CN117916370A - 核酸序列改变用组合物及改变核酸序列的靶部位的方法 - Google Patents
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Abstract
要解决的问题在于提供一种不依赖于PAM序列、PFS序列的核酸序列改变用组合物及改变核酸序列的靶部位的方法。解决手段在于一种包含RNA和融合蛋白质的核酸序列改变用组合物,其中,RNA包括:杂交区域,其能够与核酸序列的靶部位的5’侧或3’侧的序列杂交;以及引导区域,其引导融合蛋白质,引导区域包括与融合蛋白质形成复合体的识别区域,融合蛋白质包括:结合域,其识别所述RNA的识别区域,并与识别区域形成复合体,其中,将结合域包含Cas蛋白质组的RNA识别区域除外;以及改变域,其改变核酸序列的靶部位,由此能够解决问题。
Description
技术领域
本申请中的公开涉及一种核酸序列改变用组合物及改变核酸序列的靶部位的方法。
背景技术
近年来,在各种生物种中,作为改变基因组DNA的靶部位的技术的基因组编辑备受关注。作为基因组编辑方法,例如已知有如下方法:(1)使用将锌指DNA结合域(Zinc fingerarray)与非特异性DNA切割域(Nuclease domain)连结而成的锌指核酸酶(ZFN),在DNA中的靶基因座对宿主的植物细胞或昆虫细胞进行重组的方法(参照专利文献1、图1的A);(2)使用将植物病原菌黄单胞菌属所具有的DNA结合模块即转录激活因子样(TAL)效应子与DNA核酸内切酶(Nuclease domain)连结而成的TALEN,在特定的核苷酸序列内或与其相邻的部位,对靶基因进行切割/修饰的方法(参照专利文献2、图1的B)。
然而,如图1的A所示,上述专利文献1中记载的方法需要两个对基因组DNA进行识别的域(Zinc finger array),其分别由蛋白质形成。而且,对基因组DNA进行识别的两个域分别被设计为从双链DNA的靶部位识别3’侧。因此,在改变基因组DNA的靶部位时,存在需要设计不同序列的一对锌指阵列(Zinc finger array)的问题。
另外,如图1的B所示,上述专利文献2中记载的方法与专利文献1中记载的方法的不同点在于,对基因组DNA进行识别的域(TAL效应子)的方向是从双链DNA的靶部位到5’侧。然而,与专利文献1所记载的方法同样地,在改变基因组DNA的靶部位时,存在需要设计不同序列的一对TAL效应子(TAL effector)的问题。
另一方面,作为改变基因组DNA的靶部位的技术,近年来,CRISPR/Cas9受到关注(参照专利文献3~6)。如图2所示,CRISPR/Cas9由具有与想要改变的DNA互补的序列的引导RNA和与引导RNA形成复合体的Cas9蛋白质构成。CRISPR/Cas9的引导RNA只要仅识别双链DNA的一方的链而形成互补对即可。因此,与上述专利文献1和2不同地,具有对改变基因组DNA的靶部位的核酸酶域(Nuclease domain)进行引导的引导RNA为一个即可的优点。
在先技术文献
专利文献
专利文献1:日本专利第4968498号公报;
专利文献2:日本特表2013-513389号公报;
专利文献3:日本特表2015-527889号公报;
专利文献4:日本特表2016-500262号公报;
专利文献5:日本特表2016-501531号公报;
专利文献6:日本特表2016-501532号公报。
发明内容
发明要解决的问题
然而,在使用专利文献3~6中记载的CRISPR/Cas9的方法中,如图2所示,基因组DNA的PAM序列(5’-NGG-3’等)的3~4碱基上游侧的碱基通过Cas9核酸内切酶来切割。即,使用CRISPR/Cas9的方法中存在基因组DNA的靶部位被限制在PAM序列附近的问题。另外,还已知有通过使用Cas13来改变RNA,但在该情况下,也存在靶部位被限制在PFS(ProtospacerFlanking Site,前间隔序列侧翼位点)序列附近的问题。
本申请中的公开是为了解决上述问题点而完成的,进行深入研究的结果新发现,通过使用(1)包含杂交区域和识别区域的RNA、以及(2)与识别区域形成复合体的融合蛋白质,能够不依赖于PAM序列、PFS序列地改变核酸序列。即,本申请中的公开的目的在于提供一种不依赖于PAM序列、PFS序列的核酸序列改变用组合物及改变核酸序列的靶部位的方法。
解决问题的手段
(1)一种包含RNA和融合蛋白质的核酸序列改变用组合物,其中,
RNA包括:
杂交区域,其能够与核酸序列的靶部位的5’侧或3’侧的序列杂交;以及
引导区域,其引导融合蛋白质,
引导区域包括与融合蛋白质形成复合体的识别区域,
融合蛋白质包括:
结合域,其识别所述RNA的识别区域,并与识别区域形成复合体(其中,将结合域包含Cas蛋白质组的RNA识别区域除外);以及
改变域,其改变核酸序列的靶部位。
(2)根据上述(1)所述的核酸序列改变用组合物,其中,
融合蛋白质包括连结结合域和改变域的连接序列。
(3)根据上述(1)或(2)所述的核酸序列改变用组合物,其中,
引导区域包括两个识别区域。
(4)根据上述(1)至(3)中任一项所述的核酸序列改变用组合物,包括:
第一互补区域,其与杂交区域的一端部连接,
通过第一互补区域与引导区域的一端部侧形成互补对,使杂交区域和引导区域间接地连接。
(5)根据上述(1)至(4)中任一项所述的核酸序列改变用组合物其中,
引导区域包括茎环。
(6)根据上述(1)至(5)中任一项所述的核酸序列改变用组合物,其中,
结合域包括Nova的RNA结合区域,
改变域包括对基因组DNA进行切割的FokI的开裂区域。
(7)根据上述(1)至(6)中任一项所述的核酸序列改变用组合物,其中,
核酸序列为基因组DNA。
(8)一种核酸序列改变用组合物,包括:
成为用于转录上述(1)至(7)中任一项所述的RNA的模板的核酸;以及
成为用于翻译上述(1)至(7)中任一项所述的融合蛋白质的模板的核酸。
(9)一种RNA,其用于形成上述(1)至(7)中任一项所述的核酸序列改变用组合物。
(10)一种成为用于转录RNA的模板的核酸,其用于形成上述(8)所述的核酸序列改变用组合物
(11)一种融合蛋白质,其用于形成上述(1)至(7)中任一项所述的核酸序列改变用组合物。
(12)一种成为用于翻译融合蛋白质的模板的核酸,其用于形成上述(8)所述的核酸序列改变用组合物。
(13)一种改变核酸序列的靶部位的方法,包括:
导入工序,将上述(1)至(8)中任一项所述的核酸序列改变用组合物导入细胞;以及
改变工序,改变域改变核酸序列的靶部位。
