JP2005535356A - 遺伝子サイレンシングに関する方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2002年8月12日に出願された米国仮出願60/402,769、2002年8月30日に出願された米国仮出願60/407,543および2003年5月2日に出願された米国仮出願60/467,541の優先権を主張する。これらの出願は、参照として本明細書に組み込まれる。
切断の詳細な条件を以下に示すが、それらの条件は限定を意図しない。等価の組成および緩衝液を、本態様のために容易に代わりに使用することができる。
二価遷移金属イオンの存在下、約0.005:1〜25:1の範囲の基質に対するRNaseIII酵素の比(重量/重量)で、大きな二本鎖RNAを切断してhsiRNA混合物にすることができる。実際、例えば約2:1〜3:1の重量比の基質に対する高濃度のRNaseIIIを、遷移金属二価カチオンの不存在下、効果的に用いてポリアクリルアミドゲル上で21〜23ntに相当するバンドを作ることができる。バンド中の材料の量は、基質に対する酵素の比の増加と共に増加する。しかし、遷移金属二価カチオンの不存在下に得られる収率は、遷移金属二価カチオンの存在下よりも実質的に少ない。
マンガンイオンに加えて二価遷移金属イオンCo2+、Ni2+、Cd2+またはFe2+の存在下、hsiRNA混合物を調製することができる(例えば、図2および実施例2に示す)。例えば、MnCl2、CoCl2、NiSO4、CdCl2またはFeSO4を、0.1〜100mM、好ましくは5〜100mM、例えば、10〜20mMの濃度で反応混合物に加えることができる。反応を最適化するパラメータは、本明細書においてマンガンについて最も詳細に記載されているが、pH、緩衝液の条件、温度、反応時間、濃度および実施例1から7に記載の手法を用いて決定される酵素対基質の比について、他の二価遷移金属の存在下でのRNaseIIIの最適反応条件が決定できると予想される。hsiRNA混合物を調製するために、マグネシウムと比較して、10mM濃度の種々の二価遷移金属カチオンの存在下、RNaseIIIの優れた性能が証明された(図1−1および図2)。
特定の標的mRNAに対する遺伝子サイレンシングの特異性を、標的mRNA中の配列のBLAST分析を用いて確認して、RNAの伸長領域(20塩基長を超える)が非特異的遺伝子サイレンシングを避けるために他の遺伝子転写体に同一でないと決定することができる。
本明細書に記載されるように、高濃度条件下および/または遷移金属カチオンの存在下、RNaseIIIで大きなdsRNAを切断することにより生成されたdsRNAフラグメントのセットは、重複フラグメントのヘテロジニアスな混合物である。この混合物は、おそらくは、mRNA内において大きなdsRNAが配列に相補的である標的遺伝子のmRNA転写体を切断することにより、遺伝子のサイレンシングを行うことができる。例えば、実施例4および6の方法を用いて生成されたhsiRNA混合物を分析することにより、最も効果的な標的配列の特徴を単一のヌクレオチド分解を用いて定めることができる。
NNNNNNNN-10NNNNNNNNNXNNNNNNNNNN+10NNNN
(ii)siRNA
N-10NNNNNNNNNXNNNNNNNNNN+10
クローニングしたフラグメントの利用可能性は、試薬または治療剤の連続的供給のみならず、siRNAフラグメントを繰り返し投与することなく生体全体において遺伝子治療技術により所望のノックダウン効果を維持することができる新規治療手法も提供する。siRNAフラグメントまたはhsiRNA混合物を発現するクローンを、標的遺伝子の完全な、調節されたまたは一時的なin vivoでのサイレンシングに用いることができる。
充実性腫瘍または白血病を含むあらゆるタイプの癌の治療または治療の開発に本発明を用いることができ、その例が特許文献10に列挙されている。
hsiRNA混合物の調製
(RNaseIIIによるdsRNAの切断への、マンガンイオンの効果の決定)
この実施例ではhu PKRである目的とする遺伝子に対応する全長二本鎖RNA(dsRNA)を、HiScribe(商標)RNAi転写キット(New England Biolabs,Inc.、マサチューセッツ州ベバリー)を用いて発生させた。二本鎖RNAを創成する方法は、実施例7に詳細に記載する。
GL3ルシフェラーゼからの1kb(SphI−NgoMIV)フラグメントを、Litmus38i中でクローニングした。(ビオチン化T7プライマーPCRを用いて)実施例7に記載のように発生させたDNA鋳型から、HiScribe(商標)キット(New England Biolabs,Inc.、マサチューセッツ州ベバリー)を用いて二本鎖RNAを発生させた。dsRNA2.5μgを、反応混合物50μL中、1.36mg/mL RNaseIII保存溶液0.5、1、2、4、8、16μL(反応混合物中の最終濃度0.012、0.025、0.050、0.11、0.22および0.44μg/μlに相当する)を用いて消化した。反応を、50mM NaCl、50mM Tris−HCl、20mM MnCl2、1mMジチオスレイトール(pH7.5、25℃)からなる緩衝液中で20分間行い、EDTAを最終濃度25mMとなるよう加えて停止した。各反応からの40μLを、20%native PAGEで分析した(図1−2)。検出された主要な消化生成物は、単一配列合成siRNAと共移動する(図1−2、レーン5、6、7および8とレーン1とを比較)。少なくとも2μLのRNaseIII(図1−2、0.05μg/μlのRNaseIIIの最終濃度を用いるレーン5)が利用された場合、消化は完全であると判断された。蛍光ゲル濃度計測を用いて、RNaseIII濃度の関数として生成されたhsiRNAの相対量を測定した。この実験において、RNaseIII4μL(0.11μg/μl最終濃度)を用いるとhsiRNAの最大収率が得られる。
