CN113209303A - Wwp1通过溶酶体途径降解癌蛋白muc1抑制肿瘤及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了WWP1通过溶酶体途径降解癌蛋白MUC1抑制肿瘤及其应用。本发明中，揭示了WWP1与MUC1相互作用，WWP1促进MUC1的泛素化，通过溶酶体途径发挥降解作用，从而抑制肿瘤。WWP1其本身或其上调剂能够用于抑制肿瘤，进一步与蛋白酶体途径抑制剂组合应用则抑制效果更显著。此外，也可基于WWP1与MUC1的上述相互作用，筛选抑制肿瘤的药物。

Description

WWP1通过溶酶体途径降解癌蛋白MUC1抑制肿瘤及其应用
技术领域
本发明属于生物技术和药物学领域，更具体地，本发明涉及WWP1通过溶酶体途径降解癌蛋白MUC1抑制肿瘤及其应用。
背景技术
膜蛋白在真核生物细胞内的蛋白质中约占15-30％，参与调控许多基本生理过程，例如作为接收信号的受体、介导细胞内的物质运输、促进细胞器生成以及各种分子的跨细胞膜运输等，在细胞的生命活动中发挥重要作用。泛素化是蛋白质最常见的一种翻译后修饰，贯穿膜蛋白从合成到降解整个过程。泛素化可通过多种方式影响蛋白质的功能，例如调节蛋白质的稳定性和亚细胞定位。由此参与维持细胞内稳态、细胞周期、细胞凋亡、基因转录、蛋白表达、DNA损伤修复、炎症免疫和肿瘤发生等多种生理病理过程。
泛素(Ubiquitin，ub)是一种存在于所有真核生物(大部分真核细胞)中的小蛋白，由76个氨基酸组成，其结构中含有七个赖氨酸残基(K6，K11，K27，K29，K33，K48，及K63)和N端亮氨酸残基可以同源或者异源多聚形成不同的泛素化链。蛋白质泛素化就是指将泛素分子共价结合到底物蛋白赖氨酸残基的过程，由三个酶催化依次完成：E1泛素激活酶(Ubiquitin-activating enzyme)、E2泛素结合酶(Ubiquitin-transferring enzyme)和E3泛素连接酶(Ubiquitin ligase)。其中，E3泛素连接酶主要识别特异性的底物。目前报道过的E3泛素连接酶有超过600种。
靶向调控泛素-蛋白降解通路、阻断细胞的蛋白水解活性是肿瘤治疗的策略之一。调控蛋白质降解包括泛素-蛋白酶体途径(the Ubiquitin-Proteasome System，UPS)和自噬-溶酶体途径(the Autophagy-Lysosome Pathway，ALP)等。
认识细胞内蛋白质泛素化降解过程，对治疗与泛素系统相关的疾病，尤其是恶性肿瘤具有意义。然而，如何找到合适的靶蛋白以及进行怎样的调控，仍然是本领域的难点。
发明内容
本发明的目的在于提供WWP1通过溶酶体途径降解癌蛋白MUC1抑制肿瘤及其应用。
在本发明的第一方面，提供MUC1下调剂(包括降解剂、抑制剂等)在制备抑制肿瘤的组合物中的应用；其中，所述MUC1下调剂包括选自下组：(a)蛋白酶体途径抑制剂，及WWP1或其上调剂的组合；或，(b)WWP1或其上调剂。
在一个优选例中，所述肿瘤为MUC1阳性的肿瘤；较佳地，所述肿瘤为MUC1阳性的实体瘤；更佳地，所述肿瘤包括(但不限于)：乳腺癌，肝癌，肺癌，前列腺癌，甲状腺癌，结肠癌，指宫颈癌，卵巢癌，胃癌，胰腺癌。
在另一优选例中，所述MUC1阳性的肿瘤中，MUC1的表达高于正常细胞2倍以上(如2-500倍)，更佳地如5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、50倍、100倍、150倍等。
在另一优选例中，所述肿瘤为WWP1阳性的肿瘤。
在另一优选例中，所述WWP1阳性的肿瘤中，WWP1的表达高于正常细胞2倍以上(如2-500倍)，更佳地如5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、50倍、100倍、150倍等。
在另一优选例中，所述蛋白酶体途径抑制剂为蛋白酶体20S催化核心的抑制剂。
在另一优选例中，所述蛋白酶体途径抑制剂包括(但不限于)：硼替佐米(bortezomib，BTZ)，伊沙佐米(ixazomib)，卡非佐米(carfilzomib)，奥泼佐米(Oprozomib，ONX 0912)，马利佐米(marizomib；Nereus)，达拉唑米(delanzomib；CEP-18770)。
在另一优选例中，所述WWP1上调剂包括选自下组：(a)增强WWP1活性的物质；(b)增强WWP1的表达、稳定性或有效作用时间的物质；较佳地，所述WWP1上调剂包括选自(但不限于)：重组表达WWP1的表达构建物，增强WWP1对MUC1的泛素化和降解作用的多肽或化合物，WWP1的化学上调剂，促进WWP1基因启动子驱动能力的上调剂，WWP1基因特异性microRNA的下调剂。
