JP2008525336A

JP2008525336A - 抗血管新生医薬組成物を調製するためのジケトジチオピペラジン抗生物質の使用

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Publication number: JP2008525336A
Application number: JP2007547281A
Authority: JP
Inventors: ムナーリ、セルジョデ; マリオグルーニ、; エルネストメンタ、; マーラカッシン、; ジェンナロコレッラ、
Original assignee: Cell Therapeutics Europe SRL
Current assignee: Cell Therapeutics Europe SRL
Priority date: 2004-12-23
Filing date: 2005-12-14
Publication date: 2008-07-17
Also published as: WO2006066775A1; US20080255099A1; ITMI20042477A1; IL184114A0; EP1827442A1; CA2592002A1; MX2007007503A; ZA200704915B; CN101083991A; KR20070102492A; AU2005318535A1

Abstract

本発明は、抗腫瘍治療用の医薬組成物を調製するための、ジケトジチオピペラジン抗生物質、詳細にはケトシンおよびグリオトキシンの使用に関する。

Description

技術分野
本発明は、抗血管新生活性を有する薬物を調製するための、ジケトジチオピペラジン抗生物質、詳細にはケトシンおよびグリオトキシンの使用に関する。

現況技術
ケトシン（chaetocin）（Ｉ）

およびケトミン(chaetomin)（ＩＩ）

は、ケトミウム属株の菌類により産生される、抗微生物および細胞毒活性を有するカビの第２次代謝産物であるエピポリチオジオキソピペラジン抗生物質の代表的な例である（Ｃ．Ｌｅｉｇｈ、Ａ．Ｔａｙｌｏｒ、Ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓａｎｄｏｔｈｅｒｆｕｎｇａｌｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｒｅｌａｔｅｄｆｏｏｄｐｒｏｂｌｅｍｓ、Ｊ．Ｖ．Ｒｏｄｒｉｃｋｓ編２２８頁、Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９７６年；Ｇ．Ｗ．Ｋｉｒｂｙ、Ｄ．Ｊ．Ｒｏｂｉｎｓ、ＴｈｅＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆＭｙｃｏｔｏｘｉｎｓ、Ｐ．Ｓ．Ｓｔｅｎｙｌ編、３０１頁、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８０年。Ｃ．ｔｈｉｅｌａｖｉｏｉｄｅｕｍに属するケトミウム属株の培地から、およびＦａｒｒｏｗｉａ属株からのケトシンの単離については、Ｓ．Ｕｄａｇａｗａら、Ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｃｈａｅｔｏｇｌｏｂｏｓｉｎｓ，ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｃｙｓｔｉｎ，Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｃｙｓｔｉｎ，ａｎｄｃｈａｅｔｏｃｉｎｂｙＣｈａｅｔｏｍｉｕｍｓｐｐ．ａｎｄｒｅｌａｔｅｄｆｕｎｇｉ、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９７９年、２５（２）、１７０〜７頁およびＳ．Ｓｅｋｉｔａら、ＭｙｃｏｔｏｘｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙＣｈａｅｔｏｍｉｕｍｓｐｐ．ａｎｄｒｅｌａｔｅｄｆｕｎｇｉ、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９８１年、２７（８）、７６６〜７２頁も参照されたい。）。このクラスの化合物は、ジスルフィド結合の存在によって特徴づけられる。

ケトシンおよびケトミンの他に、エピポリチオジオキソピペラジンのさらなる例は、グリオトキシン（ＩＩＩ）

（Ｐ．Ｗａｒｉｎｇ、Ｊ．Ｂａｅｖｅｒ、ＧＩｉｏｔｏｘｉｎａｎｄｒｅｌａｔｅｄｅｐｉｐｏｌｉｔｈｉｏｄｉｏｘｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｓ、ＧｅｎＰｈａｒｍａｃｏｌ．、２７、１３１１〜１３１６頁、１９９６年）、スポリデスミン（Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．、１０５（１１）、３６５８〜６１頁、１９７２年）、アラノチン（Ｎ．Ｎｅｕｓｓら、Ａｒａｎｏｔｉｎａｎｄｒｅｌａｔｅｄｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ．ＩＩ，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｏｆｔｗｏｎｅｗｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ、４２、４４６７−４４７１頁、１９６８年）、ベルチシリン（Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．、１０５（１１）、３６５８〜６１頁、１９７２年）、メリナシジン（Ｆ．Ｒｅｕｓｓｅｒ、ＭｏｄｅｏｆＡｃｔｉｏｎｏｆＭｅｌｉｎａｃｉｄｉｎ，ａｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆＮｉｃｏｔｉｎｉｃＡｃｉｄＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、９６（４）、１２８５〜１２９０頁、１９６８年）およびオリザクロリン（抗生物質Ａ−３０６４１またはアスピロクロリンとも呼ばれる：Ｋ．Ｓａｋａｔａら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｒｅｖｉｓｉｏｎｏｆａｓｐｉｒｏｃｈｌｏｒｉｎｅ（＝ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃＡ３０６４１），ａｎｏｖｅｌｅｐｉｄｉｔｈｉｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−２，５−ｄｉｏｎｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓＳＰＰ、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ、２８（４６）、５６０７〜５６１０頁、１９８７年）である。Ｋ．ＭｉｃｈｅｌらによりＪ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．、２７、５７頁（１９７４年）において開示されているＰｅｎｉｃｉｌｉｕｍｔｕｒｂａｔｕｍからの代謝産物もエピポリチオジオキソピペラジン構造を有する。

