JP2010521419A - イムノフィリンおよびカルシウムチャネル活性を調整するためのイムノフィリンリガンドおよび方法 - Google Patents

イムノフィリンおよびカルシウムチャネル活性を調整するためのイムノフィリンリガンドおよび方法 Download PDF

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Abstract

カルシウムチャネル活性のモジュレーターとしてのイムノフィリンリガンドおよびその使用を開示する。カルシウムチャネル機能障害に関連する状態（例えば、神経変性障害および心血管障害）のスクリーニング方法、治療方法、および予防方法も開示する。１つの実施形態では、ラパマイシンのｍＴＯＲ結合領域を改変したイムノフィリンリガンドは、ＦＫＢＰ５２および電位開口型Ｌ型カルシウムチャネル、特に、Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットの活性を減少させることが示されている。かかる活性の減少は、神経突起伸長およびニューロンの生存の同時増加に関連することが示されている。

Description

電位開口型カルシウムチャネルを介した哺乳動物へのカルシウムの流入は、広範な種々の細胞応答および生理学的応答（興奮収縮連関、ホルモン分泌、および遺伝子発現が含まれる）を媒介する（非特許文献１；非特許文献２）。カルシウムチャネルは、膜電位に影響を及ぼし、ニューロンの多様な電気的性質に寄与する。カルシウム流入は、カルシウム依存性イオンチャネルの調節およびカルシウム依存性酵素（タンパク質キナーゼＣおよびカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩなど）活性の調整によって神経機能にさらに影響を及ぼす。シナプス前神経終末でのカルシウム濃度の増加は、典型的には、神経伝達物質放出を誘発し、カルシウムチャネル活性を増加させる。かかるカルシウム増加は、多数のヒト障害（神経学的障害および心障害（例えば、先天性片頭痛、小脳性運動失調症、アンギナ、癲癇、高血圧症、虚血、およびいくつかの不整脈）が含まれるが、これらに限定されない）に関与している。
Ｍｉｌｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３５：４６−５２ Ａｕｇｕｓｔｉｎｅら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（１９８７）１０：６３３−９３
生理学的機能および病理学的機能における電位開口型カルシウムチャネルの一般的な役割を考慮して、カルシウムチャネル活性の新規のモジュレーターの同定およびその作用機構の理解が依然として必要である。
イムノフィリンおよびカルシウムチャネル活性を調整するための方法および組成物を開示する。１つの実施形態では、ラパマイシンのｍＴＯＲ結合領域を改変したイムノフィリンリガンドは、ＦＫＢＰ５２および電位開口型Ｌ型カルシウムチャネル、特に、Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットの活性を減少させることが示されている。かかる活性の減少は、神経突起伸長およびニューロンの生存の同時増加に関連することが示されている。理論に拘束されないが、ＦＫＢＰ５２およびチャネル活性の減少の少なくともその一部が、イムノフィリンリガンド、イムノフィリン（例えば、ＦＫＢＰ５２）および／またはＬ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットの一方または両方を含む複合体の形成を介して起こると考えられる。したがって、本発明は、イムノフィリンリガンド（例えば、ｍＴＯＲ結合領域を改変したイムノフィリンリガンド）を使用したイムノフィリンおよび／またはＬ型カルシウムチャネルのβサブユニットの活性を調整（阻害、減少、および／または軽減）する方法を提供する。他の態様では、イムノフィリンリガンドを使用したカルシウムチャネル機能障害に関連する状態（例えば、神経変性障害および心血管障害）を治療または防止する方法も開示する。イムノフィリンおよび／またはカルシウムチャネルサブユニットの活性を調整する化合物を同定する方法および試薬が、本発明にさらに含まれる。
１つの態様では、本発明は、イムノフィリンリガンド（例えば、ラパマイシンアナログまたはメリダマイシンアナログ（例えば、公知または公知でないアナログ））、および（ｉ）イムノフィリンまたはその機能的バリアント、および／または（ｉｉ）カルシウムチャネルサブユニットまたはその機能的バリアントの一方または両方を含む精製複合体を提供する。したがって、本発明の例示的複合体は、イムノフィリンリガンドおよびイムノフィリンもしくはその機能的フラグメント、イムノフィリンリガンドおよびカルシウムチャネルサブユニットまたはその機能的バリアント、ならびにイムノフィリンリガンド、イムノフィリンまたはその機能的バリアント、およびカルシウムチャネルサブユニットまたはその機能的バリアントを含むことができる。本発明の複合体がさらなるポリペプチドまたはそのフラグメントを含むことができると理解される。
１つの実施形態では、ラパマイシンアナログを、ラパマイシンのｍＴＯＲ結合領域で改変し、例えば、ラパマイシン骨格の１位および４位にヘテロ原子を置換基有する（図１Ａを参照のこと）。他の実施形態では、ラパマイシンアナログは、ラパマイシン骨格の１、２、３および／または４位に環状構造を有する。他の実施形態では、ラパマイシンアナログは、本明細書中に記載の化学式（例えば、式Ｉ、Ｉａおよび／またはＩｂ）を有する。他の実施形態では、ラパマイシンアナログは、本明細書中で「ラパマイシンＩ」および「ラパマイシンＩＩ」と呼ばれる化合物の構造を有する（図１Ａ）（本明細書中でそれぞれ「化合物Ｉ」および「化合物ＩＩ」とも呼ばれる）。他の実施形態では、イムノフィリンリガンドは、他のイムノフィリン（例えば、ＦＫＢＰ１２）と比較して、ラパマイシンの少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、またはそれを超える選択性で、イムノフィリン（例えば、ＦＫＢＰ−５２）に結合する。
実施形態では、イムノフィリンは、ＦＫ５０６結合タンパク質（例えば、ＦＫＢＰ５２（例えば、哺乳動物ＦＫＢＰ５２））またはその機能的バリアントである。他の実施形態では、カルシウムチャネルサブユニットは、電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのサブユニット（例えば、β１サブユニット（例えば、哺乳動物β１サブユニット））、またはその機能的バリアントである。本明細書中に記載のポリペプチドの機能的バリアントには、非改変形態の１つ以上の活性を保持する（例えば、イムノフィリンリガンドに結合し、そして／または本明細書中に記載の複合体を形成する能力を保持する）フラグメント、変異形態、融合タンパク質、標識形態（例えば、放射性標識形態）が含まれる。用語「イムノフィリン」および「カルシウムチャネル」などには、「その機能的バリアント」が含まれるが、句「その機能的バリアント」は、読み易さのために、全体で繰り返しても繰り返さなくても良い。
別の態様では、本発明は、（ｉ）イムノフィリン（例えば、本明細書中に記載のイムノフィリン（例えば、ＦＫＢＰ５２））、（またはその機能的バリアント）、および／または（ｉｉ）カルシウムチャネルサブユニット（例えば、本明細書中に記載のカルシウムチャネルサブユニット（例えば、β１サブユニット））、（またはその機能的バリアント）と相互作用（例えば、結合）し、そして／またはその活性を調整（例えば、減少または増加）する試験化合物（例えば、本明細書中に記載のラパマイシンまたはメリダマイシンアナログ）を同定するための方法またはアッセイを提供する。方法またはアッセイは、イムノフィリン、および／またはカルシウムチャネルサブユニットを、相互作用し、そして／または活性を調整する条件下で、試験化合物と接触させる工程、試験化合物の存在下で、基準（例えば、基準サンプル（例えば、試験化合物に暴露していないコントロールサンプルまたはラパマイシンに暴露したコントロールサンプル））と比較してイムノフィリンおよび／またはカルシウムチャネルサブユニットの相互作用および／または活性の変化を検出する工程を含む。試験化合物の存在下で基準と比較したイムノフィリンおよび／またはカルシウムチャネルサブユニットの相互作用および／または活性のレベルの変化（例えば、増加または減少）は、試験化合物がイムノフィリンおよび／またはカルシウムチャネルサブユニットと相互作用し、そして／またはその活性に影響を及ぼす（例えば、増加または減少する）ことを示す。
実施形態では、試験化合物とイムノフィリンおよび／またはカルシウムチャネルサブユニットの一方または両方との間の相互作用を、複合体（例えば、１つ以上の以下の間：試験化合物とイムノフィリンとの間、試験化合物とカルシウムチャネルサブユニットとの間、または試験化合物と、イムノフィリンと、カルシウムチャネルサブユニットとの間の複合体）の形成によって検出する。試験化合物の存在下での基準と比較した複合体の形成および／または安定性の変化は、試験化合物が、イムノフィリンおよび／またはカルシウムチャネルサブユニットの一方または両方と相互作用することを示す。
さらに別の態様では、本発明は、神経栄養化合物および／または神経保護化合物を同定する方法またはアッセイを提供する。方法またはアッセイは、（ｉ）イムノフィリン（例えば、本明細書中に記載のイムノフィリン（例えば、ＦＫＢＰ５２））（またはその機能的バリアント）、および／または（ｉｉ）カルシウムチャネルサブユニット（例えば、本明細書中に記載のカルシウムチャネルサブユニット（例えば、β１サブユニット））（またはその機能的バリアント）を、相互作用し、そして／または活性を調整する条件下で、試験化合物と接触させる工程、試験化合物の存在下で、基準（例えば、基準サンプル（例えば、試験化合物に暴露していないコントロールサンプルまたはラパマイシンに暴露したコントロールサンプル））と比較してイムノフィリンおよび／またはカルシウムチャネルサブユニットの相互作用および／または活性の変化を検出する工程を含む。試験化合物の存在下で基準と比較したイムノフィリンおよび／またはカルシウムチャネルサブユニットの相互作用のレベルの増加および／または活性のレベルの減少は、潜在的な神経栄養化合物および／または神経保護化合物を示す。実施形態では、試験化合物とイムノフィリンおよび／またはカルシウムチャネルサブユニットとの間の相互作用の増加を、２つ以上の上記成分の間の複合体の形成および／または安定性の増加によって検出する。他の実施形態では、例えば、本明細書中により詳細に記載のように、活性の減少を、カルシウムチャネル活性の減少の検出によって決定する。イムノフィリン活性の減少を、例えば、糖質コルチコイド受容体活性の測定によって検出することができる。
上記スクリーニング法およびアッセイのさらなる実施形態は、１つ以上の以下の特徴を含み得る。
実施形態では、イムノフィリンおよび／またはカルシウムチャネルサブユニットがサンプル中に存在する。サンプルは、細胞溶解物または再構成された系（例えば、細胞膜または可溶性成分）であり得る。あるいは、サンプルは、培養細胞（例えば、精製培養細胞または組換え細胞）を含むことができるか、ｉｎ ｖｉｖｏで動物対象中に含むことができる。試験化合物または神経栄養化合物とイムノフィリンおよび／またはカルシウムチャネルサブユニットとの間の相互作用および／または活性の変化を、１つ以上の以下：複合体自体の結合または物理的形成の変化（例えば、生化学的検出、親和性ベースの検出（例えば、ウェスタンブロット、アフィニティカラム）、免疫沈降、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）ベースのアッセイ、分光光度的手段（例えば、円二色性、吸光度、および溶液特性の他の測定）による）；シグナル伝達の変化（例えば、増加または減少）（例えば、カルシウム依存性リン酸化および／または転写活性（例えば、本明細書中に記載の転写プロフィール））；カルシウムチャネル活性の変化（例えば、増加または減少）（例えば、電気生理学的活性、カルシウム動態）、および／またはニューロンの生存、分化および／または神経突起伸長の変化（例えば、増加または減少）の検出によって決定することができる。１つの実施形態では、試験化合物または神経栄養化合物を、同一または異なるアッセイで同定または再試験する。例えば、試験化合物または神経栄養化合物を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは無細胞系で同定し、動物モデルまたは細胞ベースのアッセイで再試験する。任意の順序または組み合わせでアッセイを使用することができる。例えば、高処理アッセイを、動物モデルまたは組織培養と組み合わせて使用することができる。
他の実施形態では、方法またはアッセイは、近接依存性シグナル生成（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｉｇｎａｌ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）（例えば、第１の融合タンパク質（例えば、イムノフィリン部分を含む融合タンパク質）および第２の融合タンパク質（例えば、βサブユニット部分を含む融合タンパク質）を含む２ハイブリッドアッセイ）に基づいた工程を準備する工程、２ハイブリッドアッセイが複合体の形成および／または安定性の変化を検出する（例えば、複合体の形成がレポーター遺伝子の転写活性化を開始させる）条件下で２ハイブリッドアッセイを試験化合物と接触させる工程を含む。
他の実施形態では、方法またはアッセイは、イムノフィリンおよび／またはカルシウムチャネルサブユニットを既知のイムノフィリンリガンド（例えば、本明細書中に記載のラパマイシンのｍＴＯＲ結合領域を改変したラパマイシンアナログ）と接触させる工程、試験化合物の非存在下または存在下で既知のイムノフィリンリガンドのイムノフィリンおよび／またはカルシウムチャネルサブユニットとの相互作用および／または活性を検出する工程をさらに含む。試験化合物の存在下または非存在下でのイムノフィリンおよび／またはカルシウムチャネルサブユニットの結合（例えば、複合体形成）および／または活性の変化は、試験化合物がイムノフィリンおよび／またはカルシウムチャネルサブユニットと相互作用および／または結合することを示す。
他の実施形態では、方法またはアッセイは、試験化合物の複合体への結合を既知のイムノフィリンリガンドの複合体への結合と比較する工程をさらに含む。方法またはアッセイは、任意に、試験化合物のイムノフィリンおよび／またはカルシウムチャネルサブユニットの複合体との相互作用（例えば、結合）を各成分と比較して検出する工程をさらに含むことができる。
いくつかの実施形態では、方法は、ニューロン活性（例えば１つ以上のニューロンの生存、分化および／または神経突起伸長）の変化（例えば、増加または減少）を評価する工程をさらに含む。１つ以上のニューロンの生存、分化および／または神経突起伸長の増加は、神経栄養化合物および／または神経保護化合物を示す。評価工程を、本明細書中に記載の培養細胞または動物モデルで行うことができる。
候補試験化合物または神経栄養化合物は、本明細書中に記載の複合体の形成を増加させ、そして／またはカルシウムチャネルまたはイムノフィリン活性を阻害する。１つの実施形態では、試験化合物は、複合体の各成分への結合と比較してより高い親和性で複合体に結合する。試験化合物または神経栄養化合物は、天然物または化学合成された化合物であり得る。例えば、試験化合物は、天然に存在するか改変された（例えば、組換え的に改変された）原核細胞（例えば、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）など）または真核細胞（例えば、真菌細胞または哺乳動物細胞）から得たポリケチドであり得る。実施形態では、試験化合物は、ラパマイシン、メリダマイシン、またはそのアナログ（例えば、本明細書中に記載のラパマイシン化合物、メリダマイシン化合物、またはそのアナログ）である。
本明細書中に開示され、そして／または本明細書中に記載の方法またはアッセイによって同定された化合物も本発明の範囲内に含まれる。本発明の化合物および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物（例えば、薬学的組成物）を開示する。１つの実施形態では、組成物は、１つ以上の薬剤（例えば、治療薬）と組み合わせた本発明の化合物を含む。１つの実施形態では、第２の薬剤は、カルシウムチャネルアンタゴニスト（例えば、Ｌ型カルシウムチャネルのアンタゴニスト）である。Ｌ型カルシウムチャネルのアンタゴニストの例には、ジヒドロピリジン、フェニルアルキルアミン、およびベンゾチアゼピン（抗統合失調症神経遮断薬（ａｎｔｉｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉｃ ｎｅｕｒｏｌｅｐｔｉｃ ｄｒｕｇ）のジフェニルブチルピペリジンクラス）が含まれる。一定の実施形態では、組成物中に存在するイムノフィリンリガンドおよび／またはカルシウムチャネルアンタゴニストの投与量は、個別に投与した組成物中に存在する薬物量よりも低い。
別の態様では、本発明は、本明細書中に開示の複合体の１つ以上のポリペプチド構成要素をコードする１つ以上の核酸を含む宿主細胞を提供する。１つの実施形態では、宿主細胞は、イムノフィリン（例えば、ＦＫＢＰ５２（例えば、哺乳動物ＦＫＢＰ５２））（またはその機能的バリアント）をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸および／または電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのサブユニット（例えば、β１サブユニット（例えば、哺乳動物β１サブユニット））（またはその機能的バリアント）をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸を含む。いくつかの実施形態では、組換えイムノフィリンおよびカルシウムチャネルサブユニットおよび／またはその調節配列を外因的に付加する。
さらに別の態様では、本発明は、本明細書中に開示の複合体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一定の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、本明細書中に開示の複合体の形成を増加させる。他の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、本明細書中に開示の複合体の形成を減少または阻害する。１つの実施形態では、抗体またはそのフラグメントは選択的に複合体に結合するが、複合体の各成分に有意に結合しない。複合体は、本明細書中に記載のイムノフィリンリガンドまたは試験化合物およびイムノフィリンおよび／またはカルシウムチャネルを含むことができる。
別の態様では、本発明は、抗体またはその抗原結合フラグメントの作製方法を提供する。本方法は、抗原（例えば、動物モデルまたはファージディスプレイ選択における免疫原）として本明細書中に記載の複合体を使用する工程、および複合体への結合に基づいて抗体またはその結合フラグメントを選択する工程を含む。本方法は、任意に、複合体への抗体またはそのフラグメントの結合を確認する工程、および複合体（すなわち、複合体の３つの成分を含む複合体）の各成分への抗体の結合を比較する工程を含むことができる。各成分またはその複合体を超えて複合体に選択的に結合する抗体またはそのフラグメントが好ましい。
別の態様では、本発明は、イムノフィリン（またはその機能的バリアント）、および／またはカルシウムチャネルサブユニット（またはその機能的バリアント）の活性を調整（例えば、減少）する方法を提供する。本方法は、相互作用（例えば、結合）する条件下で、（ｉ）本明細書中に記載のイムノフィリン（例えば、ＦＫＢＰ５２）および／または（ｉｉ）本明細書中に記載のカルシウムチャネルのサブユニット（例えば、β１サブユニット）の一方または両方をイムノフィリンリガンド（例えば、本明細書中に記載のラパマイシンまたはメリダマイシンアナログ）と接触させる工程を含む。実施形態では、調整（例えば、増加）された活性は、イムノフィリンリガンドならびにイムノフィリンおよび／またはカルシウムチャネルサブユニットの一方または両方を含む複合体の形成および／または安定性である。１つの実施形態では、接触工程を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、細胞溶解物中または再構成系）で行うことができる。あるいは、本方法を、培養細胞上（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ）で行うことができる。例えば、細胞（例えば、精製細胞または組換え細胞）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することができ、接触工程を、培養培地へのイムノフィリンリガンド（例えば、ラパマイシンまたはメリダマイシンアナログ）の添加によって行うことができる。典型的には、細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）である。いくつかの実施形態では、細胞は、神経細胞または心血管細胞である。
別の態様では、本発明は、細胞中のカルシウムチャネル活性（例えば、電位開口型カルシウムチャネル活性）および／またはイムノフィリン活性を調整（例えば、阻害）する方法を提供する。本方法は、リガンドとイムノフィリンおよび／またはサブユニットの一方または両方との間で相互作用する（例えば、これらを含む複合体を形成する）条件下で、（ｉ）イムノフィリン（例えば、ＦＫＢＰ５２（例えば、哺乳動物ＦＫＢＰ５２））（またはその機能的バリアント）；および／または（ｉｉ）電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのサブユニット（例えば、β１サブユニット（例えば、哺乳動物β１サブユニット））（またはその機能的バリアント）を発現する細胞をイムノフィリンリガンド（例えば、本明細書中に記載のラパマイシンまたはメリダマイシンアナログ）と接触させ、それにより、カルシウムチャネルおよび／またはイムノフィリン活性を阻害する工程を含む。典型的には、細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）である。いくつかの実施形態では、細胞は神経細胞または心血管細胞である。本明細書中に記載のように、本方法を、培養培地中の細胞中で行うことができる。
さらに別の態様では、本発明は、神経機能（例えば、神経突起の伸長および／または生存）を増大させる方法を提供する。本方法は、神経細胞を、神経機能を促進するのに十分な量のイムノフィリンリガンドと接触させる工程を含む。実施形態では、イムノフィリンリガンドは、１つ以上の以下：（ｉ）カルシウムシグナル伝達経路（例えば、カルシウム流入チャネル、Ｎ−メチルＤ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）型グルタミン酸受容体、プラスミノゲンアクチベーター（ＰＬＡＵ）、ＳＨＴ３Ｒチャネル）の少なくとも１つの成分の発現および／または活性の下方制御、（ｉｉ）イムノフィリン（例えば、ＦＫＢＰ５２）の活性および／または発現の減少、（ｉｉｉ）カルシウムチャネル（例えば、Ｌ型カルシウムチャネル）の活性および／または発現の減少または阻害、（ｉｖ）ステロイド受容体シグナル伝達（例えば、糖質コルチコイド受容体シグナル伝達）の活性化、（ｖ）イムノフィリンリガンド、イムノフィリン（例えば、ＦＫＢＰ５２）および／または電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのサブユニット（例えば、β１サブユニット）を含む複合体の形成の誘導、および／または（ｖｉ）カルシウム誘導性細胞死からのニューロンの保護、を誘発する濃度で存在する。
さらに別の態様では、本発明は、対象のカルシウムチャネル機能障害に関連する障害（例えば、Ｌ型カルシウムチャネル機能に関連する障害）を治療または防止する方法を特徴とする。実施形態では、障害は、リアノジン受容体チャネル病に関連しない。本方法は、障害を治療または防止するのに十分な量のイムノフィリンリガンドを対象に投与する工程を含む。実施形態では、イムノフィリンリガンドは、１つ以上の以下：（ｉ）カルシウムシグナル伝達経路（例えば、カルシウム流入チャネル、ＮＭＤＡ受容体、プラスミノゲンアクチベーター（ＰＬＡＵ）、ＳＨＴ３Ｒチャネル）の少なくとも１つの成分の発現または活性の下方制御、（ｉｉ）イムノフィリン（例えば、ＦＫＢＰ５２）活性および／または発現の減少；（ｉｉｉ）カルシウムチャネル（例えば、Ｌ型カルシウムチャネル）の活性および／または発現の減少または阻害、（ｉｖ）ステロイド受容体シグナル伝達（例えば、糖質コルチコイド受容体シグナル伝達）の活性化；（ｖ）イムノフィリンリガンド、イムノフィリン（例えば、ＦＫＢＰ５２）および／または電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのサブユニット（例えば、β１サブユニット）を含む複合体の形成の誘導、および／または（ｖｉ）カルシウム誘導性細胞死からのニューロンの保護、を誘発する濃度で存在する。
上記障害の活性の調整および治療または防止方法のさらなる実施形態は、１つ以上の以下の特徴を含むことができる。
１つの実施形態では、イムノフィリンリガンドは、ｍＴＯＲ結合領域を改変したラパマイシンアナログであり、例えば、ラパマイシン骨格の１位および４位にヘテロ原子置換基を有する（図１Ａを参照のこと）。他の実施形態では、ラパマイシンアナログは、ラパマイシン骨格の１、２、３および／または４位に環状構造を有する。他の実施形態では、ラパマイシンアナログは、本明細書中に記載の化学式（例えば、式Ｉ、Ｉａおよび／またはＩｂ）を有する。他の実施形態では、ラパマイシンアナログは、本明細書中で「ラパマイシンＩ」および「ラパマイシンＩＩ」と呼ばれる化合物の構造を有する（図１Ａ）。他の実施形態では、イムノフィリンリガンドは、別のイムノフィリン（例えば、ＦＫＢＰ−１２）と比較して、ラパマイシンの少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００倍、またはそれを超える選択性で、イムノフィリン（例えば、ＦＫＢＰ−５２）に結合する。
他の実施形態では、本方法を、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、治療または予防）プロトコールの一部として対象中に存在するか動物対象（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ動物モデル）中に存在する細胞（例えば、神経細胞）に対して行うことができる。ｉｎ ｖｉｖｏ法のために、イムノフィリンリガンド（例えば、ラパマイシンまたはメリダマイシンアナログ）を、単独または別の薬剤と組み合わせて、複合体の形成および／または安定化に十分な量で、障害（例えば、神経変性障害または心血管障害）を罹患した対象（例えば、哺乳動物）に投与することができる。
いくつかの実施形態では、治療量または投薬量を、例えば、１つ以上の以下：（ｉ）複合体形成の誘導、（ｉｉ）カルシウムシグナル伝達経路の少なくとも１つの成分の発現または活性の下方制御、（ｉｉｉ）カルシウムチャネル（例えば、Ｌ型カルシウムチャネル）の活性の減少または阻害、および／または（ｉｖ）ステロイド受容体シグナル伝達（例えば、糖質コルチコイド受容体シグナル伝達）の活性化の誘発に必要なイムノフィリンリガンドの量のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験によって対象への投与前に決定することができる。ｉｎ ｖｉｖｏ法は、任意に、カルシウムチャネル機能障害に関連する障害（例えば、Ｌ型カルシウムチャネル機能に関連する障害）に関連する１つ以上の症状を有するリスクがあるか、またはそれを有する対象を同定（例えば、評価、診断、スクリーニング、および／または選択）する工程を含むことができる。実施形態では、障害は、リアノジン受容体チャネル病に関連しない。
対象は、例えば、神経変性障害または心血管障害を罹患した哺乳動物（例えば、ヒト）であり得る。実施形態では、対象は、カルシウムチャネル機能障害（例えば、Ｌ型カルシウムチャネル機能に関連する障害）に関連する障害に関連する１つ以上の症状を有する哺乳動物である。実施形態では、障害は、リアノジン受容体チャネル病に関連しない。例えば、対象は、１つ以上の以下：卒中、パーキンソン病、癲癇、アンギナ、心不整脈、および虚血から選択された障害を罹患した哺乳動物（例えば、ヒト患者）である。他の実施形態では、対象は、１つ以上の以下、片頭痛、神経因性疼痛、急性疼痛、気分障害（ｍｏｏｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、統合失調症、鬱病、不安、小脳性運動失調症、遅発性ジスキネジー、高血圧症および／または尿失禁を罹患した哺乳動物である。
イムノフィリンリガンド（例えば、ラパマイシンまたはメリダマイシンアナログ）を、単独または１つ以上の薬剤（例えば、治療薬）と組み合わせて対象に投与することができる。１つの実施形態では、第２の薬剤は、カルシウムチャネルアンタゴニスト（例えば、Ｌ型カルシウムチャネルのアンタゴニスト）である。Ｌ型カルシウムチャネルのアンタゴニストの例には、ジヒドロピリジン、フェニルアルキルアミン、およびベンゾチアゼピン（抗統合失調症神経遮断薬のジフェニルブチルピペリジンクラス）が含まれる。一定の実施形態では、組み合わせて投与されるイムノフィリンリガンドおよび／またはカルシウムチャネルアンタゴニストの量は、個別に投与される薬物の量より少ない。薬剤を、同時または連続的に投与することができる。
さらに別の態様では、本発明は、神経細胞（例えば、ドーパミン作動性細胞、コリン作動性細胞、皮質細胞、および脊髄神経細胞）の１つ以上の神経突起の伸長、生存、および／または分化を刺激する方法を提供する。本方法は、細胞をイムノフィリン（例えば、ＦＫＢＰ５２）および／またはカルシウムチャネルβサブユニット（例えば、電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニット）のアンタゴニストと接触させる工程を含む。アンタゴニストはまた、イムノフィリン（例えば、ＦＫＢＰ５２）またはカルシウムチャネルβサブユニットの活性および／または発現のインヒビターであり得る。１つの実施形態では、インヒビターは、カルシウムチャネルの細胞内アンタゴニスト（例えば、カルシウムチャネルβサブユニットのアンタゴニスト）である。別の実施形態では、アンタゴニストは、本明細書中に記載のイムノフィリンリガンド（例えば、ラパマイシンまたはメリダマイシンアナログ）である。典型的には、イムノフィリンリガンドを、リガンド、イムノフィリン（またはその機能的バリアント）、および／またはカルシウムチャネルサブユニット（またはその機能的バリアント）を含む複合体の形成および／または安定化に十分な量で投与する。他の実施形態では、アンタゴニストは、イムノフィリン（例えば、ＦＫＢＰ５２）および／またはカルシウムチャネルβサブユニットの転写のインヒビター（例えば、ＲＮＡｉ）である。接触工程を、本明細書中に記載のように、ｉｎ ｖｉｔｒｏで（例えば、培養物中）またはｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、対象への投与）行うことができる。
本明細書中で使用する場合、冠詞「ａ」および「ａｎ」は、１つまたは１つを超える（例えば、少なくとも１つ）冠詞の文法的対象をいう。
用語「または」は、別途明確に示されない限り、用語「および／または」を意味するために本明細書中で使用され、「および／または」と交換可能に使用される。
用語「タンパク質」および「ポリペプチド」を、本明細書中で交換可能に使用する。
本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
