KR20080086027A - 고형암 세포에서 사이클로필린 ａ의 발현을 억제하는물질을 포함하는 시스플라틴에 대한 내성 억제용 약제학적조성물 및 그를 이용하여 고형암의 시스플라틴에 대한내성을 억제하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항암제인 시스플라틴에 내성을 보이는 고형암의 내성을 감소시킬 수 있는 시스플라틴 내성 억제 조성물, 이러한 조성물 및 시스플라틴을 포함하는 항암제 조성물 및 이들의 사용하여 고형암의 시스플라틴에 대한 내성을 감소시키는 방법을 제공한다. 또한 이러한 조성물을 사용하여 고형암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물을 시스플라틴에 내성을 갖는 고형암에 시스플라틴과 함께 복합 투여할 경우, 고형암의 치료 효과를 증대시킬 수 있다.

사이클로필린A, 시스플라틴, HIF-1α, 저산소상태, 내성

Description

고형암 세포에서 사이클로필린 Ａ의 발현을 억제하는 물질을 포함하는 시스플라틴에 대한 내성 억제용 약제학적 조성물 및 그를 이용하여 고형암의 시스플라틴에 대한 내성을 억제하는 방법{A pharmaceutical composition for rendering resistance to cisplatin in cancer cells comprising a material inhibiting an expression of cyclophilin A and a method for rendering resistance to cisplatin in cancer cells by using them}

도 1은 저산소상태에서(hypoxia) 사이클로필린 A가 전사적으로 상향조절(transcriptionally upregulated)됨을 나타내는 것으로, A 내지 C는 RT-PCR 분석 결과이다. 전체 RNA는 일정기간 저산소 상태에 노출되거나(A), 100μM CoCl₂(B)로 처리된 NIH3T3 세포로부터 추출하였고, 이를 사이클로필린 A 및 GAPDH mRNA의 RT-PCR 분석을 행한 것이고, D는 사이클로필린 A의 이뮤노블러팅 결과를 나타낸다. 일정 시간동안 저산소상태 노출 후에 추출된 전체 세포 용해물(lysate)(10μg)을 이뮤노블러팅 분석하였다.

도 2는 인간 사이클로필린 A 프로모터의 기능 분석에 관한 것으로, A는 사이클로필린 A 프로모터인 루시퍼라제 리포터(luciferase reporter)의 구성을 나타낸 다. B 및 C는 (A)에 나타낸 각각의 루시퍼라제 구성물로 형질감염시킨 NIH3T3(B) 및 DU145 및 HeLa(C) 세포들을 저산소상태에 노출시키고 pcDNA3-HIF-1α와 함께 공형질감염(cotransfeted)시킨 루시퍼라제 리포터 어세이 결과를 나타낸다. D는 저산소상태에 대한 반응으로 사이클로필린 A 프로모터와 HIF-α의 결합을 나타낸다. 핵 추출물은 저산소 상태에 12시간 동안 노출된 또는 노출되지 않은 DU145 세포로부터 준비되었고, EMSA 어세이는 ³²P-레이블된 야생형(WT) 또는 변이된 올리고뉴클레오타이드 프로브의 존재 내에서 10μg의 핵 추출물을 사용하여 수행하였다. 경쟁적 연구를 위하여, 100-배 molar excess의 레이블되지 않은 야생형 프로브(Cold)를 반응 혼합물에 추가하였다.

도 3은 저산소상태, 시스플라틴 또는 H₂O₂ 처리에 의해 유도되는 세포사 상에서의 사이클로필린의 영향을 나타내며, A는 사이클로필린 A의 발현 레벨을 나타낸다. B는 MTT 어세이의 결과를 나타낸다. C는 ROS 측정 결과를 나타내며, □는 시스플라틴으로 처리한 경우, ■는 시스플라틴으로 처리하지 않은 경우를 나타낸다. D는 미토콘드리아 막 전위 측정 결과를 나타낸다.

도 4는 저산소상태, 시스플라틴 또는 H₂O₂-유도된 아폽토시스(atopotosis)상의 사이클로필린 A의 과발현 또는 넉다운(knockdown)의 영향을 나타낸다. A 및 B는 CypA/WT 형질감염체(transfectants)(A) 또는 CypA knockdown(B)에서의 가공된 PARP 및 세포질(cytosol)의 사이토크롬 c의 이뮤노블러팅에 의해 아폽토시스 세포사(apoptotic)를 나타내었다. C는 Hoechst 333342 염색에 의해 아폽토시스 세포사를 나타낸 것이다.

도 5는 세포사에 대한 사이클로필린 A의 세포보호효과가 세포 종류에 제한되지 않음을 나타내는 것이다. A는 사이클로필린 A의 발현 레벨을 이뮤노블러팅으로 나타낸 결과이다. B 내지 D는 HepG2, HeLa (C), 또는 HCT116 p53^+/+ and HCT116 p53^-/- (D) 세포에서의 MTT 어세이 결과를 나타낸다.

도 6은 사이클로필린 A가 세포 증식에는 영향을 미치지 않음을 나타내는 것으로서, A는 세포 주기 분석자료이며, B는 배수기(doubling time)에 관한 결과로서 트리판 블루로 염색한 후에 세포수를 측정한 것이다.

도 7은 사이클로필린 A의 세포보호효과가 파클리탁셀(paclitaxel) 및 5-플루오로우라실(5-fluorouracil)과 같은, 아폽토시스가 증가된 ROS와 직접적으로 관련되어 있지 않은 다른 항암제에 대해서는 나타나지 않는다는 것을 나타내는 자료로서, 파클리탁셀 또는 5-플루오로우라실 20μM 투여시 사이클로필린 발현 유무에 관계없이 상대적인 세포 생존률이 유사함을 보여주는 자료이다.

본 발명은 항암제 내성 억제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 PPIase 활성을 갖는 사이클로필린 A의 발현을 억제함으로써 시스플라틴에 내성을 가질 수 있는 고형암 세포에서 시스플라틴의 내성을 억제하여 항암효과를 증대시킬 수 있는 시스플라틴 내성 억제용 조성물, 이를 이용하여 시스플라틴의 내성을 억제하는 방법 및 상기 조성물 및 시스플라틴을 포함하는 항암제에 관한 것이다.

시스플라틴은 유방암, 방광암, 위암, 자궁경부암 등과 같은 다양한 종류의 암을 치료하는데 매우 효과적이라고 알려져 있다. 시스플라틴은 백금(platinum)을 함유한 중금속 화합물로서 백금 원자를 중심으로 2개의 염소 원자와 2개의 암모니아 분자가 시스(cis)-형으로 결합되어 있으며, DNA 가닥상의 인접한 2개의 구아닌과 결합하여 사슬 내 가교(interstrand crosslink)를 형성하여 DNA 합성을 억제한다. 즉, 암세포의 핵 내에 존재하는 DNA 이중나선 구조에 부착되어 DNA 복제를 저해하여 암세포 성장 및 증식을 억제하고 암세포를 제거하여 항암효과를 나타낸다고 알려져 있다.

그러나, 시스플라틴이 다양한 종류의 암에 대하여 매우 효과적인 항암제이긴 하나, 최근의 연구에 의하면 그 내성으로 인하여 임상적인 문제가 증가하고 있다. 시스플라틴에 내성을 갖는 이유에 대해서는 여러 가지 가설이 있으나, 시스플라틴 유입(cisplatin uptake)의 감소나 유출의 증가로 인하여 발생되거나(Andrew et al., Cancer Res.,2:35-43, 1990), 다양한 유전자들이 관여한다는 설이 일반적이다. 특히, MDR(multiple drug resistance)과 MRP(multidrug resistance associated protein)의 두 종류 단백질이 시스플라틴에 대한 내성에 관여하는 것으로 알려져 왔다(Taniguchi et al., Cancer Res., 56:4124-4129, 1996). 즉, 시스플라틴에 내성을 갖는 종양 세포에서는 MRP2 단백질의 발현이 증가하며, MRP2가 글루타치온-컨주게이트 된 시스플라틴(glutathione-conjugated cisplatin)을 세포 밖으로 방출함으로써 세포의 시스플라틴에 대한 내성이 있음이 보고되어 MRP2 이외의 다른 단백질도 시스플라틴 내성에 기여할 수 있음이 확인되었다(Chen et al., Exp. Cell Res., 240:312-320, 1998). 또한 c-ras, c-fos, c-abl, p53 및 p73 등의 유전자가 시스플라틴에 대한 내성과 관련이 있음이 보고된 바 있다.