(14)根据上述(13)所述的改变核酸序列的靶部位的方法,在导入工序之前,包括:
杂交区域确定工序,确定能够与核酸序列的靶部位的5’侧或3’侧的序列杂交的杂交区域。
(15)根据上述(13)或(14)所述的改变核酸序列的靶部位的方法,其中,
用于改变一个靶部位所需的杂交区域为一个。
(16)根据上述(15)所述的改变核酸序列的靶部位的方法,其中,
引导区域包括两个识别区域。
(17)根据上述(16)所述的改变核酸序列的靶部位的方法,在导入工序之前,包括:
引导区域设计工序,至少设计识别区域的数量和RNA序列,以能够与核酸序列的改变所需数量的融合蛋白质形成复合体。
发明效果
通过本申请中公开的核酸序列改变用组合物及改变核酸序列的靶部位的方法,可以不依赖于PAM序列、PFS序列地改变核酸序列。
附图说明
图1的A是示出使用锌指核酸酶的基因组编辑方法的概略的概略图;图1的B是示出使用TALEN的基因组编辑方法的概略的概略图。
图2是示出使用CRISPR/Cas9的基因组编辑方法的概略的概略图。
图3的A和图3的B是示出改变用组合物1的概略的概略图。
图4的A和图4的B是示出改变用组合物1的变形例的概略的概略图。
图5是示出实施例2的概略的图。
图6是图片代用照片,是实施例2的电泳照片。
图7是图片代用照片,是用于确认实施例2的泳道3的箭头所示的条带的电泳照片。
具体实施方式
以下,参照附图,对核酸序列改变用组合物(以下,有时记载为“改变用组合物”)、以及改变核酸序列的靶部位的方法(以下,有时记载为“改变方法”)的实施方式进行详细说明。此外,在本说明书中,对具有同种功能的部件标注相同或类似的符号。而且,对于标注相同或类似的符号的部件,有时省略重复的说明。
另外,关于附图中所示的各结构的位置、大小、范围等,为了容易理解,有时不表示实际的位置、大小、范围等。因此,本申请中的公开不一定局限于附图所公开的位置、大小、范围等。
(核酸序列改变用组合物的实施方式)
参照图3和图4,对实施方式的改变用组合物1进行说明。图3的A和图3的B是示出改变用组合物1的概略的概略图。图4的A和图4的B是示出改变用组合物1的变形例的概略的概略图。此外,在以下的说明中,图3的A以及图3的B中共通的说明有时仅记载为“图3”。
改变用组合物1包含RNA 2和融合蛋白质3。在图3所示的例子中,RNA 2包含能够与具有双螺旋结构的基因组DNA 4的靶部位(改变部位)41的5’侧的基因组DNA 4杂交的杂交区域21、以及对融合蛋白质3进行引导的引导区域22。此外,在图3所示的例子中,杂交区域21在靶部位41的5’侧与基因组DNA 4杂交。可替代地,虽然省略图示,但也能够以在靶部位41的3'侧与基因组DNA 4杂交的方式形成杂交区域21。引导区域22与杂交区域21相邻设置。另外,引导区域22包括通过对融合蛋白质3的结合域31进行识别而与融合蛋白质3形成复合体的识别区域23。此外,图3和图4中示出改变用组合物1改变的对象为基因组DNA 4的例子。可替代地,改变用组合物1可以改变作为核酸序列的RNA。在以下的说明中,对改变用组合物1改变的对象为基因组DNA 4的例子进行说明,但关于改变域32相关说明以外的部分,即使在改变用组合物1改变的对象为基因组DNA 4的情况下、RNA 4的情况下也相同。关于改变域32相关说明以外的部分,只要将“基因组DNA 4”替换为“RNA4”即可。
融合蛋白质3包含与RNA 2的识别区域23形成复合体的结合域31、以及改变基因组DNA 4的靶部位41的改变域32。
杂交区域21的长度只要是能够在基因组DNA 4的靶部位41的5’侧或3’侧进行RNA2的定位的长度,则没有特别限制。若杂交区域21短,则存在偏离靶的风险。因此,只要考虑偏离靶的风险而适当设定长度即可。虽然没有限定,但例如可以为15bp以上、20bp以上、25bp以上、30bp以上、35bp以上、40bp以上、45bp以上。另一方面,从RNA 2的定位的观点出发,杂交区域21的长度没有特别限制,但杂交区域21越长,RNA 2的制造成本越高。因此,虽然没有限定,但例如可以为6kbp以下、5kbp以下、4kbp以下、3kbp以下、2kbp以下、1kbp以下、750bp以下、500bp以下、300bp以下、200bp以下、100bp以下、90bp以下、80bp以下、70bp以下、60bp以下、50bp以下。
关于引导区域22的长度,只要考虑融合蛋白质3的尺寸、从杂交区域21的端部到靶部位41的距离等而适当调整即可。另外,引导区域22也可以包括茎环。在图3的A所示的例子中,用一对融合蛋白质3(更具体而言,一对改变域32)改变靶部位41,因此引导区域22包含两个识别区域23。在引导区域22包含茎环的情况下,能够将两个识别区域23立体构造地接近设置。在图3的A所示的例子中,例如,以将识别区域23设置于环部分的方式形成两个茎环即可。此外,所述茎环的数量和被设置识别区域23的部分仅为例示。如果一对改变域32设置成能够改变靶部位41的位置关系,则茎环的数量也可以是一个、三个、四个。另外,识别区域23可以设置于茎,也可以以横跨茎和环的方式设置。关于识别区域23之间的长度(引导区域22的一部分的长度),只要考虑融合蛋白质3的尺寸等而适当调整即可。
识别区域23可以根据融合蛋白质3的种类决定RNA序列,以使得融合蛋白质3的结合域31可以形成复合体。后面叙述识别区域23的RNA序列和结合域31的组合。
此外,图3的A示出在基因组DNA 4的靶部位41设置一对融合蛋白质3的改变域32,并改变靶部位41的例子。因此,引导区域22包括两个识别区域23。可替代地,如图1的A和图1的B所示,也可以使用一对改变用组合物1,以改变域32与靶部位41相对的方式使一对杂交区域21与基因组DNA 4杂交。由于需要设计两个杂交区域21,因此成本提高等,但在技术上是可能的。进而可替代地,在融合蛋白质3的改变域32以一个能够改变靶部位41的情况下,如图3的B所示,引导区域22所包含的识别区域23可以为一个。即使在引导区域22所包含的识别区域23为一个的情况下,引导区域22也可以包括茎环。另外,识别区域23可以设置在环部分,也可以设置在茎部分,也可以设置成跨茎和环。此外,在图3的A以及图3的B中示出识别区域23为引导区域22的一部分的例子。可替代地,识别区域23的长度也可以与引导区域22的长度一致。在本说明书中,引导区域22包括识别区域23是指,识别区域23是引导区域22的一部分的情况、以及识别区域23的长度与引导区域22的长度一致的情况中的任一个。