在另一优选例中，所述的抑制肿瘤包括：抑制肿瘤细胞的恶性特征，抑制肿瘤细胞的增殖能力，抑制肿瘤细胞的迁移/转移，抑制肿瘤细胞的生长和成球能力，抑制肿瘤细胞的生长和肿瘤起始/干细胞的自我更新。
在另一优选例中，所述WWP1或其上调剂通过溶酶体途径降解MUC1，从而抑制肿瘤。
在另一优选例中，所述WWP1通过促进MUC1的泛素化和降解来抑制肿瘤。
在另一优选例中，所述蛋白酶体途径抑制剂促进WWP1降解MUC1。
在本发明的另一方面，提供一种用于抑制肿瘤的组合物，其包括：蛋白酶体途径抑制剂，以及WWP1或其上调剂。
在一个优选例中，所述蛋白酶体途径抑制剂为蛋白酶体20S催化核心的抑制剂；较佳地包括(但不限于)：硼替佐米(bortezomib，BTZ)，伊沙佐米(ixazomib)，卡非佐米(carfilzomib)，奥泼佐米(Oprozomib，ONX 0912)，马利佐米(marizomib；Nereus)，达拉唑米(delanzomib；CEP-18770)。
在另一优选例中，所述WWP1上调剂包括选自下组：(a)增强WWP1活性的物质；(b)增强WWP1的表达、稳定性或有效作用时间的物质；较佳地，所述WWP1上调剂包括选自(但不限于)：重组表达WWP1的表达构建物，增强WWP1对MUC1的泛素化和降解作用的多肽或化合物，WWP1的化学上调剂，促进WWP1基因启动子驱动能力的上调剂，WWP1基因特异性microRNA的下调剂。
在另一优选例中，所述的组合物为药物组合物。
在另一优选例中，所述的组合物中还包括：药学上可接受的载体。
在本发明的另一方面，提供WWP1与MUC1相互作用的复合体应用，用于作为筛选抑制肿瘤的药物或化合物的靶标(即作为筛药靶点)，筛选或制备抑制肿瘤的药物。
在本发明的另一方面，提供一种筛选抑制肿瘤的潜在物质的方法，包括：(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达WWP1与MUC1相互作用的复合体；和，(2)检测所述体系中WWP1与MUC1相互作用的情况；若所述候选物质在统计学上促进WWP1对MUC1的泛素化和降解，则该候选物质是抑制肿瘤的潜在物质。
在一个优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到所述表达体系中；和/或，步骤(2)包括：检测所述体系中WWP1与MUC1相互作用情况；并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达体系；若所述候选物质在统计学上WWP1对MUC1的泛素化和降解，则该候选物质是抑制肿瘤的潜在物质。
在另一优选例中，所述体系中还包括溶酶体途径，所述方法的(2)中，包括：检测所述体系中WWP1通过溶酶体途径与MUC1相互作用的情况；若所述候选物质在统计学上促进WWP1通过溶酶体途径对MUC1的泛素化和降解，则该候选物质是抑制肿瘤的潜在物质。
在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对WWP1或MUC1、其片段或变异体、其编码基因或其上下游分子或信号通路设计的调控分子或其构建体(如shRNA，siRNA，基因编辑试剂，表达载体，重组的病毒或非病毒构建体等)，化学小分子(如特异性抑制剂或拮抗剂)，相互作用分子等。
在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系(如表达WWP1或MUC1的细胞或细胞培养物)、亚细胞(培养物)体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于抑制肿瘤有用的物质。
在另一优选方式中，所述的WWP1选自下组：(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽；(b)将(a)所示的氨基酸序列经过一个或多个(如1～20个，1-10个，1-5个，1-3个或1-2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有(a)或(b)多肽功能的WWP1衍生物，或其活性片段；(c)序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，同源性≥90％(如同源性≥92％，≥94％，≥96％，≥98％或≥99％)的WWP1衍生物，或其活性片段。
在另一优选方式中，所述的MUC1选自下组：(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽；(b)将(a)所示的氨基酸序列经过一个或多个(如1～20个，1-10个，1-5个，1-3个或1-2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有(a)或(b)多肽功能的MUC1衍生物，或其活性片段；(c)序列与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，同源性≥90％(如同源性≥92％，≥94％，≥96％，≥98％或≥99％)的MUC1衍生物，或其活性片段。