ケトシンの構造および絶対配置は、Ｈ．Ｐ．Ｗｅｂｅｒにより開示されている（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、５３（５）、１０６１−７３頁、１９７０年；ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、Ｂ２８、２９４５頁（１９７２年））。ケトシンおよびそのジヒドロキシ誘導体、１１α，１１α’−ジヒドロキシケトシン（メリナシジンＩＶ）の細胞毒活性は、報告されており、ｌＣ₅₀は、白血病細胞ＨｅＬａに対して約０．０３μｇ／ｍＬである（Ｔ．Ｓａｉｔｏら、ＣｈｅｔｒａｃｉｎＡ，ａｎｅｗｅｐｉｐｏｌｉｔｈｉｏｄｉｏｘｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｈａｖｉｎｇａｔｅｔｒａｓｕｌｆｉｄｅｂｒｉｄｇｅｆｒｏｍＣｈａｅｔｏｍｉｕｍａｂｕｅｎｓｅａｎｄＣ．ｒｅｔａｒｄａｔｕｍ、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ、２６（３９），４７３１〜４７３４頁、１９８５年）。

血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、生理学的および生理病理学的血管新生のプロセスにおいて基本的な役割を果たす。様々なメカニズムが、ＶＥＧＦ遺伝子の調節において関係している；生体内および生体外低酸素条件下でＶＥＧＦｍＲＮＡのレベルが可逆的に増加することにより実際に示されているように、とりわけ、組織内の酸素分圧が強く関連している。ＶＥＧＦｍＲＮＡ発現の増加は、ＶＥＧＦ遺伝子のプロモーター領域内の認識部位に結合している、低酸素誘因性の転写因子−１（Ｈｉｆ−１）により主として媒介される。

多数の実験データにより、Ｈｉｆ−１は、酸素ホメオスタシスの包括的な制御因子であり、Ｈｉｆ−１活性障害は、腫瘍細胞の生存、増殖、侵入および転移を促進することが分かる（Ｇ．Ｌ．Ｓｅｍｅｎｚａ、ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗＣａｎｃｅｒ、３、２００３年、７２１−７３２頁）。従って、Ｈｉｆ−１活性の阻害を目的とする治療戦略が、癌患者の生存を増加させ得ることが仮定されている（ＳｅｍｅｎｚａＧＬ．、ＨＩＦ−１ａｎｄｔｕｍｏｒｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ：ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＴｒｅｎｄｓＭｏｌ．Ｍｅｄ、２００２年、８：Ｓ６２）。

ＨｌＦ−１は、二量体化し、ｂＨＬＨ−ＰＡＳドメインを通ってＤＮＡと結合するＨｉｆ−１αおよびＨｉｆ−１βサブユニットからなるヘテロ二量体である（ＳｅｍｅｎｚａＧＬら、Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇ，ａｎｄｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９６年、２７１、１７７７１頁）。Ｈｉｆ−１αサブユニットの発現は、ＶＨＬタンパク質とＨｉｆ−１αの結合により媒介されるユビキチン化およびプロテオソーム性分解のプロセスにより、組織内酸素により厳密に制御される（ＳｅｍｅｎｚａＧＬら、Ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ１ｌｅｖｅｌｓｖａｒｙｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌｌｙｏｖｅｒａｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙｒｅｌｅｖａｎｔｒａｎｇｅｏｆＯ₂ ｔｅｎｓｉｏｎ、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９９６年、２７１：Ｃ１１７２）。この相互作用は、Ｈｉｆ−１αが、４０２および５６４プロリン残基においてヒドロキシル化された場合にのみ行われる。酸素は、Ｈｉｆ−１αを修飾するプロリルーヒドロキシラーゼに対する制限基質である（ＥｐｓｔｅｉｎＡＣら、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＥＧＬ−９ａｎｄｍａｍｍａｌｉａｎｈｏｍｏｌｏｇｓｄｅｆｉｎｅａｆａｍｉｌｙｏｆｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅｓｔｈａｔｒｅｇｕｌａｔｅＨＩＦｂｙｐｒｏｌｙｌｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ、Ｃｅｌｌ、２００１年、１０７：４３頁）。Ｈｉｆ−１αの発現は、０₂濃度の減少とともに指数関数的に増加し、Ｈｉｆ−１活性の包括レベルを決定する。