암세포는 보통 형질 전환되지 않은 세포보다 더 스트레스에 내성을 갖고 있다. 그 암세포들은 저산소 상태, 방사선 및 항암제를 포함하는 다양한 스트레스에 대한 복합적인 방어 체계를 사용한다. 이러한 저산소 상태는 고형암을 치료하는데 있어서 오랫동안 문제점으로 지적되어 왔다. 즉, 저산소 상태의 종양세포들은 방사선 및 화학적 치료에 대해 저항성이 큰 것으로 알려져 있고(Teicher et al., Cancer Res., 41, 73~81, (1981); Gatenby et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 14, 831~838, (1988); Brizel et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 38, 285~289, (1997)), 종양세포의 전이능력을 증가시킨다는 결과가 보고된 바 있으며, 고형암 내에서 저산소증은 세포사멸(apoptosis)에 대한 저항성을 나타낸다고 한다. 따라서, 이러한 종양세포의 진행을 억제하기 위해 특히, 저산소 상태를 유도하는 인자의 발현을 제어하기 위한 연구가 있어왔다.

저산소 상태에서, 암세포들은 HIF-1α 발현을 유도함으로써 생존할 수 있다(Fillies T, Werkmeister R, van Diest PJ, Brandt B, Joos U, Buerger H., BMC Cancer 2005;5:84. 및 Semenza GL., Annu Rev Cell Dev Biol 1999;15:551-78). 그러므로, HIF-1α는 저산소 상태-유도된 아폽토시스 세포사의 잠재적인 조절자로서 제안되며(Carmeliet P, Dor Y, Herbert JM, et al., Nature 1998;394:485-90), HIF-1α 형질전환된 세포 내에서의 저산소 상태에 의한 아폽토시스의 유도는 HIF-1α을 발현하지 않는 세포 내에서 보다 더욱 어려움을 알 수 있다.

사이클로필린 A는 사이클로필린 패밀리의 전형적인(prototypical) 구성원(member)로서, 포유류 세포 내에서 매우 잘 보존된 단백질이다(Handschumacher RE, Harding MW, Rice J, Drugge RJ, Speicher DW., Science 1984;226:544-7). 전통적으로, 사이클로필린류는 네 가지의 이형으로 구성되어 있다(사이클로필린 A, B, C 및 D). 인간 서열 상동성 분석은 인간 사이클로필린 A가 인간 사이클로필린 B(Cyp B), C(Cyp C) 및 D(Cyp D)와 매우 상동적임을 나타낸다. 사이클로필린 C 및 D가 소포체에게로 표적화하는 N-말단의 서열을 가지고 있는데 반해, 18kDa의 분자량을 가지는 사이클로필린 A는 세포질에 현저하게 집중되어 있다(Harding MW, Handschumacher RE, Speicher DW., J Biol Chem 1986;261:8547-55.). 그것은 면역 억제제인 사이클로스포린 A에 대한 이뮤노필린 및 세포질의 수용체(cytosolic receptor)로서 알려져 있다(Handschumacher RE, Harding MW, Rice J, Drugge RJ, Speicher DW., Science 1984;226:544-7). 또한, 사이클로필린 A는 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소머라제(PPIase, peptidyl-prolyl cis-trans isomerase) 효소 활성을 가지고 있어, in vivo에서 단백질의 폴딩(folding)에 필수적이다. 게다가 사이클로필린의 PPIase 활성은 최근 세포내 단백질 트래피킹(trafficking)(Andreeva L, Heads R, Green CJ., Int J Exp Pathol 1999;80:305-15. 및 Caroni P, Rothenfluh A, McGlynn E, Schneider C., J Biol Chem 1991;266:10739-42), 미토콘드리아의 기능(Halestrap AP, Connern CP, Griffiths EJ, Kerr PM., Mol Cell Biochem 1997;174:167-72. 및 Connern CP, Halestrap AP., Biochem J 1994;302:321-4), 전구-mRNA(pre-mRNA) 프로세싱(Bourquin JP, Stagljar I, Meier P, et al., Nucleic Acids Res 1997;25:2055-61), 및 다중 단백질 집합체(multiprotein complex)의 안정성 유지(Andreeva L, Heads R, Green CJ. Cyclophilins and their possible role in the stress response. Int J Exp Pathol 1999;80:305-15)를 포함하는 다양한 세포 프로세스(cellular process)들에 관여하는 것으로 나타났다.

암세포 내에서의 사이클로필린 A의 기능에 대해서는 알려져 있지 않으나, 최근에 사이클로필린 A가 인간 췌장암 세포(Li M, Wang H, Li F, Fisher WE, Chen C, Yao Q., Am J Surg 2005;190:739-45 및 Shen J, Person MD, Zhu J, Abbruzzese JL, Li D., Cancer Res 2004;64:9018-26), 구강 편평상피 암세포(Fillies T, Werkmeister R, van Diest PJ, Brandt B, Joos U, Buerger H., BMC Cancer 2005;5:84. 및 Rey O, Baluda MA, Park NH., Oncogene 1999;18:827-31) 및 비소세포암(Howard BA, Furumai R, Campa MJ, et al., Cancer Res 2005;65:8853-60. 및 Howard BA, Zheng Z, Campa MJ, et al., Lung Cancer 2004;46:313-23) 등의 많은 암세포 내에서 발현된다는 사실이 보고되고 있다. 현재, 아폽토시스에의 사이클로필린A의 역할은 확실하지 않으나, 사이클로필린 A가 저산소증/재산소화(hypoxia/reoxygenation)에 대한 반응에서 심근세포(cardiac myocytes)로부터 방출되고 이들이 산화적 스트레스-유도된 아폽토시스로부터 심근세포를 보호할 수 있다는 것을 나타내는 몇몇 보고가 존재하나, 사이클로필린 A가 시스플라틴의 내성 억제에 중요한 역할을 한다는 것에 대해서는 전혀 알려진 바가 없다.

본 발명자들은 암세포 내에서 과발현된 사이클로필린 A의 역할을 밝히기 위해 저산소 조건 하에서 사이클로필린 A의 유도를 조사하였으며 저산소증- 또는 시스플라틴-유도된 세포사에서의 사이클로필린 A의 영향을 조사하였다. 이와 같은 연구에서, 본 발명자들은, 최초로, 사이클로필린 A가 HIF-1α 전사인자에 의해 전사적으로 유도된다는 것을 확인하였을 뿐만 아니라, 과발현된 사이클로필린 A가 암세포내에서 저산소증 및 시스플라틴 처리를 포함하는 세포 스트레스에 대항하여 세포를 보호한다는 놀라운 사실을 발견하고, 사이클로필린 A의 발현을 억제하는 물질이 시스플라틴에 대한 고형암의 내성을 억제할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 사이클로필린 A의 발현을 억제하는 물질을 포함하는 고형암의 시스플라틴에 대한 내성 억제용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 사이클로필린 A의 발현을 억제하는 물질 및 시스플라틴을 포함하는 항암조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 사이클로필린 A의 발현을 억제하는 물질을 투여하여 시스플라틴에 대한 고형암의 내성을 억제하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 사이클로필린 A의 발현을 억제하는 물질을 투여하는 고형암의 치료방법을 제공하는 데 있다.