図１Ａは、ラパマイシンアナログＩおよびＩＩ（図中（および全体）で、それぞれ交換可能に、「１」および「２」または「化合物１」および「化合物２」と呼ばれる）の化学合成および構造の図を示す。本明細書中で参照したナンバリングシステムを使用したラパマイシン構造も示す。図１Ｂは、ラパマイシンアナログＩ（図中で「化合物１」と呼ばれる）に応答する皮質ニューロン中でのニューロン生存の促進を示す棒グラフを示す。図１Ｃは、ラパマイシンアナログＩ（図中で「化合物１」と呼ばれる）に応答する皮質ニューロン中の神経突起伸長を示すグラフを示す。図１Ｄは、ラパマイシンアナログＩ（図中で「化合物１」と呼ばれる）に応答するＦ−１１細胞中の神経突起伸長を示すグラフを示す。 図２は、いくつかのラパマイシンアナログＩ、ＩＩ、ＦＫ５０６、およびラパマイシンの親和性マトリックスの調製を示す図を示す。 図３は、Ｆ１１細胞（マウス胚神経芽細胞腫とラット後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンとの間の融合）の溶解物由来の親和性沈殿物によって単離されたタンパク質の移動度のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル写真を示す。 図４は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル由来のトリプシン消化バンドのフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量（ＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ）分析を示す。「Ｒａｐ．Ａｎ．Ｉ」は、ラパマイシンアナログＩを示す。 図５Ａ〜５Ｄは、ラパマイシンアナログＩおよびＩＩのイムノフィリン結合の特徴を示す。図５Ａは、種々の親和性マトリックスに結合したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析を示す。マーカーレーン中に見出されるバンドは、（１）２２０ｋＤａ、（２）７８ｋＤａ、（３）４５．７ｋＤａであり、ラパマイシンアナログＩプルダウン画分中に見出されるバンドは、（４）ミオシン、（５）ＦＫＢＰ５２、（６）ＣＡＣＮＢ１、ＦＫＢＰ２５、およびＦＫＢＰ１２であり、ブランクビーズコントロール中に見出されるバンドは、（７）アクチンであり、ラパマイシンアナログＩＩプルダウン画分中に見出されるバンドは、（５）ＦＫＢＰ５２および（６）ＣＡＣＮＢ１である。「化合物１」はラパマイシンアナログＩを示し、「化合物ＩＩ」はラパマイシンアナログＩＩを示す。図５Ｂは、ラパマイシンアナログＩおよびＦＫ５０６と接触する親和性ビーズ上の対応する抗原の存在を検出するための抗ＦＫＢＰ５２および抗Ｃａ２＋チャネルβ１サブユニット抗体を使用したウェスタンブロット分析を示す。図５Ｃは、精製組換えイムノフィリンおよびシクロフィリンに結合する［１４Ｃ］−１画分を測定するためのサイズ排除クロマトグラフィの結果を示す棒グラフである。図５Ｄは、ＦＫＢＰ２５およびＰＰＩＤタンパク質の化合物２への結合を試験するためのアフィニティクロマトグラフィの結果を示すブロットである。レーンに以下のように印をつけた。「Ｃ」は、タンパク質標準を示す。「＋」は、化合物２含有ビーズと共にインキュベートしたタンパク質を示す。「−」は、ブランクビーズと共にインキュベートしたタンパク質を示す。 図６Ａ〜６Ｄは、化合物ＩおよびＩＩのＬ型カルシウムチャネルβサブユニットへの結合の特徴づけを示す。図６Ａは、対応する抗体を使用したＣＡＣＮＢ１の存在についての画分のウェスタン分析を示す。図６Ｂは、精製組換えＣＡＣＢＮ１およびＣＡＣＢＮ４に結合する［１４Ｃ］−１の画分を測定するためのサイズ排除クロマトグラフィ由来の結果を示す棒グラフである。図６Ｃは、化合物２（１μＭ）のＣＡＣＮＢ１（０〜８μＭ）への結合の際に誘導された蛍光消光を測定するための蛍光分析の結果を示す。図６Ｄは、ＣＡＣＮＢ１の化合物２への結合を試験するためのアフィニティクロマトグラフィの結果を示す。レーンに以下のように印をつけた。「Ｃ」は、タンパク質標準を示す。「＋」は、化合物２含有ビーズと共にインキュベートしたタンパク質を示す。「−」は、ブランクビーズと共にインキュベートしたタンパク質を示す。 図７は、抗ＦＫＢＰ５２抗体を使用して沈殿した種々の濃度のラパマイシンアナログＩ（０μＭ、５μＭ、または５０μＭ）に暴露したＦ１１細胞の溶解物の同時免疫沈降物の免疫ブロットを示す。免疫沈降画分を、抗Ｃａ２＋チャネルβ１サブユニット抗体を使用して免疫ブロットした。下のパネルは、タンパク質相互作用をまとめた図を示す。「ＲＡＩ」は、ラパマイシンアナログＩを示す。 図８は、神経フィラメントＥＬＩＳＡを使用したＦ１１細胞の神経突起伸長に及ぼす種々の濃度のラパマイシンアナログＩ（５０μＭ、５μＭ、または０μＭ）の影響を示す棒グラフを示す。 図９Ａ〜９Ｆは、カルシウム電流に及ぼす化合物１および２の生物学的影響を示す。図９Ａは、バス中で５μＭの化合物１、ＦＫ−５０６、またはビヒクルで２時間処置したＦ−１１細胞中のホールセルの記録由来の平均Ｃａ２＋電流密度の棒グラフである。各条件下で７細胞から記録を行った。図９Ｂは、０秒（下の軌跡）、８００秒（真中の軌跡）で内部適用した化合物１（１０μＭピペット）および外部から適用されたＬ型Ｃａ２＋チャネル遮断薬ＢＡＹ−Ｋ５５５２（上の軌跡）の存在下での代表的なＣａ２＋流を示す。図９Ｃは、図９Ｂ中に示す実験の経時変化のグラフを示す。ホールセルおよびその後の細胞への化合物１の拡散を、時間０から開始する。一旦電流が４００秒後に安定化すると、１０μＭ ＢａｙＫ−５５５２をバス中に適用する（ｎ＝３）。図９Ｄは、３００秒後に１００ｎＭ ωＣＴＸ ＭＶＩＩＡをバスを介して適用すること以外は、図９Ｃのような類似の条件を示す（ｎ＝２）。図９Ｅは、ホールセルへの侵入直後（コントロール）および内部的１０μＭ 化合物２および外部的ωＣＴＸ ＧＶＩＡを使用した記録の１０分後の海馬ニューロン由来のＣａ２＋流の軌跡を示す。図９Ｆは、海馬ニューロン由来の初期電流に対して基準化した平均応答（＋／−ＳＥＭ）を示す。化合物２（１０μＭ）を、時間０から開始して、記録ピペットを介して内部的に適用した（黒塗りの丸および黒塗りの逆三角形で示す）。外部溶液は、１μＭ ＴＴＸ＋１００ｎＭ ωＣＴＸ ＧＶＩＡ＋１０μＭ ＢＡＹ−Ｋ ５５５２（黒塗りの逆三角形、ｎ＝４）、または１μＭ ＴＴＸ＋１００ｎＭ ωＣＴＸ ＧＶＩＡ（黒塗りの丸、ｎ＝５）を含む。化合物を含まないコントロール（黒塗りの四角）は、外部的に１００ｎＭ ωＣＴＸ ＧＶＩＡを含んでいた（ｎ＝３）。 図１０Ａは、神経突起伸長に及ぼすＦＫＢＰ５２およびＣＡＣＮＢ１のｓｉＲＮＡ駆動性減少の影響を証明するグラフを示す。図１０Ｂは、ニューロンの生存に及ぼすＦＫＢＰ５２およびＣＡＣＮＢ１のｓｉＲＮＡ駆動性減少の影響を示すグラフを示す。図１０Ｃは、ｓｉＲＮＡ処置によって２４時間後に皮質ニューロン中のラミンＡ／Ｃ、ＣＡＣＮＢ１、またはＦＫＢＰ５２タンパク質発現が減少したことを確認するウェスタンブロットを示す。 図１１Ａ〜１１Ｂは、ヒトＣａ２＋チャネルβ１サブユニットイソ型１のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列（それぞれ、配列番号１〜２）を示す。 図１１Ａ〜１１Ｂは、ヒトＣａ２＋チャネルβ１サブユニットイソ型１のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列（それぞれ、配列番号１〜２）を示す。 図１１Ｃ〜１１Ｄは、ヒトＣａ２＋チャネルβ１サブユニットイソ型２のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列（配列番号３〜４）を示す。 図１１Ｃ〜１１Ｄは、ヒトＣａ２＋チャネルβ１サブユニットイソ型２のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列（配列番号３〜４）を示す。 図１１Ｅ〜１１Ｆは、ヒトＣａ２＋チャネルβ１サブユニットイソ型３のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列（配列番号５〜６）を示す。 図１１Ｅ〜１１Ｆは、ヒトＣａ２＋チャネルβ１サブユニットイソ型３のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列（配列番号５〜６）を示す。 図１１Ｇ〜１１Ｈは、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）Ｃａ２＋チャネルβ１サブユニットイソ型Ａのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列（配列番号７〜８）を示す。 図１１Ｇ〜１１Ｈは、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）Ｃａ２＋チャネルβ１サブユニットイソ型Ａのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列（配列番号７〜８）を示す。 図１１Ｉ〜１１Ｊは、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）Ｃａ２＋チャネルβ１サブユニットイソ型Ｂのアミノ酸配列（配列番号９〜１０）を示す。 図１１Ｉ〜１１Ｊは、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）Ｃａ２＋チャネルβ１サブユニットイソ型Ｂのアミノ酸配列（配列番号９〜１０）を示す。 図１２Ａ〜１２Ｂは、ヒトＦＫＢＰ５２のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列（配列番号１１〜１２）を示す。 図１２Ａ〜１２Ｂは、ヒトＦＫＢＰ５２のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列（配列番号１１〜１２）を示す。 図１２Ｃ〜１２Ｄは、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＦＫＢＰ５２のアミノ酸配列（配列番号１３〜１４）を示す。 図１２Ｃ〜１２Ｄは、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＦＫＢＰ５２のアミノ酸配列（配列番号１３〜１４）を示す。
詳細な説明
本発明は、少なくとも一部が、イムノフィリンリガンド（例えば、ｍＴＯＲ結合領域を改変したラパマイシンアナログ）が、イムノフィリンＦＫＢＰ５２および／または電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルβ１サブユニットと相互作用する（例えば、結合する）という発見に基づく。これらの化合物によるＦＫＢＰ５２および／またはＣＡＣＮＢ１の阻害は、神経突起伸長および／またはニューロンの生存を刺激する。したがって、これらの化合物の間の相互作用（および複合体形成）は、β１サブユニットの活性を阻害し、イムノフィリンリガンド（本明細書中に記載のラパマイシンアナログまたはメリダマイシンアナログなど）によって阻害されるいくつかの神経栄養活性および／または神経保護活性における電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルに関与する神経突起伸長を刺激すると考えられる。
出願人は、添付の実施例に、本明細書中に開示の少なくとも１つのイムノフィリンリガンド（ラパマイシンアナログＩＩ）は、ラパマイシンと比較して、少なくとも６００倍の（ＦＫＢＰ１２結合と比較して）ＦＫＢＰ５２の結合選択性の有意な増加を示すことをさらに示した。理論に拘束されないが、ＦＫＢＰ５２活性の阻害がおそらくステロイド（例えば、糖質コルチコイド受容体）の活性化によって神経突起伸長を媒介すると考えられる。さらに、皮質ニューロンの本明細書中に開示のイムノフィリンリガンドでの処置により、カルシウムシグナル伝達経路全体が下方制御され、Ｌ型カルシウムチャネルが部分的に阻害された。神経細胞の神経突起伸長に及ぼす有意な影響を、培養物中でのβ１サブユニットおよびＦＫＢＰ５２の発現の選択的減少によっても検出した。
本明細書中に開示のデータは、ｍＴＯＲ結合領域でのラパマイシンの改変により、ＦＫＢＰ５２に対する特異な選択性および強い神経栄養活性を有する有意に非免疫抑制性の化合物を得ることができることを証明している。ＦＫＢＰ５２は、ＦＫＢＰ５２ｓｉＲＮＡ処置皮質ニューロン中で認められる神経突起伸長によって証明されるように、おそらくステロイド受容体（糖質コルチコイド受容体が含まれる）の活性化によって、イムノフィリンリガンド媒介性神経突起伸長を媒介するようである。さらに、これらのラパマイシンアナログがＬ型Ｃａ２＋チャネルを部分的に阻害し、種々のＣａ２＋シグナル伝達タンパク質の転写を減少させる能力は、これらのアナログがＣａ２＋誘導性神経細胞死からニューロンを保護することができることを示し、この能力はニューロンの生存に及ぼすその影響と一致する。
カルシウムチャネルは、種々の組織（神経組織および心血管組織が含まれる）中に存在し、動物中の多数の生命過程（神経伝達物質放出、筋収縮、ペースメーカー活動、ならびにホルモンおよび他の物質の分泌が含まれる）で重要な役割を果たす。電位開口型カルシウムチャネルを介した神経細胞へのカルシウム流入は、広範な種々の細胞応答および生理学的応答（カルシウム依存性酵素（タンパク質キナーゼＣおよびカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩなど）の活性の調整；膜電位の調節ならびに興奮性および反復反射パターンなどの電気的性質への寄与；および神経伝達物質放出の増加が含まれるが、これらに限定されない）を媒介する。これらの過程は、神経障害および心血管障害などのヒト障害に関与する。したがって、本明細書中により詳細に記載するように、イムノフィリン−カルシウムチャネル複合体の形成による電位依存性カルシウムチャネル機能の阻害方法は、カルシウムチャネル障害の症状の治療、防止、および／または緩和に有用である。
本発明をより容易に理解することができるように、一定の用語を本明細書中および詳細な説明全体で詳細に説明する。
カルシウムチャネルは、細胞外液から細胞へのＣａ２＋イオンの流入を調節する膜貫通多サブユニットタンパク質である。最も一般的なカルシウムチャネル型は電位依存性である。動物中の「興奮」細胞（中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロン、末梢神経細胞、および筋肉細胞（骨格筋細胞、心筋細胞、ならびに静脈および動脈の平滑筋細胞が含まれる）など）は、電位依存性カルシウムチャネルを有する。電位開口型カルシウムチャネルは、細胞へのＣａ２＋イオンの流入を可能にし、典型的には、チャネルを保有する細胞の内部と細胞を浸漬する細胞外環境との間の一定レベルの電位差への脱分極が必要である。電位開口型カルシウムチャネルは、その電気生理学的性質および薬理学的性質によってＬ型、Ｎ型、Ｐ／Ｑ型、Ｒ型、およびＴ型に分類されている（Ｃａｔｔｅｒａｌｌ，２０００；Ｈｕｇｕｅｎａｒｄ １９９６；Ｄｏｌｐｈｉｎ，Ａ．Ｃ．（２００３）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５５：６０７−６２７に概説）。Ｌ型、Ｎ型、およびＰ／Ｑ型チャネルは、陽電位で活性化する（高電位開口型）。Ｔ型（または低電位開口型）チャネルは、陰電位で一過性に活性化する広範な分子クラスを示し、静止電位の変化に高度に感受性を示す。
高電位開口型カルシウムチャネルは、以下の４つの異なるポリペプチドから構成される：α１、α２δ、β、およびγ（Ｓｔｅａら、１９９４；Ｃａｔｔｅｒａｌｌ、２０００に概説）。βサブユニット（本明細書中で「ＣＡＣＢ１」とも呼ばれる）は、少なくとも４つの公知の個別の遺伝子によってコードされる可溶性細胞内タンパク質であり、それぞれ、複数のスプライスバリアントにプロセシングされる。実施形態では、βサブユニットは、１つ以上の以下の特徴を有する：（ｉ）天然に存在する哺乳動物（例えば、ヒトまたはげっ歯類）β１サブユニットのアミノ酸配列またはそのフラグメント（例えば、図１１Ａ〜１１Ｊに示すアミノ酸配列（配列番号１〜１０）またはそのフラグメント）；（ｉｉ）図１１Ａ〜１１Ｊに示すアミノ酸配列（配列番号１〜１０）またはそのフラグメントに実質的に相同なアミノ酸配列；（ｉｉｉ）天然に存在する哺乳動物（例えば、ヒトまたはげっ歯類）β１サブユニットヌクレオチド配列またはそのフラグメントによってコードされるアミノ酸配列（例えば、図１１Ａ〜１１Ｊに示すヌクレオチド配列（配列番号１〜１０）またはそのフラグメントによってコードされるアミノ酸配列）；（ｉｖ）図１１Ａ〜１１Ｊに示すヌクレオチド配列（配列番号１〜１０）またはそのフラグメントに実質的に相同なヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；（ｖ）天然に存在するβ１サブユニットヌクレオチド配列またはそのフラグメント（例えば、図１１Ａ〜１１Ｊに示すヌクレオチド配列（配列番号１〜１０）またはそのフラグメント）に対するヌクレオチド配列縮重によってコードされるアミノ酸配列；または（ｖｉ）ストリンジェントな条件下（例えば、高ストリンジェンシー条件下）で上記ヌクレオチド配列の１つとハイブリッド形成するヌクレオチド配列。いくつかの実施形態では、βサブユニットまたはその機能的バリアント（例えば、フラグメント）は、天然に存在する配列の１つ以上の活性（（ｉ）本明細書中に記載の複合体の形成；（ｉｉ）αサブユニットとの相互作用（例えば、結合）；（ｉｉｉ）電位開口型カルシウムチャネル（例えば、α１サブユニット）の細胞膜（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）への局在化または輸送の促進；（ｉｖ）チャネル開口の調整（例えば、活性化および不活化動態学の変化、Ｉ−Ｖ曲線中の左側へのシフト、および単一チャネルレベルでのチャネル開口確率の増加の誘導）；または（ｖ）１つ以上の本明細書中に記載の遺伝子の転写活性の調節（例えば、カルシウム流入チャネル、ＮＭＤＡ受容体、プラスミノゲンアクチベーター（ＰＬＡＵ）、ＳＨＴ３Ｒチャネル）が含まれるが、これらに限定されない）を示す。
他の実施形態では、βサブユニットは、以下の開示のβサブユニットと実質的に同一の配列を有する：Ｐｏｗｅｒｓら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（３２）：２２９６７−２２９７２；Ｃｏｌｌｉｎら（１９９３）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７２（６）：１３３７−１３４４；Ｈｏｇａｎ，Ｋ．ら（１９９９）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２７７（２），１１１−１１４；Ｆｏｅｌｌら（２００４）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １７（２），１８３−２００（ヒトβ１およびβ２サブユニット）；Ｔｏｂａら（２００５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２（１），７９−９２（マウスβ１サブユニットイソ型）；Ｓｅｒｉｋｏｖら（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２９３（５），１４０５−１４１１；Ｐｒａｇｎｅｌｌら（１９９１）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２９１（２），２５３−２５８；Ｃａｈｉｌｌら（２０００）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０（５），１６８５−１６９３（２０００）（ウシβ１、２、および３サブユニット）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９３）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３３（１），１１３−１２０；Ｔａｖｉａｕｘら（１９９７）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１００（２），１５１−１５４（β２およびβ４サブユニットのヒト遺伝子）；Ｃｏｌｅｃｒａｆｔら（２００２）Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄ．）５４１（Ｐｔ ２），４３５−４５２（ヒトβ２ａ，２ｃ，２ｄ、および２ｅサブユニット）；Ｏｐａｔｏｗｓｋｙら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（５２），５２３２３−５２３３２（ラットβ２サブユニット）；Ｙａｍａｄａら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（５０），４７１６３−４７１７０（２００１）（ラットβ２サブユニット）；Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇら（２００２）ＰＮＡＳ Ｕ．Ｓ．Ａ．９９（２６），１６８９９−１６９０３（ヒトβ３サブユニット、マウスβ４サブユニット）；Ｍｕｒａｋａｍｉら（１９９６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３６（１），１３８−１４３（１９９６）（マウスカルシウムチャネルβ３サブユニット）；Ｙａｍａｄａら（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２７（２），３１２−３１９（ヒトカルシウムチャネルα１サブユニット（ＣＡＣＮＬ１Ａ２）およびβサブユニット（ＣＡＣＮＬＢ３）遺伝子）；Ｃｈｅｎら（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４２９（６９９２），６７５−６８０（ヒトβ４サブユニット）；Ｈｅｌｔｏｎら（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２（５），１５７３−１５８２（２００２）（β４サブユニット）；Ｂａｄｏｕら（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０７（５７０６），１１７−１２１（２００５）（カルシウムチャネルβ４サブユニット）（その全ての内容が、本明細書中で参照により援用される）。他のβサブユニット配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号：ＮＰ＿＿６６６２３５、Ｑ９Ｙ６９８、Ｑ０２６４１、Ｑ９ＭＺＬ３、およびＰ５４２８８＿２に開示されている。
イムノフィリンは、イムノフィリンリガンドと複合体を形成し、シグナル伝達に関与する他の細胞標的のリガンドとしての機能を果たす可溶性細胞質タンパク質である。イムノフィリンクラスには、シクロフィリンおよびＦＫ５０６結合タンパク質（例えば、ＦＫＢＰ）（ＦＫＢＰ−１２およびＦＢＢＰ−５２など）が含まれる。シクロスポリンＡは、シクロフィリンに結合するマクロライドイムノフィリンリガンドである。他のマクロライドイムノフィリンリガンド（メリダマイシン、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０、およびラパマイシンなど）は、ＦＫＢＰに結合すると理解される。ＦＫ５０６、ＦＫ５２０、およびラパマイシンのＦＫＢＰへの結合は、典型的には、「ＦＫＢＰ結合ドメイン」と呼ばれるポリケチド分子の構造的に類似のセグメントを介して起こる。
２ダースを超えるＦＫＢＰに対応する遺伝子配列がヒトゲノム中で見出されている（Ｄｏｒｎａｎら，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３，１３９２−１４０９（２００３））。これらは、中枢神経系（ＣＮＳ）組織および末梢神経系（ＰＮＳ）組織で免疫組織の１０〜５０倍発現し（Ｌｙｏｎｓら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５，２９８５−２９９４（１９９５）、その発現は、神経学的疾患の発症後に増加する（Ｋｉｈｉｒａら，Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２２，２６９−２７４（２００２））。興味深いことに、ＦＫＢＰ１２、ＦＫＢＰ１２．６、およびＦＫＢＰ５２は、チャネル開閉ＦＫＢＰタンパク質として報告されており、これは、リアノジン受容体（ＲＹＲ）（Ｈｕａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ．１０３，３４５６−３４６１（２００６））、イノシトール１，４，５−三リン酸受容体（ＩＰ３Ｒ）（Ｃａｍｅｒｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ．９２，１７８４−１７８８（１９９５））、および一過性受容器電位チャネル（ＴＲＰＣ）（Ｓｉｎｋｉｎｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，３４５２１−３４５２９（２００４））を調整する。ＦＫＢＰ５２およびＦＫＢＰ５１は、エストロゲン、アンドロゲン、および糖質コルチコイドホルモンに対する下流応答を媒介する３つのステロイド受容体複合体型に会合する（Ｓｔｅｉｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ．９４，２０１９−２０２４（１９９７））。核ＦＫＢＰ２５は、ヒストンデアセチラーゼ、カゼインキナーゼＩＩ、ヌクレオリン、および転写因子ＹＹ１との会合によって遺伝子発現を調節する（Ｙａｏ ａｎｄ Ｙａｎｇ，Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ５，５９５−６１０（２００５））。ＦＫＢＰ３８は構成性に不活性であり、ミトコンドリアおよび小胞体に局在する。興味深いことに、高レベルのＣａ２＋およびカルモジュリン（ＣａＭ）は、ＦＫＢＰ３８がＢｃｌ−２に結合するのに必要である（Ｅｄｌｉｃｈら，ＥＭＢＯ Ｊ．２４，２６８８−２６９９（２００５））。イムノフィリンリガンドは、天然のＦＫＢＰ含有複合体の破壊（Ｇｏｌｄ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．３１，６４９−６６３（１９９９）；Ｅｄｌｉｃｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１，１４９６１−１４９７０（２００６））および新規の複合体（ＦＫＢＰ１２−ＦＫ５０６−カルシニューリンまたはＦＫＢＰ１２−ラパマイシン−ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）など）の形成によって種々の下流生物活性を引き起こす（Ｋｉｓｓｉｎｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ３７８，６４１−６４４（１９９５）；Ｃｈｏｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３，２３９−４２（１９９６））。
ＦＫＢＰ５２は、イムノフィリンのＦＫ５０６結合クラスのメンバーである。ＦＫ５０６の糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）関連ＦＫＢＰ５２への結合により、デキサメタゾンに応答したＧＲの核転位置が増加し、ＧＲ媒介性遺伝子発現が増強した（Ｓａｎｃｈｅｚ ａｎｄ Ｎｉｎｇ（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９：１８８−２００）。イムノフィリン（ＦＫＢＰ５２およびＣｙＰ４０など）および非イムノフィリンタンパク質（ＰＰ５、ｐ６０、およびＭａｓ７０ｐ）は、ｈｓｐ９０のＴＰＲ結合ドメインに結合する１つ以上のテトラトリコペプチド反復（ＴＰＲ）ドメインを有する（Ｒａｔａｊｃｚａｋら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１３１８７−１３１９２）。タンパク質中のＴＰＲドメイン数は、そのｈｓｐ９０結合親和性と相関するようである。ＴＰＲドメインに隣接する領域はまた、例えば、ＦＫＢＰ５２の残基２３２〜２７１への結合に関与する（Ｒａｔａｊｃｚａｋ ａｎｄ Ｃａｒｒｅｌｌｏ（１９９６）ｓｕｐｒａ）。
いくつかの実施形態では、イムノフィリンは、１つ以上の以下の特徴を有する：（ｉ）天然に存在する哺乳動物（例えば、ヒトまたはげっ歯類）ＦＫＢＰ５２のアミノ酸配列またはそのフラグメント（例えば、図１２Ａ〜１２Ｄ（配列番号１１〜１４）に示すアミノ酸配列またはそのフラグメント）；（ｉｉ）図１２Ａ〜１２Ｄに示すアミノ酸配列（配列番号１１〜１４）またはそのフラグメントと実質的に相同なアミノ酸配列；（ｉｉｉ）天然に存在する哺乳動物（例えば、ヒトまたはげっ歯類）ＦＫＢＰ５２ヌクレオチド配列またはそのフラグメントによってコードされるアミノ酸配列（例えば、図１２Ａ〜１２Ｄに示すヌクレオチド配列（配列番号１１〜１４）またはそのフラグメントによってコードされるアミノ酸配列）；（ｉｖ）図１２Ａ〜１２Ｄに示すヌクレオチド配列（配列番号１１〜１４）またはそのフラグメントと実質的に相同なヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；（ｖ）天然に存在するＦＫＢＰ５２ヌクレオチド配列またはそのフラグメント（例えば、図１２Ａ〜１２Ｄに示すヌクレオチド配列（配列番号１１〜１４））またはそのフラグメント）に縮重するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；または（ｖｉ）ストリンジェントな条件下（例えば、高ストリンジェンシー条件下）で上記ヌクレオチド配列の１つとハイブリッド形成するヌクレオチド配列。いくつかの実施形態では、ＦＫＢＰ５２またはその機能的バリアント（例えば、フラグメント）は、天然に存在する配列の１つ以上の活性（本明細書中に記載の複合体の形成；ＦＫ５０６への結合；デキサメタゾンに応答した糖質コルチコイド受容体の核転位置の増加；糖質コルチコイド受容体媒介性遺伝子発現の増強；および／または熱ショックタンパク質（例えば、ｈｓｐ９０）への結合が含まれるが、これらに限定されない）を示す。
ＦＫＢＰ５２の例示的アミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、Ｓａｎｃｈｅｚら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９（２１），５１４５−５１５２およびＰｅａｔｔｉｅら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９（２２），１０９７４−１０９７８（その両方が本明細書中で参照により援用される）に開示されている。
１つの実施形態では、本発明のβサブユニットまたはイムノフィリンポリペプチドには、任意の動物種（ヒト、げっ歯類が含まれる）由来の未変性ポリペプチドのフラグメントおよびそのバリアント（例えば、機能的バリアント）（ヒトおよび非ヒト）ポリペプチおよびそのフラグメン）（但し、これらが各未変性ポリペプチドと共通の生物活性を有する場合）が含まれるが、これらに限定されない。「フラグメント」は、１つの実施形態では、成熟未変性ポリペプチド配列内の領域を含む。全長未満のβサブユニットまたはイムノフィリンの任意の形態（例えば、ＦＫＢＰ５２）を、本発明の方法および組成物で使用することができる（但し、依然として機能的である（例えば、天然に存在する配列の少なくとも１つの活性を保持する（例えば、本明細書中に記載の複合体を形成する能力を保持する）場合））。全長未満のβサブユニットを、宿主中での全長βサブユニットタンパク質をコードするポリヌクレオチドの対応するフラグメントの発現によって産生することができる。これらの対応するポリヌクレオチドフラグメントはまた、本発明の一部である。上記改変ポリヌクレオチドを、標準的な分子生物技術（適切な所望の欠失変異体の構築、部位特異的変異誘発法、または適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応が含まれる）によって作製することができる。
ポリペプチドの「バリアント」またはそのフラグメント（例えば、β１サブユニットまたはＦＫＢＰ５２のバリアントなど）には、バリアントが未変性タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部または未変性タンパク質と実質的に同一の配列のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する限り、キメラタンパク質、標識タンパク質（例えば、放射性標識タンパク質）、融合タンパク質、変異タンパク質、類似の（例えば、実質的に類似の）配列を有するタンパク質（例えば、アミノ酸置換（例えば、保存アミノ酸置換）、欠失、挿入）を有するタンパク質）、タンパク質フラグメント、模倣物が含まれる。「機能的バリアント」には、未変性タンパク質の少なくとも１つの機能を保持する（例えば、インタクトなイムノフィリンリガンドが相互作用し、そして／または本明細書中に記載の複合体を形成する能力を保持する）バリアントが含まれる。
「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、ポリペプチドをコードする第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との融合物であり、第１および第２のアミノ酸配列は、単一ポリペプチド鎖の一部として天然に存在しない。
本明細書中で使用する場合、用語「実質的に類似の」（または「実質的に」もしくは「十分に」「相同」もしくは「同一」）は、本明細書中で、第１および第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列が類似の活性を有するように第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列に対して十分な数の同一または等価な（例えば、類似の側鎖（例えば、保存アミノ酸置換基）を有する）アミノ酸残基残基またはヌクレオチドを含む第１のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列をいうために使用される。本明細書中に開示の配列に類似または相同な（例えば、少なくとも約８５％同一）配列も、本願の一部である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超え得る。あるいは、選択的ハイブリッド形成条件（例えば、高ストリンジェンシーハイブリッド形成条件）下で、核酸セグメントが鎖の相補物とハイブリッド形成する場合に、実質的に同一である。核酸は、ホールセル、細胞溶解物、または部分精製もしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。