融合蛋白质3只要包含(1)对RNA 2的引导区域22中所含的特异性序列(识别区域23)进行识别并与识别区域23形成复合体的结合域31、以及(2)改变基因组DNA 4的靶部位41的改变域32,则没有特别限制。此外,本说明书中的“融合蛋白质”是指,如上所述那样以包含结合域31和改变域32的方式人为地合成的蛋白质,是不会天然存在的蛋白质。融合蛋白质3例如可以融合能够与识别区域23形成复合体的蛋白质、以及改变基因组DNA 4的蛋白质。此外,在使用公知的蛋白质制作融合蛋白质3的情况下,不需要包含公知的蛋白质的全部氨基酸序列。例如,在与RNA 2的识别区域23结合的蛋白质的情况下,也可以仅使用与识别区域23结合的区域。另外,在改变基因组DNA 4的蛋白质的情况下,也可以仅使用具有改变基因组DNA 4的功能的区域。
融合蛋白质3通过公知的方法制作即可。例如,可以基于所设计的融合蛋白质3的氨基酸序列设计核酸序列,使用无细胞蛋白质合成系统进行合成。或者,也可以包含启动子等来设计核酸序列,将该设计的核酸序列导入质粒,使用细胞合成融合蛋白质3。如上所述,在本说明书中记载为“融合蛋白质”的情况下,天然蛋白质本身被排除在外。
如上所述,融合蛋白质3只要包含结合域31和改变域32就没有特别限制,可以根据需要追加任意的序列。例如,也可以追加用于连结结合域31和改变域32的连接序列、成为用于将融合蛋白质3向细胞的核输送的标记的核局部化序列(nuclear localizationsignal/sequence:NLS)。NLS使用公知的序列即可。在追加NLS的情况下,只要得到NLS发挥的功能,则所设置的位置没有特别限制。例如,在以氨基酸序列观察时,从上游侧按照结合域31→改变域32的顺序形成融合蛋白质3的情况下,NLS设置在结合域31的上游侧、结合域31与改变域32之间、改变域32的下游侧即可。另外,在从上游侧按照改变域32→结合域31的顺序形成融合蛋白质3的情况下,NLS设置在改变域32的上游侧、改变域32与结合域31之间、结合域31的下游侧即可。
另外,在本说明书中,“改变”核酸序列(更具体而言,基因组DNA 4或RN4)的靶部位41是指,将双链DNA 4或单链(双链)RNA 4的靶部位41设为在物理上和/或功能上与原始的状态不同的状态。换言之,是指改变域32具有将核酸序列设为该“不同的状态”的功能。
作为将基因组DNA 4的靶部位41设为在物理上不同的状态(如果物理上不同,则作为结果,功能也不同情况较多)的改变域32,虽然没有限定,但例如可以举出具有如下功能的域。
(1)将双链DNA的糖与磷酸之间的磷酸二酯键水解而制成核苷酸的核酸酶(nuclease)
(2)在双链DNA的单链中导入切口的切口酶(nickase)
(3)将DNA的甲基(例如5-甲基胞嘧啶)脱甲基化的DNA脱甲基化酶
(4)使DNA的碱基中所含的NH2变为c=O的脱氨基化酶
(5)取代上述(3)和(4)以外的DNA所具有的基团的酶
作为将基因组DNA 4的靶部位41设为在功能上不同的状态的改变域32,虽然没有限定,但例如可以举出具有如下功能的域。
(6)转录激活因子
(7)转录抑制因子
下面示出上述(1)~(7)中记载的改变域32的更具体的例子。此外,专利文献和非专利文献中记载的酶也可以直接用作改变域32。或者,只要所记载的酶在发挥改变基因组DNA 4的功能的范围内,则一部分区域可以缺失,也可以追加。
(1)核酸酶
(1-1)FokI(日本专利第5266210号公报;T.Sakuma等,“DNA结合模块中非RVD变异的重复模式增强了TALEN活性(Repeating pattern of non-RVD variations in DNA-binding modules enhances TALEN activity)”,《科学报告》(Scientific Reports)3,文章编号:3379(2013))
(1-2)FirmCut核酸酶(国际公开第2020/045281号公报)
(2)切口酶
(2-1)RuvC核酸酶·域D10A点变异(M.Jinek等,“一种可编程双RNA引导的DNA内切酶在细菌适应性免疫中的应用(A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease inAdaptive Bacterial Immunity)”,《科学》(Science)(2012),第337卷,期号6096,第816-821页;也可以从和研药株式会社获得。)
本酶是将Cas9的第10个氨基酸从天冬氨酸(D)变为丙氨酸(A)而得到的酶。Cas9中具有的两个核酸酶域中RuvC样域的核酸酶活性会消失,因此D10A变异体作为切口酶发挥作用,产生单链DNA切割(切口)而不是双链DNA切割。在双切口法(Double Nicking method)中,对双链DNA的靶序列作用将其引导至各自的链的两个sgRNA和Cas9切口酶。
(2-2)HNH核酸酶·域H840A点变异(参照上述(2-1)中记载的文献。也可以从和研药株式会社获得。)
上述(2-1)中记载的酶仅对DNA的靶标链(target Strand)进行切割,而(2-2)所述的酶对非靶标链(non-target strand)进行切割。
(3)DNA脱甲基化酶
(3-1)甲基化胞嘧啶羟化酶Tset1(S.Morita等,“使用dCas9肽重复序列和scFv-TET1催化域融合在体内靶向DNA脱甲基化(Targeted DNA demethylation in vivo usingdCas9-peptide repeat and scFv-TET1 catalytic domain fusions)”,《自然生物技术》(Nature Biotechnology)34,p:1060-1065(2016))
(4)脱氨基化酶
(4-1)腺苷脱氨酶(C.Li等,“利用Cas9腺苷脱氨酶融合在水稻和小麦中扩增碱基编辑(Expanded base editing in rice and wheat using a Cas9-adenosine deaminasefusion)”,《基因组生物学》(Genome Biology)19,文章编号:59(2018))
(4-2)胞嘧啶脱氨酶(A.Komor等,“在没有双链DNA切割的情况下对基因组DNA中的靶碱基进行可编程编辑(Programmable editing of a target base in genomic DNAwithout double-stranded DNA cleavage)”,《自然》(nature)533,p:420-424(2016))
(5)其他酶
组蛋白质乙酰基转移酶、组蛋白质去乙酰化酶、组蛋白质赖氨酸甲酯基转移酶、组蛋白质赖氨酸脱甲基化酶等。
(6)转录激活因子
