KR101002163B1

KR101002163B1 - 사이클로필린 ｂ를 포함하는 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101002163B1
Application number: KR1020090029923A
Authority: KR
Inventors: 이진화
Original assignee: 동서대학교산학협력단
Priority date: 2009-04-07
Filing date: 2009-04-07
Publication date: 2010-12-17
Also published as: KR20100111475A

Abstract

본 발명은 사이클로필린 B를 유도 또는 억제함으로써 소포체 스트레스 관련 질환을 예방 및 치료하는 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 사이클로필린 B를 포함하는 당뇨병, 파킨슨병, 글루타민다량체 유발 응집 질환, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 허혈성 질환, 심혈관질환, 고호모시스테인증 및 동맥경화증으로 이루어진 군에서 선택되는 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이고, 또한, 본 발명은 사이클로필린 B의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는 소포체 스트레스 관련 질환인 고형암의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

사이클로필린 B, 소포체 스트레스, 아폽토시스

Description

사이클로필린 Ｂ를 포함하는 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING AND TREATING AN ER-STRESS MEDIATED DISEASE COMPRISING CYCLOPHILIN B}

소포체(ER, endoplasmic reticulum)의 내강은 번역 후 변형과 단백질의 폴딩(folding)을 위해 특수화된 세포적 환경이다. 소포체는 핵막으로부터 뻗어 나와 가지를 친 것 같은 막성분의 구조로서 리보좀이 붙어있는 조면소포체(rough endoplasmic reticulum)와 리보좀이 없는 활면소포체(smooth endoplasmic reticulum)의 두 가지가 있다. 세포 내 단백질의 약 1/3이 조면소포체에서 mRNA 에서 단백질로 번역 후 수정(posttranslational modification) 즉 폴딩(folding)과 조립(assembly), 당화(glycation) 및 이황화결합(disulfide bond) 등의 과정을 통해 활성형 단백질 구조가 된다. 또한 활면소포체는 지질과 스테롤의 합성장소이며 칼슘 저장소로 세포 내 칼슘 농도를 조절하는데 중요한 역할을 한다.

소포체 스트레스(ER stress)란 생리적 혹은 병리적 환경에 의해 소포체가 처리할 수 있는 능력 이상의 미성숙 단백질이 소포체 내로 유입이 되거나 소포체 내 칼슘이 고갈되어 소포체 기능에 장애가 발생하는 것을 말하며, 주로 단백질 폴딩 용량을 넘어서서 ER 단백질 폴딩 부하를 초과한 상태를 의미한다. 소포체 스트레스가 발생하면 세포는 생존하기 위한 방어기전을 가지는 데 이를 소포체 스트레스 반응(ER stress response)라고 한다. 소포체 스트레스 반응은 소포체 막에 존재하는 세 가지의 신호전달체계인 PERK (pancreatic ER kinase), IRE-1α/XBP-1 (inositol-requiring 1α/X-box binding protein 1) 및 ATF6 (activating transcription factor) 에 의해 매개된다.

소포체 스트레스 반응은 다음의 네 가지로 일어난다. 첫 번째 반응은 리보좀에서 mRNA로부터 단백질로 번역되는 것을 억제(translational attenuation)하여 소포체 내로 새로운 단백질이 유입되는 것을 감소시키는 것이다. 구체적으로, 정상적으로는 개시 메티오닐이 붙어있는 tRNA를 40S 리보솜 소 단위체로 수집하는 eIF2 (eukaryotic translation initiation factor 2) 중합체의 활성이 감소되는 결과로 단백질 합성이 줄어든다. 또한, 최근에 단백질 폴딩 부하를 줄이는 2가지 이상의 메커니즘이 설명되고 있는데, IRE1(ERN1로도 알려짐)-매개 ER-소재 mRNA 분해 메카니즘 (Hollien and Weissman, 2006), 또는 소포체 스트레스를 받은 세포에서는 p58^IPK(DNAJC3로도 알려짐)에 의해 ER로 가는 단백질이 합성과 동시에 단백질 분해 소체 분해를 하는 메카니즘이다 (Oyadomari et al., 2006; Rutkowski et al., 2007).

두 번째 반응은 단백질을 폴딩 시키는데 필요한 Bip(HSPA5로도 알려짐)와 같은 소포체 샤페론(chaperon)의 발현을 유도하여 소포체의 폴딩 능력을 향상시키는 것이다. 세포질 샤페론이 아닌 소포체 샤페론을 코딩하는 유전자의 전사는 UPR(unfolded protein response)로 알려진 신호전달 경로를 통해 활성화된다. 포유류에서, IRE1, PERK와 ATF6는 소포체 내강에서 잘못 폴딩된 단백질들의 존재를 감지하는 소포체 막 관통 단백질이다. 정상적인 상태에서 이 신호전달 분자들은 단백질 샤페론인 Bip가 있는 내강 영역의 상호작용을 통해 비활성 상태를 유지한다. Bip는 폴딩되지 않은 폴리펩티드 사슬과 상호작용하는 Hsp70 단백질 샤페론 집합체의 ER 소재 구성원이다. 소포체가 스트레스에 노출되었을 때 Bip 는 폴딩되지 않은 단백질에 결합하여 이 스트레스 센서들로부터 분비된다. Bip로부터 IRE1의 분비는 UPR 유전자 발현의 주요 전사 인자를 발생시키는 XBP1의 접합을 개시하기 위해 단백질 키나아제와 엔도리보뉴클라제 활성을 활성화시킨다. Bip로부터 분 비되었을 때 PERK가 활성화되고, eIF2의 알파 소단위를 인산화시키고 단백질 합성을 약화시킨다. 역설적으로, eIF2α 인산화는 선택적 mRNA들의 번역과 동시에 촉진된다. 예를 들면, eIF2α 인산화에 의한 전사인자 ATF4의 높은 번역 활성은 UPR 유전자의 약 33% 유도를 야기한다. 마지막으로, Bip 분비는 ATF6를 골지체로 이동시키고 골지체에서 핵으로 이동할 세포질 분절로 분해 Bip와 Grp94(HSP90B1로도 알려짐)와 같은 분자 샤페론과 ER 내재 폴딩 효소를 함유하는 UPR 유전자의 전사를 활성화시킨다.

세 번째 반응은 소포체 스트레스 관련 분해(ER stress-asoociated degradation, ERAD)로 소포체에서 폴딩되지 않거나 잘못 폴딩된 단백질을 세포질 내 유비퀴틴-프로테아솜(ubiquitin-proteasome) 시스템을 통해 분해하여 제거하는 과정이다.

마지막으로 소포체 스트레스가 위의 세 가지 반응으로 극복이 되지 못할 정도로 심각하게 되고 소포체가 제 기능을 회복할 수 없을 때는 세포자연사(apoptosis) 경로가 활성화되어 손상된 세포를 제거한다.

이와 같이 소포체 스트레스 반응은 다양한 세포성 스트레스에서 소포체 기능을 보존하여 세포를 보호하기 위한 중요한 보상 기전이지만, 최근에는 잘못된 신호전달 시스템으로 인하여 과도한 소포체 스트레스 반응이 유발되어 이로 인해 야기되거나 유발되는 질병들이 있다는 것이 알려지고 있다. 즉, 소포체 스트레스 반응은 특히 단백질을 합성하여 분비하는 기능이 활발한 형질세포, 췌장의 베타세포, 간세포, 조골세포와 같은 곳에서 잘 관찰되고 있으며 최근 많은 연구들은 소포체 스트레스가 당뇨병, 파킨슨병, 글루타민다량체 유발 응집 질환, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 허혈성 질환, 심혈관질환, 고호모시스테인증 및 동맥경화증과 같은 여러 가지 질환의 병인으로 작용함을 보여 주고 있다 (Kudo et al., 2002, Ann. N. Y. Acad. Sci. 977, 349-355; Ozcan et al., 2008, Mol.Cell 29, 541-551; Ozcan et al., 2006, Science 313, 1137-1140; Mattson and Chan, 2003, Cell Calcium 34, 385-397; Conn et al., 2004, Brain Res. 1022, 164-172; Katayama et al., 2004, J. Chem. Neuroanat. 28, 67-78; Pereira et al., 2004, J. Mol. Neurosci. 23, 97-104; Ryu et al.,2005, Neurobiol. Dis. 18, 54-74; Schroder and Kaufman, 2005, Mutat. Res. 569, 29-63.)

따라서, 소포체 스트레스를 조절하여 암, 당뇨병, 파킨슨병, 글루타민다량체 유발 응집 질환, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 허혈성 질환, 심혈관질환, 고호모시스테인증 및 동맥경화증과 같은 소포체 스트레스 관련 질환의 발생을 예방하고 치료를 할 수 있을 것으로 제시되고 있으나, 소포체 스트레스반응 기전에 대해서는 알려지지 않은 부분이 많아 이에 대한 연구가 부족한 실정이다. 그러므로, 효과적으로 소포체 스트레스를 조절할 수 있는 타겟을 개발할 필요성이 있다.