hsiRNAの生成のためのRNaseIIIの最適濃度をさらに定めるために、種々の濃度のRNaseIIIを用いて第2の基質の消化においてhsiRNA収率をモニターした。50mM Tris−HCl、pH7.5、100mM NaCl、1mM DTT、10mM MnCl2を含む反応液10μl中で、0.025〜3.2単位/μlに及ぶRNaseIII濃度(32単位は、RNaseIIIの1μgに相当し、0.0007〜0.1μg/μlの最終濃度を提供する)を用いて、dsRNA基質(〜1000bp、C.elegansキチン合成酵素遺伝子の一部)0.056μg/μlを消化した。反応混合物を、37℃で30分間インキュベートした。0.5M EDTAの0.5μlを加えることによりRNaseIII消化を停止した。ローディング緩衝液(キシレンシアノールおよびブロモフェノールブルーを含む)1μlを伴う各反応液(2.5μl、0.14μgのdsRNA基質に相当する)の画分を、20%native PAGEにより分析した(図1−3)。
hsiRNA生成の動態を、時間経過による研究によりモニターした。10mM Mn++を含む緩衝液の存在下に最適のRNaseIII:dsRNA比(dsRNAを0.056μg/μl、RNaseIIIを3.2単位/μl(0.1μg/μl))を用いて種々の長さの時間、消化反応を行った。成分をすべて加えた後、反応液をボルテックスにより短時間撹拌して、37℃でインキュベートした。インキュベーション中の種々の時間に、反応液10μlを取り出し、0.5M EDTA 0.5μlで反応停止した。試料を氷上に保持してから、20%native PAGEゲル上で分析した(図1−5)。
10mM Tris−HCl、pH7.5中におけるQセファロースカラム(Pharmacia、ニュージャージー州ピスカタウェイ)を通すRNaseIII消化dsRNAの高性能アニオン交換カラムクロマトグラフィーにより大量の精製hsiRNAを得た(図1−6)。RNaseIII(0.025〜0.2M NaClで溶出)および30〜1000塩基のdsRNA(0.5Mおよびより高濃度のNaClで溶出)とは別に、18〜25塩基の精製hsiRNAを0.40〜0.45M NaClでカラムから溶出した。レーン5および6は、多量のhsiRNAおよび他のサイズの少量のRNAを含む主要バンドを示す。
(種々の二価金属イオンを用いるhsiRNAの調製)
RNaseIIIの切断生成物への種々の二価カチオンの効果を決定するために、以下の実験を行った:100mM NaCl、50mM Tris−HCl、1mMジチオスレイトールおよび、37℃での10mM MgCl2(レーン1および2)、10mM MnCl2(レーン3および4)、10mM CoCl2(レーン5および6)または10mM NiSO4(レーン7および8)を含む緩衝液50μL中で、pH7.5(25℃)にて、2つの濃度の大腸菌RNaseIII(0.04μg/μlまたは0.02μg/μl)の各々を用いて、大きな二本鎖RNA分子(800bp)1μgを30分間消化した。結果を図2に示す。0.04μg/μlのRNaseIIIおよび10mMマンガンイオンの存在下での大きな二本鎖RNAの完全消化により、約22bp(20bp〜40bpの範囲)のサイズの二本鎖RNA生成物を生成した。マンガンイオンを含まない10mM Mg2+緩衝液の存在下、0.04μg/μlのRNaseIIIで消化することにより、所望の18〜25bp長より小さい(レーン1および2)と共にRNAiサイレンシング実験に適していないと分かったフラグメントが生成された。これに対して、マンガンに加えてコバルトまたはニッケルの存在下に生成されたフラグメントにより、マグネシウムイオンの存在下に得られたものよりも大きな、長さ18〜25bpの所望のフラグメントの画分が得られた。
(RNaseIII消化の短い二本鎖RNA切断生成物が、親の配列全体を表す配列を含む)
p53の転写のためのDNA鋳型(アミノ酸100〜393をコードする1.1kbフラグメント)を、制限酵素AciIで消化し、得られるフラグメントをアガロースゲル上で分離した。ゲルをエチジウムで染色し、写真に撮り、続いてナイロン薄膜(Hybond(登録商標)N+、Amersham、ニュージャージー州ピスカタウェイ)に移した。
(hsiRNAフラグメントのクローニングおよび配列決定)