(6-1)Vp64(L.Lowder等,“利用多重CRISPR-Act2.0和mTALE-Act系统在植物中进行稳健的转录激活(Robust Transcriptional Activation in Plants UsingMultiplexed CRISPR-Act2.0 and mTALE-Act Systems)”,《分子植物》(MolecularPlant),第11卷,期号2,2018,p:245-256)
(6-2)Vp16(参照上述(6-1)中记载的文献。)
(7)转录抑制因子
(7-1)KRAB(M.Boettcher等,“为工作选择合适的工具:RNAi、TALEN或CRISPR(Choosing the Right Tool for the Job:RNAi,TALEN,or CRISPR)”,《分子细胞》(Molecular Cell),201521;58(4):575-85)
(7-2)SRDX(L.Lowder等,“用于多重植物基因组编辑和转录调控的CRISPR/Cas9工具箱(A CRISPR/Cas9 Toolbox for Multiplexed Plant Genome Editing andTranscriptional Regulation)”,《植物生理》(Plant Physiology),2015,169(2):971-85)
另外,虽然部分与上述(1)~(7)重复,但也可以使用日本特表2015-527889号公报中记载的“转座酶域、整合酶域、重组酶域、解离酶域、转化酶域、蛋白质酶域、DNA甲基转移酶域、DNA羟基甲基化酶域、DNA脱甲酰基酶域、组蛋白质乙酰化酶域、组蛋白质去乙酰化酶域、核酸酶域、阻遏物域、激活域、核局部化信号域、转录-调节蛋白质(或转录复合体募集)域、细胞摄取活性相关域、核酸结合域、抗体提示域、组蛋白质修饰酶、组蛋白质修饰酶的募集者;组蛋白质修饰酶的抑制剂、组蛋白质甲基转移酶、组蛋白质脱甲基酶、组蛋白质激酶、组蛋白质磷酸酶、组蛋白质核糖化酶(ribosylase)、组蛋白质去核糖化酶(deribosylase)、组蛋白质泛素化酶(ubiquitinase)、组蛋白质去泛素化酶、组蛋白质生物素酰胺酶(biotinase)和组蛋白质尾巴蛋白质酶(tail protease)”等。日本特表2015-527889号公报的记载事项通过参照包含在本说明书中。
在能够形成上述例示的改变域32的酶中,如图3的A所示那样用两个改变域32改变基因组DNA 4的酶、如图3的B所示那样用一个改变域32改变基因组DNA 4的酶、或者用四个改变域改变基因组DNA 4的酶例如可举出如下种类。
<一个改变域32>
RuvC核酸酶·域D10A点变异、HNH核酸酶·域H840A点变异
<两个改变域32>
FokI、腺苷脱氨酶、胞嘧啶脱氨酶、Vp16
<四个改变域32>
VP64
另外,作为将RNA 4的靶部位41设为在功能上不同的状态的改变域32,虽然没有限定,但例如可以举出作为双链RNA特异性腺苷脱氨酶的作用于RNA的腺苷脱氨酶(AdenosineDeaminase Acting on RNA,ADAR)(Marina等,“用于位点特异性RNA编辑的工程化CRISPR-Cas介导系统的评估(Evaluation of Engineered CRISPR-Cas-Mediated Systems forSite-SpecificRNA Editing)”,《细胞研究》(Cell Reports)33,108350,2020年11月3日)等。
结合域31和识别区域23的序列只要是能够对RNA 2的识别区域23进行识别而与识别区域23形成复合体的蛋白质和RNA序列的组合,则没有特别限制。因此,在引导区域22包括两个以上识别区域23的情况下,可以包括针对相同的结合域31具有相同的RNA序列的识别区域23,也可以包括RNA序列不同的识别区域23。基于相同的理由,在引导区域22包含两个以上识别区域23的情况下,可以针对相同的RNA序列(识别区域23)而相同的结合域31形成复合体,也可以不同的结合域31形成复合体。
结合域31和识别区域23的序列没有限定,例如可以举出如下组合。
(1)Nova:5’-UCAY-3’(K.Jensen等,“四核苷酸UCAY指导Nova K-同源3域对RNA的特异性识别(The tetranucleotide UCAY directs the specific recognition of RNAby the Nova K-homology 3domain)”,《美国国家科学院院刊》(PNAS),2000,97(11),5740-5745。以下,有时将本论文记载为“非专利文献1”。)
另外,上述5’-UCAY-3’形成在茎环的环部分。
(2)上述非专利文献1的图6中记载的组合(参照以下的表1)。
[表1]
编号 | RNA结合蛋白质名 | RNA名 | RNA序列 |
1 | Nova-1 | α2-glyR | 参照图6中记载的序列元素 |
2 | Nova(KH3) | 10021 | 参照图6中记载的序列元素 |
3 | ZBP-1 | β-actin | 参照图6中记载的序列元素 |
4 | hnRNP-E/hnRNP-K | 15-LOX | 参照图6中记载的序列元素 |
5 | hnRNP-E | α-globin | 参照图6中记载的序列元素 |
6 | BBP/SF1 | branchpt. | 参照图6中记载的序列元素 |
(3)TLS:5’-GGUG-3’(Wang等,“诱导的ncRNA变构修饰顺式RNA结合蛋白以抑制转录(Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis toinhibit transcription)”,《自然》(nature),第454卷,2008年7月3日)
另外,虽然没有明确记载RNA序列,但作为与RNA结合的蛋白质,可举出如下蛋白质。由于与RNA结合是公知的,因此只要适当设计RNA序列即可。
(4)RNG105(N.Shiinaet等,“神经元RNA颗粒中一种新的RNA结合蛋白:局部翻译调控机制(A Novel RNA-Binding Protein in Neuronal RNA Granules:RegulatoryMachinery for Local Translation)”,《神经科学杂志》(The Journal ofNeuroscience),4月27日,2005·25(17):4420-4434)