在本发明的另一方面，提供特异性识别或扩增WWP1和MUC1的试剂的用途，用于制备诊断或预后肿瘤的诊断试剂或诊断试剂盒；所述肿瘤为MUC1阳性的肿瘤，较佳地为MUC1阳性的实体瘤。
在另一优选例中，在诊断或预后时，利用所述试剂进行分析：
在另一优选例中，若WWP1低表达或正常表达、且MUC1高表达，则适于以MUC1下调剂治疗，所述MUC1下调剂包括：(a)蛋白酶体途径抑制剂，及WWP1或其上调剂的组合；或(b)WWP1或其上调剂。
在另一优选例中，所述的诊断试剂包括：特异性结合WWP1的结合分子；特异性扩增WWP1和MUC1基因的引物；特异性识别WWP1和MUC1基因的探针；或特异性识别WWP1和MUC1基因的芯片等。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、WWP1通过溶酶体途径降解MUC1。(A)在乳腺癌细胞系MDA-MB-468和T47D中稳定表达WWP1、乳腺癌细胞系BT549和SKBR3中稳定沉默WWP1，Western blot检测WWP1和MUC1的蛋白水平。(B)在肝癌细胞系Bel-7402中稳定表达WWP1、非小细胞肺癌细胞系NCI-H1975中稳定沉默WWP1，Western blot检测WWP1和MUC1的蛋白水平。(C)在HEK293T中共转MUC1和梯度浓度WWP1，Western blot检测WWP1和MUC1的蛋白水平。(D)在HEK293T中瞬时转染MUC1和WWP1，并用CHX(30mg/ml)处理0-6小时后收细胞，Western blot检测WWP1和MUC1的蛋白水平。用image J测定每一道样品中MUC1-C的灰度值，以β-actin作为内参，进行统计学分析。(E)在HEK293T细胞中瞬时转染MUC1和WWP1，用溶酶体途径抑制剂CQ(100μM)处理24小时，或用MG132(20μM)处理6小时，转染48小时后收细胞，Western blot检测WWP1和MUC1的蛋白水平(左)；在MDA-MB-468/CTL和MDA-MB-468/WWP1细胞中，用溶酶体途径抑制剂CQ(50μM)处理24小时，或用MG132(10μM)处理6小时，Western blot检测WWP1和MUC1的蛋白水平(中)；在Bel-7402细胞中瞬时转染WWP1，用溶酶体途径抑制剂CQ(50μM)处理24小时，或用MG132(10μM)处理6小时，转染48小时后收细胞，Western blot检测WWP1和MUC1的蛋白水平(右)。(F)在HEK293T中瞬时转染MUC1和WWP1，24小时后免疫荧光检测MUC1、WWP1和LAMP2在细胞内的定位情况。标尺：20μm。(G)在HEK293T中瞬时转染MUC1和WWP1或WWP1-C890A，Western blot检测WWP1和MUC1的蛋白水平。
图2、WWP1通过降解MUC1抑制肿瘤的恶性特征。(A)CCK8检测MDA-MB-468/CTL和MDA-MB-468/WWP1细胞的增殖能力，绘制生长曲线图，****p<0.0001。(B)构建MDA-MB-468稳定沉默WWP1细胞株，Western blot检测WWP1和MUC1的蛋白水平(左)。CCK8检测细胞的增殖能力(右)，绘制生长曲线图，***p<0.001。(C)CCK8检测Bel-7402/CTL和Bel-7402/WWP1细胞的增殖能力，绘制生长曲线图，***p<0.001。(D)CCK8检测NCI-H1975/shCTL，NCI-H1975/shWWP1-#1，NCI-H1975/shWWP1-#2细胞的增殖能力，绘制生长曲线图，***p<0.001。(E)构建BT549稳定沉默WWP1细胞株，并在此基础上进一步构建稳定敲除MUC1细胞株，Western blot检测WWP1和MUC1的蛋白水平(左)。CCK8检测细胞的增殖能力(右)，绘制生长曲线图，***p<0.001。(F)平板克隆实验检测细胞的克隆形成能力(左)，统计克隆数目并计算相对克隆形成数(右)，**p<0.01，****p<0.0001。(G)Transwell实验检测细胞的迁移能力(左)，进行统计学分析(右)，***p<0.001，****p<0.0001。标尺：200μm。(H)划痕实验检测细胞48小时的迁移能力(左)，进行统计学分析(右)，**p<0.01，***p<0.001。标尺：100μm。(I)成球实验检测细胞的二次成球能力(左)，进行统计学分析(右)，***p<0.001，****p<0.0001。