한편, 사이클로필린(Cyp, cyclophilin)은 원래 면역억제제인 사이클로스포린A라는 약물과 결합하여 면역억제 작용을 하는 단백질로 알려졌으며, 대부분의 조직에서 구조적으로 발현된다. 사이클로필린은 세포에서 단백질 폴딩을 촉매하는 펩티딜-프로릴 시스-트랜스 이성화효소 (PPIase) 활성을 가진다. 사이클로필린의 몇 몇 고유의 구조적 아형(CypA, CypB, CypC, CypD는 또한 PPIA, PPIB, PPIC, PPID로도 알려짐)은 특수한 세포의 공간에 존재하고, 외관상으로는 각각 다른 기능을 수행할 수 있다. 예컨대, 사이클로필린 D는 미토콘드리아 삼투성 이행 복합체(mitochondrial permeability transition complex)의 중요한 구성요소이고 아폽토시스에서 중요한 역할을 하며, 사이클로필린 A는 가장 풍부한 CsA 결합 세포질 단백질로 알려져 있고, 사이클로필린 C는 세포질과 ER 내강 모두에 존재하는 것으로 알려져 있다. 또한, 사이클로필린 B는 주로 ER 내강에 존재하는 것으로 알려져 있으나 사이클로필린 B와 소포체 스트레스 반응과의 관련성은 알려진 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 효과적으로 소포체 스트레스를 조절할 수 있는 타겟을 발굴하고자 노력한 결과, 최초로 사이클로필린 B(이하, "Cyp B" 라고도 함)의 프로모터에 존재하는 소포체 스트레스 반응영역(ERSE)을 규명하였고, 사이클로필린 B가 소포체 스트레스로부터 세포를 보호하기 위한 중요한 기능을 하므로, 사이클로필린 B를 유도 또는 억제함으로써 소포체 스트레스 관련 질환을 예방 및 치료할 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 소포체 스트레스에 의해 유발되는 질환을 예방하고 치료하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

구체적으로, 본 발명의 하나의 목적은 사이클로필린 B를 포함하는, 당뇨병, 파킨슨병, 글루타민다량체 유발 응집 질환, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 허혈성 질환, 심혈관질환, 고호모시스테인증 및 동맥경화증으로 이루어진 군에서 선택되는 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 사이클로필린 B의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는, 소포체 스트레스 관련 질환인 고형암의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 하나의 양태로서, 본 발명은 사이클로필린 B를 포함하는, 당뇨병, 파킨슨병, 글루타민다량체 유발 응집 질환, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 허혈성 질환, 심혈관질환, 고호모시스테인증 및 동맥경화증으로 이루어진 군에서 선택되는 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 용어, "사이클로필린 B"란 사이클로필린 단백질 패밀리의 일원으로, 사이클로스포린 A-결합 단백질이며, 단세포에서 단백질 폴딩을 촉매하는 펩티딜-프로릴 시스-트랜스 이성화효소 (PPIase, peptidyl-prolyl cis-trans isomerase) 활성을 가지는 단백질을 말한다. 사이클로필린 B는 주로 소포체 내강에 존재하며 단백질 폴딩에 관여하는 것으로 알려져 있고, 그 외에 미토콘드리아의 기능 조절, 전구-mRNA(pre-mRNA) 프로세싱, 및 다중 단백질 집합체(multiprotein complex)의 안정성 유지를 포함하는 다양한 세포 프로세스(cellular process)들에 관여하는 것으로 알려져 있으나, 사이클로필린 B와 소포체 스트레스 반응과의 관련성은 알려진 바가 없다.

본 발명의 사이클로필린 B의 프로모터는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 소포체 스트레스 반응영역(ERSE)을 포함한다. 본원에서 용어, "소포체 스트레스 반응 영역(ERSE, ER stress response element)" 이란 칼레티물린, PDI, Grp94, Bip 같은 주요 소포체 샤페론을 코딩한 유전자의 전사를 유발하는 영역을 말하며, 소포체 스트레스는 상기 소포체 스트레스 반응 영역을 통해 소포체 소재 사이클로필린 B(CypB) 유전자의 발현을 활성화시켜 세포생존을 강화하고 소포체 스트레스를 경감시킨다. 본원 발명에서는 사이클로필린 B의 프로모터에 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 소포체 스트레스 반응영역이 존재한다는 것을 최초로 규명하였다.

본원에서 사용되는 용어, "소포체 스트레스(ER stress)"란 생리적 혹은 병리적 환경에 의해 소포체가 처리할 수 있는 능력 이상의 미성숙 단백질이 소포체 내로 유입이 되거나 소포체 내 칼슘이 고갈되어 소포체 기능에 장애가 발생하는 것을 말한다. 또한, "소포체 스트레스 관련 질환" 이란 소포체 스트레스로 인해 발생하거나 악화되는 질환을 말하며, 예컨대 세포 내에 단백질의 과도한 축적으로 인해 분해시스템이 더 이상 작동하기 어려워지면서 그 자체가 세포에 독성을 보여 야기되는 질환(신경 퇴행성 질환 등), 또는 잘못된 신호 전달 시스템으로 인하여 과도한 소포체 스트레스 반응이 유발되어 이로 인해 야기되거나 유발되는 질병(당뇨병 등)이 이에 포함될 수 있다. 현재, 당뇨병, 파킨슨병, 글루타민다량체 유발 응집 질환, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 허혈성 질환, 심혈관질환, 고호모시스테인증 및 동맥경화증이 소포체 스트레스 관련 질환으로 알려져 있다.

구체적으로, 알츠하이머병의 경우 환자의 조직샘플에서 PERK와 그 하부 기질인 eIF2a 경로가 대개 활성화되어 있는 것을 볼 수 있으며, 또 다른 대표적 퇴행성 질환인 파킨슨 병의 경우는 E3 ligase 단백질인 Parkin이 소포체 스트레스와 밀접하게 관련된 것으로 보고되어 있으며, 헌팅턴병의 경우 유전자의 한 부분이 돌연변이로 과대 증폭되면서 나타나는 글루타민의 중합체들이 서로 엉김을 일으키면서 세포의 분해능력으로는 더 이상 감당하기 어려울 정도의 단백질엉김체 (protein aggregation)를 형성하는 결과 자연스럽게 소포체 스트레스가 발생하게 되고, 신경세포의 사멸이 일어나는 것으로 알려져 있다. 또한, 뇌와 심장에 일어나는 허혈 (Ischemia) 증세는 세포의 산화 환원 조절기능을 붕괴시키면서 접힘이 실시되지 않은 단백질을 증가시켜 소포체 스트레스를 유도하고, 지속적인 스트레스가 세포사멸을 일으킴으로써 질병을 악화시키는 것으로 알려져 있다. 또한, 심장질환인 심장비대증(cardiac myocyte hypertrophy)이나 동맥경화 (atherosclerosis)의 경우는 UPR 단백질들이 많이 관여하는 것으로 알려져 있다. 당뇨의 경우 제 1형과 2형이 모두 소포체 스트레스와 관련된 것으로 보고되고 있고, 이에 관한 연구가 가장 활발하다. 췌장의 베타 세포(beta cell)는 인슐린을 분비하기 위해 특별히 발달된 구조의 소포체를 지니고 있기 때문에, 소포체 기능의 이상은 특히 인슐린의 기능에 문제를 일으키기 쉬우며, 제1형 당뇨의 경우는 베타 세포 사멸의 상당 부분이 소포체 스트레스의 과정을 통해 일어나고, 2형 당뇨의 경우는 소포체 스트레스로 인해 활성화되는 스트레스 효소들(stress kinases)이 인슐린에 의해 시작되는 세포신호 전달을 붕괴시킴으로써 세포들로 하여금 인슐린에 대해 둔감하게 하는 것으로 보고되었다 (Kudo et al., 2002, Ann. N. Y. Acad. Sci. 977, 349-355; Ozcan et al., 2008, Mol.Cell 29, 541-551; Ozcan et al., 2006, Science 313, 1137-1140; Mattson and Chan, 2003, Cell Calcium 34, 385-397; Conn et al., 2004, Brain Res. 1022, 164-172; Katayama et al., 2004, J. Chem. Neuroanat. 28, 67-78; Pereira et al., 2004, J. Mol. Neurosci. 23, 97-104; Ryu et al.,2005, Neurobiol. Dis. 18, 54-74; Schroder and Kaufman, 2005, Mutat. Res. 569, 29-63.).

본 발명의 상기 조성물은 사이클로필린 B의 PPIase 활성을 통해 소포체 스트레스가 유도하는 아폽토시스를 저해함으로써 세포를 보호할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어, "아폽토시스(apoptosis)"는 세포 수축, 염색질 응축, 핵 단편화(fragmentation) 및 막의 수포성 구조형성(blebbing)과 같은 현상이 일어나는 유전적으로 프로그램된 세포 사멸을 의미하며, 일반적으로 아폽토시스는 항상성을 유지하거나 이상을 초래하여 생체에 해롭게 된 세포, 예컨대 암세포, 바이러스 감염된 세포 등의 제거에 중요하다. 그러나 본 발명의 경우, 당뇨병, 파킨슨병, 글루타민다량체 유발 응집 질환, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 허혈성 질환, 심혈관질환, 고호모시스테인증 및 동맥경화증 등의 소포체 스트레스 관련 질환은 주로 과도한 소포체 스트레스 또는 잘못된 신호 전달 시스템으로 인한 소포체 스트레스로 인하여 형질세포, 신경세포, 췌장의 베타세포, 간세포 또는 조골세포 등 정상 세포의 아폽토시스가 증가되어 발생하는 것이므로, 이와 같이 소포체 스트레스가 유도하는 아폽토시스를 저해함으로써 상기 질환들의 예방 및 치료 효과를 기대할 수 있다.

본 발명자들은 다음과 같은 실험을 통하여 사이클로필린 B의 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 및 치료 용도를 규명하였다.

우선, 심근세포인 H9C2 세포에 소포체 스트레스를 유발하는 약제인 thapsigargin(Tg)와 tunicamycin(Tm) 를 처리한 결과 주요 ER 샤페론 단백질인 Bip, Grp94 및 PDI 뿐만 아니라 사이클로필린 B의 발현이 증가하고 상향조절되는 것을 확인하였으며 (도 1), 사이클로필린 B의 프로모터에 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 소포체 스트레스 반응영역(ERSE)이 존재한다는 것을 확인하였다 (도 2).