RNaseIII消化からの生成物を、プライマーアニーリング部位を、消化されたRNAの鎖の各端部に連続的にライゲートする方式を用いてクローニングした(図4−1および図4−2)。ライゲーションの順番を、ライゲートされる種の異なるリン酸化により正確に制御し、いずれかのライゲーション工程中の種のいずれかの重合も妨げた。次に、得られるRNA−DNAキメラを、RT−PCRにより増幅し、配列決定のためにプラスミドベクター内にクローニングした。また、単一プライマーを用いる第2の鎖cDNA合成を、PCR工程への代替法として行うことができる。
マルトース結合タンパク質(malE)に対応する全長二本鎖RNA(dsRNA)を、HiScribe(商標)RNAi転写キット(New England Biolabs,Inc.、マサチューセッツ州ベバリー)を用いて発生させた。In vitroでの転写のための鋳型を発生させるために、malEの808bp BglII−EcoRIフラグメントを含むpLITMUS28iプラスミドを、PCR反応において用いて、遺伝子フラグメントを増幅した。体積50μl中の、0.4μM T7最小プライマーd(5’−TAAACGACTCACTATAGG−3’(配列番号3)、400μM dNTPおよびプラスミドDNA約20ngを加えた、1×ThermoPol反応緩衝液[20mM Tris−HCl、pH8.8、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1%Triton X−100]中で、Vent(登録商標)DNAポリメラーゼ(New England Biolabs,Inc.、マサチューセッツ州ベバリー)を用いてPCRを行った。各々が94℃で30秒、50℃で30秒および72℃で30秒からなるPCRプロトコルを25サイクル行なった。消化液とPCR反応液の両方を、標準的分子生物学技術を用いてフェノール/クロロホルムで抽出しエタノールで沈殿させ、次に、TE緩衝液(10mM Tris−HCl、pH8.0、1mM EDTA)中に再懸濁して最終濃度1mg/mL(制限消化)または125μg/mL(PCR生成物)にした。次に、これらの鋳型を、大規模in vitroでの転写反応において用いて大きなdsRNAを発生させた。
RNaseIII消化を行って、malE配列から長さ22bpの小さなRNA二本鎖を得た。0.1M NaCl、50mM Tris−HCl、pH7.9、10mM MnCl2、1mMジチオスレイトールおよびRNaseIII(New England Biolabs,Inc.、マサチューセッツ州ベバリー)4μg中に全長malE dsRNA4μgを含み合計で160μLの反応液を、37℃で30分間インキュベートした。次に、試料をフェノール/クロロホルムで抽出してエタノールで沈殿させて、RNaseIIIを除去すると共にRNAフラグメントを回収した。次に、小さなRNAフラグメントを、仔牛腸管アルカリホスファターゼ(CIP)(Roche Diagnostics、ドイツ、マンハイム)で処理して、その後のライゲーション反応中の重合を防止した。これは、試料を50℃で5分間予備加熱することにより達成し、50mM Tris−HCl、pH8.5、0.1mM EDTA中、RNA1μgあたりCIP2.5単位を用いて製造者により記載されているように標準的反応においてCIPで処理した。反応は、50℃で1時間行い、続いて、フェノール/クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。次に、脱リン酸化したRNAフラグメントをTE25μL中に再懸濁した。
小さなRNAフラグメント(前記からの4μgの全試料)を、次に、その3’においてプライマー1、すなわちBamHI制限部位(下線箇所)を含むd(5’p−CTGCAGGATATCTGGATCCAC−p−3’(配列番号4)にライゲートした。RNAフラグメント二本鎖を、まず、70℃で5分間加熱することにより変性させ、次に、氷上に置いた。ライゲーションは、50mM Tris−HCl、pH7.8、10mM MgCl2、10mMジチオスレイトール、1mM ATPを含み、10%(v/v)DMSO、プライマー1の10μgおよびT4 RNAリガーゼ(New England Biolabs,Inc.、マサチューセッツ州ベバリー)120単位を加えた60μL中で20℃で24時間行った。次に、ライゲーション生成物を、7M尿素を含む変性12%ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動することによりゲル精製し、長さ約45ntのバンドを切り出した。ライゲーション生成物を、RNA溶出緩衝液を用いてゲルから溶出し、前述のようにエタノール沈殿により回収し、TE10μL中に再懸濁した。
前記ライゲーション生成物の5’RNA末端を、3’−ホスファターゼを含まないT4ポリヌクレオチドキナーゼ(T4 PNK(Roche Diagnostics、ドイツ、マンハイム))を用いてリン酸化して、その後のライゲーション反応における重合を回避した。50mM Tris−HCl、pH7.8、10mM MgCl2、10mMジチオスレイトール、1mM ATP((New England Biolabs,Inc.、マサチューセッツ州ベバリー)の1×T4 RNAリガーゼ緩衝液)および10単位のT4 PNKを含む20μL中で、前記試料全体を用いて37℃でリン酸化を30分間行った。次に、T4 PNKを、65℃で20分間インキュベートすることにより熱不活化した。