Ｈｉｆ−１αのトランス活性化ドメインの機能は、酸素分圧により制御される負の制御をも受ける。Ｎ末端トランス活性化ドメインは、ヒストンデアシラーゼを補充することによってＶＨＬ、およびＶＨＬとＨｉｆ−１α両方に結合するＨｉｆ−１（ＦＩＨ−１）を阻害する因子により負に制御される（ＳｅｍｅｎｚａＧＬ．ら、ＦＩＨ−１：ａｎｏｖｅｌｐｒｏｔｅｉｎｔｈａｔｉｎｔｅｒａｃｔｓｗｉｔｈＨＩＦ−１ａｌｐｈａａｎｄＶＨＬｔｏｍｅｄｉａｔｅｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨＩＦ−ｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖｉｔｙ、ＧｅｎｅｓＤｅｖ．、２００１年、１５：２６７５頁）。

Ｈｉｆ−１の活性化は、Ｈｉｆ−１ドメインの活性化と物理的に相互作用してＶＥＧＦにような遺伝子の転写を促進するコアクチベーターｐ３００／ＣＢＰにより行われる（ＡｒａｎｙＺ．ら、Ａｎｅｓｓｃｎｔｉａｌｒｏｌｅｆｏｒｐ．３００／ｃｂｐｉｎｔｈｅｃｅｌｌｕｌａｒ−ｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｈｙｐｏｘｉａ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９６年、９３；１２９６９頁）。ｐ３００もＣＢＰもともに、Ｓｔａｔ−３、ＮＦ−κＢ、ｐ５３など、他の転写因子に対するコアクチベーターでもある。

Ｈｉｆ−１とｐ３００／ＣＢＰの相互作用は、転写に必須であり、最近の刊行物により、腫瘍増殖に対してＨｉｆ−１／ｐ３００相互作用が重要であることが証明されている（ＤａｍｅｒｔＡ．ら、Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ−１ｂｉｎｄｉｎｇｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓｔｈｅｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ−１−ｍｅｄｉａｔｅｄｈｙｐｏｘｉａｉｎｄｕｃｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｖａｓｃｕｌａｒ−ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈ−ｆａｃｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｃ６ｇｌｉｏｍａｃｅｌｌｓ、ＢｉｏｃｈｅｍＪ．、１９９７年、３２７：４１９頁）。Ｈｉｆ−１αＣ末端トランス活性化ドメイン（Ｃ−ＴＡＤ）は、ｐ３００、およびＣＨ１と呼ばれるＣＢＰドメインに結合する。ＣＢＰおよびｐ３００のＨｉｆ−１αに対する結合は、Ｃ末端活性化ドメイン中の８０３アスパラギンを酸素依存性ヒドロキシル化することによってＦＩＨ−１により負に制御される。従って、低酸素により、プロテオソーム分解に対する安定化とＨｉｆ−１の転写活性の両方が誘導される。

Ｈｉｆ−１α ＴＡＤ−Ｃとｐ３００またはＣＢＰのＣＨ１ドメインとの相互作用の構造的な詳細が明らかにされている（ＥｃｋＭＪ．ら、ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌｂａｓｉｓｆｏｒｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔｏｆＣＢＰ／ｐ３００ｂｙｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ−１ａｌｐｈａ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００２年、９９、５３６７頁、ＷｒｉｇｈｔＰＥら、ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌｂａｓｉｓｆｏｒＨｉｆ−１ａｌｐｈａ／ＣＢＰｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｉｎｔｈｅｃｅｌｌｕｌａｒｈｙｐｏｘｉｃｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００２年、９９、５２７１頁）。ＨＩＦ−１α活性の負の制御因子と見なされているｐ３００／ＣＢＰとＣＩＴＥＤ２タンパク質（ｐ３５^srjとも呼ばれる）の相互作用の詳細も刊行されている（Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｓ．Ｊ．ら、ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＢｉｏｌｏｇｙ、２００３年、１０（７）、５０４〜１２頁）。

Ｈｉｆ−１活性化により、腫瘍の進行にとり特に重要である、血管新生因子、グルコース担体、解糖酵素、生存因子、遊走因子および侵入因子の産生に関係する多数の遺伝子の転写が誘導される。