또한, 아폽토시스적 분자의 웨스턴 블럿팅 분석 결과, H9C2 세포에 야생형 사이클로필린 B를 과발현시킨 경우 thapsigargin(Tg)와 tunicamycin(Tm)에 유도된 자멸사가 저해되었으나, PPIase의 활성에 결함이 있는 돌연변이 사이클로필린 B를 과발 현시킨 경우에는 아폽토시스에 민감한 것으로 나타났으므로, 사이클로필린 B가 PPIase 활성을 통하여 소포체 스트레스를 경감시켜 소포체 스트레스가 유발하는 아폽토시스를 저해한다는 것을 확인할 수 있었다 (도 3). 또한, 사이클로필린 B가 과발현된 경우 소포체에서 칼슘 이온(Ca² ⁺) 방출이 억제되고, 세포 내 ROS 의 축적이 억제되고, 미토콘드리아 막전위의 탈분극이 억제됨으로써 소포체 스트레스에 의한 아폽토시스가 억제된다는 것을 확인할 수 있었다 (도 5).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 사이클로필린 B의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는, 소포체 스트레스 관련 질환인 고형암의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

소포체 스트레스를 통해 접근할 수 있는 질병 중 하나가 암이다. 그러나 암의 경우는 당뇨병, 파킨슨병, 글루타민다량체 유발 응집 질환, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 허혈성 질환, 심혈관질환, 고호모시스테인증 및 동맥경화증 등의 소포체 스트레스 관련 질환과는 달리, 세포사멸을 유도하는 것이 질병 치료의 목적이 된다. 즉, 암세포의 경우는 아폽토시스 조절의 실패와 질환 발생은 높은 상관 관계를 가지며, 특히 암과 같은 증식성 질환의 치료에서 아폽토시스의 유도는 매우 중요하고, 거의 모든 항암제는 내인적 아폽토시스 경로(intrinsic pathway)를 시작시킴으로써 아폽토시스를 유도하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 사이클로필린 B가 소포체 스트레스에 의한 아폽토시스를 저해하는 효과가 있음을 입증하였으므로, 사이클로필린 B의 발현 또는 활성을 억제하여 아폽토시스를 유도함으로서 암을 예방 및 치료할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어, "고형암(Solid cancer)"은 유방 또는 전립선 등의 고형 장기(solid organ)에서 비정상적으로 세포가 성장하는 것을 말하며, 액체인 혈액에 영향을 끼치는 백혈병(leukemia)과 반대되는 개념이다. 구체적으로는 방광, 유방, 장, 신장, 간, 뇌, 식도, 쓸개, 난소, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선, 전립선 및 피부(편평상피세포 암종 포함)와 같은 암종; 섬유육종 및 횡문근육종을 포함한 간충직 발원의 종양; 성상세포종, 신경모세포종, 신경교종 및 신경초종을 포함한 중추 및 말초 신경계의 종양; 및 흑색종, 정상피종, 기형종, 골육종, 색소건피증, 각화극세포증, 갑상선 여포상암 및 카포시 육종을 포함한 기타 종양, 바람직하게는 고환암, 난소암, 폐암, 두경부암, 경추암, 신경아세포종, 골육종, 자궁경부암, 전립선암 또는 직장암, 보다 바람직하게는 자궁경부, 전립선암 또는 직장암을 포함하나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, DU 145 전립선 암 세포에서 소포체 스트레스에 대해 과발현된 사이클로필린 B의 항 아폽토시스적 효과를 평가한 결과, 사이클로필린 B가 과발현된 암 세포에서 세포사가 감소되는 것을 확인하였으며 (도 3f), CypB를 녹다운시키는 siRNA를 사용하여 RNA 간섭 실험을 한 결과, 소포체 스트레스로 유도된 아폽토시스가 상당히 증가하였으며, 높은 ROS 농도와 낮은 MMPs를 감지되었으므로 (도 6), 사이클로필린 B의 발현 또는 활성을 억제하여 아폽토시스 를 유도함으로서 암을 예방 및 치료할 수 있음을 알 수 있다.

구체적인 일 양태로서, 본 발명의 암 예방 및 치료용 약제학적 조성물은 사이클로필린 B의 활성을 억제하는 물질을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 활성억제물질은 암 세포 표면 항원 또는 분비된 표면 항원(사이클로필린 B)을 특이적으로 인식하는 항체이다. 이러한 항체는 단일클론항체 및 이에 대한 카이메릭 항체, 인간화 항체 및 인간 항체를 모두 포함하는 것이고, 신규한 항체 외에 이미 당해 기술분야에서 공지된 항체들도 포함될 수 있다.

상기 항체는 사이클로필린 B을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등이 있다.

또 다른 구체적인 일 양태로서, 본 발명의 암 예방 및 치료용 약제학적 조성물은 사이클로필린 B의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게 상기 올리고뉴클레오티드는 사이클로필린 B의 mRNA에 대한 siRNA, shRNA 또는 사이클로필린 B단백질의 mRNA에 상보적인 안티센스 핵산 서열이다.

본 발명에서 사용되는 용어, "siRNA"는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자 치료의 방법으로 제공될 수 있다.

siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70염기이다. siRNA 말단 구조는 표적 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의해 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 또는 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3' 말단 돌출한 구조와 5' 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 또한 siRNA는 표적 유전자의 발현 억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA 분자 또는 인공의 RNA 분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단 구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중 사슬 RNA 일반의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스텝 루프형 구조일 수도 있다.

본 발명에서 사용되는 siRNA는 그 자체로 폴리뉴클레오타이드 페어링을 갖는 완전한 형태, 즉 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 두 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태이거나, 생체 내에 투여된 후 이러한 형태를 갖도록 하나의 단일쇄 올리고뉴클레오타이드 단편과 이의 역방향(reverse) 상보물이 스페이서에 의해 분리된 단일쇄 폴리뉴클레오타이드로부터 유도될 수 있는 형태, 예를 들어 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유도된 siRNA 발현 카세트를 형질전환 또는 감염(infection) 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태일 수 있다. siRNA를 제조하고 세포 또는 동물로 도입하는 방법의 결정은 목적 및 표적 유전자 산물의 세포 생물학적 기능에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 siRNA는 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 서열을 가질 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "shRNA" 는 siRNA의 고가의 생합성 비용, 낮은 세포 형질감염 효율로 인한 RNA 간섭 효과의 단시간 유지 등의 단점을 극복하기 위한 것으로 RNA 중합효소 Ⅲ의 프로모터로부터 아데노 바이러스, 렌티 바이러스 및 플라스미드 발현 벡터 시스템을 이용하여 이를 세포 내로 도입하여 발현시킬 수 있으며, 이러한 shRNA는 세포 내에 존재하는 siRNA 프로세싱 효소(Dicer or Rnase Ⅲ)에 의해 정확한 구조를 갖는 siRNA로 전환되어 목적 유전자의 사일런싱을 유도함이 널리 알려져 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "안티센스 핵산"이란 특정 mRNA 의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징이 있다. 본 발명의 안티센스 서열은 사이클로필린 BmRNA에 상보적이고 사이클로필린 BmRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, 사이클로필린 BmRNA의 번 역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기이다.

안티센스 RNA의 경우 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나, 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 RNA를 합성하는 한 예는 RNA 폴리머라제Ⅰ를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 사이클로필린 B의 siRNA 또는 사이클로필린 B안티센스 핵산의 1종 이상을 포함하는 외에, 환자의 암 세포의 증식을 억제시키는 추가의 물질을 포함할 수 있으며, 또는 siRNA 또는 안티센스 핵산 분자의 유입을 촉진시키는 제제, 예를 들어 리포좀(미국 특허 제4,897,355호, 제4,394,448호, 제4,23,871호, 제4,231,877호, 제4,224,179호, 제4,753,788호, 제4,673,567호, 제4,247,411호, 제4,814,270호)을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류 중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수도 있다. 또한 안티센스 핵산은 세포에 의해 흡수되는 펩티드에 접합시킬 수도 있다. 유용한 펩타이드의 예로는 펩타이드 호르몬, 항원 또는 항체 및 펩타이드 독소 등이 있다.

본 발명의 조성물은 단독으로 사용할 수 있지만, 치료 효율을 증가시키기 위해 방사선 요법 또는 화학 요법(세포 성장 정지 또는 세포 독성 물질, 항생 물질형 물질, 알킬화제, 항대사성 물질, 호르몬제, 면역제, 인터페론형 물질, 사이클로옥시게나제 억제제, 메탈로매트릭스프로테아제 억제제, 텔로머라제 억제제, 티로신 키나제 억제제, 항성장인자 수용체 물질, 항-HER 물질, 항-EGFR 물질, 항-혈관생성 물질, 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, ras-raf 시그날 전도 경로 억제제, 세포 주기 억제제, 기타 cdk 억제제, 튜불린 결합체, 토포이소머라제Ⅰ 억제제, 토포이소머라제 Ⅱ 억제제 등)과 같은 다른 항암 치료법과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있고, 경구 투여시에는 결합체, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직 에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 조성물의 유효 투여량의 범위는 성별, 체표면적, 질환의 종류 및 중증도, 연령, 약물에 대한 민감도, 투여경로 및 배출비율, 투여시간, 치료기간, 표적세포, 발현 수준 등 기타 의학 분야에 잘 알려진 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 사이클로필린 B를 포함하는 조성물은 사이클로필린 B의 PPIase 활성을 통해 소포체 스트레스가 유도하는 아폽토시스를 저해함으로써 세포를 보호하므로 당뇨병, 파킨슨병, 글루타민다량체 유발 응집 질환, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 허혈성 질환, 심혈관질환, 고호모시스테인증 및 동맥경화증과 같은 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 사이클로필린 B의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는 조성물은 사이클로필린 B의 발현을 억제함으로써 종양 세포의 아폽토시스를 유도하므로 전립선암, 자궁경부암 또는 직장암과 같은 고형암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 세포배양

H9C2 랫트 심장 근아세포(H9C2 rat heart myoblast)를 10%(V/V) 송아지 혈청을 첨가한 증식배지(proliferation medium)인 DMEM-F12(Dulbeccos modified Eagles medium-F12)의 증식환경 아래 또는 1% 말 혈청을 첨가한 분화배지(differentiation medium)인 DNEM-F12의 분화 환경 하에서 성장시켰다. DUI45와 Chang 세포를 10% 우태아혈청과 항생제(100units/ml의 페니실린 및 100μg/ml의 스트렙토마이신 설페이트)를 첨가한 DMEM에서 배양하였다. 소포체 스트레스를 유도하기 위해서, thapsigargin(Tg) 과 tunicamycin(Tm) (BIOMOL)을 각각 1 μM과 10 μg/ml을 사용하였다.