5’および3’末端においてそれぞれプライマー2および1にライゲートした小さなRNAの生成物を、次に逆転写して二本鎖を作り、次のPCR増幅に用いた。逆転写は、プライマー3すなわちd(5’−GTGGATCCAGATATCCTGCAG−3’(配列番号6)を用いて行ったが、プライマー3はBamHI部位(下線箇所)を有するLitmus28/38逆配列プライマー(New England Biolabs,Inc.、マサチューセッツ州ベバリー)としても知られている。前記の試料全体を、0.1μMプライマー3および0.5mM dNTPと混合し、次に、65℃で5分間加熱し、続いて、氷上で冷却して、ライゲーション生成物の3’末端にプライマー3をアニーリングした(プライマー3はプライマー1に相補的)。50mM Tris−HCl、pH8.3、75mM KCl、3mM MgCl2および10mMジチオスレイトールを含む体積19μLの反応液を42℃で2分間インキュベートしてから、M−MuLV逆転写酵素(New England Biolabs,Inc.、マサチューセッツ州ベバリー)200単位を添加し、次に、25℃で10分間、42℃で50分間および70℃で15分間インキュベートした。次に、逆転写のcDNA生成物のPCR増幅により二本鎖DNAを得た。最終体積100μL中として、プライマー2および3の各々を0.2μM、400mM dNTPおよび逆転写反応液2μLを加えた、1×ThermoPol反応緩衝液中で、Deep Vent(登録商標)DNAポリメラーゼ(New England Biolabs,Inc.、マサチューセッツ州ベバリー)を用いてPCRを行った。94℃で30秒、60℃で30秒および72℃で30秒からなるPCRプロトコルを25サイクル行なった。〜70bpのPCR生成物を、前述のように8%非変性ポリアクリルアミドゲルから切り出すことにより精製し、エタノール沈殿により回収し、TE50μL中に再懸濁した。
PCRフラグメントを、標準的な分子クローニング技術により、BamHIおよびAcc65I制限部位によりpUC19プラスミド(New England Biolabs,Inc.、マサチューセッツ州ベバリー)内にクローニングした。簡単に説明すると、pUC19消化は、0.1mg/mL BSA、およびpUC19の1μgあたり8単位のBamHIおよび4単位のAcc65Iを加えた1×NE緩衝液3(0.1M NaCl、50mM Tris−HCl、pH7.9、10mM MgCl2および1mMジチオスレイトール)中で行った。消化は、37℃で3時間行った。消化したpUC19プラスミドを、1%低融点アガロースゲル上の電気泳動によりゲル精製し、製造者の指示に従ってβ−アガラース(New England Biolabs,Inc.、マサチューセッツ州ベバリー)を用いて切除ゲルスライスからDNAを回収した。PCRフラグメントを、DNAの1μg当たり20単位のBamHIおよび10単位のAcc65Iを用いる以外は同じ条件下に消化し、フェノール/クロロホルムで抽出して制限酵素を除去し、エタノール沈殿により回収した。pUC19ベクター内への消化PCRフラグメントのライゲーションを、ベクター100ngを含み、挿入部を用いるものと用いないものの両方を、400単位のT4 DNAリガーゼ(New England Biolabs,Inc.、マサチューセッツ州ベバリー)体積20μL中、10:1の挿入部対ベクターの比を用いて行った。16℃での一晩のインキュベーションに続いて、各ライゲーション生成物(すなわち、挿入部を用いるものと用いないものの両方を含む)10μLを65℃で15分間の加熱でで停止させ、SmaIで消化して、自己ライゲートベクターを線状化した。消化物(合計50μL)はライゲーション反応液10μLおよび20単位のSmaIを1×NE緩衝液4(20mM Tris−アセテート、pH7.9、50mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウム、1mM DTT)中に含み、20℃で3時間インキュベートした。65℃で15分間の加熱で停止後、各消化液1μLを、Bio−Rad Gene Pulser(登録商標)(Bio−Rad、カリフォルニア州ヘルキュール)装置を用いて大腸菌ER2738内に電気穿孔した。新しく電気穿孔した細胞を、振り混ぜつつSOC培地1.0ml中で37℃で1時間インキュベートした。細胞を、100μg/mLアンピシリンおよび、イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)および5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド(X−gal)の各々を40μg/mL含むLB寒天プレート上に置き、37℃で一晩インキュベートした。青色および白色コロニーの混合物を観察し、青色および白色コロニーカウントは、挿入部のないコントロールよりも、それぞれ5〜10倍および20倍を超えていた。
