JP4339852B2 - 遺伝子サイレンシングに関する方法および組成物 - Google Patents

Description

【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００２年８月１２日に出願された米国仮出願６０／４０２，７６９、２００２年８月３０日に出願された米国仮出願６０／４０７，５４３および２００３年５月２日に出願された米国仮出願６０／４６７，５４１の優先権を主張する。これらの出願は、参照として本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
短い二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、哺乳動物細胞中での遺伝子発現をサイレンシングするための強力な手段である（例えば、特許文献１〜９、および非特許文献１〜５参照）。
【０００３】
ｓｉＲＮＡを生じさせるための標準的方法は、予め決定された短い配列の本質的に費用のかかる化学的合成に依存している。標的配列のすべての部分がサイレンシング化において等しく効果的ではないため、効果的であるこれらの配列を確認するために、化学的に合成されたフラグメントのライブラリを生じさせる必要がある（非特許文献６参照）。
【０００４】
ｓｉＲＮＡを生じさせるための代替の方法はｉｎ ｖｉｔｒｏの転写に依存する（例えば、非特許文献７および８参照）。このアプローチは化学的合成を必要としないが、最も効果的であるものを決定するために、個々の短い配列を選択し、試験することが依然として必要である。
【０００５】
二本鎖ＲＮＡ分子を短いフラグメントに切断するために、いくつかの酵素的なアプローチが報告されている。大きなｄｓＲＮＡを切断してｉｎ ｖｉｖｏでｓｉＲＮＡを生成すると考えられている発展的に保持された酵素が、ダイサーと認識された（非特許文献９参照）。この酵素は、ヘリカーゼモチーフ、ＰＡＺ（ＰＩＷＩ−ＡＲＧＯＮＡＵＴ−ＺＷＩＬＬＥ）ドメイン、およびＲＮａｓｅＩＩＩ様である触媒ドメインのタンデムリピートを含む。大きなｄｓＲＮＡと混合されたダイサーを含むと思われるショウジョウバエ抽出物が、様々なサイズの短いｄｓＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで生成する。この混合物中でのＲＮＡｉ適用の好ましいサイズは、Ｔｕｓｃｈｌらにより２１〜２３ヌクレオチドであると決定された（特許文献４参照）。推定的切断酵素を含む粗細胞抽出物の使用に付随する問題は、例えば、タンパク質混合物中のどのタンパク質が、観察された効果を生じさせるのに必要であり充分であるかは不明である。さらにこの抽出物は、長いインキュベーション時間でｉｎ ｖｉｔｒｏで所望のサイズに切断されるような出発材料を比較的少量しか用いずに大きな二本鎖ＲＮＡを切断する際には、比較的非効率的である（非特許文献１０参照）。
【０００６】
より最近では、バキュロウイルス細胞発現システムから哺乳動物のダイサーが組換えにより得られた。バキュロウイルス感染昆虫細胞培養物において産生された組換えダイサーの溶解物が、マグネシウム緩衝剤の存在下、大きな二本鎖ＲＮＡから短い二本鎖ＲＮＡフラグメントを生じさせると報告されている。精製されたｓｉＲＮＡフラグメントを、培養された哺乳動物細胞系において同起源遺伝子の発現を「サイレンシング」させるために用いた（非特許文献１１参照）。このアプローチの制限要素として、バキュロウイルス発現システムの費用、二本鎖ＲＮＡ出発材料の不完全な消化、およびサイレンシング実験を行う前の前駆体ＲＮＡを除去するためのゲルに基づくまたは他の精製工程の必要性がある。
【０００７】
小さな二本鎖ＲＮＡを生じるための別の酵素的手法は、マグネシウムイオンの存在下、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＩＩＩを使用して、大きな二本鎖ＲＮＡを部分消化することである（非特許文献１２参照）。このアプローチに付随する問題としては、約１５ｎｔより大きい特定のサイズ範囲の二本鎖フラグメントの回収量が低いこと、および過剰または過少消化を避けるための付随する不便な滴定がある。消化を注意深くモニターしないと、マグネシウムイオンの存在下におけるＲＮａｓｅＩＩＩが、大きな二本鎖ＲＮＡを切断して、ＲＮＡｉで既知の用途がないと通常考えられる非常に小さなフラグメントにする。注意深いタイミングよい滴定で部分消化を行うことで、よくてもゲル全体にスメアーが発生するようになり、その後、培養された哺乳動物細胞におけるＲＮＡサイレンシングで用いるために特別のサイズの画分を回収することができた（非特許文献１２参照）。このアプローチでの問題は、（ａ）約１５ヌクレオチドより大きな特定のサイズを有するｄｓＲＮＡの収率に関する最終生成物、および（ｂ）切断生成物中の大きな二本鎖ＲＮＡ配列の発現量の程度に関して確実性が欠如していることである。後者は、長い二本鎖ＲＮＡの配列のすべての部分が遺伝子サイレンシングにおいて等しく効果的であるとは考えられず、重要な配列が過少発現であり、重要でない配列が過剰発現であり得るため、重要である。
【０００８】
遺伝子サイレンシングは、細胞および生物での分子機能の理解において非常に重要な方法になったため、あらゆる遺伝子のサイレンシングに適した二本鎖ＲＮＡを発生させるための、迅速で費用効果が高く、信頼性のある方法を有することが望ましい。
【０００９】
【特許文献１】
米国特許第６，５０６，５５９号明細書
【特許文献２】
国際公開第０１／２９０５８号パンフレット
【特許文献３】
国際公開第０１／６８８３６号パンフレット
【特許文献４】
国際公開第０１／７５１６４号パンフレット
【特許文献５】
米国特許出願公開第２００２／０１１４７８４号明細書
【特許文献６】
米国特許出願公開第２００３／０１２５２８１号明細書
【特許文献７】
米国特許出願公開第２００２／１６２１２６号明細書
【特許文献８】
米国特許出願公開第２００３／０１０８９２３号明細書
【特許文献９】
米国特許出願公開第２００２／０１７３４７８号明細書
【特許文献１０】
国際公開第９９／３２６１９号パンフレット
【非特許文献１】
Ｆｉｒｅら著「Ｎａｔｕｒｅ」第３９１巻：８０６〜８１１頁（１９９８年）
【非特許文献２】
Ｙａｎｇら著「Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．」第２１巻：７８０７〜７８１６頁（２００１年）
【非特許文献３】
Ｅｌｂａｓｈｉｒら著「Ｎａｔｕｒｅ」第４１１巻：４９４〜４９８頁（２００１年）
【非特許文献４】
Ｈａｍｍｏｎｄら著「Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ」第２巻：１１０〜１１９頁（２００１年）
【非特許文献５】
Ｓｈａｒｐ著「Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．」第１５巻：４８５〜４９０頁（２００１年）
【非特許文献６】
Ｈｏｌｅｎら著「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．」３０/２０：ｅ４６（２００２年）
【非特許文献７】
ＤｏｎｚｅおよびＰｉｃａｒｄ著「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．」第３０巻：１７５７〜１７６６頁（２００２年）
【非特許文献８】
Ｐａｄｄｉｓｏｎら著「Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．」第１６巻：９４８〜９５８頁（２００２年）
【非特許文献９】
Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら著「Ｎａｔｕｒｅ」第４０９巻：３６３〜３６６頁（２００１年）
【非特許文献１０】
Ｐａｄｄｉｓｏｎら「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」第９９巻：１４４３頁（２００２年）
【非特許文献１１】
Ｍｙｅｒｓら著「Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」第２１巻：３２４〜３２８頁（２００３年）
【非特許文献１２】
Ｙａｎｇら著「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」第９９巻：９９４２〜９９４７頁（２００２年）
【非特許文献１３】
Ｚｈａｎｇら著「ＥＭＢＯ Ｊ．」第２１巻：５８７５〜５８８５頁（２００２年）
【非特許文献１４】
Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉら著「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．」第３１巻：５８９〜５９５頁（２００３年）
【非特許文献１５】
Ｌｉら著「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．」第２１巻：１９１９〜１９２５頁（１９９３年）
【非特許文献１６】
Ｚｈａｎｇら著「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」第９４巻：１３４３７〜１３４４１頁（１９９７年）
【非特許文献１７】
Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら著「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」第２４３巻：８２〜９１頁（１９６８年）
【非特許文献１８】
Ｊ．Ｊ．Ｄｕｎｎ著「Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ」（Ｐ．Ｄ．Ｂｏｙｅｒ編）４８５頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２年）
【非特許文献１９】
Ｄ．Ｃｏｕｒｔ著「Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ」（Ｊ．Ｇ．ＢｅｌａｓｃｏおよびＧ．Ｂｒａｗｅｒｍａｎ編）７１頁、Ａａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３年）
【非特許文献２０】
Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ著「ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．」第２３巻：３７１頁（１９９９年）
【非特許文献２１】
ＳｕｎおよびＮｉｃｈｏｌｓｏｎ著「Ｂｉｏｃｈｅｍ．」第４０巻：５１０２〜５１１０頁（２００１年）
【非特許文献２２】
Ｈａｎｎｏｎら著「Ｎａｔｕｒｅ」第４１８巻：２４４〜２５１頁（２００２年）
【非特許文献２３】
Ｚａｍｏｒｅら著「Ｃｅｌｌ」第１０１巻：２５〜３３頁（２０００年）
【非特許文献２４】
Ｅｌｂａｓｈｉｒら著「Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」第１５巻：１８８〜２００頁（２００１年）
【非特許文献２５】
Ｍａｒｔｉｎｅｚら著「Ｃｅｌｌ」第１１０巻：５６３〜５７４頁（２００２年）
【非特許文献２６】
ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ著「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（第３版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（２００１年）
【非特許文献２７】
Ｌａｕら著「Ｓｃｉｅｎｃｅ」第２９４巻：８５８〜８６２頁（２００１年）
【非特許文献２８】
Ｌｅｅら著「Ｓｃｉｅｎｃｅ」第２９４巻：８６２〜８６４頁（２００１年）
【非特許文献２９】
Ｅｌｂａｓｈｉｒら著「ＥＭＢＯ Ｊ．」第２０巻：６８７７〜６８８８（２００１年）
【非特許文献３０】
Ｓａｍｂｒｏｏｋら著「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ」（２００１年）
【非特許文献３１】
Ｍｉｌｌｉｇａｎら著「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．」第１５巻：８７８３〜８７９８頁（１９８７年））
【００１０】
本発明の一つの態様においては、二価遷移金属カチオンとＲＮａｓｅＩＩＩを含む反応混合物中において、大きな二本鎖ＲＮＡの調製物を消化することを含む、ヘテロジニアス（heterogeneous）なｓｉＲＮＡ（ｈｓｉＲＮＡ）混合物を生成するための方法を提供する。ＲＮａｓｅＩＩＩと大きな二本鎖ＲＮＡとの重量比約０．００５：１〜２５：１の範囲で、遷移金属イオンの存在下で大きな二本鎖ＲＮＡをＲＮａｓｅＩＩＩで消化することができる。より具体的には、重量比は約０．０１２５：１〜１０：１の範囲が好ましい。ｈｓｉＲＮＡ混合物を作成するために用いる遷移金属カチオンには、例えば、マンガン、ニッケル、コバルト、亜鉛およびカドミウムがある。二価遷移金属カチオンの濃度は約５〜１００ｍＭが好ましい。濃度は決定的なものではないが、マンガンイオン１０〜２０ｍＭが好ましい範囲である。ｈｓｉＲＮＡの生成は、約６時間未満、好ましくは約２時間未満、より好ましくは１時間未満、あるいは約５秒という短時間で達成することができる。
【００１１】
本発明の一つの態様においては、酵素と基質との比（重量／重量）が約０．２５：１以上で、ＲＮａｓｅＩＩＩを含む反応混合物中で大きな二本鎖ＲＮＡの調製物を消化することを含む、ｈｓｉＲＮＡ混合物を生成する方法が提供される。
【００１２】
本発明の一つの態様においては、１以上の標的遺伝子の発現をサイレンシングまたは低下させる方法は、標的遺伝子の発現をサイレンシングまたは低下させることができるｈｓｉＲＮＡ混合物を宿主細胞内に導入することを含む。したがって、ｈｓｉＲＮＡは、（ａ）二価遷移金属カチオンとＲＮａｓｅＩＩＩを含む反応混合物中において、大きな二本鎖ＲＮＡの調製物を消化する、または（ｂ）酵素と基質との比（重量／重量）が約０．２５：１以上でＲＮａｓｅＩＩＩを含む反応混合物中で大きな二本鎖ＲＮＡの調製物を消化することにより製造することができる。重複配列を有すると共に約１５〜３０塩基のサイズであるヘテロジニアスな二本鎖ＲＮＡフラグメントのセットを、宿主細胞に導入することができ、ｈｓｉＲＮＡのセットは、ＲＮａｓｅＩＩＩを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏでの酵素的切断によりフラグメントがそこから誘導される大きな二本鎖ＲＮＡの配列の実質的な部分を表す配列を有している。上記方法において、大きなｄｓＲＮＡは、標的遺伝子またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的なヌクレオチド配列を有する。
【００１３】
本発明の一つの態様においては、約１５〜３０ヌクレオチドのサイズの複数の重複フラグメントを含む二本鎖ＲＮＡフラグメントのセットが提供され、重複フラグメントは、好ましくは酵素が精製されているｉｎ ｖｉｔｒｏでの酵素的切断によりフラグメントがそこから誘導される１以上の大きな二本鎖ＲＮＡの配列の実質的な部分を表している。大きな二本鎖ＲＮＡの一つの鎖は、特徴的に、標的メッセンジャーＲＮＡの一部または全部に相補的な配列を有する。好ましくは、このセットのフラグメントの実質的な割合、例えば少なくとも約５０％が、ゲル精製工程の前には、ヌクレオチドの長さが２１〜２２の範囲にある。
【００１４】
二本鎖ＲＮＡフラグメントのセットにより表される大きな二本鎖ＲＮＡの配列の実質的な部分は、約５０％より多く、好ましくは約６５％より多い。さらに、ＲＮＡフラグメントのセットの３０％より多い部分が、約１８〜２５塩基対のフラグメントサイズを有し得る。セットの少なくとも一つのフラグメント、しかし、セットのフラグメントの少なくとも約５０％、または７５％、または実際には１００％が、標的ｍＲＮＡの切断を起こすことができる。フラグメントのセットは、さらに、真核細胞に導入されたときに遺伝子をサイレンシングさせることができる。
【００１５】
本発明の別の態様において、各クローンがｈｓｉＲＮＡ混合物からの１以上の二本鎖ＲＮＡフラグメントに対応しているＤＮＡクローンのライブラリを創成する方法が提供される。この方法は、（ａ）ｈｓｉＲＮＡ混合物を変性して対でないＲＮＡ鎖の混合物を形成する工程、（ｂ）対でないＲＮＡ鎖の３’末端に第１の一本鎖ＤＮＡプライマーをライゲートし、対でないＲＮＡ鎖の５’末端に第２の一本鎖ＤＮＡプライマーをライゲートする工程、（ｃ）キメラＤＮＡ−ＲＮＡ生成物を逆転写して、相補的ＤＮＡフラグメントを形成する工程、（ｄ）第２の鎖を合成するための第２の一本鎖プライマーを用いて、逆転写されたＤＮＡ−ＲＮＡ生成物から二本鎖ＤＮＡを合成する、またはポリメラーゼ依存増幅法を用いてＤＮＡ−ＲＮＡ生成物を増幅する工程、および（ｅ）１以上のＤＮＡフラグメントをベクターに挿入してＤＮＡクローンのライブラリを形成する工程を含む。この態様は、場合により、第１のライゲーション工程の前に各鎖から５’リン酸を酵素的に除去し、第２のプライマーのライゲーションの前に第１のプライマーライゲーションの生成物の５’末端を酵素的にリン酸化する工程を含む。
【００１６】
工程（ｂ）におけるＲＮＡ鎖の５’末端を脱リンすることができ、前記工程（ｂ）におけるＲＮＡ鎖の３’末端は３’ヒドロキシル末端を有することができる。上記第１のＤＮＡプライマーは５’リン酸と３’リン酸の両方を有し、第２のプライマーを５’末端にライゲートする前に３’末端にライゲートすることができる。さらに、第１のプライマーにライゲートされたＲＮＡ鎖を続いてリン酸化し、次に、第２のプライマーにライゲートすることができる。この反応における第２のプライマーは、３’末端においてリン酸化されていなくてよい。前記方法で利用されるベクターは、ｐＵＣ１９またはＬｉｔｍｕｓベクターであり得るが、真核細胞における発現用のものを含む、ＤＮＡフラグメントのクローニングに適したベクターを用いることができる。
【００１７】
前記方法により生成されたＤＮＡクローンを用いて、真核細胞中の１以上の標的遺伝子の発現を低下させることができる。細胞または生物中の標的遺伝子の発現の低下は、細胞、細胞を含む組織または生物全体のいずれかにおいて生じる表現型変化を分析する手段を提供する。表現型における遺伝子発現の役割の理解は、疾患のメカニズムおよび、疾患の治療および診断の方法の洞察を提供し得る。これは、生物における所望の特徴を向上させる手段も提供することができる。ＤＮＡクローンまたは前記ｈｓｉＲＮＡの混合物を用いる遺伝子サイレンシングによる遺伝子発現の変更によって、遺伝子生成物が機能する生化学的経路を分析するための価値のある手段を提供することができ、抗体のような他の試薬と組み合わせて用いることができる。