실시예 2: RT-PCR

H9C2 세포를 48시간 동안 악티노마이신 D (2μM)와 Tg (1μM) 또는 Tm (10 μg/ml)과 함께 공동처리한 후, RT-PCR을 위해서, manufacturers protocol에 따라 TRIzol 시약을 사용하여 전체 RNA(2 μg)를 분리하였다. 이어서, 역전사효소에 의해 cDNA를 생성하고, 32주기로 PCR을 수행하였다. CypB 전사체를 증폭시키기 위한 프라이머는 다음과 같다:

정방향 프라이머: 5'-GCATGAAGGTGCCCCCCTCTTCGCC-3'

역방향 프라이머: 5'-GCCTCCTTGGCAATGGCAAAGG-3'

GAPDH를 RT-PCR을 위한 내부 대조군으로서 하기의 프라이머를 사용하여 증폭시켰다.

정방향 프라이머: 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'

역방향 프라이머: 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'

실시예 3: 플라스미드

야생형 랫트 CypB 유전자 (CypB/wt)를 하기의 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 거쳐 전체 RNA prepatation로부터 증폭시켰다.

정방향 프라이머: 5'-GCAAGCTTATGAAGGT GCCC - CCCTCTTCGCC-3' (HindIII)

역방향 프라이머: 5'-GCGGATCCCTCCTTGGCAATGGCAAAGG-3' (BamHI)

PPIase-결여 돌연변이체 유전자(PPIase-defective mutant gene, CypB/R62A)를 하기의 프라이머를 사용하여 알라닌(A) 내로 아르기닌 잔기(R62)의 돌연변이에 의해 제조하였다.

정방향 프라이머: 5'-AAGTTCCATGCTGTCATCAAGGAC-3'

역방향 프라이머: 5'-GTCCTTGATGACAGCATGGAACTT-3'

이어서 PCR 산물을 pcDNA3.0 포유동물세포 발현벡터(Invitrogen) 내로 삽입하여 pcDNA/CypB/wt 또는 pcDNA/CypB/R62A를 만들었다. CypB/wt 또는 CypB/R62A를 C 말단의 mye tag와 함께 발현시켰다. 루시퍼라제 어세이를 위해, PCR을 통해 CypB의 1000bp 프로모터 염기서열을 200bp씩 연속적으로 삭제하였다. 이어서 삭제된 절편들을 KpnI 및 XhoI와 함께 pGL3 기본 벡터(Promega) 내로 클로닝하였다. CypB 프로모터 상의 각각의 추정적인 NF-Y 또는ATF6 결합위치를 PCR-based site-directed mutagenesis에 의해 변이시켰다. CypB/wt 또는 CypB/R62A cDNA를 포함하는 pEGFP NI (Clontech)를 세포 내의 CypB/wt 또는 CypB/R62A 위치로 이용하였다. GST pull-down 실험을 위해, CypB/wt 또는 CypB/R62A를 포함하는 pGEX-KG (GE Healthcare)를 PCR-based cloning에 의해 구성하였다. 효모이중보합계 실험(yeast two hybrid experiment)을 위해, CypB 또는 CypB/R62A를 pGBKT7.0 (clontech)의 EcoRI 과 BamHI 제한부위 내로 클로닝하였다. Bip 또는 Grp94를 적절한 효소와 함께 pGADT7.0 (Clontech) 내로 클로닝하였다. ATF6 비활성 형태, ATF6 활성형태, XBP1 비스플라이싱된 형태, 및 XBP1 스플라이싱된 형태의 플라스미드들을 루시퍼라제 어세이에 사용하였다(Lee et al., 2002).

실시예 4: 웨스턴 블럿팅(Western blot)

CypB, Bip, Bax, cytochrome c, Grp94, PDI, caspase 3, procaspase 12, actin, β-tubulin and myc 에 대한 항체를 Abcam, Santa Cruz Biotechnology 및 StressGen Biotechnologies으로부터 수득하였다. 다르게 지시하지 않는 한, 액틴 단백질을 시료 단백질의 양을 표준화하기 위해 이뮤노블럿팅하였다.

실시예 5: 프로모터 분석과 루시퍼라제 어세이( Promoter analysis and luciferase assay )

Genomatrix MatInspector (http://www.genomatix.de)를 사용하여 CypB 프로모터 서열을 분석하였다. 하나의 ERSE candidate를 CypB ORF로부터 -243 bp, 약 -225 bp에 위치시키고, 다른 것들을 -693bp, 약 -673 bp에 위치시켰다. 내부 대조군 플라스미드 pCMV-Lac (Promega)와 함께 0.2 μg의 pGL3 basic-유래의 플라스미드들을 사용하여 H9C2 세포들을 형질감염시켰다. 루시퍼라제와 β-gal 활성을 microplate reader(Bio-Rad)를 사용하여 각각의 세포 분리물 50μl을 사용하여 측정하고, β-gal 활성을 기초로 하여 루시퍼라제 활성을 평준화시켰다.

실시예 6: Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)

H9C2 세포를 24 시간 동안 Tm (10 μg/ml)으로 처리하였다. TM-처리되거나 또는 처리되지 않은 세포(대략 80% confluence)의 핵 분획(nuclear fraction)의 분리를 위해, 세포에 트립신을 처리하고, 220g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후에, 총 세포를 저장성 완충액(10 mM Hepes pH, 7.9, 1.5 mM MgCl₂, 10 mM KCl, 0.2 mM PMSF, 0.5 mM DTT, 1xprotease inhibitor cocktail)으로 잘 섞고, 4℃에서 5분간 배양시켰다. 세포를 4℃에서 20분간 1550g에서 원심 분리하였다. 핵 추출물을 분리하기 위해서, 4℃에서 15분간 저장성 완충액:고염 완충액(20 mM Hepes pH, 7.9, 25% glycerol, 0.4 M KCl, 1.5 mM MgCl, 0.2 mM EDTA, 0.2 mM PMSF, 0.5 mM DTT; 1:1, v/v) 에서 배양시켰다. 잔해(debris)를 제거하고, 세포를 4℃에서 20분간 9300g로 원심분리하였다. Bradford 어세이에 의해 핵단백질농도를 결정하였다. T4 폴리 뉴클레오티드 키나아제 (Promega)를 사용하여 올리고뉴클레오티드 (CypB-ERSE, 5'-CTATCCAATGAGAGGGCTGTAACGTGGCAGC-3'; CGTtt, 5'-CTATCCAATGAGAGGGCTGTAACGTttCAGCCACCCGCA-3'; 밑줄로 표시된 잔기들은 NF-Y1-binding motif를 의미하고, 소문자의 잔기들은 ATF6-binding motif를 의미한다)를 [γ-³²P]ATP(Amersham Biosciences)로 표지하였다. 10μg/ml TM을 처리하거나 처리하지 않은 핵추출물(15μg)과 반사성동위원소로 표지된 프로브 (CypB-ERSE 또는 CGTtt)를 1 시간 동안 5 x binding buffer[25% glycerol, 50 mM Tris, pH 7.5, 250 mM NaCl, 5 mM DTT, 5 mM EDTA, 20 μg/ml poly(dI-dC)] 내에서 배양하였다. 경쟁적 어세이(competition assay)를 위해, 100배 초과량의 레이블되지 않은 경쟁자 올리고뉴클레오티드로 각 시료를 처리하였다. 랫트 ATF6 (Santa Cruz Biotechnology)에 대한 토끼항체들을 supershift 어세이에 이용하였다. 핵 추출물(15μg)을 변성되지 않은 TBE-polyacrylamide gel (4%)에 로딩하여 단백질과 γ-³²P-labeled CypB probe complexes를 용해시켰다. 변성되지 않은 TBE-polyacrylamide gel에 6시간 동안 120 V를 가하였다. 건조된 겔을 36시간 동안 x-ray필름에 노출시켰다.

실시예 7: 크로마틴 면역침강( Chromatin immunoprecipitation , ChIP )

종래 기술(Luo et al., 2003)에 따라, ATF6, XBP 또는 NF-Y (Santa Cruz Biotechnology)에 대한 항체에 의해 면역침강의 대상이 되는 교차 결합된 H9C2 크로마틴을 제외하고 통상적인 크로마틴 IP를 수행하였다. ATF6와 NF-Y의 결합부위를 포함하는 CypB-ERSE를 하기의 프라이머를 사용하여 증폭시켰다.

정방향 프라이머: 5'-ATCCCAACGCCGCCTTCCGC-3'

역방향 프라이머: 5'-AAGCAATGCGGAGTGGTAGG-3'

음성 대조군으로서, Non-ERSE를 하기의 프라이머를 사용하여 증폭시켰다.

정방향 프라이머: 5'-ACTACAGAGAAGAGGCCTTA-3'

역방향 프라이머: 5'-CCTTGCTTGGGGACCGGGAG-3'

실시예 8: 사이클로필론 B의 위치( Location of cyclophilin B)

CypB, GFP, GFP-CypB/wt 또는 GFP-CypB/R62A 구조물의 위치를 결정하기 위해, H9C2 세포 안으로 형질감염시켰다. 커버슬립에 Tg 또는 Tm으로 처리되거나 또는 처리되지 않은 형질감염체를 1μM의 ET tracker White-Blue DPI(Molecular Probes)와 함께 30분 동안 로딩하고, 상온에서 4% 포름알데히드로 14분 동안 고정하였다. 염색된 세포를 LSM510 공초점 레이저 현미경(Carl Zeiss)을 사용하여 모니터링하였다.

실시예 9: MTT 변환 어세이( MTT conversion assay )

세포 생존 능력을 12 웰 플레이트 내에서 MTT conversion 어세이를 사용하여 평가하였다. 광학 밀도를 microplate reader(Bio-Rad)에서 550nm로 읽었다. 세포의 생존을 미처리된 세포의 흡광도와 비교하여 흡광도의 백분율로 나타냈다.

실시예 10: Hoechst33342 염색과 TUNEL 어세이( Hoechst 33342 staining and TUNEL assay )

Tg와 Tm으로 처리한 후, H9C2 세포를 Hoechst 33342 (Molecular Probes) 로딩 염료로 30분간 배양하고 차가운1XPBS로 3번 세정하였다. 염색된 세포를 LSM510 공초점 레이저 현미경 (Carl zeiss)을 사용하여 모니터링하였다. TUNEL 어세이를 ApopDIRECTTM DNA fragmentation kit (MBL)로 수행하였다. Positive apoptotic nuclei를 공초점 현미경 사용으로 평가하였다.