合計126のクローンからのDNAを、QiaQuick(登録商標)(Qiagen、カリフォルニア州スタジオシティー)スピンカラムを用いて培地1.5mLから、最終体積50μLとなるように単離した。制限分析および自動SangerDNA配列決定(ABI 377および3100装置)は、126の配列クローンのうちの9個は挿入部を含まず、残りの117個のクローンは、二つのプライマー配列(プライマー1およびプライマー2)に対応する挿入部を有しており、それらの間に囲まれた種々の量の配列はクローニングされたRNA配列に対応することを示した(図4−7)。クローン配列についての長さ分布を以下に示す(クローン数は括弧内に示す):13塩基(2)、14塩基(1)、15塩基(3)、16塩基(1)、17塩基(6)、18塩基(5)、19塩基(4)、20塩基(15)、21塩基(38)および、22塩基(38)、23塩基(1)および24塩基(2)。これらの配列を、プライマー配列から単離し、親Litmus−malEまたはGFP構造の転写部分に適合させた(図4−3および図4−4並びに図4−5および図4−6)。結果は、クローニングされたフラグメントが全二本鎖RNA出発材料に及び、大きなdsRNA配列の実質的部分を含み、RNaseIII消化がランダムであることを決定的に示している。矢印は、図4−3および図4−4並びに図4−5および図4−6に示すようにクローニングした配列に対応し、矢印の頭部の方向は、配列が、示された配列(左側から右側)に相当するか相補的鎖(右側から左側)に相当するかを示している。
(クローニングしたRNaseIII生成物のライブラリの発生)
(a)クローンのライブラリは、個々のフラグメントのPCR増幅後にLitmus28i、Litmus38i(New England Biolabs,Inc.、マサチューセッツ州ベバリー)、または他の対向T7プロモーターベクター中で複数のcDNAをクローニングする、または、市販のcDNAフラグメントを用いることにより、得ることができる。ライブラリクローンは、T7ポリメラーゼを用いるin vitroでの転写およびその後の前記実施例に記載のようなRNaseIIIを用いた切断により、各クローン配列に対応するdsRNAを得るために用いられる。
(昆虫または哺乳動物細胞中においてトランスフェクトされた内因性遺伝子の遺伝子サイレンシングにおいて、hsiRNA混合物が有効である)
二価遷移金属カチオン緩衝液の存在下においてRNaseIIIにより生成されるhsiRNAを用いる遺伝子発現の抑制における効果を試験するために、HiScribe(商標)キット(New England Biolabs,Inc.、マサチューセッツ州ベバリー)およびNew England Biolabs,Inc.(マサチューセッツ州ベバリー)により提供されるキットマニュアルおよび参考文献に指示されるような標準的組換えDNA技術を用いて、ホタルGL3ルシフェラーゼcDNA(F−Luc)(1.2kb)、緑色蛍光タンパク質(GFP)cDNA(0.8kb)、p53cDNA(1.1kb)およびPKR cDNA(0.4kb)のrun−off転写により長いdsRNA調製物を合成した。dsRNAをフェノールで抽出し、エタノールで沈殿させた。
(hsiRNAを作成し、哺乳動物細胞中で遺伝子サイレンシングさせるためのキット)
in vitroでのhsiRNA混合物の作成のため、および場合により、哺乳動物細胞内へのRNAフラグメントのトランスフェクションのためのキットが提供される。
キットは、酵素および、ベクター、プライマーおよび緩衝液の少なくとも一つを含む。キットの成分の例は、すべて、New England Biolabs,Inc.(マサチューセッツ州ベバリー)から個々に入手可能であり、以下に列挙する。
T7 RNAポリメラーゼ、150単位/μl 25μl
10×緩衝液/NTP(下記組成を参照) 60μl
30×高分子成分混合物(HMW)(下記組成を参照) 20μl
BT7−最小プライマー(19MER)
5’−ビオチン−dCTCGAGTAATACGACTCACTATAG−3’(配列番号11)(10μM) 25μl
10×リボヌクレアーゼIII(1.4μg/μl) 100μl
10×hsiRNA緩衝液(下記組成を参照)
10×MnCl2(200mM) 1000μl
10×EDTA(250mM) 1000μl
Litmus 38ilucコントロール鋳型 1μl
RNase−非含有グリコーゲン 10μg/μL 50μl
TE緩衝液中のプラスミドDNA500μg/ml(10mM Tris−HCl、pH8.0、1mM EDTA)
(a)10×緩衝液/NTP
400mM Tris−HCl、pH8.1
190mM MgCl2
50mM DTT
10mMスペルミジン
40mM各NTP
(b)30X高分子量(HMW)混合物
20mM Tris−HCl、pH8.1
1.5mg/ml BSA
100単位/ml 無機ピロホスファターゼ(酵母)
12000単位/ml 膵臓リボヌクレアーゼ阻害剤
50%グリセロール
(c)10×hsiRNA緩衝液
0.5M Tris−HCl、pH7.5
10mM DTT
(1)dsRNAを発生させるin vitroでの転写の前のDNA鋳型のクローニング
前述のように調製されたDNA鋳型を用いてin vitroでの転写が行われる。転写反応において用いられる鋳型の体積は、精製の方法に依存する。未精製PCR生成物として、反応液30μlあたり5μl未満の量が用いられる。鋳型DNAの添加量は反応液30μlあたり1μgを超えてはならない。