２配列間の「相同性」または「配列同一性」（本用語は、本明細書中で交換可能に使用される）の計算を、以下のように行う。配列を、最適に比較されるように整列させる（例えば、最適なアラインメントのためにギャップを第１および第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方に導入し、比較のために非相同配列を無視することができる）。典型的には、比較のために整列させた基準配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次いで、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置を第２の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドが占める場合、分子は、その位置で同一である（本明細書中で使用する場合、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と等価である）。２配列間の同一率は、２配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップ数および各ギャップの長さを考慮した、配列が共有する同一の位置の数の関数である。
２配列間の配列の比較および同一率の決定を、数学アルゴリズムを使用して行うことができる。１つの実施形態では、２アミノ酸配列間の同一率を、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２行列またはＰＡＭ２５０行列のいずれか、ギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６、または４、およびレングスウェイト１、２、３、４、５、または６を使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中に市販のＧＡＰプログラムを組み込んだＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）アルゴリズムを使用して決定する。さらに別の実施形態では、２ヌクレオチド配列間の同一率を、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列、ギャップウェイト４０、５０、６０、３０ ７０、８０、およびレングスウェイト１、２、３、４、５、または６を使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中の市販のＧＡＰプログラムを使用して決定する。相補率を決定するために典型的に使用されるパラメーターは、ギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５を使用したＢｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリング行列である。２アミノ酸またはヌクレオチド配列間の同一率を、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表、ギャップレングスペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用した、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込んだＥ．Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７）のｓアルゴリズムを使用して決定することもできる。
本明細書中で使用する場合、用語「ストリンジェント条件下でハイブリッド形成する」は、ハイブリッド形成および洗浄の条件を説明する。ストリンジェント条件は、当業者に公知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６で見出すことができる。水性法および非水性法は、この参考文献に記載されており、いずれかを使用することができる。ストリンジェントハイブリッド形成条件の例は、約４５℃の６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリッド形成、その後の５０℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄である。ストリンジェントハイブリッド形成条件の別の例は、４５℃の６×ＳＳＣ中でのハイブリッド形成、その後の５５℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄である。ストリンジェントハイブリッド形成条件のさらなる例は、約４５℃の６×ＳＳＣ中でのハイブリッド形成、その後の６０℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回以上回の洗浄である。典型的には、ストリンジェントハイブリッド形成条件は、約４５℃の６×ＳＳＣ中でのハイブリッド形成、その後の６５℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回または２０回の洗浄である。より典型的には、使用した高ストリンジェント条件は、０．５Ｍ リン酸ナトリウム、６５℃での７％ＳＤＳ、その後の６５℃の０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳでの１回以上の洗浄である。
本明細書中に開示のポリペプチドのバリアントがさらなる保存的または非必須アミノ酸置換を有することができるが、抗原結合または他の免疫グロブリン機能に実質的に影響を及ぼさないと理解される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換したものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン（ｐｒａｌｉｎｅ）、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、ｓチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。
「非必須」アミノ酸残基は、生物活性を無効にすることなく、より好ましくは実質的に変化させることなくハイブリッド抗体の野生型配列から変化させることができる残基であるのに対して、「必須」アミノ酸残基では、かかる変化が起こる。
イムノフィリンリガンド
イムノフィリンリガンドは、主に免疫系および神経系で、イムノフィリンに結合して他の細胞標的を活性化する。いくつかのイムノフィリンは、免疫抑制性（例えば、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、およびラパマイシン）であるのに対して、他のより低い免疫抑制性を示すイムノフィリンは神経栄養活性を示す。例えば、メリダマイシンは、実質的に非免疫抑制性を示し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで有意な神経保護活性を示す（２００５年１２月８日公開のＨｅ，Ｍ．らの米国特許出願公開第２００５／０２７２１３３号および２００５年９月８日公開のＧｒａｚｉａｎｉ，Ｅ．らの米国特許出願公開第２００５／０１９７３５６号）。好ましくは、本発明の方法によって同定されるか、本発明の方法で使用されるイムノフィリンリガンドは、実質的に非免疫抑制性を示すが、望ましい活性（例えば、神経栄養活性）を保持する。好ましいイムノフィリンリガンドは、本明細書中に記載の複合体の形成を増加させ、そして／またはＦＫＢＰおよび／またはカルシウムチャネル活性を減少させる。
いくつかの実施形態では、イムノフィリンリガンドを、ｍＴＯＲ結合ドメインで改変する。ラパマイシンのｍＴＯＲ結合ドメインは、図１Ａの大員環コアの約１〜７位および２７〜３６位に局在すると考えられる。例えば、イムノフィリンリガンドは、ラパマイシン骨格の１位および４位にヘテロ原子置換基を有することができる（図１Ａ）。他の実施形態では、ラパマイシンアナログは、１、２、３および／または４位に環状構造を有する（図１Ａ）。かかるラパマイシンアナログは、米国特許出願第１１／３００，８３９号由来の２００６年６月２２日公開の発明の名称が「Ｒａｐａｍｙｃｉｎ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ，ａｎｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」である同一出願人による同時係属中の公開出願である米国特許出願公開第２００６／０１３５５４９号（その内容全体が本明細書中で参照により援用される）に開示されている。
１つの実施形態では、ラパマイシンアナログは、式Ｉ：
（上記式中のＲ１およびＲ２は異なる独立した基であり、ＯＲ３およびＮ（Ｒ３’）（Ｒ３’’）から選択されるか、Ｒ１およびＲ２は異なり、単結合を介して連結し、ＯおよびＮＲ３から選択される。Ｒ３、Ｒ３’、およびＲ３’’は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールから独立して選択される。Ｒ４およびＲ４’は、（ａ）Ｈ、ＯＨ、Ｏ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｏ（置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｏ（アシル）、Ｏ（アリール）、Ｏ（置換アリール）、およびハロゲンから独立して選択されるか、（ｂ）共にＯと二重結合を形成する。Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、Ｈ、ＯＨ、およびＯＣＨ３から独立して選択される。Ｒ８およびＲ９は、（ｉ）単結合を介して連結し、且つＣＨ２であるか、（ｉｉ）二重結合を介して連結し、且つＣＨである。Ｒ１５は、Ｃ＝Ｏ、ＣＨＯＨ、およびＣＨ２から選択され、ｎは１または２である。）またはその薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、または代謝産物を有する。
さらなる実施形態では、Ｒ１およびＲ２は単結合を介して連結し、ＯおよびＮＲ３から選択される。なおさらなる実施形態では、Ｒ１はＯであり、Ｒ２はＮＲ３である。
１つの実施形態では、Ｒ３’またはＲ３’’は、アリール基、置換アリール基、または置換ベンゼン環である。別の実施形態では、Ｒ３’またはＲ３’’の置換ベンゼン基には、以下の構造：
（式中、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ハロゲン、アシル、ＯＨ、Ｏ（アルキル）、Ｏ（置換アルキル）、Ｏ（アリール）、Ｏ（置換アリール）、Ｏ（アシル）、ＮＨ２、ＮＨ（アルキル）、ＮＨ（置換アルキル）、ＮＨ（アリール）、ＮＨ（置換アリール）、およびＮＨ（アシル）から独立して選択される）の環が含まれる。
さらなる実施形態では、Ｒ３、Ｒ３’、またはＲ３”は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびハロゲンから選択された１つまたは２つの置換基によって任意に置換されたフェニルである。なおさらなる実施形態では、Ｒ３、Ｒ３’、またはＲ３”は、１つまたは２つのメチルまたはクロロ置換基（例えば、フェニルおよび３−メチル、４−クロロフェニル）と任意に置換されたフェニルである。
１つの実施形態では、Ｒ４またはＲ４’は、ＯＨまたはＯ（アシル）（例えば、アシルは任意に−Ｃ（Ｏ）−置換されたアルキル、特に、アルキルは直鎖または分岐鎖であり得、例えば、ピリジルなどの芳香族複素環などの複素環と任意に置換される）である。例は、以下である。
他の実施形態では、式Ｉのラパマイシンアナログには、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７がＯＣＨ３であるもの、ラパマイシン骨格の１７〜２２位の窒素含有環がピペリジン環であるもの、またはＲ１５がカルボニルであるものが含まれる。
１つの実施形態では、ラパマイシンアナログは、式Ｉａ：
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ８、およびＲ９は上記のように定義される）を有する。
別の実施形態では、ラパマイシンアナログは、以下の式Ｉｂ：
を有する。
式Ｉｂでは、Ｒは、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ハロゲン、アシル、ＯＨ、Ｏ（アルキル）、Ｏ（置換アルキル）、Ｏ（アリール）、Ｏ（置換アリール）、Ｏ（アシル）、ＮＨ２、ＮＨ（アルキル）、ＮＨ（置換アルキル）、ＮＨ（アリール）、ＮＨ（置換アリール）、およびＮＨ（アシル）から独立して選択され、ｍは１〜５である。
特定のラパマイシンアナログを本明細書中に例示し、９，２７−ジヒドロキシ−３−｛２−［４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル］−１−メチルエチル｝−１０，２１−ジメトキシ−６，８，１２，１４，２０，２６−ヘキサメチル−３７−フェニル−４，９，１０，１２，１３，１４，１５，１８，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，３２，３３，３４，３４ａ−ノナデカヒドロ−３Ｈ−２３，２７−エポキシ−１８，１５−（エポキシイミノ）ピリド［２，１−ｃ］［１，４］オキサザシクロヘントリアコンチン（ｏｘａｚａｃｙｃｌｏｈｅｎｔｒｉａｃｏｎｔｉｎｅ）−１，５，１１，２８，２９（６Ｈ，３１Ｈ）−ペントン；９，２７−ジヒドロキシ−３−｛２−［４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル］−１−メチルエチル｝−１０，２１−ジメトキシ−６，８，１２，１４，２０，２６−ヘキサメチル−３７−フェニル−４，９，１０，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，３２，３３，３４，３４ａ−ヘニコサヒドロ−３Ｈ−２３，２７−エポキシ−１８，１５−（エポキシイミノ）ピリド［２，１−ｃ］［１，４］オキサザシクロヘントリアコンチン−１，５，１１，２８，２９（６Ｈ，３１Ｈ）−ペントン；３７−（４−クロロ−３−メチルフェニル）−９，２７−ジヒドロキシ−３−｛−２−［４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル］−１−メチルエチル｝−１０，２１−ジメトキシ−６，８，１２，１４，２０，２６−ヘキサメチル−４，９，１０，１２，１３，１４，１５，１８，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，３２，３３，３４，３４ａ−ノナデカヒドロ−３Ｈ−２３，２７−エポキシ−１８，１５−（エポキシイミノ）ピリド［２，１−ｃ］［１，４］オキサザシクロヘントリアコンチン−１，５，１１，２８，２９（６Ｈ，３１Ｈ）−ペントン；３７−（２，６−ジクロロフェニル）−９，２７−ジヒドロキシ−３−｛２−［４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル］−１−メチルエチル｝−１０，２１−ジメトキシ−６，８，１２，１４，２０，２６−ヘキサメチル−４，９，１０，１２，１３，１４，１５，１８，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，３２，３３，３４，３４ａ−ノナデカヒドロ−３Ｈ−２３，２７−エポキシ−１８，１５−（エポキシイミノ）ピリド［２，１−ｃ］［１，４］オキサザシクロヘントリアコンチン−１，５，１１，２８，２９（６Ｈ，３１Ｈ）−ペントン；９，２７−ジヒドロキシ−３−｛−２−［４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル］−１−メチルエチル｝−１０，２１−ジメトキシ−６，８，１２，１４，２０，２６−ヘキサメチル−３７−フェニル−４，９，１０，１２，１３，１４，１５，１８，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，３２，３３，３４，３４ａ−ノナデカヒドロ−３Ｈ−２３，２７−エポキシ−１８，１５−（エポキシイミノ）ピリド［２，１−ｃ］［１，４］オキサザシクロヘントリアコンチン−１，５，１１，２８，２９（６Ｈ，３１Ｈ）−ペントンの−２，２−ジメチル−３−（ピリジン−２−イル）−プロピオン酸エステル；３７−（２，６−ジクロロフェニル）−９，２７−ジヒドロキシ−３−｛−２−［４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル］−１−メチルエチル｝−１０，２１−ジメトキシ−６，８，１２，１４，２０，２６−ヘキサメチル−４，９，１０，１２，１３，１４，１５，１８，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，３２，３３，３４，３４ａ−ノナデカヒドロ−３Ｈ−２３，２７−エポキシ−１８，１５−（エポキシイミノ）ピリド［２，１−ｃ］［１，４］オキサザシクロヘントリアコンチン−１，５，１１，２８，２９（６Ｈ，３１Ｈ）−ペントン；またはその薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、または代謝産物が含まれる。本発明は、これらの例示的化合物に制限されない。
別の実施形態では、特定の化合物には、以下：
が含まれる。
本出願を通して呼ばれるラパマイシンアナログＩおよびＩＩを、左上から示す第１および第２の化学構造によって示す。
ラパマイシンアナログには、Ｒ１およびＲ２は単結合を介して連結し、Ｒ１はＯであり、Ｒ２はＮＲ３であり、Ｒ３はフェニルであり、Ｒ４はＯＨであり、Ｒ５〜Ｒ７はＯＣＨ３であり、Ｒ８およびＲ９はＨＣ＝ＣＨである化合物、Ｒ１はＯＲ３であり、Ｒ２はＮ（Ｒ３’）（Ｒ３’’）であり、Ｒ３はＨであり、Ｒ３’はＨであり、Ｒ３’’はフェニルであり、Ｒ４はＯＨであり、Ｒ５〜Ｒ７はＯＣＨ３であり、Ｒ８およびＲ９はＨ２Ｃ−ＣＨ２である化合物、Ｒ１およびＲ２は単結合を介して連結し、Ｒ１はＯであり、Ｒ２はＮＲ３であり、Ｒ３はフェニルであり、Ｒ４はＯＨであり、Ｒ５〜Ｒ７はＯＣＨ３であり、Ｒ８およびＲ９はＨ２Ｃ−ＣＨ２である化合物、Ｒ１およびＲ２は単結合を介して連結し、Ｒ１はＯであり、Ｒ２はＮＲ３であり、Ｒ４はＯＨであり、Ｒ５〜Ｒ７はＯＣＨ３であり、Ｒ８およびＲ９はＨＣ＝ＣＨであり、Ｒ３は、以下：
である化合物、
Ｒ１およびＲ２は単結合を介して連結し、Ｒ１はＯであり、Ｒ２はＮＲ３であり、Ｒ４はＯＨであり、Ｒ５〜Ｒ７はＯＣＨ３であり、Ｒ８およびＲ９はＨＣ＝ＣＨであり、Ｒ３は、以下：
である化合物、
Ｒ１およびＲ２は単結合を介して連結し、Ｒ１はＯであり、Ｒ２はＮＲ３であり、Ｒ３はフェニルであり、Ｒ５〜Ｒ７はＯＣＨ３であり、Ｒ８およびＲ９はＨＣ＝ＣＨであり、Ｒ４は、以下：
である化合物、および
Ｒ１およびＲ２は単結合を介して連結し、Ｒ１はＯであり、Ｒ２はＮＲ３であり、Ｒ４はＯＨであり、Ｒ５〜Ｒ７はＯＣＨ３であり、Ｒ８およびＲ９はＨ２Ｃ−ＣＨ２であり、Ｒ３は、以下：
である化合物も含まれる。
化合物は１つ以上の非対称炭素原子を含むことができ、いくつかの化合物は１つ以上の不斉（キラル）中心を含むことができ、したがって、光学異性体およびジアステレオマーを生じ得る。立体化学を考慮せずに示すが、化合物が１つ以上のキラル中心を含むことができる場合、好ましくはキラル中心の少なくとも１つはＳ立体化学である。したがって、化合物には、かかる光学異性体およびジアステレオマー、ラセミ体および分割された鏡像異性体的に純粋な立体異性体、ＲおよびＳ立体異性体の他の混合物、ならびにその薬学的に許容可能な塩、水和物、代謝産物、およびプロドラッグが含まれる。
用語「アルキル」を、本明細書中で、１〜１０個の炭素原子、望ましくは約１〜８個の炭素原子を有する直鎖および分岐鎖の飽和脂肪族炭化水素基の両方をいうために使用する。用語「アルケニル」を、本明細書中で、１つ以上の炭素−炭素二重結合を有し、且つ約２〜１０個の炭素原子を含む直鎖および分岐鎖のアルキル基をいうために使用する。１つの実施形態では、用語アルケニルは、１個または２個の炭素−炭素二重結合を有し、且つ２〜約６個の炭素原子を有するアルキル基をいう。用語「アルキニル」基を、本明細書中で、１つ以上の炭素−炭素三重結合を有し、且つ２〜８個の炭素原子を有する直鎖および分岐鎖のアルキル基をいうために使用する。別の実施形態では、用語アルキニルは、１個または２個の炭素−炭素三重結合を有し、且つ２〜６個の炭素原子を有するアルキル基をいう。
用語「シクロアルキル」を、本明細書中で、環状構造であり、且つ約４〜１０個の炭素原子または約５〜８個の炭素原子を有する上記のアルキル基をいうために使用する。
用語「置換アルキル」、「置換アルケニル」、および「置換アルキニル」は、１つ以上の置換基（ハロゲン、ＣＮ、ＯＨ、ＮＯ２、アミノ、アリール、複素環、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルカルボニル、アルキルカルボキシ、およびアリールチオが含まれるが、これらに限定されず、これらの基を、例えば、１〜４個の置換基（ハロゲン、ＣＮ、ＯＨ、ＮＯ２、アミノ、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルオキシ、アルキルカルボニル、アルキルカルボキシ、アミノアルキル、およびアリールチオが含まれる）で任意に置換することができる）を有するそれぞれ、アルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基をいう。結合が安定な化学的部分を構成する場合、これらの置換基を、アルキル基、アルケニル基、またはアルキニル基の任意の炭素に結合することができる。
本明細書中で使用する場合、用語「アリール」は、例えば、互いに（例えば、２つまたは３つ）融合または連結した単一の環以上の芳香環を含むことができ、融合または連結した環の少なくとも１つの部分が共役芳香族系を形成する、６〜２０個の炭素原子の芳香族系をいう。アリール基には、フェニル、ナフチル、ビフェニル、アントリル、テトラヒドロナフチル、フェナントリル、インデン、ベンゾナフチル、フルオレニル、およびカルバゾリルが含まれ得るが、これらに限定されない。
用語「置換アリール」は、１つ以上の置換基（任意に置換することができるハロゲン、ＣＮ、ＯＨ、ＮＯ２、アミノ、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルオキシ、アルキルカルボニル、アルキルカルボキシ、アミノアルキル、およびアリールチオが含まれる）と置換されるアリール基をいう。１つの実施形態では、置換アリール基を、１〜４個の置換基（ハロゲン、ＣＮ、ＯＨ、ＮＯ２、アミノ、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルオキシ、アルキルカルボニル、アルキルカルボキシ、アミノアルキル、およびアリールチオが含まれる）と置換する。
本明細書中で使用される、用語「複素環」は、飽和、部分不飽和、または全不飽和の安定な４〜７員の単環式および多環式複素環（ピリジルなどの芳香族が含まれる）をいう。複素環は、炭素原子および１つ以上のヘテロ原子（窒素原子、酸素原子、および硫黄原子が含まれる）を有する。１つの実施形態では、複素環は、環の骨格中に１〜４個のヘテロ原子を有する。複素環が環の骨格中に窒素原子または硫黄原子を含む場合、窒素原子または硫黄原子を酸化することができる。用語「複素環」はまた、例えば、複素環がアリール環に融合した９〜２０環員の多環式の環をいう。得られた複素環構造が化学的に安定な場合、複素環を、ヘテロ原子または炭素原子を介してアリール環に結合することができる。種々の複素環基が当該分野で公知であり、酸素含有環、窒素含有環、硫黄含有環、混合ヘテロ原子含有環、融合ヘテロ原子含有環、およびその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。酸素含有環には、フリル環、テトラヒドロフラニル環、ピラニル環、ピロニル環、およびジオキシニル環が含まれるが、これらに限定されない。窒素含有環には、ピロリル環、ピラゾリル環、イミダゾリル環、トリアゾリル環、ピリジル環、ピペリジニル環、２−オキソピペリジニル環、ピリダジニル環、ピリミジニル環、ピラジニル環、ピペラジニル環、アゼピニル環、トリアジニル環、ピロリジニル環、およびアゼピニル環が含まれるが、これらに限定されない。硫黄含有環には、チエニル環およびジチオールイル環が含まれるが、これらに限定されない。混合ヘテロ原子含有環には、オキサチオールイル環、オキサゾリル環、チアゾリル環、オキサジアゾリル環、オキサトリアゾリル環、ジオキサゾリル環、オキサチアゾリル環、オキサチオールイル環、オキサジニル（ｏｘａｚｉｎｙｌ）環、オキサチアジニル（ｏｘａｔｈｉａｚｉｎｙｌ）環、モルホリニル環、チアモルホリニル環、チアモルホリニル スルホキシド環、オキセピニル（ｏｘｅｐｉｎｙｌ）環、チエピニル（ｔｈｉｅｐｉｎｙｌ）環、およびジアゼピニル環が含まれるが、これらに限定されない。融合ヘテロ原子含有環には、ベンゾフラニル環、チオナプセン（ｔｈｉｏｎａｐｔｈｅｎｅ）環、インドリル環、ベナザゾリル（ｂｅｎａｚａｚｏｌｙｌ）環、プリニジニル（ｐｕｒｉｎｄｉｎｙｌ）環、ピラノピロリル（ｐｙｒａｎｏｐｙｒｒｏｌｙｌ）環、イソインダゾリル環、インドキサジニル（ｉｎｄｏｘａｚｉｎｙｌ）環、ベンズオキサゾリル環、アントラニリル環、ベンゾピラニル環、キノリニル環、イソキノリニル環、ベンゾジアゾニル（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｏｎｙｌ）環、ナフチルリジニル（ｎａｐｈｔｈｙｌｒｉｄｉｎｙｌ）環、ベンゾチエニル環、ピリドピリジニル（ｐｙｒｉｄｏｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）環、ベンゾキサジニル（ｂｅｎｚｏｘａｚｉｎｙｌ）環、キサンテニル環、アクリジニル環、およびプリニル環が含まれるが、これらに限定されない。
用語「置換複素環」は、本明細書中で使用する場合、１つ以上の置換基（ハロゲン、ＣＮ、ＯＨ、ＮＯ２、アミノ、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルオキシ、アルキルカルボニル、アルキルカルボキシ、アミノアルキル、およびアリールチオが含まれ、これらの基を任意に置換することができる）を有する複素環基をいう。１つの実施形態では、置換複素環基を、１〜４個の置換基と置換する。
用語「アシル」は、炭素原子で置換される−Ｃ（Ｏ）−基をいう。アシル基は、置換または末端アシル基（ＨＣ（Ｏ）−基など）であり得る。置換基には、アルキル基の上記の任意の置換基、すなわち、１つ以上の置換基（ハロゲン、ＣＮ、ＯＨ、ＮＯ２、アミノ、アリール、複素環、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルカルボニル、アルキルカルボキシ、およびアリールチオが含まれるが、これらに限定されず、これらの基を任意に置換することができる）が含まれ得る。例には、−Ｃ（Ｏ）−アルコキシ（例えば、−ＯＭｅまたは−ＯＥｔ）または−Ｃ（Ｏ）−アルキル（アルキルは直鎖または分岐鎖であり得、例えば、複素環（ピリジルなど）と任意に置換される）が含まれる。
用語「アルコキシ」は、本明細書中で使用する場合、結合点が酸素原子を介し、アルキル基が任意に置換されるＯ（アルキル）基をいう。
用語「アリールオキシ」は、本明細書中で使用する場合、結合点が酸素原子を介し、アリール基が任意に置換されるＯ（アリール）基をいう。
用語「アルキルオキシ」は、本明細書中で使用される場合、結合点がアルキル基を介するアルキルＯＨ基をいう。
用語「アリールチオ」は、本明細書中で使用する場合、結合点が硫黄原子を介し、アリール基を任意に置換することができるＳ（アリール）基をいう。
用語「アルキルカルボニル」は、本明細書中で使用する場合、結合点がカルボニル部分の炭素原子を介し、アルキル基が任意に置換されるＣ（Ｏ）（アルキル）基をいう。
用語「アルキルカルボキシ」は、本明細書中で使用する場合、結合点がカルボキシ部分の炭素原子を介し、アルキル基が任意に置換されるＣ（Ｏ）Ｏ（アルキル）基をいう。
用語「アミノアルキル」は、本明細書中で使用する場合、結合点が窒素原子を介し、アルキル基が任意に置換される第二級および第三級アミンの両方をいう。アルキル基は、同一でも異なっていてもよい。
用語「ハロゲン」は、本明細書中で使用する場合、Ｃｌ基、Ｂｒ基、Ｆ基、またはＩ基をいう。
ラパマイシンアナログを、ラパマイシン出発物質から調製することができる。好ましくは、ラパマイシン出発物質には、ラパマイシン、ノルラパマイシン、デオキソラパマイシン、デスメチルラパマイシン、またはデスメトキシラパマイシン、またはその薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、もしくは代謝産物が含まれるが、これらに限定されない。しかし、当業者は、新規の本発明のラパマイシンアナログを調製するために使用することができる適切なラパマイシン出発物質を容易に選択することができるであろう。
用語「デスメチルラパマイシン」は、１つ以上のメチル基を欠くラパマイシン化合物クラスをいう。本発明にしたがって使用することができるデスメチルラパマイシンの例には、とりわけ２９−デスメチルラパマイシン（米国特許第６，３５８，９６９号）、７−Ｏ−デスメチル−ラパマイシン（米国特許第６，３９９，６２６号）、１７−デスメチルラパマイシン（米国特許第６，６７０，１６８号）、および３２−Ｏ−デスメチルラパマイシンなどが含まれる。
用語「デスメトキシラパマイシン」は、１つ以上のメトキシ基を欠くラパマイシン化合物クラスをいい、３２−デスメトキシラパマイシンが含まれるが、これらに限定されない。
ラパマイシンアナログを、ラパマイシン出発物質と求ジエン体との組み合わせによって調製することができる。用語「求ジエン体」は、１，３−ジエンと反応して［４＋２］付加環化生成物が得られる分子をいう。好ましくは、本発明で使用される求ジエン体は、任意に置換されたニトロソベンゼンである。種々のニトロソベンゼンを本発明で使用することができ、とりわけニトロソベンゼン、２，６−ジクロロニトロソベンゼン、および１−クロロ−２−メチル−４−ニトロソベンゼンなどが含まれる。当業者は、本発明のラパマイシンアナログの調製で有効であるニトロベンゼンの量を容易に選択することができるであろう。好ましくは、過剰なニトロソベンゼンを、より好ましくは、５：１のニトロソベンゼン：ラパマイシン出発物質比で使用する。しかし、当業者によって決定された場合、１：１、２：１、または３：１のニトロソベンゼン：ラパマイシン比でさえも使用することができる。
ニトロソベンゼンおよびラパマイシン出発物質を溶媒中で合わせる。溶媒は、好ましくは、接触時にニトロソベンゼンおよび／またはラパマイシンを溶解するか、反応が進行するにつれてニトロソベンゼンおよびラパマイシンを溶解する。本発明で使用することができる溶媒には、ジメチルホルムアミド、ジオキサン（ｐ−ジオキサンなど）、クロロホルム、アルコール（メタノールおよびエタノールなど）、酢酸エチル、水、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、およびトルエン、またはその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。しかし、当業者は、ラパマイシン出発物質およびニトロソベンゼンの溶解性ならびに溶媒のこれらとの反応性に基づいて適切な溶媒を容易に選択することができるであろう。溶媒の使用量は、反応の規模、特に、反応混合物中のラパマイシン出発物質およびニトロソベンゼンの存在量に依存する。当業者は、溶媒の必要量を容易に決定することができるであろう。
典型的には、ニトロソベンゼン、ラパマイシン出発物質、および溶媒を含む溶液を、高温、好ましくは、ラパマイシンおよびニトロソベンゼンの分解を促進しない温度で維持する。１つの実施形態では、溶液を、約３０〜約７０℃、好ましくは約５０℃に維持する。成分を、ラパマイシンとニトロソベンゼンとを反応させるのに十分な時間加熱する。公知の技術を使用する当業者は、容易に加熱中の反応の進行をモニタリングし、それにより、反応実施に必要な時間を決定することができるであろう。１つの好ましい実施形態では、ラパマイシンおよびニトロソベンゼンを、ｐ−ジオキサンと合わせ、約５０℃に維持する。
ラパマイシンアナログの単離および精製は、十分に当業者の範囲内であり、クロマトグラフィ（再結晶、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）（逆相ＨＰＬＣなど）、順相ＨＰＬＣ、およびサイズ排除クロマトグラフィが含まれるが、これらに限定されない）が含まれる。
一旦ラパマイシンアナログが得られると、還元されてより飽和したラパマイシンアナログを形成することができる。当業者は、本発明で用いる適切な還元剤を容易に選択することができるであろう。好ましくは、ラパマイシンアナログの還元を、水素化剤（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）を使用して行うことができる。当業者は、本発明で用いる適切な水素化剤を容易に選択することができるであろう。典型的には、とりわけ水素ガスの存在下での遷移金属触媒または支持体（好ましくは、炭素支持体など）上の遷移金属を使用して還元する。好ましい実施形態では、水素ガスの存在下でパラジウム金属炭素担持触媒を使用して還元する。