실시예 11: 재조합 아데노바이러스( Recombinant adenovirus )

CypB/wt 또는 CypB/R62A를 pCA14 내로 클로닝하였다. 상동 재조합을 위하여 pCA14-CypB/wt 또는 pCA14-CypB/R62A 를 vmRL-H5dl 324Bst와 함께 E.coli BJ 5183 내로 형질전환시켰다. 재조합 아데노바이러스를 HEK293세포에서 증식시켰다. CypB 발현의 음성 대조군으로서 Ad-GFP 또는 감염되지 않은 세포를 사용하였다.

실시예 12: 세포간 Ca ² ⁺ 값의 측정( Measurement of intracellular Ca2 + level )

CypB/wt과 CypB/R62A 형질감염체를 10%혈청이 함유된 DMEM-F12에 25 mm 커버슬립 위에 seed하였다. Ca² ⁺-sensitive 염료 10 μM Fluo-4 (Molecular Probes)로 40분간 로딩한 후, 세포를 혈청이 없는 배지에서 세정하고 DMSO 또는 1uM Tg로 자극하였다. 세포 내의 Ca² ⁺을 제거하기 위해, Tg를 처리하기 전에 세포를 4 μM EGTA (Sigma-Aldrich)로 전배양시켰다. 30초 후, cytosolic Ca² ⁺값을 LSM510 공초점 현미경(Carl Zeiss)을 사용하여 측정하였다 (n=20).

실시예 13: 활성산소종(ROS)과 미토콘드리아 막 전위의 분석( Reactive oxygen species ( ROS ) and mitochondrial membrane potential ( MMP ) analyses (Δψm)

10μM DCF-DA(Molecular Probes)와 함께 배양 후, 세포를 유세포분석을 사용하여 ROS를 분석하였다. MMP분석을 위해, 40nM DIOC6(Molecular Probes)과 함께 배양 후, 유세포분석을 하였다.

실시예 14: RNA 간섭( RNA interference )

Si RNA 표적 염기서열은 하기와 같다: CypB-siRNA (센스, 5' UCCCAGAUGAGACUUCAAdTdT-3'; 안티센스, 5'-UUGAAGUUCUCAUCUGGGAdTdT-3'), ATF6-siRNA (센스: 5'-GGGUUCAGAUAUUGCCGUAdTdT-3'; 안티센스: 5'-UACGGCAAUAUCUGAACCCdGdT-3'), 및 control-siRNA (센스, 5'- UCCCAGAUAGAGACUUCAATT-3'; 안티센스, 5'-UUGAAGUCUCUAUCUGGGATT-3'). 웨스턴 블럿팅을 사용하여 CypB 또는 ATF6의 Si RNA의 간섭을 분석하였다.

실시예 15: GST pull - down 어세이( GST pull - down assay )

pGEX-KG/CypB (GST-CypB/wt) 및 pGEX-KG/CypB/R62A (GST-CypB/R62A)의 융합 단백질을 종래의 기술에 따라 준비하였다(Bourdoncle et al., 2005). affinity beads를 Tg와 Tm이 있거나 없이하여 24시간 동안 처리하여 500 μg의 H9C2의 총 세포 추출물을 배양하였다. 웨스턴 블럿팅을 사용하여 beads 를 계속 가지고 있는 단백질을 검출하였다.

실시예 16: 공통면역 침강( Co - immunoprecipitation )

1μM Tg와 10μg/㎖의 Tm이 있거나 없이 처리한 H9C2 세포 추출물(500μg)을 non-immune serum-coupled protein G 또는 A sepharase beads 또는 anti-CypB antibody-coupled protein G 와 A Sepharose beads 과 함께 배양하였다. 웨스턴 블럿팅을 사용하여 면역침강을 수행하였다.

실시예 17: 효소이중 보합계 어세이( Yeast two - hybrid assay )

CypB/wt 또는 CypB/R62A를 GAL4DNA결합 영역 (BD)을 코딩하는 pGBKTI에 연결시켰다. Bip 또는 Grp94 유전자를 활성영역(AD)를 코딩하는 pGRP7 내로 클로닝하였다. CypB 및 Bip 또는 Grp94 사이의 결합을 평가하기 위해, 종래의 기술에 따라 실험들을 수행하였다 (Chen et al., 2004).

실시예 18: 통계적인 분석( Statistical analyses )

적어도 3개의 독립된 실험으로부터 평균±표준편차의 결과를 나타내었다. Students t-tests 를 사용하여 통계적인 분석들을 수행하였다. 달리 지시되지 않는 한, p<0.05는 유의한 것을 의미한다.

결과

1. 사이클로필린 B는 소포체 스트레스에 의해 전사적으로 상향조절된다.

대부분의 ER 분자 샤페론은 소포체 스트레스 동안 상향조절된다 (Gillece et al., 1999; Uccelletti et al., 2004). 본 실험에서, 소포체 스트레스를 유발하는 약제인 thapsigargin(Tg) 1μM과 tunicamycin(Tm) 10μg/㎖ 와 함께 H9C2 세포를 배양함에 따라 주요 ER 샤페론 단백질인 Bip, Grp94 및 PDI 뿐만 아니라 Cyp B의 발현 농도를 급속히 증가시켰다 (도 1a). 소포체 스트레스에 의한 그들의 유발은 증식과 분화 조건에서 관찰되었다. 농도 분석에서 CypB의 발현이 Tg와 Tm 처리에서 약 두 배로 증가했음을 보여주었다(도 1a). 또한, 소포체 스트레스에서 동시에 발생하는 세포사를 현미경으로 보여주었다(도 1b). 증식과 분화 조건에서 소포체 스트레스로 유발된 세포사를 카스파아제 3, 프로카스파아제 12, cytosolic cytochrome c, 및 mitochondrial Bax 의 웨스턴 블럿팅 분석으로 표시하였고(도 1c), 세포가 소포체 스트레스를 받을 때 일어나는 아폽토시스를 Hoechst33342 염색 으로 표시하였다(도 1d). 증가된 CypB가 CypB mRNA의 전사적 유발에 의한 것인지를 조사하기 위해, 24시간 동안 소포체 스트레스 유발 작용제를 처리한 세포에 반정량적 RT-PCR을 수행하였다. Tg와 Tm을 처리한 CypB mRNA의 상향조절을 도 1e에 나타내었으며, actinomycin D처리는 CypB mRNA 유발을 방해하고, CypB mRNA가 mRNA 안정성과 상관없이 소포체 스트레스에 의해 전사적으로 유발되는 것을 도 1f에 나타내었다.

2. 사이클로필린 B프로모터에서 신규한 소포체 스트레스 반응 영역( Novel ER stress response element in cyclophilin B promoter )

전사적 유도가 CypB 프로모터에서 소포체 스트레스 반응 영역에 대한 우리의 연구를 촉진시겼다. ERSE로 추정되는 2개의 영역이 발견되었다 (도 2a). 시스 작용 영역[cis-acting element(s)]을 매핑하기 위해, 연속적으로 결실된 프로모터 지역을 루시퍼라제 유전자에 융합시키고, 합성된 리포터 플라스미드를 일시적으로 H9C2 세포 내에 삽입하고 소포체 스트레스에서 CypB 프로모터의 활성을 루시페라제 활성으로 모니터링하였다. Tg와 Tm 처리 하였을 때 전장 CypB 상류 영역에 자리잡은 루시퍼라제 리포터 활성의 3배 이상의 증가를 관찰할 수 있었다. 도 2b에 도시된 바와 같이, 결실 분석에서 -400bp와 -100bp 사이 영역은 유도에서 필요 없는 지역이며, -200bp와 -400bp 사이 영역은 유도에서 중요한 영역이다. 이 영역의 DNA 서열은 ERSE consensus 서열(CCAAT-N9-CCACG, ERSE-I)과 비슷한 시스 작용 영역에 존재한다. 이것을 더 연구하기 위해, CypB 프로모터로부터 ERSE로 추정되는 것과 pCypC/400 루시퍼라제 리포터 플라스미드를 사용하여 돌연변이 유발 연구를 수행하였다. CypB의 consensus-like 서열에서, CCACG 영역의 배향은 역위되어 있으며, CCAAT와 CCACG 영역 사이의 spacer 서열은 consensus 염기가 9개 이상인 13개 염기이다(도 2a). 이 각각의 영역 내에서 뉴클레오티드의 대체는 CypB 프로모터로부터 소포체 스트레스 유발에 대해 두 영역 모두 필수적인 것임을 증명하였다 (도 2c). 실제로, 전사인자인 NF-Y와 ATF6는 ERSE의 CCAAT와 CCACG 부분에 각각 동시에 결합한다고 보고되었다 (Yoshida et al., 2001). 종합해보면, 이러한 ERSE의 전사적 활성이 ERSE consensus 서열인 ERSE-I의 전사적 활성보다 약간 약해도 CypB 프로모터의 신규한 ERSE가 소포체 스트레스에 의한 CypB의 유도에 필요한 시스 작용 영역의 기능을 함을 확인하였다 (도 2c, line 7). EMSA와 변형된 루시퍼라제 리포터 어세이를 이용한 새로운 CypB ERSE를 통해 소포체 스트레스와 관련된 전사인자인 ATF6와 XBP1이 CypB 프로모터에 결합됨을 연구하였다. ATF6 유전자의 구조적 활성형 또는 XBP1의 스플라이싱 형태는 활성 ATF6 또는 스플라이싱 된 XBP1 단백질이 루시퍼라제 리포터를 유발하는데 충분한지 결정하기 위해 루시퍼라제 리포터 플라스미드 pCypC/400과 함께 형질감염되었다. 활성 ATF6 또는 스플라이싱된 XBP1과 공-형질감염은 루시퍼라제 활성을 약 2배 증가시켰다. 웨스턴 블럿팅 분석에서 siRNA 처리의 효능을 평가한 후, 비활성 ATF6 또는 비스플라이싱된 XBP1의 형질감염과 ATF6-siRNA 처리에 의한 ATF6의 사일런싱은 루시퍼라제 활성을 증가시키지 못하였다 (도 2d).