Ｈｉｆ−１αタンパク質の異常発現は、７０％を超えるヒト腫瘍およびそれらの転移において観察されており、血管新生の増加および腫瘍の進行に関係付けられている（Ｚｈｏｎｇ，Ｈ．ら、Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ１α ｉｎｃｏｍｍｏｎｈｕｍａｎｃａｎｃｅｒｓａｎｄｔｈｅｉｒｍｅｔａｓｔａｓｅｓ、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ、１９９９年、５９、５８３０〜５頁；Ｂｏｓ，Ｒ．ら、Ｌｅｖｅｌｓｏｆｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｌｅ−ｆａｃｔｏｒｓ−１α ｄｕｒｉｎｇｂｒｅａｓｔｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、Ｊ．Ｎａｔ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．、２００１年、９３、３０９〜１４頁；Ｔａｌｋｓ，Ｋ．Ｉ．ら、Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｔｈｅｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ−ｆａｃｔｏｒｓＨＩＦ−１α ａｎｄＨＩＦ−２ｉｎｎｏｒｍａｌｈｕｍａｎｔｉｓｓｕｅｓ）。臨床の実際では、Ｈｉｆ−１αの異常発現は、非小細胞肺癌（Ｇｉａｔｒｏｍａｎｏｌａｋｉ，Ａ．ら、Ｒｅｌａｔｉｏｎｏｆｈｙｐｏｘｉａｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ１α ａｎｄ２α ｉｎｏｐｅｒａｂｌｅｎｏｎ−ｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｔｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ／ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｆｉｌｅｏｆｔｕｍｏｒｓａｎｄｓｕｒｖｉｖａ１、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、８５、８８１〜８９０頁、（２００１年））、口咽頭扁平上皮癌（Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｄ，Ｍ．ら、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ１α：ａｎｏｖｅｌｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅａｎｄｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｐａｒａｍｅｔｅｒｉｎｔｈｅｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙｏｆｏｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌｃａｎｃｅｒ、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、６１、２９１１−２９１６頁（２００１年））、初期段階の子宮頚癌（Ｂｉｒｎｅｒ，Ｐ．ら、Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ１α ｉｓａｍａｒｋｅｒｆｏｒａｎｕｎｆａｖｏｒａｂｌｅｐｒｏｇｎｏｓｉｓｉｎｅａｒｌｙ−ｓｔａｇｅｉｎｖａｓｉｖｅｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒ、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、６０、４６９３〜４６９６頁、（２０００年））、頭頚部癌（Ｋｏｕｋｏｕｒａｋｉｓ，Ｍ．Ｉ．ら、Ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ（ＨｉｆｌＡａｎｄＨｉｆ２Ａ），ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ａｎｄｃｈｅｍｏｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙｏｕｔｃｏｍｅｏｆｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌｈｅａｄ−ａｎｄ−ｎｅｃｋｃａｎｃｅｒ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．、５３、１１９２〜１２０２頁、（２００２年））、変異ｐ５３卵巣癌（Ｂｉｒｎｅｒ，Ｐ．ら、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ１α ｉｎｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｏｖａｒｉａｎｔｕｍｏｒｓ：ｉｔｓｉｍｐａｃｔｏｎｐｒｏｇｎｏｓｉｓａｎｄｏｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、７、１６６１〜１６６８頁、（２００１年））、乏突起膠腫（Ｂｉｒｎｅｒ，Ｐ．ら、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ−１α ｉｎｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａｓ：ｉｔｓｉｍｐａｃｔｏｎｐｒｏｇｎｏｓｉｓａｎｄｏｎｎｅｏａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ、Ｃａｎｃｅｒ、９２、１６５〜１７１頁、（２００１年））、ＢＣＬ−２−陽性食道癌（Ｋｏｕｋｏｕｒａｋｉｓ，Ｍ．Ｉ．ら、Ｈｙｐｏｘｉａｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ（ＨＩＦ−１α ａｎｄＨＩＦ２α）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｅａｒｌｙｅｓｏｐｈａｇｅａｌｃａｎｃｅｒａｎｄｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃｔｈｅｒａｐｙａｎｄｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、６１、１８３０〜１８３２頁、（２００１年））など、多数の腫瘍病態における治療の失敗および死亡率の増加と関係付けられている。

Ｈｉｆ−１活性を阻害するための様々な手法が文献において記載されている。それらの一部では、Ｈｉｆ−１αに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用または陰性の優性ＨＩＦ−１α型の使用が示唆された。

薬理学的な手法のなかでも、ＰＩ３Ｋ−ｍＴＯＲ阻害剤（Ｚｕｎｄｅｌ，Ｗ．ら、ＬｏｓｓｏｆＰＴＥＮｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓＨＩＦ−１−ｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＧｅｎｅｓＤｅｖ．、１４、３９１〜３９６頁（２０００年）；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｃ．Ｃ．ら、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ１−ａｌｐｈａｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｂｙｔｈｅｍａｍｍａｌｉａｎｔａｒｇｅｔｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２２、７００４〜７０１４頁（２００２年））およびＨｉｆ−１α活性を制御するシグナルの伝達に作用するＭＥＫＫ阻害剤（Ｓｏｄｈｉ，Ａ．ら、ＴｈｅＫａｐｏｓｉ’ｓｓａｒｃｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓＧｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｓｅｃｒｅｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅａｎｄｐ３８ｐａｔｈｗａｙｓａｃｔｉｎｇｏｎｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ１α、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、６０、４８７３〜４８８０頁（２０００年））；ＨＳＰ９０シャペロンタンパク質の阻害剤（Ｍａｂｊｅｅｓｈ，Ｎ．Ｊ．ら、Ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎｉｎｄｕｃｅｓｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ１α ｐｒｏｔｅｉｎｖｉａｔｈｅｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅｐａｔｈｗａｙｉｎｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、６２，２４７８〜２４８２頁（２００２年））；細胞の酸化還元状態を修飾するチオレドキシン還元酵素の阻害剤（Ｗｅｌｓｈ，Ｓ．Ｊ．ら、Ｔｈｅｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎｒｅｄｏｘｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ１−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｙｌ２−ｉｍｉｄａｚｏｌｙｌｄｉｓｕｌｆｉｄｅａｎｄｐｌｅｕｒｏｔｉｎｉｎｈｉｂｉｔｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄｆａｃｔｏｒ１α ａｎｄｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｍｏｌ．ＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ．、２、２３５〜２４３頁（２００３年））；２−メトキシエストラジオールなどの、微小管を不安定化する分子（Ｍａｂｊｅｅｓｈ，Ｎ．Ｊ．ら、２ＭＥ２ｉｎｈｉｂｉｔｓｔｕｍｏｒｇｒｏｗｔｈａｎｄａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｂｙｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓａｎｄｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｎｇＨｉｆ、ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ、３、３６３〜３７５頁、（２００３年））、およびエポチロン（Ｅｓｃｕｉｎ，Ｄ．ら、ＥｐｏｔｈｉｌｏｎｅＢｉｎｈｉｂｉｔｓＨｉｆ−１α ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍｏｆｉｔｓｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇｅｆｆｅｃｔｓ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅ９５ｔｈＡｎｎｕａｌＭｅｅｔｉｎｇｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｆｏｒＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ、Ａｂｓ．５４２７）など、間接的なメカニズムにより作用するＨｉｆ−１α活性阻害剤が記載されている。