【００１８】
前述のＤＮＡクローンの有用性は、特定のｓｉＲＮＡフラグメントの発現のために組換えＤＮＡの存在により特定の標的遺伝子発現が変えられるトランスジェニック非ヒト動物を作成する機会を提供する。
【００１９】
本発明の一つの態様においては、ＲＮａｓｅＩＩＩ、マンガンイオンを約５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲で含むＲＮａｓｅ緩衝液、および場合により、大きな二本鎖ＲＮＡを合成するための試薬を含むｈｓｉＲＮＡ混合物を調製するためのキットが提供される。
【００２０】
本発明の一つの態様においては、大きな二本鎖ＲＮＡ分子を得るための方法であって、（ａ）二本鎖ＲＮＡをコードしているＤＮＡフラグメントまたはＤＮＡフラグメントのライブラリを、対向しているプロモーター、たとえばＴ７プロモーターに側面を挟まれるクローニング部位を有するベクターに挿入すること、（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの転写を行うこと、および（ｃ）大きな二本鎖ＲＮＡ分子を得ることを含む方法が提供される。
【００２１】
本発明の一つの態様においては、標的遺伝子の遺伝子サイレンシングを増加させることができるｈｓｉＲＮＡ混合物を確認するための迅速な発見方法であって、（ａ）標的遺伝子のセグメントに相補的な配列を各々の大きなｄｓＲＮＡが有する複数の大きなｄｓＲＮＡを合成すること、（ｂ）マンガンイオンの存在下に大きなｄｓＲＮＡの各々をＲＮａｓｅＩＩＩで消化して対応するｈｓｉＲＮＡ混合物を生成すること、（ｃ）各ｈｓｉＲＮＡ混合物を真核細胞に導入して、遺伝子サイレンシングが起こるかどうか決定すること、および（ｄ）どのｈｓｉＲＮＡ混合物が遺伝子サイレンシングの増加を起こしたか決定することを含む方法が提供される。予め選択されたｈｓｉＲＮＡ混合物と選択された第２ｈｓｉＲＮＡ混合物とを組み合わせることにより、またはｈｓｉＲＮＡ混合物から選択された個々のｓｉＲＮＡフラグメントまたはそれらのサブセットをサイレンシング活性に基づいて組み合わせることにより、遺伝子サイレンシングをさらに高めることができる。次に、これらのフラグメントを組み合わせて、所望の遺伝子サイレンシング活性の新規混合物を形成することができる。
【００２２】
本発明の一つの態様においては、ｍＲＮＡ中の切断部位からのｓｉＲＮＡに対応する配列を確認する方法であり、（ａ）酵素的にｈｓｉＲＮＡ混合物を得ること、（ｂ）ｈｓｉＲＮＡを細胞に導入すること、（ｃ）切断したｍＲＮＡを細胞から抽出すること、（ｄ）ｓｉＲＮＡによって切断されたｍＲＮＡの切断部位における末端ヌクレオチドの配列を決定すること、および（ｅ）切断部位配列からのｓｉＲＮＡ配列、およびインタクトなｍＲＮＡからの隣接ヌクレオチドを確認することを含む方法が提供される。この方法を利用して、ｍＲＮＡに特異的に結合してｍＲＮＡの切断を開始させる約１５〜３０ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡを含む、ｓｉＲＮＡフラグメントのセットを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
大きなｄｓＲＮＡの実質的な部分を表し遺伝子発現のサイレンシングにおいて効果的である重複配列を含む短い二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡフラグメントのヘテロジニアスな混合物を、マンガンまたは他の二価遷移金属イオンを含む、および／または基質に対する酵素の割合が高い、緩衝液の存在下にＲＮａｓｅＩＩＩを用いて作製するのに成功した。
【００２４】
合成化学的アプローチよりも、遺伝子サイレンシング用の短いｄｓＲＮＡを大きなｄｓＲＮＡから得るような酵素的アプローチが望まれる。しかし、ダイサー抽出物または組換えダイサーは少量でしか入手できず、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは比較的非効率的に切断する。さらに、ダイサーがＲＮＡを切断するメカニズムは、サイレンシング用の潜在的なｓｉＲＮＡを豊富に含まない混合物を産出する（非特許文献１３および１４参照）。
【００２５】
これに対して、容易に大量に生成されると共に非常に活性であるＲＮａｓｅＩＩＩは、大きなｄｓＲＮＡを、遺伝子サイレンシングにおいて非効果的であるフラグメントに迅速に切断する。
【００２６】
ＲＮａｓｅＩＩＩの酵素的特性を、遺伝子サイレンシング用以外の目的のために研究した。これらの実験のうち、一部のものは、酵素緩衝液中のマグネシウムを他の二価カチオンで置き換えた。しかし、そのような置換は、ＲＮａｓｅＩＩＩ活性にとってマグネシウムよりも好ましくないと結論付けられた（非特許文献２、および非特許文献１５から２０参照）。ＳｕｎおよびＮｉｃｈｏｌｓｏｎは、ＲＮａｓｅＩＩＩの既知の天然基質に相当する６０塩基長ヘアピンＲＮＡを用いる酵素の反応機構を解明するためにＭｎ²⁺イオンを利用した（非特許文献２１参照）。この文献は、マンガンの存在下、ＲＮａｓｅＩＩＩ活性がマンガンイオン濃度３ｍＭでピークに達し、マンガンイオンの濃度が増加すると急速に低下したことを報告した。マンガンは、高濃度で酵素上の抑制部位に結合するものと特徴付けられた。
【００２７】
従来技術においてマグネシウムイオンを他の二価カチオンと置換することは見込みがない結果であるにもかかわらず、ここで、ＲＮａｓｅＩＩＩへのマンガンイオンの効果を調査して、大きな二本鎖ＲＮＡの切断への効果を決定した。本明細書で報告された発見は、低コストで生物学的に効果的な遺伝子サイレンシング試薬を作る新規方法の基礎を提供する。
【００２８】
本明細書に記載の方法の利点には以下のとおりである。
【００２９】
（ａ）ゲルに基づくサイズ分離工程に依存しない迅速かつ費用のかからないプロセスにより遺伝子発現をサイレンシングさせるのに適したサイズの二本鎖ＲＮＡフラグメントの高められた濃度を得ること。この方法は、複数の二本鎖ＲＮＡフラグメントを含むｈｓｉＲＮＡ混合物を提供するが、この混合物はその約５％未満の切断されていない大きな二本鎖ＲＮＡを含み、約８％超のものが１８〜２５塩基対のフラグメントサイズを有する。実際、この方法の態様において、混合物は、１８〜２５塩基対のサイズを有するフラグメントを１５％または２０％または４０％より多く含み得る。その簡便性から、この手法により、自動化および処理量を増やすのが容易である。
【００３０】
（ｂ）遺伝子サイレンシング効果を起こす特定のフラグメントの確認を要することなく遺伝子サイレンシング活性を有する二本鎖ＲＮＡフラグメントの調製生物を形成すること。
【００３１】
（ｃ）個々のフラグメントをクローニングするか、またはクローンのライブラリもしくは配列を形成して、そこからフラグメントが得られるＲＮＡに関してこれらのフラグメントのマッピングを可能にすることにより、および遺伝子サイレンシング活性のために個々のフラグメントを試験することにより、方法の生成物を利用する手段を提供すること。
【００３２】
（ｄ）核酸のための標準的トランスフェクションまたは形質転換技術を用いて機能を研究するために真核細胞または生物において単一の遺伝子または遺伝子のファミリーをサイレンシングさせることを含む用途のためにｓｉＲＮＡ試薬を提供すること。
【００３３】
（ｅ）これらのｓｉＲＮＡ試薬を、治療剤としてまたは、治療剤スクリーニングもしくは標的確認アッセイにおいて用いること。
【００３４】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる用語を以下に定義する。当該用語が、文脈によって他の意味を示さない限り、この定義が適用されるものとする。
【００３５】
「ｈｓｉＲＮＡ混合物」は、遺伝子発現をサイレンシングさせるのに適した少なくとも一つのフラグメント（ｓｉＲＮＡ）を含む短い二本鎖ＲＮＡフラグメントのヘテロジニアス（ｈ）な混合物を意味する。ｈｓｉＲＮＡ混合物中のＲＮＡフラグメントは、一貫して、エチジウム染色ｎａｔｉｖｅ ポリアクリルアミドゲル分析により決定される１８〜２５塩基対の長さを有する実質的な画分（フラグメントの合計数の約１５％を超える）を含む。２５ヌクレオチドより大きいまたは１８ｎｔより小さいフラグメントの存在は排除されない。ｈｓｉＲＮＡ混合物は、好ましくは、二価遷移金属カチオン、好ましくは、マンガンイオンの存在下、「大きな」二本鎖ＲＮＡをＲＮａｓｅＩＩＩで消化することにより得られる。
【００３６】
「サイレンシング」は細胞内の遺伝子発現の標的抑制よる部分的または完全な機能消失を意味し、「ノックダウン」とも呼ばれる。環境および取り組むべき生物学的問題に応じて、部分的に遺伝子発現を低下させることが好ましいことがある。あるいは、遺伝子発現をできるだけ低下させることが望ましいかもしれない。サイレンシングの程度は、当該分野で知られているあらゆる方法により決定することができ、その一部が特許文献１０に要約されており、参照により本明細書に組み込む。アッセイに応じて、遺伝子発現の定量は、種々の量、例えば、１０％、３３％、５０％、９０％、９５％または９９％を超える量の抑制の検出を可能にする。
【００３７】
「大きな二本鎖ＲＮＡ」は、約４０塩基対（ｂｐ）を超える、例えば、１００ｂｐ、またはより詳細には３００ｂｐを超えるサイズのあらゆる二本鎖ＲＮＡを意味する。大きなｄｓＲＮＡの配列は、ｍＲＮＡのセグメントまたはｍＲＮＡ全体を表す。本明細書では、大きなｄｓＲＮＡの最大サイズは制限されない。二本鎖ＲＮＡは修飾塩基を含み得、修飾はリン酸糖バックボーンまたはヌクレオチドに成され得る。そのような修飾は、窒素または硫黄ヘテロ原子または、当該分野で知られている他のあらゆる修飾を含む。二本鎖ＲＮＡは、組換え技術および／または化学的合成により、またはＭＥＧＡＳＣＲＩＰＴ（登録商標）（Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州オースチン）のような市販のキットおよび当該分野で知られている方法を用いて、酵素的に作ることができる。本発明の一つの態様は、大きな二本鎖ＲＮＡを作成するためにＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ベバリー）を利用する。大きなｄｓＲＮＡを作成し保存する他の方法が、特許文献１０に記載されている。
【００３８】
二本鎖構造は、ヘアピンまたはミクロＲＮＡについて起こるような自己相補的ＲＮＡ鎖により、または二つの異なる相補的ＲＮＡ鎖のアニーリングにより形成することができる。
【００３９】
ｈｓｉＲＮＡ混合物についての文脈における「ヘテロジニアス（Heterogeneous）」とは、二価遷移金属イオンの存在下、ＲＮａｓｅＩＩＩでの切断後に単一の大きな二本鎖ＲＮＡまたは大きな二本鎖ＲＮＡの混合物から生成される同一でない配列を有する二本鎖ＲＮＡフラグメントを意味する。フラグメントは、大きなＲＮＡの全長からの配列を集合的に含むことによりヘテロジニアスな混合物を形成する。
【００４０】
「ＲＮａｓｅＩＩＩ」は、天然の酵素またはその組換え型を意味し、突然変異体および誘導体または相同体を含み得る。哺乳動物細胞でのサイレンシングを達成するために本明細書に記載されたバクテリアＲＮａｓｅＩＩＩの有用であるので、本態様において、真核動物または原核動物からのＲＮａｓｅの使用を支持する。本発明の態様では、ｈｓｉＲＮＡ混合物を調製するために２以上のＲＮａｓｅを使用してもよい。本明細書に定義されるＲＮａｓｅＩＩＩは、タンパク質中のアミノ酸コンセンサス配列［ＤＥＱ］−［ｋＲＱＴ］−［ＬＭ］−Ｅ−［ＦＹＷ］−［ＬＶ］−Ｇ−Ｄ−［ＳＡＲＨ］（ＰＲＯＳＩＴＥ：ＰＤＯＣ００４４８、ＲＮａｓｅＩＩＩの文献）によって特徴付けられる。
【００４１】
本実験においてＲＮａｓｅＩＩＩの濃度を記載するために単位を用いた場合、重量／体積の換算のための式は３２単位＝１μｇ／μｌ ＲＮａｓｅＩＩＩである。可溶性細菌ＲＮａｓｅＩＩＩ酵素は、組換え体をもととして容易に精製することができ、現在市販されている（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ベバリー）。
【００４２】
「完全消化」はＲＮａｓｅＩＩＩ反応を意味し、約５０塩基対より大きなサイズの二本鎖ＲＮＡのフラグメント（充填ウエル中に維持された、または酵素に結合した消化材料は除く）は、臭化エチジウム染色２０％ポリアクリルアミドゲル上で容易に検出することができない。
【００４３】
「宿主細胞」は、培養された真核細胞または、ヒトを含む哺乳動物のような脊椎動物および昆虫のような無脊椎動物を含む動物の細胞を意味する。宿主細胞は、植物および微生物からの細胞も意味する。
【００４４】
「重複」は、２つのＲＮＡフラグメントが、一つの鎖上に複数のヌクレオチドで重複する配列を有する場合、例えば、複数のヌクレオチド（ｎｔ）の数がわずか２〜５ヌクレオチドまたは５〜１０ヌクレオチド、またはそれ以上である場合を意味する。
【００４５】
「相補的配列」は、そこにハイブリッド形成する配列に必ずしも１００％同一でないが、それにもかかわらず、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２〜１６時間、その後の洗浄を含むというストリンジェントな条件下に特定の核酸にハイブリッド形成することができる配列を意味する。遺伝子変異、種の多型性、進化の相違または化学的修飾により生じる配列変化を許容できる。
【００４６】
メッセンジャーＲＮＡの「一部または全部」は、大きなｄｓＲＮＡに相補的であるｍＲＮＡの部分を意味する。
【００４７】
「実質的な部分」は、ｈｓｉＲＮＡ混合物中に含まれる配列中に表される大きなｄｓＲＮＡの配列の量を意味する。一つの態様において、代表的な配列は２０％を超える。他の態様において、代表的な配列は３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を超える。
【００４８】
「１以上のｄｓＲＮＡ」は、配列に基づき互いに異なるｄｓＲＮＡを意味する。
【００４９】
「標的遺伝子またはｍＲＮＡ」は、目的とする遺伝子またはｍＲＮＡを意味する。実際、遺伝的特徴または配列決定により予め確認された任意の遺伝子は標的となる。標的遺伝子またはｍＲＮＡは、発生遺伝子および調節遺伝子、および代謝または構造遺伝子、あるいは酵素をコードする遺伝子を含む。標的遺伝子は、表現型が調査中の細胞中で、または生物中で表現型特徴を直接または間接的に影響するような方法で発現されうる。標的遺伝子は、内因性または外因性であってよい。そのような細胞は、成体または動物胎児の体、または配偶子を含む植物中の細胞または、不死の細胞系または一次細胞培養において生じるような単離細胞を含む。
【００５０】
脊椎動物、無脊椎動物、植物または原形体細胞、あるいは微生物内へのｈｓｉＲＮＡ混合物の導入は細胞内に直接することができるか、または細胞外液より空洞もしくは間質空間に、経口的にまたは浸漬により生物の循環系に、経皮的に経粘膜経路で局所的に、または宿主にＤＮＡを感染させるウイルスベクターの使用により達成することができる。
【００５１】
培養物中の細胞内にｓｉＲＮＡを導入するために、トランスフェクションまたは形質転換の標準的プロトコルを、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００、ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）、ＴＲＡＮＳ−ＩＴ ＴＫＯ（登録商標）（Ｍｉｒｕｓ Ｃｏｒｐ．、ウィスコンシン州マジソン）、Ｔａｒｇｅｆｅｃｔ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州サンティー）、リン酸カルシウムまたは電気穿孔を用いるプロトコルを用いることができる。ｈｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡからのフラグメントを含む加工されたベクターは、生物全体を形質転換またはトランスフェクションするための細菌ベクター、プラスミドまたはウイルスベクターを含み得る。例えば葉緑体内にｄｓＲＮＡを導くための植物のために遺伝子銃を利用することができる。外来核酸を生物および細胞内に導入するための方法は、当該分野で周知である。特定のｈｓｉＲＮＡ混合物からの個々のフラグメントを発現しているＤＮＡクローンのｈｓｉＲＮＡ混合物を動物全体に導入することは、核酸を導入するための標準的技術により達成することができる。
【００５２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形の表現は、特記しない限り複数形を含む。
【００５３】
（切断の条件）
切断の詳細な条件を以下に示すが、それらの条件は限定を意図しない。等価の組成および緩衝液を、本態様のために容易に代わりに使用することができる。
【００５４】
ｈｓｉＲＮＡ混合物を、大きな二本鎖ＲＮＡ、ＲＮａｓｅＩＩＩ酵素および、二価遷移金属を含む標準的緩衝液から調製することができる。好ましい遷移金属はマンガンであるが、ｈｓｉＲＮＡを発生させるためにコバルト、ニッケル、カドミウム、亜鉛または他の遷移金属イオンも用いることができる（実施例２）。所望の反応生成物の形成は、金属イオン濃度にあまり影響されない（実施例１）。図１−１は、約５〜５０ｍＭマンガンイオン濃度のＭｎＣｌ₂の濃度が所望のｈｓｉＲＮＡ混合物を生成したことを示した。好ましい濃度は、約１０〜２０ｍＭマンガンイオンの範囲である。
【００５５】
以下のように、ｈｓｉＲＮＡ混合物を形成するための大きな二本鎖ＲＮＡ基質の消化のために、種々の酵素反応パラメータを最適化した。
【００５６】
（ａ）緩衝液条件：５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．９（２５℃）、１ｍＭ ＤＴＴから作られ、さらに選択した遷移金属または１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴおよび１０ｍＭ ＭｎＣｌ₂ ｐＨ７．５（２５℃）を含む緩衝溶液を実施例で用いた。しかし、別の緩衝液および塩を種々の濃度で利用することは本態様の範囲内である。同様に、ｐＨを変化させることは本態様の範囲内である。好ましいｐＨ範囲は、およそｐＨ７〜８．５である。
【００５７】
（ｂ）反応時間：遷移金属イオン、特に、マンガンイオンの存在下、ＲＮａｓｅＩＩＩを用いてｈｓｉＲＮＡ混合物を得る切断反応を１０分以内で達成した（図１−５）。培養を１８０分まで延長することにより同様の量のｈｓｉＲＮＡ混合物が達成されることが示された（図１−５）。反応時間は非常に決定的なパラメータではなく、実験者の都合により、１０分未満または１８０分を超える反応時間、例えば、４時間または６時間、さらにそれ以上の反応時間を利用し得ると考えられる。１分未満または５秒のようにできるだけ短い反応時間を用いても成功した結果が得られた。