하나의 양태로서, 본 발명은 시스플라틴에 내성을 가질 수 있는 고형암 세포에서 PPIase 활성을 가지는 사이클로필린 A의 발현을 억제하는 물질을 포함하는 고형암의 시스플라틴에 대한 내성 억제용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 시스플라틴에 의한 종양 세포의 아폽토시스를 억제하여 세포를 보호하는 사이클로필린 A를 억제하여 종양 세포의 아폽토시스를 유도함으로써 시스플라틴의 내성을 억제하는 효과를 가지는 조성물이다. 아폽토시스는 세포 수축, 염색질 응축, 핵 단편화(fragmentation) 및 막의 수포성 구조형성(blebbing)과 같은 현상이 일어나는 유전적으로 프로그램된 세포 사멸을 의미하며(Kerr et al., Br. J. Cancer 26:239-257, 1972; Wyllie et al., Int. Rev. Cytol., 68:251- 306, 1980), 특히 항상성을 유지하거나 이상을 초래하여 생체에 해롭게 된 세포, 즉 암세포, 바이러스 감염된 세포 등의 제거에 중요하다. 아폽토시스 조절의 실패와 질환 발생은 높은 상관 관계를 가지며, 특히 암과 같은 증식성 질환의 치료에서 아폽토시스의 유도는 매우 중요하고, 거의 모든 항암제는 내인적 아폽토시스 경로(intrinsic pathway)를 시작시킴으로써 아폽토시스를 유도하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에 있어서,“고형암(Solid cancer)”이라 함은 유방 또는 전립선 등의 고형 장기(solid organ)에서 비정상적으로 세포가 성장하는 것으로, 액체인 혈액에 영향을 끼치는 백혈병(leukemia)과 반대되는 개념이다. 본 발명의 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만 다음과 같은 여러 고형암 치료시에 시스플라틴의 내성을 억제하는데 유용하다: 방광, 유방, 장, 신장, 간, 뇌, 식도, 쓸개, 난소, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선, 전립선 및 피부(편평상피세포 암종 포함)와 같은 암종; 섬유육종 및 횡문근육종을 포함한 간충직 발원의 종양; 성상세포종, 신경모세포종, 신경교종 및 신경초종을 포함한 중추 및 말초 신경계의 종양; 및 흑색종, 정상피종, 기형종, 골육종, 색소건피증, 각화극세포증, 갑상선 여포상암 및 카포시 육종을 포함한 기타 종양, 바람직하게는 고환암, 난소암, 폐암, 두경부암, 경추암, 신경아세포종, 골육종, 자궁경부암, 전립선암 또는 직장암, 보다 바람직하게는 자궁경부, 전립선암 또는 직장암 치료시의 시스플라틴의 내성을 억제하는데 효과적이다.

상기 본 발명의 조성물에서 사이클로필린 A의 발현을 억제하는 물질은 PPIase 활성을 가지는 사이클로필린 A(CypA)에 대한 발현을 억제한다. 이는 PPIase 활성이 결여된 CypA R55A 변이체는 ROS(반응성 산소종) 생성 및 미토콘드리아 막의 탈분극을 악화시킴(CypA R55A 변이체는 H9c2 쥐의 심장 근모세포에 쥐 뇌의 CypA 변이 유전자가 형질 감염된 세포로서, 그 변이 유전자는 CypA 단백질의 55번 위치 아미노산 잔기가 아르기닌으로부터 알라닌으로 치환된 CypA 변이 단백질을 발현하며 이 변이 단백질은 야생형에 비하여 1/1000로 감소한 펩티딜-프롤릴-시스-트랜스 이소머라제(PPIase) 활성을 갖는다., 대한민국 등록특허 제10-0641295 참고)에 따라 종양 세포를 보호하는 작용을 가지지 않기 때문이다.

본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, HIF-1α의 직접적인 활성을 통한 사이클로필린 A은 저산소 상태에서 발현이 유도되고, 상기 유도된 사이클로필린 A는 저산소 상태 손상, 시스플라틴 처리 및 산화적 스트레스와 같은 세포적 스트레스에 저항하는 작용을 가진다. 또한 사이클로필린 넉다운이 시험된 세포주 내에서의 저산소 상태, 시스플라틴 처리 및 산화적 스트레스에 의해 유도된 아폽토시스를 악화시킨다. 따라서, 본 발명의 조성물은 이러한 사이클로필린 A의 발현을 억제함으로써 종양 세포의 아폽토시스를 유도한다. 또한, 하기 실시예에 나타난 바와 같이 사이클로필린 A의 발현을 억제하는 경우 아폽토시스의 중요한 조절자 중 하나인 p53이 존재하는 종양 세포뿐만 아니라 p53가 결핍된 종양 세포의 세포사를 유도할 수 있으므로, 본 발명의 조성물은 p53이 존재하는 종양 세포를 가진 암환자뿐만 아니 라, p53-결핍 암환자 내에서 종종 관찰되는 시스플라틴-내성을 극복하기 위해 효과적이다.

본 발명의 조성물은 또한, 파클리탁셀(paclitaxel) 및 5-플루오로우라실(5-fluorouracil)과 같은, 아폽토시스가 증가된 ROS와 직접적으로 관련되어 있지 않은 다른 항암제에 대해서는 내성 억제 효과를 가지지 않는다.(도 7)

바람직한 양태로서, 본 발명의 조성물은 사이클로필린 A의 발현 억제 물질로서 사이클로필린 A의 mRNA에 대한 siRNA 또는 사이클로필린 A 단백질의 mRNA에 상보적인 안티센스 핵산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, “siRNA”란 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자 치료의 방법으로 제공될 수 있다.

siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70염기이다. siRNA 말단 구조는 표적 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의해 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 또는 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 또한 siRNA는 표적 유전자의 발현 억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA 분자 또는 인공의 RNA 분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단 구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중 사슬 RNA 일반의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스텝 루프형 구조일 수도 있다.

본 발명에서 사용되는 siRNA는 그 자체로 폴리뉴클레오타이드 페어링을 갖는 완전한 형태, 즉 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 두 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태이거나, 생체 내에 투여된 후 이러한 형태를 갖도록 하나의 단일쇄 올리고뉴클레오타이드 단편과 이의 역방향(reverse) 상보물이 스페이서에 의해 분리된 단일쇄 폴리뉴클레오타이드로부터 유도될 수 있는 형태, 예를 들어 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유도된 siRNA 발현 카세트를 형질전환 또는 감염(infection) 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태일 수 있다. siRNA를 제조하고 세포 또는 동물로 도입하는 방법의 결정은 목적 및 표적 유전자 산물의 세포 생물학적 기능에 따라 달라질 수 있다.

본 발명에서 용어, “안티센스 핵산”이란 특정 mRNA 의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징이 있다. 본 발명의 안티센스 서열은 사이클로필린 A mRNA에 상보적이고 사이클로필린 A mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, 사이클로필린 A mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기이다.

안티센스 RNA의 경우 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나, 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 RNA를 합성하는 한 예는 RNA 폴리머라제Ⅰ를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

구체적인 일 실시예로서, 본 발명자는 다음과 같은 사이클로필린 A의 siRNA를 제조하였다 :

CypA-siRNA(서열번호 1 : 센스,5'-UGACUUCACACGCCAUAAUdTdT-3';

서열번호 2 : 안티센스, 5'-AUUAUGGCGUGUGAAGUCAdTdT-3')

본 발명의 조성물은 사이클로필린 A의 siRNA 또는 사이클로필린 A 안티센스 핵산의 1종 이상을 포함하는 외에, 환자의 암 세포의 증식 또는 내성을 억제시키는 추가의 물질을 포함할 수 있으며, 또는 siRNA 또는 안티센스 핵산 분자의 유입을 촉진시키는 제제, 예를 들어 리포좀(미국 특허 제4,897,355호, 제4,394,448호, 제4,23,871호, 제4,231,877호, 제4,224,179호, 제4,753,788호, 제4,673,567호, 제4,247,411호, 제4,814,270호)을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류 중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수도 있다. 또한 안티센스 핵산은 세포에 의해 흡수되는 펩티드에 접합시킬 수도 있다. 유용한 펩타이드의 예로는 펩타이드 호르몬, 항원 또는 항체 및 펩타이드 독소 등이 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 단독으로 사용할 수 있지만, 치료 효율을 증가시키고 내성을 감소시키기 위해 방사선 요법 또는 화학 요법(세포 성장 정지 또는 세포 독성 물질, 항생 물질형 물질, 알킬화제, 항대사성 물질, 호르몬제, 면역제, 인터페론형 물질, 사이클로옥시게나제 억제제, 메탈로매트릭스프로테아제 억제제, 텔로머라제 억제제, 티로신 키나제 억제제, 항성장인자 수용체 물질, 항-HER 물질, 항-EGFR 물질, 항-혈관생성 물질, 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, ras-raf 시그날 전도 경로 억제제, 세포 주기 억제제, 기타 cdk 억제제, 튜불린 결합체, 토포이소머라제Ⅰ 억제제, 토포이소머라제 Ⅱ 억제제 등)과 같은 다른 항암 치료법과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있고, 경구 투여시에는 결합체, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 사이클로필린 A의 발현을 억제하는 물질 및 시스플라틴을 포함하는 항암조성물에 관한 것이다.