近年、ヌードマウスから移植されたヒトの腫瘍において恒常的および低酸素誘導型のＨｉｆ−１αレベルをＰＸ−４７８（メルファランＮ−オキシド）により阻害したことが報告されている。この化合物は、顕著な抗腫瘍活性を示す。しかし、この化合物の作用メカニズムは、依然として十分に解明されていない（ＳＷｅｌｓｈら、ＡｎｔｉｔｕｍｏｒａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆＰＸ４７８，ａｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ１α、ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ．、３：２３３〜２４４頁（２００４年））。

最後に、ジケトジチオピペラジン構造を有するケトミウム属菌類の代謝産物、ケトミンが、Ｈｉｆ−１αのｐ３００への結合を妨害することが近年報告されている。この化合物は、ｐ３００のＣＨ１ドメインの構造を変える作用があり、従ってそれがＨｉｆ−１αと相互作用するのを妨げる。腫瘍のあるマウスにケトミンを投与すると、腫瘍中の低酸素誘導型転写および腫瘍の増殖が阻害される（Ａ．Ｌ．Ｋｕｎｇら、ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ、６、３３〜４３頁、２００４年）。

グリオトキシンおよびケトシンは、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈから市販されており、上記の刊行物に記載の方法により得ることができる。グリオトキシンの全合成は、Ｔｏｔａｌｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｇｌｉｏｔｏｘｉｎ，ｄｅｈｙｄｒｏｇｌｉｏｔｏｘｉｎａｎｄｈｙａｌｏｄｅｎｄｒｉｎ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、３７（１１）、２０４５〜２０７８頁、１９８１年においてＴ．Ｆｕｋｕｙａｍａ、Ｓ．ＮａｋａｔｓｕｋａおよびＹ．Ｋｉｓｈｉにより報告されている。

発明の開示
ジケトジチオピペラジン構造を有する抗生物質、詳細にはケトシンおよびグリオトキシンは、Ｈｉｆ−１αがｐ３００に結合することを阻害し、低酸素条件下に維持されている細胞中でのＶＥＧＦ産生を防止することができることがここに見出された。

従って、第１の実施形態では、本発明は、Ｈｉｆ−１αがｐ３００に結合することを阻害することによる病態の治療用の薬物の調製、特に抗血管新生薬物の調製のための、ケトシンおよびグリオトキシンから選択されるジケトジチオピペラジン抗生物質の使用に関するものである。

従って、本発明の目的は、抗血管新生、抗増殖および抗転移剤としてのケトシンおよびグリオトキシンである。

さらなる実施形態では、本発明は、適切な担体および賦形剤と混合された、ケトシンおよびグリオトキシン有効成分から選択されるジケトジチオピペラジン抗生物質を含む医薬組成物に関するものである。

本発明はさらに、細胞におけるＶＥＧＦの産生を阻害するための方法であって、その細胞を有効量のケトシンまたはグリオトキシンと接触させるステップを含む方法に関するものである。

発明の詳細な説明
ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＢｉｏｌｏｇｙ、２００３年、１０（７）、５０４〜５１２頁においてＦｒｅｅｄｍａｎＳＪらが適応させた蛍光アッセイ法を用いて実際に示すことが可能であったように、ジケトジチオピペラジン抗生物質、特にケトシンおよびグリオトキシンは、Ｈｉｆ−１αとｐ３００の間の相互作用を阻害することができる。