RNase−非含有水 50−xμl
10×緩衝液/NTP 6μl
DNA鋳型(〜0.5−1μg) xμl
30×HMW混合物 2μl
T7RNAポリメラーゼ(150U/μl) 2μl
60μl
以下の実施例のように、消化反応液中で、1×(10倍希釈)RNaseIIIを(0.14μg/μl)の濃度でおよび0.07μg/μLのdsRNAを使用する。
(表3)
dH2O 105−xμl
10×hsiRNA緩衝液 15μl
dsRNA x μl(10μg)
RNaseIII 15μl
10×MnCl2 15μl
150μl
37℃で20分間インキュベートする。
10×EDTA15μlを迅速に加えて反応を停止する。
1/10体積の3M NaOAc、pH5.5、2μLのグリコーゲン溶液、および3倍体積の冷95%エタノールを加える。−70℃で30分間または、−20℃で2時間乃至一晩置いた。微小遠心分離機にて14000rpmで15分間回転させた。小さなペレットの形成を避けるように上澄を注意深く除去し、2倍体積の80%エタノールを加えて、室温で10分間インキュベートし、5分間遠心分離し、試験管から液分を流し、取り除く。ペレットを風乾する。乾燥RNAを、10mM Tris−HCl、pH8.0、1mM EDTA、またはdH2O中に、溶解する。
UV分光光度計(260nmでのOD値1は、40μg/mL dsRNAに相当)または蛍光計(オレゴン州ユージーン在、Molecular ProbesのRIBOGREEN(登録商標)を使用)を用いて、または当該分野で用いられるsiRNA標準と比較することにより測定する。
エタノール沈殿後、hsiRNA混合物を、lipofectin2000、oligofectamine、TRANS−IT TKO(登録商標)(Mirus Corp.、ウィスコンシン州マジソン)およびTargefect(Targeting Systems、カリフォルニア州サンティー)のようなオリゴヌクレオチドトランスフェクションに適した試薬およびプロトコルを用いて哺乳動物細胞に直接トランスフェクトすることができる。さらに、リン酸カルシウムおよび電気穿孔が、短いRNAのトランスフェクションで効果的であると報告されている。
(標的mRNAの異なる配列セグメントに相当するhsiRNA混合物は、標的mRNAのサイレンシングにおいて効果的である)
(RNaseIIIで消化した大きなdsRNAを用いて効果的siRNA配列を発見する方法:DnMT1に対する単一の活性siRNAの決定)
プライマー1:(gtcagtctcattgggcctgccgtt)(配列番号13)
プライマー2:(gaaggcctcagggggcaggtacaca)(配列番号14)
プライマー3:(tcataccacagctggtagaagtaggt)(配列番号15) を標準的合成を用いて合成し、5’末端において、α32P−ATPおよびポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)(New England Biolabs,Inc.、マサチューセッツ州ベバリー)を用いて製造者により提供されたプロトコルにより高特異的活性で標識した。3つの別々の反応の2セットでプライマー伸長を行う。1つのセットは、hsiRNA混合物で処理した細胞からのRNAを用いることであり、第2のセットはGFPに向けられたsiRNAで処理したネガティブなコントロール細胞からのRNAを用いることである。各プライマー伸長反応は、A+−RNAの1μg、および製造者のガイドラインに従うプロメガプライマー伸長システム(Promega、ウィスコンシン州マジソン)、および非特許文献30に記載の標準的プロトコルを用いて行う。プライマー伸長生成物を、プライマー1、2および3およびDNA鋳型としてのフラグメント2のLitmus構造体を用いて調製されたSangerシーケンシングラダーに近接したポリアクリルアミドシーケンシングゲルにおいて分析して、単一ヌクレオチドの解像度での生成物を確認することができる。標的DNMT1 RNA上の切断部位は、プライマー伸長生成物バンドの可動性を、それぞれの配列ラダーにおいて共移動する可動性と比較する、例えば、プライマー1の伸長生成物をプライマー1を用いて発生させた配列ラダーと比較することにより確認する。前述のプロトコルを図11に要約する。その結果は、切断部位におけるmRNAの配列を提供する。siRNAの中心領域に対応する部位において切断を起こすようにsiRNAがmRNAに結合する(非特許文献25参照)ことを認識していれば、切断部位における配列からのmRNAの確認された切断の原因となる全長siRNAフラグメントの配列を決定することができる。切断の原因となるsiRNAフラグメントの配列がいったん確認されると、確認された配列を有するDNAを作成することができ、二本鎖RNAを発現することができるプロモーターを有するベクターにDNAを挿入する標準的技術を用いてクローンを調製することができる。siRNAをコードするクローニングされたDNAは、次に、遺伝子サイレンシングの研究のための、または治療剤として使用するための試薬として役立つことができる。
配列番号2:GFP転写体
配列番号3:プライマー