ラパマイシンアナログの還元を、典型的には、溶媒中で行う。種々の溶媒を還元で使用することができ、溶媒には、メタノールなどのアルコールが含まれるが、これらに限定されない。しかし、当業者は、本発明で用いる適切な溶媒を、水素化触媒および還元されるラパマイシンアナログに応じて、容易に選択することができるであろう。溶媒量は、反応規模、特に、還元されるラパマイシンアナログの量に依存する。
当業者は、本発明での水素化剤の使用量を容易に決定することができる。しかし、当業者は、還元してより飽和した本発明のラパマイシンアナログを形成するのに必要な水素化剤の量を決定および調整することができるであろう。さらに、種々の装置を使用して、本発明の水素化を行うことができ、装置にはとりわけＰａｒｒ装置などが含まれる。特定の水素化装置の選択は、十分に当業者の範囲内である。
本発明のラパマイシンアナログの好ましい調製方法を、以下のスキーム１にまとめる。
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１５、およびｎは上記で定義されている）
ラパマイシンアナログを、薬学的または生理学的に許容可能な酸または塩基由来の薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、または代謝産物の形態で使用することができる。これらの塩には、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの鉱酸または無機酸および酢酸、シュウ酸、コハク酸、およびマレイン酸などの有機酸との以下の塩が含まれるが、これらに限定されない。他の塩には、エステル形態、カルバミン酸塩形態、および他の従来の「プロドラッグ」の形態のアルカリ金属またはアルカリ土類金属（ナトリウム、カリウム、カルシウム、またはマグネシウムなど）との塩が含まれ、かかる形態で投与した場合にｉｎ ｖｉｖｏで活性部分に変換される。
ラパマイシンアナログのさらなる合成経路および特徴づけは、２００６年６月２２日公開の発明の名称が「Ｒａｐａｍｙｃｉｎ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ，ａｎｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」である同一出願人による同時係属中の公開出願である米国特許出願公開第２００６／０１３５５４９号（上記で援用される）の実施例１〜３に記載されている。
本発明の方法で使用することができるラパマイシンアナログの他の例は、米国特許出願第１１／３００，９４１号由来の２００６年６月２２日公開の発明の名称が「Ｒａｐａｍｙｃｉｎ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」である共同所有の公開出願である米国特許出願公開第２００６／０１３５５５０号（その内容全体が本明細書中で参照により援用される）に開示されている。
他の実施形態では、イムノフィリンリガンドはメリダマイシンアナログである。本発明の方法で使用することができるメリダマイシンアナログの例には、例えば、米国特許出願公開第２００５／０１９７３７９号、米国特許出願公開第２００５／０２７２１３３号、米国特許出願公開第２００５／０１９７３５６号、ＷＯ２００５／０８４６７３号、ＷＯ２００５／０８５２５７号，ならびに以下の共同所有の仮出願：２００５年３月２３日出願の発明の名称が「Ｍｅｒｉｄａｍｙｃｉｎ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」である米国特許出願第６０／６６４，４８３号（ＵＳＰＴＯ ＰＡＩＲによって公的に利用可能）および；２００６年３月７日出願の発明の名称が「Ｍｅｒｉｄａｍｙｃｉｎ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」である米国特許出願第６０／７７９，９４０号（その内容全体が本明細書中で参照により援用される）に開示のものが含まれる。開示のイムノフィリンリガンドのいくつかの神経栄養効果を、本明細書中に記載の複合体の形成によって媒介することができる。１つの実施形態では、メリダマイシンアナログは、米国特許出願公開第２００５／０１９７３７９号中の化合物Ｉの化学式を有する。
いくかの上記ラパマイシンおよびメリダマイシンアナログは、培養した皮質ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、および脊髄ニューロンで強力な神経栄養活性（例えば、神経保護活性、神経変性活性および／または神経突起伸長刺激活性）を有することが証明されている。
イムノフィリン複合体
１つの態様では、本発明は、イムノフィリン複合体の発見に関する。いくつかの実施形態では、複合体には、イムノフィリンリガンド（例えば、本明細書中に記載のラパマイシンまたはメリダマイシンアナログ）、イムノフィリン（例えば、ＦＫＢＰ５２）またはその機能的バリアント、およびカルシウムチャネルサブユニット（例えば、電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニット）またはその機能的バリアントが含まれる。
本明細書中で使用する場合、用語「結合」および「複合体形成」は、２つ以上の分子（とりわけ、例えば、ポリペプチド、マクロライドなど）の間の直接または間接的な会合をいう。直接的会合には、例えば、生理学的条件下での共有結合、静電結合、疎水性結合、イオン結合、および／または水素結合の相互作用が含まれる。間接的会合には、例えば、複合体の一部であるが、直接的相互作用を持たない２つ以上の分子が含まれる。１つの実施形態では、分子間の会合は、生理学的条件下で安定な複合体を維持するのに十分である。
本発明の複合体を、単離形態、組換え形態、または精製形態で得ることができる。「タンパク質」または「複合体」の修飾語としての用語「精製された」または「単離された」は、通常は細胞または細胞溶解物中のタンパク質に会合している他のタンパク質を実質的に含まないタンパク質の調製をいう。例えば、句「実質的に含まない」は、４０％、３０％、２０％（乾燥重量）未満の夾雑タンパク質を含む調製物を含み、典型的には、５％未満の夾雑タンパク質を含む。「精製された」また「単離された」は、再構成されたタンパク質混合物を生成するために使用した成分タンパク質調製物をいう場合、示した分子が他の生体高分子（特に、他のタンパク質（精製調製物としてか本再構成混合物におけるその機能において成分タンパク質の特徴を実質的にマスキングするか、減少させるか、混乱させるか、変化させることができる他のタンパク質）など）の実質的な非存在下で存在することを意味する。用語「精製された」または「単離された」は、本明細書中で使用する場合、好ましくは、少なくとも８０乾燥重量％、典型的には８５重量％の範囲、より典型的には９５〜９９重量％以上の存在する同型の生体高分子（しかし、水、緩衝液、および他の小分子、特に分子量５０００未満の分子は存在することができる）を意味する。１つの実施形態では、複合体またはタンパク質は、精製物質（例えば、マトリックスまたは他の物質）を実質的に含まない。他の実施形態では、複合体またはタンパク質を、精製物質と会合する。
用語「組換え」「タンパク質」、または「複合体」は、組換えＤＮＡ技術によって産生される複合体を形成するタンパク質をいう。一般に、発現されるタンパク質をコードするＤＮＡを、適切な発現ベクターに挿入し、これを使用して宿主細胞（本明細書中で「組換え細胞」ともいう）を形質転換し、異種タンパク質を産生する。さらに、組換えタンパク質をコードする組換え遺伝子に関する句「〜に由来する」は、未変性タンパク質のアミノ酸配列または天然に存在するタンパク質の変異（置換、挿入、および欠失が含まれる）によって生成された類似のアミノ酸配列を有するタンパク質が「組換えタンパク質」の意味の範囲内に含まれることを意味する。
１つの実施形態では、本発明は、例えば、複合体成分（例えば、天然に存在する細胞または組換え細胞）を含む細胞（例えば、イムノフィリン処理細胞）からの抽出によって調製された複合体を提供する。細胞からの抽出を、当該分野で公知の任意の方法によって行うことができる。例えば、複合体を、一連の伝統的なタンパク質精製工程（遠心分離、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィおよび／またはアフィニティ精製など）によって細胞から抽出することができる。一般に、複合体を分解しない精製工程および条件を選択することが好ましいであろう。添付の実施例に記載するように、溶解緩衝液（例えば、６ｍｌ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ４０（ＮＰ４０）、０．１％メルカプトエタノール、および２％プロテアーゼインヒビターカクテル）を使用することができる。例えば、Ｆｒｅｔｚら（１９９１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：１４０９）に記載のように、樹脂にイムノフィリンリガンド（例えば、ラパマイシンアナログ）を結合したアフィニティマトリックスを調製することができる。１つの実施形態では、アフィニティマトリックスを、アミノ−フェニル−酪酸を介したＡｆｆｉ−ｇｅｌ１０ 樹脂の使用によって調製することができる（図１）。簡潔にのべれば、アミノ−フェニル−酪酸のアミノ基を、ジアリルジカーボナートなどの保護基での処理によって保護することができる。得られた複合体の酸基（ａｃｉｄ ｇｒｏｕｐ）を、ＣＨ２Ｃｌ２中のＰｈＯＰ（Ｏ）Ｃｌ２ ＤＭＦ複合体で活性化することができる。反応停止後、エステル生成物を、例えば、ＨＰＬＣによって精製し、例えば、ＭＳおよびＮＭＲによって特徴づけることができる。アリルオキシカルボニル基の除去後、生成物のアミノ基を、Ａｆｆｉｇｅｌ−１０マトリックスに連結することができる。得られたＡｆｆｉｇｅｌ−イムノフィリンリガンドアフィニティマトリックスを、洗浄し、保存することができる。抽出後、溶解細胞のアリコートを、アフィニティビーズ（Ａｆｆｉｇｅｌ１０−イムノフィリンリガンドなど）と混合することができる。ビーズを、例えば、４−２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析することができる。タンパク質バンドを消化し、例えば、ＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ分析によってさらに分析することができる。
他の実施形態では、複合体を、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細胞中に発現した組換えポリペプチドの精製およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの複合体の再構成によって調製することができる。一定の実施形態では、複合体の１つ以上の成分ポリペプチドを、細胞の内因性遺伝子から発現する。一定の実施形態では、複合体は、１つ以上の成分ポリペプチドを組換え核酸から発現する組換え複合体である。一定の実施形態では、本発明はまた、複合体の少なくとも１つのポリペプチドを標識した標識タンパク質複合体を含む。例えば、標識は、例えば、１つ以上の放射性同位体、蛍光化合物、酵素、および酵素補因子から選択することができる検出可能な標識である。別の実施形態では、標識は、ポリペプチドの精製、単離、または検出を容易にする。標識は、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、および免疫グロブリン重鎖定常領域であり得る。１つの実施形態では、標識タンパク質はＦＫＢＰ５２である。別の実施形態では、標識タンパク質はカルシウムチャネルサブユニットである。標識複合体またはその成分を、適切な親和性精製（例えば、上記のように、ヘキサヒスチジンタグの場合のニッケルまたは銅樹脂との複合体の接触、ＧＳＴタグの場合のグルタチオン樹脂との複合体の接触）によって精製することができる。
一定の実施形態では、本発明の複合体は、水溶性形態（「可溶性複合体」）である。例えば、可溶性複合体は、イムノフィリンおよび／またはカルシウムチャネルサブユニットの可溶性細胞質部分を含むことができる。他の実施形態では、複合体は、水に対する溶解性が低いか、膜結合形態であり得る。例えば、膜貫通ドメインを有するタンパク質を含む複合体は、一般に、水不溶性であろう。不溶性複合体を、例えば、脂質、界面活性剤、および／または他の成分を含む脂質ミセル、界面活性剤ミセル、または混合ミセルとして調製することができる。不溶性複合体を、細胞由来の膜画分として調製することもできる。膜画分は、膜部分が、例えば、遠心分離または濾過によって細胞の可溶性部分から簡潔に分離された粗膜画分であり得る。膜画分を、例えば、複合体の１つ以上のタンパク質中に存在するアフィニティタグに指向するアフィニティ精製によってさらに精製することができる。複合体が脂質二重層中に存在する場合、脂質二重層は、例えば、小胞（任意に、逆である（すなわち、小胞の内側に向かって面する通常は細胞外面を有する））または平面上二重層（ｐｌａｎａｒ ｂｉｌａｙｅｒ）であり得る。
結晶化形態の複合体も本発明の範囲内である。
１つの実施形態では、複合体は架橋している。架橋複合体を、多官能性剤または二官能性剤である架橋試薬を使用して調製することができる。かかる薬剤は、化合物のジアミン基（例えば、ヘキサメチレンジアミン、ジアミノオクタン、エチレンジアミン、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド塩酸塩（ＭＰＢＨ）、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ−ヒドラジド塩酸塩（Ｍ２ Ｃ２ Ｈ）、および３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル ヒドラジド（ＰＤＰＨ）、および他のアミンアルケンなど）を含む。かかる架橋剤の例は、グルタルアルデヒド、スクシンアルデヒド、オクタンジアルデヒド、およびグリオキサールである。さらなる多官能性架橋剤には、ハロ−トリアジン（例えば、塩化シアヌル）；ハロ−ピリミジン（例えば、２，４，６−トリクロロ／ブロモ−ピリミジン）；脂肪族または芳香族モノまたはジカルボン酸の無水物またはハライド（例えば、マレイン酸無水物、（メタ）アクリロイルクロリド、クロロ塩化アセチル）；Ｎ−メチロール化合物（例えば、Ｎ−メチロール−クロロアセトアミド）；ジ−イソシアナートまたはジ−イソチオシアナート（例えば、フェニレン−１，４−ジ−イソシアナートおよびアジリジン）が含まれる。他の架橋剤には、エポキシド（例えば、ジ−エポキシド、トリ−エポキシド、およびテトラ−エポキシドなど）が含まれる。他の利用可能な架橋試薬の代表的リストについては、例えば、ｔｈｅ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．（１９９７）を参照のこと。Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９９１）も参照のこと。
あるいは、可逆的架橋剤を使用することができる。可逆的架橋剤の例は、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｅｄｓ．）（１９８１）に記載されている。可逆的保護基のために使用される任意の種々のストラテジーを、溶解を可逆的（ｆｅｖｅｒｓｉｂｌｅ）に調製することができる炭水化物架橋した糖タンパク質結晶の生成における少なくとも１つの架橋に適切な架橋剤に組み込むことができる。種々のアプローチが、この主題にかんするＷａｌｄｍａｎｎの概説、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｍｉｅ Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３５，ｐ．２０５６（１９９６）に列挙されている。他の可逆的架橋剤型は、ジスルフィド結合含有架橋剤である。
本発明は、さらに、本明細書中に記載の複合体の形成および／または安定性を調整（例えば、増加）する方法を提供する。本方法は、複合体を形成する条件下で、イムノフィリン（例えば、ＦＫＢＰ５２（例えば、ヒトＦＫＢＰ５２）またはその機能的バリアントおよび電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのサブユニット（例えば、β１サブユニット）（例えば、ヒトβ１サブユニット）またはその機能的バリアントをイムノフィリンリガンド（例えば、本明細書中に記載のラパマイシンアナログまたはメリダマイシンアナログ）と接触する工程を含む。接触工程を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、細胞溶解物中または再構成系中）で行うことができる。あるいは、本方法を、対象（例えば、ヒト対象または動物対象）（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ動物モデル）中に存在する細胞（例えば、神経細胞または心血管細胞）に対して行うことができる。
本方法を、培養細胞に対して使用することもできる。例えば、細胞（例えば、精製細胞または組換え細胞）をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することができ、接触工程を、培養培地へのイムノフィリンリガンド（例えば、ラパマイシンアナログまたはメリダマイシンアナログ）の添加によって行うことができる。典型的には、細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）である。いくつかの実施形態では、細胞は神経細胞または心血管細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、組換え細胞（例えば、宿主細胞）である。かかる方法は、（ｉ）イムノフィリンおよび／またはカルシウムチャネルサブユニットをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを細胞に導入する工程；（ｉｉ）細胞をイムノフィリンリガンド（例えば、本明細書中に記載のラパマイシンアナログまたはメリダマイシンアナログ）と接触させる工程；（ｉｉｉ）それにより、複合体を形成する工程を含む。
宿主細胞
別の態様では、本発明は、本明細書中に開示の複合体の１つ以上のポリペプチド構成要素をコードする１つ以上の核酸を含む宿主細胞を特徴とする。１つの実施形態では、宿主細胞は、イムノフィリン、（例えば、ＦＫＢＰ５２（例えば、本明細書中に記載の哺乳動物ＦＫＢＰ５２））またはその機能的バリアントをコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸；および／または電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのサブユニット（例えば、β１サブユニット）（例えば、本明細書中に記載の哺乳動物β１サブユニット）またはその機能的バリアントをコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸を含む。１つの実施形態では、第１の核酸は、図１３Ａ〜１３Ｂに示すアミノ酸配列（配列番号６〜７）またはこれに実質的に同一の配列をコードするヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、第２の核酸は、図１２Ａ〜１２Ｅに示すアミノ酸配列（配列番号１〜５）またはこれに実質的に同一の配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
「宿主細胞」、「組換え細胞」、および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で交換可能に使用される用語である。かかる用語は特定の本細胞だけでなく、かかる細胞の子孫または潜在的子孫もいうと理解される。変異または環境の影響によって後世で一定の改変が起こり得るので、かかる子孫は、実際に、親細胞と同一でないかもしれないが、依然として本明細書中で使用される用語の範囲内に含まれる。
用語「組換え核酸」には、天然で共に存在しない少なくとも２つの配列を含む任意の核酸が含まれる。組換え核酸を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、分子生物学法の使用による）またはｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、相同組換えまたは非相同組換えによる新規の染色体位置での核酸の挿入による）で生成することができる。
いくつかの実施形態では、宿主細胞を、例えば、タンパク質またはタンパク質複合体の精製、作製、または研究のために使用することができる。任意に、宿主細胞を、例えば、アッセイプロトコール（下記のものなど）での化合物の試験のために使用することができる。
一定の実施形態では、本発明の複合体のポリペプチドの組換え発現を個別に行い、これから複合体を形成することができる。別の実施形態では、本発明の複合体のかかるポリペプチドの組換え発現を同一細胞中で行い、これから複合体を形成することができる。
組換え発現に適切な宿主細胞には、細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．など）、酵母、植物細胞、昆虫細胞（など）、および哺乳動物細胞（線維芽細胞、リンパ球、Ｕ９３７細胞（または他の前単球細胞株）、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）など）が含まれる。
宿主細胞発現のために、組換え核酸を、発現構築物中の１つ以上の調節配列に作動可能に連結することができる。調節ヌクレオチド配列は、一般に、発現のために使用される宿主細胞に適切であろう。種々の宿主細胞のための多数の適切な発現ベクター型および適切な調節配列は、当該分野で公知である。典型的には、１つ以上の調節ヌクレオチド配列には、プロモーター配列、リーダー配列またはシグナル配列、リボゾーム結合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および転写終結配列、およびエンハンサー配列またはアクチベーター配列が含まれ得るが、これらに限定されない。当該分野で公知の構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターは、本発明によって意図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーターまたは１つを超えるプロモーターのエレメントを合わせたハイブリッドプロモーターであり得る。発現構築物は、エピソーム（プラスミドなど）上の細胞に存在することができるか、発現構築物を染色体中に挿入することができる。好ましい実施形態では、発現ベクターは、形質転換した宿主細胞を選択可能な選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカー遺伝子は当該分野で周知であり、使用される宿主細胞によって異なるであろう。
発現ベクターはまた、融合ドメイン（典型的には、発現ベクターによって得られる）を含むことができ、その結果、本発明の組換えポリペプチドが融合ドメインを有する融合ポリペプチドとして発現される。融合ドメインの主な利点は、融合ドメインが融合ポリペプチドの同定および／または精製を補助し、タンパク質発現レベルおよび総収量も増強されることである。
抗体
さらに別の態様では、本発明は、本明細書中に開示の複合体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを特徴とする。一定の実施形態では、抗体は、本明細書中に開示の複合体の形成および／または安定性を増加させる。他の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、本明細書中に開示の複合体の形成および／または安定性を減少または阻害する。例示的抗体分子には、完全な免疫グロブリン分子または、例えば、抗原結合部位を含むその一部（Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、ヒト化キメラ抗体、およびＦ（ｖ）のような当該分野で公知の免疫グロブリン分子の一部が含まれる）が含まれる。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を、当該分野で公知の方法によって産生することができる（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７；Ｃａｍｐｂｅｌｌ “Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｏｄｅｎｔ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ” ｉｎ Ｂｕｒｄｏｎら（ｅｄｓ．）（１９８５）“Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１３，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｓ）（１９８８）Ｉｎ “Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ（その全ての内容が、本明細書中で参照により援用される）。
本発明の精製複合体またはそのポリペプチド成分を使用して動物を免疫化し、複合体と特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を得ることができる。かかる抗体を、免疫原として全複合体または全長ポリペプチド成分を使用するか、そのフラグメントの使用によって得ることができる。ポリペプチドのより小さなフラグメントを使用して、動物を免疫化することもできる。ペプチド免疫原は、さらに、カルボキシル末端にシステイン残基を含むことができ、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などのハプテンに抱合する。さらなるペプチド免疫原を、チロシン残基の硫酸化チロシン残基との置換によって生成することができる。かかるペプチドの合成方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ａｕｓｂｅｌら（ｅｄｓ）（１９８７）Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）に記載されている。
改変抗体またはその抗原結合フラグメントを、当該分野で公知の技術によって生成することができ、これらの技術は、例えば、Ｗｏｏｄらの国際公開ＷＯ９１／００９０６号，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらの国際公開ＷＯ９１／１０７４１号；Ｌｏｎｂｅｒｇらの国際公開ＷＯ９２／０３９１８号；Ｋａｙらの国際公開ＷＯ９２／０３９１７号；Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−５９；Ｇｒｅｅｎら（１９９４）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．７：１３−２１；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１−５５；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎら（１９９３）Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３−４０；Ｔｕａｉｌｌｏｎら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：３７２０−２４；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎら（１９９１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：１３２３−１３２６；Ｌａｒｒｉｃｋら（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：１５２−５６；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号；Ａｋｉｒａらの欧州特許出願第１８４，１８７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉの欧州特許出願第１７１，４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎらの欧州特許出願第１７３，４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒらの国際公開ＷＯ８６／０１５３３号；Ｃａｂｉｌｌｙら米国特許第４，８１６，５６７号；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：３４３９−４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−２６；Ｓｕｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：２１４−１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４９；Ｓｈａｗら（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−５９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−０７；Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４；およびＱｕｅｅｎらの米国特許第５，５８５，０８９号，同第５，６９３，７６１号、および同第５，６９３，７６２号（その全ての内容が、本明細書中で参照により援用される）に開示されている。これらの方法は、少なくとも１つの重鎖または軽鎖由来の免疫グロブリンＦｖ可変領域の全部または一部をコードする核酸配列の単離、操作、および発現を含む。かかる核酸の供給源は、当業者に公知であり、例えば、所定の標的に対する抗体を産生するハイブリドーマから得ることができる。次いで、組換え抗体またはそのフラグメントをコードする組換えＤＮＡを、適切な発現ベクターにクローン化することができる。
複合体の形成を調整する試験化合物を同定するためのアッセイ
別の態様では、本発明は、試験化合物、イムノフィリン、およびカルシウムチャネルサブユニットを含む複合体の形成および／または安定性を調整（例えば、阻害または増加）する試験化合物を同定するための方法またはアッセイを提供する。方法またはアッセイは、複合体を形成させる条件下で、イムノフィリンまたはその機能的バリアントおよびβサブユニットまたはその機能的バリアントを含むサンプルを試験化合物と接触させる工程、基準サンプル（例えば、試験薬に暴露していないコントロールサンプルまたはラパマイシンに暴露しているコントロールサンプル）と比較して試験化合物と接触したサンプル中の複合体の存在を検出する工程を含む。基準サンプル中の複合体のレベルと比較した試験化合物の存在下での複合体のレベルの変化（例えば、増加または減少）は、試験化合物が複合体の形成および／または安定性に影響を及ぼす（例えば、増加または減少する）ことを示す。複合体形成を、基準サンプルと比較して、例えば、約１．５、２、５、１０倍、またはそれを超えて増加させる試験化合物が好ましい。
試験化合物を、例えば、細菌、放線菌（例えば、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）、酵母、または他の生物（例えば、天然物）から得るか、化学的に産生するか（例えば、小分子（ペプチド模倣物が含まれる））、組換え的に産生することができる。例えば、米国特許出願公開第２００５／０２７２１３３号、米国特許出願公開第２００５／０１９７３７９号に記載のように、例えば、ポリケチドを、天然に存在するか遺伝的に改変されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種から産生することができる。本明細書中に開示のラパマイシンアナログおよびメリダマイシンアナログの改変形態を、別法として化学合成によって産生することができる。
本発明の複合体は、新規の改変マクロライド（例えば、改変形態の本明細書中に開示のラパマイシンアナログおよびメリダマイシンアナログ）を生成可能である。精製複合体を三次元結晶構造の決定のために使用することができ、この構造を分子内相互作用のモデリングに使用することができる。例えば、複合体の結晶構造を決定することができ、当該分野で公知の技術を使用した妥当な薬物デザインの実施によって構造を改変することができる。米国特許出願公開第２００５／０２８８４８９Ａ１号（その内容が本明細書中で参照により援用される）に記載のように、妥当な薬物デザイン、コンピュータモデリング、モデル構築のための多数のコンピュータプログラムを利用可能である。