【００５８】
（ｃ）反応混合物中の酵素の濃度：酵素を滴定して反応生成物をゲル上で分析したとき、図１−２で、１０００塩基のサイズの二本鎖ＲＮＡ２．５μｇ（合計体積５０μｌ）を完全に消化するためには、０．０２５μｇ／μｌ ＲＮａｓｅＩＩＩを超える最終濃度で充分であることを示した。実施例１において、ＲＮａｓｅＩＩＩの０．１μｇ／μｌを用いて１０００ｂｐ ｄｓＲＮＡの０．０５６μｇ／μｌを３７℃で３０分間消化したときのｈｓｉＲＮＡの最大収率を計算した（２２ｂｐ二本鎖ＲＮＡ毎に約１個のＲＮａｓｅＩＩＩモノマーに相当する）。
【００５９】
（ｄ）基質に対するＲＮａｓｅＩＩＩ酵素の量（重量／重量）：
二価遷移金属イオンの存在下、約０．００５：１〜２５：１の範囲の基質に対するＲＮａｓｅＩＩＩ酵素の比（重量／重量）で、大きな二本鎖ＲＮＡを切断してｈｓｉＲＮＡ混合物にすることができる。実際、例えば約２：１〜３：１の重量比の基質に対する高濃度のＲＮａｓｅＩＩＩを、遷移金属二価カチオンの不存在下、効果的に用いてポリアクリルアミドゲル上で２１〜２３ｎｔに相当するバンドを作ることができる。バンド中の材料の量は、基質に対する酵素の比の増加と共に増加する。しかし、遷移金属二価カチオンの不存在下に得られる収率は、遷移金属二価カチオンの存在下よりも実質的に少ない。
【００６０】
図１−２は、酵素対基質の比が約０．０１２５：１〜８．８：１、好ましくは約０．２５：１以上の範囲で行う切断による生成物を示している。図１−２は、酵素と基質との重量比が０．５：１で、マンガンイオンの存在下、大きな二本鎖ＲＮＡを完全に消化したことを示している。大きなｄｓＲＮＡに対するＲＮａｓｅＩＩＩの高い濃度比（例えば、質量比で０．２５：１〜２：１〜１５：１）における切断で、１５〜３０ヌクレオチド、特に２１〜２３ヌクレオチドに相当する画分の収率が向上する。マンガンイオンの存在下での高濃度の酵素を用いると、所望のサイズのフラグメントの収率がさらに向上する。
【００６１】
（ｅ）マンガンに加えての遷移金属二価カチオンの使用
マンガンイオンに加えて二価遷移金属イオンＣｏ²⁺、Ｎｉ²⁺、Ｃｄ²⁺またはＦｅ²⁺の存在下、ｈｓｉＲＮＡ混合物を調製することができる（例えば、図２および実施例２に示す）。例えば、ＭｎＣｌ₂、ＣｏＣｌ₂、ＮｉＳＯ₄、ＣｄＣｌ₂またはＦｅＳＯ₄を、０．１〜１００ｍＭ、好ましくは５〜１００ｍＭ、例えば、１０〜２０ｍＭの濃度で反応混合物に加えることができる。反応を最適化するパラメータは、本明細書においてマンガンについて最も詳細に記載されているが、ｐＨ、緩衝液の条件、温度、反応時間、濃度および実施例１から７に記載の手法を用いて決定される酵素対基質の比について、他の二価遷移金属の存在下でのＲＮａｓｅＩＩＩの最適反応条件が決定できると予想される。ｈｓｉＲＮＡ混合物を調製するために、マグネシウムと比較して、１０ｍＭ濃度の種々の二価遷移金属カチオンの存在下、ＲＮａｓｅＩＩＩの優れた性能が証明された（図１−１および図２）。
【００６２】
遺伝子サイレンシングの分野における問題の一つは、切断のために特定のメッセンジャーＲＮＡを効果的に標的にするという所望の目的を達成することができる短い二本鎖ＲＮＡ（１５〜３０ｂｐ）を特定する問題である。本発明の各態様において、この問題は、未翻訳ｍＲＮＡを含む標的ｍＲＮＡの全部または一部に同一の配列を有する大きな二本鎖ＲＮＡを利用すること、およびこの大きなＲＮＡを、遺伝子サイレンシングのための適当なサイズの複数の重複フラグメントに切断することにより解決される。実施例３および４は、切断生成物が大きな二本鎖ＲＮＡの全長を表すことを示しており、実施例６は、ｈｓｉＲＮＡ混合物が、昆虫細胞および哺乳動物細胞を含む種々の細胞にトランスフェクトすることにより、遺伝子サイレンシングすることができるフラグメントをその中に含むことを示している。
【００６３】
いったんｈｓｉＲＮＡ混合物が得られると、混合物中の個々の二本鎖ＲＮＡフラグメントに対応するＤＮＡ配列を含むクローンのライブラリを作成することができる（実施例４）。適当なプロモーターが提供されると、長期間の遺伝子サイレンシングに用いるための短い二本鎖ＲＮＡの連続的な供給が行われるように細胞をトランスフェクトするために個々のクローンを用いることができる。標的細胞または生物に個々のクローンまたは選択されたクローンの混合物をトランスフェクトした結果としての遺伝子発現のサイレンシングは、例えば治療用途において、細胞に二本鎖ＲＮＡ自体をトランスフェクトすることにより達成される一時的な遺伝子サイレンシング効果よりも優れた、特別の利点を有する。これは、特定の遺伝子の遺伝子発現を特異的に調節する薬剤を限定せずに供給する治療用途のための新規試薬を提供する。
【００６４】
本明細書に記載されるような個々のフラグメントのクローンを得ることの他の利点としては、（ａ）二本鎖ＲＮＡの切断により形成されるフラグメントの混合物中でのどの単一のフラグメントまたはフラグメントのサブセットが遺伝子サイレンシングが可能であり、混合物中の他のフラグメントが不可能であることを理解する根拠、（ｂ）遺伝子サイレンシングにおいて一部のＲＮＡフラグメントが効果的であり他のフラグメントは効果的でないかの理由を研究する手段、（ｃ）特定のｍＲＮＡのための特定のｈｓｉＲＮＡの特異性の証明、（ｄ）異なるＲＮａｓｅＩＩＩに対する、特定のＲＮａｓｅＩＩＩからのｈｓｉＲＮＡ混合物の独自の特徴の証明、および（ｅ）ｈｓｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡ上で切断を誘発する部位の特徴付け；ならびに（ｆ）クローニングされたフラグメントの統計的分析に基づく合成ｓｉＲＮＡの設計のためのコンピューターアルゴリズムの創造、がある。
【００６５】
（遺伝子サイレンシングの特異性）
特定の標的ｍＲＮＡに対する遺伝子サイレンシングの特異性を、標的ｍＲＮＡ中の配列のＢＬＡＳＴ分析を用いて確認して、ＲＮＡの伸長領域（２０塩基長を超える）が非特異的遺伝子サイレンシングを避けるために他の遺伝子転写体に同一でないと決定することができる。
【００６６】
本明細書に記載の方法を用いて、遺伝子ファミリーの単一のメンバーに特異的であると共に、その遺伝子ファミリーの他のメンバーからのｍＲＮＡをサイレンシングさせないｈｓｉＲＮＡ調製物を、標的ｍＲＮＡのセグメントに配列が相補的である長いｄｓＲＮＡ（長いｄｓＲＮＡセグメントとも呼ばれる）から製造することができる。あるいは、遺伝子ファミリー中のあらゆる遺伝子に特異性を有するが遺伝子ファミリー外の他の遺伝子の特異性を有さないｈｓｉＲＮＡ調製物を製造することができる。
【００６７】
独自のまたは、ｍＲＮＡのファミリーのためのコンセンサス領域の一部または全部を形成するｍＲＮＡ配列を標的にすることにより、適当な遺伝子サイレンシング効果を達成することができる。
【００６８】
ｓｉＲＮＡフラグメントの「超強力な」混合物を、場合によりクローニングされると共に標的ｍＲＮＡ上の部位において切断を起こすものと認識される個々のｓｉＲＮＡフラグメントを組み合わせて、所望の遺伝子サイレンシング効果を有する混合物を得る本方法に従って調製することができる。
【００６９】
本態様の利点の一つは、活性についてｉｎ ｖｉｖｏで試験することができると共に、オリゴヌクレオチドフラグメントの費用のかかる化学的合成を必要とすることなく、または部分的酵素的消化または天然のダイサーを含む細胞の粗抽出物により提供されるような、より場当たり的な手法を必要とすることなく、そこから、特定の配列特異性を有するフラグメントのサブセットを所望により選択することができる、ｈｓｉＲＮＡフラグメントの混合物を迅速に調製する性能である。二価カチオンの存在下でのＲＮａｓｅＩＩＩ消化の利点は、大きなｄｓＲＮＡの全体が、重複フラグメントにより実質的に表されることである。図４−５および図４−６は、ＮｈｅＩ−ＢｓｒＧＩ ＧＦＰフラグメントの配列の５０％を超える部分が、ｈｓｉＲＮＡ混合物の相補的ｓｉＲＮＡフラグメントによって覆われることを示している。このパーセントによる表示は推定であると予想される。リンカーとして用いられる特性のプライマーにまたはクローニングされたフラグメントの部分的サンプリングに関する他の鎖と比較して、一つの鎖から得られるクローンに明らかな偏りがある。
【００７０】
鋳型ＤＮＡから発現される標的ｍＲＮＡに関する大きなＲＮＡのサイズおよび配列の特徴を変えることにより、遺伝子サイレンシングへの洞察を達成することができる。例えば、連続的に削除またはランダムに切断されたＤＮＡ鋳型を、種々なサイズのｄｓＲＮＡを発生させるために用いることができ、ここに記載のようにＲＮａｓｅＩＩＩで消化したときに、サイレンシングにおける効果について試験することができる（実施例８）。
【００７１】
実施例８は、ｍＲＮＡのセグメントに対応すると共に二価カチオンの存在下にＲＮａｓｅＩＩＩ消化に付されたｄｓＲＮＡが、細胞培地におけるノックダウン遺伝子発現においていかに効果的であるかを示している。異なるセグメントが、ノックダウン活性の程度において変化する混合物を生成することができる。例えば、この手法を用いて、ｍＲＮＡにおける翻訳配列に隣接する長い末端繰り返し（ＬＴＲ）領域の調節機能を理解することができる。
【００７２】
ＤｎＭＴ１セグメント１、３または２に対応するｈｓｉＲＮＡによるＤｎＭＴ１のノックダウン（効果の向上のため）を、対応するタンパク質バンドの低下または不存在により検出した（レーン４、５および６とレーン２および３（図１０−１との比較）。試験した３つのすべての場合に、（セグメント１、２および３）ｈｓｉＲＮＡで処理した細胞は、標的ＤｎＭＴ１の発現の効果的なノックダウンを示した。セグメント２のｈｓｉＲＮＡのサイレンシング効果は、セグメント１および３のｈｓｉＲＮＡよりも高かった。逆に、ｐ５３バンド強度は、ＤｎＭＴ１に対応するすべてのｈｓｉＲＮＡ混合物の影響を受けなかった（図１０）。
【００７３】
異なるセグメントからのｈｓｉＲＮＡを試験することが簡便なので、ヘテロジニアスなｓｉＲＮＡ混合物中のｓｉＲＮＡ分子の活性を決定するための標的配列の迅速な一次スクリーニングができる。
【００７４】
本明細書に記載の方法を複数のｈｓｉＲＮＡ混合物の生成に適用することもでき、混合物は次に、複数遺伝子を同時にサイレンシングさせるために用いることができる。さらなる用途は、ｈｓｉＲＮＡを用いて上流または下流調節領域を標的にして発現を調節することを含む。したがって、ＤＮＡ鋳型の集団の転写により得られる大きなｄｓＲＮＡの混合物を、単一反応において、二価遷移金属イオンおよび／または高濃度の酵素の存在下にＲＮａｓｅＩＩＩにより消化することができる（複合化）。実施例７に、大きな二本鎖ＲＮＡを作成するための方法が示されている。
【００７５】
選択されたｓｉＲＮＡフラグメントを作るためのｈｓｉＲＮＡ混合物またはそれらのクローンの前記発生は、実施例７に記載のタイプのキットを利用することにより部分的または全体として達成することができる。所望の大きな二本鎖ＲＮＡを作成するため、ｈｓｉＲＮＡ混合物をつくるため、および細胞にそのような混合物をトランスフェクトするための指示が提供されている。実施例４は、これらの混合物中の個々のフラグメントを、引き続きいかにクローニングし、それらの配列を分析およびマッピングするかを記載している。
【００７６】
（標的ｍＲＮＡの部位特異的切断）
本明細書に記載されるように、高濃度条件下および／または遷移金属カチオンの存在下、ＲＮａｓｅＩＩＩで大きなｄｓＲＮＡを切断することにより生成されたｄｓＲＮＡフラグメントのセットは、重複フラグメントのヘテロジニアスな混合物である。この混合物は、おそらくは、ｍＲＮＡ内において大きなｄｓＲＮＡが配列に相補的である標的遺伝子のｍＲＮＡ転写体を切断することにより、遺伝子のサイレンシングを行うことができる。例えば、実施例４および６の方法を用いて生成されたｈｓｉＲＮＡ混合物を分析することにより、最も効果的な標的配列の特徴を単一のヌクレオチド分解を用いて定めることができる。
【００７７】
ＲＮＡｉについての機構の研究により、特異的ヌクレアーゼを含むＲＩＳＣ複合体を標的配列に導くことにより、活性ｓｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡの部位特異的切断を起こすことが示されている（非特許文献１４、２２〜２４参照）。ＲＩＳＣ複合体により切断されたｍＲＮＡのフラグメントを、ノーザンブロットにより検出することができる（非特許文献１４参照）。各切断の場合のヌクレオチド位置は、２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡの中心である配列位置に対応するｍＲＮＡの末端から１０個の塩基残基であることが分かる（非特許文献２５参照）。このように、ｍＲＮＡ上のＲＩＳＣ切断部位を用いて、この切断を導いた対応するｓｉＲＮＡの配列を推測することができる。
【００７８】
実施例６および８に記載のような遺伝子サイレンシング活性を有するｈｓｉＲＮＡ混合物を用いて出発して、ＲＮａｓｅ保護分析およびプライマー伸長分析のような標準的方法を用いて標的ｍＲＮＡ上の１以上の切断部位を分析することができる（非特許文献２６参照）。例えば、標的ｍＲＮＡ（ｉ）中のヌクレオチドＸにおける仮定的切断部位が、ｓｉＲＮＡ（ｉｉ）を推定する。次に、個々の推定されたｓｉＲＮＡ配列を合成し、効果について試験した。
【００７９】
（ｉ）標的ｍＲＮＡ
ＮＮＮＮＮＮＮＮ_-10ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ₊₁₀ＮＮＮＮ
（ｉｉ）ｓｉＲＮＡ
Ｎ_-10ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ₊₁₀
【００８０】
前記手法を、実施例９および図１１において例示した。
【００８１】
本態様のもう一つの利点は、単一のｓｉＲＮＡフラグメントまたはｈｓｉＲＮＡ混合物フラグメントの特定の混合物またはサブセットがいったん得られると、これらを実施例４および５に記載のようにクローニングして、各実験について新しい（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成を要することなく、これらの核酸を連続的またはｉｎ ｖｉｖｏで調節して供給することができる。
【００８２】
（使用例）
クローニングしたフラグメントの利用可能性は、試薬または治療剤の連続的供給のみならず、ｓｉＲＮＡフラグメントを繰り返し投与することなく生体全体において遺伝子治療技術により所望のノックダウン効果を維持することができる新規治療手法も提供する。ｓｉＲＮＡフラグメントまたはｈｓｉＲＮＡ混合物を発現するクローンを、標的遺伝子の完全な、調節されたまたは一時的なｉｎ ｖｉｖｏでのサイレンシングに用いることができる。
【００８３】
病原体から誘導された遺伝子を、抑制のために標的することができる。例えば、遺伝子は、宿主の免疫抑制を直接起こすことができたり、または病原体の複製、病原体の伝達または感染の維持に必須であり得る。抑制ＲＮＡを、ｉｎ ｖｉｔｒｏすなわちｅｘ ｖｉｖｏで細胞内に導入し、続いて、生物内に入れて治療を行うことができる、または、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与により生物を直接治療することができる。遺伝子治療の方法を思い描くことができる。例えば、病原体による感染の危険性のある細胞または既に感染された細胞、特に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染を、本発明によるＲＮＡの導入による治療のために標的にすることができる。標的遺伝子は、病原体または、病原体を宿主に入れることができる宿主遺伝子、病原体または宿主による薬物代謝、病原体のゲノムの複製または取り込み、宿主中の感染の達成または拡張、または、病原の次世代の集合であり得る。予防法（すなわち、感染の予防またはリスクの低下）、並びに、感染に付随する症状の頻度または重篤度の低下を思い描くことができる。
充実性腫瘍または白血病を含むあらゆるタイプの癌の治療または治療の開発に本発明を用いることができ、その例が特許文献１０に列挙されている。
【実施例】
【００８４】
以下の実施例で、本発明をさらに説明する。かかる実施例は本発明の理解を助けるために提供されるものであり、本発明を制限するものではない。
【００８５】
上記で引用され、かつ以下で引用される参考文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００８６】
（実施例１）
ｈｓｉＲＮＡ混合物の調製
（ＲＮａｓｅＩＩＩによるｄｓＲＮＡの切断への、マンガンイオンの効果の決定）
この実施例ではｈｕ ＰＫＲである目的とする遺伝子に対応する全長二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）ＲＮＡｉ転写キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ベバリー）を用いて発生させた。二本鎖ＲＮＡを創成する方法は、実施例７に詳細に記載する。
【００８７】
０．４ｋｂ二本鎖ＲＮＡ分子（０．２５μｇ）を、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５、１０、２０または５０ｍＭ ＭｎＣｌ₂または１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂（対照）、１ｍＭジチオスレイトール（ｐＨ７．５、２５℃）からなる緩衝液２０μｌ中で３７℃にて３０単位の大腸菌ＲＮａｓｅＩＩＩ（０．９μｇ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ベバリー）で消化した。５０〜１００ｍＭ ＭｎＣｌ₂を含む試料も、長い二本鎖ＲＮＡの完全な消化について試験する。
【００８８】
種々の濃度のマンガンイオンの存在下でのＲＮａｓｅＩＩＩの消化生成物は、１８〜２５ｂｐのサイズ範囲が多かった。このように得られるフラグメントの混合物を、ここで、ｈｓｉＲＮＡ混合物と表す。これに対して、マンガンイオンの不存在で１０ｍＭ Ｍｇ²⁺緩衝液中にて二本鎖ＲＮＡをＲＮａｓｅＩＩＩで消化すると、ｈｓｉＲＮＡを特徴付ける所望の２０〜４０ｂｐフラグメントよりも主要なサイズが小さい部分的消化により生じるフラグメントのヘテロジニアスなサイズの混合物が得られた（図１−１および２）。マグネシウムイオンの存在下でのＲＮａｓｅＩＩＩの消化生成物は、遺伝子サイレンシングにおいて実質的に非効果的であることが分かった（図１−１、２および５）。
【００８９】
（種々の量のＲＮａｓｅＩＩＩを用いる１ｋｂ ｄｓＲＮＡからのｈｓｉＲＮＡの生成）