본 발명의 항암조성물은 상기 시스플라틴에 대한 내성 억제용 조성물에 대한 담체, 투여 경로 및 투여량이 동일한 양상으로 적용될 수 있으며, 사이클로필린 A의 발현을 억제하는 물질과 시스플라틴의 조성 비율은 성별, 증상의 정도, 내성의 정도, 연령, 투여 방법 등의 다양한 인자를 고려하여 당업자가 적절하게 결정할 수 있다.

본 발명은 또 다른 일 양태로서, 사이클로필린 A의 발현을 억제하는 물질을 환자에게 투여하여 시스플라틴에 대한 고형암의 내성을 억제하는 방법을 제공하는 데 있다.

구체적으로 본 발명의 고형암 내성 억제 방법은 본 발명의 시스플라틴에 대한 내성 억제용 조성물을 약학적 유효량으로 당해 분야에서 공지된 투여 경로를 이용하여 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 이에 추가적으로 공지의 내성을 억제시키는 물질 등을 함께 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물에 함유되는 siRNA 또는 안티센스 핵산의 유효 투여량의 범위는 성별, 체표면적, 암의 종류 및 중증도, 연령, 약물에 대한 민감도, 투여경로 및 배출비율, 투여시간, 치료기간, 표적세포, 발현 수준 등 기타 의학 분야에 잘 알려진 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 사이클로필린 A의 발현을 억제하는 물질을 투 여하는 고형암의 치료방법을 제공한다. 구체적으로 본 발명의 고형암 치료 방법은 본 발명의 시스플라틴에 대한 내성 억제용 조성물을 약학적 유효량으로 상기 본 발명의 내성 억제방법에서 언급한 바와 마찬가지로 당해 분야에서 공지된 투여 경로를 이용하여 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 이에 추가적으로 예를 들어 공지의 항암제와 같은 암을 치료하는 물질 또는 내성을 억제시키는 물질 등을 함께 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예

실험물질 및 방법

실시예 1. 세포 배양 및 저산소증

인간 전립선 암종 DU145, 인간 자궁경부 암종 HeLa, 인간 직장암종 HCT116 p53^+/+과 p53^-/-세포는 10% 우태아 혈청, 100U/ml penicillin 및 100ug/ml streptomycin이 첨가된 RPMI1640 배지에서 배양시켰다. 쥐의 섬유아세포 NIH3T3, 간모세포종(hepatoblastoma) HepG2 및 인간 태아 신장(human embryonic kidney) HEK 293 세포를 상기와 같은 성분이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium에 서 배양한다. 일정한 시간동안 hypoxia chamber(0.5% O₂) 내에 상기 세포들을 두고 저산소 상태를 발생시켰다.

실시예 2. RT - PCR

사이클로필린 A의 mRNA 분석을 하기 위하여, TRIzol 시약(Invitrogen)을 사용하여 세포로부터 전체 RNA를 제조하였다. 전체 RNA(2㎍)를 AMV 역전사효소(reverse-transcriptase)(Promega) 및 Taq polymerase를 사용하여 두 단계 프로토콜에 의해 증폭시켰다. 사이클로필린 A 전사체를 증폭시키기 위한 프라이머들은 다음과 같다:

forward: 5'- GCAAGCTTACCATGGTCAACCCCACC -3' (서열번호 3)

reverse: 5'- GCGGATCCGAGTTGTCCACAGRCGGA -3' (서열번호 4)

GAPDH를 RT-PCR을 위한 내부 대조군으로서 증폭시켰다. 증폭하고 제어했다. 1% agarose gel로 증폭된 부산물을 분리하였다.

실시예 3. 사이클로필린 A 프로모터 분석을 위한 플라스미드의 제작

상기 사이클로필린 A 프로모터 서열을 Genomatrix의 MatInspector를 사용하여 분석했다(http://www.genomatrix.de). 네가지 저산소증-반응 요소(HRE) 후보 자(candidates)를 상기 사이클로필린 A 프로모터 내에서 확인하였다. 루시퍼라제 리포터 플라스미드의 제작을 위해, PCR을 통하여 연속적으로 200bp씩 삭제하여 Cyp A 프로모터 서열의 1012 염기쌍(bp)을 제거하였다. 삭제된 절편들은 HindIII와 KpnI과 함께 pGL3 basic 벡터(Promega) 내로 클로닝하였다. 변이분석(mutational analysis)을 위해, CypA 프로모터상의 각각의 추정적인 HRE 자리(putative HRE site)는 PCR-based site-directed mutagenesis에 의해 변이시켰다. CypA promoter 또는 변이된 HRE(Hypoxia Response Element) site의 다양한 부분을 포함하는 luciferase reporter를 제작하기 위한 프라이머는 다음과 같다.

pGL3-CypA-200 forward, 5'-GCGGTACCCCTGGCCTACAAGTGCATTTT-3'(서열번호 5)

pGL3-CypA-200 reverse, 5'-GCCAAGCTTGGCTAATAGTACACGGTTTTC-3'(서열번호 6)

pGL3-CypA-1012 forward, 5'-CCGGTACCATGTGTCGTCCCCATCAG-3'(서열번호 7)

pGL3-CypA-47M forward, 5'-GGGAGGCCGGCT TATA CCGTTTTGCAGAC-3'(서열번호 8)

pGL3-CypA-47M reverse, 5'-GTCTGCAAAACGG TATA AGCCTGGCCTCCC-3'(서열번호 9)

pGL3-CypA-77M forward, 5'-GCCCCTTTTATAC TATA TTCGGCCCCGCCC-3'(서열번호 10)

pGL3-CypA-77M reverse, 5'-GGGCGGGGCCGAA TATA GTATAAAAGGGGC-3'(서열번호 11)

pGL3-CypA-309M forward, 5'-ACTGACCCTCCCC TATA CCCCGCGTCCCGT-3'(서열번호 12)

pGL3-CypA-309M reverse, 5'-ACGGGACGCGGGG TATA GGGGAGGGTCAGT-3'(서열번호 13)

pGL3-CypA-589M forward, 5'-TGGTAGGACGCGA TATA GTGTTTGCCCGCG-3'(서열번호 14)

pGL3-CypA-589M reverse, 5'-CGCGGGCAAACAC TATA TCGCGTCCTACCA-3'(서열번호 15)

실시예 4. 루시퍼라제 어세이

내부 대조군 플라스미드인 pSV-β-gal과 함께 0.5㎍의 pGL3 basic-유래의 플라스미드를 사용하여 NIH3T3, DU145 및 HeLa 세포를 형질감염시켰다. 상기 세포들을 12시간 저산소 상태에 노출시키고, 150㎕의 lysis buffer 내에서(1% Triton X-100, 25mM Gly-Gly, 15mM MgSO₄ 및 2mM EGTA, pH 8.0)를 수확하였다. 루시퍼라제와 β-gal 활성을 microplate reader를 사용하여 각각의 세포 분리물 20㎕을 사용하여 측정하고, 종래 보고된 바와 같이(Haque M, Davis DA, Wang V, Widmer I, Yarchoan R., J Virol 2003;77:6761-8) β-gal 활성을 기초로 하여 루시퍼라제 활성을 평준화시킨다.