图3、WWP1不能降解MUC1-AQA和MUC1-K1231R突变体。(A)HEK293T细胞中转染Vector-HA和MUC1-HA，48小时后收集细胞，用HA-beads孵育进行免疫共沉淀，Western blot检测MUC1与内源性WWP1存在相互作用(左)；收集BT549细胞并裂解，用IgG做对照，用anti-MUC1-C抗体进行免疫共沉淀，Western blot检测WWP1和MUC1的相互作用(右)。(B)在HEK293T细胞中瞬时转染WWP1和GFP-CD或GFP-AQA，48小时后收细胞，用myc-beads进行免疫共沉淀，对WWP1和GFP-CD/AQA截断体进行Western blot检测。(C)将GST/GST-CD/GST-AQAbeads与WWP1孵育过夜，用co-IP裂解液洗三遍后，对GST beads沉淀下来的蛋白进行Western blot检测。(D-F)在MDA-MB-468/gMUC1细胞中构建回转MUC1-WT或MUC1-AQA/K1231R突变体及WWP1的细胞系。Western blot检测WWP1和MUC1的蛋白水平(D)；CCK8检测细胞的增殖能力(E)；成球实验检测细胞的成球能力(F)，进行统计学分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图4、蛋白酶体途径抑制剂促进WWP1降解MUC1。(A)在MDA-MB-468细胞中分别应用ixazomib(200nM)、carfilzomib(200nM)、bortezomib(200nM)、HCQ(10μM)处理，作用时间24小时，以及MHY1486(2μM)处理6小时，DMSO作为阴性对照。Western blot检测MUC1和LC3的蛋白水平。(B)在BT549/shCTL，BT549/shWWP1-#1，BT549/shWWP1-#2细胞中应用bortezomib(0、4nM、8nM)作用24小时。Western blot检测WWP1、MUC1和LC3的蛋白水平。(C)在BT549/shCTL，BT549/shWWP1-#1，BT549/shWWP1-#2细胞中应用ixazomib(0、50nM)作用24小时。Western blot检测WWP1、MUC1的蛋白水平。(D)在T47D/CTL和T47D/WWP1细胞株中用bortezomib(5nM)作用24小时，DMSO作为阴性对照。Western blot检测WWP1和MUC1的蛋白水平。(E)在MDA-MB-468/gCTL、MDA-MB-468/gMUC1细胞中分别过表达vector或WWP1后，应用bortezomib(2nM)作用24小时，DMSO作为阴性对照。Western blot检测WWP1、MUC1和LC3的蛋白水平。(F)在MDA-MB-468/gCTL、MDA-MB-468/gMUC1细胞中分别过表达vector或WWP1后，应用bortezomib(1nM)作用0-6天，DMSO作为阴性对照。每天同一时间用CCK8试剂盒检测各组细胞的增殖能力，绘制生长曲线图。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。(G)在MDA-MB-468/gCTL、MDA-MB-468/gMUC1细胞中分别过表达vector或WWP1后，用DMSO或BTZ(1nM)处理5天，成球实验检测细胞的成球能力，进行统计学分析，**p<0.01。标尺：200μm。
图5、Bortezomib有效抑制WWP1/MUC1阳性移植瘤生长。(A)在MDA-MB-468/gCTL和MDA-MB-468/gMUC1细胞株中分别过表达vector或WWP1后，进行裸鼠皮下成瘤实验，待15天后肿瘤大小达到4mm×4mm时，将小鼠随机分为两组(每组5只)，以0.25mg/kg剂量的bortezomib对小鼠腹腔注射，每周2次，连续2周，对照组给予等体积的PBS。45天后将小鼠安乐死，分离肿瘤组织并拍照。(B)每3天用游标卡尺监测肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线并进行统计学分析(mean±SEM，n＝5)。**p<0.01，****p<0.0001。(C)对各组小鼠分离出的肿瘤组织进行称重，并进行统计学分析(mean±SEM，n＝5)。**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。(D)对各组小鼠在安乐死前进行称重，并进行统计学分析(mean±SEM，n＝5)。*p<0.05。(E)免疫组化染色检测荷瘤裸鼠肿瘤组织中MUC1和WWP1的表达情况。标尺：50μm。
图6、在乳腺癌患者组织中MUC1与WWP1呈负相关。(A)108例乳腺癌病人样本中MUC1和WWP1的表达呈负相关，选取代表性图片。标尺：100μm。(B)MUC1和WWP1的IHC打分后的统计学分析。(C-F)乳腺癌四种亚型Luminal A(C)、Luminal B(D)、HER2+(E)、TNBC(F)中对MUC1和WWP1的IHC打分后的统计学分析。
具体实施方式
本发明人经过深入研究，首次揭示了WWP1与MUC1相互作用，WWP1促进MUC1的泛素化，通过溶酶体途径发挥降解作用，从而抑制肿瘤。WWP1其本身或其上调剂能够用于抑制肿瘤，进一步与蛋白酶体途径抑制剂组合应用则抑制效果更显著。此外，也可基于WWP1与MUC1的上述相互作用，筛选抑制肿瘤的药物。
本发明发现了调控MUC1蛋白降解的有效途径，阐述了MUC1蛋白降解的分子机制，提供了靶向降解MUC1从而抑制肿瘤生长的新策略，为肿瘤治疗提供了新靶点或新思路。
WWP1与MUC1及其相互作用
WWP1属于HECT家族中NEDD4家族，包含：一个C2结构区域，参与蛋白与蛋白相互作用以及钙离子依赖的细胞膜结合；四个WW结构域，通过识别脯氨酸富集基序(例如PPXY、PPLP、PPR或p(S/T)P)与底物蛋白结合；一个HECT结构域，具有E3泛素连接酶活性，其活性依赖C890位点。WWP1通过调控多种底物蛋白的亚细胞定位、表达水平或活性，参与基因转录、细胞增殖、分化、凋亡和衰老等生命过程。其底物包括Smad2、ErbB4/HER4、RNF11、KLF5、p63、p27、p53、PTEN等。
黏蛋白1(mucin 1，MUC1)是一种I型跨膜糖蛋白，广泛表达于呼吸系统、消化系统和生殖系统等分泌型上皮细胞的管腔表面，起润滑和保护作用。MUC1基因编码约120-225KDa的高分子量糖蛋白，由N端亚基(MUC1-N)和C端亚基(MUC1-C)通过非共价键结合构成。MUC1-N主要由20个氨基酸为单元构成的串联重复序列组成，富含保守的糖基化位点。MUC1-C包含58个氨基酸构成的胞外结构域(extracellular domain，ECD)、28个氨基酸构成的跨膜结构域(transmembrane domain，TMD)和72个氨基酸构成的细胞内结构域(cytoplasmic domain，CD)。MUC1在肿瘤细胞中糖基化的水平降低，蛋白水平增加，并在细胞膜上呈现非极性分布，常与生长因子受体结合并发挥生物学功能。临床研究发现MUC1在70％的实体瘤，尤其是90％以上的乳腺癌中高表达，水平高达正常细胞的50-100倍。MUC1异常表达与多种癌症如乳腺癌、前列腺癌、肺癌和甲状腺癌的临床预后不良相关。MUC1在多种肿瘤细胞中异常高表达，主要原因包括基因拷贝数的增加和转录水平的上调，而本领域中对于MUC1蛋白水平的调控知之甚少。
当被应用于本发明时，所述WWP1或MUC1可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自机体。此外，所述的WWP1或MUC1也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组WWP1或MUC1，以应用于实验或临床。所述的WWP1或MUC1包括全长蛋白或其生物活性片段。优选的，所述的WWP1的氨基酸序列可以与SEQ ID NO:1所示的序列基本上相同或其同源物(来自不同物种的同源基因或同源蛋白)；所述的MUC1的氨基酸序列可以与SEQ ID NO:2所示的序列基本上相同或其同源物。根据WWP1或MUC1的氨基酸序列可以方便地得出其相应的核苷酸编码序列。
经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的WWP1或MUC1的氨基酸序列也包括在本发明中。WWP1或MUC1或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，TheBenjamin/Cummings Pub.Co.P224。
任何一种WWP1或MUC1的生物活性片段或同功能变体都可以应用到本发明中。在这里，WWP1或MUC1的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的WWP1或MUC1的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长WWP1或MUC1的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长WWP1或MUC1的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。
本发明也可采用经修饰或改良的WWP1或MUC1，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的WWP1或MUC1。也就是说，任何不影响WWP1或MUC1的生物活性的变化形式都可用于本发明中。
本发明所述的WWP1与MUC1可以构成复合体(蛋白复合体)，用于作为筛选抑制肿瘤的药物或化合物的靶标(即作为筛药靶点)，筛选或制备抑制肿瘤的药物。
WWP1及其上调剂的应用
本发明人发现，WWP1通过溶酶体途径降解MUC1，抑制肿瘤的恶性转化；蛋白酶体途径抑制剂促进WWP1降解MUC1。动物模型试验显示，Bortezomib有效抑制WWP1/MUC1阳性移植瘤生长。对于肿瘤患者的研究显示，肿瘤组织中MUC1与WWP1呈负相关。
基于本发明人的新发现，本发明首先提供了WWP1或其上调剂的应用，用于制备抑制肿瘤的组合物；或用于筛选抑制肿瘤的物质。
如本文所用，所述的WWP1的上调剂包括了促进剂、激动剂等。任何可提高WWP1的活性、维持WWP1的稳定性、促进WWP1的表达、促进WWP1的分泌、延长WWP1有效作用时间、或促进WWP1的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为具有上调功能的有效物质。
作为本发明的优选方式，所述的WWP1的上调剂包括(但不限于)：在转入细胞后可表达(优选过表达)WWP1的表达载体或表达构建物。通常，所述表达载体包含一基因盒，所述的基因盒含有编码WWP1的基因及与之操作性相连的表达调控序列。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
WWP1多核苷酸序列可插入到重组表达载体中，从而可将之转入到细胞中，过表达产生WWP1。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于本发明。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。例如，所述的表达载体包括：病毒载体，非病毒载体；较佳地，所述的表达载体包括(但不限于)：腺相关病毒，慢病毒载体，腺病毒载体等。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含WWP1的DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。
本发明的WWP1或其上调剂可直接用于抑制肿瘤。此外，还可同时与其它治疗剂或辅剂联合使用。作为本发明的特别优选的方式，将所述WWP1或其上调剂与蛋白酶体途径抑制剂联合应用，
本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-20wt％；较佳的0.00001-10wt％)的所述的WWP1、或其上调剂(如过表达该WWP1的表达载体)、或其类似物，以及蛋白酶体途径抑制剂；进一步地，所述组合物中还可包括药学上可接受的载体。
通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。
如本文所用，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
如本文所用，所述的“过表达”是指使得目标基因在细胞中呈现显著高于(如高5％以上，10％以上，20％以上，30％以上，50％以上，60％以上，80％以上或那个高)普通表达(细胞本底表达)的表达量。这一普通表达的表达量可以通过检测未经改造的细胞的平均表达量来统计。
本发明的组合物含有安全有效量的WWP1、或其上调剂(如过表达该WWP1的表达载体)、或其类似物，以及蛋白酶体途径抑制剂。“药学上可接受的”载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。所述药物制剂还可制成缓释制剂。
作为本发明的优选方式，所述的蛋白酶体途径抑制剂为蛋白酶体20S催化核心的抑制剂；较佳地所述蛋白酶体20S催化核心的抑制剂包括硼替佐米(bortezomib，BTZ，也称为velcade)、伊沙佐米(ixazomib，也称为Ninlaro)、卡非佐米(carfilzomib，也称为kyprolis)、奥泼佐米(Oprozomib，ONX 0912)、马利佐米(marizomib；Nereus)和达拉唑米(delanzomib；CEP-18770)。
本发明所述的WWP1或其上调剂、蛋白酶体途径抑制剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的WWP1或其上调剂、蛋白酶体途径抑制剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的WWP1或其上调剂以及蛋白酶体途径抑制剂每天以约0.00001mg-10mg/kg动物体重1的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
WWP1的上调剂或类似物的给药方式主要取决于所述上调剂的类型和特性，这是本领域人员可以评估的。
WWP1及MUC1作为药物筛选靶点
在得知了所述的WWP1与MUC1的功能和作用机制后，可以基于该特征来筛选调节WWP1与MUC1相互作用的物质，从而找到潜在或确定的对于抑制MUC1、进而抑制肿瘤具有作用的物质。
因此，本发明提供一种筛选抑制肿瘤的潜在物质的方法，所述方法包括(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达WWP1与MUC1相互作用的复合体；和，(2)检测所述体系中WWP1与MUC1相互作用的情况；若所述候选物质在统计学上促进WWP1对MUC1的泛素化和降解，则该候选物质是抑制肿瘤的潜在物质。
在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到WWP1与MUC1相互作用的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达WWP1与MUC1的体系。
所述的表达WWP1与MUC1的体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达WWP1与MUC1的细胞；或可以是重组表达WWP1与MUC1的细胞。所述的表达WWP1与MUC1的体系还可以是(但不限于)亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型)等。
作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于抑制肿瘤真正有用的物质。
本发明对于WWP1与MUC1的表达、活性、存在量、相互作用或MUC1的泛素化的检测方法没有特别的限制。可以采用常规的蛋白定量或半定量检测技术，例如(但不限于)：免疫共沉淀、SDS-PAGE法，Western-Blot法，ELISA等。
另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的化合物、组合物或药物，或一些潜在物质。一些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于抑制肿瘤真正有用的物质，从而用于临床。
WWP1与MUC1作为诊断靶点
基于本发明人的上述新发现，可以将WWP1与MUC1作为诊断肿瘤相关的病理状态(疾病)的标志物：(i)进行肿瘤的分型、鉴别诊断、和/或易感性分析；(ii)评估相关人群相关疾病治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法；(iii)早期评估相关人群相关疾病患病风险，早期监测早期防治。比如，可分离出由WWP1与MUC1表达异常或MUC1泛素化异常而导致相关疾病的人群，从而可进行更有针对性地治疗。
本发明也提供了WWP1与MUC1的用途，用于制备诊断或预后肿瘤的诊断试剂或诊断试剂盒。
可采用各种本领域已知的技术来检测WWP1与MUC1或其编码基因的存在与否、表达情况、表达水平、泛素化水平或活性，这些技术均包含在本发明中。例如可用已有技术如Southern印迹法、Western印迹法、DNA序列分析、PCR等，这些方法可结合使用。
本发明还提供了用于在分析物中检测WWP1或MUC1基因的存在与否以及表达情况的试剂。优选的，当进行基因水平的检测时，可以采用特异性扩增WWP1或MUC1的引物；或特异性识别WWP1或MUC1的探针来确定WWP1或MUC1基因的存在与否；当进行蛋白水平的检测时，可以采用特异性结合WWP1或MUC1编码的蛋白(包括其泛素化状态)的抗体或配体来确定WWP1或MUC1蛋白的表达情况。例如，所述的试剂是引物，其可特异性扩增出WWP1或MUC1基因或基因片段。针对WWP1或MUC1基因的特异性探针的设计是本领域人员熟知的技术，例如，制备一种探针，其可与WWP1或MUC1基因上特定位点发生特异性结合，而不与WWP1或MUC1基因以外的其它基因特异性结合，且所述探针带有可检测信号。此外，利用特异性结合WWP1或MUC1蛋白(包括其泛素化状态)的抗体来检测分析物中WWP1或MUC1蛋白表达情况的方法也是本领域人员熟知的技术。
本发明还提供了用于在分析物中检测WWP1或MUC1基因的存在与否以及表达情况的试剂盒，该试剂盒包括：特异性扩增WWP1或MUC1基因的引物；特异性识别WWP1或MUC1基因的探针；或特异性结合WWP1或MUC1蛋白(包括其泛素化状态)的抗体或配体。
所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或核酸序列分析软件等。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