種々のアッセイ形式で十分であるが、本開示を考慮して、本明細書中に明記されていないアッセイ形式が当業者に理解されるであろう。アッセイ形式をタンパク質複合体の形成、酵素活性などの条件に近づけ、この形式を多数の異なる形態で得ることができ、この形式には、無細胞系（例えば、精製タンパク質または細胞溶解物）ベースのアッセイおよびインタクトな細胞を使用する細胞ベースのアッセイが含まれる。簡潔な結合アッセイを使用して、複合体成分間の相互作用または複合体の基質への結合を阻害または増強する化合物を検出することができる。
一定の実施形態では、本発明は、複合体のポリペプチドおよび複合体の１つ以上の相互作用ポリペプチドを含む再構成タンパク質調製物を提供する。１つの実施形態では、複合体の全成分を、反応混合物に同時に添加する。他の実施形態では、反応混合物を、成分の連続的添加（例えば、イムノフィリンとカルシウムチャネルとの混合物の形成）およびイムノフィリンリガンドの添加によって調製する。あるいは、イムノフィリンリガンドを、イムノフィリンまたはカルシウムチャネルに添加することができる。成分の任意の順序または組み合わせを使用することができる。本発明のアッセイには、標識ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質−タンパク質結合アッセイおよびタンパク質結合の免疫アッセイなどが含まれる。１つの実施形態では、サンプルは、細胞溶解物または再構成系である。再構成複合体は、少なくとも半精製タンパク質の再構成混合物を含むことができる。半精製とは、再構成混合物中で使用したタンパク質を他の細胞タンパク質から事前に分離したことを意味する。例えば、細胞溶解物と対照的に、複合体形成に関与するタンパク質は、混合物中の全ての他のタンパク質と比較して、混合物中に少なくとも純度５０％で存在し、より好ましくは、純度９０〜９５％で存在する。一定の実施形態では、再構成混合物が複合体のアセンブリおよび／または分解を測定する能力を妨害するかそうでなければ変化させ得る（細胞起源などの）他のタンパク質を実質的に欠くように、再構成タンパク質混合物を、高度に精製されたタンパク質の混合によって誘導する。一定の実施形態では、候補化合物の存在下または非存在下で、アッセイを、反応物を含めるのに適切な任意の容器中で行うことができる。例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が含まれる。
一定の実施形態では、本発明の複合体のアセンブリ、安定性、または機能を妨害する能力に基づいて試験化合物を検出する薬物スクリーニングアッセイを作製することができる。複合体の検出および定量により、成分間の相互作用の阻害（または増強）における化合物の有効性を決定するための手段が得られる。化合物の有効性を、種々の濃度の試験化合物を使用して得たデータ由来の用量応答曲線の作成によって評価することができる。さらに、コントロールアッセイを行って、比較のためのベースラインを得ることもできる。コントロールアッセイでは、複合体の形成を、試験化合物の非存在下で定量する。
一定の実施形態では、複合体中または複合体と基質ポリペプチドとの間の任意の２つのポリペプチドの間の会合を、種々の技術によって検出することができ、その多くが上に事実上記載されている。例えば、複合体形成の調整を、例えば、検出可能に標識されたタンパク質（例えば、放射性標識、蛍光標識、または酵素標識）、免疫アッセイ、またはクロマトグラフィ検出を使用して定量することができる。表面プラズモン共鳴システム（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から利用可能なものなど）を使用して、タンパク質−タンパク質相互作用を検出することもできる。
一定の実施形態では、複合体の１つのポリペプチドを固定化して、１つのポリペプチドの非複合体化形態からの複合体の分離を容易にし、アッセイの自動化に適応することができる。複合体の他の成分が不溶性マトリックスに結合されるイムノフィリンリガンド（または複合体の他の成分）を含むアフィニティマトリックスまたはビーズが本明細書中に記載されている。試験化合物を、複合体形成を促す条件下でインキュベートする。インキュベーション後、ビーズを洗浄して任意の非結合相互作用タンパク質を除去し、マトリックスビーズに結合した放射性標識を直接決定するか（例えば、シンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）中に存在するビーズ）、例えば、マイクロタイタープレートを使用する場合、複合体の解離後に上清中で決定する。あるいは、非結合タンパク質を洗い流した後、複合体をマトリックスから解離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分離し、マトリックス結合画分中に見出された相互作用ポリペプチドレベルを、標準的な電気泳動技術を使用してゲルから定量することができる。
あるいは、アッセイを、培養細胞（例えば、精製された培養細胞または組換え細胞）を使用してアッセイを行うことができる。例えば、２ハイブリッドアッセイ（相互作用トラップアッセイ（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｔｒａｐ ａｓｓａｙ）ともいう）を、複合体中の任意の２つのポリペプチドの相互作用の検出および一方および他方へのタンパク質の結合を阻害または増強する試験化合物のその後の検出のために使用することができる（米国特許第５，２８３，３１７号；Ｗ０９４／１０３００号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４；ａｎｄ Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６（全ての内容が参照により援用される）も参照のこと）。
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多数の薬物スクリーニングプログラムでは、所与の期間で調査される化合物数を最大にするために、高処理アッセイが望ましい。無細胞系で行われる本発明のアッセイ（精製もしくは半精製タンパク質または溶解物を使用して構築することができるアッセイなど）は、アッセイを、迅速に構築し、試験化合物によって媒介される分子標的の変化を比較的容易に検出することが可能なように作製することが可能であるという点で、しばしば「一次」スクリーニングとして好ましい。さらに、試験化合物の細胞毒性および／または生物学的利用能の影響を、一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系で無視することができ、その代わりに、アッセイを、主に分子標的に及ぼす薬物の影響に集中し、この影響は、他のタンパク質に対する結合親和性の変化または分子標的の酵素的性質の変化として現れ得る。
一定の実施形態では、タンパク質複合体の活性には、免疫沈降および共免疫沈降タンパク質の分析、または同時精製タンパク質のアフィニティ精製および分析によって評価することができるタンパク質複合体形成が含まれ得るが、これらに限定されない。蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）ベースのアッセイを使用して、複合体形成を決定することもできる。互いに極めて近接させられる適切な発光スペクトルおよび励起スペクトルを有する蛍光分子は、ＦＲＥＴを示し得る。一方の分子（ドナー分子）の発光スペクトルが他方の分子（アクセプター分子）の励起スペクトルと重複するように蛍光分子を選択する。ドナー分子を、ドナー励起スペクトル内の適切な強度の光によって励起する。次いで、ドナーは、吸収したエネルギーを蛍光として発光する。産生された蛍光エネルギーを、アクセプター分子によって消光する。ＦＲＥＴは、ドナー由来の蛍光シグナルの強度の減少、その励起状態の寿命の減少、および／またはアクセプターに特徴的なより長い波長（より低いエネルギー）での蛍光の再発光として出現し得る。蛍光タンパク質が物理的に分離する場合、ＦＲＥＴ効果は縮小するか消失する。ＦＲＥＴベースのアッセイは、米国特許第５，９８１，２００号（その内容が参照により援用される）に記載されている。
一般に、スクリーニングアッセイが結合アッセイ（タンパク質−タンパク質結合、化合物−タンパク質結合など）である場合、１つ以上の分子を、標識に連結することができる。この標識により、検出可能なシグナルを直接または間接的に得ることができる。種々の標識には、放射性同位体、蛍光剤、化学発光体、酵素、特異的結合分子、および粒子（例えば、磁性粒子）などが含まれる。特異的結合分子には、対（ビオチンおよびストレプトアビジン、ジゴキシンおよび抗ジゴキシンなど）が含まれる。特異的結合メンバーのために、相補メンバーを、通常、公知の手順にしたがって、検出する分子で標識するであろう。
種々の他の試薬を、スクリーニングアッセイに含めることができる。これらには、最適なタンパク質−タンパク質結合を容易にし、そして／または非特異的またはバックグラウンドの相互作用を減少させるために使用される塩、中性タンパク質（例えば、アルブミン）、界面活性剤などの試薬が含まれる。アッセイ効率を改善する試薬（プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌化合物など）を使用することができる。成分の混合物を、必須の結合が得られる任意の順序で添加する。任意の適切な温度（典型的には４℃と４０℃との間）でインキュベーションを行うことができる。最適な活性を得るためにインキュベーション期間を選択するが、迅速な高処理スクリーニングを容易にするために最適化することもできる。
一定の実施形態では、試験化合物をさらにアッセイして、カルシウムチャネル活性を調整する化合物を同定することができる。例えば、試験化合物の影響を、真核細胞を試験化合物およびカルシウムチャネル選択イオンを含む溶液に暴露した場合に機能的カルシウムチャネル（例えば、異種チャネル）を有するかかる細胞のカルシウムチャネル活性の試験、および試験化合物を含まない溶液中に同一の細胞または実質的に同一のコントロール細胞のカルシウムチャネル活性と測定したカルシウムチャネル活性の比較によって測定することができる。１つの実施形態では、チャネルが開口した場合に内向き電流（ｉｎｗａｒｄ ｃｕｒｒｅｎｔ）を得るのに十分な濃度のカルシウムチャネル選択イオンを有する溶液中に、細胞を維持する。かかるアッセイの実施方法は、当業者に公知である。例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ卵母細胞およびアセチルコリン受容体を使用して適用した類似の方法については、Ｍｉｓｈｉｎａら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：３６４；Ｎｏｄａら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２２：８２６−８２８；Ｃｌａｕｄｉｏら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１６８８−１６９４を参照のこと。
アッセイは、機能的カルシウムチャネルを発現する細胞に基づき、試験化合物が異種機能的チャネルを介したカルシウムチャネル選択イオン（Ｃａ＋＋またはＢａ＋＋など）の流れの規模および持続時間を増強、拮抗、または調整する能力を機能的に（電気生理学的になど）測定する。細胞の組換えカルシウムチャネルを介して流れる電流量を、１つの実施形態では、直接（電気生理学的など）、別の実施形態では、細胞内に起こり、カルシウム（または他の）イオン依存性様式で直接影響を及ぼす独立した反応のモニタリングによって決定することができる。
カルシウムチャネル活性の任意の評価方法を、本明細書中に記載の方法と併せて使用することができる。例えば、カルシウムチャネル活性を調整する能力について化合物を試験する方法の１つの実施形態では、電流量を、カルシウムチャネル選択イオンに感受性を示し、異種カルシウムチャネルを発現する真核細胞を使用し、指標タンパク質をコードする構造遺伝子に発現のために作動可能に連結される転写調節エレメントも含む反応の調整によって測定する。指標遺伝子の転写のために使用される転写調節エレメントは、細胞中で、カルシウムチャネル選択イオン（Ｃａ２＋およびＢａ＋など）に反応する。かかる転写ベースのアッセイの詳細は、例えば、ＰＣＴ国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／５６２５号に記載されている。
他の実施形態では、当業者に公知であり、本明細書中に例示されているカルシウムチャネル活性の電気生理学的測定方法を、表示の目的のために使用することができる。任意のかかる方法を使用して、機能的カルシウムチャネルの形成を検出し、得られた電流の動態学および他の特徴を特徴づけることができる。薬理学的研究を、電気生理学的測定と組み合わせて、他の実施形態では、カルシウムチャネルをさらに特徴づけることができる。
一般に、神経系における所与の試験化合物の活性を、以下の１つ以上を行う化合物の能力の検出によってアッセイすることができる：神経突起伸長の促進、化学的処理による損傷からのニューロンの保護、ニューロンまたは神経細胞の成長促進、神経系の神経組織または器官と関連する喪失または損傷した運動能力、機能的能力、または認識能力の回復、またはニューロンの再生。例えば、単離された神経細胞培養物（例えば、ドーパミン作動性細胞、皮質細胞、ＤＲＧ細胞の培養物）を、当該分野で公知の方法によって単離し、培養することができる（例えば、Ｐｏｎｇら（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：９８６−９９４；Ｐｏｎｇら（２００１）Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．１７１（１）：８４−９７を参照のこと）。ニューロン活性、分化、生存の変化を、例えば、米国特許出願公開第２００５／０１９７３５６号（それぞれ培養したドーパミン作動性ニューロンおよび皮質ニューロン中の３Ｈ−ドーパミン取り込みおよび神経フィラメント含有量の変化の測定を示す例を記載している）に記載の当該分野で認識された技術を使用して検出および定量することができる。あるいは、培養した神経細胞神経系細胞株（例えば、神経芽細胞腫細胞株、クロム親和性細胞腫細胞（ＰＣ１２細胞）、Ｆ１１中のニューロン活性を特徴づけることができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性は、多数のヒト神経変性状態（パーキンソン病；アルツハイマー病；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；外傷；脊髄損傷；多発性硬化症；糖尿病性ニューロパシー；化学療法などの医学的処置に関連するニューロパシー；虚血または虚血誘導性損傷；卒中などが含まれるが、これらに限定されない）を治療および／または改善するために使用することができる薬剤の同定で有用であり得る。
ニューロン活性の検出方法には、例えば、グルタミン酸神経毒性から保護する能力について化合物を試験する神経保護アッセイが含まれる。感覚神経培養物（ＤＲＧ）を、神経突起伸長および神経栄養活性についてアッセイすることもできる。培養細胞を、イムノフィリンリガンドで処置し、その後に新規の神経突起線維の存在についてアッセイする。免疫組織化学は、コントロールと比較した神経突起の視覚化および定量を助けることができる。
多数の動物モデルおよび細胞培養アッセイが開発されており、このアッセイは、疾患（上記ヒト疾患が含まれる）の処置に対するその臨床的関連性によって信頼に値する。以下の各参考文献を、これらのアッセイの出典として使用することができ、その全ては、特に、その目的のためにその全体が本明細書中で参照により具体的に援用される：Ｓｔｅｉｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：２０１９−２０２４（１９９７）；Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｂｉｏｏｒｇａｎ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：１７８５−１７９０（１９９７）；ＭｃＭａｈｏｎら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．５：６１６−６２４（１９９５）；Ｇａｓｈら，Ｎａｔｕｒｅ ３８０：２５２−２５５（１９９６）；Ｇｅｒｌａｃｈら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．−−Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０８：２７３−２８６（１９９１）；Ａｐｆｅｌら，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．６３４：７−１２（１９９４）；Ｗａｎｇら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．２８２：１０８４−１０９３（１９９７）；Ｇｏｌｄら，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４７：２６９−２７８（１９９７）；Ｈｏｆｆｅｒら，Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ．［Ｓｕｐｐｌ．］４９：１−１０（１９９７）；ａｎｄ Ｌｙｏｎｓら，ＰＮＡＳ ９１：３１９１−３１９５（１９９４）。
治療的使用および予防的使用
さらに別の態様では、本発明は、イムノフィリン（例えば、ＦＫＢＰ５２）またはその機能的バリアントおよび電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのサブユニット（例えば、β１サブユニット）またはその機能的バリアントを発現する細胞（例えば、哺乳動物細胞）中の機能（例えば、カルシウムチャネル活性（例えば、電位開口型カルシウムチャネル活性））を調整する方法を提供する。１つの実施形態では、カルシウムチャネルまたはＦＫＢＰ５２の活性または発現を阻害する。カルシウムチャネル活性が阻害される実施形態では、神経突起の伸長および／または生存を刺激することが好ましい。典型的には、本発明の方法で使用される細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）（例えば、神経細胞または心血管細胞）である。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書中に記載の複合体を形成させる条件下で、細胞をイムノフィリンリガンド（例えば、本明細書中に記載のラパマイシンアナログまたはメリダマイシンアナログ）と接触させ、それにより、カルシウムチャネル活性を阻害する工程を含む。
関連する実施形態では、本方法は、細胞（例えば、ドーパミン作動性細胞、コリン作動性細胞、皮質細胞、および脊髄神経細胞）をカルシウムチャネルβサブユニット（例えば、電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニット）のアンタゴニストと接触する工程を含む。アンタゴニストはまた、カルシウムチャネルβサブユニットの活性および／または発現のインヒビターであり得る。用語「アンタゴニスト」は、本明細書中で使用する場合、カルシウムチャネルβサブユニット（例えば、β１サブユニット）の１つ以上の生物活性を減少、阻害、または縮小する薬剤をいう。拮抗作用は、必ずしもカルシウムチャネルβサブユニットの生物活性の完全な消失を示すわけではない。１つの実施形態では、アンタゴニストは、本明細書中に記載のイムノフィリンリガンド（例えば、ラパマイシンアナログまたはメリダマイシンアナログ）である。典型的には、イムノフィリンリガンドを、リガンド、イムノフィリンまたはその機能的バリアント、およびカルシウムチャネルサブユニットまたはその機能的バリアントを含む複合体を形成および／または安定化するのに十分な量で投与する。他の実施形態では、アンタゴニストは、カルシウムチャネルβサブユニット転写のインヒビター（例えば、本明細書中により詳細に記載されている核酸インヒビター（例えば、ＲＮＡｉ））である。
本発明の方法を、培養培地中の細胞中で行うことができる。あるいは、本方法を、対象（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏの一部（例えば、治療または予防）プロトコールとしてか、動物対象（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ動物モデル）中に存在する細胞（例えば、神経細胞または心血管細胞）に対して行うことができる。
したがって、対象におけるカルシウムチャネル機能障害に関連する障害を治療または防止する方法は、本発明に含まれる。本方法は、リガンド、イムノフィリンまたはその機能的バリアント、およびカルシウムチャネルサブユニットまたはその機能的バリアントを含む複合体を形成および／または安定化するのに十分な量のイムノフィリンリガンド（例えば、ラパマイシンアナログまたはメリダマイシンアナログ）を対象に投与し、それにより、障害を治療または防止する工程を含む。本方法は、任意に、カルシウムチャネル機能障害に関与する障害に関連する１つ以上の症状を有するリスクがあるか、またはそれを有する対象を同定（例えば、評価、診断、スクリーニング、および／または選択）する工程を含む。対象は、例えば、神経変性障害または心血管障害を罹患した哺乳動物（例えば、ヒト）であり得る。例えば、対象は、１つ以上の卒中、パーキンソン病、片頭痛、小脳性運動失調症、アンギナ、癲癇、高血圧症、虚血、または心不整脈から選択される障害を罹患したヒト（例えば、ヒト患者）である。
本明細書中で使用する場合、用語「対象」は、ヒトおよび非ヒト動物を含むことが意図される。好ましいヒト動物には、異常なカルシウムチャネル活性によって特徴づけられた障害を有するヒト患者が含まれる。用語「非ヒト動物」には、脊椎動物（例えば、哺乳動物および非哺乳動物（非ヒト霊長類、げっ歯類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類など））が含まれる。対象は、例えば、神経変性障害または心血管障害を罹患した哺乳動物（例えば、ヒト）であり得る。
句、「治療有効量」のイムノフィリンリガンドは、対象の治療にて単回用量または複数回用量での対象（例えば、ヒト対象）への投与の際に有効な薬剤の量をいう。用語「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」には、障害の１つ以上の症状の治癒、重症度の軽減、改善、またはかかる治療が存在しない場合に予想される生存を超える対象の生存の延長が含まれる。同様に、句「予防的有効量」のイムノフィリンリガンドは、障害（例えば、本明細書中に記載の障害）の発症または再発の防止または遅延における対象（例えば、ヒト患者）への単回用量または複数回用量での投与の際に有効な薬剤の量をいう。
イムノフィリンリガンド（例えば、ラパマイシンアナログ）を、単独または１つ以上の薬剤（例えば、治療薬）と組み合わせて投与することができる。この文脈中での用語「組み合わせて」は、薬剤を、実質的に同時期に（同時または連続的のいずれか）投与することを意味する。第２の化合物の投与開始時に連続的に投与する場合、２つの化合物のうちの第１の化合物は、治療部位での有効濃度で依然として検出可能であることが好ましい。１つの実施形態では、第２の薬剤は、カルシウムチャネルアンタゴニスト（例えば、Ｌ型カルシウムチャネルのアンタゴニスト）である。Ｌ型カルシウムチャネルのアンタゴニストの例には、ジヒドロピリジン；フェニルアルキルアミン（例えば、ベラパミル、ガルパミル（ｇａｌｌｐａｍｉｌ）、およびチアパミル（ｔｈｉａｐａｍｉｌ））；ベンゾチアゼピン；抗統合失調性神経遮断薬のジフェニルブチルピペリジンクラス（例えば、ピモジド、フルスピリジン（ｆｌｕｓｐｉｒｉｄｉｎｅ）、ペンフルリドール、およびクロピモジド）；ならびにニフェジピン、カルバマゼピン、ジルチアゼム、ニカルジピン、ニモジピン、およびニトレジピンが含まれる。
カルシウムチャネル機能障害に関連する例示的障害には、卒中；パーキンソン病；片頭痛（例えば、先天性片頭痛）；小脳性運動失調症；アンギナ；癲癇；高血圧症；虚血（例えば、心虚血）；心不整脈；卒中；頭部外傷または脊髄損傷、または脳、末梢神経、中枢神経、または神経筋系に対する他の損傷；慢性疼痛、神経因性疼痛、および急性疼痛；気分障害；統合失調症；鬱病；不安；精神疾患；薬物耽溺；アルコール依存症、および尿失禁が含まれる。
カルシウム（Ｃａ２＋）イオンチャネルの機能障害に関連する他の障害の例には、悪性高熱、セントラルコア病、カテコールアミン作動性多形性心室頻拍、および不整脈惹起性右室異形成２型（ＡＲＶＤ−２）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法を使用して治療することができる神経学的障害の例には、アルツハイマー病；ハンチントン病；脊髄損傷；外傷性脳損傷；レヴィ小体痴呆；ピック病；ニーマン・ピック病（Ｎｉｅｗｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ ｄｉｓｅａｓｅ）；アミロイド血管症；脳アミロイド血管症；全身性アミロイド症；アミロイド症を伴うオランダ型遺伝性脳出血；封入体筋炎；軽度認知障害；ダウン症候群；および神経筋障害（筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症、および筋ジストロフィ（デュシェンヌ型ジストロフィ、ベッカー型筋ジストロフィ、顔面肩甲上腕型（ランドウジー・デジェリン）筋ジストロフィ、および肢帯型筋ジストロフィ（ＬＧＭＤ）が含まれる）が含まれる）が含まれる。イムノフィリンリガンドはまた、例えば、上記状態および／または損傷、卒中、または他の外傷の１つの発症後のいくつかの神経学的および／または神経筋機能または他の機能の修復における神経保護薬および／または神経再生薬（ｎｅｕｒｏｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）として有用である。
治療することができるさらなる心血管障害の例には、鬱血性心不全；不整脈惹起性症候群（ａｒｒｈｙｔｈｍｏｇｅｎｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（パーオキシソーマル頻拍（ｐａｒｏｘｙｓｏｍａｌ ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、遅延後脱分極、心室性頻拍、突発性頻拍（ｓｕｄｄｅｎ ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、運動誘発性不整脈、ＱＴ延長症候群、および二方向性頻拍が含まれる）；血栓塞栓障害（動脈心血管血栓塞栓障害、静脈心血管血栓塞栓障害、および心腔血栓塞栓障害が含まれる）；アテローム性動脈硬化症；再狭窄；抹消動脈疾患；冠動脈バイパス移植術；頸動脈疾患；動脈炎；心筋炎；心血管炎症；血管炎症；冠状動脈性心疾患（ＣＨＤ）；不安定性アンギナ（ＵＡ）；不安定性無反応性アンギナ；安定性アンギナ（ＳＡ）；慢性安定性アンギナ；急性冠不全症候群（ＡＣＳ）；一次または再発性の心筋梗塞；急性心筋梗塞（ＡＭＩ）；心筋梗塞；非Ｑ波心筋梗塞；非ＳＴＥ心筋梗塞；冠状動脈疾患；虚血性心疾患；虚血性突然死（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｕｄｄｅｎ ｄｅａｔｈ）；一過性虚血発作；卒中；閉塞性末梢動脈疾患；静脈血栓症；深部静脈血栓症；血栓性静脈炎；動脈塞栓症；冠動脈血栓症；大脳動脈血栓症；脳塞栓；腎臓塞栓症；肺塞栓症；（ａ）人工弁または他の移植片、（ｂ）留置カテーテル、（ｃ）ステント、（ｄ）心肺バイパス、（ｅ）血液透析、または（ｆ）血液を血栓症を促進する人工物表面に暴露する他の手段に起因する血栓症；アテローム性動脈硬化症、手術または外科合併症、長期固着（ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）、動脈フィブリル化（ａｒｔｅｒｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ）、先天性血栓形成傾向、癌、糖尿病、薬物またはホルモンの影響、および妊娠合併症に起因する血栓症；心不整脈（ｃａｒｄｉａｃ ａｒｒｈｙｔｍｉａｓ）（上室性不整脈、動脈不整脈、心房粗動、心房細動が含まれる）；Ｈｅａｒｔ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２ Ｖｏｌｕｍｅ Ｓｅｔ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１，Ｅｕｇｅｎｅ Ｂｒａｕｎｗａｌｄ，Ｄｏｕｇｌａｓ Ｐ．Ｚｉｐｅｓ，Ｐｅｔｅｒ Ｌｉｂｂｙ，Ｄｏｕｇｌａｓ Ｄ．Ｚｉｐｅｓおよびその薬物の調製中に列挙した他の疾患が含まれるが、これらに限定されない。
さらなる実施形態では、心血管疾患を、１つ以上の以下から選択する：アテローム性動脈硬化症；冠状動脈性心疾患（ＣＨＤ）；再狭窄（ｒｅｓｔｅｎｓｏｓｉｓ）；抹消動脈疾患；冠動脈バイパス移植術；頸動脈疾患；動脈炎；心筋炎；心血管炎症；血管炎症；不安定性アンギナ（ＵＡ）；不安定性無反応性アンギナ；安定性アンギナ（ＳＡ）；慢性安定性アンギナ；急性冠不全症候群（ＡＣＳ）；心筋梗塞；または急性心筋梗塞（ＡＭＩ）（一次または再発性の心筋梗塞、非Ｑ波心筋梗塞、非ＳＴ上昇心筋梗塞、およびＳＴ上昇心筋梗塞が含まれる）。
イムノフィリンリガンドの量または投薬量の要件は、状態、示した症状の重症度、および治療される特定の対象に応じて変化し得る。当業者は、本明細書中に記載の方法にしたがって、イムノフィリンリガンドの必要量を容易に決定することができるであろう。好ましくは、イムノフィリンリガンドの投薬量は、リガンド、イムノフィリンまたはその機能的バリアント、およびカルシウムチャネルサブユニットまたはその機能的バリアントを含む複合体の形成および／または安定化に十分な投薬量である。いくつかの実施形態では、投薬量を、本発明の教示にしたがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験することができる。１つの実施形態では、約０．５〜２００ｍｇ、約０．５〜１００ｍｇ、約０．５〜約７５ｍｇを投与する。なおさらなる実施形態では、約１〜約２５ｍｇを投与する。別の実施形態では、特に別の薬剤と組み合わせて使用する場合、約０．５〜約１０ｍｇを投与する。なおさらなる実施形態では、約２〜約５ｍｇを投与する。さらに別の実施形態では、約５〜約１５ｍｇを投与する。
所望の効果を得るのに必要な投薬量未満、一般にリガンドの至適用量未満のイムノフィリンリガンドの投薬量で治療を開始することができる。その後、この環境下で最適な効果に到達するまで、投薬量を増加することができる。正確な投薬量は、治療される各対象の経験に基づいて主治医によって決定されるであろう。一般に、組成物を、いかなる有害または悪影響を及ぼす副作用を生じることなく有効な結果が得られる濃度で投与することが最も望ましい。
一定の実施形態では、核酸アンタゴニストを使用して、カルシウムチャネルβサブユニット（例えば、β１サブユニット）をコードする内因性遺伝子の発現を減少させる。１つの実施形態では、核酸アンタゴニストは、カルシウムチャネルβサブユニットをコードするｍＲＮＡをターゲティングするｓｉＲＮＡである。他のアンタゴニスト核酸型（例えば、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、三重らせん形成剤（ｆｏｒｍｅｒ）、またはアンチセンス核酸）も使用することができる。いくつかの実施形態では、核酸アンタゴニストを、カルシウムチャネルβサブユニットの下流エフェクター標的に指向することができる。
ｓｉＲＮＡは、任意にオーバーハングを含む小さな二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。例えば、ｓｉＲＮＡの二重鎖領域は約１８〜２５ヌクレオチド長（例えば、約１９、２０、２１、２２、２３、または２４ヌクレオチド長）である。典型的には、ｓｉＲＮＡ配列は、標的ｍＲＮＡに正確に相補的である。特にｄｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを使用して、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）中での遺伝子発現をサイレンシングすることができる。ｓｉＲＮＡには、２９塩基対ステムおよび２−ヌクレオチド３’オーバーハングを有する短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）も含まれる。例えば、Ｃｌｅｍｅｎｓら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：６４９９−６５０３；Ｂｉｌｌｙら（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１４４２８−１４４３３；Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ．４１１：４９４−８；Ｙａｎｇら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：９９４２−９９４７；Ｓｉｏｌａｓら（２００５），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（２）：２２７−３１；米国特許出願公開第２００４００８６８８４号；同第２００３０１６６２８２号；同第２００３０１４３２０４号；同第２００４００３８２７８号；および同第２００３０２２４４３２号を参照のこと。