ATF6 또는 XBP1이 CypB ERSE 서열에 직접 결합을 측정하기 위해 EMSA를 바로 수행하였다. Tm 처리 또는 처리되지 않은 H9C2 세포로부터 핵 추출물을 준비하고 ³²P 표지 CypB-ERSE 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한 EMSA 또는 변형된 버전(CGTtt)를 수행하였다. 야생형은 Tm이 처리된 핵 추출물과 2개의 복합체를 형성하였다: 아래쪽 밴드는 NF-Y 단백질, 위쪽 밴드는 NF-Y + ATF6 로 추정됨. 항-ATF6 항체를 가진 슈퍼시프트(supershift) EMSA는 CypB-ERSE의 ATF6 결합 활성을 확실히 보여주었다(도 2e). 대조적으로 변형된 버전은 NF-Y와 ATF6와 함께 소량으로 복합체를 형성, CypB 프로모터의 새로운 ERSE와 특이성을 보여주었다. 이러한 결합은 비 표지 경쟁자 올리고뉴클레오티드를 100배 가량 함유한 배양에 의해 없어졌다. 더욱이 ChIP 어세이는 또한 CypB ERSE가 XBP1이 아닌 ATF6 와 NF-Y와 쉽게 결합한다는 것을 보여주었다 (도 2f). 웨스턴 블럿팅 분석에서, 활성 ATF6는 대조군 세포에서 거의 찾을 수 없었지만 소포체 스트레스 상태에서는 증가한 반면 NF-Y는 그대로 남아 있었다 (도 2g).

3. 사이클로필린 B의 과발현은 thapsigargin 또는 tunicamycin 로 유도된 세포사를 억제한다.

소포체 스트레스 반응 동안 CypB의 보호 역할을 평가하기 위해, H9C2 세포에서 PPIase의 활성에 결함이 있는 myc-tagged CypB/wt 또는 myc-tagged CypB/R62A 를 과발현시켰다. 안정된 형질감염체인 CypB/wt와 CypB/R62A 모두 정착시킨 후, CypB의 발현 농도와 Bip, Grp94와 같은 다른 소포체 스트레스 반응 단백질을 이뮤 노블럿팅으로 분석하였다(도 3a). 본 실험에 사용한 3개의 각 클론 중에서, 다른 소포체 스트레스 단백질인 Bip, Grp94 발현 농도의 방해로 과발현된 CypB는 나타나지 않았다. 이어서, 과발현된 artifacts를 제거하고 CypB/wt 와 CypB/R62A 형질감염체가 ER에 정확히 맞춰졌는지 판단하기 위해 CypB/wt와 CypB/R62A의 위치를 공초점 현미경 분석을 통하여 관찰하였다. 세포 내 ER을 찾기 위해 ER tracker 를 사용하였다. 도 3b는 과발현된 CypB/wt 또는 CypB/R62A가 ER tracker와 같이 위치한 것을 나타내는데, 이는 과발현된 CypB/wt와 CypB/R62A가 ER에 정확히 맞춰졌고 artifacts를 발생시키지 않았음을 보여주었다. 세포에 Tg와 Tm가 처리되었을 때도, 과발현된 단백질들의 위치는 변하지 않았다(도 3b). 따라서, 현재 CypB의 일부가 다른 곳에 분산되었을 가능성을 배제할 수 없지만 과발현된 CypB/wt는 주로 ER에 위치함을 확인하였다. Tg와 Tm에 의한 소포체 스트레스를 받은 아폽토시스에서의 CypB/wt 또는 CypB/R62A의 영향은 MTT conversion 분석과 분해된 카스파아제 3, cytosolic cytochrome c, 프로카스파아제 12와 mitochondrial Bax를 포함한 아폽토시스적 분자의 웨스턴 블럿팅 분석에 의해 결정하였다. pcDNA와 비교하여, CypB/wt가 과발현된 세포는 Tg와 Tm으로 유도된 자멸사에 잘 견디고, CypB/R62A 형질감염체는 더 민감함을 확인할 수 있다(도 3c, d). PPIase-결핍 돌연변이로부터 얻은 민감도는 PPIase 활성이 보호 역할에 포함된다는 것을 보여주었다. 소포체 스트레스가 Bip, Grp94와 PDI 같은 표적 분자의 발현을 증가시킨다는 전제에서, CypB/wt가 과발현된 세포에서 그들의 감소는 CypB/wt의 과발현이 소포체 스트레스에 대한 세포의 민감성을 줄인다는 것을 보여주었다. 그러나, 대조적으로, 도 3e 에 도시된 바와 같이, CypB/R62A의 과발현은 세포를 민감하게 함을 확인할 수 있다. CypB의 PPIase 활성을 통한 CypB 과발현으로 소포체 스트레스의 경감은 소포체 스트레스가 유발하는 세포사에 대한 CypB의 항 아폽토시스적 역할을 보여주었다. 또한, CypB는 세포 밖으로 분비되는 것으로 알려져 있다. 분비된 CypB의 효과를 시험하기 위해, 배양배지로부터 CypB의 면역침강 (supplementary material 도 S1A)과 CypB항체를 사용한 항체 중화를 (supplementary material 도 S1B) 수행하였다. 결과는 pcDNA 단독, CypB/wt 또는 CypB/R62A를 형질감염한 세포에서 분비된 CypB는 소포체 스트레스로 유도된 세포사에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주었다. 세포 특이성을 제거하기 위해 Chang 세포와 DU 145 전립선 암 세포에서 소포체 스트레스에 대해 과발현된 CypB/wt의 항 아폽토시스적 효과를 평가하였다. 먼저, 아데노바이러스가 발현한 유일한 GFP, CypB/wt 또는 CypB/R62A를 Chang 과 DU145 세포의 형질도입에서 아용하였다(도 3f). 이뮤노블럿팅 분석은 외인성의 CypB 또는 CypB/R62A가 내인성의 CypB와 유사한 농도로 발현된 것을 보여주었다. 양쪽 세포 유형에서, CypB/wt 감염체는 소포체 스트레스 조건에서 감염되지 않은 세포 또는 Ad-GFP 감염체와 비교하여 세포사가 감소된 것을 보여주었다 (도 3f). 대조적으로, CypB/R62A 감염체는 세포사가 상당히 증가된 것을 보여주었다. 종합적으로, 이 결과들은 PPIase 활성화를 통해 소포체 스트레스로 유도된 아폽토시스를 억제하기 위해 과발현된 CypB/wt의 능력은 H9C2 세포에만 국한되지 않는다는 것을 보여주었다.

4. 사이클로필린 B의 과발현은 ER , ROS 발생 및 미토콘드리아막 전위 탈분극으로부터 Ca ² ⁺ 누출을 억제한다

ER의 Ca² ⁺은 아폽토시스에서 중요한 역할 한다는 것이 보고되었다(Mattson and Chan, 2003; Benali-Furet et al., 2005).

그러므로, ER Ca² ⁺ 항상성에서 과발현된 CypB/wt 또는 CypB/R62A의 영향을 평가하였다. Ca² ⁺이 포함(도 4a)되거나 포함되지 않은 배지(도 4b)에서 배양 후 세포를 Tg에 처리하였다. 세포질에 Ca² ⁺이 없는 경우는 상기 실시예에서 설명하였다. Ca² ⁺이 포함된 배지와 포함되지 않은 배지 모두에서, pcDNA- 또는 CypB/R62A이 형질감염된 세포와 비교하여, Tg 처리후 CypB/wt 형질감염체에서 훨씬 적은 Ca² ⁺이 세포질로 방출됨을 확인하였다. 흥미롭게도, CypB/R62A의 과발현은 pcDNA이 형질감염된 세포에서 관찰된 것 보다 ER로부터 많은 Ca² ⁺ 방출을 일으켰다. 이러한 관찰은 과발현된 CypB/wt가 소포체 스트레스 동안 ER에서 Ca² ⁺누출을 감소시킨 반면, 과발현된 CypB/R62A는 소포체 스트레스 동안 ER에서 Ca² ⁺ 누출을 증가시킨다는 것을 보여주었다. 지속된 소포체 스트레스로 인한 접히지 않은 단백질 반응(UPR, unfolded protein response) 로부터 활성 산소종(ROS, Reactive oxygen species)의 축적은 세포사에 원인이 된다 (Haynes et al., 2004; Xue et al., 2005). DCF 산 화의 형광 측정법을 통해 DCF-DA(도 5a)를 사용하여 세포 내의 ROS를 감지하여 ROS 농도를 결정하였다. pcDNA가 형질감염된 세포에서의 DCF-DA의 로딩은 Tg의 존재에서 ROS 축적을 보여주었다. Tg 때문에 소포체 스트레스로 인한 ROS 축적은 CypB/wt의 과발현 또는 카탈라아제 처리에 의해 약화되었다. 많은 양의 ROS는 같은 Tg농도를 사용한 CypB/R62A 형질감염체에서 관찰되는 것과는 대조적으로, CypB는 PPIase 활성을 통하여 ROS 발생을 어느 정도 약화시키는 것을 보여주었다. 소포체 스트레스로 유도된 세포사(Chae et al., 2004)와 관련된 미토콘드리아막 전위(MMP)는 Tg에 24시간 노출된 pcDNA 형질감염한 세포에서 감소되었다(도 5b). M2 영역에서 측정되는 Tg에 의한 MMP 감소는 CypB/wt 에서 또는 카탈라아제 처리에 의해 거의 완전히 억제되지만 CypB/R62A 형질감염체에서는 악화되었다. 일관되게, MTT로 측정한 양쪽 세포의 생존 능력(도 5c)과 TUNEL분석(도 5) 에 의해 관찰된 DNA 분열은 ROS와 D MMP 측정 결과와 일치한다. 종합적으로, 이 결과는 CypB/wt의 과발현이 ER에서 Ca² ⁺ 소모의 억제와, ROS 발생과 미토콘드리아 손상을 약화시키는 PPIase 의존적 방법으로 소포체 스트레스로 유도된 아폽토시스에 대한 세포의 저항을 상당히 증가시키는 것을 보여주었다.