ＧＬ３ルシフェラーゼからの１ｋｂ（ＳｐｈＩ−ＮｇｏＭＩＶ）フラグメントを、Ｌｉｔｍｕｓ３８ｉ中でクローニングした。（ビオチン化Ｔ７プライマーＰＣＲを用いて）実施例７に記載のように発生させたＤＮＡ鋳型から、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ベバリー）を用いて二本鎖ＲＮＡを発生させた。ｄｓＲＮＡ２．５μｇを、反応混合物５０μＬ中、１．３６ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＩＩＩ保存溶液０．５、１、２、４、８、１６μＬ（反応混合物中の最終濃度０．０１２、０．０２５、０．０５０、０．１１、０．２２および０．４４μｇ／μｌに相当する）を用いて消化した。反応を、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ ＭｎＣｌ₂、１ｍＭジチオスレイトール（ｐＨ７．５、２５℃）からなる緩衝液中で２０分間行い、ＥＤＴＡを最終濃度２５ｍＭとなるよう加えて停止した。各反応からの４０μＬを、２０％ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥで分析した（図１−２）。検出された主要な消化生成物は、単一配列合成ｓｉＲＮＡと共移動する（図１−２、レーン５、６、７および８とレーン１とを比較）。少なくとも２μＬのＲＮａｓｅＩＩＩ（図１−２、０．０５μｇ／μｌのＲＮａｓｅＩＩＩの最終濃度を用いるレーン５）が利用された場合、消化は完全であると判断された。蛍光ゲル濃度計測を用いて、ＲＮａｓｅＩＩＩ濃度の関数として生成されたｈｓｉＲＮＡの相対量を測定した。この実験において、ＲＮａｓｅＩＩＩ４μＬ（０．１１μｇ／μｌ最終濃度）を用いるとｈｓｉＲＮＡの最大収率が得られる。
【００９０】
（基質に対するＲＮａｓｅＩＩＩの最適比の関連および普遍化）
ｈｓｉＲＮＡの生成のためのＲＮａｓｅＩＩＩの最適濃度をさらに定めるために、種々の濃度のＲＮａｓｅＩＩＩを用いて第２の基質の消化においてｈｓｉＲＮＡ収率をモニターした。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＭｎＣｌ₂を含む反応液１０μｌ中で、０．０２５〜３．２単位／μｌに及ぶＲＮａｓｅＩＩＩ濃度（３２単位は、ＲＮａｓｅＩＩＩの１μｇに相当し、０．０００７〜０．１μｇ／μｌの最終濃度を提供する）を用いて、ｄｓＲＮＡ基質（〜１０００ｂｐ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓキチン合成酵素遺伝子の一部）０．０５６μｇ／μｌを消化した。反応混合物を、３７℃で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ ＥＤＴＡの０．５μｌを加えることによりＲＮａｓｅＩＩＩ消化を停止した。ローディング緩衝液（キシレンシアノールおよびブロモフェノールブルーを含む）１μｌを伴う各反応液（２．５μｌ、０．１４μｇのｄｓＲＮＡ基質に相当する）の画分を、２０％ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥにより分析した（図１−３）。
【００９１】
別の実験において、０．０６、０．１２、０．２４および０．４７μｇ／μｌの濃度のｄｓＲＮＡを、前述と同じ反応条件下に、３．２単位／μｌのＲＮａｓｅＩＩＩ（０．１μｇ／μｌ）を用いて消化した（図１−４）。
【００９２】
この実施例において、０．０５６μｇ／μｌ ｄｓＲＮＡ基質についてＲＮａｓｅＩＩＩの０．１μｇ／μｌを用いて、またはｄｓＲＮＡの１μｇ当たり５７単位のＲＮａｓｅＩＩＩを用いて、ｈｓｉＲＮＡの最大収率を得た（図１−３、レーン２）。この濃度比において、２２ｂｐ長のｄｓＲＮＡセグメント毎に約１個のＲＮａｓｅＩＩＩモノマー分子がある。酵素対基質のこの比の半分において（図１−３、レーン３）、僅かに少ないｈｓｉＲＮＡが得られた。同様に、図１−４のレーン３または４において、ｈｓｉＲＮＡの最大量が得られた。ＲＮａｓｅＩＩＩの量が減少すると、ｈｓｉＲＮＡ蓄積は少なく、ｄｓＲＮＡは、より大きなフラグメントに切断した。
【００９３】
これらの実験は、反応液１０μＬ中、ｄｓＲＮＡの１μｇ当たり２５〜５０単位のＲＮａｓｅＩＩＩを用いると、ｈｓｉＲＮＡの最大収率が得られることを示している。
【００９４】
（二本鎖ＲＮＡ切断の時間経過による研究）
ｈｓｉＲＮＡ生成の動態を、時間経過による研究によりモニターした。１０ｍＭ Ｍｎ⁺⁺を含む緩衝液の存在下に最適のＲＮａｓｅＩＩＩ：ｄｓＲＮＡ比（ｄｓＲＮＡを０．０５６μｇ／μｌ、ＲＮａｓｅＩＩＩを３．２単位／μｌ（０．１μｇ／μｌ））を用いて種々の長さの時間、消化反応を行った。成分をすべて加えた後、反応液をボルテックスにより短時間撹拌して、３７℃でインキュベートした。インキュベーション中の種々の時間に、反応液１０μｌを取り出し、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ０．５μｌで反応停止した。試料を氷上に保持してから、２０％ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥゲル上で分析した（図１−５）。
【００９５】
この実験から、ｈｓｉＲＮＡバンドの生成において、Ｍｎ⁺⁺の存在下でのＲＮａｓｅＩＩＩの消化が迅速であることが明らかである。１０分間のインキュベーション後、ｈｓｉＲＮＡの生成は定量的であり、ｈｓｉＲＮＡより大きなｄｓＲＮＡは検出できない。
【００９６】
（精製ｈｓｉＲＮＡの調製）
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中におけるＱセファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を通すＲＮａｓｅＩＩＩ消化ｄｓＲＮＡの高性能アニオン交換カラムクロマトグラフィーにより大量の精製ｈｓｉＲＮＡを得た（図１−６）。ＲＮａｓｅＩＩＩ（０．０２５〜０．２Ｍ ＮａＣｌで溶出）および３０〜１０００塩基のｄｓＲＮＡ（０．５Ｍおよびより高濃度のＮａＣｌで溶出）とは別に、１８〜２５塩基の精製ｈｓｉＲＮＡを０．４０〜０．４５Ｍ ＮａＣｌでカラムから溶出した。レーン５および６は、多量のｈｓｉＲＮＡおよび他のサイズの少量のＲＮＡを含む主要バンドを示す。
【００９７】
ローディングおよび勾配のプロフィール調整に基づいて、タンパク質または高分子量ｄｓＲＮＡまたはＤＮＡを不純物を含まないで１μｇ〜１ｍｇ／ｍｌの範囲またはそれ以上のｈｓｉＲＮＡの濃度を得ることができる。そのような高濃度の精製ｈｓｉＲＮＡを、ＦＤＡの許可のためにあらゆる人工的な不純物の分離が必要である場合、ｉｎ ｖｉｖｏでの試薬または治療薬として用いることができる。
【００９８】
（実施例２）
（種々の二価金属イオンを用いるｈｓｉＲＮＡの調製）
ＲＮａｓｅＩＩＩの切断生成物への種々の二価カチオンの効果を決定するために、以下の実験を行った：１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭジチオスレイトールおよび、３７℃での１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂（レーン１および２）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ₂（レーン３および４）、１０ｍＭ ＣｏＣｌ₂（レーン５および６）または１０ｍＭ ＮｉＳＯ₄（レーン７および８）を含む緩衝液５０μＬ中で、ｐＨ７．５（２５℃）にて、２つの濃度の大腸菌ＲＮａｓｅＩＩＩ（０．０４μｇ／μｌまたは０．０２μｇ／μｌ）の各々を用いて、大きな二本鎖ＲＮＡ分子（８００ｂｐ）１μｇを３０分間消化した。結果を図２に示す。０．０４μｇ／μｌのＲＮａｓｅＩＩＩおよび１０ｍＭマンガンイオンの存在下での大きな二本鎖ＲＮＡの完全消化により、約２２ｂｐ（２０ｂｐ〜４０ｂｐの範囲）のサイズの二本鎖ＲＮＡ生成物を生成した。マンガンイオンを含まない１０ｍＭ Ｍｇ²⁺緩衝液の存在下、０．０４μｇ／μｌのＲＮａｓｅＩＩＩで消化することにより、所望の１８〜２５ｂｐ長より小さい（レーン１および２）と共にＲＮＡｉサイレンシング実験に適していないと分かったフラグメントが生成された。これに対して、マンガンに加えてコバルトまたはニッケルの存在下に生成されたフラグメントにより、マグネシウムイオンの存在下に得られたものよりも大きな、長さ１８〜２５ｂｐの所望のフラグメントの画分が得られた。
【００９９】
（実施例３）
（ＲＮａｓｅＩＩＩ消化の短い二本鎖ＲＮＡ切断生成物が、親の配列全体を表す配列を含む）
ｐ５３の転写のためのＤＮＡ鋳型（アミノ酸１００〜３９３をコードする１．１ｋｂフラグメント）を、制限酵素ＡｃｉＩで消化し、得られるフラグメントをアガロースゲル上で分離した。ゲルをエチジウムで染色し、写真に撮り、続いてナイロン薄膜（Ｈｙｂｏｎｄ（登録商標）Ｎ⁺、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）に移した。
【０１００】
１．１ｋｂフラグメントのｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写により合成された二本鎖ＲＮＡを、実施例２に記載のように、１０ｍＭ Ｍｎ⁺⁺の存在下にｐＨ７．５および２５℃で、０．０４μｇ／μｌの最終濃度でＲＮａｓｅＩＩＩにより３０分間消化し、生成物を２０％ｎａｔｉｖｅ ポリアクリルアミドゲル上で分離した。
【０１０１】
消化の生成物（ｈｓｉＲＮＡ混合物）を、臭化エチジウム染色により視覚化し、約２１ｂｐに相当する画分を小さなゲルスライスに切り出し、透析膜で封止した小さなチューブで電気溶出により２０分間精製し、以下の実施例４に記載のようにエタノールで沈殿した。シチジン−３'，５'−ビス［５'−³²Ｐ]リン酸で標識された精製された短いＲＮＡおよび製造者（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ベバリー）に推奨されるＴ４ ＲＮＡリガーゼ。³²Ｐ標識ＲＮＡをプローブとして用いて、０．５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、７％ＳＤＳ、１％ＢＳＡ中で、同じゲルのサザンブロットを４８℃で一晩調べた。５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、０．１％ＳＤＳ中で、ブロットを同じ温度で３回３０分間洗い、続いてＸ線フィルムに感光させた。
【０１０２】
オートラジオグラムは、ｈｓｉＲＮＡ混合物を生成するために集合的に用いられたＤＮＡ鋳型のすべてのフラグメントが、プローブによりハイブリッド形成されたが、サイズマーカー中に大量に存在する関係のないＤＮＡフラグメントはハイブリッド形成されなかったことを示している（図３−１のレーン２と３を比較）。
【０１０３】
フィルムをスキャンニングして、プローブの相対量を定量した。放射活性強度を、バンドのサイズに対してプロットした。図３−２は、各バンドについてのプローブの量は、フラグメントのサイズに比例しており、各フラグメントに対応する臭化エチジウムの蛍光の量に類似していることを示している。これらの結果は、Ｍｎ⁺⁺の存在下におけるＲＮａｓｅＩＩＩの消化により生成される１５〜３０ｂｐのサイズの短いＲＮＡフラグメントが、親配列全体からのフラグメントを含むことを示している。
【０１０４】
（実施例４）
（ｈｓｉＲＮＡフラグメントのクローニングおよび配列決定）
ＲＮａｓｅＩＩＩ消化からの生成物を、プライマーアニーリング部位を、消化されたＲＮＡの鎖の各端部に連続的にライゲートする方式を用いてクローニングした（図４−１および図４−２）。ライゲーションの順番を、ライゲートされる種の異なるリン酸化により正確に制御し、いずれかのライゲーション工程中の種のいずれかの重合も妨げた。次に、得られるＲＮＡ−ＤＮＡキメラを、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、配列決定のためにプラスミドベクター内にクローニングした。また、単一プライマーを用いる第２の鎖ｃＤＮＡ合成を、ＰＣＲ工程への代替法として行うことができる。
【０１０５】
ライゲートされたオリゴヌクレオチドは、定められた配列（ポリアデニル化されていない）からなり、非特許文献２４、２７および２８の記載とは異なり、純粋にＤＮＡのみからなっていた。また、ライゲーション反応中の自己重合を防止するために、５’および３’リン酸基を有するプライマー１を合成した。ＲＴ ＰＣＲにより発生したｃＤＮＡから最終的ライブラリを構築するために、ＤＮＡフラグメントを増幅し、プラスミドｐＵＣ１９内に直接クローニングした（クローニング前にコンカテマー化していない）。
【０１０６】
１．ｄｓＲＮＡの発生
マルトース結合タンパク質（ｍａｌＥ）に対応する全長二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）ＲＮＡｉ転写キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ベバリー）を用いて発生させた。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写のための鋳型を発生させるために、ｍａｌＥの８０８ｂｐ ＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを含むｐＬＩＴＭＵＳ２８ｉプラスミドを、ＰＣＲ反応において用いて、遺伝子フラグメントを増幅した。体積５０μｌ中の、０．４μＭ Ｔ７最小プライマーｄ（５’−ＴＡＡＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’（配列番号３）、４００μＭ ｄＮＴＰおよびプラスミドＤＮＡ約２０ｎｇを加えた、１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ反応緩衝液［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２ｍＭ ＭｇＳＯ₄、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００］中で、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ベバリー）を用いてＰＣＲを行った。各々が９４℃で３０秒、５０℃で３０秒および７２℃で３０秒からなるＰＣＲプロトコルを２５サイクル行なった。消化液とＰＣＲ反応液の両方を、標準的分子生物学技術を用いてフェノール／クロロホルムで抽出しエタノールで沈殿させ、次に、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁して最終濃度１ｍｇ／ｍＬ（制限消化）または１２５μｇ／ｍＬ（ＰＣＲ生成物）にした。次に、これらの鋳型を、大規模ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写反応において用いて大きなｄｓＲＮＡを発生させた。
【０１０７】
大規模なｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写反応を、合計体積３００μＬすなわち製造者により記載されたパイロット反応の１０倍に増大した。二本鎖ＤＮＡ鋳型を、ＧＦＰの７３１ｂｐ ＮｈｅＩ−ＢｓｒＧＩフラグメントを含むＬｉｔｍｕｓ３８ｉから同様に調製した。ＧＦＰ ｄｓＲＮＡについては、各消化鋳型１０μＬを用い、ｍａｌＥ遺伝子フラグメントについては、反応あたりＰＣＲ反応液４０μＬを用いた。反応液は、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．１、１９ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭスペルミジン、４ｍＭの各ｒＮＴＰ、５０μｇ／ｍＬ ＢＳＡ、３単位／μＬ酵母無機ピロフォスファターゼ、４００単位／ｍＬ胎盤ＲＮａｓｅ阻害剤、および５０００単位／ｍＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを含んでいた。反応液を４２℃で２時間、６５℃で１０分間インキュベートし、次に、−２０℃で保存した。ＲＮａｓｅＩＩＩ消化の調製において、ｄｓＲＮＡを、８％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により精製し、正確なサイズに相当する切除バンドを切り出した（ＧＦＰまたはｍａｌＥについて、それぞれ、８２９ｂｐおよび９０８ｂｐ）。ｄｓＲＮＡを、３７℃でインキュベートしつつ、４００μＬ ＲＮＡ溶離緩衝液（０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ）中で一晩撹拌し、さらに４００μＬを加えて４時間撹拌することにより、ゲルスライスから溶出した。溶出試料を貯蔵し、フェノール／クロロホルムで抽出してゲル残渣およびＳＤＳを除去し、エタノールで沈殿させ、Ｔｒｉｓ ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液１００μＬ中に再懸濁させた。
【０１０８】
２．全長ｍａｌＥ ｄｓＲＮＡのＲＮａｓｅＩＩＩ消化：
ＲＮａｓｅＩＩＩ消化を行って、ｍａｌＥ配列から長さ２２ｂｐの小さなＲＮＡ二本鎖を得た。０．１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１０ｍＭ ＭｎＣｌ₂、１ｍＭジチオスレイトールおよびＲＮａｓｅＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ベバリー）４μｇ中に全長ｍａｌＥ ｄｓＲＮＡ４μｇを含み合計で１６０μＬの反応液を、３７℃で３０分間インキュベートした。次に、試料をフェノール／クロロホルムで抽出してエタノールで沈殿させて、ＲＮａｓｅＩＩＩを除去すると共にＲＮＡフラグメントを回収した。次に、小さなＲＮＡフラグメントを、仔牛腸管アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ、マンハイム）で処理して、その後のライゲーション反応中の重合を防止した。これは、試料を５０℃で５分間予備加熱することにより達成し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ中、ＲＮＡ１μｇあたりＣＩＰ２．５単位を用いて製造者により記載されているように標準的反応においてＣＩＰで処理した。反応は、５０℃で１時間行い、続いて、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。次に、脱リン酸化したＲＮＡフラグメントをＴＥ２５μＬ中に再懸濁した。
【０１０９】
３．小さなＲＮＡフラグメントのプライマー１へのライゲーション