アンチセンス剤は、例えば、約８〜約８０核酸塩基（すなわち、約８〜約８０ヌクレオチド）、例えば、約８〜約５０核酸塩基、または約１２〜約３０核酸塩基を含むことができる。アンチセンス化合物には、標的核酸とハイブリッド形成してその発現を調整するリボザイム、外部ガイド配列（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド（オリゴザイム（ｏｌｉｇｏｚｙｍｅ））、および他の短い触媒ＲＮＡまたは触媒オリゴヌクレオチドが含まれる。アンチセンス化合物は、標的遺伝子中の配列に相補的な少なくとも８個の連続する核酸塩基のストレッチを含むことができる。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリッド形成可能であるべきその標的核酸配列と１００％相補的である必要はない。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの標的への結合が標的分子の正常な機能を妨害して有用性が喪失され、特異的結合が望ましい条件下（すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイまたは治療上の処置の場合は生理学的条件下、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合は、アッセイが行われる条件下）でオリゴヌクレオチドの非標的配列への非特異的結合を回避するのに十分な相補度である場合に特異的にハイブリッド形成可能である。
アンチセンスオリゴヌクレオチドのｍＲＮＡ（例えば、カルシウムチャネルβサブユニットをコードするｍＲＮＡ）とのハイブリッド形成は、ｍＲＮＡの１つ以上の正常な機能を妨害することができる。妨害されるべきｍＲＮＡの機能には、全ての重要な機能（例えば、ＲＮＡのタンパク質翻訳部位への転位置、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つ以上のｍＲＮＡ種を得るためのＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡが関与し得る触媒活性など）が含まれる。特異的タンパク質のＲＮＡへの結合も、ＲＮＡへのアンチセンスオリゴヌクレオチドハイブリッド形成を妨害することができる。
例示的アンチセンス化合物には、標的核酸（例えば、カルシウムチャネルβサブユニットをコードするｍＲＮＡ）と特異的にハイブリッド形成するＤＮＡまたはＲＮＡ配列が含まれる。相補領域は、約８〜約８０核酸塩基伸長することができる。化合物は、１つ以上の修飾核酸塩基を含むことができる。修飾核酸塩基には、例えば、５置換ピリミジン（５−ヨードウラシル、５−ヨードシトシン、およびＣ５−プロピニルピリミジン（Ｃ５−プロピニルシトシンおよびＣ５−プロピニルウラシルなど）など）が含まれ得る。他の適切な修飾核酸塩基には、Ｎ４−−（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキルアミノシトシンおよびＮ４，Ｎ４−−（Ｃ１〜Ｃ１２）ジアルキルアミノシトシンが含まれる。修飾核酸塩基には、７置換８−アザ−７−デアザプリンおよび７置換７−デアザプリン（例えば、７−ヨード−７−デアザプリン、７−シアノ−７−デアザプリン、７−アミノカルボニル−７−デアザプリンなど）も含まれ得る。これらの例には、６−アミノ−７−ヨード−７−デアザプリン、６−アミノ−７−シアノ−７−デアザプリン、６−アミノ−７−アミノカルボニル−７−デアザプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシ−７−ヨード−７−デアザプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシ−７−シアノ−７−デアザプリン、および２−アミノ−６−ヒドロキシ−７−アミノカルボニル−７−デアザプリンが含まれる。さらに、Ｎ６−−（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキルアミノプリンおよびＮ６，Ｎ６−−（Ｃ１〜Ｃ１２）ジアルキルアミノプリン（Ｎ６−メチルアミノアデニンおよびＮ６，Ｎ６−ジメチルアミノアデニンが含まれる）も適切な修飾核酸塩基である。同様に、他の６−置換プリン（例えば、６−チオグアニンが含まれる）は、適切な修飾核酸塩基を構成することができる。他の適切な核酸塩基には、２−チオウラシル、８−ブロモアデニン、８−ブロモグアニン、２−フルオロアデニン、および２−フルオログアニンが含まれる。任意の上記修飾核酸塩基の誘導体も適切である。任意の前記化合物の置換基には、Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ２〜Ｃ３０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ３０アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アミド、ニトロ、チオ、スルホニル、カルボキシル、アルコキシ、アルキルカルボニル、およびアルコキシカルボニルなどが含まれ得る。
他の核酸剤型の説明も利用可能である。例えば、米国特許第４，９８７，０７１号；同第５，１１６，７４２号；および同第５，０９３，２４６号；Ｗｏｏｌｆら（１９９２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ，Ｄ．Ａ．Ｍｅｌｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）；８９：７３０５−９；Ｈａｓｅｌｈｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９；Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．６：５６９−８４；Ｈｅｌｅｎｅ（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６；ａｎｄ Ｍａｈｅｒ（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４：８０７−１５を参照のこと。
薬学的組成物
１つの態様では、本発明は、１つ以上のイムノフィリンリガンドを含む薬学的組成物の調製方法を含む。他の実施形態では、本明細書中に記載の複合体を含む薬学的組成物を開示する。本明細書中で使用する場合、「イムノフィリンリガンド」または「イムノフィリンリガンド」を含む組成物は、１つ以上のイムノフィリンリガンドを含む組成物を含むことを意図する。組成物を、いくつかの異なる経路によって哺乳動物対象に投与することができ、固体または液体の形態で経口投与することが望ましい。
イムノフィリンリガンドを含む固体形態（錠剤、カプセル、およびカプレットが含まれる）を、イムノフィリンリガンドと上に記載の１つ以上の成分とのブレンドによって形成することができる。１つの実施形態では、組成物の成分を、乾式または湿式でブレンドする。別の実施形態では、成分を乾式粒造する。さらなる実施形態では、成分を液体に懸濁または溶解して添加し、哺乳動物対象への投与に適切な形態にする。
イムノフィリンリガンドを含む液体形態を、哺乳動物対象への投与に適切な液体中のイムノフィリンリガンドの溶解または懸濁によって形成することができる。
イムノフィリンリガンドを含む本明細書中に記載の組成物を、薬学的有効量のイムノフィリンリガンドを使用して所望の送達経路に適切な任意の形態で処方することができる。例えば、本発明の組成物を、経路、皮膚、経皮、気管支内、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、腹腔内、鼻腔内、膣、直腸、舌下、頭蓋内、硬膜外、気管内などの経路または徐放によって送達させることができる。好ましくは、送達は経口である。
本発明の経口投与用錠剤を使用して、イムノフィリンリガンドの誘導体（当業者に公知のエステル、カルバミン酸塩、硫酸塩、エーテル、オキシム、および炭酸塩などが含まれるが、これらに限定されない）を含む経口投与用錠剤を作製することもできる。
薬学的有効量のイムノフィリンリガンドは、特定の化合物、送達様式、治療される状態の重症度、および組成物中で使用される任意の他の有効成分に応じて変化し得る。最適な治療反応が得られるように投与計画を調整することもできる。いくつかの分割用量を毎日送達させることができるか（例えば、１日に２〜４回の分割投与）、単回用量を送達させることができる。しかし、治療緊急時に用量を比例的に増減することができる。１つの実施形態では、日毎、週毎、または月毎に送達させる。別の実施形態では、毎日送達させる。しかし、周期的送達に基づいて、１日量を増減することができる。
イムノフィリンリガンドを、１つ以上の薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤（本発明の組成物と適合する固体および液体キャリアが含まれるが、これらに限定されない）と組み合わせることができる。かかるキャリアには、アジュバント、シロップ、エリキシル、希釈剤、結合剤、潤滑剤、界面活性剤、造粒剤、崩壊剤、軟化薬、金属キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、充填剤、崩壊剤、およびその組み合わせなどが含まれる。１つの実施形態では、イムノフィリンリガンドを、金属キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、充填剤、崩壊剤、潤滑剤、および結合剤と組み合わせる。アジュバントには、香味物質、着色剤、防腐剤、および補助的抗酸化剤（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ）（ビタミンＥ、アスコルビン酸、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）およびブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）が含まれ得る）が含まれ得るが、これらに限定されない。
結合剤には、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタラート、微結晶性セルロース、非結晶セルロース、ポリプロピルピロリドン、ポリビニルピロリドン（ポビドン、ＰＶＰ）、ゼラチン、アラビアゴムおよびアカシア、ポリエチレングリコール、デンプン、糖（スクロース、カオリン、デキストロース、およびラクトースなど）、コレステロール、トラガカント、ステアリン酸、ゼラチン、カゼイン、レシチン（ホスファチド）、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、セチルエステルワックス、デキストラート、デキストリン、グリセリルモノオレアート、モノステアリン酸グリセリル、グリセリルパルミトステアラート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンステアラート、ポリビニルアルコール、およびゼラチンなどが含まれ得るが、これらに限定されない。１つの実施形態では、結合剤は、ポビドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはゼラチンである。別の実施形態では、結合剤はポビドンである。
潤滑剤には、ステアリン酸マグネシウム、軽質無水ケイ酸、タルク、ステアリン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、およびフマル酸ステアリルナトリウムなどが含まれ得る。１つの実施形態では、潤滑剤は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはフマル酸ステアリルナトリウムである。別の実施形態では、潤滑剤はステアリン酸マグネシウムである。
造粒剤には、二酸化ケイ素、微結晶性セルロース、デンプン、炭酸カルシウム、ペクチン、クロスポビドン、およびポリプラスドンなどが含まれ得るが、これらに限定されない。
崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）または崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｎｔ）には、クロスカルメロースナトリウム、デンプン、カルボキシメチルセルロース、置換ヒドロキシプロピルセルロース、重炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム、グリコール酸デンプンナトリウム、アルファ化デンプン、またはクロスポビドンなどが含まれ得る。１つの実施形態では、崩壊剤はクロスカルメロースナトリウムである。
軟化薬には、ステアリルアルコール、ミンク油、セチルアルコール、オレイルアルコール、ラウリン酸イソプロピル、ポリエチレングリコール、オリーブ油、ワセリン、パルミチン酸、オレイン酸、およびミリスチン酸ミリスチルが含まれ得るが、これらに限定されない。
界面活性剤には、ポリソルベート、ソルビタンエステル、ポロクサマー、またはラウリル硫酸ナトリウムが含まれ得る。１つの実施形態では、界面活性剤はラウリル硫酸ナトリウムである。
金属キレート剤には、生理学的に許容可能なキレート剤（エデト酸、リンゴ酸、またはフマル酸が含まれる）が含まれ得る。１つの実施形態では、金属キレート剤はエデト酸である。
ｐＨ調整剤を使用して、イムノフィリンリガンドを含む溶液を約ｐＨ４〜約ｐＨ６に調整することもできる。１つの実施形態では、イムノフィリンリガンドを含む溶液のｐＨを、約ｐＨ４．６に調整する。ｐＨ調整剤には、生理学的に許容可能な薬剤（クエン酸、アスコルビン酸、フマル酸、またはリンゴ酸、およびその塩が含まれる）が含まれ得る。１つの実施形態では、ｐＨ調整剤はクエン酸である。
本発明で使用することができる充填剤には、無水ラクトース、微結晶性セルロース、マンニトール、リン酸カルシウム、アルファ化デンプン、またはスクロースが含まれる。１つの実施形態では、充填剤は無水ラクトースである。別の実施形態では、充填剤は微結晶性セルロースである。
１つの実施形態では、イムノフィリンリガンドを含む組成物を、錠剤、カプレットまたはカプセル、マイクロカプセル、分散性粉末、顆粒、懸濁液、シロップ、エリキシル、およびエアゾールによって経口送達させる。望ましくは、イムノフィリンリガンドを含む組成物を経口送達させる場合、錠剤および硬カプセルまたは液体充填カプセルによって送達させる。別の実施形態では、イムノフィリンリガンドを含む組成物を、容易に注射針を通過する範囲の流動性を示す滅菌注射溶液、懸濁液、分散液、および粉末の形態で静脈内、筋肉内、皮下、非経口、および腹腔内に送達させることができる。かかる注射用組成物は、製造および保存条件下で無菌且つ安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用がない。さらなる実施形態では、イムノフィリンリガンドを含む組成物を、従来の座剤の形態で直腸送達させることができる。別の実施形態では、イムノフィリンリガンドを含む組成物を、従来の座剤、クリーム、ゲル、リング、またはコーティングした子宮内器具（ＩＵＤ）の形態で膣送達させることができる。
別の実施形態では、イムノフィリンリガンドを含む組成物を、支持構造（すなわち、本発明の化合物を含む支持する薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含むことができるフレームワーク）（例えば、血管ステントまたはシャント、冠動脈ステント、末梢ステント、カテーテル、動静脈移植片、バイパス移植片、および脈管構造で用いる薬物送達バルーン）のコーティングまたは含浸によって送達させることができる。１つの実施形態では、使用に適切なコーティングには、本発明の化合物が実質的に溶解可能な任意の高分子材料から構成される高分子コーティングが含まれるが、これらに限定されない。支持構造およびコーティングまたは含浸方法（例えば、米国特許第６，８９０，５４６号に記載の方法）は当業者に公知であり、本発明を制限しない。
さらに別の実施形態では、イムノフィリンリガンドを含む組成物を、エアゾールの形態で鼻腔内または気管支内に送達させることができる。
遊離塩基または薬理学的に許容可能な塩としてのこれらの活性化合物の溶液または懸濁液を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水中で調製する。また、分散液を、グリセロール、液体、ポリエチレングリコール、およびその油中での混合物中で調製する。通常の保存および使用条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための防腐剤を含む。
注射に適切な薬学的形態には、滅菌水溶液または分散液または滅菌注射液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。あらゆる場合において、形態は無菌であり、容易に注射針を通過する範囲の流動性を示す。形態は、製造および保存条件下で無菌且つ安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用がない。キャリアは、例えば、水、エタノール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、その適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒である。
本発明はまた、イムノフィリンリガンドを含むキットまたはパッケージを提供する。本発明のキットは、上記考察の哺乳動物対象への投与に適切なリガンドおよびキャリアを含むことができる。キットはまた、イムノフィリンリガンドの調製に必要な試薬を含むことができる。複合体、その成分、および／または試薬、ならびに使用説明書を含むキットも本発明の範囲内である。
以下の実施例を本発明の例示するために示すが、実施例は本発明の範囲を制限しない。当業者は、特定の試薬および条件を以下の実施例で概説しているが、修正形態を作製することができ、この修正形態が本発明の精神および範囲に含まれることを意味すると認識するであろう。
（実施例１）ラパマイシンアナログＩおよびＩＩの合成
ＦＫ５０６およびラパマイシンとその各タンパク質標的との複合体により、免疫抑制活性が得られ、これは慢性神経変性の治療状況で望ましくないかもしれない（Ｌａｍら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２６５１１−２２（１９９５））。したがって、非免疫抑制性イムノフィリンリガンドを構築するために、以下により詳細に記載するように、ＦＫＢＰ結合部分がインタクトなままでｍＴＯＲとの相互作用を破壊する（図１Ａ）ために、ラパマイシンアナログＩおよびＩＩを、Ｃ１，Ｃ３ジエンでのニトロソベンゼンとの［４＋２］付加環化反応を介してラパマイシンから調製した。
ラパマイシンアナログＩの合成
化学物質を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。
ラパマイシン（０．３ｇ、０．３２８ｍｍｏｌ）を、穏やかに加熱しながら５ｍＬトルエン中に溶解した。この溶液に、ニトロソベンゼン（０．１ｇ、３当量）を含む５ｍＬトルエン溶液を滴下した。反応混合物を、７０oＣで１６時間撹拌し、生成物を、逆相高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）（カラム：２５０×２０ｍｍ ＹＭＣ ＯＤＳ−Ａ（５０×２０ガードカラム付）、移動相：８０〜８５％メタノール：水で４０分間、流速＝２０ｍＬ／分）によってクロマトグラフィ分析して、０．１３９ｇの生成物を得た（収率４２％、ｔＲ＝１２．１分、ＨＰＬＣの分析条件：カラム＝ＹＭＣ ＯＤＳ−Ａ Ｓ−３ １２０Å、移動相／勾配：９５％水（＋０．０２５％ギ酸）／アセトニトリル（＋０．０２５％ギ酸）から５％水で６分、５％で９分間保持、流速＝０．３０ｍＬ／分）。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）：δ７．２９（ｍ，２Ｈ，Ｈ５７），７．０２（ｍ，２Ｈ，Ｈ５６），６．９０（ｍ，１Ｈ，Ｈ５８），６．２５（ｍ，１Ｈ，Ｈ２），５．６５（ｍ，１Ｈ，Ｈ３），５．２５（ｍ，１Ｈ，Ｈ２９），５．１６（ｍ，１Ｈ，Ｈ５），５．１２（ｍ，１Ｈ，Ｈ２５），５．０７（ｍ，１Ｈ，Ｈ４），４．３７（ｍ，１Ｈ，Ｈ２２），４．０９（ｍ，１Ｈ，Ｈ３１），３．９５（ｍ，１Ｈ，Ｈ３２），３．７４（ｍ，１Ｈ，Ｈ９），３．６９（ｍ，１Ｈ，Ｈ１），３．５９（ｍ，１Ｈ，３１−ＯＨ），３．４４（ｍ，１Ｈ，Ｈ２８），３．４４（ｍ，１Ｈ，Ｈ２８），３．３３（ｓ，３Ｈ，Ｍｅ５４），３．２９（ｍ，３Ｈ，Ｍｅ５３），３．２７（ｍ，１Ｈ，Ｈ４２），３．０７（ｍ，１Ｈ，Ｈ３４），３．０６（ｓ，３Ｈ，Ｍｅ５２），２．９４（ｍ，１Ｈ，Ｈ１８），２．８６（ｍ，１Ｈ，Ｈ４１），２．８４（ｍ，１Ｈ，Ｈ２６），２．６４（ｍ，１Ｈ，Ｈ２６’），２．１４（ｍ，１Ｈ，Ｈ２１），２．０９（ｍ，１Ｈ，Ｈ１２），２．０５（ｍ，１Ｈ，Ｈ４０），２．０１（ｍ，１Ｈ，Ｈ３６），２．００（ｍ，１Ｈ，Ｈ３５），１．８７（ｍ，１Ｈ，Ｈ３７），１．８５（ｍ，１Ｈ，Ｈ４３），１．８１（ｍ，１Ｈ，Ｈ２１’），１．７８（ｓ，３Ｈ，Ｍｅ４８），１．７４（ｍ，１Ｈ，Ｈ１９），１．７４（ｍ，１Ｈ，Ｈ２０），１．６９（ｍ，１Ｈ，Ｈ８），１．６４（ｍ，１Ｈ，Ｈ４４），１．６３（ｍ，１Ｈ，Ｈ８’），１．６０（ｍ，１Ｈ，Ｈ１１），１．５５（ｍ，１Ｈ，Ｈ４４’），１．５１（ｓ，３Ｈ，Ｍｅ４５），１．４３（ｍ，２Ｈ，Ｈ１０），１．４２（ｍ，１Ｈ，Ｈ１９’），１．３９（ｍ，１Ｈ，Ｈ２０’），１．３７（ｍ，１Ｈ，Ｈ３９），１．２７（ｍ，１Ｈ，Ｈ３８），１．１２（ｄ，３Ｈ，Ｍｅ５０），１．０６（ｄ，３Ｈ，Ｍｅ４７），１．０４（ｍ，１Ｈ，Ｈ３８’），１．０３（ｄ，３Ｈ，Ｍｅ４９），０．８９（ｄ，３Ｈ，Ｍｅ５１），０．８３（ｄ，３Ｈ，Ｍｅ４６），０．６３（ｍ，１Ｈ，Ｈ４０’）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）：δ２１５．４（ｓ，Ｃ３３），２０９．５（ｓ，Ｃ２７），１９８．５（ｓ，Ｃ１５），１７０．６（ｓ，Ｃ２３），１６６．４（ｓ，Ｃ１６），１４９．２（ｓ，Ｃ５５），１３９．９（ｓ，Ｃ６），１３８．７（ｓ，Ｃ３０），１３０．０（ｄ，Ｃ５７），１２８．０（ｄ，Ｃ３），１２７．９（ｄ，Ｃ２９），１２７．２（ｄ，Ｃ５），１２７．０（ｄ，Ｃ２），１２１．５（ｄ，Ｃ５８），１１６．１（ｄ，Ｃ５６），９９．５（ｓ，Ｃ１３），８７．３（ｄ，Ｃ３２），８５．２（ｄ，Ｃ４１），８４．８（ｄ，Ｃ７），７８．２（ｄ，Ｃ３１），７７．０（ｄ，Ｃ２５），７４．５（ｄ，Ｃ４２），６８．４（ｄ，Ｃ４），６８．３（ｄ，Ｃ９），６０．３（ｄ，Ｃ１），５８．６（ｑ，Ｃ５３），５７．４（ｄ，Ｃ２２），５６．９（ｑ，Ｃ５４），５６．１（ｑ，Ｃ５２），４６．９（ｄ，Ｃ２８），４２．８（ｄ，Ｃ３４），４１．７（ｔ，Ｃ２６），３９．５（ｔ，Ｃ１８），３９．５（ｔ，Ｃ８），３８．６（ｔ，Ｃ３５），３８．５（ｔ，Ｃ３８），３７．５（ｄ，Ｃ３６），３５．６（ｄ，Ｃ１２），３５．３（ｔ，Ｃ４０），３３．９（ｄ，Ｃ３７），３３．８（ｄ，Ｃ３９），３２．９（ｔ，Ｃ４３），３２．２（ｔ，Ｃ１０），３２．２（ｔ，Ｃ４４），２８．２（ｔ，Ｃ２１），２７．７（ｔ，Ｃ１１），２５．１（ｔ，Ｃ１９），２１．６（ｔ，Ｃ２０），１８．５（ｑ，Ｃ５０），１８．０（ｑ，Ｃ４９），１６．７（ｑ，Ｃ５１），１６．３（ｑ，Ｃ４６），１６．０（ｑ，Ｃ４７），１２．４（ｑ，Ｃ４８），１０．８（ｑ，Ｃ４５）；ＦＴ−ＩＣＲＭＳ（ｍ／ｚ）：Ｃ５７Ｈ８５Ｎ２Ｏ１４の［Ｍ＋Ｈ］＋計算値１０２１．５９９５４；実測値１０２１．５９７８０。
ラパマイシンアナログＩＩの合成
ラパマイシンアナログＩ（０．２９ｇ、０．２８４ｍｍｏｌ）を、１８ｍｍ試験管中の７ｍＬメタノールに溶解し、Ｐｄ／Ｃ触媒（Ａｌｄｒｉｃｈ）のスパチュラチップを添加した。混合物を、Ｐａｒｒ装置にて２．０気圧のＨ２で１５分間水素化した。生成物を、逆相ＨＰＬＣ（カラム：２５０×２０ｍｍ ＹＭＣ ＯＤＳ−Ａ（５０×２０ガードカラム付）、移動相：８０％ メタノール：水で１５分間、その後に８５％で５分間、次いで８５％で２０分間保持、流速＝２０ｍＬ／分）によってクロマトグラフィ分析して、０．０８９ｇの生成物を得た（収率３１％、ｔＲ＝１２．６分、ＨＰＬＣの分析条件：カラム＝ＹＭＣ ＯＤＳ−Ａ Ｓ−３ １２０Å、移動相／勾配：９５％水（＋０．０２５％ギ酸）／アセトニトリル（＋０．０２５％ギ酸）から５％水で６分間、５％で９分間保持、流速＝０．３０ｍＬ／分）。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）：δ７．２５（ｍ，２Ｈ，Ｈ５７），６．９１（ｍ，２Ｈ，Ｈ５６），６．７９（ｍ，１Ｈ，Ｈ５８），５．４４（ｍ，１Ｈ，Ｈ２９），５．３５（ｍ，１Ｈ，Ｈ５），５．２４（ｍ，１Ｈ，Ｈ２５），５．１１（ｍ，１Ｈ，Ｈ２２），４．５０（ｍ，１Ｈ，Ｈ４），４．４２（ｍ，１Ｈ，１３−ＯＨ），４．００（ｍ，１Ｈ，Ｈ３１），３．８０（ｍ，１Ｈ，Ｈ９），３．７７（ｍ，１Ｈ，Ｈ３２），３．６７（ｍ，１Ｈ，Ｈ７），３．５７（ｍ，１Ｈ，３１−ＯＨ），３．４３（ｍ，１Ｈ，Ｈ２８），３．３５（ｍ，１Ｈ，Ｈ１８），３．３５（ｓ，３Ｈ，Ｍｅ５４），３．３４（ｍ，１Ｈ，Ｈ１），３．３２（ｍ，１Ｈ，Ｈ１８’），３．３２（ｓ，３Ｈ，Ｍｅ５３），３．２７（ｍ，１Ｈ，Ｈ４２），３．１６（ｍ，１Ｈ，Ｈ３４），３．０８（ｓ，３Ｈ，Ｍｅ５２），３．００（ｍ，１Ｈ，４２−ＯＨ），２．８７（ｍ，１Ｈ，Ｈ４１），２．７９（ｍ，１Ｈ，Ｈ２６），２．７１（ｍ，１Ｈ，Ｈ２６’），２．２９（ｍ，１Ｈ，Ｈ２１），２．１８（ｍ，１Ｈ，Ｈ３６），２．１０（ｍ，１Ｈ，Ｈ４０），１．９５（ｍ，１Ｈ，Ｈ３５），１．９５（ｍ，１Ｈ，Ｈ３７），１．８６（ｍ，１Ｈ，Ｈ４３），１．８５（ｍ，１Ｈ，Ｈ２），１．８５（ｍ，１Ｈ，Ｈ３），１．８２（ｍ，１Ｈ，Ｈ１２），１．７９（ｍ，１Ｈ，Ｈ２’），１．７７（ｍ，１Ｈ，Ｈ２０），１．７１（ｍ，１Ｈ，Ｈ８），１．６９（ｍ，１Ｈ，Ｈ１９），１．６８（ｍ，１Ｈ，Ｈ２１’），１．６６（ｓ，３Ｈ，Ｍｅ４８），１．６４（ｍ，１Ｈ，Ｈ４４），１．６３（ｍ，１Ｈ，Ｈ８’），１．６１（ｍ，１Ｈ，Ｈ１０），１．６０（ｍ，２Ｈ，Ｈ１１），１．５０（ｍ，１Ｈ，Ｍｅ４５），１．４６（ｍ，１Ｈ，Ｈ３’），１．４３（ｍ，１Ｈ，Ｈ１９’），１．３９（ｍ，１Ｈ，Ｈ２０），１．３９（ｍ，１Ｈ，Ｈ３９），１．３５（ｍ，１Ｈ，Ｈ１０’），１．２９（ｍ，１Ｈ，Ｈ３８），１．２６（ｍ，１Ｈ，Ｈ４３’），１．１３（ｄ，３Ｈ，Ｍｅ４７），１．１２（ｍ，１Ｈ，Ｈ３８’），１．０７（ｄ，３Ｈ，Ｍｅ４９），１．０３（ｍ，１Ｈ，Ｈ３５’），１．０３（ｄ，３Ｈ，Ｍｅ４６），１．００（ｍ，１Ｈ，Ｈ４４’），０．９７（ｄ，３Ｈ，Ｍｅ５０），０．９１（ｄ，３Ｈ，Ｍｅ５１），０．６６（ｍ，１Ｈ，Ｈ４０’）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）：δ２１６．１（ｓ，Ｃ３３），２１０．３（ｓ，Ｃ２７），１９８．３（ｓ，Ｃ１５），１７０．３（ｓ，Ｃ２３），１６８．３（ｓ，Ｃ１６），１４９．９（ｓ，Ｃ５５），１３９．９（ｓ，Ｃ３０），１３９．４（ｓ，Ｃ６），１３０．２（ｄ，Ｃ５７），１２９．４（ｄ，Ｃ５），１２８．１（ｄ，Ｃ２９），１１９．７（ｄ，Ｃ５８），１１４．２（ｄ，Ｃ５６），９８．４（ｓ，Ｃ１３），８８．５（ｄ，Ｃ３２），８５．４（ｄ，Ｃ４１），８５．０（ｄ，Ｃ７），７７．７（ｄ，Ｃ３１），７６．３（ｄ，Ｃ２５），７４．８（ｄ，Ｃ４２），７２．３（ｄ，Ｃ４），６８．５（ｄ，Ｃ９），６０．０（ｄ，Ｃ１），５９．２（ｑ，Ｃ５３），５７．１（ｑ，Ｃ５４），５６．０（ｑ，Ｃ５２），５２．０（ｄ，Ｃ２２），４６．５（ｄ，Ｃ２８），４５．１（ｔ，Ｃ１８），４２．７（ｄ，Ｃ３４），４２．１（ｔ，Ｃ２６），４０．８（ｔ，Ｃ３５），３９．１（ｔ，Ｃ３８），３８．３（ｔ，Ｃ８），３５．７（ｔ，Ｃ４０），３５．０（ｄ，Ｃ１２），３４．３（ｄ，Ｃ３７），３４．１（ｄ，Ｃ３９），３３．１（ｔ，Ｃ４３），３２．５（ｔ，Ｃ４４），３２．１（ｔ，Ｃ１０），３２．０（ｄ，Ｃ３６），２９．１（ｔ，Ｃ１１），２８．０（ｔ，Ｃ２１），２６．８（ｔ，Ｃ３），２５．９（ｔ，Ｃ１９），２１．７（ｔ，Ｃ２０），２０．６（ｔ，Ｃ２），１９．０（ｑ，Ｃ４９），１７．５（ｑ，Ｃ４７），１７．４（ｑ，Ｃ５０），１６．８（ｑ，Ｃ４６），１６．４（ｑ，Ｃ５１），１３．１（ｑ，Ｃ４８），１０．４（ｑ，Ｃ４５）；ＦＴ−ＩＣＲＭＳ（ｍ／ｚ）：Ｃ５７Ｈ８７Ｎ２Ｏ１４の［Ｍ＋Ｈ］＋計算値１０２３．６１５１９；実測値１０２３．６１７２２。
ラパマイシンアナログＩおよびＩＩの生物活性
方法
神経突起伸長の測定
皮質ニューロンを、２％パラホルムアルデヒドを使用して５分間固定し、その後に４％パラホルムアルデヒドで５分間固定した。細胞を、ブロッキング液（０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ＋１．５％正常ヤギ血清を含むＰＢＳ）中でインキュベートし、その後に一次抗体（抗神経クラスＩＩＩ β−チューブリン（ＴＵＪ１）（Ｃｏｖａｎｃｅ Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）および二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウス）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）とインキュベートした。各工程を、室温で１時間行った。各条件についての総神経突起伸長を、ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＨＣＳ Ｒｅａｄｅｒ（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）によるＮｅｕｒｏｎａｌ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｂｉｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎを使用して分析した。
ニューロンの生存アッセイ（神経フィラメントＥＬＩＳＡ）
培養物を、４％パラホルムアルデヒドにて３７℃で３０分間固定した。非特異的結合を、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＰＢＳとの４５分間のインキュベーションによってブロッキングした。次いで、培養物を、抗神経フィラメント（２００ｋＤ）モノクローナル抗体（１：１０００，クローンＲＴ−９７，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）と４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ抱合二次抗体（１：１０００，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を、２時間適用した。３回の洗浄後、ペルオキシダーゼ基質Ｋ−ＢｌｕｅＭａｘ（Ｎｅｏｇｅｎ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ；Ｙｏｕｎｇら，１９９９）を培養物に添加し、オービタルシェーカーにて１０分間インキュベートした。ペルオキシダーゼ基質は、Ｋ−ＢｌｕｅＭａｘ液中で高い溶解性を示す。次いで、光学密度を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｐｌｕｓ比色分析プレートリーダーを使用して、６５０ｎｍで容易に測定する。
免疫抑制アッセイ
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を、製造者の説明書どおりにＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）を使用した末梢血リンパ球からの負の選択によって精製した。Ｂｌａｉｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６０：１２，１９９８に記載のように、Ｔｏｓｙｌ活性化磁性ミクロスフィア（Ｄｙｎａｌ，Ｇｒｅａｔ Ｎｅｃｋ，ＮＹ）を、抗ＣＤ３ Ａｂ（１μｇ／１０７ミクロスフィア）および抗ＣＤ２８Ａｂ（０．５μｇ／１０７ミクロスフィア）でコーティングした。マウスＩｇＧを使用して、ミクロスフィアの結合能力を飽和した（総タンパク質＝５μｇ／１０７ミクロスフィア）。タンパク質コーティングミクロスフィアを、精製ＣＤ４＋Ｔ細胞（２×１０６細胞／ｍＬ、比１ビーズ：１細胞）に添加し、ＲＰＭＩ、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン培地中にて７２時間活性化した。Ｂｅｎｎｅｔｔら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：７１１，２００３に記載のように、細胞を回収し、洗浄し、新鮮な培地中で一晩培養し、ＩＬ−２で再刺激した。簡潔にのべれば、一晩静置した細胞を再計数し、平底９６ウェルマイクロタイタープレート中にプレートし（１０５細胞／ウェル）、漸増濃度の化合物の存在下にて１ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で刺激した。再刺激物の培養７２時間後、プレートを１μＣｉ／ウェルのトリチウム化チミジンをパルスし、６〜１６時間インキュベートした。