5. 소포체 스트레스로 유도된 아폽토시스에 대한 사이클로필린 B가 결핍된 세포의 민감도의 증가

소포체 스트레스 반응에서 CypB의 생리학적 역할을 더 자세히 평가하기 위 해, CypB를 녹다운시키는 siRNA를 사용하여 RNA 간섭 실험을 실시 하였다. 웨스턴 블럿팅 분석으로 분석했을 때, CypB의 발현은 특이 siRNA의 간섭에 의해 대부분 완전히 억제되었으며 Grp94와 Bip 같은 다른 단백질의 발현으로 CypB-siRNA의 영향은 관찰되지 않았다. MTT 분석, 웨스턴 블럿팅 분석과 TUNEL 분석에서 소포체 스트레스로 유도된 아폽토시스는 CypB 녹다운의 결과로 상당히 증가하는 것을 보여주었다(도 6b,c). 또한 처리하지 않거나 control-siRNA 형질감염된 세포와 비교하여 Tg와 Tm이 처리된 CypB 녹다운 세포에서 높은 ROS 농도와 낮은 MMPs를 감지하였다. 일반적인 카스파아제 억제제인 z-VAD-fmk가 아폽토시스를 억제하기 위해 첨가되었을 때, 소포체 스트레스로 유도된 자멸사는 CypB 녹다운 조건에서 부분적으로 구제되었으므로 소포체 스트레스로부터 CypB가 매개하는 보호는 부분적으로 카스파아제 의존적이라는 것을 확인할 수 있었다(도 6d).

6. 사이클로필린 B는 Bip 와 Grp94 와 물리적으로 상호작용한다

ER 소재 샤페론은 거대한 복합체로서 존재한다고 보고되었으며, GST pull-down (도 7a)와 공-면역침강분석법(도 7b)으로 CypB가 Bip 또는 Grp94와 상호작용하는지를 판단하였다. 그 결과는 CypB가 소포체 스트레스와 상관없이 Bip와 Grp94와 상호작용하고 소포체 스트레스 후 상호작용의 명백한 증가는 샤페론 발현 증가의 결과임을 보여주었다. CypB와 bip 또는 Grp94 사이의 상호작용은 최종적으로 yeast two-hybrid 분석법으로 증명하였다(도 7c). GST pull-down assay (도 7a)에 따라서, yeast two-hybrid assay는 Bip 와 Grp94와 더불어 CypB/wt 와 CypB/R62A 의 상호작용을 보여주었다. 따라서 CypB의 PPIase 활성화는 Bip 또는 Grp94에 결합하는데 영향을 주지 않음을 확인할 수 있었다. 종합적으로, CypB는 Bip와 Grp94와 함께 물리적으로 상호작용하고 이러한 상호작용은 CypB의 PPIase 활성화가 필요하지 않다는 것을 보여주었다.

도 1은 사이클로필린 B는 소포체 스트레스에 의해 전사적으로 상향조절됨을 보여준다. 48시간 동안 증식 조건(PM)에서 또는 24시간 동안 분화 조건(DM)에서 1 μM Tg와 10 μg/ml의 Tm으로 H9C2 세포를 처리하였다. 대조군(con)은 처리되지 않은 세포이다.

도 1a는 Bip, Grp94, PDI에 대한 소포체 스트레스 마커 항체들로 인한 웨스턴 블럿팅 분석을 나타내었다. CypB 단백질 농도를 농도계로 정량하였다. 액틴은 로딩 대조군으로 사용하였다. CypB의 각 밴드 아래 숫자는 적어도 3번의 다른 실험에서의 대표 값이며 평균 ± 표준편차로 나타내었다. ^* P<0.05는 PM에서 처리되지 않은 세포와 비교; ^# P<0.05는 DM에서 처리되지 않은 세포와 비교.

도 1b는 소포체 스트레스로 유도된 세포사의 현미경 사진이다.

도 1c는 아폽토시스 마커에 대한 항체에 의한 웨스턴 블럿팅 결과이다: 카스파아제 3 (cleaved form), Bax (mitochondrial), 프로카스파아제 12와 시토크롬 c (cytosolic). 또는 Tm에 노출되었을 때, 카스파아제 3의 분해, 프로카스파아제 12의 환원, 시토크롬 c의 방출과 Bax의 이동이 관찰된다. β-튜불린(β-tubulin)과 HSP60을 각각 세포질과 미토콘드리아 분획에서 로딩 대조군으로 사용하였다. 프로카스파아제 12의 각 밴드 아래 숫자는 적어도 3번의 다른 실험에서의 대표값이며 평균 ± 표준 편차로 나타내었다. ^* P<0.05는 PM에서 처리되지 않은 세포와 비교; ^# P<0.05는 DM에서 처리되지 않은 세포와 비교.

도 1d는 Hoechst 33342 염색에 의한 아폽토시스가 유도된 크로마틴 응축의 측정결과이다. 노란 화살표는 아폽토시스로 유도된 크로마틴 응축과 조각(fragmentation)을 나타낸다. 막대 그래프에서 데이터는 5번의 독립된 실험에서 얻은 값을 평균 ± 표준 편차로 나타내었다. ^* P<0.05는 PM에서 처리되지 않은 세포와 비교;^# P<0.05는 DM에서 처리되지 않은 세포와 비교.

도 1e 및 1f는 CypB 전사체의 반-정량적 RT-PCR 분석결과이다. RT-PCR의 대조군으로 GAPDH mRNA 증폭을 사용하였다. 처리되지 않은 세포에서 CypB의 전사 농도를 참고자료로 사용하였다. CypB의 각 밴드 아래 숫자는 최소 3번의 다른 실험의 대표 값이며 평균 ± 표준 편차로 나타내었다. ^* P<0.05는 PM에서 처리되지 않은 세포와 비교; ^# P<0.05는 DM에서 처리되지 않은 세포와 비교(e). 악티노마이신 D (Actinomycin D, AD)를 mRNA 합성을 저해하는데 사용하였다. ^* P<0.05 악티노마이신 D-처리 세포와 처리되지 않은 세포와 비교 (f).

도 2는 사이클로필린 B의 프로모터 분석 결과이다.

도 2a는 Genomatix MatInspector program으로 CypB 프로모터 서열을 분석한 결과이다. CypB 프로모터의 ERSE 영역으로 추정되는 2개를 밑줄로 표시하였다.

도 2b는 CypB 프로모터의 루시퍼라제 리포터 어세이 결과이다. 세포를 증식 조건에서 24시간 동안 1 μM Tg 또는 10 μg/ml Tm과 배양하였다. 대조군은 Tg 또는 Tm 처리되지 않은 세포이다. 데이터는 5개의 독립된 실험으로부터 평균 ± 표준편차로 나타내었다. ^§ P<0.05는 처리되지 않은 pGL3 basic과 비교; ^* P<0.05는 처리되지 않은 pCypB/400과 비교; ^# P<0.05는 처리되지 않은 pCypB/400과 비교.

도 2c는 ERSE와 동일한 서열의 돌연변이 분석 결과이다. 루시퍼라제 어세이를 돌연변이된 ERSE 프로모터가 포함된 pCypB/400에 근거한 구조체를 사용하여 수행하였다. 1, pGL3 basic vector; 2, pCypB/400; 3, CCAAg 돌연변이 구조체; 4, aaccT 돌연변이 구조체; 5, CtTGG 돌연변이 구조체; 6, aGTGG 돌연변이 구조체; 7, ERSE와 동일한 서열이 포함된 pCypB/400. 데이터는 5개의 독립된 실험으로 얻은 값을 평균 ± 표준편차로 나타내었다. ^* P<0.05는 Tg가 처리된 pCypB/400와 비교; ^# P<0.05는 Tm가 처리된 pCypB/400와 비교.

도 2d는 ATF6또는 XBP1에 의한 CypB 프로모터의 활성을 보여준다. 루시퍼라제 어세이를 pCypB/400과 다음 중 하나: pcDNA, 비 활성 ATF6, 활성 ATF6, 접합되지 않은 XBP1, 접합된 XBP1, 또는 ATF6-siRNA 와 수행하였다. 데이터는 5개의 독립된 실험으로 얻은 값을 평균 ± 표준편차로 나타내었다. ^* P<0.05는 비 활성 ATF6 형질감염과 비교; ^# P<0.05는 접합되지 않은 XBP1 형질감염과 비교;^** P<0.05는 활성 ATF6 형질감염과 비교. 음성 대조군으로 pcDNA를 사용하였다. 모든 루시퍼라제 데이터는 pCypB/400(B-D)의 기초적인 활성에 비례하여 평균 ± 표준편차로 나타내었다.

도 2e는 CypB ERSE 모티프의 EMSA와 슈퍼시프트 EMSA를 보여준다. 핵 추출물은 24시간 동안 Tm에 노출되거나 노출되지 않은 H9C2 세포에서 추출하고 ATF6에 특수한 항 혈청 또는 항체 없이 전 배양 후 CypB-ERSE 프로브 또는 변형된 프로브(CGTtt)와 같이 배양하였다.

도 2f는 Tg 또는 Tm에 24시간 노출 또는 노출되지 않은 H9C2 세포의 추출물과 같이 있는 ATF6, XBP1 또는 NF-Y에 대한 항체를 이용한 ChIP 어세이를 보여준다. 전체 투입 크로마틴의 1:100 희석으로부터 증폭을 나타내는 샘플을 투입하였다. IgG: 전-면역 혈청.

도 2g는 핵 추출물을 이용한 ATF6, NF-Y 또는 Lamin B에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블럿팅결과이다. Tg와 Tm에 노출되었을 때 활성 ATF6는 증가한 반면 NF-Y는 변화가 없었다. Lamin B를 핵 추출물의 로딩 대조군으로 사용하였다.

도 3은 사이클로필린 B의 과발현이 소포체 스트레스가 유발한 세포사를 약화시킴을 보여준다.

도 3a는 표시된 형질감염체에서 CypB/wt 또는 CypB/R62A의 발현 농도를 웨스턴 블럿팅으로 분석한 결과이다. 각 경우에서 3개의 다른 클론을 복제 특이성의 가능성을 제외하기 위해 분석하였다. CypB는 myc로 표시. Bip와 Grp94 같은 ER 샤페론 단백질은 다른 ER 샤페론 단백질에서 과발현된 CypB의 영향을 모니터링하기 위한 기준으로 검출하였다. 액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다.