従って、ケトシンおよびグリオトキシンは、血管新生および腫瘍の増殖の制御に有用である。

これらの化合物の医薬組成物は、好都合には、血管新生が病変形成因子として関係する多数の病態、例えば、様々な形態の固形腫瘍、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、乾癬、エマンジオーマ、強皮症、血管新生緑内症を治療するために使用できる。

Ｈｉｆ−１αがｐ３００のＣＨ１ドメインと結合するのを阻害できる化合物に特に敏感である固形腫瘍は、肺癌、乳癌、前立腺癌、神経芽腫、神経膠芽腫、多形性膠芽腫、黒色腫、中枢神経系癌、口咽頭扁平上皮癌、子宮頚癌、卵巣癌、食道癌、腎臓癌、大腸癌、頭頚部癌および乏突起膠腫を含む。

企図された治療用途に対して、該ケトジチオピペラジン抗生物質は、選択された化合物の薬物−毒物学および薬物動態特性、ならびに病態、その重篤度および進行段階、ならびに患者の体重、性別および年令に応じて当技術分野の専門家により決定される用量において、経口、非経口、経皮、直腸、局所または等価の投与経路により投与される。

しかし、用量は、通常、患者の体重に関して０，１〜１００ｍｇ／Ｋｇ／ダイである。

ケトシンおよび／またはグリオトキシンは、場合によっては、他の化学療法剤剤との組合せ、例えば、異なる作用メカニズムを有する相乗効果の可能性のある薬剤を用いる化学療法プロトコルにおいて投与される。

本発明の組成物の例は、カプセル，錠剤、注射可能もしくは経口溶液または懸濁液、座薬、放出制御性の形態などを含む。前記組成物は、通常の技法および賦形剤、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓＨａｎｄｂｏｏｋ、ＸＶＩＩ版、ＭａｃｋＰｕｂ．、Ｎ．Ｙ．、Ｕ．Ｓ．Ａに開示の方法により調製できる。

本発明を以下の実施例においてより詳細に例示する。

実施例ｌ
Ｂｉｏｔ−Ｈｉｆ−１α⁷⁸⁶〜⁸²⁶／ＧＳＴ−ｐ３００^323/423の阻害
Ｈｉｆ−１αとｐ３００の間の相互作用を防止するケトシンの能力を、ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＢｉｏｌｏｇｙ、２００３年、１０（７）、５０４〜５１２頁においてＦｒｅｅｄｍａｎＳＪらにより開示され、適切に改変された蛍光アッセイ（ＤＥＬＦＩＡ（商標））法を使用して評価した。

Ｃ末端アミノ酸７８６〜８２６（ビオチン化Ｈｉｆ−１α⁷⁸⁶〜⁸²⁶）に対応するヒトビオチン化Ｈｉｆ−１α断片を、ＡｎａＳｐｅｃＩｎｃ（ＳａｎＪｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）から得、さらなる精製をすることなく使用した。

ＧＳＴ−ｐ３００³²³〜⁴²³断片を発現するコンストラクトをＥ．ｃｏｌｉのＢＬ２１（ＤＥ３）株中で形質転換した。こうしたコンストラクトを、発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍｎ．２７−４５−８０−０１）中で、３２３〜４２３アミノ酸間に含まれるｐ３００領域をコードするＤＮＡ配列をクローニングすることにより得た；このＤＮＡ配列をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応法）により得た。タンパク質の発現は、１ｍＭのイソプロピルー１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘導された。細菌を、適切な緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ８．００、１００ｍＭＮａＣｌ、０．ｌｍＭＺｎＳＯ４、１ｍＭＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍｌリソジムおよび１錠のＲｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤）の存在下で超音波により溶解し、溶解部分に含まれるＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオンーセファローゼ４Ｂ樹脂（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；ｎｏ．２７−４５７４−０１）上で精製した。タンパク質の最終濃度を、Ｂｉｏｒａｄアッセイ（ＢｒａｄｆｏｒｄＭ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７２、２４８頁、（１９７６年））によりＢｒａｄｆｏｒｄに従って求めた。試料の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。試料を５０％グリセロール中で−８０℃で保存した。

９６ウエルのＮＵＮＣＭａｘｉｓｏｒｐプレートを使用して以下のようにアッセイを行った。Ｃ９６ＮＵＮＣＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、ｐｒｏｄｕｃｔＮｏ．４４６６１２）を、ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４のリン酸塩緩衝生理食塩水）中最終濃度が１μｇ／ｍｌであるストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ；ｐｒｏｄｕｃｔＮｏ．Ｓ４７６２）を用いて終夜インキュベートした。次いで、各ウエルを、ＴＢＳＴ緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）３００μｌで３回洗浄した。次いで、各ウエルに、ＴＢＳＢ（５０ｍＭトリスＨＣＩｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ，５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，ｐｒｏｄｕｃｔＮｏ．Ａ２１５３））中ビオチン化Ｈｉｆ−１α⁷⁸⁶〜⁸²⁶の１０ｎＭ溶液１００μｌを加え、２５℃で１時間インキュベートした。各プレートの最終列には、ＴＢＳＢ緩衝液のみを加えた。次いで、各ウエルを、ＴＢＳＴ緩衝液３００μｌで３回洗浄した。このように調製したプレートをアッセイのために使用した。

