2021-09-07 | 2022-08-03 | 核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
JP (2) | JP7125727B1 (ja) |
CN (1) | CN117916370A (ja) |
WO (1) | WO2023038020A1 (ja) |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013058404A1 (ja) | 2011-10-21 | 2013-04-25 | 国立大学法人九州大学 | Pprモチーフを利用したrna結合性蛋白質の設計方法及びその利用 |
WO2018030488A1 (ja) | 2016-08-10 | 2018-02-15 | 和光純薬工業株式会社 | Pprモチーフを利用したdna結合性タンパク質およびその利用 |
WO2019217942A1 (en) | 2018-05-11 | 2019-11-14 | Beam Therapeutics Inc. | Methods of substituting pathogenic amino acids using programmable base editor systems |
JP2020510038A (ja) | 2017-03-09 | 2020-04-02 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | がんワクチン |
WO2020241877A1 (ja) | 2019-05-29 | 2020-12-03 | エディットフォース株式会社 | 凝集の少ないpprタンパク質及びその利用 |
JP2021522783A (ja) | 2018-05-01 | 2021-09-02 | ウェイク・フォレスト・ユニバーシティ・ヘルス・サイエンシーズWake Forest University Health Sciences | 真核生物の遺伝子編集のためのレンチウイルスベースのベクターならびに関連システムおよび方法 |
WO2022097663A1 (ja) | 2020-11-06 | 2022-05-12 | エディットフォース株式会社 | FokIヌクレアーゼドメインの変異体 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2003251286B2 (en) | 2002-01-23 | 2007-08-16 | The University Of Utah Research Foundation | Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases |
US20080131962A1 (en) | 2006-05-25 | 2008-06-05 | Sangamo Biosciences, Inc. | Engineered cleavage half-domains |
WO2011072246A2 (en) | 2009-12-10 | 2011-06-16 | Regents Of The University Of Minnesota | Tal effector-mediated dna modification |
EP3494997B1 (en) | 2012-07-25 | 2019-09-18 | The Broad Institute, Inc. | Inducible dna binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof |
US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
SG10201912327SA (en) | 2012-12-12 | 2020-02-27 | Broad Inst Inc | Engineering and Optimization of Improved Systems, Methods and Enzyme Compositions for Sequence Manipulation |
MX2015007550A (es) | 2012-12-12 | 2017-02-02 | Broad Inst Inc | Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas. |
KR20210062639A (ko) | 2018-08-27 | 2021-05-31 | 고쿠리츠다이가쿠호진 히로시마다이가쿠 | 신규 뉴클레아제 도메인 및 그 이용 |
-
2021
- 2021-09-07 JP JP2021145726A patent/JP7125727B1/ja active Active
-
2022
- 2022-08-03 JP JP2022123946A patent/JP2023038910A/ja active Pending
- 2022-09-06 WO PCT/JP2022/033375 patent/WO2023038020A1/ja active Application Filing
- 2022-09-06 CN CN202280059262.8A patent/CN117916370A/zh active Pending
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013058404A1 (ja) | 2011-10-21 | 2013-04-25 | 国立大学法人九州大学 | Pprモチーフを利用したrna結合性蛋白質の設計方法及びその利用 |
WO2018030488A1 (ja) | 2016-08-10 | 2018-02-15 | 和光純薬工業株式会社 | Pprモチーフを利用したdna結合性タンパク質およびその利用 |
JP2020510038A (ja) | 2017-03-09 | 2020-04-02 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | がんワクチン |
JP2021522783A (ja) | 2018-05-01 | 2021-09-02 | ウェイク・フォレスト・ユニバーシティ・ヘルス・サイエンシーズWake Forest University Health Sciences | 真核生物の遺伝子編集のためのレンチウイルスベースのベクターならびに関連システムおよび方法 |
WO2019217942A1 (en) | 2018-05-11 | 2019-11-14 | Beam Therapeutics Inc. | Methods of substituting pathogenic amino acids using programmable base editor systems |
WO2020241877A1 (ja) | 2019-05-29 | 2020-12-03 | エディットフォース株式会社 | 凝集の少ないpprタンパク質及びその利用 |
WO2022097663A1 (ja) | 2020-11-06 | 2022-05-12 | エディットフォース株式会社 | FokIヌクレアーゼドメインの変異体 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2023038817A (ja) | 2023-03-17 |
CN117916370A (zh) | 2024-04-19 |
WO2023038020A1 (ja) | 2023-03-16 |
JP2023038910A (ja) | 2023-03-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7502537B2 (ja) | Ruvcドメインを有する酵素 | |
JP2021019617A (ja) | Cas9−crRNA複合体によるRNA指向性DNA切断 | |
US10913941B2 (en) | Enzymes with RuvC domains | |
AU2021231074C1 (en) | Class II, type V CRISPR systems | |
WO2017043656A1 (ja) | 標的化したdna配列の核酸塩基を特異的に変換する、グラム陽性菌のゲノム配列の変換方法、及びそれに用いる分子複合体 | |
JP2023533417A (ja) | Ruvcドメインを有する酵素 | |
KR20240055073A (ko) | 클래스 ii, v형 crispr 시스템 | |
JP7125727B1 (ja) | 核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法 | |
CN118139979A (zh) | 具有hepn结构域的酶 | |
US20220220460A1 (en) | Enzymes with ruvc domains | |
US20230348877A1 (en) | Base editing enzymes | |
GB2617659A (en) | Enzymes with RUVC domains | |
WO2023039377A1 (en) | Class ii, type v crispr systems | |
WO2023057746A1 (en) | Method of generating a library of polynucleotide molecules encoding guide rnas | |
CN116867897A (zh) | 碱基编辑酶 | |
CN118202044A (zh) | 碱基编辑酶 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210907 |
|
A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20210907 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20211108 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220314 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220509 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220719 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220803 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7125727 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |