WO2019035485A1 - ゲノム編集酵素の活性を阻害する核酸アプタマー - Google Patents

ゲノム編集酵素の活性を阻害する核酸アプタマー Download PDF

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WO2019035485A1
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oligonucleotide
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guide rna
sequence
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真 宮岸
義雄 加藤
晶 趙
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国立研究開発法人産業技術総合研究所
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    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)

Definitions

  • the present invention relates to nucleic acid aptamers that inhibit the activity of genome editing enzymes.
  • Patent Document 1 discloses a fusion protein of dCas9 and a heterologous functional domain (for example, a transcription activation domain).
  • the present invention has been made to provide a nucleic acid aptamer capable of inhibiting the action of a genome editing enzyme on a target sequence by inhibiting the binding of the genome editing enzyme to the target sequence.
  • the present inventors succeeded in obtaining a nucleic acid aptamer that can specifically bind to a genome editing enzyme and inhibit its activity.
  • the present invention provides a nucleic acid aptamer that inhibits the binding activity or enzymatic activity of a complex comprising a guide RNA and a nuclease to a target nucleic acid that is a substrate of the complex, which comprises Regions (1) to (3): (1) a single-stranded guide RNA recognition region comprising a guide RNA recognition oligonucleotide consisting of a sequence that recognizes the guide RNA, (2) a fragment of PAM sequence corresponding to the nuclease A double-stranded neck region containing in the strand, wherein the neck region comprises a first neck oligonucleotide consisting of the PAM sequence and a second neck oligonucleotide consisting of a sequence complementary to the PAM sequence And a neck region, and (3) a double-stranded structural stabilization region comprising a first structurally stabilized oligonucleotide and a second structurally stabilized oligonucleotide
  • the nuclease is preferably a nuclease of the Crispr-Cas family.
  • the guide RNA recognition oligonucleotide in the region (1) preferably comprises a sequence of 2 to 30 bases in length adjacent to the PAM sequence of the target nucleic acid.
  • the guide RNA recognition oligonucleotide in the region (1) consists of a sequence of 3 to 22 bases in length adjacent to the PAM sequence of the target nucleic acid.
  • the region (1) is preferably 6 to 50 bases in length.
  • the region (1) preferably contains a crosslinked nucleic acid.
  • the region (2) may include a mismatch or a bulge.
  • the first neck oligonucleotide in the region (2) is 5'-NGG-3 'and the complex is Crispr-Cas9.
  • said first neck oligonucleotide in said region (2) is 5'-TTTN-3 'and said complex is CRISPR-Cpf1.
  • the region (3) is preferably 4 base pairs or more in length.
  • the nucleic acid aptamer may comprise phosphorothioate modifications.
  • the present invention is a method for producing a nucleic acid aptamer that inhibits the binding activity or enzymatic activity of a complex comprising a guide RNA and a nuclease to a target nucleic acid that is a substrate of the complex.
  • a method comprising the steps of: linking; and (7) synthesizing a nucleic acid comprising a sequence designed by the steps (1) to (6).
  • the method further comprises the step of (5 ') linking the first structural stabilized oligonucleotide with the second structural stabilized oligonucleotide.
  • the above method preferably further comprises the step of (6 ') linking the guide RNA recognition oligonucleotide directly or via a linker oligonucleotide to the first neck oligonucleotide.
  • the present invention also provides, according to one embodiment, a method for inhibiting the binding activity or enzymatic activity of a complex comprising a guide RNA and a nuclease to a target nucleic acid which is a substrate of the complex,
  • a method comprising the steps of: preparing a reaction solution containing the complex and the target nucleic acid; and (2) adding the nucleic acid aptamer to the reaction solution.
  • the present invention provides a method of inhibiting the binding activity or enzymatic activity of a complex comprising a guide RNA and a nuclease to a target nucleic acid that is a substrate of the complex in cells. And (1) introducing the complex into a cell containing a target nucleic acid, and (2) introducing the nucleic acid aptamer into the cell.
  • the present invention also provides, according to one embodiment, (1) introducing into a cell a complex comprising a guide RNA and a nuclease of the Crispr-Cas family, and (2) introducing the nucleic acid aptamer into the cell. And a step of providing a genome editing method.
  • the nucleic acid aptamer of the present invention can temporally and spatially control the action of the genome editing enzyme on the target sequence by inhibiting the binding of the genome editing enzyme based on the Crispr-Cas system to the target sequence.
  • nucleic acid since nucleic acid is used as a raw material, it can be easily introduced into cells as compared to antibodies. Therefore, the nucleic acid aptamer of the present invention exhibits the following excellent effects and is useful. (1)
  • the timing and accuracy of genome editing can be controlled in vitro or in vivo (in a cell or in an animal individual), and unnecessary and unwillingness to the target sequence of the genome editing enzyme complex Effects can be reduced or avoided.
  • a nucleic acid aptamer of the present invention used at a low concentration or having a reduced binding specificity when cleaving a nucleic acid using a genome editing enzyme complex in vitro or in vivo (in a cell or an animal individual)
  • the activity of the genome editing enzyme complex can be partially suppressed by using As a result, the genome editing enzyme complex can accurately act only on the target sequence, and off-target effects can be minimized.
  • a plurality of Cas9 / sgRNA complexes targeting different sequences are simultaneously introduced into a cell, only the activity of a particular Cas9 / sgRNA complex can be inhibited.
  • FIG. 1 shows the results of evaluating the inhibitory effect of candidate aptamers against Cas9 obtained by SELEX on target site cleavage by Cas9 / sgRNA (GFPg1) by an in vitro assay. It was shown that s21, s36 and s40 have high inhibitory activity.
  • FIG. 2 shows the results of confirming the concentration dependence of the inhibitory activity of the candidate aptamers s21, s36 and s40 on target site cleavage by Cas9 / sgRNA (GFPg1) by in vitro assay.
  • FIG. 3 is a schematic view showing a secondary structure of s21.
  • FIG. 1 shows the results of evaluating the inhibitory effect of candidate aptamers against Cas9 obtained by SELEX on target site cleavage by Cas9 / sgRNA (GFPg1) by an in vitro assay. It was shown that s21, s36 and s40 have high inhibitory activity.
  • FIG. 2 shows the results
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of in vitro assay evaluation of the inhibitory effect of truncation mutant s21 with a shortened guide RNA recognition region on target site cleavage by Cas9 / sgRNA (GFPg1). .
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of evaluating the inhibitory effect of the aptamer having a mutation introduced into the guide RNA recognition region of s21 and s36 on target site cleavage by Cas9 / sgRNA (GFPg1) by an in vitro assay.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of evaluating the inhibitory effect of the aptamer having a mutation introduced into the guide RNA recognition region of s21 and s36 on target site cleavage by Cas9 / sgRNA (GFPg1) by an in vitro assay.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of evaluating the inhibitory effect of the aptamer having a point mutation introduced into the guide RNA recognition region of s21-2 on target site cleavage by Cas9 / sgRNA (GFPg1) by an in vitro assay. is there.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of evaluating the inhibitory effect of the aptamer in which the length of the structural stabilization region of s21-2 has been changed on target site cleavage by Cas9 / sgRNA (GFPg1) by an in vitro assay. .
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of evaluating the inhibitory effect of an aptamer in which the sequence of the structural stabilization region of s21-2 has been altered on target site cleavage by Cas9 / sgRNA (GFPg1) by an in vitro assay.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of evaluating the inhibitory effect of the aptamer having a mutation introduced into the neck region of s21-2 on target site cleavage by Cas9 / sgRNA (GFPg1) by an in vitro assay.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of evaluation of the inhibitory effect on target site cleavage by Cas9 / sgRNA (GFPg1) of an aptamer having a phosphorothioate modification introduced into s21-2 by in vitro assay.
  • FIG. 11 shows the results of evaluation of the interaction between s21-based aptamers and Cas9 by gel shift assay.
  • FIG. 12 shows the results of evaluation of the interaction between s21-based aptamers and Cas9 by surface plasmon resonance assay.
  • FIG. 13 is a schematic view showing secondary structures of s21-2 (stem loop type aptamer) and s21-sf (stem flap type aptamer).
  • FIG. 14 shows the results of evaluating the inhibitory effect of s21-based stem flap-type aptamer on target site cleavage by Cas9 / sgRNA (GFPg1) by in vitro assay.
  • FIG. 15 shows the results of evaluating the inhibitory effect of s21-2 on Cas9 / crRNA targeting different sequences by in vitro assay.
  • FIG. 16 shows the results of evaluation of the inhibitory effect of antisense DNA and antisense RNA against a guide sequence in sgRNA on target site cleavage by Cas9 / sgRNA (GFPg1) by an in vitro assay.
  • FIG. 17 is a schematic view of the mechanism of inhibition of Cas9 / sgRNA by an aptamer.
  • FIG. 18 is a diagram showing the results of evaluation of the inhibitory effects of stem loop type aptamers and stem flap type aptamers on Cas9 / crRNA (GFP332) and Cas9 / crRNA (GFP373) by in vitro assays.
  • FIG. 19 is a diagram showing the results of evaluating the influence of the length of the loop structure of the stem-loop aptamer on the inhibitory effect by an in vitro assay.
  • FIG. 20 shows the results of evaluating the crRNA sequence specificity of the inhibitory effect of the stem flap type aptamer on Cas9 / crRNA by an in vitro assay.
  • FIG. 21 is a diagram showing the results of evaluating the effect of the flap structure length of the stem flap type aptamer on the inhibitory effect by an in vitro assay.
  • FIG. 22 is a diagram showing the results of evaluation of the effect of the addition of a base to the end opposite to the flap structure of the stem flap type aptamer on the inhibitory effect by an in vitro assay.
  • FIG. 23 shows the results of evaluation of the inhibitory effect of the stem flap type aptamer on Cas9 / crRNA targeting the EGFR gene by in vitro assay.
  • FIG. 24 is a diagram showing the results of evaluating the influence of the length of the flap structure on the inhibitory effect of the stem flap-type aptamer by in vitro assay.
  • FIG. 25 shows the results of evaluation of the inhibitory effect of the stem flap type aptamer on Cas9 / crRNA targeting the EpCAM gene by in vitro assay.
  • FIG. 26 is a schematic view of a mechanism of inhibition of Cpf1 / crRNA by a stem flap type aptamer.
  • FIG. 27 shows the results of evaluating the inhibitory effect of the stem flap type aptamer on target site cleavage by Cpf1 / crRNA (GFPa) by in vitro assay.
  • FIG. 28 shows the results of evaluation of the inhibitory effect of the stem flap type aptamer on Cpf1 / crRNA targeting the EGFR gene by in vitro assay.
  • FIG. 29 shows fluorescence microscope images confirming the inhibitory effect of the stem flap type aptamer on target genome editing by Cas9 / crRNA: tracrRNA complex targeting the target sequence-mScarlet reporter cassette introduced into the intracellular genome.
  • FIG. 30 shows the inhibitory effect of the aptamer having an LNA modification introduced into the flap structure on target genome editing by Cas9 / crRNA: tracrRNA complex targeting the target sequence-mScarlet reporter cassette introduced into the intracellular genome
  • FIG. 31 is a graph showing the results of collecting the cells shown in FIG. 30 and quantifying them by FACS.
  • FIG. 32 shows the inhibitory effect of an aptamer with LNA modification introduced into the flap structure on target genome editing in cells by Cas9 / crRNA: tracrRNA complex targeting the target sequence-mScarlet reporter cassette introduced into the genome It is a figure which shows the fluorescence-microscope image which confirmed density
  • FIG. 33 is a graph showing the results of collecting the cells shown in FIG. 32 and quantifying them by FACS.
  • FIG. 34 shows the results of evaluation based on detection of indel of the inhibitory effect of the aptamer on target genome editing in cells by the Cas9 / crRNA: tracrRNA complex targeting an endogenous gene.
  • the present invention provides a nucleic acid aptamer that inhibits the binding activity or enzymatic activity of a complex comprising a guide RNA and a nuclease to a target nucleic acid that is a substrate of the complex, comprising: Regions (1) to (3): (1) a single-stranded guide RNA recognition region comprising a guide RNA recognition oligonucleotide consisting of a sequence that recognizes the guide RNA, (2) a fragment of PAM sequence corresponding to the nuclease A double-stranded neck region containing in the strand, wherein the neck region comprises a first neck oligonucleotide consisting of the PAM sequence and a second neck oligonucleotide consisting of a sequence complementary to the PAM sequence And a double-stranded structural stabilization region comprising a neck region, and (3) a first structural stabilization oligonucleotide, and a second structural stabilization oligonucleotide.
  • region (1) is linked to the second neck oligonucleotide to form a flap structure, or the region (1) comprises the first neck oligonucleotide and the second A loop structure linked to the neck oligonucleotide, wherein the guide RNA recognition oligonucleotide in the region (1) is adjacent to the second neck oligonucleotide, and 2) and the region (3) are linked together to form a stem structure.
  • the “nucleic acid aptamer” means a nucleic acid molecule capable of specifically binding to a target molecule (in the present invention, a complex containing a guide RNA and a nuclease) with high affinity.
  • the nucleic acid aptamer can have an effect of inhibiting the activity of the target molecule by specifically binding to the target molecule.
  • the nucleic acid constituting the nucleic acid aptamer is not particularly limited, and may be, for example, DNA, RNA, modified nucleic acid, etc., and only one or two or more of these may be combined to constitute the nucleic acid aptamer.
  • the nucleic acid aptamer in the present invention may be a DNA aptamer, an RNA aptamer, a DNA / RNA chimeric nucleic acid aptamer, an aptamer containing a modified nucleic acid in part of them, and the like.
  • the nucleic acid aptamer in the present invention is a DNA aptamer.
  • modified nucleic acids refer to nucleic acids composed of non-naturally occurring nucleotides or non-naturally occurring nucleic acids.
  • non-naturally occurring nucleotide refers to a nucleotide which contains an artificial chemical modification which does not occur in nature as a base or a sugar, and which has the same property / structure as a naturally occurring nucleotide.
  • Non-natural nucleotides are known, such as abasic nucleosides, arabinonucleosides, 2'-deoxyuridines, alpha-deoxyribonucleosides, beta-L-deoxyribonucleosides, other sugar modifications (eg, substituted pentasaccharides (eg 2'-O-methyl ribose, 2'-deoxy-2'-fluoro ribose, 3'-O-methyl ribose, 1 ', 2'-deoxy ribose), arabinose, substituted arabinose sugar, substituted hexamonosaccharide, ⁇ - Non-naturally occurring nucleotides including nucleosides having anomeric sugars etc.) can be mentioned.
  • substituted pentasaccharides eg 2'-O-methyl ribose, 2'-deoxy-2'-fluoro ribose, 3'-O-methyl ribose,
  • non-naturally occurring nucleotide in the present specification may be a nucleotide containing a base analog or a modified base.
  • Base analogs include, for example, 2-oxo (1H) -pyridin-3-yl, 5-substituted 2-oxo (1H) -pyridin-3-yl, 2-amino-6- (2-thiazolyl) And purin-9-yl group, 2-amino-6- (2-thiazolyl) purin-9-yl group, 2-amino-6- (2-oxazolyl) purin-9-yl group and the like.
  • Modified bases include, for example, modified pyrimidines (eg, 5-hydroxycytosine, 5-fluorouracil, 4-thiouracil), modified purines (eg, 6-methyladenine, 6-thioguanosine), and other heterocyclic bases. It can be mentioned.
  • non-naturally occurring nucleic acid is a nucleic acid analog into which artificial chemical modification not naturally occurring is introduced into its backbone, and has the same property / structure as natural nucleic acid.
  • Non-naturally occurring nucleic acids include, for example, peptide nucleic acid (PNA: Peptide Nucleic Acid), peptide nucleic acid having a phosphate group (PHONA), crosslinked nucleic acid, morpholino nucleic acid, triazole linked nucleic acid and the like.
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • PONA peptide nucleic acid having a phosphate group
  • crosslinked nucleic acid morpholino nucleic acid
  • morpholino nucleic acid triazole linked nucleic acid and the like.
  • Examples include methyl phosphonate type DNA / RNA, phosphorothioate type DNA / RNA, phosphoramidate type DNA / RNA, 2'-O-methyl type DNA / RNA and the like.
  • the modified nucleic acid used in the nucleic acid aptamer of the present invention is preferably a crosslinked nucleic acid and / or a phosphorothioate modified nucleic acid.
  • the modified nucleic acid may be contained in any region of the nucleic acid aptamer of the present invention, it is particularly preferable that the crosslinked nucleic acid be contained in the guide RNA recognition region of the nucleic acid aptamer as described in detail below. .
  • a complex containing a guide RNA and a nuclease means a complex capable of inducing a nuclease specifically at a site recognized by the guide RNA and interacting with a nucleic acid.
  • a complex containing a guide RNA and a nuclease is referred to as "gRNA / nuclease complex”.
  • the gRNA / nuclease complex in the present invention is originally derived from an acquired immune mechanism called Crispr-Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeat and CRISPR-associated proteins) possessed by a prokaryote.
  • the Crispr-Cas system is currently roughly divided into two classes based on the type of Cas and is further classified into six types of types I to VI (class 1 is type I, type III, IV Type 2; Type II, Type V, Type VI)
  • Class 1 is type I, type III, IV Type 2; Type II, Type V, Type VI
  • the gRNA / nuclease complex in the present invention may be derived from any of the Crispr-Cas systems.
  • nuclease in the present invention may be any nuclease of the Crispr-Cas family.
  • nucleases of the Crispr-Cas family include Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (previously called Csn1 or Csx12), Cas10, Cas12 , Cas13, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc2, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr6, Csb1, Csb1, Csb1, Csb2, Csb2, Csb2, , Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, or homologs
  • the nuclease in the present invention may be an RNA-guided nuclease (RGN) other than Cas nuclease, which can be induced by a guide RNA to interact with a target site of nucleic acid If it is, it may be any nuclease derived from any species.
  • RGN RNA-guided nuclease
  • the nuclease in the present invention may have artificial modifications or mutations as long as the nuclease is induced by the guide RNA to maintain the function of interacting with the target site of the nucleic acid.
  • the nuclease in the present invention may be either DNA nuclease or RNA nuclease, but those used for genetic modification in genome editing technology are particularly preferred. That is, the nuclease in the present invention is preferably a nuclease of Crispr-Cas family, and particularly preferably Cas9 and Cpf1 (also called Cas12a) (Takashi Yamano et al., "Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA" ", Cell, doi: 10.1016 / j. Cell. 2014.04.003). Moreover, as a preferable RNA nuclease in the present invention, for example, Cas13a and the like can be mentioned.
  • the nuclease in the present invention may be an endonuclease or a nickase. Furthermore, the nuclease in the present invention may be one in which the cleavage activity has been lost by mutation. That is, taking Cas9 as an example, the nuclease in the present invention may include wild-type Cas9 which is an endonuclease, Cas9 (D10A) which is a nickase, and dCas9 which does not have a cleavage activity. Furthermore, fusion proteins of such mutant nucleases with additional functional domains (eg, transcription activation domain, transcription repression domain, cytidine deaminase, etc.) may also be included in the nuclease in the present invention.
  • additional functional domains eg, transcription activation domain, transcription repression domain, cytidine deaminase, etc.
  • guide RNA refers to RNA having a function of guiding a gRNA / nuclease complex to a target nucleic acid to specifically bind it, including a guide sequence complementary to the target nucleic acid.
  • the structure of the guide RNA is not particularly limited as long as it has the above-described function, as long as it contains a guide sequence.
  • the guide RNA may be CRISPR RNA (crRNA), and when it is the type II Crispr-Cas system,
  • the guide RNA may be dual RNA of crRNA and trans-activating crRNA (tracrRNA).
  • the guide RNA in the present invention may be a single-stranded guide RNA (sgRNA) in which a crRNA and a tracrRNA are linked by a linker.
  • sgRNA single-stranded guide RNA
  • crRNA has a guide sequence of about 16 to 24 bases complementary to a target nucleic acid and a repeat region
  • tracrRNA is an anti-repeat complementary to the repeat region. It has a region, and crRNA and tracrRNA form a double strand.
  • the nucleic acid aptamer of the present invention comprises, as a first region, a single-stranded guide RNA recognition region comprising a guide RNA recognition oligonucleotide consisting of a sequence that recognizes a guide RNA contained in gRNA / nuclease complex.
  • the “guide RNA recognition region” in the nucleic acid aptamer of the present invention means a functional structural unit for the nucleic acid aptamer to interact with the guide RNA included in the target gRNA / nuclease complex.
  • the guide RNA recognition region in the nucleic acid aptamer of the present invention contains a guide RNA recognition oligonucleotide consisting of a sequence that recognizes the guide RNA contained in the gRNA / nuclease complex.
  • a sequence that recognizes a guide RNA means that the sequence forms a base pair with at least a part of the guide RNA.
  • Base pairs may include not only G: C and A: T but also wobble base pairs such as G: T or G: U.
  • “at least a portion" of the guide RNA means 2 bases long to full length of the guide RNA.
  • the “sequence that recognizes the guide RNA” in the nucleic acid aptamer of the present invention has complementarity to 2 bases long to full length of the guide RNA.
  • the guide RNA recognition oligonucleotide need not have perfect or complete (ie, 100%) complementarity to 2 base lengths to full length of the guide RNA, and the guide RNA recognition oligonucleotide It should have a degree of complementarity capable of interacting with at least a part of the guide RNA.
  • the “guide RNA recognition oligonucleotide” in the nucleic acid aptamer of the present invention is at least 80%, 90%, 95%, 99%, or 100% sequence complementary to 2 base lengths to full length of the guide RNA. It only needs to have sex.
  • the “guide RNA recognition oligonucleotide” in the nucleic acid aptamer of the present invention is several (eg, one, two, three) in the sequence completely complementary to the 2-base length to the entire length of the guide RNA , 4, 5) bases may be inserted, deleted or substituted. Sequence complementarity can be calculated using conventional computational algorithms in the art (such as NCBI BLAST).
  • the partial sequence may be selected from any part of the guide RNA, but the guide RNA Preferably, they are selected from the guide sequences in At this time, the partial sequence selected from the guide sequences is preferably complementary to the portion adjacent to the PAM sequence in the target nucleic acid of the gRNA / nuclease complex.
  • the guide RNA recognition oligonucleotide in the nucleic acid aptamer of the present invention may be, for example, a sequence of 2 bases or more, 3 bases or more, 4 bases or more adjacent to the PAM sequence of the target nucleic acid, preferably the PAM sequence of the target nucleic acid It consists of a sequence 2-30 bases long adjacent to, particularly preferably 3-22 bases long adjacent to the PAM sequence of the target nucleic acid, most preferably 4-15 bases long adjacent to the PAM sequence of the target nucleic acid.
  • the guide RNA recognition region in the nucleic acid aptamer of the present invention may be composed only of the guide RNA recognition oligonucleotide or may contain a linker oligonucleotide.
  • the linker oligonucleotide may be any sequence, but is preferably a sequence that does not form a base pair with the guide RNA recognition oligonucleotide, and is preferably an AT-rich sequence.
  • the linker oligonucleotide may be linked to either end or both ends of the guide RNA recognition oligonucleotide, but is preferably directly linked to the second neck oligonucleotide described below without the linker sequence. Is preferred.
  • the length of the linker oligonucleotide may be arbitrary as long as the function of the guide RNA recognition region is maintained. Accordingly, the length of the guide RNA recognition region as a whole may be, for example, 6 to 50 bases, preferably 7 to 25 bases, particularly preferably 7 to 15 bases. .
  • the nucleic acid aptamer of the present invention may be composed of any nucleic acid such as DNA, RNA or modified nucleic acid as described above, but it is particularly preferable to include a crosslinked nucleic acid in the guide RNA recognition region.
  • the inclusion of the crosslinked nucleic acid in the guide RNA recognition region can further improve the inhibitory activity of the nucleic acid aptamer on the complex.
  • BNA Banded Nucleic Acid
  • 2 ', 4'-BNA also known as LNA (Locked Nucleic Acid)
  • analogs eg amino-LNA, thio-LNA, ⁇ -L-oxy- LNA, ENA (2'-O, 4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acid), AmNA (Amido-bridged Nucleic Acid), GuNA (Guanidine-bridged Nucleic Acid), scpBNA (2'-O, 4'-C) -spirocyclopropyl-bridged Nucleic Acid, cEt-BNA (constrained ethy-bridged Nucleic Acid), 3'-amino-2 ', 4'-BNA, 5'-amino-2', 4'-BNA, PrNA (2 ' -O, 4'-C-Propylene-bridged Nucleic Acid), 2 ', 4'-BNA NC (2'-O
  • the nucleic acid aptamer of the present invention is a double-stranded neck region containing a PAM sequence corresponding to the nuclease in one strand as a second region, wherein the neck region is a first neck oligo consisting of the PAM sequence It comprises a neck region comprising a nucleotide and a second neck oligonucleotide consisting of a sequence having complementarity to said PAM sequence.
  • the first neck oligonucleotide in the nucleic acid aptamer of the present invention consists of a PAM sequence recognized by nuclease in gRNA / nuclease complex.
  • PAM proto-spacer flanking motif
  • PAM sequences differ depending on the bacterial species from which the nuclease is derived and the type / subtype of nuclease. Table 1 below shows an example of a PAM sequence recognized by Cas9. For example, the PAM sequence recognized by Cas9 from S. pyogenes is known to be 5'-NGG.
  • nucleases have been generated that have been mutated to recognize a variety of different PAM sequences.
  • a large number of such nuclease and PAM sequences have been reported (eg, Cebrian-Serrano, A. & Davies, B., “Crispr-Chosholhogues and variants: optimizing the repertoire, specificity and delivery of genome engineering tools", Mamm. Genome (2017). Doi: 10.1007 / s00335-017-9967-4 and Murevec J, Pirc Z, Yang B., "New variants of CRISPR RNA-guided genome editing enzymes.”, Plant Biotechnol. J. (2017) Apr 1. doi: 10.1111 / pbi.
  • the nucleic acid aptamer of the present invention may be directed to any of the above-mentioned nuclease and PAM sequences and can be targeted to the target gRNA / nuclease complex. Depending on the appropriate PAM sequence can be selected to be used as the first neck oligonucleotide.
  • the sequence of protospacer flanking site can be used as the first neck oligonucleotide.
  • the PFS sequence is a sequence having the same function as the PAM sequence, and is present adjacent to the guide RNA-targeted sequence in the target RNA.
  • PAM sequences that can be used as the first neck oligonucleotide in the present invention may also include PFS sequences.
  • nucleases to be included in the gRNA / nuclease complex in the present invention are Cas9 and Cpf1. Therefore, in the nucleic acid aptamers of the present invention, it is preferable to use PAM sequences corresponding thereto (5'-NGG and 5'-TTTN, respectively) as the first neck oligonucleotide.
  • the second neck oligonucleotide in the nucleic acid aptamer of the present invention consists of a sequence having complementarity to the PAM sequence used as the first neck oligonucleotide.
  • the second neck oligonucleotide preferably has 100% complementarity to the PAM sequence used as the first neck oligonucleotide, but To the extent that two neck oligonucleotides can form a duplex, it can contain one or two mismatches or bulges.
  • a single-stranded guide RNA recognition region is linked to at least a second neck oligonucleotide.
  • the single stranded guide RNA recognition region forms a flap structure.
  • the single stranded guide RNA recognition region is linked to both the first neck oligonucleotide and the second neck oligonucleotide, the single stranded guide RNA recognition region forms a loop structure.
  • the single stranded guide RNA recognition region is linked such that the guide RNA recognition oligonucleotide contained therein is adjacent to the second neck oligonucleotide.
  • the nucleic acid aptamer of the present invention comprises, as a third region, a double-stranded structural stabilization region comprising a first structural stabilization oligonucleotide and a second structural stabilization oligonucleotide.
  • the first structurally stabilized oligonucleotide may consist of any nucleic acid sequence
  • the second structurally stabilized oligonucleotide may be any sequence capable of forming a duplex with the first structural stabilized oligonucleotide.
  • the nucleic acid sequence of the first structurally stabilized oligonucleotide and the second structurally stabilized oligonucleotide have at least 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, or 100% complementarity.
  • the structure stabilization region of the double strand may contain one or more (for example, one, two, three, four, five or more) mismatches or bulges. Good.
  • the first structurally stabilized oligonucleotide is added to the first neck oligonucleotide and the second structurally stabilized oligonucleotide is added to the second neck oligonucleotide and hybridized to each other to form a double stranded structure
  • the structural stabilization region of the double strand may have any length, for example, 4 bases, as long as the structure and function of the neck region and the guide RNA recognition region in the nucleic acid aptamer of the present invention are maintained. It may be a pair length or more, 6 base pair length or more, 8 base pair length or more, and preferably 6 to 20 base pair length.
  • the first structural stabilization oligonucleotide and the second structural stabilization oligonucleotide may be the same length or may be different lengths.
  • the free end of the structural stabilization region ie, the end opposite to where the neck region is linked
  • the nucleic acid aptamer of the present invention can be produced by combining the single-stranded guide RNA recognition region designed according to the above, the double-stranded neck region, and the double-stranded structural stabilization region.
  • the present invention provides a method for producing a nucleic acid aptamer that inhibits the binding activity or enzymatic activity of a complex comprising a guide RNA and a nuclease to a target nucleic acid that is a substrate of the complex.
  • the arrangement (positional relationship) of the PAM sequence in the target gene and the sequence targeted by the guide RNA differs depending on the type of Cas.
  • guide RNA target sequence the sequence targeted by the guide RNA
  • it recognizes a PAM sequence downstream of the guide RNA target sequence (ie adjacent to the 3 'end of the guide RNA target sequence), and in the case of Cpf1 upstream of the guide RNA target sequence ( That is, they recognize PAM sequences that flank the 5 'end of the guide RNA target sequence.
  • the arrangement order of the guide RNA recognition oligonucleotide and the first and / or second neck oligonucleotides in the nucleic acid aptamer of the present invention in the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction corresponds to the gRNA / nuclease complex targeted by the nucleic acid aptamer It may be changed as appropriate depending on the type of nuclease contained.
  • a nucleic acid aptamer is produced in which a single-stranded guide RNA recognition region is linked to both the first and second neck oligonucleotides (ie, a single-stranded guide RNA recognition region forms a loop structure)
  • a nucleic acid aptamer directed to a complex comprising a nuclease that recognizes a PAM sequence downstream of a guide RNA target sequence, such as Cas9, in the 5 ' ⁇ 3' direction: Second structurally stabilized oligonucleotide-second neck oligonucleotide-guided RNA recognition oligonucleotide-(linker oligonucleotide-) first neck oligonucleotide-first structurally stabilized oligonucleotide linked in sequence; (Ii) A nucleic acid aptamer directed to a complex comprising a nuclease that recognizes a PAM sequence upstream of a guide RNA
  • linker oligonucleotide— means any linker oligonucleotide. That is, the method of the present embodiment may further include the step of (6 ′) linking the guide RNA recognition oligonucleotide directly or via a linker oligonucleotide to the first neck oligonucleotide.
  • nucleic acid aptamer when producing a nucleic acid aptamer in which a single-stranded guide RNA recognition region is linked only to the second neck oligonucleotide (ie, a single-stranded guide RNA recognition region forms a flap structure), (I) A nucleic acid aptamer directed to a complex comprising a nuclease that recognizes a PAM sequence downstream of a guide RNA target sequence, such as Cas9, in the 5 ' ⁇ 3' direction: First neck oligonucleotide-first structure stabilized oligonucleotide (-) second structure stabilized oligonucleotide-second neck oligonucleotide-guided RNA recognition oligonucleotides are linked in order; (Ii) A nucleic acid aptamer directed to a complex comprising a nuclease that recognizes a PAM sequence upstream of a guide RNA target sequence, such as Cpf1, in the 5
  • the method of the present embodiment may further include the step of linking (5 ′) the first structure-stabilizing oligonucleotide and the second structure-stabilizing oligonucleotide.
  • the nucleic acid aptamers designed as described above can be produced by methods known in the art. Specifically, for example, it can be chemically synthesized by the amidite method or the phosphoramidite method. (See, for example, Nucleic Acid (Vol. 2) [1] Synthesis and Analysis of Nucleic Acid (Editor: Yukio Sugiura, Hirokawa Publishing Company)). Alternatively, it may be biosynthesized by a method using RNA polymerase or a genetic engineering method using DNA polymerase.
  • the nucleic acid aptamer of the present invention when the nucleic acid aptamer of the present invention is an RNA aptamer, it can be prepared by chemically synthesizing a template DNA containing a promoter sequence of RNA polymerase (eg, T7 promoter) and transcribing it by RNA polymerase .
  • a promoter sequence of RNA polymerase eg, T7 promoter
  • the nucleic acid aptamer of the present invention is a DNA aptamer
  • it when the nucleic acid aptamer of the present invention is a DNA aptamer, it can be prepared by chemically synthesizing a template DNA and amplifying it by PCR.
  • the nucleic acid aptamer of the present invention when producing a nucleic acid aptamer in which a single stranded guide RNA recognition region is linked only to the second neck oligonucleotide ie, the single stranded guide RNA recognition region forms a flap structure
  • the first structure stabilized oligonucleotide and the second structure stabilized oligonucleotide may be prepared at the free end of the structure stabilized region ( That is, they may be synthesized and produced as a single nucleic acid by linking at the end opposite to where the neck region is linked).
  • the first aptamer partial nucleic acid consisting of the first neck oligonucleotide-the first structure stabilizing oligonucleotide, and the second structure stabilizing oligonucleotide-the second neck oligonucleotide-guide RNA recognition oligonucleotide
  • a second aptamer partial nucleic acid may be synthesized and hybridized, or the first neck oligonucleotide-first structure stabilized oligonucleotide-second structure stabilized oligonucleotide-second
  • the neck oligonucleotide-guide RNA recognition oligonucleotide may be synthesized and produced as a single nucleic acid.
  • the nucleic acid aptamers of the invention can specifically bind to gRNA / nuclease complexes and inhibit the action of the complexes on the target sequence. Therefore, it is useful to be able to freely control its timing and accuracy by using it in combination with various existing methods based on the Crispr-Cas system including genome editing.
  • the present invention provides a method for inhibiting the binding activity or enzymatic activity of a complex comprising a guide RNA and a nuclease to a target nucleic acid which is a substrate of the complex ( 1) A method comprising the steps of: preparing a reaction solution containing the complex and the target nucleic acid; and (2) adding the nucleic acid aptamer to the reaction solution.
  • a reaction solution containing gRNA / nuclease complex and a target nucleic acid of the complex is prepared.
  • the composition of the reaction solution is not particularly limited as long as it is suitable for the enzyme activity of the nuclease, and can be appropriately determined according to the composition of the reaction solution used in the already established genome editing method .
  • the reaction solution contains a gRNA / nuclease complex and a target nucleic acid of the complex in a buffer (eg, 1 to 100 mM HEPES (pH 7.0 to pH 8.0), 1 to 100 mM Tris (pH 7.0 to preparation by adding to an aqueous solvent containing pH 8.0) and / or a salt (eg, 50 to 300 mM NaCl, 50 to 300 mM KCl, 0 to 100 mM MgCl 2 and the like) it can.
  • the final concentration of gRNA / nuclease complex in the reaction solution may be, for example, in the range of 10 to 300 nM.
  • the final concentration of the target nucleic acid in the reaction solution may be, for example, in the range of 1 to 1000 nM.
  • the reaction time of the gRNA / nuclease complex and the target nucleic acid of the complex can be appropriately determined depending on the type of nuclease used, and can be performed, for example, for 5 minutes to 24 hours.
  • a nucleic acid aptamer is added to the reaction solution.
  • the addition amount of the nucleic acid aptamer can be appropriately determined, for example, in the final concentration range of 0.1 to 1000 nM.
  • the inhibition reaction by the nucleic acid aptamer can preferably be performed for 5 minutes to 24 hours.
  • the gRNA / nuclease complex and the nucleic acid aptamer may be added to the reaction solution sequentially or simultaneously.
  • the nucleic acid aptamer can be added after reacting the gRNA / nuclease complex with the target nucleic acid, which can stop the excess enzymatic reaction of the complex.
  • the nucleic acid aptamer can be added together when preparing a reaction solution containing the gRNA / nuclease complex and the target nucleic acid, which can control the degree and accuracy of the enzyme reaction of the complex. . That is, the gRNA / nuclease complex, the target nucleic acid of the complex, and the nucleic acid aptamer may all be added simultaneously to the aqueous solvent containing the buffer and / or the salt.
  • the present invention is, according to a fourth embodiment, a method for inhibiting the binding activity or enzymatic activity of a complex comprising a guide RNA and a nuclease to a target nucleic acid which is a substrate of the complex, which comprises Introducing the complex into a cell containing a target nucleic acid, and (2) introducing the nucleic acid aptamer into the cell.
  • the gRNA / nuclease complex is introduced into cells containing the target nucleic acid.
  • the cells are not particularly limited as long as they contain the target nucleic acid of interest, and cells of any living species such as prokaryotes such as E. coli, fungi such as yeast, insects, plants, and animals can be used.
  • Preferred cells in the method of the present embodiment are cells of plant or animal origin, particularly preferably cells of a mammal such as human.
  • the type of animal cell is not particularly limited, and cells isolated from any tissue, fertilized eggs, cultured cells and the like can be used.
  • the target nucleic acid contained in the cell may be an endogenous nucleic acid such as genomic DNA or mitochondrial DNA, or an exogenous nucleic acid such as a plasmid vector.
  • the gRNA / nuclease complex can be performed according to the already established genome editing protocol.
  • the previously prepared gRNA and nuclease may be introduced into cells by lipofection, microinjection, electroporation or the like.
  • the gRNA / nuclease complex may be expressed in cells by introducing an expression vector containing a nucleic acid encoding gRNA and / or nuclease into the cells and then culturing the cells.
  • an appropriate viral vector or non-viral vector can be selected and used depending on the type of cell into which the gRNA / nuclease complex is to be introduced.
  • the nucleic acid aptamer is then introduced into the cells.
  • the introduction of the nucleic acid aptamer into cells can be performed by a known method according to the type of cells, and can be performed, for example, by lipofection, microinjection, electroporation or the like.
  • the cells after introduction of the nucleic acid aptamer are preferably cultured for 1 to 7 days under appropriate culture conditions according to the type.
  • the nucleic acid aptamer and the gRNA / nuclease complex may be introduced into cells sequentially or simultaneously.
  • the nucleic acid aptamer can be introduced 1 to 6 hours after the introduction of the gRNA / nuclease complex into cells, which can suppress the excess enzyme activity of the complex.
  • the nucleic acid aptamer can be introduced into the cell simultaneously with the gRNA / nuclease complex, which can control the degree and accuracy of the enzyme reaction of the complex.
  • the present invention comprises (1) introducing into a cell a complex comprising a guide RNA and a nuclease of Crispr-Cas family, and (2) introducing the nucleic acid aptamer into the cell. And a step of genome editing.
  • the method of this embodiment performs genome editing by using the target nucleic acid in the fourth embodiment as genomic DNA and using the gRNA / Cas nuclease complex as the gRNA / nuclease complex in the fourth embodiment It is.
  • the cells that can be used in the method of this embodiment are the same as those in the fourth embodiment.
  • introduction of gRNA / Cas nuclease complex and / or nucleic acid aptamer into cells can be carried out by the same procedure as in the method of the fourth embodiment.
  • the existing methods based on the Crispr-Cas system, including genome editing, are useful because the timing, accuracy, degree, etc. can be freely controlled. .
  • a nucleic acid aptamer for His-Cas9 protein prepared by E. coli expression system was obtained by SELEX method. The details are as follows.
  • His-Cas9 protein (Streptococcus pyogenes Cas9) is bound to His-linked magnetic beads (Thermo Fisher Scientific, 10103D) and binding buffer (10 mM Tris / HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 , tRNA) Washed with Thereafter, a chemically synthesized nucleic acid library (N17, N19, N21, N23) and magnetic beads to which His-Cas9 protein was bound were incubated in binding buffer at room temperature for 1 hour. Then, after washing three times with binding buffer, elution was carried out at 98 ° C. for 3 minutes to recover a nucleic acid bound to His-Cas9 protein.
  • N G, A, T or C, and U is deoxyuridine.
  • Example 2-1 Secondary screening of candidate aptamers based on inhibitory activity against Cas9 Cleavage of a plasmid containing the EGFP (GFP) sequence with Cas9 and GFP-targeting sgRNA (sgRNA: sgRNA with a guide sequence designed to target the GFP-g1 site) is in the presence of the candidate aptamer It was tested whether it was inhibited.
  • sgRNA sgRNA with a guide sequence designed to target the GFP-g1 site
  • the candidate aptamer has no inhibitory activity on Cas9
  • the complex of Cas9 and sgRNA (GFPg1) cleaves the GFP sequence in the plasmid.
  • the candidate aptamer has an inhibitory activity on Cas9, the above cleavage is suppressed.
  • the sequence of GFP contained in the plasmid is as follows.
  • GFP (SEQ ID NO: 67)
  • s21, s36 and s40 have high Cas9 inhibitory activity among the 60 candidate aptamers of s1 to s55, C1, C2, C4, C6, and C95.
  • Ep159”, “Ep84” and “GslG” are negative controls using unrelated nucleic acid aptamer sequences, and none of them showed any Cas9 inhibitory activity.
  • sgCCR5 is the result when sgRNA (sgRNA (CCR5)) having a guide sequence designed to target another sequence (sequence of CCR5) in place of the candidate aptamer is added. No competitive inhibitory effect was observed with concentrations 30 nM and 100 nM sgRNA (CCR5).
  • GFP-targeting sgRNA sgRNA (GFPg1)
  • GFPg1 GFP-targeting sgRNA
  • CCR5 sequence of sgRNA
  • Ep 159, Ep 84, GslG unrelated nucleic acid aptamer sequence
  • Example 2-1 the inhibitory activity of the aptamer was evaluated by the same procedure as in Example 2-1 unless otherwise noted.
  • Example 2-2 Re-evaluation of inhibitory activity of candidate aptamers
  • concentration of the aptamer was changed to re-evaluate the inhibitory activity.
  • the inhibitory activity of the aptamer was evaluated by the same procedure as in Example 2-1 above.
  • Example 3 Analysis of correlation between sequence / structure of nucleic acid aptamer and inhibitory activity by mutation introduction experiment
  • s21 which showed high inhibitory activity against Cas9 / sgRNA (GFP-g1)
  • GFP-g1 Cas9 / sgRNA
  • the secondary structure as shown in FIG. 3 was considered to form a
  • the nucleic acid aptamer was divided into the following three regions, and mutational analysis was performed.
  • Neck region forming a double strand. It is a variable region having a random sequence in the library.
  • Guide RNA recognition region A single stranded loop structure is formed. It is a variable region having a random sequence in the library.
  • Example 3-1 Mutagenesis into the guide RNA recognition region
  • a truncated mutant aptamer having different lengths of the guide RNA recognition region is synthesized, leaving a sequence common to s21 and s36 (s21-1, s21-2, s21-3, s21-4, s21-5) , S21-6, Tetra), Cas9 / sgRNA (GFP-g1) were examined for inhibitory activity.
  • the sequences of mutant aptamers are shown in Table 5.
  • the underlined sequence (CGCC) is a sequence suggested to be important for the inhibitory activity against Cas9 / sgRNA (GFP-g1) from the results of this example.
  • nucleic acid aptamers containing sequences common to s21 and s36 (N19-M1, N19-M2, N19-13, N19-14: sequences are shown in Table 6) Were selected to evaluate their inhibitory activity.
  • a candidate aptamer (N23-meme1, whose guide RNA recognition region starts with CGCC) N23-meme2), a candidate aptamer containing CGCC at any position of the guide RNA recognition region (N23-m1, N23-m2, N23-m3), and a candidate aptamer having a mutation in the neck region of s21 and s36 (s21) -mut1, s36-mut1) was selected, and the inhibitory activity against Cas9 / sgRNA (GFP-g1) was examined.
  • the sequences of these candidate aptamers are shown in Table 7.
  • the results are shown in FIG.
  • the candidate aptamers (N23-meme1, N23-meme2) whose guide RNA recognition region starts with CGCC both showed the same level of inhibitory activity as s21.
  • candidate aptamers (N23-m1, N23-m2, N23-m3) containing CGCC at other positions of the guide RNA recognition region, and candidate aptamers having mutations in the s21 and s36 neck regions (s21-mut1, s36- All mut1) showed only weak inhibitory activity compared with s21.
  • nucleic acids (s21-2 lm1, s21-2 lm2, s21-2 lm3, s21-2 lm4, s21-2 lm5, s21-2 lm6, s21-2 lm7) in which point mutations are introduced into the guide RNA recognition region of s21-2 are prepared, The inhibitory activity was evaluated. These nucleic acid sequences are shown in Table 8 (mutation sites are underlined).
  • the structural stabilization region is 11 base pairs long (s21-2e) based on s21-2 (structural stabilization region: 12 base pairs long) 10 base pairs in length (s21-2f), 9 base pairs in length (s21-2 g), 8 base pairs in length (s21-2 a), 6 base pairs in length (s21-2 b), 3 base pairs in length (s21-2 c)
  • a nucleic acid of 0 base pair length (s21-2d) was prepared and examined for inhibitory activity against Cas9 / sgRNA (EGFP-g1). These nucleic acid sequences are shown in Table 9.
  • nucleic acid in which the sequence is substituted every two base pairs from the free end while retaining the stem structure s21-2m1 to s21-2m7) were prepared and examined for inhibitory activity against Cas9 / sgRNA (EGFP-g1). These nucleic acid sequences are shown in Table 10 (mutation sites are underlined).
  • the results are shown in FIG.
  • nucleic acid sequences (s21-2 mm1 to s21-2 mm11) into which various mutations were introduced for the neck region were prepared, and the correlation between the sequence / structure of the neck region and the inhibitory activity of the aptamer was examined in detail. These nucleic acid sequences are shown in Table 11 (mutation sites are underlined).
  • the third base pair from the base pair adjacent to the structural stabilization region in the neck region is such that the type of the base does not affect the inhibitory activity of the aptamer if the base pair is formed, the first and second base pairs
  • the sequence of the neck portion adjacent to the first CGCC sequence of the guide RNA recognition region (referred to as "sense sequence” in this example) has higher inhibitory activity in the order of TC> CC> TT, and its complementary strand It has been found that the arrangement of a certain neck portion (referred to as "antisense sequence” in this example) needs to be GG, and that the insertion of a bulge in the sense sequence is permitted (s21-2 mm11) did.
  • Example 3-4 Inhibitory Activity of Phosphorothioated Nucleic Acid Aptamer
  • phosphorothioate modification For the use of nucleic acids in vivo, it is often carried out to replace the oxygen atom of the phosphate group of the nucleic acid with a sulfur atom (phosphorothioate modification) in order to increase the stability. Therefore, it was examined whether phosphorothioate modification (hereinafter referred to as "thiolation”) affects the inhibitory activity of the aptamer.
  • the sequences of the prepared thiolated nucleic acids are shown in Table 12 (thiolated bases are indicated by ⁇ ).
  • nucleic acid (s21-ls2s1 to s21-ls2s5) obtained by thiolating 3 bases of the sense / antisense sequence of the structural stabilization region and the neck region of s21-2 (s21-ls2s1 to s21-ls2s5) All ⁇ ls2s6) had inhibitory activity, and almost no decrease in inhibitory activity was observed compared to s21-2.
  • the inhibitory activity of the nucleic acid (s21-ls2s all) obtained by thiolating all bases in the entire region of s21-2 was significantly reduced.
  • Binding buffer (20 mM Tris / HCl, pH 8.0, 250 mM NaCl): 2 pmol of Cas9 protein and 20 pmol of nucleic acid aptamer (s21, s21-2, s21-mm2, tetra, St2-1 SA (aptamer against Streptavidin)) Incubate at room temperature for 30 minutes in 1 mM MgCl 2 , 2.5% glycerol, 0.05% Tween-20, 0.05 mg / ml tRNA).
  • Example 5 Analysis of Physicochemical Interaction between Cas9 Protein and Nucleic Acid Aptamer by Surface Plasmon Resonance Analysis
  • Surface plasmon resonance analysis was performed to calculate the dissociation constant (Kd) between the Cas9 protein and the nucleic acid aptamer.
  • Kd dissociation constant
  • 5'biotin modified s21 was prepared and immobilized on a streptavidin sensor chip (GE Healthcare). Then different concentrations (2.5 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM) of Cas9 protein in running buffer (20 mM Tris / HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 , 0.005% Tween-20) The sensorgram was obtained by loading. Kd was calculated by Biacore evaluation software package (GE Healthcare, Ver. 2.0). The same test was performed using Tetra as a control.
  • Example 6 Design of Stem-Flap Type Aptamer As the first four bases of the guide RNA recognition region are important for the inhibitory activity of the Cas9 aptamer, as shown in FIG. 13, a stem flap type in which only the first four bases (CGCC) are used as the guide RNA recognition region An aptamer (s21-sf) was prepared and examined for its inhibitory activity. The sequence of s21-sf is shown below (Table 14).
  • the results are shown in FIG.
  • the newly designed stem flap structure-forming aptamer (s21-sf) was confirmed to have almost the same inhibitory activity as the aptamer (s21-2) forming the stem-loop structure.
  • Example 7-1 sgRNA Sequence Specificity of Cas9 Aptamer Since s21-2 showed high inhibitory activity against Cas9 / sgRNA (GFPg1), s21-2 also showed similar inhibitory activity against Cas9 / sgRNA complex targeting other sites on the GFP sequence We examined whether we had.
  • a complex crRNA: tracrRNA
  • crRNA and tracrRNA those purchased from Fasmac or IDT were used. The sequences of crRNA are shown in Table 15 (underlining indicates a guide sequence in crRNA).
  • crRNAs targeting different sites of GFP were respectively annealed to tracrRNA to form a crRNA: tracrRNA complex, and then s21-2 and Cas9 proteins were simultaneously added to examine the inhibitory activity of s21-2.
  • the crRNA: tracrRNA used had a final concentration of 30 nM, and the final concentration of Cas9 was 50 nM, which is the same as Example 2-1.
  • the aptamer concentration is shown in the figure.
  • FIG. s21-2 targets the same site as Cas9 / sgRNA (GFPg1): Cas9 / crRNA showed high inhibitory activity against tracrRNA (GFPg1), but targets other sites (GFP332, GFP373, GFP686) And Cas9 / crRNA: showed only weak inhibitory activity against tracrRNA.
  • GFPg1 Cas9 / sgRNA
  • s21-2 interacts with crRNA (GFPg1). Therefore, looking at the sequence of s21-2, the first four bases CGCC of the guide RNA recognition region which is important for inhibitory activity and the four bases GGCG at the 3 'end of the guide sequence in crRNA (GFPg1) are complementary. There was a possibility of forming a double strand.
  • s21-2 and s21-sf are as shown in the schematic diagram shown in FIG. 17 based on the fact that the antisense region of the neck region is the same as the PAM sequence (NGG) and the consideration based on the crystal structure of Cas9 / sgRNA. It was suggested that they bind to Cas9 / sgRNA complex in various ways.
  • the inhibitory activity of the antisense DNA (As (GFPg1)) and the antisense RNA (AsRNA (GFPg1)) against the guide sequence in sgRNA (GFPg1) was evaluated by the existing method (antisense method). Was hardly seen ( Figure 16).
  • the sequences of As (GFPg1) and AsRNA (GFPg1) are shown in Table 16.
  • Example 7-2 Design of Aptamers Based on Specificity Mechanism Stem-flap type aptamers (sf (GFP332), sf (GFP 373)) and stem-loop type aptamers (s21-2 (s21-2) to Cas9 / crRNA (GFP332) and Cas9 / crRNA (GPF373) according to the binding model shown in FIG. GFP332), s21-2 (GFP 373)) were designed, and their inhibitory activities were measured.
  • the sequences are shown in Tables 17 and 18 (sequences considered to be double stranded with guide sequences in crRNA are underlined).
  • the results are shown in FIG.
  • the stem flap type aptamers (sf (GFP332) and sf (GFP 373)) have high inhibitory activity (Cas9 / sgRNA (GFPg1) against s21 aptamer against both Cas9 / crRNA (GFP332) and Cas9 / crRNA (GPF373) Equivalent). This result strongly suggests the binding mode that we assume.
  • stem loop type aptamers (s21-2 (GFP332), s21-2 (GFP 373)) against Cas9 / crRNA (GFP332) and Cas9 / crRNA (GPF 373) have slightly lower inhibition than the corresponding stem flap type aptamers It showed activity. It is considered that the cause is that the loop length is short (7 bases) and the double strand with the guide strand in the crRNA is not sufficiently assembled.
  • s21-A s21-A
  • GFP 373 a stem-loop type aptamer in which the loop length is extended to 17 bases and A except 4 bases considered to form a double strand with the guide sequence is composed of A.
  • sequences are shown in Table 18 above
  • inhibitory activity against Cas9 / crRNA GFP 332
  • Cas9 / crRNA GPF 373
  • Example 8 Experiment on Structural Parameters of Stem-Flap Aptamer Apopters (s21-2, s21-sf) targeting the GFPg1 site for Cas9 / crRNA (GFP332) and Cas9 / crRNA (GPF373), respectively, to investigate the specificity of the stem flap type aptamer for the guide sequence Inhibitory activity of structure-free negative control aptamer (sf-0), stem flap type aptamer targeting GFP332 site (sf (GFP332)), and stem flap type aptamer targeting GFP373 site (sf (GFP 373)) evaluated.
  • the sequence of sf-0 is shown in the table.
  • sf (GFP332) showed very high inhibitory activity against Cas9 / crRNA (GFP332) and sf (GFP 373) against Cas9 / crRNA (GPF 373).
  • s21-sf (a stem flap-type aptamer targeting a GFPg1 site) showed almost no inhibitory activity against both Cas9 / crRNA (GFP332) and Cas9 / crRNA (GPF373). From this result, it was shown that the stem flap type aptamer has high sequence specificity.
  • s21-2 (a stem loop type aptamer targeting a GFPg1 site) shows some inhibitory activity against both Cas9 / crRNA (GFP332) and Cas9 / crRNA (GPF373), It is suggested that the specificity is rather low.
  • Stem flap type aptamers (sf-0, sf-2 (GFPg1), sf-3 (GFPg1), sf-4 (GFPg1), sf-5 (sf-0, sf-2 (GFPg1), s21- GFPg1), sf-6 (GFPg1); each having a flap structure of 0, 2, 3, 4, 5 or 6 bases long, and an aptamer in which a complementary sequence of the flap sequence is added to the antisense sequence of the neck region ( sf-ds) was prepared and its inhibitory activity was examined.
  • a double stranded decoy (decoy: double strand of decoy-s and decoy-as) having the same guide sequence and PAM sequence as the target DNA was used as a control.
  • the sequences of sf-2 (GFPg1), sf-3 (GFPg1), sf-4 (GFPg1), sf-5 (GFPg1), sf-6 (GFPg1), decoy-s and decoy-as are shown in Table 20.
  • sf-ds and double-stranded decoy in which the flap sequence part was made double-stranded showed only weak inhibitory activity as compared with the stem-flap type aptamer. From this result, it was suggested that the flap portion in the stem flap type aptamer is important for inhibitory activity to be single-stranded.
  • aptamers (s21-sf-T1, s21-sf-T2, s21-sf-T3) in which a sequence of 1 to 4 bases long not combining a flap portion and a double strand is added to the antisense sequence of the neck region When the inhibitory activity was evaluated, all had high inhibitory activity (FIG. 22).
  • an aptamer (s21-sf-ShortStem) in which the structure stabilization region of s21-sf is shortened to 6 base pairs in length exhibits an inhibitory activity which is not different from s21-sf (structure stabilization region: 12 base pairs in length) (Fig. 22).
  • the structural stabilization region has a length of at least 6 base pairs, the structure of the structural stabilization region does not seem to affect the inhibitory activity.
  • the sequences of s21-sf-T1, s21-sf-T2, s21-sf-T3 and s21-sf-ShortStem are as follows (Table 21).
  • Example 9 Verification Experiment of Inhibitory Activity of Aptamers for Cas9 / crRNA Targeted to Other Genes Stem flap-type aptamer (sf) against Cas9 / crRNA (EGFR-b) and Cas9 / crRNA (EGFR-c) targeting two sites (EGFR-b and EGFR-c) in the EGF receptor (EGFR) gene sequence (EGFR-b), sf (EGFR-c)) were designed, and their inhibitory activity was examined.
  • a target plasmid a plasmid containing a gene sequence of a fusion protein of human EGF receptor and GFP was used.
  • the gene sequence of the EGF receptor is as follows.
  • EGF receptor (SEQ ID NO: 159)
  • the results are shown in FIG.
  • the stem flap type aptamers sf (EGFR-b) and sf (EGFR-c) against Cas9 / crRNA (EGFR-b) and Cas9 / crRNA (EGFR-c) are targeted to the GFP analyzed in the previous example Cas9 Only slightly lower inhibitory activity was obtained compared to the stem flap type aptamer for / crRNA. It is considered that the cause of this is that the sequence in which the crRNA and the aptamer form a duplex is AT-rich, and the duplex is less likely to be formed between the two.
  • an aptamer sf5 (EGFR-b), sf5 (EGFR-c), sf5 (EGFR-c) in which the length of the flap structure is extended to 5 bases or 6 bases in order to easily form a double strand ), Sf6 (EGFR-c)
  • sf5 EGFR-b
  • EGFR-c sf5
  • EGFR-c antisense DNA
  • EpCAM stem flap type aptamer
  • EpCAM Cas9 / crRNA
  • the results are shown in FIG.
  • the stem flap type aptamer (sf (EpCAM)) for Cas9 / crRNA (EpCAM) also showed high inhibitory activity as the stem flap type aptamer for Cas9 / crRNA targeting other genes.
  • Cpf1 which is a Crispr genome editing enzyme frequently used next to Cas9 was used as a Cas9 homolog.
  • Cpf1 recognizes a PAM sequence (TTTN) upstream (that is, adjacent to the 5 'end) of a guide RNA target sequence in a target gene and cleaves double-stranded DNA of the target gene. Therefore, in the case of a stem flap type aptamer for Cpf1 / crRNA, it is necessary to place a flap structure portion at the opposite end (that is, the 5 'end) to that of a stem flap type aptamer for Cas9 / crRNA It should be. Therefore, as shown in FIG.
  • a stem flap type aptamer (sf-c (GFPa)) targeting Cpf1 / crRNA and a crRNA (GFPa) targeting GFP were designed, and the inhibitory activity of the aptamer was evaluated. Furthermore, in the Cas9 inhibitory aptamer, since G: T base pairs in the neck region contributed to the increase in inhibitory activity, three stem flap type aptamers (sf-c1 (GFPa), similarly introduced with T: G base pairs, sf-c2 (GFPa) and sf-c3 (GFPa) were also produced. The same plasmid as that used in Example 2 was used as the plasmid containing the GFP gene. The Cpf1 enzyme and crRNA used were purchased from IDT.
  • crRNA The sequences of crRNA (GFPa) and the aptamer are shown in Table 25.
  • the underline indicates a sequence considered to be double-stranded with crRNA.
  • a final concentration of 60 nM Cpf1 and a final concentration of 50 nM crRNA (GFPa) are mixed in buffer (50 mM Tris / HCl pH 7.9, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 , 100 ug / ml BSA) for 20 minutes Let stand. Thereafter, a final concentration of 3 nM of plasmid and aptamer were added and incubated at 37 ° C. for 10 minutes. Thereafter, cleavage of the plasmid was observed by 0.65% agarose gel electrophoresis.
  • the results are shown in FIG.
  • the stem flap type aptamer designed to Cpf1 / crRNA also showed high inhibitory activity like the stem flap type aptamer to Cas9 / crRNA.
  • all aptamers in which a T: G mismatch was inserted in the neck region showed a decrease in inhibitory activity.
  • crRNA for three target sequences of EGFR (EGFR-1, EGFR-2, EGFR-3) and the corresponding stems Flap-type aptamers (sf-c (EGFR-1), sf-c (EGFR-2), sf-c (EGFR-3)) were designed and examined for their inhibitory activity.
  • the three target sequences of EGFR and the sequences of stem flap type aptamers corresponding to each are shown in Table 26. In the table, the underline indicates a sequence considered to be double-stranded with crRNA.
  • a reporter cell line (293-mScarlet) was generated in which a fluorescent protein (mScarlet) was expressed when genome editing occurred.
  • 293-mScarlet cells were generated by inserting a reporter cassette in which the target sequence having a stop codon was inserted upstream of the coding sequence of mScarlet into the HEK 293 genome by the Thermo Fisher Scientific Flp-In system. 293-mScarlet cells do not express mScarlet before genome editing, due to the presence of a stop codon upstream of the mScarlet coding sequence.
  • reporter cassette The sequence of the above reporter cassette is shown below.
  • the lower case letters indicate the mScarlet sequence, and the upper case letters indicate the target sequence including the stop codon.
  • the underline indicates the target sequence of Cas9 / crRNA, and TAG located at the 3 'end of the target sequence is a stop codon.
  • Reporter cassette target sequence-mScarlet: ATGGCGTCTTCTTCTCCATTTCACACCGAAGCAGAGTTTTTCGGATTCCCGAGTAG CAGATGACCATGACAAGTAG (SEQ ID NO: 184)
  • Cas9 protein (2 ⁇ g) / crRNA: tracrRNA (0.5 ⁇ g) complex was used for 293-mScarlet cell line seeded in a 24-well plate using LipofectamineTM CRISPRMAXTM Cas9 Transfection Reagent (Thermo Fisher Scientific) Introduced.
  • tracrRNA The introduction of the aptamer 6 hours after the introduction of Cas9 / crRNA: tracrRNA was carried out using Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific). The sequences of the crRNA and aptamer used are shown in Table 27. ⁇ Denotes a thiolated base.
  • the results are shown in FIG.
  • the aptamer was introduced into Cas9 / crRNA: tracrRNA simultaneously (Cas9 / crRNA (Sca) + sf-Sca, 0h) or after 6 hours (Cas 9 / crRNA (Sca) + sf-Sca, 6h) , Sf-Sca significantly inhibited genome editing in cells.
  • Example 12 Genome editing inhibition experiment in cells of aptamer containing LNA
  • an aptamer sf-Sca-LNA in which the flap structure portion was substituted with LNA was synthesized, and the experimental system and procedure similar to Example 11 The inhibitory activity was evaluated.
  • the aptamer (final concentration 100 nM) was introduced into cells simultaneously with Cas9 / sgRNA, and then cultured for 3 days, and microscopically observed the presence or absence of expression of mScarlet.
  • the cells after observation were collected, and the number of cells in which genome editing had occurred (cells expressing mScarlet) was counted using FACS.
  • the sequence of sf-Sca-LNA is shown in Table 28. Underlining indicates LNA (where C in LNA is 5 methyl cytosine) and ⁇ indicates a thiolated base.
  • Example 13 Inhibition experiment by LNA-modified aptamer for genome editing of endogenous gene
  • Example 13 Inhibition experiment by LNA-modified aptamer for genome editing of endogenous gene
  • HPRT1 and EMX1 were selected as the target endogenous genes.
  • the obtained complex was introduced into 293FT cells (Thermo Fisher Scientific) at the same time with the aptamer by the same procedure as Example 11, and cultured for 3 days.

Abstract

ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体の、標的核酸に対する結合活性または酵素活性を阻害する核酸アプタマーであって、以下の領域（１）～（３）：（１）前記ガイドRNAを認識する配列からなるガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを含む、一本鎖のガイドRNA認識領域、（２）前記PAM配列からなる第一のネックオリゴヌクレオチドと、前記PAM配列に対して相補性を有する配列からなる第二のネックオリゴヌクレオチドとを含む、ネック領域、および（３）第一の構造安定化オリゴヌクレオチドと、第二の構造安定化オリゴヌクレオチドとを含む、二本鎖の構造安定化領域を含んでなり、ここで、前記領域（１）が、前記第二のネックオリゴヌクレオチドに連結されてループ構造またはフラップ構造を形成し、かつ、前記領域（２）および（３）が連結されて一緒にステム構造を形成する、核酸アプタマー。

Description

ゲノム編集酵素の活性を阻害する核酸アプタマー
　本発明は、ゲノム編集酵素の活性を阻害する核酸アプタマーに関する。
　ゲノム編集法として、Zinc finger、TALEN、Crispr-Cas9を利用した方法が知られており、中でもCrispr-Cas9を用いたゲノム編集法が、その効率の高さと簡便性から、広範な細胞または生物種を対象として多くの研究において採用されている。Crispr-Cas9は、ガイドRNAとともに複合体を形成し、ガイドRNAの一部と相補的な配列およびそれに隣接するPAM配列を持つDNAを認識して切断する。DNAの切断部位が修復される過程で生じる塩基の挿入または欠失などにより、遺伝子を改変(例えば、ノックアウト)することができる。
　また、Crispr-Cas9によるDNAの切断がDNA修復機構を促進することを利用した、相同組換えまたは非相同末端結合(NHEJ)による外来遺伝子の導入方法も開発されている。さらに、dCas9(切断活性のないCas9変異体)とデアミナーゼを用いた一塩基編集技術や、dCas9とDNA(脱)メチル化酵素を用いたエピゲノム編集技術なども報告されている。例えば、特許文献１は、dCas9と異種機能ドメイン(例えば、転写活性化ドメイン)との融合タンパク質を開示している。
　Crispr-Cas9を特異的に阻害する方法を確立できれば、ゲノム編集を時間的・空間的に制御することが可能となり、上記のような種々の手法を、さらに様々な用途に適用することが可能となる。また、Cas9は、標的以外の部位を切断してしまうオフターゲット作用を有することが知られるが、Crispr-Cas9の阻害剤を用いて酵素反応時間を限定できれば、ゲノム編集におけるオフターゲット作用を軽減できることが期待される。
特表２０１６－５１２２６４号公報
　本発明は、ゲノム編集酵素の標的配列への結合を阻害することにより、ゲノム編集酵素の標的配列への作用を阻害することができる核酸アプタマーを提供することを目的としてなされたものである。
　本発明者らは、鋭意研究の結果、ゲノム編集酵素に特異的に結合し、その活性を阻害できる核酸アプタマーを得ることに成功した。
　すなわち、本発明は、一実施形態によれば、ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体の、前記複合体の基質である標的核酸に対する結合活性または酵素活性を阻害する核酸アプタマーであって、以下の領域（１）～（３）：（１）前記ガイドRNAを認識する配列からなるガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを含む、一本鎖のガイドRNA認識領域、（２）前記ヌクレアーゼに対応するPAM配列を片鎖に含む二本鎖のネック領域であって、前記ネック領域が、前記PAM配列からなる第一のネックオリゴヌクレオチドと、前記PAM配列に対して相補性を有する配列からなる第二のネックオリゴヌクレオチドとを含む、ネック領域、および（３）第一の構造安定化オリゴヌクレオチドと、第二の構造安定化オリゴヌクレオチドとを含む、二本鎖の構造安定化領域を含んでなり、ここで、前記領域（１）が、前記第二のネックオリゴヌクレオチドに連結されてフラップ構造を形成し、または、前記領域（１）が、前記第一のネックオリゴヌクレオチドおよび前記第二のネックオリゴヌクレオチドに連結されたループ構造であって、前記領域（１）における前記ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドが前記第二のネックオリゴヌクレオチドに隣接している、ループ構造を形成し、かつ、前記領域（２）および前記領域（３）が連結されて一緒にステム構造を形成する、核酸アプタマーを提供するものである。
　前記ヌクレアーゼはCrispr-Casファミリーのヌクレアーゼであることが好ましい。
　前記領域（１）における前記ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドは、前記標的核酸のPAM配列に隣接する2～30塩基長の配列からなることが好ましい。
　前記領域（１）における前記ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドは、前記標的核酸のPAM配列に隣接する3～22塩基長の配列からなることがより好ましい。
　前記領域（１）は、6～50塩基長であることが好ましい。
　前記領域（１）は、架橋型核酸を含むことが好ましい。
　前記領域（２）は、ミスマッチまたはバルジを含んでもよい。
　前記領域（２）における前記第一のネックオリゴヌクレオチドは5’-NGG-3’であり、前記複合体はCrispr-Cas9であることが好ましい。
　前記領域（２）における前記第一のネックオリゴヌクレオチドは5’-TTTN-3’であり、前記複合体はCRISPR-Cpf1であることが好ましい。
　前記領域（３）は、4塩基対長以上であることが好ましい。
　上記核酸アプタマーは、ホスホロチオエート修飾を含んでもよい。
　また、本発明は、一実施形態によれば、ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体の、前記複合体の基質である標的核酸に対する結合活性または酵素活性を阻害する核酸アプタマーを製造する方法であって、（１）前記ガイドRNAを認識する配列からなるガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを決定するステップと、（２）前記ヌクレアーゼに対応するPAM配列からなる第一のネックオリゴヌクレオチドと、前記第一のネックオリゴヌクレオチドに対して相補性を有する配列からなる第二のネックオリゴヌクレオチドとを決定するステップと、（３）第一の構造安定化オリゴヌクレオチドと、第二の構造安定化オリゴヌクレオチドとを決定するステップと、（４）前記第一のネックオリゴヌクレオチドに、前記第一の構造安定化オリゴヌクレオチドを付加するステップと、（５）前記第二のネックオリゴヌクレオチドに、前記第二の構造安定化オリゴヌクレオチドを付加するステップと、（６）前記ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを、第二のネックオリゴヌクレオチドに連結するステップと、（７）前記ステップ（１）～（６）により設計された配列を含む核酸を合成するステップとを含む、方法を提供するものである。
　上記方法は、（５’）前記第一の構造安定化オリゴヌクレオチドと、前記第二の構造安定化オリゴヌクレオチドとを連結するステップをさらに含むことが好ましい。
　あるいは、上記方法は、（６’）前記ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを、直接またはリンカーオリゴヌクレオチドを介して第一のネックオリゴヌクレオチドに連結するステップをさらに含むことが好ましい。
　また、本発明は、一実施形態によれば、ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体の、前記複合体の基質である標的核酸に対する結合活性または酵素活性を阻害する方法であって、（１）前記複合体と前記標的核酸とを含む反応液を調製するステップと、（２）上記核酸アプタマーを前記反応液に添加するステップとを含む、方法を提供するものである。
　また、本発明は、一実施形態によれば、細胞内において、ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体の、前記複合体の基質である標的核酸に対する結合活性または酵素活性を阻害する方法であって、（１）標的核酸を含む細胞に前記複合体を導入するステップと、（２）上記核酸アプタマーを前記細胞に導入するステップとを含む、方法を提供するものである。
　また、本発明は、一実施形態によれば、（１）ガイドRNAとCrispr-Casファミリーのヌクレアーゼとを含む複合体を細胞に導入するステップと、（２）上記核酸アプタマーを前記細胞に導入するステップとを含む、ゲノム編集方法を提供するものである。
　本発明の核酸アプタマーは、Crispr-Casシステムに基づくゲノム編集酵素の標的配列への結合を阻害することにより、ゲノム編集酵素の標的配列への作用を時間的・空間的に制御することができる。また、核酸を原料としているため、抗体と比較して、細胞への導入も容易である。そのため、本発明の核酸アプタマーは、以下のような優れた効果を奏し、有用である。
　（１）本発明の核酸アプタマーを用いることにより、インビトロまたはインビボ(細胞内または動物個体内)においてゲノム編集のタイミングや精度を制御でき、ゲノム編集酵素複合体の標的配列への不必要かつ不本意な作用を低減または回避することができる。
　（２）インビトロまたはインビボ(細胞内または動物個体内)においてゲノム編集酵素複合体を用いて核酸を切断する際、本発明の核酸アプタマーを低濃度で用いる、または、結合特異性を弱めた核酸アプタマーを用いることにより、ゲノム編集酵素複合体の活性を部分的に抑制できる。その結果としてゲノム編集酵素複合体が標的配列のみに正確に作用でき、オフターゲット効果を最小化することができる。
　（３）異なる配列を標的とする複数のCas9/sgRNA複合体を細胞に同時に導入されている場合に、特定のCas9/sgRNA複合体の活性のみを阻害できる。
　（４）本発明のアプタマーに、他の物質を認識する機能性核酸を連結することにより、前記他の物質を用いてゲノム編集酵素複合体に対する阻害活性を自在に制御することが可能となる。
　（５）ファージ療法において、標的の病原菌がCrispr-Casシステムを有する場合、病原菌がファージに対する免疫を獲得するため、ファージが感染できなくなるが、本発明の核酸アプタマーを用いることにより、この問題を回避できる。本発明の核酸アプタマーを用いて病原菌のCrispr-Casシステムを抑制することにより、ファージの病原菌に対する感染能を持続させることができ、ファージ療法の効果を高めることができる。
　（６）RNAを基質とするCrispr-Casシステムを用いたウイルス感染の診断キットと本発明の核酸アプタマーを併用することにより、疑陽性検出を低減でき、診断の精度を高めることが可能となる。
図１は、SELEXで得られたCas9に対する候補アプタマーの、Cas9/sgRNA(GFPg1)による標的部位切断に対する阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。s21、s36およびs40が高い阻害活性を有することが示された。 図２は、候補アプタマーs21、s36およびs40の、Cas9/sgRNA(GFPg1)による標的部位切断に対する阻害活性の濃度依存性を、in vitroでのアッセイにより確認した結果を示す図である。 図３は、s21の二次構造を示す模式図である。 図４は、s21のガイドRNA認識領域を短くした変異体(truncation mutant)の、Cas9/sgRNA(GFPg1)による標的部位切断に対する阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。 図５は、s21およびs36のガイドRNA認識領域に変異を導入したアプタマーの、Cas9/sgRNA(GFPg1)による標的部位切断に対する阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。 図６は、s21-2のガイドRNA認識領域に点突然変異を導入したアプタマーの、Cas9/sgRNA(GFPg1)による標的部位切断に対する阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。 図７は、s21-2の構造安定化領域の長さを変更したアプタマーの、Cas9/sgRNA(GFPg1)による標的部位切断に対する阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。 図８は、s21-2の構造安定化領域の配列を変更したアプタマーの、Cas9/sgRNA(GFPg1)による標的部位切断に対する阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。 図９は、s21-2のネック領域に変異を導入したアプタマーの、Cas9/sgRNA(GFPg1)による標的部位切断に対する阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。 図１０は、s21-2にホスホロチオエート修飾を導入したアプタマーの、Cas9/sgRNA(GFPg1)による標的部位切断に対する阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。 図１１は、s21ベースのアプタマーとCas9との相互作用を、ゲルシフトアッセイにより評価した結果を示す図である。 図１２は、s21ベースのアプタマーとCas9との相互作用を、表面プラズモン共鳴アッセイにより評価した結果を示す図である。 図１３は、s21-2(ステムループ型アプタマー)およびs21-sf(ステムフラップ型アプタマー)の二次構造を示す模式図である。 図１４は、s21ベースのステムフラップ型アプタマーの、Cas9/sgRNA(GFPg1)による標的部位切断に対する阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。 図１５は、s21-2の、異なる配列を標的とするCas9/crRNAに対する阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。 図１６は、sgRNA中のガイド配列に対するアンチセンスDNAおよびアンチセンスRNAの、Cas9/sgRNA(GFPg1)による標的部位切断に対する阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。 図１７は、アプタマーによるCas9/sgRNAに対する阻害メカニズムの模式図である。 図１８は、Cas9/crRNA(GFP332)およびCas9/crRNA(GFP373)に対するステムループ型アプタマーおよびステムフラップ型アプタマーの阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。 図１９は、ステムループ型アプタマーのループ構造の長さが阻害効果に与える影響を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。 図２０は、ステムフラップ型アプタマーのCas9/crRNAに対する阻害効果の、crRNA配列特異性を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。 図２１は、ステムフラップ型アプタマーのフラップ構造の長さが阻害効果に与える影響を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。 図２２は、ステムフラップ型アプタマーのフラップ構造と反対側の末端に対する塩基の付加が阻害効果に与える影響を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。 図２３は、EGFR遺伝子を標的とするCas9/crRNAに対するステムフラップ型アプタマーの阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。 図２４は、フラップ構造の長さがステムフラップ型アプタマーの阻害効果に与える影響を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。 図２５は、EpCAM遺伝子を標的とするCas9/crRNAに対するステムフラップ型アプタマーの阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。 図２６は、ステムフラップ型アプタマーによるCpf1/crRNAに対する阻害メカニズムの模式図である。 図２７は、ステムフラップ型アプタマーの、Cpf1/crRNA(GFPa)による標的部位切断に対する阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。 図２８は、EGFR遺伝子を標的とするCpf1/crRNAに対するステムフラップ型アプタマーの阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。 図２９は、細胞内ゲノムに導入された標的配列-mScarletレポーターカセットを標的とするCas9/crRNA:tracrRNA複合体による標的ゲノム編集に対する、ステムフラップ型アプタマーの阻害効果を確認した蛍光顕微鏡像を示す図である。 図３０は、細胞内ゲノムに導入された標的配列-mScarletレポーターカセットを標的とするCas9/crRNA:tracrRNA複合体による標的ゲノム編集に対する、フラップ構造部分にLNA修飾を導入したアプタマーの阻害効果を確認した蛍光顕微鏡像を示す図である。 図３１は、図３０に示す細胞を回収し、FACSにより定量化した結果を示すグラフである。 図３２は、ゲノムに導入された標的配列-mScarletレポーターカセットを標的とするCas9/crRNA:tracrRNA複合体による、細胞内における標的ゲノム編集に対する、フラップ構造部分にLNA修飾を導入したアプタマーの阻害効果の濃度依存性を確認した蛍光顕微鏡像を示す図である。 図３３は、図３２に示す細胞を回収し、FACSにより定量化した結果を示すグラフである。 図３４は、内在遺伝子を標的とするCas9/crRNA:tracrRNA複合体による、細胞内における標的ゲノム編集に対するアプタマーの阻害効果を、インデルの検出に基づき評価した結果を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。
　本発明は、第一の実施形態によれば、ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体の、前記複合体の基質である標的核酸に対する結合活性または酵素活性を阻害する核酸アプタマーであって、以下の領域（１）～（３）：（１）前記ガイドRNAを認識する配列からなるガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを含む、一本鎖のガイドRNA認識領域、（２）前記ヌクレアーゼに対応するPAM配列を片鎖に含む二本鎖のネック領域であって、前記ネック領域が、前記PAM配列からなる第一のネックオリゴヌクレオチドと、前記PAM配列に対して相補性を有する配列からなる第二のネックオリゴヌクレオチドとを含む、ネック領域、および（３）第一の構造安定化オリゴヌクレオチドと、第二の構造安定化オリゴヌクレオチドとを含む、二本鎖の構造安定化領域を含んでなり、ここで、前記領域（１）が、前記第二のネックオリゴヌクレオチドに連結されてフラップ構造を形成し、または、前記領域（１）が、前記第一のネックオリゴヌクレオチドおよび前記第二のネックオリゴヌクレオチドに連結されたループ構造であって、前記領域（１）における前記ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドが前記第二のネックオリゴヌクレオチドに隣接している、ループ構造を形成し、かつ、前記領域（２）および前記領域（３）が連結されて一緒にステム構造を形成する、核酸アプタマーである。
　本発明において、「核酸アプタマー」とは、高い親和性で標的分子(本発明においては、ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体)と特異的に結合できる核酸分子を意味する。核酸アプタマーは、標的分子に特異的に結合することにより、標的分子の活性を阻害する作用を有し得る。核酸アプタマーを構成する核酸は、特に限定されず、例えば、DNA、RNA、修飾核酸などであってよく、これらの１種のみまたは２種以上を組み合わせて核酸アプタマーを構成することができる。よって、本発明における核酸アプタマーは、DNAアプタマー、RNAアプタマー、DNA/RNAキメラ型核酸アプタマー、およびそれらの一部に修飾核酸を含むアプタマーなどであってよい。好ましくは、本発明における核酸アプタマーは、DNAアプタマーである。
　本明細書において、修飾核酸とは、非天然ヌクレオチドにより構成される核酸、または非天然核酸をいう。ここで、「非天然ヌクレオチド」とは、天然には存在しない人工的な化学修飾を塩基または糖を含むヌクレオチドであって、天然のヌクレオチドと同様の性質／構造を有するものをいう。種々の非天然ヌクレオチドが公知であり、例えば、脱塩基ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、2’-デオキシウリジン、α-デオキシリボヌクレオシド、β-L-デオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾(例えば、置換五単糖(2’-O-メチルリボース、2’-デオキシ-2’-フルオロリボース、3’-O-メチルリボース、1’, 2’-デオキシリボース)、アラビノース、置換アラビノース糖、置換六単糖、α－アノマー糖など)を有するヌクレオシドを含む非天然ヌクレオチドなどが挙げられる。また、本明細書における非天然ヌクレオチドは、塩基アナログまたは修飾塩基を含むヌクレオチドであってもよい。塩基アナログには、例えば、2-オキソ(1H)-ピリジン-3-イル基、5位置換-2-オキソ(1H)-ピリジン-3-イル基、2-アミノ-6-(2-チアゾリル)プリン-9-イル基、2-アミノ-6-(2-チアゾリル)プリン-9-イル基、2-アミノ-6-(2-オキサゾリル)プリン-9-イル基などが挙げられる。修飾塩基には、例えば、修飾ピリミジン(例えば、5-ヒドロキシシトシン、5-フルオロウラシル、4-チオウラシル)、修飾プリン(例えば、6-メチルアデニン、6-チオグアノシン)、およびその他の複素環塩基などが挙げられる。また、本明細書において、「非天然核酸」とは、その骨格に天然には存在しない人工的な化学修飾が導入された核酸アナログであって、天然の核酸と同様の性質／構造を有するものをいう。非天然核酸には、例えば、ペプチド核酸(PNA：Peptide Nucleic Acid)、ホスフェート基を有するペプチド核酸(PHONA)、架橋化核酸、モルホリノ核酸、トリアゾール連結核酸などが挙げられる。メチルホスホネート型DNA/RNA、ホスホロチオエート型DNA/RNA、ホスホルアミデート型DNA/RNA、2’-O-メチル型DNA/RNAなどが挙げられる。
　本発明の核酸アプタマーにおいて用いられる修飾核酸は、好ましくは、架橋化核酸および／またはホスホロチオエート修飾核酸である。また、修飾核酸は、本発明の核酸アプタマーのいずれの領域において含まれてもよいが、以下に詳述するように、核酸アプタマーのガイドRNA認識領域において架橋化核酸が含まれることが、特に好ましい。
　本発明において、「ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体」とは、ガイドRNAにより認識される部位特異的にヌクレアーゼが誘導され、核酸と相互作用することができる複合体を意味する。以降、本明細書では、ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体を「gRNA／ヌクレアーゼ複合体」と記載する。本発明におけるgRNA／ヌクレアーゼ複合体は、元来、原核生物が有するCrispr-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeat and CRISPR-associated proteins)と呼ばれる獲得免疫機構に由来する。Crispr-Casシステムは、Casの種類に基づいて、現在のところ、2つのクラスに大別され、さらにI～VI型の6種類に分類されているが(クラス1はI型、III型、IV型；クラス2はII型、V型、VI型)、本発明におけるgRNA／ヌクレアーゼ複合体は、そのいずれのCrispr-Casシステムに由来するものであってもよい。
　したがって、本発明における「ヌクレアーゼ」は、Crispr-Casファミリーの任意のヌクレアーゼであってよい。Crispr-Casファミリーのヌクレアーゼの非限定的な例としては、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(以前はCsn1またはCsx12とも呼ばれていた)、Cas10、Cas12、Cas13、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、またはこれらのホモログなどが挙げられる。
　また、本発明におけるヌクレアーゼは、Casヌクレアーゼ以外のRNA誘導型ヌクレアーゼ(RNA-guided nuclease：RGN)であってもよく、ガイドRNAにより誘導されて核酸の標的部位に対して相互作用することができるものであれば、任意の生物種に由来する任意のヌクレアーゼであってよい。また、本発明におけるヌクレアーゼは、ガイドRNAにより誘導されて核酸の標的部位に対して相互作用する機能を維持している限り、人工的な修飾または変異を有するものであってよい。
　本発明におけるヌクレアーゼは、DNAヌクレアーゼまたはRNAヌクレアーゼのいずれであってもよいが、ゲノム編集技術において遺伝子改変のために用いられるものが特に好ましい。すなわち、本発明におけるヌクレアーゼは、好ましくはCrispr-Casファミリーのヌクレアーゼであり、特に好ましくはCas9およびCpf1(Cas12aとも呼ばれる)(Takashi Yamano et al., "Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA", Cell, doi：10.1016/j.cell.2016.04.003)である。また、本発明における好ましいRNAヌクレアーゼとしては、例えばCas13aなどが挙げられる。
　さらに、本発明におけるヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼであってもよいし、ニッカーゼであってもよい。さらに、本発明におけるヌクレアーゼは、変異により切断活性が失われたものであってもよい。すなわち、Cas9を例とすれば、本発明におけるヌクレアーゼには、エンドヌクレアーゼである野生型Cas9、ニッカーゼであるCas9(D10A)、切断活性を有しないdCas9のいずれもが含まれてよい。さらに、そのような変異ヌクレアーゼと追加の機能ドメイン(例えば、転写活性化ドメイン、転写抑制化ドメイン、シチジンデアミナーゼなど)との融合タンパク質も、本発明におけるヌクレアーゼに含まれてよい。
　本発明において、「ガイドRNA」とは、標的核酸に対して相補的なガイド配列を含み、gRNA／ヌクレアーゼ複合体を標的核酸へとガイドして特異的に結合させる機能を有するRNAを意味する。ガイドRNAの構造は、ガイド配列を含みさえすれば、上記機能を有する限りにおいて特に限定されない。例えば、本発明におけるgRNA／ヌクレアーゼ複合体がI型のCrispr-Casシステムである場合には、ガイドRNAはCRISPR RNA(crRNA)であってよく、II型のCrispr-Casシステムである場合には、ガイドRNAはcrRNAとtrans-activating crRNA(tracrRNA)とのデュアルRNAであってよい。また、本発明におけるガイドRNAは、crRNAとtracrRNAとがリンカーにより連結された一本鎖ガイドRNA(sgRNA)であってもよい。例えば、Crispr-Casシステムにおいては、crRNAは、標的核酸に対して相補的な約16塩基～24塩基長のガイド配列とリピート領域とを有し、tracrRNAは、当該リピート領域に相補的なアンチリピート領域を有し、crRNAとtracrRNAとが二本鎖を形成する。
　本発明の核酸アプタマーは、第1の領域として、gRNA／ヌクレアーゼ複合体に含まれるガイドRNAを認識する配列からなるガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを含む、一本鎖のガイドRNA認識領域を含む。本発明の核酸アプタマーにおける「ガイドRNA認識領域」とは、核酸アプタマーが、対象となるgRNA／ヌクレアーゼ複合体含まれるガイドRNAに相互作用するための機能構造単位を意味する。
　本発明の核酸アプタマーにおけるガイドRNA認識領域は、gRNA／ヌクレアーゼ複合体に含まれるガイドRNAを認識する配列からなるガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを含む。ここで、「ガイドRNAを認識する配列」とは、当該配列が、ガイドRNAの少なくとも一部に対して塩基対を形成することを意味する。なお、塩基対には、G:CおよびA:Tのみならず、G:TまたはG:Uなどのゆらぎ塩基対も含まれてよい。また、ここで、ガイドRNAの「少なくとも一部」とは、ガイドRNAのうちの2塩基長～全長を意味する。したがって、本発明の核酸アプタマーにおける「ガイドRNAを認識する配列」は、ガイドRNAのうちの2塩基長～全長に対して相補性を有する。この際、ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドは、ガイドRNAのうちの2塩基長～全長に対して完璧または完全な(すなわち100%の)相補性を有している必要はなく、ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドがガイドRNAの少なくとも一部に対して相互作用できる程度の相補性を有していればよい。
　したがって、本発明の核酸アプタマーにおける「ガイドRNA認識オリゴヌクレオチド」は、ガイドRNAのうちの2塩基長～全長に対して、少なくとも80%、90%、95%、99%、または100%の配列相補性を有していればよい。言い換えれば、本発明の核酸アプタマーにおける「ガイドRNA認識オリゴヌクレオチド」は、ガイドRNAの2塩基長～全長に対して完全に相補的な配列において、数個(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ)の塩基が挿入、欠失または置換されたものであってよい。なお、配列相補性は、当分野における慣用の計算アルゴリズム(NCBI BLASTなど)を用いて計算することができる。
　本発明の核酸アプタマーにおけるガイドRNA認識オリゴヌクレオチドが、ガイドRNAの部分配列に対して相補性を有する配列からなる場合、前記部分配列は、ガイドRNAの任意の部分から選択されてよいが、ガイドRNA中のガイド配列から選択されることが好ましい。また、この際、ガイド配列から選択される部分配列は、gRNA／ヌクレアーゼ複合体の標的核酸におけるPAM配列に隣接する部分に相補的であることが好ましい。すなわち、本発明の核酸アプタマーにおけるガイドRNA認識オリゴヌクレオチドは、例えば、標的核酸のPAM配列に隣接する2塩基以上、3塩基以上、4塩基以上の配列からなってよく、好ましくは標的核酸のPAM配列に隣接する2～30塩基長、特に好ましくは標的核酸のPAM配列に隣接する3～22塩基長、最も好ましくは標的核酸のPAM配列に隣接する4～15塩基長の配列からなる。
　本発明の核酸アプタマーにおけるガイドRNA認識領域は、ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドのみから構成されてもよいし、リンカーオリゴヌクレオチドを含んでもよい。リンカーオリゴヌクレオチドは任意の配列であってよいが、ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドとの間で塩基対を形成しない配列であることが好ましく、かつ、ATリッチな配列であることが好ましい。リンカーオリゴヌクレオチドは、ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドのいずれか一方の末端または両方の末端に連結されてよいが、好ましくは、以下に述べる第二のネックオリゴヌクレオチドに、リンカー配列を介さずに直接連結されることが好ましい。リンカーオリゴヌクレオチドの長さは、ガイドRNA認識領域の機能が維持されることを限度として、任意であってよい。したがって、ガイドRNA認識領域の全体としての長さは、例えば、6～50塩基長であってよく、好ましくは7～25塩基長であってよく、特に好ましくは7～15塩基長であってよい。
　本発明の核酸アプタマーは、上述の通り、DNA、RNA、修飾核酸などの任意の核酸により構成されてよいが、ガイドRNA認識領域において架橋型核酸を含むことが特に好ましい。ガイドRNA認識領域に架橋型核酸を含めることにより、核酸アプタマーの複合体に対する阻害活性をさらに向上させることができる。架橋型核酸としては、BNA(Bridged Nucleic Acid)および2’,4’-BNA(別名LNA(Locked Nucleic Acid))ならびにそれらのアナログ(例えば、amino-LNA、thio-LNA、α-L-oxy-LNA、ENA(2’-O,4’-C-Ethylene-bridged Nucleic Acid)、AmNA(Amido-bridged Nucleic Acid)、GuNA(Guanidine-bridged Nucleic Acid)、scpBNA(2’-O,4’-C-spirocyclopropylene-bridged Nucleic Acid)、cEt-BNA(constrained ethy-bridged Nucleic Acid)、3’-amino-2’,4’-BNA、5’-amino-2’,4’-BNA、PrNA(2’-O,4’-C-Propylene-bridged Nucleic Acid)、2’,4’-BNANC(2’-O,4’-C-aminomethylene-bridged Nucleic Acid)、2’,4’-BNACOC(2’-O,4’-C-methyleneoxymethylene-bridged Nucleic Acid)など)を用いることができる。ガイドRNA認識領域に含まれる架橋型核酸の割合は、特に限定されないが、例えば50%以上、70%以上、80%以上、90%以上、または100%であってよい。
　本発明の核酸アプタマーは、第2の領域として、前記ヌクレアーゼに対応するPAM配列を片鎖に含む二本鎖のネック領域であって、前記ネック領域が、前記PAM配列からなる第一のネックオリゴヌクレオチドと、前記PAM配列に対して相補性を有する配列からなる第二のネックオリゴヌクレオチドとを含む、ネック領域を含む。
　本発明の核酸アプタマーにおける第一のネックオリゴヌクレオチドは、gRNA／ヌクレアーゼ複合体中のヌクレアーゼにより認識されるPAM配列からなる。「PAM(プロトスペーサー隣接モチーフ)」とは、ヌクレアーゼが標的核酸の標的部位に対して相互作用するために必要な2～8塩基長の配列であり、標的核酸中において、ガイドRNAにより標的化された配列に隣接して存在する(標的化するガイドRNAには存在しない)。PAM配列は、ヌクレアーゼが由来する細菌種やヌクレアーゼの型／亜型によって異なる。以下の表１に、Cas9が認識するPAM配列の例を示す。例えば、S. pyogenes由来のCas9が認識するPAM配列は、5’-NGGであることが知られている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、様々な異なるPAM配列を認識するように変異させたヌクレアーゼも作製されている。このようなヌクレアーゼおよびPAM配列については多数報告されており(例えば、Cebrian-Serrano, A. & Davies, B., "Crispr-Cas orthologues and variants: optimizing the repertoire, specificity and delivery of genome engineering tools", Mamm. Genome (2017). doi:10.1007/s00335-017-9697-4、および、Murovec J, Pirc Z, Yang B., "New variants of CRISPR RNA-guided genome editing enzymes.", Plant Biotechnol. J. (2017) Apr 1. doi: 10.1111/pbi.12736参照)、本発明の核酸アプタマーは、上記いずれのヌクレアーゼおよびPAM配列を対象としたものであってもよく、標的とするgRNA／ヌクレアーゼ複合体に応じて適切なPAM配列を選択して第一のネックオリゴヌクレオチドとして使用することができる。
　また、標的とするgRNA／ヌクレアーゼ複合体が、例えばCas13aなどのRNAヌクレアーゼを含むものである場合には、第一のネックオリゴヌクレオチドとしてプロトスペーサー隣接部位(protospacer flanking site：PFS)の配列を用いることができる。PFS配列は、PAM配列と同様の機能を有する配列であり、標的RNA中の、ガイドRNAにより標的化された配列に隣接して存在する。したがって、本発明において第一のネックオリゴヌクレオチドとして使用できるPAM配列には、PFS配列も含まれてよい。
　すでに上で述べたように、本発明におけるgRNA／ヌクレアーゼ複合体に含まれる好ましいヌクレアーゼは、Cas9およびCpf1である。したがって、本発明の核酸アプタマーにおいては、それらに対応するPAM配列(それぞれ5’-NGGおよび5’-TTTN)を、第一のネックオリゴヌクレオチドとして使用することが好ましい。
　本発明の核酸アプタマーにおける第二のネックオリゴヌクレオチドは、第一のネックオリゴヌクレオチドとして使用されるPAM配列に対して相補性を有する配列からなる。この際、第二のネックオリゴヌクレオチドは、第一のネックオリゴヌクレオチドとして使用されるPAM配列に対して、100%の相補性を有していることが好ましいが、第一のネックオリゴヌクレオチドと第二のネックオリゴヌクレオチドとが二本鎖を形成できることを限度として、1つまたは2つのミスマッチまたはバルジを含むことができる。
　本発明の核酸アプタマーにおいて、一本鎖のガイドRNA認識領域は、少なくとも第二のネックオリゴヌクレオチドに連結される。一本鎖のガイドRNA認識領域が第二のネックオリゴヌクレオチドのみに連結される場合、一本鎖のガイドRNA認識領域はフラップ構造を形成する。一本鎖のガイドRNA認識領域が、第一のネックオリゴヌクレオチドおよび第二のネックオリゴヌクレオチドの両方に連結される場合、一本鎖のガイドRNA認識領域は、ループ構造を形成する。いずれの場合も、一本鎖のガイドRNA認識領域は、その中に含まれる前記ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドが第二のネックオリゴヌクレオチドに対して隣接するように連結される。
　本発明の核酸アプタマーは、第3の領域として、第一の構造安定化オリゴヌクレオチドと、第二の構造安定化オリゴヌクレオチドとを含む、二本鎖の構造安定化領域を含む。第一の構造安定化オリゴヌクレオチドは任意の核酸配列からなってよく、第二の構造安定化オリゴヌクレオチドは、当該第一の構造安定化オリゴヌクレオチドと二本鎖を形成できる配列であれば、任意の核酸配列であってよい。したがって、第一の構造安定化オリゴヌクレオチドと第二の構造安定化オリゴヌクレオチドとは、少なくとも70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、または100%の相補性を有していればよく、二本鎖の構造安定化領域には、1つまたは複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上)のミスマッチまたはバルジが含まれていてもよい。
　第一の構造安定化オリゴヌクレオチドは、第一のネックオリゴヌクレオチドに付加され、第二の構造安定化オリゴヌクレオチドは、第二のネックオリゴヌクレオチドに付加され、互いにハイブリダイズして二本鎖の構造安定化領域を形成することにより、核酸アプタマー全体の構造を安定化する。したがって、二本鎖の構造安定化領域は、本発明の核酸アプタマーにおけるネック領域およびガイドRNA認識領域の構造および機能が維持されることを限度として、任意の長さであってよく、例えば4塩基対長以上、6塩基対長以上、8塩基対長以上であってよく、好ましくは6～20塩基対長である。
　第一の構造安定化オリゴヌクレオチドおよび第二の構造安定化オリゴヌクレオチドは、同じ長さであってもよいし、異なる長さであってもよい。したがって、構造安定化領域の自由末端(すなわち、ネック領域が連結されているのとは反対側の末端)は、平滑末端であってもよいし、粘着末端(5’突出または3’突出末端)であってもよい。あるいは、構造安定化領域の自由末端は、相互に連結されていてもよい。
　本発明の核酸アプタマーは、上記にしたがって設計された一本鎖のガイドRNA認識領域、二本鎖のネック領域、および二本鎖の構造安定化領域を組み合わせることにより、製造することができる。
　すなわち、本発明は、第二の実施形態によれば、ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体の、前記複合体の基質である標的核酸に対する結合活性または酵素活性を阻害する核酸アプタマーを製造する方法であって、（１）前記ガイドRNAを認識する配列からなるガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを決定するステップと、（２）前記ヌクレアーゼに対応するPAM配列からなる第一のネックオリゴヌクレオチドと、前記第一のネックオリゴヌクレオチドに対して相補性を有する配列からなる第二のネックオリゴヌクレオチドとを決定するステップと、（３）第一の構造安定化オリゴヌクレオチドと、第二の構造安定化オリゴヌクレオチドとを決定するステップと、（４）前記第一のネックオリゴヌクレオチドに、前記第一の構造安定化オリゴヌクレオチドを付加するステップと、（５）前記第二のネックオリゴヌクレオチドに、前記第二の構造安定化オリゴヌクレオチドを付加するステップと、（６）前記ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを、第二のネックオリゴヌクレオチドに連結するステップと、（７）前記ステップ（１）～（６）により設計された配列を含む核酸を合成するステップとを含む、方法である。
　ここで、Crispr-Casシステムにおいて、標的遺伝子におけるPAM配列とガイドRNAにより標的化される配列(以下、「ガイドRNA標的配列」と記載する)の配置(位置関係)は、Casの種類によって異なる。例えば、Cas9の場合には、ガイドRNA標的配列の下流の(すなわち、ガイドRNA標的配列の3’末端に隣接する)PAM配列を認識し、Cpf1の場合には、ガイドRNA標的配列の上流の(すなわち、ガイドRNA標的配列の5’末端に隣接する)PAM配列を認識する。そのため、本発明の核酸アプタマーにおけるガイドRNA認識オリゴヌクレオチドと第一および／または第二のネックオリゴヌクレオチドの、5’→3’方向の並び順は、核酸アプタマーが対象とするgRNA／ヌクレアーゼ複合体に含まれるヌクレアーゼの種類によって適宜変更され得る。
　したがって、例えば、一本鎖のガイドRNA認識領域が第一および第二のネックオリゴヌクレオチドの両方に連結された(すなわち、一本鎖のガイドRNA認識領域がループ構造を形成する)核酸アプタマーを製造する場合、
　（ｉ）Cas9のような、ガイドRNA標的配列の下流のPAM配列を認識するヌクレアーゼを含む複合体を対象とする核酸アプタマーは、5’→3’方向に：
　第二の構造安定化オリゴヌクレオチド－第二のネックオリゴヌクレオチド－ガイドRNA認識オリゴヌクレオチド－(リンカーオリゴヌクレオチド－)第一のネックオリゴヌクレオチド－第一の構造安定化オリゴヌクレオチド
の順に連結され；
　（ｉｉ）Cpf1のような、ガイドRNA標的配列の上流のPAM配列を認識するヌクレアーゼを含む複合体を対象とする核酸アプタマーは、5’→3’方向に：
　第一の構造安定化オリゴヌクレオチド－第一のネックオリゴヌクレオチド－(リンカーオリゴヌクレオチド－) ガイドRNA認識オリゴヌクレオチド－第二のネックオリゴヌクレオチド－第二の構造安定化オリゴヌクレオチド
の順に連結される。なお、上記において、「(リンカーオリゴヌクレオチド－)」は、任意のリンカーオリゴヌクレオチドを意味する。すなわち、本実施形態の方法は、（６’）前記ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを、直接またはリンカーオリゴヌクレオチドを介して第一のネックオリゴヌクレオチドに連結するステップをさらに含んでいてよい。
　また、例えば、一本鎖のガイドRNA認識領域が第二のネックオリゴヌクレオチドのみに連結された(すなわち、一本鎖のガイドRNA認識領域がフラップ構造を形成する) 核酸アプタマーを製造する場合、
　（ｉ）Cas9のような、ガイドRNA標的配列の下流のPAM配列を認識するヌクレアーゼを含む複合体を対象とする核酸アプタマーは、5’→3’方向に：
　第一のネックオリゴヌクレオチド－第一の構造安定化オリゴヌクレオチド(－)第二の構造安定化オリゴヌクレオチド－第二のネックオリゴヌクレオチド－ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドの順に連結され；
　（ｉｉ）Cpf1のような、ガイドRNA標的配列の上流のPAM配列を認識するヌクレアーゼを含む複合体を対象とする核酸アプタマーは、5’→3’方向に：
　ガイドRNA認識オリゴヌクレオチド－第二のネックオリゴヌクレオチド－第二の構造安定化オリゴヌクレオチド(－)第一の構造安定化オリゴヌクレオチド－第一のネックオリゴヌクレオチド
の順に連結される。なお、上記において、「(－)」は、構造安定化領域の自由末端における任意の連結を意味する。すなわち、本実施形態の方法は、（５’）前記第一の構造安定化オリゴヌクレオチドと、前記第二の構造安定化オリゴヌクレオチドとを連結するステップをさらに含んでいてよい。
　上記のように設計された核酸アプタマーは、当該技術分野において公知の方法により製造することができる。具体的には、例えば、アミダイト法もしくはホスホアミダイト法などにより化学合成することができる。(例えば、Nucleic Acid(Vol.2)[1]Synthesis and Analysis of Nucleic Acid(Editor: Yukio Sugiura, Hirokawa Publishing Company)参照)。または、RNAポリメラーゼを用いる方法やDNAポリメラーゼを用いた遺伝子工学的手法により生合成してもよい。例えば、本発明の核酸アプタマーがRNAアプタマーである場合には、RNAポリメラーゼのプロモーター配列(例えば、T7プロモーター)を含む鋳型DNAを化学合成し、それをRNAポリメラーゼにより転写することによって作製することができる。例えば、本発明の核酸アプタマーがDNAアプタマーである場合には、鋳型DNAを化学合成し、それをPCRにより増幅することによって作製することができる。
　一本鎖のガイドRNA認識領域が第二のネックオリゴヌクレオチドのみに連結された(すなわち、一本鎖のガイドRNA認識領域がフラップ構造を形成する) 核酸アプタマーを製造する場合、本発明の核酸アプタマーは、2本のアプタマー部分核酸を合成後にハイブリダイズさせて作製してもよいし、第一の構造安定化オリゴヌクレオチドと第二の構造安定化オリゴヌクレオチドとを、構造安定化領域の自由末端(すなわち、ネック領域が連結されているのとは反対側の末端)において連結させて1本の核酸として合成して作製してもよい。例えば、第一のネックオリゴヌクレオチド－第一の構造安定化オリゴヌクレオチドからなる第一のアプタマー部分核酸と、第二の構造安定化オリゴヌクレオチド－第二のネックオリゴヌクレオチド－ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドからなる第二のアプタマー部分核酸とを合成し、ハイブリダイズさせて作製してもよいし、第一のネックオリゴヌクレオチド－第一の構造安定化オリゴヌクレオチド－第二の構造安定化オリゴヌクレオチド－第二のネックオリゴヌクレオチド－ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを1本の核酸として合成して作製してもよい。
　本発明の核酸アプタマーは、gRNA／ヌクレアーゼ複合体に特異的に結合し、複合体の標的配列への作用を阻害できる。そのため、ゲノム編集をはじめとするCrispr-Casシステムに基づく既存の種々の方法と組み合わせて用いるのみにより、そのタイミングや精度を自在に制御することができ、有用である。
　すなわち、本発明は、第三の実施形態によれば、ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体の、前記複合体の基質である標的核酸に対する結合活性または酵素活性を阻害する方法であって、（１）前記複合体と前記標的核酸とを含む反応液を調製するステップと、（２）上記核酸アプタマーを前記反応液に添加するステップとを含む、方法である。
　本実施形態の方法では、gRNA／ヌクレアーゼ複合体と、前記複合体の標的核酸とを含む反応液を調製する。反応液の組成は、ヌクレアーゼの酵素活性のために適したものであれば、特に限定されず、すでに確立されたゲノム編集法において使用される反応液の組成に準じて適切に決定することができる。例えば、反応液は、gRNA／ヌクレアーゼ複合体と前記複合体の標的核酸とを、バッファ(例えば、1～100 mMのHEPES(pH 7.0～pH8.0)、1～100 mMのTris(pH 7.0～pH8.0)など)および／または塩(例えば、50～300 mMのNaCl、50～300 mMのKCl、0～100 mMのMgCl2など)を含む水性溶媒に添加することにより、調製することができる。反応液におけるgRNA／ヌクレアーゼ複合体の終濃度は、例えば、10～300 nMの範囲であってよい。反応液における標的核酸の終濃度は、例えば、1～1000 nMの範囲であってよい。gRNA／ヌクレアーゼ複合体と前記複合体の標的核酸との反応時間は、用いるヌクレアーゼの種類に応じて適宜決定することができ、例えば、5 分～24時間行うことができる。
　次いで、核酸アプタマーを、上記反応液に添加する。核酸アプタマーの添加量は、例えば、終濃度0.1～1000 nMの範囲で適宜決定することができる。核酸アプタマーによる阻害反応は、好ましくは、5分～24時間行うことができる。
　なお、本実施形態の方法において、gRNA／ヌクレアーゼ複合体と核酸アプタマーとは、順次または同時に反応液に添加されてよい。例えば、gRNA／ヌクレアーゼ複合体と標的核酸とを反応させた後に核酸アプタマーを添加することができ、これにより、複合体の過剰な酵素反応を止めることができる。あるいは、核酸アプタマーは、gRNA／ヌクレアーゼ複合体と標的核酸とを含む反応液を調製する際に一緒に添加することもでき、これにより、複合体の酵素反応の程度や精度を制御することができる。すなわち、バッファおよび／または塩を含む水性溶媒に対して、gRNA／ヌクレアーゼ複合体と、前記複合体の標的核酸と、核酸アプタマーとを、すべて同時に添加してもよい。
　本発明は、第四の実施形態によれば、ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体の、前記複合体の基質である標的核酸に対する結合活性または酵素活性を阻害する方法であって、（１）標的核酸を含む細胞に前記複合体を導入するステップと、（２）上記核酸アプタマーを前記細胞に導入するステップとを含む、方法である。
　本実施形態の方法では、gRNA／ヌクレアーゼ複合体を、標的核酸を含む細胞に導入する。細胞は、目的の標的核酸を含むものであれば特に限定されず、大腸菌などの原核生物、酵母などの真菌、昆虫、植物、動物など、あらゆる生物種の細胞を用いることができる。本実施形態の方法における好ましい細胞は、植物または動物由来の細胞であり、特に好ましくはヒトなどの哺乳動物由来の細胞である。動物細胞の種類も特に限定されず、任意の組織から単離された細胞、受精卵、培養細胞などを用いることができる。また、細胞に含まれる標的核酸は、ゲノムDNAやミトコンドリアDNAなどの内在性の核酸であってもよいし、プラスミドベクターなどの外因性の核酸であってもよい。
　gRNA／ヌクレアーゼ複合体の細胞への導入は、すでに確立されたゲノム編集法のプロトコールにしたがって行うことができる。例えば、予め調製したgRNAとヌクレアーゼとを、リポフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどにより細胞に導入すればよい。あるいは、gRNAおよび／またはヌクレアーゼをコードする核酸を含む発現ベクターを細胞に導入し、その後、細胞を培養することにより、gRNA／ヌクレアーゼ複合体を細胞内で発現させてもよい。発現ベクターには、gRNA／ヌクレアーゼ複合体を導入する細胞の種類に応じて、適切なウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを選択して用いることができる。
　次いで、核酸アプタマーを、上記細胞に導入する。核酸アプタマーの細胞への導入は、細胞の種類に応じて、公知の方法により行うことができ、例えば、リポフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどにより行うことができる。核酸アプタマーの導入後の細胞を、その種類に応じた適切な培養条件下で、１～７日間培養することが好ましい。
　なお、本実施形態の方法において、核酸アプタマーとgRNA／ヌクレアーゼ複合体は、順次または同時に細胞に導入されてよい。例えば、gRNA／ヌクレアーゼ複合体を細胞に導入した1～6時間後に核酸アプタマーを導入することができ、これにより、複合体の過剰な酵素活性を抑制することができる。あるいは、核酸アプタマーは、gRNA／ヌクレアーゼ複合体と同時に細胞に導入することもでき、これにより、複合体の酵素反応の程度や精度を制御することができる。
　本発明は、第五の実施形態によれば、（１）ガイドRNAとCrispr-Casファミリーのヌクレアーゼとを含む複合体を細胞に導入するステップと、（２）上記核酸アプタマーを前記細胞に導入するステップとを含む、ゲノム編集方法である。
　本実施形態の方法は、第四の実施形態における標的核酸をゲノムDNAとして、かつ、第四の実施形態におけるgRNA／ヌクレアーゼ複合体としてgRNA／Casヌクレアーゼ複合体を用いることにより、ゲノム編集を行うものである。したがって、本実施形態の方法において用いることができる細胞は、第四の実施形態におけるものと同様である。また、gRNA／Casヌクレアーゼ複合体および／または核酸アプタマーの細胞への導入も、第四の実施形態の方法におけるものと同様の手順により行うことができる。
　第三～第五の実施形態の方法によれば、ゲノム編集をはじめとするCrispr-Casシステムに基づく既存の種々の方法において、そのタイミング、精度、程度などを自在に制御できるため、有用である。
　以下に、具体的な実施例を示し、本発明についてさらに説明するが、本発明は以下の開示により限定されるものではない。また、本明細書中で引用する文献の内容は、参照により本明細書の一部をなすものとする。
(実施例１．Cas9に対する核酸アプタマーの取得)
　Cas9タンパク質に対する核酸アプタマーとして、大腸菌発現系により調製したHis-Cas9タンパク質に対する核酸アプタマーをSELEX法により取得した。詳細は以下の通りである。
　His-Cas9タンパク質(Streptococcus pyogenes Cas9)をHis-結合磁気ビーズ(Thermo Fisher Scientific社、10103D)に結合させ、結合バッファ(10 mM Tris/HCl  pH7.4、150 mM NaCl、1 mM MgCl2、tRNA)で洗浄した。その後、化学合成した核酸ライブラリー(N17、N19、N21、N23)とHis-Cas9タンパク質を結合させた磁気ビーズとを、結合バッファ中、常温で一時間インキュベートした。その後、結合バッファで3回洗浄した後、98℃、3分間で溶出し、His-Cas9タンパク質と結合した核酸を回収した。5サイクルのセレクションを行い、増幅ステップのプライマーには、N-Rev、N-Fを用いた。セレクション後、増幅した配列をIllumina社のMiSeqにより解析した。得られた約10万リードの配列から、近似配列を有するクラスターの配列、および、数の多い配列から、任意の候補アプタマー配列をピックアップした。候補アプタマー配列を化学合成し、以下の実施例において、Cas9に対する候補アプタマーの阻害活性を調べた。なお、核酸ライブラリーの配列、プライマー配列を表２に示す。また、ピックアップした候補配列を表３Ａ～３Ｃに示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　なお、NはG,A,TまたはCであり、Uはデオキシウリジンである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
(実施例２－１．Cas9に対する阻害活性に基づく候補アプタマーの２次スクリーニング)
　EGFP(GFP)配列を含むプラスミドの、Cas9およびGFP-targeting sgRNA(sgRNA(GFPg1): GFP-g1サイトを標的とするように設計したガイド配列を有するsgRNA)による切断が、候補アプタマーの存在下で阻害されるかどうかを試験した。候補アプタマーがCas9に対する阻害活性を有しない場合、Cas9とsgRNA(GFPg1)との複合体により、プラスミド中のGFP配列が切断される。一方、候補アプタマーがCas9に対する阻害活性を有する場合、上記切断が抑制される。プラスミドに含まれるGFPの配列は以下の通りである。
GFP：
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG(配列番号６７)
　0.5 pmol(終濃度50 nM)のCas9タンパク質、0.3 pmolのsgRNA(終濃度30 nM)、1 pmolの候補アプタマー(終濃度100 nM)、およびGFP配列を含むプラスミド(終濃度3 nM)を、10μlの反応バッファ(20 mM HEPES pH6.5、100 mM NaCl、5 mM MgCl2、0.1 mM EDTA)中で混合し、37℃、20分間インキュベートした。その後、0.65%アガロースゲル電気泳動により、プラスミドの切断を観察した。
　結果を図１に示す。図中、「Cas9(-)」はCas9を入れていないコントロールサンプルであり、すなわち、プラスミドが切断されなかった場合の結果を示す。一方、「Aptamer(-)」は候補アプタマーを添加せずに調製したサンプルであり、すなわち、プラスミドが切断された場合の結果を示す。プラスミドが切断されたことにより、高分子量の二本のバンド(Open circular DNAおよび一本鎖DNA)が確認できる。したがって、低分子量のバンドが強く検出されるほど、候補アプタマーのCas9に対する阻害活性が高いと評価することができる。
　図1の結果から、s1～s55、C1、C2、C4、C6、およびC95の60個の候補アプタマーのうち、s21、s36およびs40が、高いCas9阻害活性を有することが示された。また、「Ep159」、「Ep84」および「GslG」は、無関係な核酸アプタマー配列を用いたネガティブコントロールであり、いずれもCas9阻害活性は確認されなかった。なお、「sgCCR5」は、候補アプタマーに代えて、他の配列(CCR5の配列)を標的とするように設計したガイド配列を有するsgRNA(sgRNA(CCR5))を加えた場合の結果であり、終濃度30nMおよび100nMのsgRNA(CCR5)による競合的な阻害効果は確認されなかった。
　GFP-targeting sgRNA(sgRNA(GFPg1))の配列(Nat. Biotechnol. 2015, 33(1):73-80. doi: 10.1038/nbt.3081.)、sgRNA(CCR5)の配列、無関係な核酸アプタマー配列(Ep159、Ep84、GslG)を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 　なお、核酸の表記において、大文字はDNA、小文字はRNAを表すものとする。
　また、以下の実施例においては、特に断りがない限り、上記実施例２－１と同様の手順により、アプタマーの阻害活性を評価した。
(実施例２－２．候補アプタマーの阻害活性の再評価)
　高いCas9阻害活性が確認されたs21、s36およびs40について、アプタマーの濃度を変更して、阻害活性の再評価を行った。具体的には、各候補アプタマーの終濃度を3 nM、10 nM、または、30 nMとして、上記実施例２－１と同様の手順により、アプタマーの阻害活性を評価した。
　結果を図２に示す。この結果、s21およびs36の核酸アプタマーがCas9/sgRNA(GFP-g1)に対する高い阻害活性を有していることが示された。
(実施例３．変異導入実験による核酸アプタマーの配列／構造と阻害活性との相関の解析)
　Cas9/sgRNA(GFP-g1)に対して高い阻害活性を示したs21は、5’末端および3’末端が互いに相補的な配列を有していることから、図３に示すような二次構造を形成しているものと考えられた。この推定された二次構造に基づき、核酸アプタマーを以下の3つの領域に分けて、変異導入解析を行った。
　(1) 構造安定化領域：　二本鎖を形成している。PCRプライマーの結合配列を含み、アプタマーの由来するライブラリーごとに規定された固定の配列を有する。
　(2) ネック領域：　二本鎖を形成している。ライブラリーにおいてランダムな配列を有する可変領域である。
　(3) ガイドRNA認識領域：　一本鎖ループ構造を形成している。ライブラリーにおいてランダムな配列を有する可変領域である。