도 3b는 과발현된 CypB의 소재화를 보여준다. 증식 조건에서 Tg 또는 Tm처리 24시간 후 세포에서 GFP-CypB/wt 또는 GFP-CypB/R62A의 소재화를 현미경으로 관찰하였다. ER tracker를 ER을 확인하는데 사용하였다. 위쪽 패널은 GFP 단독으로 소재화한 것을 보여준다. 중간 패널은 GFP-CypB/wt의 소재화를 보여주고 아래쪽 패널은 GFP-CypB/R62A의 소재화를 보여준다. ER tracker 는 파란색; GFP는 녹색. 막대 길이는 20 μm.

도 3c는 증식 조건(PM) 또는 분화 조건(DM)에서 과발현된 CypB/wt에 의한 소포체 스트레스가 유도하는 세포사의 약화를 MTT 어세이로 분석한 결과이다. CypB/R62A의 과발현이 세포 생존을 더 줄이는 것을 보여준다. 데이터는 5개의 독립된 실험에서 얻은 값을 평균 ± 표준편차로 나타내었다. ^* P<0.05는 Tg 처리 pcDNA 형질감염된 세포와 비교; ^# P<0.05는 PM과 DM에서 각각 Tm 처리 pcDNA 형질감염된 세포와 비교.

도 3d는 아폽토시스 마커 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅 결과이다: 카스파아제 3(cleaved form), 시토크롬 c (cytosolic), 프로카스파아제 12와 Bax (mitochondrial). 각 밴드 아래 숫자는 최소 5번의 다른 실험들의 대표 값이며 평균 ± 표준편차로 나타내었다. ^* P<0.05는 Tg가 처리된 pcDNA와 비교.

도 3e는 CypB/wt 와 CypB/R62A 형질감염체에서 ER 내재 단백질 유도의 변화를 보여준다. 세포로부터 나온 전체 세포의 추출물은 웨스턴 블럿팅으로 Bip, Grp94 와 PDI을 분석하였다. 각 밴드 아래 숫자는 최소 5번의 다른 실험들의 대표 값이며 평균 ± 표준편차로 나타내었다. ^* P<0.05는 Tg가 처리된 pcDNA와 비교

도 3f는 CypB의 방어적인 역할이 세포 종류에 국한되지 않음을 보여준다. Chang와 DU145 세포는 아데노바이러스, Ad-GFP, Ad-CypB/wt, 또는 Ad-CypB/R62A에 감염되지 않았다. CypB의 발현 농도를 웨스턴 블럿팅으로 검출하였다. 그들의 형질 도입 빈도(~60%)를 GFP 양성으로 모니터링하였다. 각 밴드 아래의 숫자는 최소 5번의 다른 실험들의 대표 값이고 평균 ± 표준편차로 나타내었다. ^* P<0.05는 각각 감염되지 않은 Chang와 DU145 세포와 비교. 소포체 스트레스 후 각 감염체의 생존율을 MTT 어세이로 정량하였다. Ad-GFP는 녹색 형광 단백질 아데노바이러스; Ad-CypB/wt는 CypB 아데노바이러스; Ad- CypB/R62A는 CypB/R62A 아데노바이러스. 데이터는 5번의 독립된 실험에서 얻은 값을 평균 ± 표준편차로 나타내었다. ^* P<0.05는 Tg 처리된 감염되지 않은 세포와 비교; ^# P<0.05는 Tm 처리된 감염되지 않은 Chang 와 DU145 세포.

도 4는 과발현된 사이클로필린 B가 소포체 스트레스 반응 하의 ER로부터 Ca²⁺의 배출을 억제함을 보여준다. 형질감염체로 표지된 cytosolic Ca² ⁺값의 상대적인 변화는 왼쪽 패널에서 보여주고, 오른쪽 패널에tj는 좌표를 따라 그린 것(plotted)룰 보여주고 있다.

도 4a는 초록색 세포 내의 Ca² ⁺을 보여준다. 빨간색 화살표(왼쪽 패널)와 점선(오른쪽 패널).

도 4b는 각 형질감염체를 1μM Tg 로 처리하기 이전에 4mM EGTA에 처리하여 세포 밖의 Ca² ⁺을 감소시켰다. 도 4a와 도 4b에서, 빨간 화살표(왼쪽 패널)과 점선 (오른쪽 패널)은 Tg 처리지점을 표시한 것이다. 도 4b에서, 파란색 화살표(왼쪽 패널)와 점선(오른쪽 패널)은 EGTA 처리지점을 표시한 것이다.

도 5는 사이클로필린 B과발현이 소포체 스트레스의 반응 하에서 ROS 생성, 미토콘드리아 막의 손상과 염색체 DNA 분열을 억제함을 보여준다.

도 5a는 ROS 측정과 그것의 정량 분석 결과이다. 점선은 세포 내의 ROS의 기본값을 나타낸 것이다. 데이터는 5번의 독립된 실험에서 얻은 값을 평균 ± 표준편차로 나타내었다.

도 5b는 MMP측정과 그것의 정량분석 결과이다. 화살표는 손상된 미토콘드리아를 가진 세포를 나타낸다. M1과 M2는 각각 손상된 세포와 손상되지 않은 미토콘드리아이다.

도 5c는 MTT 어세이에 의한 세포생존능력을 보여준다. Con, 처리하지 않음; Tg, 1 μM Tg 처리; Tg+catalase, Tg 처리하기 이전에 2000 U/ml catalase로 전처리. 데이터는 5번의 독립된 실험에서 얻은 값을 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *P<0.05는 Tg처리된 pcDNA와 비교, #P<0.05는 Tg 처리된 CypB/R62A와 비교.

도 5d는 TUNEL 어세이와 그것의 정량분석 결과이다. 초록색 화살표는 TUNEL-양성 세포를 나타낸다. 데이터는 5번의 독립된 실험에서 얻은 값을 평균 ± 표준편차로 나타내었다.

도 6은 사이클로필린 B의 Si RNA 녹다운이 소포체 스트레스-유도된 세포사를 강화함을 보여준다.

도 6a는 CypB-siRNA의 녹다운 효율이 웨스턴 블럿팅에 의해 결정됨을 보여준다. Grp94, Bip 및 PDI 같은 ER 샤페론 단백질은 다른 ER 샤페론 단백질에 CypB-siRNA의 모니터링된 효과를 참고하여 검출한 것이다.

도 6b는 MTT 어세이 결과이다. 각 세표계열의 상대적인 세포 생존능력은 con-siRNA 형질감염체를 기본으로 하여 보여준다. 데이터는 5번의 독립된 실험에서 얻은 값을 평균 ± 표준편차로 나타내었다. ^*P<0.05는 Tg 로 처리된 con-siRNA와 비교, ^#p<0.05는 Tm으로 처리된 con-siRNA와 비교.

도 6c는 세포 자멸사로 표지된 항체의 웨스턴 블럿팅 결과이다: Caspade 3(cleaved form) 및 Bax. TUNEL 어세이를 con-siRNA와 CypB-siRNA 형질감염체를 24시간 동안 Tg로 처리한 후 실행하였다. 초록색 화살표는 TUNEL-양성 세포를 나타낸다. 각 밴드 아래의 숫자는 적어도 5번의 독립된 실험에서 얻은 값을 평균 ± 표준편차로 나타내었다. ^*p<0.05는 Tg로 처리된 con-siRNA 형질감염체와 비교.

도 6d는 CypB의 방어적인 역할이 일부 Caspase에 의존함을 보여준다. Tg로 처리하기 이전에 PcDNA-, CypB/wt- 및 CypB-siRNA-형질감염된 세포를 50 μM z-VAD-FMK와 함께 배양하였다. 생존한 세포의 백분율을 MTT 어세이를 사용하여 측정하였다. 데이터는 5번의 독립된 실험에서 얻은 값을 평균 ± 표준편차로 나타내었 다. ^*P<0.05는 Tm 으로 처리된 pcDNA 형질감염체와 비교, ^#P<0.05는 Tm으로 처리된 CypB-siRNA 형질감염체와 비교.

도 7은 사이클로필린 B가 Bip와 Grp 94와 상호작용함을 보여준다.

도 7a는 GST pull-down 어세이 결과이다. GST pull-down 어세이는 박테리아성 발현된 재조합 GST-Cypb/wt과 GST-CypB/R62A의 융합 단백질과 Tg와 Tm이 처리되거나 처리되지 않은 H2C2 추출물을 사용하여 수행하였다. 웨스턴 블럿팅은 Bip, Grp94, CypB 또는 GST항체를 사용하여 수행하였다. GST를 단독으로 음성 대조군으로 사용하였다.

도 7b는 Bip와 Grp94와 함께 CtpB의 공-면역침강을 보여준다. 면역침강을 비면역 혈청 (Non-IS)또는 항-CypB 항체(CypB-AB)와 함께 수행하였다.

도 7c는 효모이중보합계 어세이 결과이다. PGBKT7, PGAD7, PGBKT7/CypB/wt, PGBKT7/R62A, PGADT7/Grp78 및 PGADT7/Grp94를 AH109와 함께 효모이중보합계 어세이에서 사용하였다. 상부 패널에서는 CypB/wt가 Bip 또는 Grp94와 함께 상호작용함을 보여주고, 하부 패널에서는 CypB/R62A가 Bip 또는 Grp94와 상호작용함을 보여준다.

<110> Dongseo Technology Headquters <120> COMPOSITION FOR PREVENTING AND TREATING AN ER-STRESS MEDIATED DISEASE <130> PA090069/KR <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 1 ccaagatgct aggattaaag agacgtgg 28 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> promoter <222> (1)..(23) <223> endoplasmic reticulum stress response element of the CypB promoter <400> 2 ccaatgagag ggctgtaacg tgg 23 <210> 3 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense siRNA for cyclophilin B <400> 3 ucccagauga gacuucaa 18 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense siRNA for cyclophilin B <400> 4 uugaaguucu caucuggga 19

Claims

사이클로필린 B의 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 소포체 스트레스 반응영역(ERSE)을 포함하는, 글루타민다량체 유발 응집 질환, 심혈관질환, 고호모시스테인증 및 동맥경화증으로 이루어진 군에서 선택되는 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 소포체 스트레스 반응영역을 통해 발현이 활성화되는 사이클로필린 B는 PPIase 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
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