(5)NAPOR(W.ZHANGet等,“神经系统中特定区域的选择性剪切:RNA结合蛋白NAPOR调控的意义(Region-specific alternative splicing in the nervous system:Implications for regulation by the RNA-binding protein NAPOR)”,《核糖核酸》(RNA)(2002),8:671-685,剑桥大学出版社(Cambridge University Press))
(6)DAZL及RBFOX(D.Sharma1等,“细胞中RNA结合蛋白的动力学景观(The kineticlandscape of an RNA-binding protein in cells)”,《自然》(Nature),第591卷,2021年3月4日)
(7)Sam68(P.Bielli等,“RNA结合蛋白Sam68是人类癌症中的多功能参与者(TheRNA-binding protein Sam68 is a multifunctional player in human cancer)”,《内分泌相关癌症》(Endocrine-Related Cancer),(2011)18R91-R102)
(8)Spi-1/PU.1(M.Hallier等,“转录因子Spi-1/PU.1结合RNA并干扰RNA结合蛋白p54nrb(The Transcription Factor Spi-1/PU.1Binds RNA and Interferes with theRNA-binding Protein p54nrb)”,《生物化学杂志》(THE JOURNAL OF BIOLOGICALCHEMISTRY),第271卷,第19号,第11177-11181页,1996)
(9)PUM2蛋白质,QKI蛋白质,IGF2BP蛋白质(M.Hafner等,“PAR-CLIP对RNA结合蛋白和微小RNA靶位点的转录组鉴定(Transcriptome-wide Identification of RNA-Binding Protein and MicroRNA Target Sites by PAR-CLIP)”,《细胞》(Cell),141,129-141,2010)
为了示出上述的结合域31和改变域32的具体例,所引用的各论文的记载事项、以及各论文所引用的论文的记载事项通过参照包含在本说明书中。
此外,作为Cas蛋白质组的Cas9等对基因组DNA 4的PAM序列进行识别是公知的。另外,众所周知,PAM序列根据核酸酶来源的细菌种或核酸酶的型/亚型而不同(参照以下的表2)。进而,众所周知,作为Cas蛋白质组的Cas13对RNA的PFS序列进行识别。因此,本申请中公开的结合域31将对PAM序列、PFS序列进行识别并进行结合的蛋白质、以及对该蛋白质的PAM序列或PFS序列进行识别的区域除外。也可以换言之,将结合域31包含Cas蛋白质组的RNA识别区域除外。作为Cas蛋白质组,例如可列举出Cas9、Cpf1、Cas3、Cas8a-c、Cas10、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Csm2或Cm5等。另一方面,在Cas蛋白质组内,改变核酸序列的区域也可以作为改变域32而包含。
[表2]
菌种 | 亚型 | PAM序列 |
S.pyogenes | II | 5′-NGG |
S.aureus | II-A | 5′-NNGRRT |
S.solfataricus | I-A1 | 5′-CCN |
S.solfataricus | I-A2 | 5′-TCN |
H.walsbyi | I-B | 5′-TTC |
E.coli | I-E | 5′-AWG |
E.coli | I-F | 5′-CC |
P.aeruginosa | I-F | 5′-CC |
S.thermophilus | II-A | 5′-NNAGAA |
S.agalactiae | II-A | 5′-NGG |
F.novicida | V-A | TTTN-′3 |
Acidaminococcus sp. | V-A | TTTN-′3 |
通过使用第一实施方式的改变用组合物,起到如下效果。
(1)RNA2包括与基因组DNA 4或RNA 4杂交的杂交区域21、以及引导区域22。而且,引导区域22包含一个以上的与融合蛋白质3形成复合体的识别区域23。因此,如图3的A和图3的B所示,无论改变域32具有改变功能的是一聚体还是二聚体(或更多),杂交区域21可以为一个。因此,杂交区域21的设计变得容易。
(2)专利文献3~6中记载的CRISPR/Cas9中,基因组DNA 4的靶部位41被限制在PAM序列附近。另外,在Cas13的情况下,RNA 4的靶部位41也被限制在PFS序列附近。另一方面,第一实施方式的改变用组合物1可以不受基因组DNA 4或RNA 4的序列的限制地决定靶部位41。
(3)能够任意地设计引导区域22所包含的识别区域23的数量。因此,能够根据融合蛋白质3的种类来设计引导区域22,因此引导区域22的设计自由度提高。
(4)融合蛋白质3与天然蛋白质(以及改变了一部分的蛋白质)不同,能够通过选择作为结合域31发挥功能的区域以及作为改变域32发挥功能的区域并进行融合而形成。因此,与以往的天然蛋白质(以及改变了一部分的蛋白质)相比,能够减小融合蛋白质3的尺寸。进而,融合蛋白质3的设计自由度提高。
(核酸序列改变用组合物的变形例1)
接着,参照图4的A和图4的B,对实施方式的改变用组合物1的变形例1进行说明。在图3所示的例子中,RNA 2的杂交区域21和引导区域22直接连接。另一方面,在图4的A和图4的B所示的变形例中,RNA 2包含与杂交区域21的一端部连接的第一互补区域24。而且,通过第一互补区域24与引导区域22的一端部侧形成互补对,杂交区域21和引导区域22间接地连接。
在实施方式的改变用组合物1的情况下,由于杂交区域21和引导区域22直接连接,因此需要一体地形成RNA 2。另一方面,在变形例1中,根据靶部位41仅设计杂交区域21和第一互补区域24即可。因此,通过大量生产引导区域22和融合蛋白质3,能够实现成本降低。另外,提供改变用组合物1的经营者仅提供引导区域22及融合蛋白质3,可以在用户侧设计、合成杂交区域21及第一互补区域24,因此可以快速地开始实验。
(核酸序列改变用组合物的变形例2)