小さなＲＮＡフラグメント（前記からの４μｇの全試料）を、次に、その３’においてプライマー１、すなわちＢａｍＨＩ制限部位（下線箇所）を含むｄ（５’ｐ−ＣＴＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＣ−ｐ−３’（配列番号４）にライゲートした。ＲＮＡフラグメント二本鎖を、まず、７０℃で５分間加熱することにより変性させ、次に、氷上に置いた。ライゲーションは、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰを含み、１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、プライマー１の１０μｇおよびＴ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ベバリー）１２０単位を加えた６０μＬ中で２０℃で２４時間行った。次に、ライゲーション生成物を、７Ｍ尿素を含む変性１２％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動することによりゲル精製し、長さ約４５ｎｔのバンドを切り出した。ライゲーション生成物を、ＲＮＡ溶出緩衝液を用いてゲルから溶出し、前述のようにエタノール沈殿により回収し、ＴＥ１０μＬ中に再懸濁した。
【０１１０】
４．プライマー２への中間体のライゲーション
前記ライゲーション生成物の５’ＲＮＡ末端を、３’−ホスファターゼを含まないＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ ＰＮＫ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ、マンハイム））を用いてリン酸化して、その後のライゲーション反応における重合を回避した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ（（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ベバリー）の１×Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ緩衝液）および１０単位のＴ４ ＰＮＫを含む２０μＬ中で、前記試料全体を用いて３７℃でリン酸化を３０分間行った。次に、Ｔ４ ＰＮＫを、６５℃で２０分間インキュベートすることにより熱不活化した。
【０１１１】
プライマー１にライゲートしたリン酸化された小さなＲＮＡフラグメントを、次に、その５’においてプライマー２、すなわちＡｃｃ６５Ｉ制限部位（下線箇所）を含むｄ（５’−ＣＡＴＧＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＴＴＴＣＴＡＴＴＣＴＣ−３’（配列番号５）にライゲートした。ライゲーションは、１×Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ緩衝液を含み、１０％ＤＭＳＯ、プライマー２の１μｇおよびＴ４ ＲＮＡリガーゼ６０単位を含む３０μＬ中で２０℃で２４時間行った。次に、ライゲーション生成物を、７Ｍ尿素を含む変性１２％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動することによりゲル精製し、約７０ｎｔでバンドを切り出した。ライゲーション生成物を、ＲＮＡ溶出緩衝液を用いてゲルから溶出し、前述のようにエタノール沈殿により回収し、ＴＥ１０μＬ中に再懸濁した。
【０１１２】
５．クローニングのためのＲＮＡ／プライマーハイブリッドの逆転写およびＰＣＲ増幅
５’および３’末端においてそれぞれプライマー２および１にライゲートした小さなＲＮＡの生成物を、次に逆転写して二本鎖を作り、次のＰＣＲ増幅に用いた。逆転写は、プライマー３すなわちｄ（５’−ＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＧ−３’（配列番号６）を用いて行ったが、プライマー３はＢａｍＨＩ部位（下線箇所）を有するＬｉｔｍｕｓ２８／３８逆配列プライマー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ベバリー）としても知られている。前記の試料全体を、０．１μＭプライマー３および０．５ｍＭ ｄＮＴＰと混合し、次に、６５℃で５分間加熱し、続いて、氷上で冷却して、ライゲーション生成物の３’末端にプライマー３をアニーリングした（プライマー３はプライマー１に相補的）。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ₂および１０ｍＭジチオスレイトールを含む体積１９μＬの反応液を４２℃で２分間インキュベートしてから、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ベバリー）２００単位を添加し、次に、２５℃で１０分間、４２℃で５０分間および７０℃で１５分間インキュベートした。次に、逆転写のｃＤＮＡ生成物のＰＣＲ増幅により二本鎖ＤＮＡを得た。最終体積１００μＬ中として、プライマー２および３の各々を０．２μＭ、４００ｍＭ ｄＮＴＰおよび逆転写反応液２μＬを加えた、１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ反応緩衝液中で、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ベバリー）を用いてＰＣＲを行った。９４℃で３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で３０秒からなるＰＣＲプロトコルを２５サイクル行なった。〜７０ｂｐのＰＣＲ生成物を、前述のように８％非変性ポリアクリルアミドゲルから切り出すことにより精製し、エタノール沈殿により回収し、ＴＥ５０μＬ中に再懸濁した。
【０１１３】
６．ＰＣＲフラグメントのｐＵＣ１９内へのクローニング
ＰＣＲフラグメントを、標準的な分子クローニング技術により、ＢａｍＨＩおよびＡｃｃ６５Ｉ制限部位によりｐＵＣ１９プラスミド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ベバリー）内にクローニングした。簡単に説明すると、ｐＵＣ１９消化は、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、およびｐＵＣ１９の１μｇあたり８単位のＢａｍＨＩおよび４単位のＡｃｃ６５Ｉを加えた１×ＮＥ緩衝液３（０．１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂および１ｍＭジチオスレイトール）中で行った。消化は、３７℃で３時間行った。消化したｐＵＣ１９プラスミドを、１％低融点アガロースゲル上の電気泳動によりゲル精製し、製造者の指示に従ってβ−アガラース（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ベバリー）を用いて切除ゲルスライスからＤＮＡを回収した。ＰＣＲフラグメントを、ＤＮＡの１μｇ当たり２０単位のＢａｍＨＩおよび１０単位のＡｃｃ６５Ｉを用いる以外は同じ条件下に消化し、フェノール／クロロホルムで抽出して制限酵素を除去し、エタノール沈殿により回収した。ｐＵＣ１９ベクター内への消化ＰＣＲフラグメントのライゲーションを、ベクター１００ｎｇを含み、挿入部を用いるものと用いないものの両方を、４００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ベバリー）体積２０μＬ中、１０：１の挿入部対ベクターの比を用いて行った。１６℃での一晩のインキュベーションに続いて、各ライゲーション生成物（すなわち、挿入部を用いるものと用いないものの両方を含む）１０μＬを６５℃で１５分間の加熱でで停止させ、ＳｍａＩで消化して、自己ライゲートベクターを線状化した。消化物（合計５０μＬ）はライゲーション反応液１０μＬおよび２０単位のＳｍａＩを１×ＮＥ緩衝液４（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−アセテート、ｐＨ７．９、５０ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ）中に含み、２０℃で３時間インキュベートした。６５℃で１５分間の加熱で停止後、各消化液１μＬを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州ヘルキュール）装置を用いて大腸菌ＥＲ２７３８内に電気穿孔した。新しく電気穿孔した細胞を、振り混ぜつつＳＯＣ培地１．０ｍｌ中で３７℃で１時間インキュベートした。細胞を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）の各々を４０μｇ／ｍＬ含むＬＢ寒天プレート上に置き、３７℃で一晩インキュベートした。青色および白色コロニーの混合物を観察し、青色および白色コロニーカウントは、挿入部のないコントロールよりも、それぞれ５〜１０倍および２０倍を超えていた。
【０１１４】
７．配列決定および分析
合計１２６のクローンからのＤＮＡを、ＱｉａＱｕｉｃｋ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州スタジオシティー）スピンカラムを用いて培地１．５ｍＬから、最終体積５０μＬとなるように単離した。制限分析および自動ＳａｎｇｅｒＤＮＡ配列決定（ＡＢＩ ３７７および３１００装置）は、１２６の配列クローンのうちの９個は挿入部を含まず、残りの１１７個のクローンは、二つのプライマー配列（プライマー１およびプライマー２）に対応する挿入部を有しており、それらの間に囲まれた種々の量の配列はクローニングされたＲＮＡ配列に対応することを示した（図４−７）。クローン配列についての長さ分布を以下に示す（クローン数は括弧内に示す）：１３塩基（２）、１４塩基（１）、１５塩基（３）、１６塩基（１）、１７塩基（６）、１８塩基（５）、１９塩基（４）、２０塩基（１５）、２１塩基（３８）および、２２塩基（３８）、２３塩基（１）および２４塩基（２）。これらの配列を、プライマー配列から単離し、親Ｌｉｔｍｕｓ−ｍａｌＥまたはＧＦＰ構造の転写部分に適合させた（図４−３および図４−４並びに図４−５および図４−６）。結果は、クローニングされたフラグメントが全二本鎖ＲＮＡ出発材料に及び、大きなｄｓＲＮＡ配列の実質的部分を含み、ＲＮａｓｅＩＩＩ消化がランダムであることを決定的に示している。矢印は、図４−３および図４−４並びに図４−５および図４−６に示すようにクローニングした配列に対応し、矢印の頭部の方向は、配列が、示された配列（左側から右側）に相当するか相補的鎖（右側から左側）に相当するかを示している。
【０１１５】
図４−１および図４−２のスキームに従うＲＮａｓｅＩＩＩ消化で得られたフラグメントを有する個々のクローンからのＤＮＡ挿入部を単離し配列を決定した。クローニング法で用いたプライマーを確認した後にフラグメント中の残りのヌクレオチドの数を数えることにより挿入長を決定した。二つの異なる転写体（Ｌｉｔｍｕｓ２８ｉ中のｍａｌＥおよびＬｉｔｍｕｓ３８ｉ中のｇｆｐ）からの合計１２６の挿入部を、次に、挿入長対発生頻度としてプロットし、図４−７のグラフおよび表に示す。
【０１１６】
図４−７の表に示すように、クローンを含む挿入部の６５％、すなわち１１７中の７６個が、２１または２２ヌクレオチドの長さの挿入部を持っていた。これらの１１７のクローンのうち１個が、長さが５ｎｔの挿入部、すなわち、Ｍｎ²⁺の代わりにＭｇ²⁺を含む緩衝液中、ＲＮａｓｅＩＩＩ消化のための従来技術を用いて典型的に生じるサイズである１１ｎｔより短い挿入部を有していた。前記クローニング実験は、Ｍｎ²⁺を含む緩衝液中でのＲＮａｓｅＩＩＩ消化により生じるフラグメントの実質的な部分が２１〜２２ｎｔであることをさらに確認するものである。
【０１１７】
（実施例５）
（クローニングしたＲＮａｓｅＩＩＩ生成物のライブラリの発生）
（ａ）クローンのライブラリは、個々のフラグメントのＰＣＲ増幅後にＬｉｔｍｕｓ２８ｉ、Ｌｉｔｍｕｓ３８ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ベバリー）、または他の対向Ｔ７プロモーターベクター中で複数のｃＤＮＡをクローニングする、または、市販のｃＤＮＡフラグメントを用いることにより、得ることができる。ライブラリクローンは、Ｔ７ポリメラーゼを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写およびその後の前記実施例に記載のようなＲＮａｓｅＩＩＩを用いた切断により、各クローン配列に対応するｄｓＲＮＡを得るために用いられる。
【０１１８】
（ｂ）前述のように得られ精製された、または実施例４における、大きなｄｓＲＮＡのＲＮａｓｅＩＩＩ消化生成物を、実施例４に記載のようにＬｉｔｍｕｓ２８ｉベクター内でクローニングすることができる。各クローンは、ここで、最初の長い配列のＲＮａｓｅＩＩＩ切断により生成される単一の短い配列を表し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写により単一の短い配列セグメントｄｓＲＮＡ（例えば、１８〜２５ｂｐ）を得るのに用いることができる。複数のクローンの効果についての試験を、高処理量フォーマットで行うことができる。その理由は、すべての手順（ＰＣＲ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写、ＲＮａｓｅＩＩＩ切断およびトランスフェクション）は、標準的な方法を用いてマイクロタイタープレートフォーマットで行うことができるからである。最高のセグメント（サイレンシングにおいて最も効果的なもの）はこのように確認され、特別のベクター（ヘアピン、アデノウイルス／レトロウイルス）に導入する、または特定の下流での用途のために化学的に合成することができる。
【０１１９】
短いｄｓＲＮＡ生成物を、細胞トランスフェクションアッセイまたは同種の配列の遺伝子ノックアウトのためのトランスジェニック動物研究において用いることができる。適当なアッセイは、細胞形状、生存力、コトランスフェクトされたリポーター発現、薬剤治療への感受性などのようなサイレンシング効果を評価するために行われる。すべてのこれらの手順は、マイクロタイタープレートフォーマットにおいて自動化しやすい。
【０１２０】
（実施例６）
（昆虫または哺乳動物細胞中においてトランスフェクトされた内因性遺伝子の遺伝子サイレンシングにおいて、ｈｓｉＲＮＡ混合物が有効である）
二価遷移金属カチオン緩衝液の存在下においてＲＮａｓｅＩＩＩにより生成されるｈｓｉＲＮＡを用いる遺伝子発現の抑制における効果を試験するために、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ベバリー）およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ベバリー）により提供されるキットマニュアルおよび参考文献に指示されるような標準的組換えＤＮＡ技術を用いて、ホタルＧＬ３ルシフェラーゼｃＤＮＡ（Ｆ−Ｌｕｃ）（１．２ｋｂ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｃＤＮＡ（０．８ｋｂ）、ｐ５３ｃＤＮＡ（１．１ｋｂ）およびＰＫＲ ｃＤＮＡ（０．４ｋｂ）のｒｕｎ−ｏｆｆ転写により長いｄｓＲＮＡ調製物を合成した。ｄｓＲＮＡをフェノールで抽出し、エタノールで沈殿させた。
【０１２１】
ＧＦＰ ｄｓＲＮＡおよびＦ−Ｌｕｃ ｄｓＲＮＡの各々１０μｇを、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭジチオスレイトールを含み、１０ｍＭ ＭｎＣｌ₂または１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂およびＲＮａｓｅＩＩＩ（２０μｇ）を加えた１００μｌ中で、３７℃で３０分間消化した。消化生成物をエタノールで沈殿させ、ペレットを滅菌ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。これらのＲＮａｓｅＩＩＩにより得られたｄｓＲＮＡが、ルシフェラーゼ、ＧＦＰまたはｐ５３の発現を低下または除去する効果を、（ａ）培養されたショウジョウバエシュナイダーＳＬ２培養細胞、（ｂ）ヒト胎児腎臓細胞２９３、または（ｃ）サル上皮Ｃｏｓ−７細胞で試験した。すべての培養物は、適当な培地０．５ｍＬを有する２４穴プレート上にある。
【０１２２】
（ａ）ショウジョウバエシュナイダーＳＬ２培養細胞を、１０％胎児ウシ血清を補充したシュナイダー培地において２７℃.で培養した。細胞を、トランスフェクションの１６時間前に、２４ウエルプレートの０．２×１０⁶／ｍｌ／穴でのトランスフェクションのために平板培養した。ｐＧＬ２系ルシフェラーゼリポータープラスミド０．１μｇ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼリポータープラスミド０．０５μｇおよび、前述のようにＲＮａｓｅＩＩＩで消化した、または消化していないＧＬ３ルシフェラーゼｄｓＲＮＡ０．０５〜０．５μｇ、典型的には０．１μｇからなる混合物を、血清を含まないシュナイダー培地１００μＬ中のＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）トランスフェクション試薬３μＬと混合し、室温で３０分間インキュベートし、トランスフェクションプレートの一つのウエルに加えた。２７℃で４０時間後、二重ルシフェラーゼマニュアルに記載のような二重ルシフェラーゼリポーターシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マジソン）を用いて、細胞をルシフェラーゼ活性について分析した。相対的ルシフェラーゼ活性は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼに対するホタルルシフェラーゼの比であると表される（図５）。
【０１２３】