실시예 5. 핵 추출물의 제조 및 Electrophoretic Mobility Shift Assay( EMSA )

핵추출물들은 종래 보고들에 따라 제조되었다(Shibanuma M, Kuroki T, Nose K., Oncogene 1990;5:1025-32., Semenza GL, Wang SL., Mol Cell Biol 1992;12:5447-54. 및 Semenza GL, Jiang BH, Leung SW, et al., J Biol Chem 1996 20;271:32529-37) EMSA는 CypA 프로모터 서열로부터 유래된 올리고뉴클레오티드(CypA-WT, 5’-CCTTTTATAC CACG TTCGGCCCCG-3’(서열번호 16);CypA-M, 5’-GCCCCTTTTATAC TATA TTCGGCCCCGCCC-3’(서열번호 17))를 사용하여 수행하였다. 올리고뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 가닥을 이중-가닥 올리고 뉴클레오티드로 결합시키고 [r-³²p] ATP(Amersham Biosciences)을 사용하여 레이블링하였다. 12시간 동안 저산소상태 배양을 한 후에 DU145와 NIH3T3세포로부터 핵 추출물을 수득하였다. 핵 추출물은(10㎍) 5X binding buffer(25% glycerol, 50mM Tis-HCL, pH 7.5, 250 mM NaCl, 5mM DTT, 1mg/ml poly(dI-DC), 5mM EDTA) 내에서 배양하였다. 추출된 핵과 방사성 동위원소로 레이블링한 올리고뉴클레오티드의 상호작용을 위하여, 30분간 상온에서 상기 반응 혼합물을 인큐베이션시켰다. 경쟁적 어세이(competition assay)를 위하여, 100배 초과량의 레이블되지 않은 올리고뉴클레오티드를 방사선동위원소로 레이블링한 프로브를 추가하기에 앞서 상기 반응 혼합물에 부가했다. 상기 샘플을 5%의 non-denaturing polyacrylamide gel상에 통과시켰다. 상기 겔을 그후 건조하여 -80℃에서 증감지(intensifying screen)를 사용하여 x-ray필름에 노출 시켰다.

실시예 6. MTT(3-(4,5- dimethylthiazol -2- yl )-2,5- diphenyltetrazolium bromide) 어세이

세포 생존 능력을 12 웰 플레이트 내에서 MTT conversion 어세이를 사용하여 평가하였다. 배양 배지는 0.5 mg/mL 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide(Sigma-Aldrich)를 포함한 배지 1ml로 교체되었고 37℃에서 60분간 배양하였다.

MTT 기질상에서의 미토콘드리아 효소 활동에서 유래된 푸른색의 테트라졸륨 결정들을 blue color tetrazolium crystal miticondreal 효소에 의한 활성화로부터 MTT기질을 150㎕ DMSO를 사용하여 녹였다. 광학 밀도를 microplate reader에서 595nm로 읽었다.

세포의 생존을 미처리된 세포의 흡광도와 비교하여 흡광도의 백분율로 나타냈다.

실시예 7. 세포주기분석

60% 컨플루언스(confluence)까지 세포를 배양시키고, S 단계(S phase)에 있는 세포를 정지시키기 위해 24시간동안 2mM 티미딘(thymidine)으로 처리했다. 세포 들을 PBS로 씻어내고 일정한 기간 동안 새로운 배지에서 배양했다. 세포주기 분석을 위해 세포를 수확하고, PBS를 사용하여 씻고, 밤새 4℃에서 70% 에탄올을 사용하여 고정시켰다. 고정된 세포들은 원심분리하여 0.05mg/ml 요오드화 프로피디움(propidium iodide) 및 0.2 mg/ml RNase-A을 포함하는 1ml PBS에서 재분산하고 이후 1시간 동안 4℃에서 배양하였다. 세포주기를 분석하기 위해 DNA 내용물을 FACSCalibur flow cytometer(Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ)을 사용하여 결정하였다.

실시예 8. ROS 의 분석 및 미토콘드리아 막 전위(Δψ _m ) 측정

ROS를 2'-7'-디클로로디히드로플루오레세인 디아세테이트(DCF-DA. Molecular Probe) 염색제를 사용하여 측정하였다. 인간 전립선 암종 DU145 세포들을 완전 배지(complete medium)에서 80%의 컨플루언스가 될 때까지 배양시키고 시스플라틴을 처리하거나 처리하지 않았다. 그 후에, 상기 세포들을 10uM DCF-DA와 함께 37℃에서 30분 동안 로딩한 후에 PBS 1ml에 재분산하였다. 형광은 유세포분석기(flow cytometer)를 사용하여 측정하였다(FACSCalibur flow cytometer(Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ). 평균 DCF 형광 강도는 488nm에서의 여기(excitation) 및 525nm에서의 방사(emission)로 측정하였다. 미처리된 세포들은 ROS 레벨을 위한 참조로서 사용되었다. 미토콘드리아 막 전위는 3,3-디헥실옥사카보시아닌 아이오다이 드(3,3-hexyloxacarbocyanine iodide) 염색제(DiOC₆, Molecular Probes)를 사용하여 측정되었다. 시스플라틴(30μM)의 처리 후에, 세포들을 40nM DiOC₆와 함께 37℃에서 로딩하여 유세포 분석 전에 1ml의 PBS에서 재분산했다. DiOC₆를 488nm에서 여기시키고, 525nm에서 형광을 분석하였다.

실시예 9. 세포 내( subcellular ) 분별

세포를 lysis buffer(250mM 수크로오스, 0.1M EDTA, 2mM HEPES, pH 7.4)에 분산시키고, 동질화하여 10분 동안 900g에서 원심분리하였다. 그 후에 상층액(부유물, supernatant)를 20분 동안 10,000g에서 다시 원심분리하였다. 그 결과로 나온 상층액(cytosol)을 15% SDS-PAGE를 하고, 세포질 분획을 성공적으로 미토콘드리아 분획에서 분리하기 위한 항-시토크롬 c 옥시다제 서브유닛(anti-cytochrome c oxidase subunit Ⅳ(COX4) 항체(clonetech)를 사용하여 이뮤노블러팅을 하는 것에 의해 분석하였다.

실시예 10. Hoechst staining

세포들을 30분동안 Hoechst 33342(Molecular Probe) 로딩 염색제와 함께 배양하고 4% 포름알데하이드 내에서 20분 동안 고정시켰다. 냉장고에서 보관한 4℃의 PBS로 세 번 세척한 후, 염색된 세포들을 공초점 레이저 현미경(confocal laser microscope, META 510, Zeiss)을 사용하여 모니터하였다. 아폽토시스된 세포들은 핵의 응축 및 파쇄에 의해 표시되었다.

실시예 11. 안정한 형질감염

pcDNA3-CypA/WT(3㎍), 또는 pcDNA3(3㎍) 단독을 DU145 세포내로 GenePOTER(Genlantis)를 사용하여 형질감염시킨다. 안정된 형질감염에 사용하기 위한 세포들을 선택적 배지에서 G418 600mg/ml과 함께 한 달 동안 배양했다. 그 후에, 약제-내성을 가진 각각의 클론들을 분리하고 선택적 배지의 존재 내에서 추가적인 증폭을 위해 6개의 웰 플레이트에 옮겼다.

실시예 12. small interfering RNA( siRNA )

사이클로필린 A(CypA-siRNA) 또는 대조군 서열(control-siRNA)에 특이적인 siRNA들을 Eurogene tech(Intron Biotechnology, Kyungki, korea)로 제조하였다. siRNA(0.5㎍)를 METAFECTENE 형질감염 시약(Biontex, Munich, Germany)을 사용하여 세포내로 형질감염시켰다. siRNA 목적 서열들은 다음과 같다:

CypA-siRNA(센스,5'-UGACUUCACACGCCAUAAUdTdT-3'(서열번호 1); 안티센스, 5'-AUUAUGGCGUGUGAAGUCAdTdT-3'(서열번호 2)) 및 대조군-siRNA(universal negative control). 사이클로필린 A의 간섭에 기초한 siRNA의 효율은 이뮤노블럿에 의해 모 니터하였다.

실시예 13. 재조합 아데노바이러스

CypA/WT(야생형 사이클로필린 A, Cyclpphilin A/Wild type) cDNA를 pCA14내로 복제했다. 상동적인 재조합을 위하여 pCA14-CypA를 vmRL-H5dl 324Bst와 함께 E.coli BJ 5183내로 transform 시켰다. 재조합된 아데노바이러스를 HEK293 세포에서 증식 시켰다. 바이러스 DNA 구조는 hindIII 제한효소 소화(hindIII restriction enzyme digestion)에 의해 확립한다. 아데노바이러스 스톡(stocks)을 4시간 동안(444,000g, 10℃) 세슘 구배(cesium gradient)를 통해 정제하고 표준 플라그 어세이(standard plaque assay)를 사용하여 적정하였다. 외인성 사이클로필린 A를 발현시키기 위해 세포들을 재조합 아데노바이러스를 사용하여 300의 MOI로 24시간동안 감염시켰다. adeno-GFP(Ad)로 감염 되지 않았거나 혹은 감염된 세포들을 사이클로필린 A 발현을 위한 음성 대조군으로 사용하였다.