接着,对实施方式的改变用组合物1的变形例2进行说明。在上述实施方式的改变用组合物1及变形例1中,用RNA 2和融合蛋白质3形成改变用组合物1。可替代地,作为变形例2,也可以使用成为用于转录RNA 2的模板的核酸(以下,有时记载为“RNA 2用模板”)、以及成为用于翻译融合蛋白质3的模板的核酸(以下,有时记载为“融合蛋白质3用模板”)来形成改变用组合物1。RNA 2用模板和融合蛋白质3用模板可以使用DNA或RNA。RNA 2用模板至少包含用于转录RNA 2的序列即可。另外,融合蛋白质3用模板至少包含用于翻译融合蛋白质3的序列即可。RNA 2用模板和融合蛋白质3用模板可以根据需要包含启动子、翻译促进用的非翻译区域。
更具体而言,在RNA 2用模板和融合蛋白质3用模板为DNA的情况下,在RNA 2用模板的上游连结RNA转录用的启动子,在融合蛋白质3用模板的上游连结蛋白质翻译用的启动子。然后,通过将RNA 2用模板和融合蛋白质3用模板导入细胞,在细胞内,(1)从RNA 2用模板转录RNA 2,(2)从融合蛋白质3用模板转录mRNA,从转录的mRNA翻译融合蛋白质3,(3)在细胞内形成改变用组合物1。
另外,在RNA 2用模板和融合蛋白质3用模板为DNA的情况下,可以与启动子一起插入到相同的质粒载体中,也可以插入到不同的质粒载体中。或者,也可以代替质粒载体,将RNA 2用模板和融合蛋白质3用模板与启动子一起插入到腺相关病毒(AAV)等DNA型病毒中。通过将质粒载体或DNA型病毒导入细胞,在细胞内形成改变用组合物1。此外,在质粒载体或DNA型病毒已经包含启动子时,将不含启动子的RNA 2用模板和融合蛋白质3用模板插入到质粒载体或DNA型病毒即可。
在RNA 2用模板和融合蛋白质3用模板为RNA的情况下,使用慢病毒等RNA型病毒来代替DNA型病毒即可。在使用RNA型病毒的情况下,首先从插入到细胞中的RNA型病毒中插入的RNA 2用模板和融合蛋白质3用模板,逆转录DNA。然后,从逆转录的DNA转录RNA 2,另外,从逆转录的DNA转录mRNA,从该mRNA翻译融合蛋白质3。此外,融合蛋白质3用模板也可以是mRNA。在融合蛋白质3用模板为mRNA的情况下,不需要在mRNA上连结启动子。通过将mRNA导入细胞内,能够在细胞内从mRNA直接翻译融合蛋白质3。
如上所述,根据成为模板的核酸的种类,最终得到RNA 2和融合蛋白质3的路径不同。在本说明书中记载为“成为用于转录RNA的模板的核酸”的情况下,作为模板的核酸是除了直接转录RNA 2的模板(模板DNA)之外还包含间接地转录RNA 2的模板(模板RNA)的概念。同样地,在记载为“成为用于翻译融合蛋白质的模板的核酸”的情况下,作为模板的核酸是除了直接翻译融合蛋白质3的模板(mRNA)之外还包含间接地翻译融合蛋白质3的模板(模板DNA、模板RNA)的概念。
此外,如果在细胞内最终形成改变用组合物1,则RNA 2用模板和融合蛋白质3用模板的种类(模板DNA、模板RNA、mNRA)和形态(向载体、病毒的插入的有无)可以相同,也可以不同。
RNA转录用的启动子、蛋白质翻译用的启动子、质粒、DNA型病毒、RNA型病毒只要发挥上述功能就没有特别限制,使用公知的物质即可。虽然没有限定,但例如作为RNA转录用的启动子,例如可以举出U6启动子等。作为蛋白质翻译用的启动子,可以举出CMV启动子等。作为质粒,可以举出哺乳类用的pcDNA3.1;细菌用的pBluescriptII KS、pET类;酵母用的pPIC类等。作为DNA型病毒,可以举出上述腺相关病毒(AAV)。作为RNA型病毒,可以举出上述慢病毒等。此外,变形例2的改变用组合物1也可以换言之为改变用组合物形成用的组合物。
(核酸序列改变用组合物的变形例3)
接着,对实施方式的改变用组合物1的变形例3进行说明。在上述实施方式的改变用组合物1及变形例1中,将RNA2和融合蛋白质3组合而形成改变用组合物1。另外,在变形例2中,将RNA 2用模板和融合蛋白质3用模板组合而形成改变用组合物1。可替代地,在变形例3中,也可以仅提供形成改变用组合物1的组合要素的一方,在使用分别提供的要素时组合,从而形成改变用组合物1。
更具体而言,(1)仅将实施方式的改变用组合物1及变形例1中记载的RNA 2作为用于形成改变用组合物1的RNA 2来提供,(2)仅将实施方式的改变用组合物1及变形例1中记载的融合蛋白质3作为用于形成改变用组合物1的融合蛋白质3来提供,(3)仅将变形例2中记载的RNA 2用模板作为用于形成改变用组合物1的RNA 2用模板来提供,(4)仅将变形例2中记载的融合蛋白质3用模板作为用于形成改变用组合物1的融合蛋白质3用模板来提供即可。RNA 2和融合蛋白质3已经在实施方式的改变用组合物1及变形例1中进行了说明,RNA 2用模板和融合蛋白质3用模板在变形例2中已经进行了说明。因此,由于重复记载,因此省略具体的记载。
(改变核酸序列的靶部位的方法的实施方式)
改变方法包括:导入工序,将上述改变用组合物的实施方式和变形例中说明的改变用组合物1导入细胞;以及改变工序,改变域32改变核酸序列4的靶部位41。
细胞只要包含核酸序列4就没有特别限制。例如,可以举出人或非人动物细胞;植物细胞;昆虫细胞;大肠杆菌、酵母、霉菌等微生物细胞等。另外,细胞可以是单一细胞,也可以是细胞彼此凝集成块的细胞(球状体)。在本说明书中记载为“细胞”的情况下,也包含单一细胞和多个细胞凝集而成的块的任意概念。
导入工序只要能够将改变用组合物1导入细胞则没有特别限制,可以使用电穿孔等公知的方法。另外,在使用DNA病毒或RNA病毒作为变形例2的改变用组合物的情况下,只要通过公知的方法感染细胞即可。此外,在使用了变形例2的改变用组合物1的情况下,在导入工序之后,包括在细胞内形成RNA 2和融合蛋白质3的工序。
在改变工序中,导入到细胞的改变用组合物1的杂交区域21与核酸序列4杂交,改变域32改变核酸序列4的靶部位41。此外,如上所述,改变一个靶部位41所需的杂交区域21可以是一个,也可以是两个。然而,本申请所公开的改变用组合物1可以在一个引导区域22中包含两个以上的识别区域23。因此,即使是改变一个靶部位41所需的杂交区域21为一个,也能够设计识别区域23以使得能够与核酸序列4的改变所需数量的融合蛋白质3形成复合体。在将改变一个靶部位41所需的杂交区域21设为一个的情况下,能够削减制造成本、提高实验的便利性。
改变方法可以在导入工序之前包括与核酸序列4的靶部位41的5’侧或3’侧的序列杂交的杂交区域确定工序。也可以包含在杂交区域确定工序中确定的杂交区域21来制作RNA 2整体。另外,也可以通过在用户侧制作杂交区域21和第一互补区域24,并与另外提供的引导区域22和融合蛋白质3组合,来制作改变用组合物1并实施改变方法。