（実施例３－１．ガイドRNA認識領域への変異導入）
　まず、ガイドRNA認識領域の長さによる、核酸アプタマーの阻害活性に対する影響について調べた。s21とs36の間で共通性のある配列を残し、ガイドRNA認識領域の長さが異なる短縮型変異アプタマーを合成し(s21-1、s21-2、s21-3、s21-4、s21-5、s21-6、Tetra)、Cas9/sgRNA(GFP-g1)に対する阻害活性を調べた。変異アプタマーの配列を表５に示す。なお、下線を付した配列(CGCC)は、本実施例の結果から、Cas9/sgRNA(GFP-g1)に対する阻害活性に重要であることが示唆された配列である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　さらに、候補アプタマーのスクリーニングにより得られた配列の中から、s21およびs36と共通の配列を含む核酸アプタマー(N19-M1、N19-M2、N19-13、N19-14：配列を表６に示す)を選択し、それらの阻害活性を評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　結果を図４に示す。ガイドRNA認識領域の長さが7塩基以上のアプタマーでは、阻害活性の低下はあまり見られなかったが、ガイドRNA認識領域の長さが6塩基のアプタマー(s21-3)では、阻害活性が有意に低下した。一方、ガイドRNA認識領域を、安定的なループ構造を形成することが知られるテトラループ配列に置き換えたアプタマー(Tetra)では、阻害活性が著しく低下した。また、s21およびs36と共通の配列を含む核酸アプタマーでは、ネック領域を持ち、かつ、ガイドRNA認識領域の最初(5’末端)の4塩基の配列がCGCCであるN19-13のみが阻害活性を示したことから、ガイドRNA認識領域の最初のCGCCがCas9/sgRNA(GFP-g1)に対する阻害活性に重要であることが推察された。
　ガイドRNA認識領域におけるCGCCの位置が阻害活性に及ぼす影響について、さらに解析するために、候補アプタマーのスクリーニングにより得られた配列の中から、ガイドRNA認識領域がCGCCで始まる候補アプタマー(N23-meme1、N23-meme2)、ガイドRNA認識領域のいずれかの位置にCGCCを含む候補アプタマー(N23-m1、N23-m2、N23-m3)、ならびに、s21およびs36のネック領域に変異を有する候補アプタマー(s21-mut1、s36-mut1)を選択し、Cas9/sgRNA(GFP-g1)に対する阻害活性を調べた。これらの候補アプタマーの配列を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　結果を図５に示す。ガイドRNA認識領域がCGCCで始まる候補アプタマー(N23-meme1、N23-meme2)はどちらもs21と同レベルの阻害活性を示した。一方、ガイドRNA認識領域の他の位置にCGCCを含む候補アプタマー(N23-m1、N23-m2、N23-m3)や、s21およびs36のネック領域に変異を有する候補アプタマー(s21-mut1、s36-mut1)は、いずれもs21と比較して弱い阻害活性しか示さなかった。
　さらに、s21-2のガイドRNA認識領域に点変異を導入した核酸(s21-2lm1、s21-2lm2、s21-2lm3、s21-2lm4、s21-2lm5、s21-2lm6、s21-2lm7)を作製し、阻害活性を評価した。これらの核酸配列を表８に示す(変異部位を下線で示した)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　結果を図６に示す。ガイドRNA認識領域(7塩基長)のうち、1塩基目に点変異を導入(C→G)したアプタマー(s21-2lm1)および2塩基目に点変異を導入(G→C)したアプタマー(s21-2lm2)は、クリティカルに阻害活性を消失した。また、3塩基目に点変異を導入(C→G)したアプタマー(s21-2lm3)および4塩基目に点変異を導入(C→G)したアプタマー(s21-2lm4)も、有意に阻害活性が低下した。一方、5～7塩基目における点変異導入は、阻害活性に大きな影響を与えなかった(s21-2lm5、s21-2lm6、s21-2lm7)。以上の結果から、ガイドRNA認識領域の最初のCGCC配列がCas9/sgRNA(GFP-g1)に対する阻害活性に重要であり、それ以外の配列は特に重要でないことが確認された。
(実施例３－２．構造安定化領域およびネック領域への変異導入)
　次に、構造安定化領域の配列／構造とアプタマーの阻害活性との相関を調べた。まず、構造安定化領域の長さについての影響を調べるために、s21-2(構造安定化領域：12塩基対長)を元にして、構造安定化領域が11塩基対長(s21-2e)、10塩基対長(s21-2f)、9塩基対長(s21-2g)、8塩基対長(s21-2a)、6塩基対長(s21-2b)、3塩基対長(s21-2c)、0塩基対長(s21-2d)の核酸を調製し、Cas9/sgRNA(EGFP-g1)に対する阻害活性について調べた。これらの核酸配列を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　結果を図７に示す。構造安定化領域が8塩基対長までは、短くなるにしたがって阻害活性が徐々に減少したが、6塩基対長以下になると阻害活性が急激に失われることが示された。
　次に、構造安定化領域およびネック領域の塩基配列の重要性について確認するため、s21-2を元にして、ステム構造を保持したまま、自由末端から2塩基対ごとに配列を置換した核酸(s21-2m1～s21-2m7)を調製し、Cas9/sgRNA(EGFP-g1)に対する阻害活性について調べた。これらの核酸配列を表１０に示す(変異部位を下線で示した)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　結果を図８に示す。構造安定化領域に変異を導入した核酸(s21-2m1～s21-2m6)はいずれもs21-2と同等の阻害活性を示し、アプタマーの阻害活性は構造安定化領域の配列には依存しないことが明らかになった。一方、ネック領域に変異を導入した核酸(s21-2m7)は、阻害活性を大きく損なっており、ネック領域の塩基配列はアプタマーの阻害活性に重要であることが示唆された。
(実施例３－３．ネック領域への変異導入)
　次に、ネック領域について、様々な変異を導入した核酸配列(s21-2mm1～s21-2mm11)を調製し、ネック領域の配列／構造とアプタマーの阻害活性との相関を詳細に調べた。これらの核酸配列を表１１に示す(変異部位を下線で示した)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　結果を図９に示す。ネック領域内の構造安定化領域に隣接した塩基対から3番目の塩基対は、塩基対が形成されていれば塩基の種類はアプタマーの阻害活性に影響しないこと、1番目と2番目の塩基対については、ガイドRNA認識領域の最初のCGCC配列に隣接するネック部分の配列(本実施例では「センス配列」と呼称する)がTC>CC>TTの順に阻害活性が高いこと、その相補鎖であるネック部分の配列(本実施例では「アンチセンス配列」と呼称する)がGGであることが必要であること、また、センス配列におけるバルジの挿入は許容される(s21-2mm11)ことが判明した。
(実施例３－４．ホスホロチオエート化核酸アプタマーの阻害活性)
　生体内での核酸の使用のためには、安定性を上げるために、核酸のリン酸基の酸素原子を硫黄原子により置換(ホスホロチオエート修飾)することがしばしば行われる。そこで、ホスホロチオエート修飾(以下、「チオール化」と表記する)がアプタマーの阻害活性に影響を与えるか否かについて検討を行った。調製したチオール化核酸の配列を表１２に示す(チオール化塩基を^で示した)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　結果を図１０に示す。s21-2の構造安定化領域およびネック領域のセンス配列／アンチセンス配列の3塩基をチオール化した核酸(s21-ls2s1～s21-ls2s5)、ガイドRNA認識領域の全塩基をチオール化した核酸(s21-ls2s6)はいずれも阻害活性を有し、s21-2と比較して阻害活性の減少はほとんどみられなかった。一方、s21-2の全領域の全塩基をチオール化した核酸(s21-ls2s all)の阻害活性は有意に減少した。
(実施例４．ゲルシフトアッセイによるCas9とアプタマーの相互作用の解析)
　Cas9タンパク質と、阻害活性を有する核酸アプタマーとの間の相互作用を、ゲルシフトアッセイにより解析した。詳細な実験条件は以下の通りである。
　2 pmolのCas9タンパク質と、20 pmolの核酸アプタマー(s21、s21-2、s21-mm2、tetra、St2-1SA(Streptavidinに対するアプタマー))を結合バッファ(20 mM Tris/HCl pH8.0、250 mM NaCl、1 mM MgCl2、2.5% glycerol、0.05% Tween-20、0.05 mg/ml tRNA)中で30分間常温にてインキュベートした。その後、8%アクリルアミドゲルで電気泳動し、SYBR Gold(Thermo Fisher Scientific社)によって染色後、Bio-Rad ChemiDoc XRS imageanalysis system(Bio-Rad社)により解析した。なお、St2-1SAの配列は以下の通りである(表１３)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　結果を図１１に示す。高いCas9阻害活性を有するs21およびs21-2を用いたサンプルにおいては、Cas9タンパク質との複合体を示すバンドがゲル上部にみられた。一方、Cas9阻害活性の低いs21-2mm2、Tetra、およびSt2-1SA(ネガティブコントロール) を用いたサンプルにおいては、Cas9タンパク質との複合体を示すバンドはみられなかった。
(実施例５．表面プラズモン共鳴分析によるCas9タンパク質と核酸アプタマーとの物理化学的相互作用の解析)
　Cas9タンパク質と核酸アプタマーとの間の解離定数(Kd)を算出するために、表面プラズモン共鳴分析を行った。詳細な実験手法は以下の通りである。
　5’ビオチン修飾したs21を調製し、ストレプトアビジンセンサーチップ(GEヘルスケア社)上に固定した。その後、ランニングバッファ(20 mM Tris/HCl pH8.0、150 mM NaCl、1 mM MgCl2、0.005% Tween-20)中に、異なる濃度(2.5 nM、5 nM、10n M、20 nM)のCas9タンパク質をロードすることにより、センサグラムを得た。KdはBiacore evaluation software package(GEヘルスケア社、Ver 2.0)により算出した。また、コントロールとして、Tetraを用いて同様の試験を行った。
　結果を図１２に示す。s21とCas9タンパク質との間のKdは、0.57 nMであり、s21が非常に高いCas9結合能を持っていることが分かった。一方、阻害活性が弱かったTetraとCas9タンパク質との間のKdは、8.79 μMであった。
(実施例６．ステムフラップ型アプタマーの設計)
　Cas9アプタマーの阻害活性にはガイドRNA認識領域の最初の4塩基が重要であることから、図１３で示すように、この最初の4塩基(CGCC)のみをガイドRNA認識領域としたステムフラップ型のアプタマー(s21-sf)を調製し、その阻害活性について調べた。s21-sfの配列を以下に示す(表１４)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　結果を図１４に示す。新たに設計したステムフラップ構造を形成するアプタマー(s21-sf)は、ステムループ構造を形成するアプタマー(s21-2)と、ほぼ同等の阻害活性を持つことが確認された。
(実施例７－１．Cas9アプタマーのsgRNA配列特異性)
　s21-2は、Cas9/sgRNA(GFPg1)に対して高い阻害活性を示したので、GFP配列上の他の部位を標的とするCas9/sgRNA複合体に対してもs21-2が同様の阻害活性を有するかどうかについて検討した。以降の実験では、sgRNAに代えて、crRNAとtracrRNAとをアニーリングさせた複合体(crRNA:tracrRNA)を用いた。crRNAおよびtracrRNAは、ファスマック社またはIDT社から購入したものを用いた。crRNAの配列を表１５に示す(下線はcrRNAにおけるガイド配列を示す)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　GFPの異なる部位を標的化する3つのcrRNAを、それぞれtracrRNAとアニーリングさせてcrRNA:tracrRNA複合体とした後、s21-2とCas9タンパク質を同時に加え、s21-2の阻害活性について調べた。なお、使用したcrRNA:tracrRNAは終濃度30 nMであり、Cas9の終濃度は50 nMであり、実施例２－１と同じである。アプタマー濃度は図中に示した。
　結果を図１５に示す。s21-2は、Cas9/sgRNA(GFPg1)と同じ部位を標的とするCas9/crRNA:tracrRNA (GFPg1)に対しては高い阻害活性を示したが、他の部位(GFP332、GFP373、GFP686)を標的とするCas9/crRNA:tracrRNAに対しては弱い阻害活性しか示さなかった。この結果は、すなわち、s21-2がcrRNA(GFPg1)と相互作用していることを示唆するものと考えられる。そこで、s21-2の配列をみてみると、阻害活性に重要であるガイドRNA認識領域の最初の4塩基CGCCと、crRNA(GFPg1)中のガイド配列の3’末端の４塩基GGCGが相補的であり、二本鎖を形成する可能性が考えられた。さらに、ネック領域のアンチセンス配列がPAM配列(NGG)と同じ配列であること、およびCas9/sgRNAの結晶構造に基づく考察から、s21-2およびs21-sfは、図１７に示す模式図のような様式でCas9/sgRNA複合体に結合していることが示唆された。
　なお、既存の手法(アンチセンス法)により、sgRNA(GFPg1) 中のガイド配列に対するアンチセンスDNA(As(GFPg1))およびアンチセンスRNA(AsRNA(GFPg1))の阻害活性を評価したところ、阻害活性はほとんど見られなかった(図１６)。As(GFPg1)、AsRNA(GFPg1)の配列を表１６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
(実施例７－２．特異性メカニズムに基づいたアプタマーの設計)
　図１７に示す結合モデルに従って、Cas9/crRNA(GFP332)およびCas9/crRNA(GPF373)に対して、ステムフラップ型アプタマー(sf(GFP332)、sf(GFP373))およびステムループ型アプタマー(s21-2(GFP332)、s21-2(GFP373))を設計し、その阻害活性を測定した。配列を表１７および１８に示す(crRNA中のガイド配列と二本鎖を組むと考えられる配列を下線で示す)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　結果を図１８に示す。ステムフラップ型アプタマー(sf(GFP332)およびsf(GFP373))は、Cas9/crRNA(GFP332)およびCas9/crRNA(GPF373)の両方に対して、高い阻害活性(Cas9/sgRNA(GFPg1)に対するs21アプタマーと同等) を示した。この結果は、本発明者らが想定する結合様式を強く示唆している。
　また、Cas9/crRNA(GFP332)、Cas9/crRNA(GPF373)に対するステムループ型アプタマー(s21-2(GFP332)、s21-2(GFP373))は、対応するステムフラップ型アプタマーに比べて、やや低い阻害活性を示した。この原因としては、ループ長が短く(7塩基)、crRNA中のガイド鎖と十分に二本鎖を組めていない可能性が考えられた。
　そこで、ループ長を17塩基まで伸ばし、ガイド配列と二本鎖を形成すると考えられる4塩基以外をAで構成したステムループ型アプタマー(s21-A(GFP332)、s21-A(GFP373))を設計し(配列は上の表１８に示す)、Cas9/crRNA(GFP332)、Cas9/crRNA(GPF373)に対する阻害活性を測定した。
　結果を図１９に示す。s21-A(GFP332)および s21-A(GFP373)はいずれも、対応するステムフラップ型アプタマーと同等の阻害活性を示した。この結果から、ループ長を伸長することにより、阻害活性を回復できることが示された。なお、ガイド配列に対するアンチセンスDNA(As(GFP332)、As(GFP373))は、上記アプタマーと比較して低い阻害活性しか示さなかった。
(実施例８.ステムフラップ型アプタマーの構造的なパラメータに関する実験)
　ステムフラップ型アプタマーのガイド配列に対する特異性を調べるために、Cas9/crRNA(GFP332)およびCas9/crRNA(GPF373)のそれぞれに対する、GFPg1部位を標的とするアプタマー(s21-2、s21-sf)、フラップ構造のないネガティブコントロールアプタマー(sf-0)、GFP332部位を標的とするステムフラップ型アプタマー(sf(GFP332))、およびGFP373部位を標的とするステムフラップ型アプタマー(sf(GFP373))の阻害活性を評価した。sf-0の配列を表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　結果を図２０に示す。sf(GFP332)はCas9/crRNA(GFP332)に対して、sf(GFP373)はCas9/crRNA(GPF373)に対して、非常に高い阻害活性を示した。これに対し、s21-sf(GFPg1部位を標的とするステムフラップ型アプタマー)は、Cas9/crRNA(GFP332)およびCas9/crRNA(GPF373)のいずれに対してもほとんど阻害活性を示さなかった。この結果から、ステムフラップ型アプタマーが高い配列特異性を有することが示された。その一方で、s21-2(GFPg1部位を標的とするステムループ型アプタマー)は、Cas9/crRNA(GFP332)およびCas9/crRNA(GPF373)のいずれに対しても若干の阻害活性を示しており、配列特異性がやや低いことが示唆された。
　次に、ステムフラップ型アプタマーのフラップの長さと阻害活性との間の関係について調べた。s21-sfを元にして、フラップ構造の長さを変更したステムフラップ型アプタマー(sf-0、sf-2(GFPg1)、sf-3(GFPg1)、sf-4(GFPg1)、sf-5(GFPg1)、sf-6(GFPg1)；それぞれ0、2、3、4、5、6塩基長のフラップ構造を有する)、および、フラップ配列の相補配列をネック領域のアンチセンス配列に付加したアプタマー(sf-ds) を作製し、その阻害活性を調べた。また、標的DNAと同じガイド配列およびPAM配列を有する二本鎖デコイ(decoy：decoy-sとdecoy-asとの二本鎖)を対照として用いた。sf-2(GFPg1)、sf-3(GFPg1)、sf-4(GFPg1)、sf-5(GFPg1)、sf-6(GFPg1)、decoy-s、decoy-asの配列を表２０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　結果を図２１に示す。sf-0(フラップ長:0)は100 nMでもほとんど阻害活性を示さないが、フラップ構造が2、3、4塩基長に伸びるにしたがって(sf-2(GFPg1)、sf-3(GFPg1)、sf-4(GFPg1))、アプタマーの阻害活性が上昇することが確認された。また、4塩基長以上のフラップ構造を有するアプタマー(sf-4(GFPg1)、sf-5(GFPg1)、sf-6(GFPg1))は、いずれも高い阻害活性を示した。一方、フラップ配列部分を二本鎖にしたsf-dsや二本鎖デコイは、ステムフラップ型アプタマーに比べて、弱い阻害活性しか示さなかった。この結果から、ステムフラップ型アプタマーにおけるフラップ部分は一本鎖であることが阻害活性に重要であることが示唆された。
　さらに、フラップ部分と二本鎖を組まない1～4塩基長の配列をネック領域のアンチセンス配列に付加したアプタマー(s21-sf-T1、s21-sf-T2、s21-sf-T3)についても阻害活性を評価したところ、いずれも高い阻害活性を有していた(図２２)。また、s21-sfの構造安定化領域を6塩基対長にまで短くしたアプタマー(s21-sf-ShortStem)は、s21-sf(構造安定化領域:12塩基対長)と変わらない阻害活性を示した(図２２)。この結果から、構造安定化領域が少なくとも6塩基対長を有していれば、構造安定化領域の構造は阻害活性に影響しないようであることが理解される。なお、s21-sf-T1、s21-sf-T2、s21-sf-T3、s21-sf-ShortStemの配列は以下の通りである(表２１)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
（実施例９．他の遺伝子の標的とするCas9/crRNAに対するアプタマーの阻害活性の検証実験）
　EGF受容体(EGFR)遺伝子配列中の2つの部位(EGFR-bおよびEGFR-c)を標的とするCas9/crRNA(EGFR-b)およびCas9/crRNA(EGFR-c)に対するステムフラップ型アプタマー(sf(EGFR-b)、sf(EGFR-c))を設計し、阻害活性を調べた。標的プラスミドには、ヒトEGF受容体とGFPの融合タンパク質の遺伝子配列を含むプラスミドを用いた。EGF受容体の遺伝子配列は以下の通りである。
EGF receptor：