（ｂ）ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ−２９３）を、１０％胎児ウシ血清を加えたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において３７℃で５％ＣＯ₂下に培養した。細胞を、トランスフェクションの１６時間前に、６穴プレートの０．２×１０⁶／ウエルでのトランスフェクションのために平板培養した。ｐＧＬ３系ルシフェラーゼリポータープラスミド０．１μｇ、ｐＥＧＦＰ０．１μｇおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼリポータープラスミド０．０５μｇおよび、ｈｓｉＲＮＡ（前述のようにＲＮａｓｅＩＩＩで消化したｄｓＲＮＡ）０．１〜０．５μｇ（典型的には０．１μｇ）またはＧＦＰ−２２ｓｉＲＮＡ１０ピコモル（（センス鎖）５’ＧＣＡＡＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵ３’（配列番号７）および（アンチセンス鎖）５’ＧＡＡＣＵＵＣＡＧＧＧＵＣＡＧＣＵＵＧＣＣＧ（配列番号８））（Ｘｅｒａｇｏｎ、アラバマ州ハンツビル）からなる混合物を、血清を含まないＤＭＥＭ１５０μＬ中のＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）トランスフェクション試薬６μＬと混合し、室温で３０分間インキュベートし、トランスフェクションプレートの一つのウエルに加えた。ＧＦＰおよびルシフェラーゼの発現は、それぞれ蛍光およびルミネセンスにより調べた（図６−１および図６−２）。より効率的なトランスフェクションのために、２４穴プレートの１つの穴についてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００の２μＬおよびＯＰＴＩＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）１００μＬを用いＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００およびＯＰＴＩＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を用いて、前述のように調製したルシフェラーゼｈｓｉＲＮＡ（最終濃度１４ｎＭで０．０２５μｇ）またはＧＬ３ルシフェラーゼｈｓｉＲＮＡ（２０ピコモル）（（センス鎖）５’ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＴＴ３’（配列番号９）および（アンチセンス鎖）５’ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧＴＴ（配列番号１０））（Ｘｅｒａｇｏｎ、アラバマ州ハンツビル）を、ＨＥＫ２９３細胞内にトランスフェクトした。細胞を、二重ルシフェラーゼキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マジソン）を用いてその製造者により指示されるようにルシフェラーゼアッセイのために処理した（図６−３）。
【０１２４】
（ｃ）サル上皮細胞（ＣＯＳ−７）を、５％胎児ウシ血清を加えたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において３７℃で５％ＣＯ₂下に培養した。細胞を、トランスフェクションの２４時間前に、２４穴プレートの各穴での０．２×１０⁶／０．５ｍｌでのトランスフェクションのために、またはトランスフェクションの６時間前に、８５％の細胞密度で平板培養した。各細胞の穴について、ｐＥＧＦＰ０．１μｇおよび、大きなｄｓＲＮＡから得られた、エタノール沈殿により精製されたｈｓｉＲＮＡ（６ｎｇ／μＬ）１または５μＬからなる混合物を、製造者に指示されるようにＯＰＴＩＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）１００μＬの最終体積となるようにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）２μＬと混合し、室温で２０分間インキュベートしてから細胞に加えた。ＧＦＰの発現を、蛍光顕微鏡検査により調べ、他の内因性標的の発現を、適当な抗体を有する細胞抽出物のウエスタンブロットにより調べた。別の実験において、ｐ５３ｄｓＲＮＡから生成されたｈｓｉＲＮＡ（５ｎｇ／μＬ）０、５または１０μＬあるいは前述のようにＲｅｎｉｌｌａ ｄｓＲＮＡから生成されたｈｓｉＲＮＡ（５ｎｇ／μＬ）１０μＬを、ｐＣＤＮＡベクター中の切り詰めたヒトｐ５３（残基１００〜３９３）を発現するプラスミド、およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを発現するプラスミドと共に、トランスフェクションに用いた。細胞を、トランスフェクションの４８時間後に溶解し、二重ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マジソン）を用いてルシフェラーゼアッセイのために処理した。個々のウエルからの溶解物を、ポリクローナル抗ｐ５３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、マサチューセッツ州ベバリー）を用いるウエスタンブロットによっても分析した。試験細胞は、化学的に得られたｓｉＲＮＡの効率に匹敵またはそれを上回る効率を有する標的遺伝子の発現の効果的なノックダウンを示した。
【０１２５】
図５において、ルシフェラーゼに対応する長いｄｓＲＮＡは、ショウジョウバエ培養細胞における活性のサイレンシングにおいて効果的であると示された。ｈｓｉＲＮＡ混合物は、ＲＮＡｉ機構（非特許文献２９参照）を介して遺伝子サイレンシングを達成するのに必須であると以前に示されている２−塩基非含有３’−ＯＨオーバーハングの構造を有するようである。しかし、Ｍｇ²⁺のみの存在下でのＲＮａｓｅＩＩＩ消化から生じる生成物は、ルシフェラーゼのサイレンシングを行うことができなかった。これに対して、マンガンイオンの存在下でのＲＮａｓｅＩＩＩ消化生成物は、サイレンシングにおいて非常に効果的であった。これらの結果は、図１−１および１−２に示すようにＲＮａｓｅＩＩＩにより発生するフラグメントのサイズ分布に関連し、適当なサイズであると共に遺伝子サイレンシングを起こすように配列する分子をｈｓｉＲＮＡ混合物が含むことを示している。
【０１２６】
ｐＧＬ３ルシフェラーゼ遺伝子に対応する化学的に合成したｓｉＲＮＡは、おそらく、ｐＧＬ２／ｐＧＬ３ルシフェラーゼの対応する配列における点突然変異の相違ゆえに、このアッセイにおいて効果的でないとわかった。この結果は、単一分子と比較した、二本鎖の短いＲＮＡの混合物を用いるサイレンシングの効果を示している。
【０１２７】
図６−１において、Ｍｎ²⁺の存在下におけるＧＦＰ ｄｓＲＮＡの消化生成物が、未処理対照細胞と比較して、蛍光細胞の不存在下により示されるような哺乳動物細胞中のＧＦＰの特異的サイレンシングにおいて効果的であると示されている。サイレンシングおよび不要な非特異的全体的効果の不存在の特異性を図６−２に示すが、標的にされていないルシフェラーゼの活性が、Ｍｎ²⁺の存在下に得られるＧＦＰ ｄｓＲＮＡにより影響されない。図６−３は、ＲＮａｓｅＩＩＩにより生成されるｈｓｉＲＮＡによるルシフェラーゼのサイレンシングが、４０ｎＭ ＧＬ３ルシフェラーゼｓｉＲＮＡにより得られるものと比較して、非常に効果的であることを示している。
【０１２８】
図７は、２４穴プレートの１つの穴当たり６ｎｇに相当するｈｓｉＲＮＡフラグメントの濃度が、蛍光細胞の減少した数により検出されるような著しいサイレンシングを引き起こすのに充分であることを示している。３０ｎｇでは、非常に高い効率でのＧＦＰ標的遺伝子発現の劇的なノックダウンを示し、関連のない配列に相当する等量のｈｓｉＲＮＡフラグメントを用いた場合、ＧＦＰは影響を受けない。
【０１２９】
図８−１において、内因性（Ｅ）のｐ５３と、ｈｓｉＲＮＡ混合物標的ｐ５３によりトランスフェクト（Ｔ）されたｐ５３の両方のノックダウンが、対応するタンパク質バンドの減少または不存在（レーン２および３とレーン１との比較）により検出することができる。逆に、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性は、ｈｓｉＲＮＡ混合物標的Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを用いた場合にのみ影響される（図８−２、試料１と試料２および３とを比較）。試験したすべての場合に、ｈｓｉＲＮＡで処理した細胞は、化学的に得られたｓｉＲＮＡの効率に匹敵またはそれより優れた効率で標的遺伝子の発現の効果的なノックダウンを示した。
【０１３０】
これらの結果は、Ｍｎ²⁺イオンの存在下、ＲＮａｓｅＩＩＩにより生成されるｈｓｉＲＮＡ混合物が、トランスフェクション遺伝子および内因性遺伝子の両方についてサイレンシングのための効果的かつ特異的な媒体であり、哺乳動物細胞中での遺伝子発現を調節するために用い得ることを示している。
【０１３１】
（実施例７）
（ｈｓｉＲＮＡを作成し、哺乳動物細胞中で遺伝子サイレンシングさせるためのキット）
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｈｓｉＲＮＡ混合物の作成のため、および場合により、哺乳動物細胞内へのＲＮＡフラグメントのトランスフェクションのためのキットが提供される。
【０１３２】
本発明の態様において、各キットは、２４穴プレートフォーマットにおけるトランスフェクションのために複数の大きなｄｓＲＮＡを加工するための試薬を含み（１００回のトランスフェクションに充分である）、使用のための指示を含む。
【０１３３】
（キット成分）
キットは、酵素および、ベクター、プライマーおよび緩衝液の少なくとも一つを含む。キットの成分の例は、すべて、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ベバリー）から個々に入手可能であり、以下に列挙する。
【０１３４】
（表１）
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、１５０単位／μｌ ２５μｌ
１０×緩衝液／ＮＴＰ（下記組成を参照） ６０μｌ
３０×高分子成分混合物（ＨＭＷ）（下記組成を参照） ２０μｌ
ＢＴ７−最小プライマー（１９ＭＥＲ）
５’−ビオチン−ｄＣＴＣＧＡＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’（配列番号１１）（１０μＭ） ２５μｌ
１０×リボヌクレアーゼＩＩＩ（１．４μｇ／μｌ） １００μｌ
１０×ｈｓｉＲＮＡ緩衝液（下記組成を参照）
１０×ＭｎＣｌ₂（２００ｍＭ） １０００μｌ
１０×ＥＤＴＡ（２５０ｍＭ） １０００μｌ
Ｌｉｔｍｕｓ ３８ｉｌｕｃコントロール鋳型 １μｌ
ＲＮａｓｅ−非含有グリコーゲン １０μｇ／μＬ ５０μｌ
ＴＥ緩衝液中のプラスミドＤＮＡ５００μｇ／ｍｌ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）
【０１３５】
さらに、キットは、トランスフェクション試薬、ＲＮＡサイズマーカーおよびストレプトアビジン被覆ビーズを含んでいてもよい。
【０１３６】
（緩衝液組成）
（ａ）１０×緩衝液／ＮＴＰ
４００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．１
１９０ｍＭ ＭｇＣｌ₂
５０ｍＭ ＤＴＴ
１０ｍＭスペルミジン
４０ｍＭ各ＮＴＰ
（ｂ）３０Ｘ高分子量（ＨＭＷ）混合物
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．１
１．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
１００単位／ｍｌ 無機ピロホスファターゼ（酵母）
１２０００単位／ｍｌ 膵臓リボヌクレアーゼ阻害剤
５０％グリセロール
（ｃ）１０×ｈｓｉＲＮＡ緩衝液
０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５
１０ｍＭ ＤＴＴ
【０１３７】
このキットは最適化された緩衝液中でＲＮａｓｅＩＩＩを利用して、長いｄｓＲＮＡから、約１８〜２５ヌクレオチドの範囲のフラグメントを生成する。ｄｓＲＮＡ生成物は、ＲＮａｓｅＩＩＩで切断されて、遺伝子発現のサイレンシングに適したｈｓｉＲＮＡ混合物を再現可能に生成する。混合物中の異なるｓｉＲＮＡフラグメントの配列は、標的遺伝子全体に沿ってその配列に位置する。ｈｓｉＲＮＡ混合物は、エタノール沈殿により精製され、トランスフェクションで用いることができる。
【０１３８】
ＲＮａｓｅＩＩＩに加えて、キットは、使用のための指示と共に、Ｔ７プロモーターに挟まれるＤＮＡ鋳型からの大きなｄｓＲＮＡの高収率ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写のための試薬、および場合により反応を行うための反応溶液を含んでいてもよい。
【０１３９】
キットに付随する指示の例には以下のものがある。
（１）ｄｓＲＮＡを発生させるｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写の前のＤＮＡ鋳型のクローニング
【０１４０】
転写用のＤＮＡ鋳型を作るための一つの手段は、Ｌｉｔｍｕｓ２８ｉ／３８ｉ二方向転写ベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ベバリー）中で目的のＤＮＡをクローニングすることである。目的のＤＮＡを、端部を規定するＴ７プロモーターに挟まれる標的配列を用いて線状生成物を生成するＢＴ７最小プライマーのような単一のＴ７プロモーター特異的プライマーを用いるＰＣＲにより増幅することができる。
【０１４１】
あるいは、Ｔ７プロモーターが添付された標的遺伝子特異的プライマーを用いて、あらゆる特異的ｃＤＮＡ配列を増幅することができる。例えば、増幅プライマー：
【０１４２】
【化１】

【０１４３】
ここで、標的特異的配列（太線）の前にある５’端部に位置するＴ７プロモーター（下線）を用いて、任意のｃＤＮＡ鋳型を増幅することができる。
【０１４４】
ビオチン化ＢＴ７プライマーを用いて、Ｔ７プロモーターで挟まれるあらゆる配列を増幅させることができる。場合により、増幅したビオチン化ＤＮＡ鋳型を、ストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ベバリー）に結合することにより単離し、転写のための鋳型として直接用いることができる。固定ＤＮＡ鋳型の形成のために、ストレプトアビジン磁気ビーズ懸濁液２５〜５０μＬを、等量の１Ｍ ＮａＣｌとの増幅（ＰＣＲ）反応混合物に加え、室温で１０〜１５分間インキュベートする。上澄を、磁石の存在下、除去し、ＴＥ０．５ｍｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌを用いてビーズで洗った。再懸濁ビーズを、転写反応において直接用いることができる。固定ＤＮＡ鋳型のｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写により、ＤＮＡ非含有二本鎖ＲＮＡが生成される。
【０１４５】
増幅は、ＰＣＲのようなあらゆるポリメラーゼを用いる方法により達成することができる。増幅生成物は、エタノール沈殿により、またはクロマトグラフィー法（例えば、ＱｉａＱｕｉｃｋ（登録商標）カラム（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州スタジオシティー））により精製され、ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水または等価物を用いて調製される）中に再懸濁されて、〜５００μｇ／ｍｌの最終濃度が得られる。
【０１４６】
ＧＬ３ルシフェラーゼからなるコントロールを、Ｌｉｔｍｕｓ３８ｉＬｕｃプラスミドを用いて調製することができ、ＧＬ３ルシフェラーゼ遺伝子の１．０ｋｂｐフラグメントが、Ｌｉｔｍｕｓ３８ｉのＳｐｈＩおよびＮｇｏＭＩＶ部位においてクローニングされる。ＭｆｅＩおよびＳｔｕＩを用いて線状化し（別々の反応で）、続いて組み合わせた線状化鋳型をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写することにより、長さが１．０ｋｂｐの二本鎖ＲＮＡが生成される。
【０１４７】
Ｌｉｔｍｕｓ２８ｉ／３８ｉベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ベバリー）にサブクローニングされたｃＤＮＡの制限フラグメントから誘導されたＲＮＡを含む１００〜６００ｂｐの長さの二本鎖ＲＮＡを切断することにより得られた１以上のフラグメントを用いて、特定の遺伝子サイレンシング用のｈｓｉＲＮＡ混合物を提供するために、パイロット研究を行うことができる。
【０１４８】
（ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写）
前述のように調製されたＤＮＡ鋳型を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写が行われる。転写反応において用いられる鋳型の体積は、精製の方法に依存する。未精製ＰＣＲ生成物として、反応液３０μｌあたり５μｌ未満の量が用いられる。鋳型ＤＮＡの添加量は反応液３０μｌあたり１μｇを超えてはならない。
【０１４９】
（表２）
ＲＮａｓｅ−非含有水 ５０−ｘμｌ
１０×緩衝液／ＮＴＰ ６μｌ
ＤＮＡ鋳型（〜０．５−１μｇ） ｘμｌ
３０×ＨＭＷ混合物 ２μｌ
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（１５０Ｕ／μｌ） ２μｌ
６０μｌ
【０１５０】
４２℃でのインキュベーションは、実質的な二次構造を含むＲＮＡ転写体の収率を向上させることができる。特定の転写体中の二次構造含量を測定するのは困難であるため、可能であればすべての転写を４２℃で行うことが推奨される。転写収率は、最初の（約）９０分間に線形的に増加し、２〜３時間後に最大に達する。所望ならば反応を一晩行うことができるが、収率は高くならない。二本鎖ＲＮＡは、３７℃での長期インキュベーション時に安定である。
【０１５１】
転写反応を、ＲＮａｓｅの混入を避けるように注意して、１％アガロースゲル上で分析することができる。二本鎖ＲＮＡは、およそ反応で用いられるＤＮＡ鋳型として移動する。Ｌｉｔｍｕｓ３８ｉｌｕｃコントロール鋳型からの転写体の予想される長さは、１０００ｂｐである。
【０１５２】
二本鎖ＲＮＡ転写生成物を、エタノール沈殿により精製する。３Ｍ ＮａＯＡｃの１／１０体積を、２倍体積の冷９５％エタノールと共に、ｐＨ５．５で加える。氷上で１５分間インキュベートする、または−２０℃で一晩保存する。微小遠心分離機にて１４０００ｒｐｍで１５分間回転させる。上澄を除去し、２倍体積の８０％エタノールを加え、室温で１０分間インキュベートし、５分間遠心分離し試験管から液分を流し、取り除く。ペレットを風乾する。乾燥ＲＮＡを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、またはｄＨ₂Ｏ中に、溶解する。
【０１５３】
（ｈｓｉＲＮＡ混合物の形成）
以下の実施例のように、消化反応液中で、１×（１０倍希釈）ＲＮａｓｅＩＩＩを（０．１４μｇ／μｌ）の濃度でおよび０．０７μｇ／μＬのｄｓＲＮＡを使用する。
【０１５４】
以下を組み合わせる：
（表３）
ｄＨ₂Ｏ １０５−ｘμｌ
１０×ｈｓｉＲＮＡ緩衝液 １５μｌ
ｄｓＲＮＡ ｘ μｌ（１０μｇ）
ＲＮａｓｅＩＩＩ １５μｌ
１０×ＭｎＣｌ₂ １５μｌ
１５０μｌ