실시예 14. 이뮤노블러팅

세포추출물을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)으로 분리하고, 니트로셀룰로즈 막 상으로 이동시켰다. 블로킹 후에 상기 막을 표지된(indicated) 일차 항체와 함께 배양하고 이후 2차 항체로 배양 하였다. 샘플들은 강화(enhanced) 화학발광 시약으로 탐지했다(Santa Cruz).

조건을 지정하지 않고(Unless specified), 모든 이뮤노블럿 분석을 위한 샘플 단백질의 양을 표준화하기 위해 액틴 단백질을 이뮤노블럿하였다. 사이클로필린 A, PARP, 시토크롬 c, 또는 액틴에 대한 항체들은 Santacruz 및 Upstate Biotechnology로부터 구입하였다.

결과

1. 사이클로필린 A는 저산소상태에 대한 반응에서 전사적으로 상향조절된다.

사이클로필린 A 유전자가 저산소상태에 의해 유도될 수 있는지를 조사하기 위하여, 지시된 기간의 시간동안 저산소상태에 노출된 섬유아세포 NIH3T3로부터 추출된 mRNA를 사용하여 RT-PCR 분석을 수행하였다. 대조군으로서 사용된 GAPDH mRNA가 변화하지 않은 반면(도 1A), 사이클로필린 A 전사체들은 배양 3시간 후 증가하였고, 12시간 까지 계속 증가하였다. 이러한 결과를 확증하기 위하여, 저산소 조건하에서 배양하는 대신 저산소증을 모방하는 약물인 CoCl₂를 사용하여 RT-PCR 분석을 반복하였다. 사이클로필린 mRNA에의 증가는 CoCl₂ 처리 12시간 후에도 관찰되었다(도 1B). 본 발명자는 사이클로필린 A 유전자 발현에의 증가는 전사율(transcription rate)의 증가에 의한 전사 단계에서 이루어지는지 또는 mRNA 안정화에 의한 전사-후 단계에서 일어나는 것으로 가정하였다. mRNA 안정화의 가능성 을 제외하기 위해, 9시간 동안 저산소상태에서 사이클로필린 A의 유도 및 이후 저산소 또는 정상산소상태 하에서 악티노마이신 디(Actinomycin D) 5㎍/ml를 처리함에 의해 저산소상태에서의 사이클로필린 A mRNA의 수준을 정상 산소상태와 비교했다. 악티노마이신 디는 사이클로필린 전사의 드 노보 합성(de novo synthesis)을 저해하지 않았다. 도 1C에 나타난 바와 같이, 사이클로필린 A mRNA의 반감기는 양쪽 조건 모두에서 유사한 것으로 판명되었다. 이러한 결과들은 mRNA의 안정화가 아닌 전사 활성이 저산소 조건에서 사이클로필린 A의 유도를 유발한다는 것을 증명한다. 사이클로필린 A의 축적이 사이클로필린 A 단백질의 증가된 수준을 유발하는 것인지의 여부를 결정하기 위해, 일정기간동안 저산소 상태에 놓아둔 섬유아세포 NIH3T3 세포 전체 용해물을 사용하여 이뮤노블러팅 분석을 수행하였다. 도 1D에서 나타나는 바와 같이, 대조군으로 사용된 액틴 단백질의 수준은 계속 일정한 데 반해, 저산소 상태에 3시간 노출 후에 사이클로필린 A 단백질에의 빠른 증가가 관찰되었고, 노출 12시간까지 계속 증가하였다.

2. 사이클로필린 A 프로모터는 HIF -α 전사 인자에 의해 활성화 된다 .

저산소상태에 의한 사이클로필린 A의 상향조절은 사이클로필린 A 프로모터가 HIF-1α 결합부위(binding site)인 저산소상태-반응인자(hypoxia responsive element, HRE)를 가지고 있는지의 여부를 조사하도록 하였다. 우선, 인간 사이클로필린 A 유전자의 프로모터의 생물정보 분석은 일치하는 HRE 서열 5‘-CGTG-3'을 찾 는 것으로 수행되었다. 사이클로필린 개시 코돈으로 -47bp(HRE1), -77bp(HRE2), -309bp(HRE3) 및 -589bp(HRE4) 올라간 곳에 위치한 네 가지의 추정적인 HRE 서열들을 알아내었다(도 2A).

어떤 HRE(hypoxia responsive element)가 저산소상태에 반응하는지를 알아보기 위해, 1012bp 사이클로필린 프로모터의 다양한 영역을 포함하는 몇가지의 루시퍼라제(luciferase) 리포터 구성물을 제조하였다(도 2A). 사이클로필린 A 프로모터의 활성은 저산소 조건하에서 12시간 배양한 후 루시퍼라제 어세이에 의해 관찰되었다. 정상산소상태 또는 저산소상태 어느쪽도 비어있는 pGL3-basic plasmid에 대해 어떠한 루시퍼라제 활성이 관찰되지 않았다. 그러나, pGL3-Cyp A-200 및 pGL3-Cyp A-1012에 대해서는, 정상 산소 상태에 비해 저산소 상태 하에서 거의 두 배의 증가가 있었다(도 2B). 그러므로, 이것은 pGL3-Cyp A-200 및 pGL3-CypA-1012가 HRE1 및 HRE2 자리를 가지고 있기 때문에, pGL3-Cyp A-200 및 pGL3-CypA-1012가 저산소상태-유도된 루시퍼라제 활성을 나타냄을 제안한다. 사이클로필린 A 프로모터의 추가적인 결실 분석은 HRE2 자리가 없는 루시퍼라제 구성물은 어떠한 것이든 저산소 조건에 반응하지 않음을 나타낸다. HRE2 자리가 저산소 상태의 유도의 원인임을 증명하기 위해, 사이클로필린 A 프로모터 상의 각각의 HRE 자리(5‘-CGTG-3')를 5’-TATA-3'로 변이시켰다. pGL3-CypA-47M,pGl3-CypA309M 및 pGL3-CypA-589M는 정상 산소 상태에 비해 저산소 상태에 대해 약 두배의 루시퍼라제 활성의 증가를 나타내었다. 이와 대조적으로, 변이된 HRE2를 포함하는 pGL3-Cyp A-77M의 루시퍼라제 활성은 저산소 상태에 의해 유도되지 않았으며, 이는 HRE2 자리가 저산소상태에 의한 사이클로필린 유도의 원인이 됨을 나타내는 것이다. HIF1-α는 저산소 상태에서의 중요한 전사 인자로 알려져 있다(Semenza GL. Regulation of mammalian O₂ homeostasis by hypoxia-inducible factor 1. Annu Rev Cell Dev Biol 1999;15:551-78). 따라서, pcDNA3-HIF-1α의 형질감염에 의해 HIF-1α를 과잉발현시켰고, HIF-1α가 사이클로필린 1의 전사체를 유도하는지 여부를 결정하기 위해 대조군과 정상산소상태에서의 형질전환페의 루시퍼라제 활성을 비교하였다. 저산소 상태 실험에서, 기능적인 HRE2를 포함하는 모든 루시퍼라제 구조물들은 pcDNA3-HIF-1α가 공형질감염(cotransfected)되는 경우 2배 증가한 루시퍼라제 활성을 보여준다(도 2B). 흥미롭게도 다른 사이클로필린 루시퍼라제 구성물에 비해 pGL3-CypA-200은 정상 산소 상태에서 낮은 루시퍼라제 활성을 나타내었다(도 2B). 또한, HIF-1α 형질감염 실험에서의 pGL3-CypA-1012와 비교하여, pGL3-CypA-200은 더욱 약한 근본적인 루시퍼라제 활성을 나타내며, 이는 다른 cis-acting 요소가 HRE2의 상류(upstream)에 위치한 사이클로필린 A의 일반적인 발현을 요구함을 나타내는 것이다. 최종적으로 사이클로필린 A의 개시코돈으로부터 -317bp에 추정적인 GC box를 두었다.

다음으로, 사이클로필린 A는 정상세포보다 암세포에서 더 잘 발현된다는 것이 알려져 있기 때문에, CypA는 보통 세포안에 종양에서 발현된다고 보고되었기 때문에 HeLa 그리고 DU145세포와 같은 암세포에서의 pGL3-CypA-1012의 루시퍼라제 활성화를 측정했다.