配列番号4:プライマー
配列番号5:プライマー
配列番号6:プライマー
配列番号7:GFPsiRNAセンス鎖
配列番号8:GFPsiRNAアンチセンス鎖
配列番号9:GL3ルシフェラーゼsiRNAセンス鎖
配列番号10:GL3ルシフェラーゼsiRNAアンチセンス鎖
配列番号11:プライマー
配列番号12:増幅プライマー
配列番号13:DNAアンチセンスプライマー1
配列番号14:DNAアンチセンスプライマー2
配列番号15:DNAアンチセンスプライマー3
Claims (47)
- (a)二価遷移金属カチオンとRNaseIIIを含む反応混合物において、大きな二本鎖RNAの調製物を消化すること、および
(b)hsiRNA混合物を生成すること
を含む、hsiRNA混合物を生成する方法。 - hsiRNA混合物が、大きな二本鎖RNAの調製物の完全消化の生成物である、請求項1に記載の方法。
- 反応混合物中のRNaseIIIと大きな二本鎖RNAとの重量比が約0.005:1〜25:1の範囲にある、請求項1に記載の方法。
- 反応混合物中のRNaseIIIと大きな二本鎖RNAとの重量比が約0.0125:1〜10:1の範囲にある、請求項1に記載の方法。
- 遷移金属カチオンがマンガンである、請求項1に記載の方法。
- 反応混合物が、マンガンイオンを約5〜10mMの範囲の濃度で含む、請求項5に記載の方法。
- 反応混合物が、マンガンイオンを約10〜20mMの範囲の濃度で含む、請求項6に記載の方法。
- 遷移金属がニッケル、コバルトおよびカドミウムから選択される、請求項1に記載の方法。
- 完全消化が6時間未満で達成される、請求項2に記載の方法。
- 完全消化が2時間未満で達成される、請求項2に記載の方法。
- (a)酵素と基質との比(重量/重量)が約0.25:1以上でRNaseIIIを含む反応混合物中で大きな二本鎖RNAの調製物を消化すること、および
(b)hsiRNA混合物を生成すること
を含む、hsiRNA混合物を生成する方法。 - 混合物中の各siRNAのヌクレオチド配列が標的遺伝子に相補的な配列を有する、請求項1または11に従って作られるhsiRNA混合物を宿主細胞に導入することを含む、標的遺伝子のサイレンシング発現法。
- 約5〜30のヌクレオチドのサイズの複数の重複フラグメントを含む二本鎖RNAフラグメントのセットであって、セット中のフラグメントは、精製された酵素でのin vitroの切断によりフラグメントがそこから得られる1以上の大きな二本鎖RNAの配列の実質的な部分を集合的に表しており、大きな二本鎖RNAの各々の一つの鎖が、標的メッセンジャーRNAの一部または全体に相補的な配列を有する、二本鎖RNAフラグメントのセット。
- 実質的な部分が大きな二本鎖RNAの配列の約50%を超える、請求項13に記載のフラグメントのセット。
- 実質的な部分が大きな二本鎖RNAの配列の約65%を超える、請求項13に記載のフラグメントのセット。
- RNAフラグメントの約30%を超えるものが、約18〜25塩基対のフラグメントサイズである、請求項13に記載のフラグメントのセット。
- セット中の少なくとも1つのフラグメントおよび最大100%のフラグメントが、細胞中の標的mRNAの切断を起こすことができる、請求項13に記載のフラグメントのセット。
- フラグメントの少なくとも約50%がmRNAの切断を起こすことができる、請求項17に記載のフラグメントのセット。
- フラグメントの少なくとも約75%がmRNAの切断を起こすことができる、請求項17に記載のフラグメントのセット。
- 真核細胞中に導入されたときにin vivoでRNAをサイレンシングさせることができる、請求項13に記載のフラグメントのセット。
- 各クローンがhsiRNA混合物からの1以上の二本鎖RNAフラグメントを発現しているDNAクローンのライブラリをそのhsiRNA混合物から作る方法であって、
(a)hsiRNA混合物を変性して、対でないRNA鎖の混合物を形成すること、
(b)対でないRNA鎖の3’末端に第1の一本鎖DNAプライマーをライゲート(連結)し、対でないRNA鎖の5’末端に第2の一本鎖DNAプライマーをライゲートすること、
(c)工程(b)のキメラDNA−RNA生成物を逆転写して、相補的DNAフラグメントを形成すること、および
(d)1以上のDNAフラグメントをベクター内に挿入してクローンのライブラリを形成すること、を含む方法。 - 工程(c)が、DNAフラグメントのポリメラーゼ依存増幅を行うことをさらに含む、請求項21に記載の方法。
- 工程(b)におけるRNA鎖の5’末端を脱リン酸化する、請求項21に記載の方法。
- 工程(b)におけるRNA鎖の3’末端が3’ヒドロキシル末端であり、第1のDNAプライマーが5’リン酸と3’リン酸の両方を有し、第1のプライマーが第2のプライマーの前に3’末端にライゲートされる、請求項23に記載の方法。
- 工程(b)の第1のプライマーにライゲートされたRNA鎖をリン酸化し、3’末端でリン酸化されていない第2のプライマーにライゲートする、請求項24に記載の方法。
- 各クローンがhsiRNA混合物からの1以上の二本鎖RNAフラグメントに対応しているクローンのライブラリを創る方法であって、
(a)hsiRNA混合物を変性して対でないRNA鎖の混合物を形成すること、