改变方法可以在导入工序之前包括至少设计识别区域23的数量和RNA序列的引导区域设计工序,以能够与核酸序列4的改变所需数量的融合蛋白质3形成复合体。引导区域设计工序也可以根据需要包括将两个以上的识别区域23连结的连接序列的设计。一个引导区域22与两个以上的融合蛋白质3形成复合体、该融合蛋白质3中所含的改变域32改变核酸序列4是未知的。因此,上述引导区域设计工序是新型工序。
另外,DNA具有自我修复功能。因此,在核酸序列4为基因组DNA的情况下,在实施改变工序后,可以根据需要实施向靶部位41的DNA导入工序。在改变域32为FokI等对基因组DNA 4进行切割的酶的情况下,通过改变工序,基因组DNA 4的靶部位41被切割而改变为物理上不同的状态。其结果,基因组DNA 4有时丧失功能(敲除)。另一方面,切割后的基因组DNA 4有时通过自我修复功能来修复切割部位。通过将ssODN、ssDNA或dsDNA与改变组合物1同时导入细胞,在对改变工序中切割的基因组DNA 4的靶部位41进行修复时,可以在切割部位插入期望的DNA片段。通过插入期望的DNA片段,也能够对基因组DNA 4追加意图的功能(敲入)。
此外,本申请中的公开不限于上述实施方式。在本申请中公开的范围内,可以进行上述各实施方式的自由的组合、或者各实施方式的任意构成要素的变形、或者任意构成要素的省略。
以下举出实施例对本申请所公开的实施方式进行具体说明,但该实施例仅用于说明实施方式。并不表示限定或限制本申请所公开的发明的范围。
[实施例]
<实施例1>
通过以下的步骤,制作改变用组合物1。
(1)融合蛋白质(Fok I-Nova)的制备
制备FokI-Nova作为融合蛋白质3。FokI-Nova的氨基酸序列如序列号1(SEQ.ID.1)所示。此外,以下的表3所示的序列号1中,下划线部分(从第1行右起第7列的“Q”~第5行左起第11列的“F”)表示FokI的开裂区域(改变域32),双下划线部分(从第5行左起第28列的“K”~第6行右起第8列的“G”)表示NOVA的RNA结合区域(结合域31),粗字符下划线部分(从第6行右起第3列的“P”~第7行左起第4列的“V”)表示NLS。其他为连接序列等。
[表3]
(1-1)表达载体向表达用大肠杆菌的克隆
将以表达序列号1所示的FokI-Nova的方式设计的表达载体克隆到表达用大肠杆菌中。将浓度调整为10ng/μL的表达载体1μL与表达用大肠杆菌50μL混合,在冰上静置20分钟。然后,在42℃下处理1分钟,施加热冲击后,返回到冰上。将转化后的大肠杆菌总量与SOC培养基250μL混合,在37℃下培养1小时。其中,将100μL撒在LB板(含抗生素)上,在37℃下培养一晚。
从板上拾取单一菌落,在37℃下培养一晚。将培养液与50%甘油溶液等量混合后,在-80℃下保存。
<试剂>
·表达用大肠杆菌:BL21(DE3)pLysS
·抗生素:卡那霉素
(1-2)100mL培养/纯化
从大肠杆菌甘油储备液中植菌,在10ml的LB培养基(含抗生素)中在37℃下培养一晚。向100mL的LB培养基(含抗生素)中添加10ml前培养液,在37℃下培养。确认为OD=0.6附近,添加IPTG以使得最终浓度为1mM,在25℃下培养一晚。向菌体中加入5ml蛋白质提取试剂并进行悬浮。添加蛋白质提取试剂、10μl的溶解酶生物处理试剂(Lysonase BioprocessingReagent)(Novagen公司制造),在室温下搅拌5分钟。通过离心分离回收上清液作为可溶性组分。在柱中加入1ml树脂,使其沉降。使保存液流动后,加入平衡缓冲液10床体积(bedvolumes),使树脂平衡。
将可溶性组分加入色谱柱,使His-Tag融合蛋白质结合。用8床体积的平衡缓冲液清洗柱。用7床体积的平衡缓冲液(包含10mM咪唑(Imidazole))清洗柱。用3床体积的洗脱缓冲液洗脱His-Tag融合蛋白质。
将纯化后的蛋白质与EzApply(ATTO)等量混合,在95℃下进行5分钟的热处理,制备电泳样品。对5~20%聚丙烯酰胺凝胶施加样品,以20mA泳动70分钟。使用FokI抗体,确认合成了设计尺寸的FokI-Nova融合蛋白质。
<试剂>
·蛋白质提取试剂:BugBuster蛋白抽提试剂(Novagen公司制造)
·纯化树脂:TALON金属亲和树脂(宝生物公司制造)
·平衡缓冲液:50mM磷酸钠,300mM氯化钠;pH7.4
·洗脱缓冲液:50mM磷酸钠,300mM氯化钠,150mM咪唑;pH7.4
·泳动缓冲液:25mM氨丁三醇(Tris)pH 8.3,192mM甘氨酸(Glycine),0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)
(2)RNA 2(杂交区域21+引导区域22)的制作
实施例中制作的RNA 2的序列如序列号2所示。RNA 2通过以下的步骤制作。
(a)杂交区域21
以pEGFP-N1(序列号3)为模板,使用
·Fw引物(Forward primer,正向引物)(eGFP Xba5P:5’-GCTCTAGAAAACGGCCACAA GTTCAGCGTGTC-3’:序列号4)
·Rv引物(Reverseprimer,反向引物)(eGFP Spe3P:5’-TGACTAGTGGGTGTCGCCCTC GAACTTCACCT-3’:序列号5)
来扩增290bp,在两端附加限制酶位点。用常规方法在pCR2.1载体上进行连接(Ligation)。
此外,序列号4及5的下划线部分是与编码图5所示的GFP的DNA序列4形成互补对的序列(杂交区域21的两端部)。此外,在图5中,为了方便纸面,序列号的“ID.”省略记载。
(b)引导区域22
对UCAY5P(5’-TCGGATCCGCAGTCTCATCATCATTTTCATTTTGTTCGTTAGCACATTGGGCAGTCTCAT-3’:序列号6)、以及UCAY3P(5’-GAAGATCTCAAAATGAAAATGATGATGAGACTGCCCAATGTGCTAAC GAACAAAATGAAA-3’:序列号7)进行退火,并进行伸长反应。用BamHI和BglII对在BamHI位点退火后的模板进行限制酶处理,通过常规方法在上述(a)的下游侧进行连接(Ligation)。
(c)RNA 2的合成
用HindIII对pCR2.1载体进行限制酶处理,用体外转录T7试剂盒(in vitroTranscription T7 Kit)合成RNA。
另外,RNA 2通过连接子包括两个非专利文献1的图6的α2-glyR(GCAGUCUCAUCAUCAUUUUCAUUUUG:序列号8)作为识别区域23。
[表4]
<实施例2>
使用实施例1中制作的改变用组合物1,按照以下的顺序进行将GFP编码的基因组DNA 4(序列号9)的切割实验。图5是示出实施例2的概略的图。