도 2C에 나타난 바와 같이, 루시퍼라제 활성은 저산소상태 및 HIF-1α 형질감염에 의해 이러한 암세포들에서 각각 3.5 및 3배 증가했다. 그러므로 이는 HIF-1α가 저산소상태에 대한 사이클로필린 A의 발현을 조절함을 나타내고 있다.

3. 사이클로필린 A 프로모터의 HRE 서열에의 HIF -1α의 결합

HIF-1α가 CypA 프로모터의 HRE2 서열에 결합하는지를 알아보기 위해 저산소 상태로 12시간 배양한 DU145 세포로부터의 핵추출물을 사용하여 EMSA 실험을 수행했다. 이 실험에서는 HRE2의 야생형 또는 변이된 형태를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. 첫 번째로, 정상 산소 상태에서 HIF-1α가 CypA 프로모터의 HRE2 서열에 결합하는지 검사했다. 변이된 HRE2를 포함하는 ³²p-labeled oligonucleotide는 그렇지 않은 반면, 야생형 HRE2를 포함하는 ³²p-labeled oligonucleotide는 정상 산소 상태에서 배양된 DU145 세포에서 추출한 핵단백질과 함께 복합화되었다(도 2D, 1 및 2 lane). 변이된 HRE2를 포함하는 올리고뉴클레오티드가 복합물을 형성하지 않는데 반해, 저산소 상태의 조건 하에서 배양된 경우 복합물은 더 잘 관찰되었다(도 2D, 4 및 5 lane). 이 복합물의 특이성은 과량의 레이블 되지 않은 동일한 올리고뉴클레오티드를 사용한 경쟁적 억제에 의해 증명되었 다(도 2D 3 및 6 lane). NIH3T3로부터의 핵 추출물을 이용한 일치하는 EMSA 데이터를 재현함으로써 결과를 확인하였다. 그러므로, 사이클로필린 A의 상향조절이 결국 저산소상태에 반응하는 HIF-1α에 의해 매개되는 것으로 결론지었다.

4. 사이클로필린 A는 ROS 증가의 억제 및 미토콘드리아 막 전위의 감소에 의해 저산소 - 및 시스플라틴 -유도된 세포사에 대하여 세포를 탈감작시킨다 .

HIF-1α는 고형 종양세포의 생존과 성장 역할에 중요하다고 알려져 왔다(23. Carmeliet P, Dor Y, Herbert JM, et al., Nature 1998;394:485-90. 및 Mizuno T, Nagao M, Yamada Y, et al., Cancer Gene Ther 2006;13:131-40). 저산소 상태하에서 HIF-1α 전사 인자를 경유하여 사이클로필린 A가 유도되는지를 연구했다. 그래서 CypA가 고형 종양 세포의 성장 및 생존, 특히 저산소 상태, 시스플라틴 및 H₂O₂ 처리와 같은 산화적 스트레스를 포함하는 세포 스트레스에 대해 반응함에 있어 중요한 역할을 한다고 가설을 세웠다.

첫 번째 저산소상태로 초래된 세포사멸에서의 CypA의 역할을 평가하기 위해 DU145 세포를 안정하게 mock vector, pcDNA3-CypA/W로 감염시키거나 또는 CypA-siRNA를 사용하여 일시적으로 감염시킨 후에 MTT 어세이를 수행하였고 4일 동안 저산소 상태에 노출시켰다. 저산소 상태 실험에 앞서, 이뮤노블러팅에 의해 형질감 염된 세포 내에서 외인성 사이클로필린의 발현 수준을 평가하였다(도 3A). 내인성 사이클로필린 A에 비하여, 외인성 사이클로필린 A는 발현에 있어 거의 두배 증가를 보였다. 더욱이 siRNA 특유한 간섭에 의해 사이클로필린 A의 발현이 거의 95%정도 억제 됐다(도 3A). 도 3B에 나타난 바와 같이, 4일간 저산소 상태에 노출되었던 사이클로필린 형질감염체들은 mock transfectants 보다 두드러지게 높은 세포 생존률을 보였다; 사이클로필린 A 넉다운은 형질감염체 사이에서 가장 높은 세포사를 나타내었으며, 이는 사이클로필린 A가 저산소상태-유도된 세포사로부터 세포들을 보호함을 나타내는 것이다.

다음, MTT 어세이를 통하여 CypA 형질감염체 및 사이클로필린A가 넉다운된 세포군이 시스플라틴에 대해 갖는 화학내성에 대해 알아보았다. 시스플라틴은 세포사를 일으키나 사이클로필린 A 형질전환체는 mock transfectant 보다 높은 세포 생존율을 나타냈다.

대조적으로, 사이클로필린 A 넉다운된 세포들은 대조군 siRNA 형질전환체에 비해 두드러지게 생존율이 낮아지는 것을 보였다(도 3B). 시스플라틴은 부분적으로 ROS의 발생을 통하여 아폽토시스를 유발한다고 알려졌다. 사이클로필린 A의 과발현이 ROS의 생성 증가를 저해하는 것에 의해 아폽토시스를 완화시키는지 여부를 결정하기 위해서, 사이클로필린 A 형질전환체 및 사이클로필린 A 넉다운 샘플 모두에서 H₂O₂처리에 대한 세포 저항력을 시험하였다. 그림 3B를 보면 H₂O₂는 세포사를 일으켰으나, 사이클로필린 A 형질전환체는 mock 형질전환체에 비해 높은 생존율을 보였다. 대조적으로, 사이클로필린 A 넉다운 샘플들은 두드러게 낮은 세포 생존율을 나타낸다. 그러므로 각 형질전환된 세포주에서의 사이클로필린 A의 항산화 활성에 대해 평가했다. 그림 3C에서 명백하게 나타나는 바와 같이, 시스플라틴으로 처리하는 것은 ROS의 발생을 일으켰다. 흥미롭게도, 사이클로필린 A 넉다운은 ROS의 생성을 악화시키는데 반해, 사이클로필린 A의 과발현은 ROS를 두드러지게 증가시키지 않는다. 도 3D에서 나타나는 바와 같이, 사이클로필린 A 넉다운은 가장 두드러지는 시스플라틴-유도된 미토콘드리아 막 탈분극을 나타내고, mock 형질감염된 샘플들이 그 뒤를 따랐다. 이러한 데이터들은 사이클로필린 A 과발현이 시스플라틴-유도된 ROS 증가 및 미토콘드리아 막 전위의 손실을 억제하는 것을 나타낸다.

다음으로, 저산소 상태 및 H₂O₂ 처리된 조건 하에서 사이클로필린 A 형질전환체 및 사이클로필린 A 넉다운 샘플들에서의 세포 ROS 및 미토콘드리아 막 전위를 관찰했다. 시스플라틴-유도 아폽토시스에서 처럼 저산소상태 및 H₂O₂ 처리는 이러한 형질전환된 세포들 내에서 ROS 생성 및 미토콘드리아 막 탈분극에 있어 변화의 유사한 패턴을 유도하였다. 그러므로, 이는 사이클로필린 A가 최소한 부분적으로 그들의 항산화 역할의 결과로 세포를 스트레스-유도 세포사로부터 보호함을 보여준다.

5. 아폽토시스에 대한 Cyclophilin A의 세포보호 역활

사이클로필린 A 형질전환체 및 사이클로필린 넉다운 내에서 아폽토시스-관련 단백질 PARP 및 사이토크롬 c가 미토콘드리아로부터 사이토플라즘으로 방출되는 과정상에서 저산소상태, 시스플라틴 및 H₂O₂ 처리의 효과는 이뮤노블러팅을 사용하여 연구했다. 저산소상태 또는 시스플라틴 또는 H₂O₂를 사용한 처리 하에서의 세포들의 성장은 카스파제-3 기질인 PARP의 분리를 나타내고, 이는 85kDa의 분열된 PARP 산물의 존재로 알 수 있다(도 4A 및 4B). 따라서, 시토크롬 c의 방출 정도는 또한 세포 스트레스와 함께 증가된다. 예상된 바와 같이, 사이클로필린 A의 과발현은 PARP 및 시토크롬 c 방출 과정을 감소시킨다(도 4A). 대조적으로 사이클로필린 A 넉다운은 PARP 및 시토크롬 c의 세포질 방출을 대조군-siRNA에 비해 두드러지게 증가시켰다(도 4B). 또한 시스플라틴-유도된 아폽토시스에서의 사이클로필린 A의 저해는 Hoechst 염색에 의해 증명되었다(도 4C). 이러한 데이터는 사이클로필린 A 과발현이 저산소상태, 시스플라틴 및 H₂O₂에 대한 아폽토시스-관련 단백질의 반응을 탈감작시킴을 증명하는 것이고, 이는 암세포들에서 과발현된 사이클로필린 A가 스트레스-유도된 아폽토시스를 완화시킴으로써 세포를 보호할 수 있음을 보여준다.