ATGCGACCCTCCGGGACGGCCGGGGCAGCGCTCCTGGCGCTGCTGGCTGCGCTCTGCCCGGCGAGTCGGGCTCTGGAGGAAAAGAAAGTTTGCCAAGGCACGAGTAACAAGCTCACGCAGTTGGGCACTTTTGAAGATCATTTTCTCAGCCTCCAGAGGATGTTCAATAACTGTGAGGTGGTCCTTGGGAATTTGGAAATTACCTATGTGCAGAGGAATTATGATCTTTCCTTCTTAAAGACCATCCAGGAGGTGGCTGGTTATGTCCTCATTGCCCTCAACACAGTGGAGCGAATTCCTTTGGAAAACCTGCAGATCATCAGAGGAAATATGTACTACGAAAATTCCTATGCCTTAGCAGTCTTATCTAACTATGATGCAAATAAAACCGGACTGAAGGAGCTGCCCATGAGAAATTTACAGGAAATCCTGCATGGCGCCGTGCGGTTCAGCAACAACCCTGCCCTGTGCAACGTGGAGAGCATCCAGTGGCGGGACATAGTCAGCAGTGACTTTCTCAGCAACATGTCGATGGACTTCCAGAACCACCTGGGCAGCTGCCAAAAGTGTGATCCAAGCTGTCCCAATGGGAGCTGCTGGGGTGCAGGAGAGGAGAACTGCCAGAAACTGACCAAAATCATCTGTGCCCAGCAGTGCTCCGGGCGCTGCCGTGGCAAGTCCCCCAGTGACTGCTGCCACAACCAGTGTGCTGCAGGCTGCACAGGCCCCCGGGAGAGCGACTGCCTGGTCTGCCGCAAATTCCGAGACGAAGCCACGTGCAAGGACACCTGCCCCCCACTCATGCTCTACAACCCCACCACGTACCAGATGGATGTGAACCCCGAGGGCAAATACAGCTTTGGTGCCACCTGCGTGAAGAAGTGTCCCCGTAATTATGTGGTGACAGATCACGGCTCGTGCGTCCGAGCCTGTGGGGCCGACAGCTATGAGATGGAGGAAGACGGCGTCCGCAAGTGTAAGAAGTGCGAAGGGCCTTGCCGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACTCCTCCTCTGGATCCACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAGCCCAGGGACTGCGTCTCTTGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATGCGAAGGCGCCACATCGTTCGGAAGCGCACGCTGCGGAGGCTGCTGCAGGAGAGGGAGCTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGGCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAACTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAGGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTGCCTATCAAGTGGATGGCATTGGAATCAATTTTACACAGAATCTATACCCACCAGAGTGATGTCTGGAGCTACGGGGTGACCGTTTGGGAGTTGATGACCTTTGGATCCAAGCCATATGACGGAATCCCTGCCAGCGAGATCTCCTCCATCCTGGAGAAAGGAGAACGCCTCCCTCAGCCACCCATATGTACCATCGATGTCTACATGATCATGGTCAAGTGCTGGATGATAGACGCAGATAGTCGCCCAAAGTTCCGTGAGTTGATCATCGAATTCTCCAAAATGGCCCGAGACCCCCAGCGCTACCTTGTCATTCAGGGGGATGAAAGAATGCATTTGCCAAGTCCTACAGACTCCAACTTCTACCGTGCCCTGATGGATGAAGAAGACATGGACGACGTGGTGGATGCCGACGAGTACCTCATCCCACAGCAGGGCTTCTTCAGCAGCCCCTCCACGTCACGGACTCCCCTCCTGAGCTCTCTGAGTGCAACCAGCAACAATTCCACCGTGGCTTGCATTGATAGAAATGGGCTGCAAAGCTGTCCCATCAAGGAAGACAGCTTCTTGCAGCGATACAGCTCAGACCCCACAGGCGCCTTGACTGAGGACAGCATAGACGACACCTTCCTCCCAGTGCCTGAATACATAAACCAGTCCGTTCCCAAAAGGCCCGCTGGCTCTGTGCAGAATCCTGTCTATCACAATCAGCCTCTGAACCCCGCGCCCAGCAGAGACCCACACTACCAGGACCCCCACAGCACTGCAGTGGGCAACCCCGAGTATCTCAACACTGTCCAGCCCACCTGTGTCAACAGCACATTCGACAGCCCTGCCCACTGGGCCCAGAAAGGCAGCCACCAAATTAGCCTGGACAACCCTGACTACCAGCAGGACTTCTTTCCCAAGGAAGCCAAGCCAAATGGCATCTTTAAGGGCTCCACAGCTGAAAATGCAGAATACCTAAGGGTCGCGCCACAAAGCAGTGAATTTATTGGAGCA(配列番号１５９)
　EGF受容体(EGFR)遺伝子配列中の2つの部位(EGFR-bおよびEGFR-c)を標的とするcrRNAの配列、ならびに、ステムフラップ型アプタマーsf(EGFR-b)およびsf(EGFR-c) の配列は以下の通りである(表２２)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　結果を図２３に示す。Cas9/crRNA(EGFR-b)およびCas9/crRNA(EGFR-c)に対するステムフラップ型アプタマーsf(EGFR-b) およびsf(EGFR-c)は、先の実施例において解析したGFPを標的とするCas9/crRNAに対するステムフラップ型アプタマーに比べると、やや低い阻害活性しか得られなかった。この原因としては、crRNAとアプタマーが二本鎖を組む配列がAT-richであり、両者の間で二本鎖が形成されにくいことが考えられた。そこで、二本鎖を形成しやすくするために、フラップ構造の長さを5塩基長または6塩基長に伸ばしたアプタマー(sf5(EGFR-b)、sf5(EGFR-c)、sf5(EGFR-c)、sf6(EGFR-c))を設計し、再度阻害活性を評価した。また、コントロールとして、アンチセンスDNA(As(EGFR-b)、As(EGFR-c))を用いた。これらの配列を表２３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　結果を図２４に示す。予想通り、EGFRのどちらの標的部位に対するCas9/crRNAについても、フラップ長さを伸ばすことにより阻害活性が回復し、6塩基長のフラップ構造を持つステムフラップ型アプタマーsf6(EGFR-b) およびsf6(EGFR-c)は、GFPを標的とするCas9/crRNAに対するステムフラップ型アプタマーと同程度の阻害活性を示した。
　さらに、EpCAM遺伝子を標的とするCas9/crRNA(EpCAM)に対するステムフラップ型アプタマー(sf(EpCAM))を設計し、阻害活性を調べた。標的プラスミドにはEpCAM遺伝子中の標的配列をクローニングしたプラスミドを用いた。配列を以下に示す。
EpCAM：GTGCACCAACTGAAGTACACCGG (配列番号１７０)
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　結果を図２５に示す。Cas9/crRNA(EpCAM)に対するステムフラップ型アプタマー(sf(EpCAM))も、他の遺伝子を標的とするCas9/crRNAに対するステムフラップ型アプタマーと同様に高い阻害活性を示した。
(実施例１０．Cpf1(Cas9ホモログ)に対するアプタマーのデザインと阻害活性の検証実験)
　Cas9には様々ホモログが存在し、それぞれ異なる配列からなるPAMを認識することが知られている。そこで、上記実施例において検討したCas9阻害アプタマーの設計方法が、他のPAM配列を認識するCas9ホモログに対しても適用可能なものであるかどうかについて検証した。
　ここでは、Cas9ホモログとして、Cas9に次いでよく使用されているCrisprゲノム編集酵素であるCpf1を用いた。Cpf1は、標的遺伝子中のガイドRNA標的配列の上流の(すなわち、5’末端に隣接する)PAM配列(TTTN)を認識し、標的遺伝子の二本鎖DNAを切断する。そのため、Cpf1/crRNAに対するステムフラップ型アプタマーの場合には、Cas9/crRNAに対するステムフラップ型アプタマーの場合とは反対側の末端(すなわち、5’末端)にフラップ構造部分を配置することが必要であるはずである。そこで、図２６に示すように、Cpf1/crRNAを標的とするステムフラップ型アプタマー(sf-c(GFPa))およびGFPを標的とするcrRNA(GFPa)を設計し、アプタマーの阻害活性を評価した。さらに、Cas9阻害アプタマーでは、ネック領域におけるG:T塩基対が阻害活性の上昇に寄与したので、同様にT:G塩基対を導入した3種類のステムフラップ型アプタマー(sf-c1(GFPa)、sf-c2(GFPa)、sf-c3(GFPa))も作製した。また、GFP遺伝子を含むプラスミドは、実施例２で使用したものと同じものを使用した。Cpf1酵素、crRNAはIDT社から購入したものを使用した。
　crRNA(GFPa)およびアプタマーの配列を表２５に示す。表中、下線は、crRNAと二本鎖を組むと考えられる配列を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
　終濃度60 nMのCpf1、終濃度50 nMのcrRNA(GFPa)をバッファ(50 mM Tris/HCl pH7.9、100 mM NaCl、10 mM MgCl2、100 ug/ml BSA)中で混合し、20 分間静置した。その後、終濃度 3 nMのプラスミドおよびアプタマーを加え、37℃で10分間インキュベートした。その後、0.65%アガロースゲル電気泳動により、プラスミドの切断を観察した。
　結果を図２７に示す。Cpf1/crRNAに対して設計したステムフラップ型アプタマーも、Cas9/crRNAに対するステムフラップ型アプタマー同様、高い阻害活性を示した。また、ネック領域にT:Gミスマッチを挿入したアプタマーでは、いずれも阻害活性が減少した。
　さらに、Cpf1/crRNAに対するステムフラップ型アプタマーのデザインの一般性を検証するために、EGFRの3箇所の標的配列(EGFR-1、EGFR-2、EGFR-3)に対するcrRNAおよび、それぞれに対応するステムフラップ型アプタマー(sf-c(EGFR-1)、sf-c(EGFR-2)、sf-c(EGFR-3))を設計し、アプタマーの阻害活性について調べた。EGFRの3箇所の標的配列およびそれぞれに対応するステムフラップ型アプタマーの配列を表２６に示す。表中、下線は、crRNAと二本鎖を組むと考えられる配列を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　結果を図２８に示す。いずれのCpf1/crRNAに対するステムフラップ型アプタマーも高い阻害活性を示した。
(実施例１１．細胞内におけるアプタマー阻害活性の検証実験)
　本発明のアプタマーが、細胞内においてもCas9/crRNAを阻害できるかどうかを確認するために、ゲノム編集が生じると蛍光タンパク質(mScarlet)が発現するレポーター細胞株(293-mScarlet)を作製した。293-mScarlet細胞は、Thermo Fisher Scientific社のFlp-Inシステムにより、HEK293のゲノムに、終止コドンを有する標的配列がmScarletのコード配列の上流に挿入されたレポーターカセットを挿入することにより作製した。293-mScarlet細胞は、ゲノム編集される前の状態では、mScarletのコード配列の上流に終止コドンが存在することにより、mScarletを発現しない。しかし、標的配列に依存的なゲノム編集が起こると、切断された標的部位における塩基の挿入または欠失により終止コドンが消失し、さらに切断部位がmScarletのコード配列のフレームと一致するように正しく修復された場合に、mScarlet蛍光タンパク質が発現するようになる。
　上記レポーターカセットの配列を以下に示す。小文字はmScarletの配列、大文字は終止コドンを含む標的配列を示す。また、下線はCas9/crRNAの標的配列を示し、標的配列の3’末端に位置するTAGが終止コドンである。
レポーターカセット(標的配列-mScarlet)：
ATGGCGTCTTCTTCTCATTTCACACCGAAGCAGAGTTTTTCGGATTCCCGAGTAGCAGATGACCATGACAAGTAGCGGCAGGACCAGCCCCAAGATGACTTGGAGATAACTACTAAGAAGAAAACGGTGAGCAAGGGCGAGGAGgtgagcaagggcgaggcagtgatcaaggagttcatgcggttcaaggtgcacatggagggctccatgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcccttctcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccagggccttcatcaagcaccccgccgacatccccgactactataagcagtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgccgtgaccgtgacccaggacacctccctggaggacggcaccctgatctacaaggtgaagctccgcggcaccaacttccctcctgacggccccgtaatgcagaagaagacaatgggctgggaagcgtccaccgagcggttgtaccccgaggacggcgtgctgaagggcgacattaagatggccctgcgcctgaaggacggcggccgctacctggcggacttcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagatgcccggcgcctacaacgtcgaccgcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccgtggtggaacagtacgaacgctccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaag(配列番号１８４)
　24ウェルプレートに播種された293-mScarlet細胞株に、Cas9タンパク質(2μg)/crRNA:tracrRNA(0.5 μg)複合体を、Lipofectamine(商標) CRISPRMAX(商標) Cas9 Transfection Reagent (Thermo Fisher Scientific社)を用いて導入した。Cas9/crRNA:tracrRNAの導入と同時(すなわち、0時間後)または6時間後に、アプタマー(sf-Sca)(終濃度100 nM)またはネガティブコントロールアプタマー(ds-cont)(終濃度100 nM)を導入し、その後、3日間培養し、mScarletの発現の有無を顕微鏡観察した。なお、Cas9/crRNA:tracrRNAの導入6時間後におけるアプタマーの導入は、Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific社)を用いて行った。使用したcrRNAおよびアプタマーの配列を表２７に示す。^はチオール化塩基を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
　結果を図２９に示す。アプタマーをCas9/crRNA:tracrRNAの導入と同時(Cas9/crRNA(Sca)+sf-Sca,0h)または6時間後(Cas9/crRNA(Sca)+sf-Sca,6h)に導入したいずれの場合も、sf-Scaにより細胞におけるゲノム編集が顕著に阻害された。
（実施例１２．LNAを含むアプタマーの細胞でのゲノム編集阻害実験）
　細胞内におけるアプタマーのゲノム編集に対する阻害効果をさらに改善するために、フラップ構造部分をLNAに置換したアプタマー(sf-Sca-LNA)を合成し、実施例１１と同様の実験系および手順により、その阻害活性を評価した。アプタマー(終濃度100 nM)をCas9/sgRNAと同時に細胞に導入し、その後、3日間培養し、mScarletの発現の有無を顕微鏡観察した。さらに、アプタマーの阻害活性を定量的に評価するために、観察後の細胞を回収し、FACSを用いてゲノム編集が起きた細胞(mScarletを発現する細胞)の数をカウントした。sf-Sca-LNAの配列を表２８に示す。下線はLNAを示し(ただし、LNAのCは5メチルシトシンである)、^はチオール化塩基を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
　その結果を図３０および図３１に示す。DNAアプタマー(sf-Sca)は、細胞内でのゲノム編集を約60～70%阻害したのに対し、LNA/DNAアプタマー(sf-Sca-LNA)は、ほぼ完全に細胞内でのゲノム編集を阻害した。また、sf-Sca-LNAの濃度依存性を調べた結果を図３２および図３３に示す。sf-Sca-LNAは、終濃度50 nM以上でほぼ完全にゲノム編集を阻害できることが明らかになった。
（実施例１３．内在遺伝子のゲノム編集に対するLNA修飾アプタマーによる阻害実験）
　次に、Cas9による内在遺伝子に対するゲノム編集をアプタマーにより阻害することができるかを調べた。標的とする内在遺伝子には、HPRT1とEMX1を選んだ。それぞれの遺伝子を標的とするcrRNAを合成し、Cas9/crRNA:tracrRNA複合体を調製した。得られた複合体を、実施例１１と同様の手順により、アプタマーと同時に293FT細胞(Thermo Fisher Scientific社)に導入し、3日間培養した。その後、細胞を回収し、Guide-it Mutation Detection kit(タカラバイオ社)を用いて、細胞からDNAを抽出し、ゲノム編集の標的部位をPCRで増幅し、PCR産物をT7E1 酵素により処理した後、2%アガロースゲル電気泳動することにより、ゲノム編集によって生じたインデル(insertion/deletion)を検出した。使用したcrRNA、アプタマー、およびプライマーの配列を表２９に示す。表中、大文字はDNA、小文字はRNA、下線はLNAを示し(ただし、LNAのCは5メチルシトシンである)、^はチオール化塩基を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
　結果を図３４に示す。HPRT1とEMX1のどちらに対するゲノム編集も、本発明の方法により設計されたアプタマー(sf-HPRT1およびsf-EMX1)により、ほぼ完全に阻害できることが確認された。

Claims (17)

  1. 　ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体の、前記複合体の基質である標的核酸に対する結合活性または酵素活性を阻害する核酸アプタマーであって、以下の領域（１）～（３）：
    　（１）前記ガイドRNAを認識する配列からなるガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを含む、一本鎖のガイドRNA認識領域、
    　（２）前記ヌクレアーゼに対応するPAM配列を片鎖に含む二本鎖のネック領域であって、前記ネック領域が、前記PAM配列からなる第一のネックオリゴヌクレオチドと、前記PAM配列に対して相補性を有する配列からなる第二のネックオリゴヌクレオチドとを含む、ネック領域、および
    　（３）第一の構造安定化オリゴヌクレオチドと、第二の構造安定化オリゴヌクレオチドとを含む、二本鎖の構造安定化領域
    を含んでなり、
    　ここで、前記領域（１）が、前記第二のネックオリゴヌクレオチドに連結されてフラップ構造を形成し、または、前記領域（１）が、前記第一のネックオリゴヌクレオチドおよび前記第二のネックオリゴヌクレオチドに連結されたループ構造であって、前記領域（１）における前記ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドが前記第二のネックオリゴヌクレオチドに隣接している、ループ構造を形成し、かつ、
    　前記領域（２）および前記領域（３）が連結されて一緒にステム構造を形成する、
    核酸アプタマー。
  2. 　前記ヌクレアーゼがCrispr-Casファミリーのヌクレアーゼである、請求項１に記載の核酸アプタマー。
  3. 　前記領域（１）における前記ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドが、前記標的核酸のPAM配列に隣接する2～30塩基長の配列からなる、請求項１または２に記載の核酸アプタマー。
  4. 　前記領域（１）における前記ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドが、前記標的核酸のPAM配列に隣接する3～22塩基長の配列からなる、請求項３に記載の核酸アプタマー。
  5. 　前記領域（１）が6～50塩基長である、請求項１～４のいずれか１項に記載の核酸アプタマー。
  6. 　前記領域（１）が架橋型核酸を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸アプタマー。
  7. 　前記領域（２）がミスマッチまたはバルジを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の核酸アプタマー。
  8. 　前記領域（２）における前記第一のネックオリゴヌクレオチドが5’-NGG-3’であり、前記複合体がCrispr-Cas9である、請求項１～７のいずれか１項に記載の核酸アプタマー。
  9. 　前記領域（２）における前記第一のネックオリゴヌクレオチドが5’-TTTN-3’であり、前記複合体がCRISPR-Cpf1である、請求項１～７のいずれか１項に記載の核酸アプタマー。
  10. 　前記領域（３）が4塩基対長以上である、請求項１～９のいずれか１項に記載の核酸アプタマー。
  11. 　ホスホロチオエート修飾を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の核酸アプタマー。
  12. 　ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体の、前記複合体の基質である標的核酸に対する結合活性または酵素活性を阻害する核酸アプタマーを製造する方法であって、
    　（１）前記ガイドRNAを認識する配列からなるガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを決定するステップと、
    　（２）前記ヌクレアーゼに対応するPAM配列からなる第一のネックオリゴヌクレオチドと、前記第一のネックオリゴヌクレオチドに対して相補性を有する配列からなる第二のネックオリゴヌクレオチドとを決定するステップと、
    　（３）第一の構造安定化オリゴヌクレオチドと、第二の構造安定化オリゴヌクレオチドとを決定するステップと、
    　（４）前記第一のネックオリゴヌクレオチドに、前記第一の構造安定化オリゴヌクレオチドを付加するステップと、
    　（５）前記第二のネックオリゴヌクレオチドに、前記第二の構造安定化オリゴヌクレオチドを付加するステップと、
    　（６）前記ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを、第二のネックオリゴヌクレオチドに連結するステップと、
    　（７）前記ステップ（１）～（６）により設計された配列を含む核酸を合成するステップと
    を含む、方法。
  13. 　（５’）前記第一の構造安定化オリゴヌクレオチドと、前記第二の構造安定化オリゴヌクレオチドとを連結するステップ
    をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 　（６’）前記ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを、直接またはリンカーオリゴヌクレオチドを介して第一のネックオリゴヌクレオチドに連結するステップ
    をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
  15. 　ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体の、前記複合体の基質である標的核酸に対する結合活性または酵素活性を阻害する方法であって、
    　（１）前記複合体と前記標的核酸とを含む反応液を調製するステップと、
    　（２）請求項１～１１のいずれか１項に記載の核酸アプタマーを前記反応液に添加するステップと
    を含む、方法。
  16. 　細胞内において、ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体の、前記複合体の基質である標的核酸に対する結合活性または酵素活性を阻害する方法であって、
    　（１）標的核酸を含む細胞に前記複合体を導入するステップと、
    　（２）請求項１～１１のいずれか１項に記載の核酸アプタマーを前記細胞に導入するステップと
    を含む、方法。
  17. 　（１）ガイドRNAとCrispr-Casファミリーのヌクレアーゼとを含む複合体を細胞に導入するステップと、
    　（２）請求項１～１１のいずれか１項に記載の核酸アプタマーを前記細胞に導入するステップと
    を含む、ゲノム編集方法。
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