結果
上記のように、化合物のＦＫＢＰ結合部分がインタクトなままでｍＴＯＲとの相互作用を破壊するために、ラパマイシンアナログＩおよびＩＩを、Ｃ１，Ｃ３ジエンでのニトロソベンゼンとの［４＋２］付加環化反応を介してラパマイシンから調製した（図１Ａ）。化合物ＩＩは、１μＭまでのＩＬ−２刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の検出可能な阻害は認められなかった。これは、ラパマイシン（ＩＣ５０＝０．００５μＭ）と対照的であった。さらに、神経フィラメントＥＬＩＳＡによって測定したところ、化合物Ｉは、培養ラット皮質ニューロン（図１Ｂ）においてニューロンの生存を促進し、皮質ニューロン（図１Ｃ）およびＦ−１１細胞（図１Ｄ）の両方において神経突起伸長を促進することが見出された。重要なことには、１０および３０ｍｇ／ｋｇの化合物２は、虚血性卒中の一過性中心大脳（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｍｉｄ−ｃｅｒｅｂｒａｌ）動脈閉塞モデルにおける梗塞体積をそれぞれ２４％および２３％有意に減少させた（米国特許出願公開第０６／０１３５５４９号の実施例９を参照のこと）。これらの化合物の治療潜在性を考慮すると、これらの化合物の細胞標的を同定して、ニューロンの生存および神経突起伸長の促進におけるその役割を評価した。
（実施例２）
化学合成およびアフィニティマトリックスの調製
標的タンパク質を同定するために、ラパマイシンアナログＩ、ラパマイシンアナログＩＩ、およびメリダマイシンアナログを含むアフィニティマトリックスを、Ｆｒｅｔｚら（前出）によって公開された方法にしたがって、アミノ−フェニル−酪酸を介したＡｆｆｉ−Ｇｅｌ１０樹脂への化合物の結合（図２）によって調製した。簡潔にのべれば、ジアリルジカーボナート（１２００μＭ）を含むジオキサン：水（３：１；５０ｍｌ）での室温で３時間の処理によって、アミノ−フェニル−酪酸のアミノ基（１２００ｍｇ）を、アリルオキシカルボニル基で保護した。得られた４−（パラ−Ｎ−Ａｌｌｏｃ−アミノフェニル）ブタニルエステル（８０ｍｇ）の酸基を、ＰｈＯＰ（Ｏ）Ｃｌ２・ＤＭＦ複合体を含むＣＨ２Ｃｌ２（１ｍｌ）によって４℃で活性化し、ピリジン（９０μＭ）の存在下にてラパマイシンアナログＩ（８０ｍｇ）の４２−ヒドロキシル基と室温で３０分間反応させた。メタノールで反応を停止させ、エステル生成物を、ＨＰＬＣによって純度９９％に精製し、ＭＳおよびＮＭＲによって特徴づけた。Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（２ｍｇ）およびジメドン（ｄｉｍｅｄｏｎｅ）（７ｍｇ）を含むＴＨＦ（１．２ｍｌ）での処理によるエステル生成物（４０ｍｇ）のアリルオキシカルボニル基の除去後、生成物のアミノ基を、２％ピリジンを含むＴＨＦの存在下で、Ａｆｆｉｇｅｌ−１０マトリックス（４ｍｌ）に結合した。得られたＡｆｆｉ−Ｇｅｌ−ラパマイシンアナログＩアフィニティマトリックスを、エタノール、水、およびエタノールアミン・５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ８．０）緩衝液で洗浄し、４０％エタノール中に保存した。
類似のアプローチを使用して、ラパマイシンアナログＩＩ、米国特許出願公開第２００５／０１９７３７９号に化合物Ｉとして開示のメリダマイシンアナログ、ＦＫ５０６、およびラパマイシンを含むアフィニティマトリックスを調製した。
（実施例３）
標的タンパク質のアフィニティ沈殿
実施例２で調製したマトリックスを使用して、Ｆ−１１（ラット脊髄後根神経節ニューロン（ＤＲＧ）とマウス神経芽細胞腫とのハイブリッド）細胞（Ｐｌａｔｉｋａ，Ｄ．ら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２：３４９９−３５０３）の溶解物から標的タンパク質を沈殿させた。
実験Ａ
Ｆ１１細胞を、７５ｃｍ２の通気フラスコ中の培養培地（１０％ＦＢＳおよび１％ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補足したＤＭＥＭ）中にて、５％ＣＯ２を含む３７℃インキュベーター中で成長させた。細胞を８０％コンフルエンスで回収し、ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。溶解緩衝液（６ｍｌ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０（ＮＰ４０）、０．１％メルカプトエタノール、および２％プロテアーゼインヒビターカクテル）を１０９細胞に添加した。２６ゲージニードルを強制的に通過させることによって細胞を破壊し、４℃で１５分間の遠心分離後にＳ−１００上清を回収した。アリコート（２ｍｌ）をアフィニティビーズ（１００〜１５０μｌ；Ａｆｆｉｇｅｌ１０、Ａｆｆｉｇｅｌ１０−ＦＫ５０６、およびＡｆｆｉｇｅｌ１０−ラパマイシンアナログＩなど）と４℃で一晩混合した。溶解緩衝液（２ｍｌ）およびその後のＰＢＳ（２ｍｌ）での洗浄後、ビーズを４〜２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。図２は、以下のレーンを示す：Ｆ１１細胞の溶解物、ブランク（タンパク質は、Ａｆｆｉｇｅｌ−１０ビーズに結合する）、ＦＫ５０６（タンパク質は、Ａｆｆｉｇｅｌ−１０−ＦＫ５０６ビーズに結合する）、ラパマイシンアナログＩＩ（タンパク質は、Ａｆｆｉｇｅｌ−１０−ラパマイシンアナログＩビーズに結合する）、マーカー（タンパク質標準）。タンパク質バンド（図３）を切り出し、トリプシン（０．３μｇ）を含む消化緩衝液（３０μｌ；０．２％ ＮＨ４ＨＣＯ３）にて３０℃で一晩消化した。得られたペプチドを、Ｃ１８樹脂で精製し、ＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ分析に供した。ＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳデータを手作業で編集し、これを使用して、タンパク質データベースを検索した。結果を図４に示し、以下のスコアを有する。ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ５２）（Ｐ３０４１６，スコア：９４，予測：９．６ｅ−０５）；５９ｋＤａバンドのＭＳデータ：２７５３．３５；１７１０．９４；２２１５．１３；２３６３．１５；１２９８．７１；１２１５．５９；１０００．５１；１０００．４６；１７９０．９３；１３８１．７０；２７４６．３６；１３１６．７１；および１１７１．６０。電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルβ１サブユニット（Ｑ８Ｒ３Ｚ５−０３−００−００，スコア：１３３，予測：１ｅ−０９）；５２ｋＤａバンドのＭＳデータ：６５１．３８；６６３．３９；７７９．５４；８５３．５５；１０１４．５０；１３４７．７５；１２１７．７８；１３４６．６７；１２９７．７５；１２３１．７７；８７７．５２；８５３．４７；９１９．４８；１０１４．５６；１０４１．６３；１２１７．７４；１２３１．７４；１２９６．８４；８６９．５８（主要）。
約６０ｋＤａのハンドの１３のフラグメントは、ＦＫＢＰ５２タンパク質の部分配列と９．６ｅ−５のｐ値で適合し、約５０ｋＤａのバンドの１９のフラグメントは、電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニット（ＣＡＣＢ１）の部分配列と適合した。他の副成分は、骨格タンパク質（アクチンおよびミオシン）であった。したがって、イムノフィリンＦＫＢＰ５２およびＣＡＣＢ１を、ラパマイシンアナログＩの結合候補と同定した。
実験Ｂ
別の実験では、Ｆ１１細胞を、７５ｃｍ２の通気フラスコ中の培養培地（１０％ＦＢＳおよび１％ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補足したＤＭＥＭ）中にて、５％ＣＯ２を含む３７℃インキュベーター中で成長させた。細胞を８０％コンフルエンスで回収し、ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。３×１０８細胞に、溶解緩衝液（２ｍｌ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、０．１％メルカプトエタノール、および２％プロテアーゼインヒビターカクテル）を添加し、４℃で１５分間の遠心分離後にそのＳ−１００上清を回収した。アリコート（２ｍｌ）をアフィニティビーズ（１００〜１５０μｌ）と４℃でインキュベートした。溶解緩衝液（２ｍｌ）およびその後のＰＢＳ緩衝液（２ｍｌ）での洗浄後、ビーズをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質バンドを切り出し、トリプシン（０．３μｇ）を含む消化緩衝液（３０μｌ；０．２％ ＮＨ４ＨＣＯ３）にて３０℃で消化した。得られたペプチド（２μｌ）を、ＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳのナノエレクトロスプレーのチップにロードし、１％ギ酸を含むメタノール（２μｌ）と混合した。約−８００Ｖの高電位を、ナノエレクトロスプレーのチップとガラス製毛細管との間に印加した。得られた質量スペクトルデータを、ＨＰチューニングミックスを使用して外部較正し、ＮＣＢＩタンパク質データベースにおけるＭａｓｃｏｔ検索のために使用した。妥当なタンパク質候補を、信頼スコア（ｐ値）に基づいて選択した。ウェスタン分析のために、沈殿したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、エレクトロブロッティング（１００Ｖ、１時間）によってＰＶＤＦ膜に移し、抗ＣＡＣＮＢ１抗体または抗ＦＫＢＰ４抗体で免疫ブロッティングし、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）染色によって視覚化した。
結果
図５Ａに示すように、３つの強いバンド（２２０ｋＤａ、６０ｋＤａ、および５０ｋＤａ）および２つの非常に弱いバンド（２５ｋＤａおよび１２ｋＤａ）が、ラパマイシンアナログＩおよびＩＩ両方のプルダウン画分中に見出された。各バンドのＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳスペクトルを、ＮＣＢＩデータベースでのＭａｓｃｏｔ検索のために使用した（以下の表１を参照のこと）。ＦＫＢＰ５２（Ｇｏｌｄ，Ｂ．Ｇ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．３１，６４９−６６３（１９９９））および電位開口型Ｌ型カルシウムチャネル（ＶＧＣＣ）のβ１サブユニット（ＣＡＣＮＢ１）（Ｏｐａｔｏｗｓｋｙ，Ｙ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ ４２，３８７−３９９（２００４）。電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットの機能的コアおよびα１相互作用ドメインとのその複合体の構造分析をラパマイシンアナログＩおよびＩＩの主な標的として同定し、その存在を、ウェスタン分析（図５Ｂ）によって確認した。ＦＫＢＰ２５およびＦＫＢＰ１２が弱いバンド中で同定されたのに対して、ミオシンおよびアクチンが全ての画分で見出された。これは、樹脂への非特異的結合を示す。
（実施例４）
ウェスタン分析および動態解析による沈殿標識の特徴づけ
方法
組換え遺伝子のクローニングおよび発現ならびに結合アッセイ
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が開発したＧａｔｅｗａｙクローニング法を使用して、ｃａｃｎｂ１／ＣＡＣＮＢ１遺伝子、ｃａｃｎｂ４／ＣＡＣＮＢ４遺伝子、ｆｋｂｐ３／ＦＫＢＰ２５遺伝子、ｆｋｂｐ４／ＦＫＢＰ５２遺伝子、ｐｐｉｄ遺伝子、ｐｐｉｆ遺伝子、およびｆｋｂｐ８／ＦＫＢＰ３８遺伝子を、ｐＤＥＳＴ１７（Ｎ−Ｈｉｓ６タグ）ベクターにクローン化した。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、Ｈｉｓ６−ＣＡＣＮＢ１：ＴＧＧ５４８ＴＡＡをｐＤＥＳＴ１７−ＣＡＣＮＢ１から生成した。Ｈｉｓ６タグ化タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によってタンパク質は９５％を超える純度を示し、これをそのまま使用した。２ｍＭ Ｃａ２＋および５μＭ ＣａＭの存在下でＦＫＢＰ３８を試験した（Ｅｄｌｉｃｈ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１，１４９６１−１４９７０（２００６）。ラパマイシンアナログＩＩへの結合を、ブランクＡｆｆｉ−Ｇｅｌ １０ビーズと比較したラパマイシンアナログＩＩマトリックス上に保持したタンパク質量に基づいて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定した。３７℃での各精製タンパク質（１０μＭ）の［１４Ｃ］−ラパマイシンアナログＩ（１０μＭ、２４１Ｃｉ／ｍｏｌ）との反応後、ラパマイシンアナログＩの結合を、ＴｏｐＴｉｐ Ｐ−４カラムによってタンパク質と同時溶離した１４Ｃ放射能の定量によって測定した。ラパマイシンアナログＩによって誘導されたタンパク質蛍光消光を、ラパマイシンアナログＩ（１μＭ）でのＨｉｓ６−ＣＡＣＮＢ１：ＴＧＧ５４８ＴＡＡタンパク質（０〜８μＭ）の滴定によって測定した。
動態分析
Ｈｉｓ６タグ化されたＦＫＢＰ１２タンパク質およびＦＫＢＰ５２タンパク質へのイムノフィリンリガンドの結合を、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、（０〜１０μＭ）イムノフィリンリガンド、３ｎＭ［３Ｈ］−ＦＫ５０６（８７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、および（５ｎＭ）酵素を含む０．１ｍｌ反応混合物中のＮｉキレート化ＦＬＡＳＨプレート上に保持された３Ｈ ＦＫ５０６の定量によって測定した。反応を、三連で２５℃にて３０分間行った。Ｋｄを、Ｃａｒｒｅｒａｓ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９８、５７−６１（２００１））に記載の方法を使用して計算した。
本明細書中に記載の実施例で使用した以下の材料を、以下の市販業者から入手した。抗体をＡｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から入手した。培地、ヒトＯＲＦクローン（ｃａｃｎｂ１、ｃａｃｎｂ４、ｆｋｂｐ３、ｆｋｂｐ４、ｆｋｂｐ８、ｐｐｉＦ、およびｐｐｉＤ）、プラスミド（ｐＤＥＳＴ１７）、およびＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標）システムを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手した。タンパク質精製キットを、Ｐｉｅｒｅｓ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）またはＱｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）から入手した。ＴＯＰＴｉｐ Ｐ−４カラムを、Ｇｌｙｇｅｎ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）から入手した。Ｎｉキレート化Ｆｌａｓｈプレートおよび［３Ｈ］−ＦＫ５０６を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から入手した。ＰＣＲ試薬およびＡｆｆｉ−Ｇｅｌ １０を、ＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）から入手した。ラットゲノム２３０ ２．０ ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）を、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（登録商標）（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）から入手した。ＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ分析を、能動的に遮蔽された９．４ Ｔｅｓｌａ超伝導磁石（Ｍａｇｎｅｘ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ．，ＵＫ）およびＢｒｕｋｅｒ ＡＰＯＬＬＯ ＥＳＩ外部電源を備えたＢｒｕｋｅｒ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）ＡＰＥＸＩＩ ＦＴ−ＩＣＲ 質量分析計で行った。
結果
表２は、ＦＫ５０６およびラパマイシンの両方が類似の親和性（それぞれ、Ｋｄ（ＦＫＢＰ１２）／Ｋｄ（ＦＫＢＰ５２）＝０．４６および０．２３）でＦＫＢＰ１２およびＦＫＢＰ５２に結合することを示す。対照的に、化合物２は、ＦＫＢＰ１２と比較してＦＫＢＰ５２結合に顕著な優先性を示した（Ｋｄ（ＦＫＢＰ１２）／Ｋｄ（ＦＫＢＰ５２）＝２２９）。化合物２はラパマイシンと同一のＦＫＢＰ結合のためのピペコリン酸部分を有し、修飾部位が離れているので、これは予想外である。Ｘ線構造は、ＦＫＢＰ５２およびＦＫＢＰ１２のイソメラーゼドメインが非常に類似しており（Ｗｕら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１０１，８３４８−５３（２００４）、その活性部位残基の配列アラインメントがたった１つのアミノ酸の相違しか示さなかった（ＦＫＢＰ１２中のＨｉｓ８７対ＦＫＢＰ５２中のＳｅｒ１１８）（Ｄｏｒｎａｎら，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３，１３９２−１４０９（２００３））ことを示した。ラパマイシンおよびそのアナログは、アミド結合についての回転のために主要なおよび微量の溶液配座異性体（ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｆｏｒｍｅｒ）の組として存在することが公知である（Ｋｅｓｓｌｅｒら，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７６，１１７−１３０（１９９３））。さらなるＮＯ−フェニル部分は、マクロラクトン配座異性体の大域的集団全体に影響を及ぼし、それにより、イムノフィリン選択性に影響を及ぼす。この所見は、化合物２に対する結合親和性の劇的相違と一致するようであり、それに対して（ｔｏｗａｒｄｓ）、異なるが依然として相同なイムノフィリンがＦＫＢＰ２５について報告されたラパマイシンとＦＫ５０６との間の結合親和性の劇的相違と一致するようである（Ｇａｌａｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１，２４２７−２４３４（１９９２））。これは、特定のＦＫＢＰへの結合を増強するラパマイシンに対する非足場修飾を示す。
イムノフィリンおよび関連するシクロフィリンに対する化合物の特異性をさらに立証するために、化合物１および化合物２の精製組換えＦＫＢＰ２５、ＦＫＢＰ３８、シクロフィリンＦ（ＰＰＩＤ）、シクロフィリンＤ（ＰＰＩＦ）への結合を測定した。卒中モデルでその重要性が報告されているので、これらの標的を化合物２のｉｎ ｖｉｖｏ活性を考慮して選択した（以下参照）。（Ｅｄｌｉｃｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１，１４９６１−１４９７０（２００６）；Ｂａｉｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ４３４，６５８−６６２（２００５）；Ｅｄｌｉｃｈら，ＥＭＢＯ Ｊ．２４，２６８８−２６９９（２００５））。種々の推定標的への［１４Ｃ］−１の結合の結果を、図５Ｃに示す。濃度１０μＭで、［１４Ｃ］−１はＦＫＢＰと十分に結合し、ＰＰＩＤと弱く結合し、ＰＰＩＦおよびＦＫＢＰ３８／Ｃａ２＋／ＣａＭとわずかに結合する。化合物２はまた、類似の選択性プロフィールでＦＫＢＰ５２、ＦＫＢＰ２５、およびＦＫＢＰ１２と結合する（図５Ｄ、表２）。
アフィニティ精製で同定し、ウェスタン分析によって確認した他の主な結合タンパク質（図６Ａ）（ＣＡＣＮＢ１）は、一次ニューロン中のＬ型Ｃａ２＋チャネルに関連するβサブユニットの１つである。化合物１および２の結合パートナーとしてのこの特異的サブユニットをさらに立証するために、ＶＧＣＣおよびＣ末端短縮ＣＡＣＮＢ１のβ４サブユニット（ＣＡＣＮＢ４）への結合を決定した（図６Ｂ）。組換えＨｉｓ６−ＣＡＣＮＢ１：ＴＧＧ５４８ＴＡＡタンパク質を、ＣＡＣＮＢ１からの５１個のＣ末端残基の除去によって調製した。ＣＡＣＮＢ１に対するその配列相同性のために、全長ＣＡＣＮＢ４への結合も試験した（Ｏｐａｔｏｗｓｋｙ，Ｙ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ ４２，３８７−３９９（２００４））。濃度１０μＭで、［１４Ｃ］−化合物１は、変異Ｈｉｓ６−ＣＡＣＮＢ１：ＴＧＧ５４８ＴＡＡと弱く結合し、ＣＡＣＮＢ４とわずかに結合した。化合物１のＨｉｓ６−ＣＡＣＮＢ１：ＴＧＧ５４８ＴＡＡ変異体への結合をさらに確認するために、本発明者らは、化合物１によって誘導されるタンパク質蛍光の消光を測定した。図６Ｃは、化合物１のＣＡＣＮＢ１への結合を示す線形用量応答曲線を示す。化合物２はまた、類似の選択性プロフィールでＣＡＣＮＢ１に結合する（図６Ｄ）。
薬物標的またはラパマイシンアナログＩの結合候補（イムノフィリンＦＫＢＰ５２およびＣＡＣＢ１）の存在も、対応する抗体を使用したウェスタンブロッティングによって確認した。アフィニティビーズ上のタンパク質を、４〜２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分離し、１００Ｖで１時間、ＰＶＤＦ膜に移した。膜を、ブロッキング液、一次抗体（抗ＦＫＢＰ５２または抗Ｃａ２＋チャネル−β１サブユニット抗体；２００倍希釈）、および二次抗体（ペルオキシダーゼ抱合抗ウサギＩｇＧ抗体；１０００倍希釈）を使用してブロッティングした。図８に示すように、標的タンパク質の存在を、ＴＭＢ染色後に視覚化した。
ウェスタン分析は、両タンパク質のラパマイシンアナログＩへの結合を証明したが、ブランクビーズへの結合を示さなかった。ＦＫＢＰ５２は、ラパマイシンアナログＩビーズおよびＦＫ５０６ビーズの画分中に検出されたが、ブランクビーズ中に検出されなかった。電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルβ１サブユニットは、ラパマイシンアナログＩビーズ画分中のみで検出された。これは、ラパマイシンアナログＩがＦＫＢＰ５２および電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットに特異的に結合することを示す。
（実施例５）
新規の複合体であるＦＫＢＰ５２−ラパマイシンアナログ１−Ｃａ２＋チャネルβ１サブユニットの形成
共免疫沈降を使用して、ＦＫＢＰ５２、ラパマイシンアナログＩ、および電位開口型カルシウムチャネルβ１サブユニットの間の複合体形成を調査した。簡潔にのべれば、Ｆ１１細胞溶解物のアリコート（１．８ｍｌ）を、０、５、および５０μＭのラパマイシンアナログＩとそれぞれ４℃で５時間混合した。抗ＦＫＢＰ５２抗体を、２００倍希釈で各アリコートに添加し、４℃で５時間インキュベートした。次いで、プロテインＡビーズ（５０〜１００μＭ）を添加して、抗ＦＫＢＰ５２抗体会合複合体を沈殿させた。ビーズ上に免疫沈降したタンパク質をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、４〜２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ＰＶＤＦに移し、抗Ｃａ２＋チャネルβ１サブユニット抗体（５００倍希釈）で免疫ブロットしてβ１サブユニットを検出した。
結果
結果を図７に示す。Ｃａ２＋チャネルβ１サブユニットは、ラパマイシンアナログＩの非存在下でＦＫＢＰ５２と共に沈降しなかった。これは、Ｃａ２＋チャネルβ１サブユニットがＦＫＢＰ５２と会合しないことを示す。ラパマイシンアナログＩ（５μＭ）の存在下で、大量のＣａ２＋チャネルβ１サブユニットはＦＫＢＰ５２と共免疫沈降し、複合体形成を示す。しかし、過剰量のラパマイシンアナログＩ（５０μＭ）はβ１サブユニットの沈降量を減少させ、より少量の複合体形成を示す。これは、限られた量の溶解物中のＦＫＢＰ５２およびβ１サブユニットの両方の化合物結合部位の飽和に起因し得る。
（実施例６）
複合体形成は神経突起伸長と相関する
神経フィラメントＥＬＩＳＡを使用して、ラパマイシンアナログＩの非存在下または存在下で成長したＦ１１細胞の神経突起伸長を測定した。簡潔にのべれば、Ｆ１１細胞を、１０％ ＦＢＳ、１％ ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、およびラパマイシンアナログＩ（０、５、または５０μＭ）を補足したＤＭＥＭ中で９６時間成長させた。細胞を、４％パラホルムアルデヒドにて３７℃で３０分間固定した。非特異的結合を、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＰＢＳとの４５分間のインキュベーションによってブロッキングした。次いで、培養物を、抗神経フィラメント（２００ｋＤ）モノクローナル抗体（１０００倍）と４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ抱合抗マウス二次抗体（１０００倍）を２時間適用した。３回の洗浄後、ペルオキシダーゼ基質Ｋ−ＢｌｕｅＭａｘを培養物に添加し、１０分間インキュベートした。６５０ｎｍの光学密度を測定した。
結果
結果を図８に示す。５μＭラパマイシンアナログＩで処置した細胞は、５０μＭラパマイシンアナログＩまたは無化合物コントロールで処置した細胞より神経フィラメント含有量が４〜５倍であり、５μＭラパマイシンアナログＩでの強い神経突起伸長を示す。これは、同一濃度のラパマイシンアナログＩの存在下での複合体形成と直接相関した。
（実施例７）
ラパマイシンアナログでの処置後のＦ−１１細胞中のカルシウムチャネルの電気生理学的性質の評価
方法。ホールセルのパッチクランプ記録
パッチクランプ技術のホールセル記録を使用し、ＨＥＫＡ（Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の取得および分析プログラムＰｕｌｓｅ−ＰｕｌｓｅＦｉｔを備えたＥＰＣ−９増幅器（ＨＥＫＡ，Ｉｎｓｔｒｕｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．）を使用して、室温で細胞からカルシウム電流を記録した。電極を、Ｐ−８７プラー（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用して組み立てた。電極は、記録液（１４０ｍＭ ＣｓＣｌ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２Ｍ ＡＴＰ、１ｍＭ ｃＡＭＰ、ｐＨ７．２）を充填した場合に、２〜５ＭΩの抵抗を示した。標準的なバス記録液は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭデキストロース、および４ｍＭ ＢａＣｌ２を含む無Ｃａ２＋およびＭｇ２＋ ＨＢＳＳ（ｐＨ ７．４）である。電流を３ｋＨｚでフィルタリングし、内向きＣａ２＋電流を、−８０ｍＶ〜６０ｍＶで５０ｍｓの１０ｍＶ脱分極工程を使用して、−９０ｍＶに保持した細胞から記録した。
結果
ＣＡＣＮＢ１は、一次ニューロン中のＬ型Ｃａ２＋チャネルに会合するβサブユニットの１つである（Ｐｉｃｈｌｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１３８７７−１３８８２（１９９７））。β１ｂ、β３、およびβ４サブユニットはＬ型Ｃａ２＋チャネル流を増強することが公知であるのに対して、β２サブユニットは負の役割を果たす（Ｏｐａｔｏｗｓｋｙら，Ｎｅｕｒｏｎ ４２，３８７−３９９（２００４）；Ｓｃｈｊｏｔｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，３３９３６−３３９４２（２００３））。本発明者らのラパログのβ１ｂサブユニットへの結合がこのサブユニットの機能を阻害する場合、Ｌ型Ｃａ２＋流が減少すると予想される。したがって、ラパマイシンアナログ１での処置後のＦ−１１細胞中のＣａ２＋チャネルの電気生理学的性質を測定した。
Ｆ−１１細胞中で記録したホールセルＣａ２＋流は、短期間（１０分間の適用；この時間内でＦＫ５０６はＣａ２＋流を阻害した）の化合物１のバス適用によって影響を受けないので、細胞を、５μＭの化合物１に２時間暴露し、ビヒクル処置コントロールと比較した。この処置パラダイムにより、細胞中で検出されたＣａ２＋流が非常に減少し、電流密度が６．５＋／−０．５ｐＡ／ｐＦから３．２＋／−０．３ｐＡ／ｐＦに減少した（４９％減少）（図９Ａ）。Ｃａ２＋流に対するカルシニューリン依存性作用について記載されているように（（Ｙａｓｕｔｓｕｎｅら，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １２６（３），７１７−７２９（１９９９）；Ｆａｕｃｏｎｎｉｅｒ，Ｊ．ら，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８８，Ｈ７７８−Ｈ７８６（２００５））、ＦＫ５０６はまた、Ｃａ２＋流に対して類似の影響を及ぼすことが見出された（電流は２．９＋／−０．１ｐＡ／ｐＦに減少した（５５％減少））。巨大なサイズの化合物１と組み合わせて、これは、その後の実験のために、記録パッチピペットによって化合物を細胞内に直接添加することが必要である。
ホールセル記録の実施時（時間０）に開始する細胞への拡散を介した化合物１の内部適用により、Ｃａ２＋流が即座に阻害され、数分以内に定常状態の電流遮断レベルに到達した。興味深いことに、Ｆ−１１における化合物の影響は非常に多様であるが、ＤＲＧ細胞と神経芽細胞腫細胞とのハイブリッドとして、Ｎ型およびＬ型Ｃａ２＋チャネルの発現プロフィールは、各Ｆ−１１細胞間で異なることが公知である（Ｂｏｌａｎｄ，Ｌ Ｍ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ４２０，２２３−２４５（１９９０））。ＢＡＹ−Ｋ５５５２（Ｌ型遮断薬）での阻害によって決定したところ、いくつかの細胞（図９Ｃ）がＬ型Ｃａ２＋チャネルを主に含んでおり、他（図９Ｄ）は、ωＣＴＸ ＭＶＩＩＡ（Ｎ型遮断薬）によって阻害されるＮ型チャネルを主に含んでいた。図９Ｃは、ＢＡＹ−Ｋ５５５２に応答する細胞中で化合物１での処置によってＣａ２＋流が減少する一方で、図９Ｄは化合物１に応答しない細胞がどのようにしてωＣＴＸ ＭＶＩＩＡに感受性を示すＣａ２＋流を含むのかを示す。前者の場合、化合物１（１０μＭ）の内部適用により、１０分以内にＣａ２＋流が平均４６＋／−１．８％減少した（図９Ｃ）。ωＣＴＸ ＭＶＩＩＡに有意に応答する細胞では、有意な電流の減少は見出されなかった（図９Ｄ）。Ｃａ２＋流に及ぼすパラログの影響のさらなる立証を、培養ラット海馬ニューロンに対して行った。Ｎ型Ｃａ２＋チャネルを遮断し、化合物２（１０μＭ）を内部ピペット液に添加した場合、電流は１０分後に７４．５＋／−８．８までゆっくり阻害された（図９Ｅ，Ｆ）。Ｎ型およびＬ型Ｃａ２＋チャネルの遮断によって細胞中の残存する電流の阻害が２１．３＋／−４．４％にしか減少しなかったので（図９Ｆ）、この影響は、少なくとも一部はＬ型チャネルの阻害に起因した。
（実施例８）
ラパマイシンアナログでの処置後の転写プロファイリング
方法
転写プロファイリング
皮質ニューロン培養物を、Ｅ１６ラット胚から調製した。プレーティング２４時間後、培養物を、１０μＭイムノフィリンリガンドおよび対応するビヒクルで処置した。処置４時間後、１２時間後、２４時間後、および４８時間後、細胞を溶解した。各サンプル由来の総ＲＮＡを、ＲＮＥＡＳＹ（登録商標）ミニキット（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））で抽出した。二本鎖ｃＤＮＡを、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標）システム（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標））を使用して２μｇの各ＲＮＡサンプルから合成し、精製し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写して、ビオチン標識ＵＴＰおよびＣＴＰの存在下でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用してビオチン化ｃＲＮＡを調製した。製造者が推奨するように、断片化ｃＲＮＡを、ラットゲノム２３０ ２．０ ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）（ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（登録商標）、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）とハイブリッド形成した。ハイブリッド形成したアレイを、製造者のプロトコールにしたがってＦｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４５０で染色し、その後にＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（登録商標）スキャナ３０００でスキャンした。ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（登録商標）ＭＡＳ ５．０ソフトウェアを使用して、生データを作成した。転写プロファイリングデータを、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙで分析した。