独立に、各試験化合物の１０μＭＤＭＳＯ溶液を各ウエル中に１０μｌ含むプレート（娘プレート）を調製した。このプレートにインキュベーション緩衝液（０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を加えたＴＢＳＢ、０．５ｍＭＤＴＴ、１０μＭＺｎＣｌ₂）で希釈されたＧＳＴ−ｐ３００³²³〜⁴²³断片の１１１ｐＭ溶液１００μｌを加え、その溶液を混合した。娘プレート中の混合物１００μＬを直ちにアッセイプレート中に移した。

最後の２つのウエル列は除いて、各娘プレートをケトシン濃度が１０μＭになるように調製し、各ウエルにＤＭＳＯ１０μＬを加えた。これらの２つの列を、陽性（列１１、＋Ｈｉｆ−１）および陰性（列１２、−Ｈｉｆ−１）対照とした。

２５℃で１時間インキュベートした後、各ウエルを、ＴＢＳＴ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）３００μＬで３回洗浄した。次いで、各ウエルに、１０μＭＺｎＣｌ₂を含むＴＢＳＳ緩衝液１００μＬ中に溶解したユーロピウム標識化抗ＧＳＴ抗体（標識されたＤＥＬＦＩＡＥｕ−Ｎ１；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；ｐｒｏｄｕｃｔｎｏ．ＡＤ０２５１）６０．８ｎｇを加えた。室温で１時間インキュベートした後、各ウエルを、ＴＢＳＴ緩衝液３００μｌで３回洗浄し、次いで、シグナル増幅溶液（促進溶液、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒｐｒｏｄｏｔｔｏＮｏ．１２４４−１０５）１００μｌを加えた。

次いで、時間分解蛍光モードにおいてＦＵＳＩＯＮａｌｐｈａ−ＦＰ−ＨＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）読取り機を用いてプレートを読んだ。

ケトシン活性を以下のようにして計算した。試験プレートの列１２中の陰性対照の蛍光平均値を、他のすべてのウエルの蛍光値から差し引いた。次いで、各ウエルについて得られた蛍光値を、列１１中の陽性対照の平均蛍光値（これは最高シグナル値、１００％を表したものである）で除し、パーセント値で表した。阻害値は、１００と、各ウエルについて計算されたシグナルパーセンテージとの差であった。

該化合物が、各列において９０μＭ〜０．１７８μＭの１０種の異なる濃度で存在する娘プレートを使用して、それからＩＣ₅₀（シグナルの５０％を阻害させるのに必要な化合物の濃度）が導出できる用量−応答曲線を計算することができた。媒体のみを含む列１１および１２により、対照が表された。

この試験では、ケトシンにより、Ｂｉｏｔ−Ｈｉｆ−１α⁷⁸⁶〜⁸²⁶とＧＳＴ−ｐ３００^323/423の相互作用がＩＣ₅₀１２．５μＭで阻害されることが分かった。

実施例２
ＶＥＧＦ産生の阻害
ルシフェラーゼオープンリーティングフレームがラットＶＥＧＦ遺伝子プロモーターの制御下に置かれているベクターを安定に発現させるために、遺伝子修飾されたヒトエパト癌腫Ｈｅｐ３Ｂ細胞（Ｈｅｐ３Ｂ−ＶＥＧＦＬルシフェラーゼ）についての細胞試験を使用して本発明の化合物を評価した。

デスフェリオキサミン（低酸素を誘導する）によるＨＩＦ−１誘導により、ＶＥＧＦプロモーターの活性化によるルシフェラーゼ転写が誘導され、市販のキットを用いて測定できるルシフェラーゼ活性が増加する元になる。Ｈｉｆ−１α／ｐ３００複合体を妨害する化合物により、ＨｌＦ依存性のルシフェラーゼ活性化が阻害され、ルシフェラーゼ活性が減少する。従って、このアッセイにより、ＶＥＧＦ産生および続いての腫瘍血管新生に必須であるＶＥＧＦプロモーターに対する該化合物の活性を評価することが可能である。

Ｈｅｐ−３Ｂ−ＶＥＧＦルシフェラーゼ系統を以下の手順により得た。

ヒトエパト癌腫Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣｒｅｆｅｒｅｎｃｅＮｏ．ＨＢ−８０６４）を、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ２ｍｌ中の濃度が２．５×１０⁵細胞／ウエルである６−ウエルプレート上に播種し、その翌日、Ｆｕｇｅｎｅ６（ＲｏｃｈｅＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（登録商標））を用いて形質移入した。各ウエル中の形質移入混合物には、形質移入反応Ｆｕｇｅｎｅ６が６μｌ、レポータープラスミドｐｘｐ２−ＶＥＧＦ−ルシフェラーゼ（ラットＶＥＧＦプロモーター、ＮＣＢＩＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｕ２２３７３、Ｌｅｖｙら、ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０（２２）、１３３３３−１３３４０頁、１９９５年）が１μｇ、および細胞を耐ネオマイシン性にさせるｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミド（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）が１０ｎｇ含まれていた。形質移入は、製造者の説明書に従って行われた。