(1)GFP的PCR扩增
以序列号3为模板,使用以下的引物通过常规方法得到序列号9所示的GFP的PCR产物。
·Fw引物(5’-GTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3’:序列号10)
·Rv引物(5’-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’:序列号11)
(2)使用上述(1)中得到的200ng的PCR产物、实施例1中制作的200ng的RNA、实施例1中制作的125ng的融合蛋白质(Nova-FokI)。使用CutSmart缓冲液在37℃下处理2小时后,进行RNase(核糖核酸酶)处理,进行电泳。结果示于图6。图6所示的电泳照片的各泳道如下。
M:100bp标记物(Marker)
1:GFP的仅PCR产物
2:GFP的PCR产物+融合蛋白质
3:GFP的PCR产物+融合蛋白质+RNA
如图6所示,确认到在泳道2的“GFP的PCR产物+融合蛋白质”中,PCR产物通过FokI被随机切割。另一方面,确认到在泳道3的“GFP的PCR产物+融合蛋白质+RNA”中,改变用组合物1的杂交区域21与GFP的PCR产物杂交,因此PCR产物以规定的长度被切割。
此外,如图5所示,杂交区域21设计成在将GFP编码的序列(714bp)的大致中央附近被切割。因此,进行了确认图6的泳道3的箭头所示的DNA片段包含将GFP编码的序列的上游侧和下游侧这两者的实验。
利用QIAGEN公司的QIAquick凝胶提取试剂盒对图6的泳道3的箭头所示的条带进行凝胶提取(以下,记载为“条带提取物”)。参照图5说明确认实验的概略。
(1)条带提取物的扩增
1:使用序列号10作为Fw引物、使用序列号12作为Rv引物来扩增条带提取物。扩增产物的长度为221bp。
2:使用序列号13作为Fw引物、序列号使用11作为Rv引物来扩增带提取物。扩增产物的长度为251bp。
(2)以序列号3为模板的GFP片段的扩增
3:使用序列号10作为Fw引物、使用序列号12作为Rv引物来扩增编码GFP片段的序列。扩增产物的长度为221bp。
4:使用序列号13作为Fw引物、使用序列号11作为Rv引物来扩增编码GFP片段的序列。扩增产物的长度为251bp。
此外,序列号12和13的序列如下。
·序列号12:5’-TAGCGGCTGAAGCACTGCAC-3’
·序列号13:5’-ACAAGCAGAAGAACGGCATCAAG-3’
进行上述扩增产物的电泳。结果示于图7。图7的M相当于100bp标记物,图7的泳道1~4相当于上述1~4中记载的扩增产物。根据图7的泳道1和2所示的结果,确认到在用融合蛋白质3切割的条带提取物中包含将GFP片段编码的序列的上游侧和下游侧。由以上的结果确认,通过使用本申请中公开的改变用组合物,能够不依赖于PAM序列、PFS序列地改变核酸序列。
工业应用性
通过使用本申请中公开的核酸序列改变用组合物和改变核酸序列的靶部位的方法,能够不依赖于PAM序列、PFS序列地改变核酸序列。因此,在制药行业、研究机关等需要基因组编辑的产业中有用。
符号说明
1:基因组DNA改变用组合物;2:RNA;21:杂交区域;22:引导区域;23:识别区域;24:第一互补区域;3:融合蛋白质;31:结合域;32:改变域;4:核酸序列、基因组DNA、RNA;41:靶部位。
Claims (17)
1.一种包含RNA和融合蛋白质的核酸序列改变用组合物,其中,
RNA包括:
杂交区域,其能够与核酸序列的靶部位的5’侧或3’侧的序列杂交;以及
引导区域,其引导融合蛋白质,
引导区域包括与融合蛋白质形成复合体的识别区域,
融合蛋白质包括:
结合域,其识别所述RNA的识别区域,并与识别区域形成复合体,其中,将结合域包含Cas蛋白质组的RNA识别区域除外;以及
改变域,其改变核酸序列的靶部位。
2.根据权利要求1所述的核酸序列改变用组合物,其中,
融合蛋白质包括连结结合域和改变域的连接序列。
3.根据权利要求1或2所述的核酸序列改变用组合物,其中,
引导区域包括两个识别区域。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸序列改变用组合物,包括:
第一互补区域,其与杂交区域的一端部连接,
通过第一互补区域与引导区域的一端部侧形成互补对,使杂交区域和引导区域间接地连接。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸序列改变用组合物,其中,
引导区域包括茎环。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸序列改变用组合物,其中,
结合域包括Nova的RNA结合区域,
改变域包括对基因组DNA进行切割的FokI的开裂区域。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的核酸序列改变用组合物,其中,
核酸序列为基因组DNA。
8.一种核酸序列改变用组合物,包括:
成为用于转录权利要求1至7中任一项所述的RNA的模板的核酸;以及
成为用于翻译权利要求1至7中任一项所述的融合蛋白质的模板的核酸。
9.一种RNA,其用于形成权利要求1至7中任一项所述的核酸序列改变用组合物。
10.一种成为用于转录RNA的模板的核酸,其用于形成权利要求8所述的核酸序列改变用组合物。
11.一种融合蛋白质,其用于形成权利要求1至7中任一项所述的核酸序列改变用组合物。
12.一种成为用于翻译融合蛋白质的模板的核酸,其用于形成权利要求8所述的核酸序列改变用组合物。
13.一种改变核酸序列的靶部位的方法,包括:
导入工序,将权利要求1至8中任一项所述的核酸序列改变用组合物导入细胞;以及
改变工序,改变域改变核酸序列的靶部位。
14.根据权利要求13所述的改变核酸序列的靶部位的方法,在导入工序之前,包括:
杂交区域确定工序,确定能够与核酸序列的靶部位的5’侧或3’侧的序列杂交的杂交区域。
15.根据权利要求13或14所述的改变核酸序列的靶部位的方法,其中,
用于改变一个靶部位所需的杂交区域为一个。
16.根据权利要求15所述的改变核酸序列的靶部位的方法,其中,
引导区域包括两个识别区域。
17.根据权利要求16所述的改变核酸序列的靶部位的方法,在导入工序之前,包括:
引导区域设计工序,至少设计识别区域的数量和RNA序列,以能够与核酸序列的改变所需数量的融合蛋白质形成复合体。
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