6. 세포사에 대한 사이클로필린 A의 세포보호역할은 세포종에 한정되지 않는 다.

다음으로, 본 발명이 인간 전립선 DU145 암세포에만 한정되는지 여부를 결정하기 위하여, 또한 HepG2 및 HeLa 세포 내에서 저산소, 시스플라틴 또는 H2O2 유도된 아폽토시스에서의 사이클로필린 A 저해역할에 대해 시험하였다. 우선, HepG2 및 HeLa 세포들에서 사이클로필린 A 아데노바이러스 또는 사이클로필린 A 넉다운을 확립한 후, 사이클로필린 A의 단백질 발현 수준을 시험하였다. 사이클로필린 A 감염체들에서, 외인성 사이클로필린 A는 내인성 사이클로필린 A(도 5A)에 비해 거의 1.5 배 발현되었다. 예상된 바와 같이, si-RNA-기반의 사이클로필린 A 저해 또한 HepG2 및 HeLa 세포들 양쪽에서 효과적으로 사이클로필린 A 발현을 억제하였다. 도 4B 및 4C에서 나타난 바와 같이, 저산소 상태, 시스플라틴 또는 H2O2 처리를 하였을 때 사이클로필린 넉다운 샘플들이 증가된 세포사를 발생시키는데 반해, 사이클로필린 A 감염체들은 mock 샘플들에 비해 감소된 세포사를 나타내었다. 이러한 결과는 명백하게 아폽토시스를 억제하는 사이클로필린의 능력이 특정 세포에 한정되는 것이 아님을 나타낸다.

또한 p53이 아폽토시스의 중요한 조절자의 하나이기 때문에, CypA knockdown이 p53 결핍된 세포들에서의 아폽토시스를 악화시키는지 여부를 실험하였다. 이 실험에서 HCT116 p53^+/+와 HCT116 p53^-/- 세포주 내에서 siRNA 저해에 의해 사이클로필린 A를 성공적으로 억제하였다. 세포 스트레스에 대한 사이클로필린 A 넉다운의 저 항력은 HCT116 p53^+/+와 HCT116 p53^-/- 배경 내에서 관찰되었다. HCT116 p53^+/+ 및 HCT116 p53^-/- 양쪽에서, 사이클로필린 A 넉다운은 저산소 상태, 시스플라틴 또는 H2O2 처리된 경우, 대조군-si-RNA 에 비해 세포사가 증가했다. 그러므로 사이클로필린 A 넉다운은 p53의 존재 없이 조차도 아폽토시스를 두드러지게 악화시킬 수 있다고 결론지었다.

7. Cyclonphilin A는 세포의 증식에 영향을 미치지않는다.

최근에, 사이클로필린 A가 세포 증식에 영향을 미침으로써 종양의 성장을 증가시킬 수있다는 것이 제안되었다(Howard BA, Furumai R, Campa MJ, et al. Stable RNA interference-mediated suppression of cyclophilin A diminishes non-small-cell lung tumor growth in vivo. Cancer Res 2005;65:8853-60). 세포주에서 이러한 가설을 검증하기 위해, 세포주기 진행상에서 및 세포 배수기 상에서 사이클로필린 A의 역할을 관찰했다.

Mock, CypA 형질전환체 및 사이클로필린 A 넉다운을 성장시키고, 2mM 티미딘(thymidine)으로 싱크로나이즈하고 특정 기간 동안 새로운 배지에 방출시킨 후, DNA 내용물을 결정하기 위한 FACS 분석을 하였다. 도 6A에 나타나는 바와 같이, 각 세포주 내에서 정상 세포주기 진행이 관찰되었다. Mock, CypA transfectants 및 CypA knockdown을 16시간 넘게 관찰하였으나 DNA content는 별다른 차이점을 보이지 않았다. 게다가, 배수기에서도 다른 차이점은 없었다(도 6B). 배수기는 15시간 정도였다. 이러한 데이터들은 실험한 세포주 내에서 사이클로필린 A의 세포적 기능은 세포 증식보다는 아폽토시스와 관련될 수 있음을 제안한다.

상술한 바와 같이, 활성성분으로서 사이클로필린 A의 발현을 억제하는 물질을 포함하는 본 발명의 조성물을 시스플라틴에 내성을 갖는 고형암에 시스플라틴과 함께 복합 투여할 경우, 사이클로필린 A 과잉발현에 의한 저산소증 및 시스플라틴에 의해 유도된 세포사멸에 대한 종양 세포의 저항력을 감소시켜 기존의 항암제인 시스플라틴에 대한 고형암의 내성을 억제하여 적은 용량으로 최대의 효과를 낼 수 있도록 치료 효율을 높여 고형암의 치료 효과를 증대시킬 수 있다.

<110> KIM, SUNG SOO CHAE, WONCHAE CHOI, KYU JIN <120> A pharmaceutical composition for rendering resistance to cisplatin in cancer cells comprising a material inhibiting an expression of cyclophilin A and a method for rendering resistance to cispllatin in cancer cells by using them <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CypA-siRNA, sense <220> <221> misc_RNA <222> (1)..(19) <223> two dT(deoxythymine) are added in C-terminal of the sequence <400> 1 ugacuucaca cgccauaau 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CypA-siRNA, antisense <220> <221> misc_RNA <222> (1)..(19) <223> two dT(deoxythymidine) are added in C-terminal of the sequence <400> 2 auuauggcgu gugaaguca 19 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a foward primer for amplifying transcriptome of Cyclophilin A <400> 3 gcaagcttac catggtcaac cccacc 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying transcriptome of Cyclophilin A <400> 4 gcggatccga gttgtccaca grcgga 26 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGL3-CypA-200 forward primer <400> 5 gcggtacccc tggcctacaa gtgcatttt 29 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGL3-CypA-200 reverse primer <400> 6 gccaagcttg gctaatagta cacggttttc 30 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGL3-CypA-1012 forward primer <400> 7 ccggtaccat gtgtcgtccc catcag 26 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGL3-CypA-47M forward primer <400> 8 gggaggccgg cttataccgt tttgcagac 29 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGL3-CypA-47M reverse primer <400> 9 gtctgcaaaa cggtataagc ctggcctccc 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGL3-CypA-77M forward primer <400> 10 gcccctttta tactatattc ggccccgccc 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGL3-CypA-77M reverse primer <400> 11 gggcggggcc gaatatagta taaaaggggc 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGL3-CypA-309M forward primer <400> 12 actgaccctc ccctataccc cgcgtcccgt 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGL3-CypA-309M reverse primer <400> 13 acgggacgcg gggtataggg gagggtcagt 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGL3-CypA-589M forward primer <400> 14 tggtaggacg cgatatagtg tttgcccgcg 30 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGL3-CypA-589M reverse primer <400> 15 cgcgggcaaa cactatatcg cgtcctacca 30 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for EMSA of CypA-WT <400> 16 ccttttatac cacgttcggc cccg 24 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for EMSA of CypA-M <400> 17 gcccctttta tactatattc ggccccgccc 30

Claims (6)

1. 사이클로필린 A의 발현을 억제하는 물질을 포함하는 고형암의 시스플라틴 내성 억제용 약제학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 고형암은 전립선암, 자궁경부암 또는 직장암인 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 p53이 결핍된 환자의 고형암의 시스플라틴에 대한 내성 억제용인 약제학적 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 사이클로필린 A의 발현을 억제하는 물질은 siRNA 또는 안티센스 핵산인 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 1번의 서열을 가지는 siRNA인 조성물.
6. PPIase 활성을 가지는 사이클로필린 A의 발현을 억제하는 물질 및 시스플라틴을 포함하는 항암조성물.

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