３７℃で２０分間インキュベートする。
１０×ＥＤＴＡ１５μｌを迅速に加えて反応を停止する。
【０１５５】
消化生成物をモニターするのに、１０〜２０％ｎａｔｉｖｅ ポリアクリルアミドゲルが適当である。消化生成物は、出発の長いｄｓＲＮＡの長さにかかわらず、長いｄｓＲＮＡが切断されて１８〜２５ヌクレオチドの範囲のサイズを有するフラグメントのｈｓｉＲＮＡ混合物が提供されたことを示す。この混合物は、トランスフェクションで用いる前にエタノール沈殿の単一工程で精製することができる。
【０１５６】
（ｈｓｉＲＮＡフラグメントのエタノール沈殿）
１／１０体積の３Ｍ ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．５、２μＬのグリコーゲン溶液、および３倍体積の冷９５％エタノールを加える。−７０℃で３０分間または、−２０℃で２時間乃至一晩置いた。微小遠心分離機にて１４０００ｒｐｍで１５分間回転させた。小さなペレットの形成を避けるように上澄を注意深く除去し、２倍体積の８０％エタノールを加えて、室温で１０分間インキュベートし、５分間遠心分離し、試験管から液分を流し、取り除く。ペレットを風乾する。乾燥ＲＮＡを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、またはｄＨ₂Ｏ中に、溶解する。
【０１５７】
（ｄｓＲＮＡ濃度の決定）
ＵＶ分光光度計（２６０ｎｍでのＯＤ値１は、４０μｇ／ｍＬ ｄｓＲＮＡに相当）または蛍光計（オレゴン州ユージーン在、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＰｒｏｂｅｓのＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）を使用）を用いて、または当該分野で用いられるｓｉＲＮＡ標準と比較することにより測定する。
【０１５８】
（トランスフェクションガイドライン）
エタノール沈殿後、ｈｓｉＲＮＡ混合物を、ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ２０００、ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、ＴＲＡＮＳ−ＩＴ ＴＫＯ（登録商標）（Ｍｉｒｕｓ Ｃｏｒｐ．、ウィスコンシン州マジソン）およびＴａｒｇｅｆｅｃｔ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州サンティー）のようなオリゴヌクレオチドトランスフェクションに適した試薬およびプロトコルを用いて哺乳動物細胞に直接トランスフェクトすることができる。さらに、リン酸カルシウムおよび電気穿孔が、短いＲＮＡのトランスフェクションで効果的であると報告されている。
【０１５９】
実験結果に従って調節される初期量としてトランスフェクションウエル（２４穴フォーマット）あたり２５〜１００ｎｇのｈｓｉＲＮＡを用いることができる。
【０１６０】
ｄｓＲＮＡをより安定または耐分解性にする２−フルオロ−リボ−ＣＴＰ、２−フルオロ−リボ−ＵＴＰ、２−Ｏ−メチル−リボ−ＣＴＰ、２−Ｏ−メチル−リボ−ＵＴＰ、２−Ｏ−メチル−リボ−ＡＴＰ、２−Ｏ−メチル−リボ−ＧＴＰまたは他の２’修飾物質のような、前記１０×緩衝液中のＮＴＰの代わりとなる修飾リボヌクレオチドを含む修飾転写緩衝液を用いて、前述のようなｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写により大きなｄｓＲＮＡを合成することができる。これらの目的のためにＤＵＲＡＳＣＲＩＢＥ（登録商標）キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ウィスコンシン州マジソン）を用いることができる。
【０１６１】
（実施例８）
（標的ｍＲＮＡの異なる配列セグメントに相当するｈｓｉＲＮＡ混合物は、標的ｍＲＮＡのサイレンシングにおいて効果的である）
【０１６２】
遺伝子発現を抑制するための標的遺伝子の異なるセグメントに相補的な大きな二本鎖ＲＮＡからのｈｓｉＲＮＡ混合物の効果を、実施例６に記載のように１０ｍＭ Ｍｎ²⁺イオンの存在下、ＲＮａｓｅＩＩＩを消化して生成される混合物を用いて決定した。ヒトＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤｎＭｔ１）（Ａｃｃ．Ｘ６３６９２）の３ｃＤＮＡフラグメントのｒｕｎ−ｏｆｆ転写により大きなｄｓＲＮＡ調製物を合成した。ヌクレオチド（１７３７〜２１１３）に対応するセグメント１、ヌクレオチド（２１１４〜３２３０）に対応するセグメント２およびヌクレオチド（３２３１〜４３９１）に対応するセグメント３をＰＣＲによって増幅し、Ｌｉｔｍｕｓ２８ｉ内にクローニングした。ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ベバリー）およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ベバリー）により提供されるキットマニュアルおよび参考文献に指示されている標準的組換えＤＮＡ技術を用いて、ｄｓＲＮＡを生成した。ｄｓＲＮＡをエタノールで沈殿させ、１０ｍＭ ＭｎＣｌ₂の存在下、ＲＮａｓｅＩＩＩで加工した。
【０１６３】
これらのＲＮａｓｅＩＩＩ発生ｈｓｉＲＮＡ混合物がＤｎＭＴ１の発現を低下させる効果を、サル上皮ＣＯＳ−７細胞中で試験した。細胞を実施例６に記載のように培養し、以下のフォーマットで発現プラスミド（ｈｅｘａ−ヒスチジンｔａｇに融合した全長ヒトＤｎＭＴ１配列を含むｐｃＤＮＡ−４）を用いて１μｇ／穴でトランスフェクトした。ａ：単独、またはｂ：ルシフェラーゼに対して合成ｓｉＲＮＡ１００ｎｇを用い、またはｃ：ＤｎＭＴ１セグメント１からのｈｓｉＲＮＡ１００ｎｇを用い、またはｄ：ＤｎＭＴ１セグメント２からのｈｓｉＲＮＡ１００ｎｇを用い、またはｅ：ＤｎＭＴ１セグメント３からのｈｓｉＲＮＡ１００ｎｇを用い、実施例６に記載のようなＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いる。ｈｓｉＲＮＡの最終濃度は１５ｎＭ。トランスフェクションの４８時間後に細胞を溶解し、各溶解物からの画分を、特定のサイレンシング効果を決定するために抗ＤｎＭＴ１抗体（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ベバリー）および非特異的サイレンシング効果を試験するために抗ｐ５３抗体を用いてウエスタンブロットで分析した。
【０１６４】
ウエスタンブロットの結果（図１０−１および図１０−２）は、３つのすべてのセグメントが、ＤｎＭＴ１の発現の低下に効果的であるがｐ５３の発現に影響を与えないｈｓｉＲＮＡを生成することを示している（レーン４、５および６）。結果は、セグメント２（レーン６）からのｈｓｉＲＮＡ混合物が、他のセグメントから得られる生成物と比較すると、ウエスタンブロット上の対応するバンドに関連して低下した信号が示すように、他の２つのセグメントからのものよりもサイレンシングの性能が高いことも示した。
【０１６５】
（実施例９）
（ＲＮａｓｅＩＩＩで消化した大きなｄｓＲＮＡを用いて効果的ｓｉＲＮＡ配列を発見する方法：ＤｎＭＴ１に対する単一の活性ｓｉＲＮＡの決定）
【０１６６】
ヒトＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤｎＭＴ１、ＡＣＣ．Ｘ６３６９２）のフラグメント２に対応するｈｓｉＲＮＡ混合物。２００ｎｇ／ｍＬの濃度のヌクレオチド（２１１４〜３２３０）を、実施例８に記載のように、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いてＨＥＫ２９３細胞に導入してＤｎＭＴ１ ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介サイレンシングを誘導する。処理した細胞および、非標的遺伝子、例えばＧＦＰに向けられたｈｓｉＲＮＡ混合物で処理した対照細胞からのＲＮＡ全体を、ＲＮＡｗｉｚ試薬（Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州オースチン）を用いるトランスフェクションの６時間後に、まず抽出し、次に、製造者のプロトコルに従ってポリ−Ａ−スピンキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ベバリー）を用いてｍＲＮＡを単離するために用いた。ＤＮＡアンチセンス：
プライマー１：（ｇｔｃａｇｔｃｔｃａｔｔｇｇｇｃｃｔｇｃｃｇｔｔ）（配列番号１３）
プライマー２：（ｇａａｇｇｃｃｔｃａｇｇｇｇｇｃａｇｇｔａｃａｃａ）（配列番号１４）
プライマー３：（ｔｃａｔａｃｃａｃａｇｃｔｇｇｔａｇａａｇｔａｇｇｔ）（配列番号１５） を標準的合成を用いて合成し、５’末端において、α３２Ｐ−ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ベバリー）を用いて製造者により提供されたプロトコルにより高特異的活性で標識した。３つの別々の反応の２セットでプライマー伸長を行う。１つのセットは、ｈｓｉＲＮＡ混合物で処理した細胞からのＲＮＡを用いることであり、第２のセットはＧＦＰに向けられたｓｉＲＮＡで処理したネガティブなコントロール細胞からのＲＮＡを用いることである。各プライマー伸長反応は、Ａ＋−ＲＮＡの１μｇ、および製造者のガイドラインに従うプロメガプライマー伸長システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マジソン）、および非特許文献３０に記載の標準的プロトコルを用いて行う。プライマー伸長生成物を、プライマー１、２および３およびＤＮＡ鋳型としてのフラグメント２のＬｉｔｍｕｓ構造体を用いて調製されたＳａｎｇｅｒシーケンシングラダーに近接したポリアクリルアミドシーケンシングゲルにおいて分析して、単一ヌクレオチドの解像度での生成物を確認することができる。標的ＤＮＭＴ１ ＲＮＡ上の切断部位は、プライマー伸長生成物バンドの可動性を、それぞれの配列ラダーにおいて共移動する可動性と比較する、例えば、プライマー１の伸長生成物をプライマー１を用いて発生させた配列ラダーと比較することにより確認する。前述のプロトコルを図１１に要約する。その結果は、切断部位におけるｍＲＮＡの配列を提供する。ｓｉＲＮＡの中心領域に対応する部位において切断を起こすようにｓｉＲＮＡがｍＲＮＡに結合する（非特許文献２５参照）ことを認識していれば、切断部位における配列からのｍＲＮＡの確認された切断の原因となる全長ｓｉＲＮＡフラグメントの配列を決定することができる。切断の原因となるｓｉＲＮＡフラグメントの配列がいったん確認されると、確認された配列を有するＤＮＡを作成することができ、二本鎖ＲＮＡを発現することができるプロモーターを有するベクターにＤＮＡを挿入する標準的技術を用いてクローンを調製することができる。ｓｉＲＮＡをコードするクローニングされたＤＮＡは、次に、遺伝子サイレンシングの研究のための、または治療剤として使用するための試薬として役立つことができる。
【０１６７】
前記内容に加えて、ｓｉＲＮＡ配列をコードするクローニングされたＤＮＡをクローニングすることができる。このＤＮＡは、ヘアピン構造を有するＲＮＡを発現する。このＤＮＡは、遺伝子サイレンシング用の試薬として役立つ。あるいは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写に用いるために、ＤＮＡを化学的に合成することができる。これらの環境において、所望のｓｉＲＮＡの配列が、スペーサーが挿入されている繰り返し配列を有するＤＮＡとして合成される。いったん転写されると、反対方向のＲＮＡ繰り返し部分は、スペーサーにより表されるループ領域を有するヘアピン生成物を発生させることができる（非特許文献３１参照）。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１−１】ｈｓｉＲＮＡ混合物の生成に対するＭｎ²⁺イオン濃度の効果を示す図である。 ヒトＰＫＲに相当する４００ｂｐのｄｓＲＮＡ（０．２５μｇ）、大腸菌ＲＮａｓｅＩＩＩ（最終濃度０．０５μｇ／μｌ）および５、１０、２０または５０ｍＭ塩化マンガン緩衝液（レーン２〜５）または１０ｍＭ塩化マグネシウム含有緩衝液（レーン６）の反応混合物２０μｌを、３７℃で２０分間インキュベートした。消化生成物を、２０％ＴＢＥアクリルアミドゲル上で分析した。すべての濃度のマンガンイオンの存在下、マグネシウムイオンの存在下に観察されるよりも実質的に多い量の２０〜２５ｂｐフラグメントが得られた。
【図１−２】２０ｍＭ Ｍｎ²⁺緩衝液中でのｈｓｉＲＮＡ混合物の形成に対するＲＮａｓｅＩＩＩの濃度の変化の効果を示す図である。 ホタルルシフェラーゼに相当する１０００ｂｐのｄｓＲＮＡ（２．５μｇ）およびＲＮａｓｅＩＩＩ（１．３６ｍｇ／ｍｌ）０、０．５、１、２、４、８および１６μｌを含む反応混合物５０μｌを、３７℃で２０分間消化した。反応終了後、各試料４０μｌを２０％ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ上で分析した。２０〜２５塩基対のサイズ範囲のｈｓｉＲＮＡ混合物（角型括弧内）の量を、柱状図（蛍光強度Ｘ領域）に示すように臭化エチジウム染色ゲルの蛍光濃度測定を用いて決めた。ＲＮａｓｅＩＩＩ（１．３６ｍｇ／ｍｌ）４μｌは、所望のサイズ範囲のフラグメントの実質的な分画を生成するのに充分であった。
【図１−３】一定量の基質と共に種々の量のＲＮａｓｅＩＩＩを用いるｈｓｉＲＮＡ混合物の効果的生成のためのＲＮａｓｅＩＩＩと基質との最適比をいかに決めたかを示す図である。 Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓキチン合成酵素に相当する１０００ｂｐのｄｓＲＮＡ（０．５６μｇ）を含む反応混合物５０μｌを、種々の量のＲＮａｓｅＩＩＩを用いて消化した。レーン２〜５について、それぞれ、１．７、０．８、０．４および０．２のＲＮａｓｅＩＩＩ／基質（重量）比を計算した。切断緩衝液は１０ｍＭ ＭｎＣｌ₂を含んでいた。レーン２〜９の各試料について５０μｌ中の酵素の量は、０．１、０．０５、０．０２５、０．０１２、０．００６、０．００３、０．００１５、０．０００７μｇ／μｌであった。レーン１は、二本鎖ＤＮＡマーカーを含み、レーン１０は酵素を含まない。
【図１−４】一定量のＲＮａｓｅＩＩＩと共に種々の量の基質を用いるｈｓｉＲＮＡ混合物の効果的生成のためのＲＮａｓｅＩＩＩと基質との最適比を決定した方法を示す図である。 ０．１μｇ／μｌのＲＮａｓｅＩＩＩおよび種々の量のキチン合成酵素二本鎖ＲＮＡを含み、レーン１〜４の基質の濃度が、それぞれ０．６９μｇ／μｌ、０．３７μｇ／μｌ、０．１７μｇ／μｌおよび０．０６μｇ／μｌであり、ＲＮａｓｅＩＩＩと基質との重量比がそれぞれ０．２、０．４、０．８および１．７である反応混合物５０μｌ。
【図１−５】１０ｍＭのマンガンイオンの存在下でのｈｓｉＲＮＡ混合物の形成に対する、インキュベーション時間の効果を示す図である。ｄｓＲＮＡ（１０００ｂｐ）５．６μｇを、１００μｌ中の全ＲＮａｓｅＩＩＩ １０μｇで消化した。各レーンは、１、１０、２０、３０、４０、６０、９０、１２０および１８０分（レーン１〜９）に生じる反応の１／１０を含む。レーン１０は、ｄｓＤＮＡマーカーを含む。
【図１−６】ファルマシアＱセファロースＨＰアニオン交換カラム上でのｈｓｉＲＮＡの精製を示す図である。ＣＲＥＢ ｄｓＲＮＡ（８００ｂｐ）１ｍｇを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＭｎＣｌ₂、１ｍＭジチオスレオトール中で、３７℃にてＲＮａｓｅＩＩＩ １ｍｇで２０分間消化した。消化された試料を、１ｍｌ ＱセファロースＨＰカラム上に直接置き、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５（緩衝液Ａ）５ｍｌで洗い、緩衝液Ａ中、０〜２．０Ｍ ＮａＣｌグラジエントで溶出した。用いた流速は２ｍｌ／分であった。０．０２５〜０．２Ｍ ＮａＣｌの間でカラムからＲＮａｓｅＩＩＩが溶出する。レーン１〜１０は、カラムからのｈｓｉＲＮＡの溶出プロフィールを示し、矢印（レーン６）はグラジエント（０．４０〜０．４５Ｍ ＮａＣｌ）上の位置に対応し、主要な〜１８−２５塩基ｈｓｉＲＮＡが溶出する。
【図２】ＧＦＰ ｄｓＲＮＡ（８００ｂｐ）上のＲＮａｓｅＩＩＩ消化に対する、Ｍｇ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｃｏ²⁺およびＮｉ²⁺の効果を示す図である。 各反応混合物は、最終体積５０μｌの緩衝液中にＧＦＰ二本鎖ＲＮＡ１μｇを含み、最終濃度１０ｍＭとなるように金属イオン：Ｍｇ²⁺（レーン１および２）、Ｍｎ²⁺（レーン３および４）、Ｃｏ²⁺（レーン５および６）、Ｎｉ²⁺（レーン７および８）が補充され、各金属イオンについて、それぞれ、０．０４μｇ／μｌおよび０．０２μｇ／μｌの濃度のＲＮａｓｅＩＩＩ用いられる。レーン９は、全長ＧＦＰ ｄｓＲＮＡを有する。レーンＭは、２０、４０、６０、８０ｂｐ長ｄｓＤＮＡのマーカーを含む。
【図３−１】介在染料（左側）およびプローブにより検出されるＤＮＡフラグメントと、ＤＮＡ基質に対応するｄｓＲＮＡからの放射標識ｈｓｉＲＮＡフラグメントとの関係を示す図である。 実施例７に示すようにｈｓｉＲＮＡ混合物を発生させるための鋳型としてｐ５３ＤＮＡフラグメントを用いた。レーン１は未消化ＤＮＡ；レーン２はＡｃｉＩで消化したＤＮＡ、そしてレーン３は１００塩基ラダーマーカーを示す。実施例３に従って、ＤＮＡ試料をアガロースゲル上に走らせ、臭化エチジウム（左側パネル）で染色し、次に、薄膜に移動させた。ＤＮＡを、ゲル精製標識化ｈｓｉＲＮＡ混合物（右側パネル）で検出した。
【図３−２】図３−１のレーン２におけるバンドのエチジウム蛍光（ライン）および放射活性（棒グラフ）の定量的分析を示す図である。染色された放射活性ゲル上のバンドの強度は、フラグメントサイズに基づく予想された信号に対応する。サザンブロットにおける信号は、放射活性ｈｓｉＲＮＡが、親ＲＮＡの全長を表すことを示している。
【図４−１】ＲＮａｓｅＩＩＩ消化生成物をクローニングする方法を示す概略図である。
【図４−２】ＲＮａｓｅＩＩＩ消化生成物をクローニングする方法を示す概略図である。
【図４−３】対向Ｔ７プロモーターにより包囲された隣接Ｌｉｔｍｕｓ２８ｉポリリンカー配列を有するｍａｌＥ転写体の配列（配列番号１）である（表１）。ｍａｌＥをＬｉｔｍｕｓ中にクローンするために本来用いられる制限部位をマークしている。矢印は、図４−１および図４−２に示すようにクローニングされた配列に対応し、矢印の頭部の方向は、配列が、示された配列（左側から右側）に相当するか相補的鎖（右側から左側）に相当するかを示している。