結果
ラパマイシンアナログ結合の下流の結果をさらに分析するために、１０μＭのラパマイシンアナログＩまたはＩＩで処置したラット皮質ニューロン培養物の転写プロファイリングデータを得た。
転写プロファイリングにより、ラパマイシンアナログＩまたはＩＩ処置後のＣａ２＋シグナル伝達経路の全下方制御が明らかとなった（表３Ａを参照のこと）。ラパマイシンアナログＩにより、主な原形質膜Ｃａ２＋流入チャネル（ＶＧＣＣ、一過性受容器電位チャネル、グルタミン酸受容体のＮ−メチルＤ−アスパラギン酸サブタイプ（ＮＭＤＡ）、およびＳＨＴ３Ｒチャネルなど）が下方制御された。これらのチャネルのうち、ＮＭＤＡチャネルを介したＣａ２＋流入は、アポトーシスを誘導する主な事象である（Ｇｈｏｓｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８，２３９−２４７（１９９５））。ＮＭＤＡペプチドを切断してＣａ２＋流入を活性化することが公知のプラスミノゲンアクチベーター（ＰＬＡＵ）（Ｔｒａｙｎｅｌｉｓら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７，１７−１８（２００１））が有意に下方制御された（ラパマイシンアナログＩによって−４０倍、ラパマイシンアナログＩＩによって−１０倍）。これは、ＮＭＤＡチャネルを介したＣａ２＋流入が減少する可能性が高い。また、ＩＰ３受容体の下方制御によって内部貯蔵からのＣａ２＋放出が減少し得、カルモジュリンおよびカルモジュリンキナーゼの下方制御（例えば、ＰＮＣＫ、−２０倍）によってサイトゾルＣａ２＋シグナル伝達が減少するであろう。ニューロンのＣａ２＋の過剰負荷は、一般に、最終的にニューロンの死滅を誘導するＣａ２＋依存性過程を誘発する重要な事象と見なされているので、認められたＣａ２＋流入およびＣａ２＋シグナル伝達経路の減衰は、卒中および外傷性脳損傷の処置に重要であり得る（Ｇｈｏｓｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８，２３９−２４７（１９９５））。さらに、細胞Ｃａ２＋レベルの低下は、Ｂｃｌ２のＦＫＢＰ３８／Ｃａ２＋／ＣａＭ活性化（Ｅｄｌｉｃｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１，１４９６１−１４９７０（２００６））またはＰＰＩＤ関連ミトコンドリア膜透過性遷移孔（Ｂａｉｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ４３４，６５８−６６２（２００５））によってアポトーシスを抑制させることができる。
コレステロール生合成遺伝子の有意な上方制御（例えば、ＬＳ、＋１３倍）が認められ、これは、ステロイド受容体の活性化を示した（Ｗａｎｇら，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４７，７７８−７８６（２００６））（表３Ｂを参照のこと）。ＦＫ５０６、ステロイドホルモン、またはゲルダナマイシンによるステロイド受容体の活性化が神経突起伸長を刺激することが報告されているので、ラパマイシンアナログＩおよびＩＩのＦＫＢＰ５２への結合により、ステロイド受容体を活性化し、神経突起伸長を促進する可能性がある。
（実施例１０）
電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットの減少が神経突起伸長を刺激する。
ＲＮＡｉテクノロジーを使用して、ＣＡＣＢ１（Ｃａ２＋チャネルβ１サブユニット）およびＦＫＢＰ４（ＦＫＢＰ５２）遺伝子の転写レベルを減少させ、成長表現型によって生物学的影響を試験した。
方法
ニューロン培養物
簡潔にのべれば、皮質ニューロン培養物を、胎生期１５日目（Ｅ１５）のラット胚（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から調製した。胚を回収し、その脳を取り出し、皮質を、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まない氷冷リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で解剖した。解剖した皮質組織片を共にプールし、２０ＩＵ／ｍｌパパインを含むＥａｒｌｅ平衡塩類溶液（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ）を含む酵素解離培地に移し、３７℃で３０分間インキュベートした。酵素解離後、パパイン溶液を吸引し、先端熱加工したパスツールピペットを使用して、２，０００ＩＵ／ｍｌ ＤＮアーゼおよび１０−ｍｇ／ｍｌオボムコイドプロテアーゼインヒビターを含む完全培地（Ｂ−２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、３．３μｇ／ｍｌアフィディコリン、０．５ｍＭグルタミン酸塩を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地）で組織を機械的に砕いた（ｔｒｉｔｕｒａｔｅ）。
一次皮質ニューロンへのｓｉＲＮＡの一過性トランスフェクション
各条件について、５×１０５個の皮質ニューロンを、９６ウェルシャトル（ａｍａｘａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）上にてプログラムＤＣ−１０４を使用して、２００ｎｇのｓｉＧＬＯラミンＡ／Ｃ ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ ＲＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）、Ｌ型カルシウムチャネルβ１サブユニットｓｉＲＮＡ（ＧＧＡＧＡＡＧＵＡＣＡＡＵＡＡＵＧＡＣＴＴ（配列番号１５）（センス）、およびＧＵＣＡＵＵＡＵＵＧＵＡＣＵＵＣＵＣＣＴＴ（配列番号１６）（アンチセンス））、またはＦＫＢＰ４ ｓｉＲＮＡ（ＣＣＵＡＧＣＵＡＵＧＣＵＵＵＵＧＧＣＡＴＴ（配列番号１７）（センス）およびＵＧＣＣＡＡＡＧＣＡＵＡＧＣＵＡＧＧＴＴ（配列番号１８）（アンチセンス）（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）でトランスフェクトした。各トランスフェクション反応由来の２５μｌを、ポリ−Ｄ−リジンコーティング９６ウェル（実験あたり４ウェル）に添加した。トランスフェクトした皮質ニューロンを、培養物中で２４時間維持した。
ウェスタンブロッティング
スクランブルしたｓｉＲＮＡ、ラミンＡ／Ｃ、ＣＡＣＮＢ１、またはＦＫＢＰ５２ ｓｉＲＮＡで処置した皮質ニューロンを、プロテアーゼインヒビターカクテルおよびホスファターゼインヒビターを含むＲＩＰＡ緩衝液中で溶解し、タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して測定した。条件あたり２μｇのタンパク質を各ウェルにロードし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。タンパク質をニトロセルロースに移し、ラミンＡ／Ｃ（Ｕｐｓｔａｔｅ）、ＣＡＣＮＢ１（ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、またはＦＫＢＰ５２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）に対する抗体およびローディングコントロールとしてのアクチン（Ｓｉｇｍａ）とインキュベートした。バンドを発色させ、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線画像化システムおよびＯｄｙｓｓｅｙソフトウェア（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）を使用して定量した。タンパク質発現ノックダウンを、スクランブルしたｓｉＲＮＡ発現の比率としてのアクチンに対する比として計算した。
結果
ラパマイシンアナログＩまたはＩＩによるＦＫＢＰ５２およびＣＡＣＮＢ１の両方の阻害が神経突起伸長およびニューロンの生存に寄与することをさらに証明するために、本発明者らは、ラット皮質ニューロンを、ラミンＡ／Ｃ（コントロールとしての機能を果たすため）、ＦＫＢＰ５２、ＣＡＣＮＢ１、またはＦＫＢＰ５２＋ＣＡＣＮＢ１に対するｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、２４時間後に総神経突起伸長を測定した。コントロールと比較した総神経突起伸長は、ＣＡＣＮＢ１ ｓｉＲＮＡ処置ニューロンで本質的に不変であったが、ＦＫＢＰ５２ ｓｉＲＮＡ−（コントロールの１２５±１２％）およびＦＫＢＰ５２＋ＣＡＣＮＢ１ ｓｉＲＮＡ処置（コントロールの１２６±１４％）ニューロンで有意に増加し（図１０Ａ）、ＦＫＢＰ５２の阻害が神経突起伸長を刺激することを示した。並行して、本発明者らは、ＥＬＩＳＡアッセイによってニューロンの生存に及ぼすｓｉＲＮＡの影響を評価して、神経フィラメント発現を定量した。コントロールと比較したニューロンの生存の比率は、ＣＡＣＮＢ１ ｓｉＲＮＡ処置細胞で減少し（コントロールの８０±３％）、ＦＫＢＰ５２ ｓｉＲＮＡ処置細胞で中等度に増加し（コントロールの１１２±２％）、ＦＫＢＰ５２＋ＣＡＣＮＢ１ ｓｉＲＮＡ処置細胞で有意に増加した（コントロールの１５２±２％）（図１０Ｂ）。これは、ＦＫＢＰ５２およびＣＡＣＮＢ１の両方の減少がニューロンの生存を促進することを示す。ウェスタンブロットを行い、ｓｉＲＮＡ処置が２４時間後に皮質ニューロン中のラミンＡ／Ｃ、ＣＡＣＮＢ１、またはＦＫＢＰ５２のタンパク質発現を減少させることを検証した。代表的なブロットを図１０Ｃに示す。ラミンＡ／Ｃ発現は７９．２１±１３．６８％に減少し、ＣＡＣＮＢ１発現は７０．７９±２０．７９％に減少し、ＦＫＢＰ５２発現は８６．８３±７．０３％に減少した（ｎ＝３）。
これらの実験は、ラパマイシンアナログＩがＦＫＢＰ５２および電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルβ１サブユニットと新規の複合体を形成したことを証明している。複合体形成により、β１サブユニットの活性が阻害され、神経突起伸長が刺激された。これらの実験はまた、ｍＴＯＲ結合領域でのラパマイシンの改変によって調製された２つの実質的に非免疫抑制性のイムノフィリンリガンドであるラパマイシンアナログＩおよびＩＩ（Ａｂｒａｈａｍら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４，４８３−５１０（１９９６））が強い神経突起伸長活性を示すことを証明している。アフィニティ精製により、これら両方がイムノフィリンＦＫＢＰ５２およびＬ型電位依存性Ｃａ２＋チャネルのβ１サブユニット（ＣＡＣＮＢ１）に結合することが明らかとなった。ラパマイシンアナログＩＩは、ラパマイシンよりＦＫＢＰ１２と比較したＦＫＢＰ５２に対する結合選択性が６８７倍であった。さらに、化合物で処置したラット皮質ニューロンはＣａ２＋シグナル伝達経路の全体的下方制御を示し、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルの部分阻害が処置Ｆ−１１細胞で認められた。ラット皮質ニューロンにおけるＦＫＢＰ５２および／またはＣＡＣＮＢ１遺伝子の減少により、神経突起伸長およびニューロンの生存が促進された。理論に拘束されないが、出願人は、イムノフィリンリガンドがＣａ２＋シグナル伝達の調整によってニューロンをＣａ２＋誘導性細胞死から潜在的に保護し、ＦＫＢＰ５２結合を介したステロイド受容体の活性化によって神経突起伸長を促進することができると考える。この新規の神経保護機構は、多数の疾患の処置に有益な洞察を与えるものである。
本出願で引用された全ての参考文献、係属中の特許出願、および公開特許の内容は、本明細書中で参照により明確に援用される。
等価物
当業者は、日常的実験のみを使用して、本明細書中に記載の特定の実施形態の多数の等価物を認識するか確認することができるであろう。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。

Claims (59)

  1. イムノフィリンリガンドと、（ｉ）イムノフィリンもしくはその機能的フラグメントおよび／または（ｉｉ）カルシウムチャネルサブユニットもしくはその機能的フラグメントの一方あるいは両方とを含む精製複合体。
  2. 前記イムノフィリンリガンドが、ラパマイシン骨格の１位および４位にヘテロ原子置換基を有するラパマイシンアナログである、請求項１に記載の精製複合体。
  3. 前記イムノフィリンリガンドが、式Ｉ：
    （式中、
    Ｒ１およびＲ２は異なる独立した基であり、ＯＲ３およびＮ（Ｒ３’）（Ｒ３’’）からなる群より選択されるか、
    Ｒ１およびＲ２は異なり、単結合を介して連結し、ＯおよびＮＲ３からなる群より選択され、
    Ｒ３、Ｒ３’、およびＲ３’’は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、
    Ｒ４およびＲ４’は、
    （ａ）Ｈ、ＯＨ、Ｏ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｏ（置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｏ（アシル）、Ｏ（アリール）、Ｏ（置換アリール）、およびハロゲンからなる群より独立して選択されるか、または、
    （ｂ）共にＯと二重結合を形成し、
    Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、Ｈ、ＯＨ、およびＯＣＨ３からなる群より独立して選択され、
    Ｒ８およびＲ９は、（ｉ）単結合を介して連結し、且つＣＨ２であるか、（ｉｉ）二重結合を介して連結し、且つＣＨであり、
    Ｒ１５は、Ｃ＝Ｏ、ＣＨＯＨ、およびＣＨ２からなる群より選択され、ｎは１または２である）を有するラパマイシンアナログまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項１に記載の精製複合体。
  4. 前記ラパマイシンアナログのＲ１がＯであり、Ｒ２がＮＲ３である、請求項３に記載の精製複合体。
  5. 前記ラパマイシンアナログのＲ１がＯＲ３であり、Ｒ２がＮ（Ｒ３’）（ＮＲ３’’）である、請求項３に記載の精製複合体。
  6. 前記ラパマイシンアナログのＲ３、Ｒ３’、またはＲ３’’が、アリールまたは置換アリールである、請求項３に記載の精製複合体。
  7. 前記ラパマイシンアナログのアリールまたは置換アリールが、構造：
    （式中、
    Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ハロゲン、アシル、ＯＨ、Ｏ（アルキル）、Ｏ（置換アルキル）、Ｏ（アリール）、Ｏ（置換アリール）、Ｏ（アシル）、ＮＨ２、ＮＨ（アルキル）、ＮＨ（置換アルキル）、ＮＨ（アリール）、ＮＨ（置換アリール）、およびＮＨ（アシル）からなる群より独立して選択される）である、請求項６に記載の精製複合体。
  8. 前記イムノフィリンリガンドが、
    からなる群より選択されるラパマイシンアナログである、請求項１に記載の精製複合体。
  9. 前記イムノフィリンが、図１２Ａ〜１２Ｄに示すアミノ酸配列（配列番号１１〜１４）と少なくとも９５％同一であるか、または同一である配列を有するＦＫＢＰ５２またはその機能的フラグメントである、請求項１に記載の精製複合体。
  10. 前記カルシウムチャネルサブユニットが、図１１Ａ〜１１Ｊに示すアミノ酸配列（配列番号１〜１０）と少なくとも９５％同一であるか、または同一である配列を有する電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットまたはその機能的フラグメントである、請求項１に記載の精製複合体。
  11. 図１２Ａ〜１２Ｄに示すアミノ酸配列（配列番号１１〜１４）を有するＦＫＢＰ５２をコードするヌクレオチド配列を含む第１の組換え核酸および／または図１１Ａ〜１１Ｊに示すアミノ酸配列（配列番号１〜１０）を有する電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組換え核酸を含む組換え宿主細胞。
  12. 請求項１に記載の精製複合体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
  13. 試験化合物と（ｉ）イムノフィリンおよび／または（ｉｉ）電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットの一方または両方とを含む複合体の形成を増加させる試験化合物の同定方法であって、
    該複合体の形成が可能な条件下でイムノフィリンもしくはその機能的フラグメントおよび／またはβ１サブユニットまたはその機能的フラグメントを試験化合物と接触させる工程、
    該試験化合物の存在下で基準と比較して該複合体の存在を検出する工程
    を含み、
    該基準中の該複合体のレベルと比較した、該試験化合物の存在下での該複合体のレベルの増加が、該試験化合物が複合体形成を増加させることを示す、方法。
  14. 前記サンプルが細胞溶解物、再構成された系であり、培養物または動物対象中の細胞を含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記複合体形成の増加を、該複合体の物理的形成の増加、シグナル伝達の変化、カルシウムチャネル活性の減少、またはニューロン活性の変化の１つ以上の検出によって決定する、請求項１３に記載の方法。
  16. 前記ニューロン活性の変化を、生存、分化、または神経突起伸長の１つ以上の増加として検出する、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記試験化合物が天然に存在するかまたは改変したＳ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓから得たポリケチドである、請求項１３に記載の方法。
  18. 請求項１３に記載の方法によって同定された化合物。
  19. イムノフィリンリガンドと、（ｉ）イムノフィリンまたはその機能的バリアントおよび／または（ｉｉ）カルシウムチャネルサブユニットまたはその機能的バリアントの一方または両方とを含む複合体の形成を増加させる方法であって、該複合体の形成を増加させる条件下で、イムノフィリンもしくはその機能的フラグメントおよび／または電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットまたはその機能的フラグメントをイムノフィリンリガンドと接触させる工程を含む、方法。
  20. 前記接触工程が細胞溶解物、再構成した系、または培養物もしくは動物対象中の細胞において起こる、請求項１９に記載の方法。
  21. 細胞中の電位開口型カルシウムチャネル活性および／またはＦＫＢＰ５２活性を減少させる方法であって、イムノフィリンリガンドとＦＫＢＰ５２またはそのフラグメントおよび／またはそのサブユニットまたはそのフラグメントの一方または両方との間で結合を可能にする条件下で、ＦＫＢＰ５２またはその機能的フラグメントおよび／または電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットまたはその機能的フラグメントの一方または両方を発現する細胞をイムノフィリンリガンドと接触させ、それにより、該カルシウムチャネル活性を阻害する工程を含む、方法。
  22. 前記接触工程が、前記イムノフィリンリガンドを培養物中の哺乳動物の神経細胞または心血管細胞に添加する工程を含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記接触工程が、前記イムノフィリンリガンドと前記ＦＫＢＰ５２またはそのフラグメントおよび／またはそのサブユニットまたはそのフラグメントの一方または両方との間に複合体を形成するのに十分な量で該イムノフィリンリガンドを対象に投与することを含む、請求項２１に記載の方法。
  24. 前記対象に投与された前記イムノフィリンの量を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体形成を誘導するのに必要なイムノフィリンリガンドの量を試験することによって決定する、請求項２３に記載の方法。
  25. Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関与する障害に関連する１つ以上の症状を有するリスクがあるか、またはそれを有する対象を同定する工程をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
  26. 前記対象が、神経変性障害または心血管障害を罹患した哺乳動物である、請求項２３に記載の方法。
  27. 前記イムノフィリンリガンドを、Ｌ型カルシウムチャネルアンタゴニストと組み合わせて投与する、請求項２３に記載の方法。
  28. 前記イムノフィリンリガンドが、ラパマイシン骨格の１位および４位にヘテロ原子置換基を有するラパマイシンアナログである、請求項２３に記載の方法。
  29. 前記ラパマイシンアナログが、式Ｉ：
    （式中、
    Ｒ１およびＲ２は異なる独立した基であり、ＯＲ３およびＮ（Ｒ３’）（Ｒ３’’）からなる群より選択されるか、
    Ｒ１およびＲ２は異なり、単結合を介して連結し、ＯおよびＮＲ３からなる群より選択され、
    Ｒ３、Ｒ３’、およびＲ３’’は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、
    Ｒ４およびＲ４’は、
    （ａ）Ｈ、ＯＨ、Ｏ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｏ（置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｏ（アシル）、Ｏ（アリール）、Ｏ（置換アリール）、およびハロゲンからなる群より独立して選択されるか、
    （ｂ）共にＯと二重結合を形成し、
    Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、Ｈ、ＯＨ、およびＯＣＨ３からなる群より独立して選択され、
    Ｒ８およびＲ９は、（ｉ）単結合を介して連結し、且つＣＨ２であるか、（ｉｉ）二重結合を介して連結し、且つＣＨであり、
    Ｒ１５は、Ｃ＝Ｏ、ＣＨＯＨ、およびＣＨ２からなる群より選択され、ｎは１または２である）またはその薬学的に許容可能な塩を有する、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記ラパマイシンアナログが、
    からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記ＦＫＢＰ５２またはその機能的フラグメントが、図１２Ａ〜１２Ｄに示すアミノ酸配列（配列番号１１〜１２）と少なくとも９５％同一であるか、または同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の方法。
  32. 前記電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットまたはその機能的フラグメントが、図１１Ａ〜１１Ｊに示すアミノ酸配列（配列番号１〜１０）と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の方法。
  33. 神経突起伸長および／または神経細胞の生存を刺激する方法であって、該神経細胞をイムノフィリンリガンドと接触させる工程を含み、該イムノフィリンリガンドが、１つ以上の以下：（ｉ）カルシウムシグナル伝達経路の少なくとも１つの成分の発現または活性の下方制御、（ｉｉ）ＦＫＢＰ５２活性または発現の減少、（ｉｉｉ）Ｌ型カルシウムチャネルの活性または発現の減少または阻害、（ｉｖ）糖質コルチコイド受容体シグナル伝達の活性化、（ｖ）イムノフィリンリガンド、ＦＫＢＰ５２および／またはβ１サブユニットを含む複合体の形成の誘導、および／または（ｖｉ）カルシウム誘導性細胞死からのニューロンの保護、を誘発する濃度で存在する、方法。
  34. 前記接触工程が、前記イムノフィリンリガンド、およびＦＫＢＰ５２および／またはβ１サブユニットの一方または両方を含む複合体を形成するのに十分な量での前記イムノフィリンリガンドの対象への投与を含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記対象に投与された前記イムノフィリンの量を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体形成を誘導するのに必要なイムノフィリンリガンドの量を試験することによって決定する、請求項３４に記載の方法。
  36. Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関与する障害に関連する１つ以上の症状を有するリスクがあるか、またはそれを有する対象を同定する工程をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
  37. Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関連する障害を治療する方法であって、イムノフィリンリガンドと、イムノフィリンもしくはその機能的フラグメントおよび／またはカルシウムチャネルサブユニットもしくはその機能的フラグメントの一方または両方とを含む複合体を形成するのに十分な量で該イムノフィリンリガンドを対象に投与し、それにより、該障害を治療する工程を含む、方法。
  38. 前記対象に投与された前記イムノフィリンの量を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体形成を誘導するのに必要なイムノフィリンリガンドの量を試験することによって決定する、請求項３７に記載の方法。
  39. Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関与する障害に関連する１つ以上の症状を有するリスクがあるか、またはそれを有する対象を同定する工程をさらに含む、請求項３７に記載の方法。
  40. 前記対象が、神経変性障害または心血管障害を罹患した哺乳動物である、請求項３７に記載の方法。
  41. 前記対象が、卒中、パーキンソン病、癲癇、アンギナ、心不整脈および虚血からなる群より選択される障害を罹患した哺乳動物である、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記対象が、片頭痛、神経因性疼痛、急性疼痛、気分障害、統合失調症、鬱病、不安、小脳性運動失調症、遅発性ジスキネジー、高血圧症、および尿失禁からなる群より選択される障害を罹患した哺乳動物である、請求項４０に記載の方法。
  43. 前記イムノフィリンリガンドを、Ｌ型カルシウムチャネルアンタゴニストと組み合わせて投与する、請求項３７に記載の方法。
  44. 前記イムノフィリンリガンドが、式Ｉ：
    （式中、
    Ｒ１およびＲ２は異なる独立した基であり、ＯＲ３およびＮ（Ｒ３’）（Ｒ３’’）からなる群より選択されるか、
    Ｒ１およびＲ２は異なり、単結合を介して連結し、ＯおよびＮＲ３からなる群より選択され、
    Ｒ３、Ｒ３’、およびＲ３’’は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、
    Ｒ４およびＲ４’は、
    （ａ）Ｈ、ＯＨ、Ｏ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｏ（置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｏ（アシル）、Ｏ（アリール）、Ｏ（置換アリール）、およびハロゲンからなる群より独立して選択されるか、
    （ｂ）共にＯと二重結合を形成し、
    Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、Ｈ、ＯＨ、およびＯＣＨ３からなる群より独立して選択され、
    Ｒ８およびＲ９は、（ｉ）単結合を介して連結し、且つＣＨ２であるか、（ｉｉ）二重結合を介して連結し、且つＣＨであり、
    Ｒ１５は、Ｃ＝Ｏ、ＣＨＯＨ、およびＣＨ２からなる群より選択され、ｎは１または２である）を有するラパマイシンアナログまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項３３または請求項３７のいずれかに記載の方法。
  45. 前記ラパマイシンアナログが、
    からなる群より選択される、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記イムノフィリンが、図１２Ａ〜１２Ｄに示すアミノ酸配列（配列番号１１〜１４）と少なくとも９５％同一であるか、または同一であるアミノ酸配列を有するＦＫＢＰ５２またはその機能的フラグメントである、請求項４４に記載の方法。
  47. 前記カルシウムチャネルサブユニットが、図１１Ａ〜１１Ｊに示すアミノ酸配列（配列番号１〜１０）と少なくとも９５％同一であるか、または同一であるアミノ酸配列を有する電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットまたはその機能的フラグメントである、請求項４４に記載の方法。
  48. 神経細胞の神経突起伸長を刺激する方法であって、該神経細胞を、電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットのアンタゴニストおよび／またはＦＫＢＰ５２のアンタゴニストの一方または両方と、該β１サブユニットまたはＦＫＢＰ５２の活性または発現を減少させる条件下で接触させる工程を含む、方法。
  49. 前記神経細胞が、ドーパミン作動性細胞、コリン作動性細胞、皮質細胞、および脊髄細胞からなる群より選択される、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記アンタゴニストが、β１サブユニットおよび／またはＦＫＢＰ５２と複合体を形成するイムノフィリンリガンドである、請求項４８に記載の方法。
  51. 前記アンタゴニストが、カルシウムチャネルβサブユニットまたはＦＫＢＰ５２の転写のインヒビターである、請求項４８に記載の方法。
  52. 前記アンタゴニストが抗体である、請求項４８に記載の方法。
  53. Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関連する状態の予防または治療のための薬物の製造におけるイムノフィリンリガンドの使用。
  54. 前記イムノフィリンリガンドが、ラパマイシン骨格の１位および４位にヘテロ原子置換基を有するラパマイシンアナログである、請求項５３に記載の使用。
  55. Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関連する状態の予防または治療のためのＬ型カルシウムチャネルアンタゴニストと組み合わせたイムノフィリンリガンドの使用。
  56. Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関連する状態の予防または治療のための薬物の製造における請求項１３〜請求項１７のいずれか１項に記載のように同定した化合物の使用。
  57. Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関連する状態の予防または治療で用いるイムノフィリンリガンド。
  58. Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関連する状態の予防または治療で用いるイムノフィリンリガンドおよびＬ型カルシウムチャネルアンタゴニストを含む組成物。
  59. Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関連する状態の予防または治療で用いる請求項１３〜請求項１７のいずれか１項に記載のように同定した化合物。
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