(b)混合物中の各鎖から5’リン酸を酵素的に除去すること、
(c)各鎖の3’ヒドロキシル末端に、5’リン酸と3’リン酸の両方を有するDNAプライマーをライゲートすること、
(d)得られる種の5’末端を酵素的にリン酸化すること、
(e)各鎖の5’リン酸化末端に、非リン酸化3’末端を有する第2のDNAプライマーをライゲートすること、
(f)工程(e)のキメラDNA−RNA生成物を逆転写して、相補的DNAフラグメントを形成すること、および
(g)1以上のDNAフラグメントをベクター内に挿入して配列のライブラリを形成すること、
を含む方法。 - 工程(f)が、DNAフラグメントのポリメラーゼ依存増幅を行うことをさらに含む、請求項26に記載の方法。
- ベクターが、pUC19またはLitmusベクターである、請求項26に記載の方法。
- RNAseIIIの調製物、および約5mM〜100mMの範囲のマンガンイオンを含むRNAse緩衝液、並びに、場合により大きな二本鎖RNAを合成するための試薬を含む、hsiRNA混合物を調製するためのキット。
- 大きな二本鎖RNA分子を得る方法であって、
(a)二本鎖RNAをコードしているDNAフラグメントまたはDNAフラグメントのライブラリを、対向しているT7プロモーターに隣接されるクローニング部位を有するベクター内に挿入すること、
(b)in vitroまたはin vivoで転写を行うこと、および
(c)大きな二本鎖RNA分子を得ること、
を含む方法。 - 真核細胞中の1以上の標的遺伝子の発現を低下させる方法であって、
(a)細胞内に請求項13に記載のhsiRNAフラグメントのセットを導入し、大きなdsRNAが、各々の標的遺伝子のメッセンジャーRNA転写体の全部または一部に相補的であること、および
(b)hsiRNAを欠いている真核細胞中の遺伝子の発現と比べて、真核細胞中の1以上の標的遺伝子の発現を低下させること、
を含む方法。 - 真核細胞中の1以上の標的遺伝子の発現を低下させる方法であって、
細胞内に請求項21または26に従って作られた1以上のDNAクローンを導入し、DNAクローンが、DNA配列を欠いている真核細胞中の遺伝子の発現と比べて標的真核細胞の発現を低下させるのに適したsiRNAフラグメントを発現することを含む方法。 - 1以上の標的遺伝子の発現を低下させることが表現型の変化を引き起こすように真核細胞が哺乳動物中に存在する、請求項31または32に記載の方法。
- 表現型の変化が、哺乳動物における病気の治療を提供する、請求項33に記載の方法。
- 表現型の変化が、哺乳動物における所望の特徴を高めることである、請求項34に記載の方法。
- 表現型の変化が、選択された表現型の診断となる、請求項33に記載の方法。
- 遺伝子の低下した発現が、遺伝子生成物が機能する生化学的経路を分析するための手段である、請求項31または32に記載の方法。
- 生化学的経路を、診断試薬と組み合わせてさらに分析することができる、請求項37に記載の方法。
- 診断試薬が1以上の抗体である、請求項38に記載の方法。
- 真核細胞が非ヒト動物中に存在する、請求項31または32に記載の方法。
- 真核細胞が、DNA配列を含む受精卵母細胞から創られたトランスジェニック動物の成分である、請求項31または32に記載の方法。
- 標的遺伝子の遺伝子サイレンシングを増加させることができるhsiRNA混合物を確認するための迅速発見法であって、
(a)標的遺伝子のセグメントに相補的な配列を各々の大きなdsRNAが有する複数の大きなdsRNAを合成すること、
(b)マンガンイオンの存在下に大きなdsRNAの各々をRNaseIIIで消化して対応するhsiRNA混合物を生成すること、
(c)各hsiRNA混合物を真核細胞内に導入して、遺伝子サイレンシングが起こるかどうか決定すること、および
(d)どのhsiRNA混合物が増加した遺伝子サイレンシングを起こしたか決定すること、
を含む方法。 - 工程(d)が、増加する遺伝子をサイレンシングするために第1のhsiRNA混合物を第2のhsiRNA混合物と組み合わせることをさらに含む、請求項42に記載の方法。
- hsiRNA混合物から個々のsiRNAフラグメントを選択し、個々のsiRNAフラグメントを真核細胞内に導入して所望の遺伝子サイレンシングを達成することをさらに含む、請求項42に記載の方法。
- mRNA中の切断部位からのsiRNAに対応する配列を確認する方法であり、
(a)酵素的にhsiRNA混合物を得ること、
(b)hsiRNAを細胞内に導入すること、
(c)切断したmRNAを細胞から抽出すること、
(d)siRNA切断mRNAの切断部位における末端ヌクレオチドの配列を決定すること、および
(e)切断部位配列からのsiRNA配列、およびインタクトなmRNAからの隣接ヌクレオチドを確認すること、
を含む方法。 - 配列を決定する工程が、標識された伸長DNAプライマーを用いることをさらに含む、請求項45に記載の方法。
- mRNAに特異的に結合してmRNAの切断を開始させる約15〜30ヌクレオチドの二本鎖RNAを含む、siRNAフラグメントのセット。
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