【図４−４】対向Ｔ７プロモーターにより包囲された隣接Ｌｉｔｍｕｓ２８ｉポリリンカー配列を有するｍａｌＥ転写体の配列（配列番号１）である（表１）。ｍａｌＥをＬｉｔｍｕｓ中にクローンするために本来用いられる制限部位をマークしている。矢印は、図４−１および図４−２に示すようにクローニングされた配列に対応し、矢印の頭部の方向は、配列が、示された配列（左側から右側）に相当するか相補的鎖（右側から左側）に相当するかを示している。
【図４−５】対向Ｔ７プロモーターにより包囲された隣接Ｌｉｔｍｕｓ２８ｉポリリンカー配列を有するＧＦＰ転写体の配列（配列番号２）である。ＧＦＰをＬｉｔｍｕｓ中にクローンするために本来用いられる制限部位をマークしている。矢印は、図４−１及び図４−２に示すようにクローニングされた配列に対応し、矢印の頭部の方向は、配列が、示された配列（左側から右側）に相当するか相補的鎖（右側から左側）に相当するかを示している。
【図４−６】対向Ｔ７プロモーターにより包囲された隣接Ｌｉｔｍｕｓ２８ｉポリリンカー配列を有するＧＦＰ転写体の配列（配列番号２）である。ＧＦＰをＬｉｔｍｕｓ中にクローンするために本来用いられる制限部位をマークしている。矢印は、図４−１及び図４−２に示すようにクローニングされた配列に対応し、矢印の頭部の方向は、配列が、示された配列（左側から右側）に相当するか相補的鎖（右側から左側）に相当するかを示している。
【図４−７】個々のＤＮＡクローンにおける挿入長を報告している柱状図と、表の要約を示す図である。数値は、ｍａｌＥとＧＦＰの両方からの全クローンの分析から編集されている。ｙ軸はクローンの数を表し、ｘ軸は挿入長を表している。
【図５】ショウジョウバエ細胞にＦｆｌｕｃ ｈｓｉＲＮＡ混合物（実施例６）をトランスフェクトすると、ＧＬ−２ホタルルシフェラーゼが実質的にサイレンシングされ、Ｍｇ²⁺の存在下でＭｎ²⁺の不存在下に形成されたＲＮａｓｅＩＩＩ生成物は非効果的であることを示す図である。ホタルルシフェラーゼ用のｈｓｉＲＮＡ混合物をトランスフェクション後にホタルルシフェラーゼおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの両方を発現しているショウジョウバエ細胞からの抽出物のルミネセンスを比較することにより、特異的に標的された遺伝子サイレンシングが示された。ホタルルシフェラーゼルミネセンスとＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼのＲＬＵ比を発現している柱状図での比較を示す。柱状図には：任意の形状の二本鎖ＲＮＡフラグメントをトランスフェクトしなかったコントロール細胞（コントロール）；ルシフェラーゼに対応する非消化二本鎖ＲＮＡ（ｌｕｃ：１．２ｋｂ）；マグネシウムイオンの存在下、ＲＮａｓｅＩＩＩで切断した後のＦｆｌｕｃ二本鎖ＲＮＡ（ｌｕｃｉｉｉ ｍｇ）、Ｆｆｌｕｃ ｈｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞（ｌｕｃｉｉｉ ｍｎ）およびＧＬ３ルシフェラーゼ用の２２ｂｐ化学的合成ｓｉＲＮＡ（ｓｉｌｕｃ）が示されている。
【図６−１】ＧＦＰ ｈｓｉＲＮＡ混合物が、蛍光顕微鏡検査を用いてＨＥＫ２９３細胞中の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現を効果的にサイレンシングさせることを示す図である。（ｉ）細胞に、ＧＦＰ ｃＤＮＡを含むプラスミドをトランスフェクトしたコントロール；および（ｉｉ）ＧＦＰ ｃＤＮＡを含むプラスミドおよびＧＦＰに対応するｈｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞（実施例３）。
【図６−２】遺伝子サイレンシングが、用いたｈｓｉＲＮＡに特異的であることを示す図である。ＨＥＫ−２９３細胞中のルシフェラーゼの量を、ルミネセンスにより測定し（ＲＬＵ）、二本鎖ＲＮＡをトランスフェクトしなかった細胞（コントロール）およびＧＦＰ二本鎖ＲＮＡから誘導されたｈｓｉＲＮＡ混合物をトランスフェクトした細胞（ＧＦＰ−ＲＮａｓｅＩＩＩ）の両方が、ルシフェラーゼ活性への効果が観察されなかった。
【図６−３】ｈｓｉＲＮＡ混合物が、合成ｈｓｉＲＮＡと同様に効果的にルシフェラーゼをサイレンシングさせることを示す図である。ＨＥＫ−２９３細胞中のルシフェラーゼを、ルミネセンス（ＲＬＵ）により測定した。二本鎖ＲＮＡをトランスフェクトしなかった細胞（コントロール）；ホタルルシフェラーゼ二本鎖ＲＮＡから得られたｈｓｉＲＮＡ混合物をトランスフェクトした細胞（Ｆｆｌｕｃ−ｈｓｉＲＮａｓｅ）；ＧＬ３−ルシフェラーゼ用の合成ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞（ＧＬ３−ｓｉＲＮＡ）。ｈｓｉＲＮＡ混合物とｓｉＲＮＡの両方が、ルシフェラーゼの標的サイレンシングを起こした。
【図７】ＣＯＳ−７細胞中のＧＦＰ ｈｓｉＲＮＡを用いる標的サイレンシングの性能を示す図である。蛍光顕微鏡検査は、（ｂ）６ｎｇおよび（ｃ）３０ｎｇのＧＦＰ ｈｓｉＲＮＡと共に、（ａ）コントロール細胞中に検出できる遺伝子サイレンシングがなく（二本鎖ＲＮＡをトランスフェクトしていない）、（ｄ）５ｎｇのＰＫＲまたは（ｅ）３０ｎｇのＰＫＲ ｈｓｉＲＮＡと共に、ＧＦＰを発現するプラスミドをトランスフェクトした細胞における遺伝子サイレンシングを示す。
【図８−１】ヒトｐ５３ｈｓｉＲＮＡ混合物またはＲｌｕｃ−ｈｓｉＲＮＡ混合物をトランスフェクトした後のサルＣＯＳ−７細胞中での内因性サルおよびトランスフェクトしたヒトのｐ５３の発現の標的サイレンシングを示す図である。ＣＯＳ−７に、同時に、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）を発現するプラスミドをトランスフェクトした。図８−１は、抗ｐ５３抗体を用いる細胞抽出物のウエスタンブロットを示す図である。Ｅ＞は内因性ｐ５３の位置を示し、Ｔ＞はトランスフェクションｐ５３フラグメント（アミノ酸１００〜３５３）の位置を示す。ウエスタンブロットは、Ｒｌｕｃ−ｈｓｉＲＮＡ５０ｎｇをトランスフェクトした後（レーン１）；ヒトｐ５３ｈｓｉＲＮＡ混合物５０ｎｇをトランスフェクトした後（レーン２）；ヒトｐ５３ｈｓｉＲＮＡ混合物１００ｎｇをトランスフェクトした後（レーン３）；およびトランスフェクトの不存在下（レーン４）における、細胞中でのトランスフェクトしたおよび内因性ｐ５３の発現の量を反映する。
【図８−２】図８−２は、Ｒｌｕｃ−ｈｓｉＲＮＡが、図８−１に示すトランスフェクション細胞中でＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをサイレンシングさせ、一方、ｐ５３−ｈｓｉＲＮＡ混合物は、ルシフェラーゼの発現に影響を与えないことを示す図である。柱状図の１、２および３と標識された棒は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの（ＲＬＵ）としての発現水準を測定している、図８−１のレーン１、２および３において分析された試料に関する。柱状図は、Ｒｌｕｃ−ｈｓｉＲＮＡがルシフェラーゼの発現をサイレンシングさせるがレーン１においてｈｕｐ５３をサイレンシングさせず、レーン２および３において内因性およびヒトのｐ５３のサイレンシングにおいて効果的であるｐ５３−ｈｓｉＲＮＡ混合物が、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼに明らかなサイレンシング効果を有さないことを示している。
【図９】遺伝子サイレンシング研究のための、細胞内にトランスフェクトするためのｈｓｉＲＮＡ混合物を形成するようにマンガンの存在下にＲＮａｓｅＩＩＩで切断するためのあらゆる所望の大きなｄｓＲＮＡを作るためのキットの概略図である。
【図１０−１】抗ＤｎＭＴ１抗体を用いるウエスタンブロットであり、各混合物がＤｎＭＴ１の異なるセグメントに対応しているｈｓｉＲＮＡの３つの混合物の、ＤｎＭＴ１へのノックダウン効果を示す図である。ノックダウン効果は、対応するタンパク質バンドの減少または不存在により検出可能である。レーン１は、未トランスフェクション細胞からの抽出物を含み、レーン２は、ＤｎＭＴ１を発現しているプラスミドをトランスフェクトした細胞からの抽出物を含み、レーン３は、ＤｎＭＴ１を発現しているプラスミドと、ルシフェラーゼに対応するｓｉＲＮＡ１００ｎｇとをトランスフェクトした細胞からの抽出物を含み、レーン４は、ＤｎＭＴ１を発現しているプラスミドと、Ｄｎｍｔ１セグメント１からのｈｓｉＲＮＡ１００ｎｇとをトランスフェクトした細胞からの抽出物を含み、レーン５は、ＤｎＭＴ１を発現しているプラスミドと、ＤｎＭｔ１セグメント３からのｈｓｉＲＮＡ１００ｎｇとをトランスフェクトした細胞からの抽出物を含み、レーン６は、ＤｎＭＴ１を発現しているプラスミドと、Ｄｎｍｔ１セグメント２からのｈｓｉＲＮＡ１００ｎｇとをトランスフェクトした細胞からの抽出物を含む。
【図１０−２】抗ｐ５３抗体を用いるウエスタンブロットであり、図１０−１に示す３つの混合物の存在下でのｐ５３の発現へのノックダウン効果の不存在を示す図である。レーン１から６は図１０−１に記載した抽出物を含む。
【図１１】標的ｍＲＮＡにおけるｓｉＲＮＡ誘発切断部位を確認するためのプロトコルの概略図である。（ａ）２０ｍＭマンガンイオンの存在下における大きなｄｓＲＮＡのＲＮａｓｅＩＩＩ切断により得られるｈｓｉＲＮＡ混合物に付される既知の配列の標的ｍＲＮＡ（ｂ）切断されたｍＲＮＡフラグメント（ｃ）標識された伸長ＤＮＡプライマーおよび生成物（ｄ）シーケンスゲル上で分析されたプライマー伸長生成物
【配列表フリーテキスト】
【０１６９】
配列番号１：ｍａｌE 転写体
配列番号２：ＧＦＰ転写体
配列番号３：プライマー
配列番号４：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
配列番号７：ＧＦＰｓｉＲＮＡセンス鎖
配列番号８：ＧＦＰｓｉＲＮＡアンチセンス鎖
配列番号９：ＧＬ３ルシフェラーゼｓｉＲＮＡセンス鎖
配列番号１０：ＧＬ３ルシフェラーゼｓｉＲＮＡアンチセンス鎖
配列番号１１：プライマー
配列番号１２：増幅プライマー
配列番号１３：ＤＮＡアンチセンスプライマー１
配列番号１４：ＤＮＡアンチセンスプライマー２
配列番号１５：ＤＮＡアンチセンスプライマー３

Claims (31)

1. （ａ）マンガンの二価遷移金属カチオンとＲＮａｓｅＩＩＩを含む反応混合物において、大きな二本鎖ＲＮＡの調製物を消化すること、および
   （ｂ）ｈｓｉＲＮＡ混合物を生成すること
   を含むことを特徴とする、ｈｓｉＲＮＡ混合物を生成する方法。
2. ｈｓｉＲＮＡ混合物が、大きな二本鎖ＲＮＡの調製物の完全消化の生成物である、請求項１に記載の方法。
3. 完全消化が６時間未満で達成される、請求項２に記載の方法。
4. 完全消化が２時間未満で達成される、請求項２に記載の方法。
5. 反応混合物中のＲＮａｓｅＩＩＩと大きな二本鎖ＲＮＡとの重量比が約０．００５：１〜２５：１の範囲にある、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 反応混合物中のＲＮａｓｅＩＩＩと大きな二本鎖ＲＮＡとの重量比が約０．０１２５：１〜１０：１の範囲にある、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
7. 反応混合物中のＲＮａｓｅＩＩＩと大きな二本鎖ＲＮＡとの重量比が約０．２５：１以上である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
8. 反応混合物が、遷移金属カチオンマンガンを５〜１００ｍＭの範囲の濃度で含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 反応混合物が、遷移金属カチオンマンガンを１０〜２０ｍＭの範囲の濃度で含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
10. 混合物中の各ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列が標的遺伝子に相補的である、請求項１〜９のいずれか１項に従って作られるｈｓｉＲＮＡ混合物を、ヒト内の宿主細胞を除く宿主細胞に導入することを含むことを特徴とする、標的遺伝子のサイレンシング発現法。
11. ＲＮＡｓｅＩＩＩの調製物、および約５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲のマンガンイオンを含むＲＮＡｓｅ緩衝液を含むことを特徴とする、ｈｓｉＲＮＡ混合物を調製するためのキット。
12. 大きな二本鎖ＲＮＡを合成するための試薬をさらに含む、請求項１１に記載のキット。
13. 使用のための指示をさらに含む請求項１１又は１２に記載のキット。
14. 請求項１の方法で得てなるｈｓｉＲＮＡ混合物からなる二本鎖ＲＮＡフラグメントのセットであって、１５〜３０のヌクレオチドのサイズの複数の重複フラグメントを含み、セット中のフラグメントは、大きな二本鎖ＲＮＡの配列の５０％超を表しており、フラグメントの各々の一つの鎖が、標的メッセンジャーＲＮＡの一部または全体に相補的な配列を有する、二本鎖ＲＮＡフラグメントのセット。
15. セット中のフラグメントが、大きな二本鎖ＲＮＡの配列の６５％超を表している、請求項１４に記載のセット。
16. ＲＮＡフラグメントの３０％を超えるものが、１８〜２５塩基対のフラグメントサイズである、請求項１４に記載のフラグメントのセット。
17. セット中の少なくとも１つのフラグメントおよび最大１００％のフラグメントが、細胞中の標的ｍＲＮＡの切断を起こすことができる、請求項１６に記載のフラグメントのセット。
18. ヒト内の細胞以外の真核細胞中に導入されたときにｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡをサイレンシングさせることができる、請求項１４に記載のフラグメントのセット。
19. ＤＮＡクローンのライブラリを、請求項１に従って得てなるｈｓｉＲＮＡ混合物から作る方法であって、各クローンが前記ｈｓｉＲＮＡ混合物からの１以上の二本鎖ＲＮＡフラグメントを発現しており、前記方法は、
    （ａ）ｈｓｉＲＮＡ混合物を変性して、対になっていないＲＮＡ鎖の混合物を形成すること、
    （ｂ）前記対になっていないＲＮＡ鎖の３’末端に第１の一本鎖ＤＮＡプライマーをライゲート（連結）し、前記対になっていないＲＮＡ鎖の５’末端に第２の一本鎖ＤＮＡプライマーをライゲートすること、
    （ｃ）工程（ｂ）のキメラＤＮＡ−ＲＮＡ生成物を逆転写して、相補的ＤＮＡフラグメントを形成すること、および
    （ｄ）１以上のＤＮＡフラグメントをベクター内に挿入してクローンのライブラリを形成すること、を含む方法。
20. 工程（ｃ）が、ＤＮＡフラグメントのポリメラーゼ依存増幅を行うことをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
21. 工程（ｂ）におけるＲＮＡ鎖の５’末端が脱リン酸化される、請求項１９に記載の方法。
22. 工程（ｂ）におけるＲＮＡ鎖の３’末端が３’ヒドロキシル末端であり、第１のＤＮＡプライマーが５’リン酸と３’リン酸の両方を有し、第１のプライマーが第２のプライマーの前に３’末端にライゲートされる、請求項２１に記載の方法。
23. 工程（ｂ）の第１のプライマーにライゲートされたＲＮＡ鎖をリン酸化し、３’末端でリン酸化されていない第２のプライマーにライゲートする、請求項２２に記載の方法。
24. クローンのライブラリを創る方法であって、各クローンは請求項１に従って調製されたｈｓｉＲＮＡ混合物からの１以上の二本鎖ＲＮＡフラグメントに対応しており、前記方法は、
    （ａ）ｈｓｉＲＮＡ混合物を変性して対となっていないＲＮＡ鎖の混合物を形成すること、
    （ｂ）混合物中の各鎖から５’リン酸を酵素的に除去すること、
    （ｃ）各鎖の３’ヒドロキシル末端に、５’リン酸と３’リン酸の両方を有するＤＮＡプライマーをライゲートすること、
    （ｄ）得られる種の５’末端を酵素的にリン酸化すること、
    （ｅ）各鎖の５’リン酸化末端に、非リン酸化３’末端を有する第２のＤＮＡプライマーをライゲートすること、
    （ｆ）工程（ｅ）のキメラＤＮＡ−ＲＮＡ生成物を逆転写して、相補的ＤＮＡフラグメントを形成すること、および
    （ｇ）１以上のＤＮＡフラグメントをベクター内に挿入して配列のライブラリを形成すること、
    を含む方法。
25. 工程（ｆ）が、ＤＮＡフラグメントのポリメラーゼ依存増幅を行うことをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
26. ベクターが、ｐＵＣ１９またはＬｉｔｍｕｓベクターである、請求項２４に記載の方法。
27. 標的遺伝子の、増加した遺伝子サイレンシングをしうるｈｓｉＲＮＡ混合物を確認するための迅速発見法であって、
    （ａ）標的遺伝子のセグメントに相補的な配列を各々の大きなｄｓＲＮＡが有する複数の大きなｄｓＲＮＡを合成すること、
    （ｂ）請求項１に従いｈｓｉＲＮＡ混合物を生成すること、
    （ｃ）各ｈｓｉＲＮＡ混合物をヒト内の細胞以外の真核細胞内に導入して、遺伝子サイレンシングが起こるかどうか決定すること、および
    （ｄ）どのｈｓｉＲＮＡ混合物が増加した遺伝子サイレンシングを起こしたか決定すること、
    を含む方法。
28. 工程（ｄ）が、増加した遺伝子サイレンシングをするために、請求項１に従って作製した第１のｈｓｉＲＮＡ混合物を、請求項１に従って作製した第２のｈｓｉＲＮＡ混合物と組み合わせることをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
29. ｈｓｉＲＮＡ混合物から個々のｓｉＲＮＡフラグメントを選択し、個々のｓｉＲＮＡフラグメントを前記真核細胞内に導入して所望の遺伝子サイレンシングを達成することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
30. ｍＲＮＡ中の切断部位からのｓｉＲＮＡに対応する配列を確認する方法であり、
    （ａ）請求項１記載の方法を用いてｈｓｉＲＮＡ混合物を得ること、
    （ｂ）ｈｓｉＲＮＡを細胞内に導入すること、
    （ｃ）切断したｍＲＮＡを細胞から抽出すること、
    （ｄ）ｓｉＲＮＡ切断ｍＲＮＡの切断部位における末端ヌクレオチドの配列を決定すること、および
    （ｅ）切断部位配列からのｓｉＲＮＡ配列、およびインタクトなｍＲＮＡからの隣接ヌクレオチドを確認すること、
    を含む方法。
31. 配列を決定する工程が、標識された伸長ＤＮＡプライマーを用いることをさらに含む、請求項３０に記載の方法。

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