適切な細胞集団（表現型的に耐ネオマイシンである）を、「限定希釈」手順に基づくクローニング手法により選択した（ＳａｍｂｒｏｏｋＪ．、ＦｒｉｔｓｃｈＥ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓＴ．（１９８９年）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ａ．ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ；ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉ）。ルシフェラーゼの発現／活性の以下の試験、「ルシフェラーゼアッセイ」および上清中に分泌されたＶＥＧＦを定量するための試験、「分泌ＶＥＧＦＥＬＩＳＡ試験」は、安定的に形質移入された選択細胞を用いて行われる。

以下の実験プロトコルを使用した。

１日目。Ｈｅｐ−３Ｂ−ＶＥＧＦルシフェラーゼ細胞を、密度１×１０⁴細胞／ウエル／媒体１２５μｌで「ブランク」９６ウエルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）上に播種し、次いで、サーモスタット（３７℃／５％ＣＯ₂）中で終夜定着させた。

２日目。化合物の「３．２×作業溶液」（ＤＭＳＯ濃度が１．６％ｖ／ｖになるように予め媒体に調製された）７５μｌを細胞に加えた（部分体積／ウエル＝２００μｌ、化合物の部分濃度＝１．２×、ＤＭＳＯの部分濃度＝０．６％）。サーモスタット中で１時間インキュベーションした後、６×（６００μＭ）デスフェリオキサミン原料溶液（最終体積／ウエル＝２４０μｌ、化合物の最終濃度＝１×、ＤＭＳＯの最終濃度０．５％、デスフェリオキサミンの最終濃度＝１×〜１００μＭ）を４０μｌ／ウエルで添加することにより、低酸素が化学的に誘導された。次いで、プレートをさらにサーモスタット中に１８〜２０時間置いた。

３日目。「ルシフェラーゼアッセイ」および「分泌ＶＥＧＦＥＬｌＳＡ試験」を以下に説明する通りに行った。

分泌ＶＥＧＦＥＬＩＳＡ試験
分泌ＶＥＧＦの定量を、「ＤｕｏＳｅｔＥｌｉｓａＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＳｙｓｔｅｍｈｕｍａｎＶＥＧＦ」キット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。

Ｈｅｐ３Ｂ／ＶＥＧＦルシフェラーゼクローンの細胞が播種された「ブランク」９６ウエルプレートからの上清１００μｌ／ウエルを、透明な９６ウエルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）内に移し、キット製造者の説明書に従ってアッセイした。

分泌ＶＥＧＦを阻害するためのＥＬＩＳＡ試験では、ケトシンおよびグリオトキシンは、それぞれ、０．１μＭおよび０．２μＭのＩＣ₅₀を示した。

ルシフェラーゼアッセイ
ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現の定量を、ＢｒｉｇｈｔＧｌｏＲｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った。上清を廃棄し、ＰＢＳにより１回洗浄した後、４０μｌ／ウエルのＢｒｉｇｈｔＧｌｏＲｅａｇｅｎｔを、「ブランク」９６ウエルプレート、即ち、ヒトエパト癌腫Ｈｅｐ３Ｂ／ＶＥＧＦ−ルシフェラーゼ細胞のないプレートに加えた。レポーター遺伝子の発現レベルは、ルミノメーターを用いてプレートを読んで求められた。

ＶＥＧＦプロモーターを阻害するためのルシフェラーゼアッセイでは、ケトシンおよびグリオトキシンは、それぞれ、０．０４μＭおよび０．０５μＭのＩＣ₅₀（ルシフェラーゼシグナルの５０％を阻害させる化合物の濃度）を示した。

Claims

Ｈｉｆ−１αのｐ３００への結合を阻害することが必要とされる病態を治療するための医薬組成物を調製するための、ケトミンを除くジケトジチオピペラジン抗生物質の使用。
抗血管新生薬物を調製するための、請求項１に記載の使用。
固形腫瘍を予防または治療するための、請求項１または２に記載の使用。
腫瘍が、肺癌、乳癌、前立腺癌、神経芽腫、神経膠芽腫、多形性膠芽腫、黒色腫、中枢神経系癌、口咽頭扁平上皮癌、子宮頚癌、卵巣癌、食道癌、腎臓癌、大腸癌、頭頚部癌および乏突起膠腫から選択される、請求項３に記載の使用。
抗生物質が、ケトシンまたはグリオトキシンである、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用。
血管新生阻害剤としてのケトシンおよびグリオトキシン。
抗増殖剤および抗転移剤としてのケトシンおよびグリオトキシン。
適切な媒体および賦形剤と混合された有効成分としてのケトシンおよび／またはグリオトキシンを含む医薬組成物。
細胞におけるＶＥＧＦの産生を阻害するための方法であって、前記細胞を有効量のケトシンまたはグリオトキシンと接触させるステップを含む方法。