材料和方法
1、细胞株的培养
人胚胎肾细胞系HEK293T、人肝癌细胞系Bel-7402和人乳腺癌细胞系T47D培养于DMEM(Corning，NY，USA)中，含10％胎牛血清(Gibco，Grand Island，NY，USA)，培养条件：5％CO2，37℃恒温培养箱。人乳腺癌细胞系BT549、SKBR3和人非小细胞肺癌细胞系NCI-H1975培养于RPMI1640(Corning，NY，USA)中，含10％胎牛血清，培养条件：5％CO2，37℃恒温培养箱。人乳腺癌细胞系MDA-MB-468培养于L15(Corning，NY，USA)中，含10％胎牛血清，培养条件：无CO2，37℃恒温培养箱。
2、质粒转染与病毒包装
使用Nano293T转染试剂(NCM，China)，按照制造商的说明用质粒转染HEK293T细胞。转染48小时后，通过0.45μm滤膜收集病毒上清。慢病毒载体质粒PGIPZ lentiviralplasmids，包装质粒PSPAX2和PMD2G均购自Thermo Scientific Open Biosystems GIPZLentiviral shRNA mir Library。
3、构建WWP1过表达的稳转细胞株
在HEK293T细胞中转染plvx-IRES-puro/WWP1慢病毒质粒，48小时后收集病毒上清。将MDA-MB-468细胞接种至6cm培养皿中，约24小时后当细胞处于对数生长期(50-60％汇合度)时，加入1ml相应的病毒液和polybrene(终浓度为8ug/ml)，感染后24小时换液，并用puromycin筛选得到稳转细胞系。
WWP1氨基酸序列如下(人源，SEQ ID NO:1)：
MATASPRSDTSNNHSGRLQLQVTVSSAKLKRKKNWFGTAIYTEVVVDGEITKTAKSSSSSNPKWDEQLTVNVTPQTTLEFQVWSHRTLKADALLGKATIDLKQALLIHNRKLERVKEQLKLSLENKNGIAQTGELTVVLDGLVIEQENITNCSSSPTIEIQENGDALHENGEPSARTTARLAVEGTNGIDNHVPTSTLVQNSCCSYVVNGDNTPSSPSQVAARPKNTPAPKPLASEPADDTVNGESSSFAPTDNASVTGTPVVSEENALSPNCTSTTVEDPPVQEILTSSENNECIPSTSAELESEARSILEPDTSNSRSSSAFEAAKSRQPDGCMDPVRQQSGNANTETLPSGWEQRKDPHGRTYYVDHNTRTTTWERPQPLPPGWERRVDDRRRVYYVDHNTRTTTWQRPTMESVRNFEQWQSQRNQLQGAMQQFNQRYLYSASMLAAENDPYGPLPPGWEKRVDSTDRVYFVNHNTKTTQWEDPRTQGLQNEEPLPEGWEIRYTREGVRYFVDHNTRTTTFKDPRNGKSSVTKGGPQIAYERGFRWKLAHFRYLCQSNALPSHVKINVSRQTLFEDSFQQIMALKPYDLRRRLYVIF
RGEEGLDYGGLAREWFFLLSHEVLNPMYCLFEYAGKNNYCLQINPASTINPDHLSYFCFIGRFIAMALFHGKFIDTGFSLPFYKRMLSKKLTIKDLESIDTEFYNSLIWIRDNNIEECGL
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EVRMRLLQFVTGTCRLPLGGFAELMGSNGPQKFCIEKVGKDTWLPRSHTCFNRLDLPPYKSYEQLKEKLLFAIEETEGFGQE
在MDA-MB-468等癌细胞中过表达WWP1时，也采用上述慢病毒质粒。
瞬时转染使用的是以pCMV-Myc-WWP1质粒载体，其中WWP1的序列与上述病毒载体一致。
4、构建WWP1稳定敲低细胞系
通过WWP1特异性shRNA序列建立WWP1敲除细胞系。shRNA序列为：
shCTL(对照)：5’-ctcgcttgggcgagagtaa-3’(SEQ ID NO:3)；
shWWP1-#1：5’-aggtactttgttgatcata-3’(SEQ ID NO:4)；
shWWP1-#2：5’-acaagaacaacaacattca-3’(SEQ ID NO:5)。
将BT549或MDA-MB-468细胞接种至6cm培养皿中，约24小时后当细胞处于对数生长期(50-60％汇合度)时，加入1ml相应的病毒液和polybrene(终浓度为8ug/ml)，感染后24小时换液，并用puromycin筛选稳定转染的细胞株。
5、构建MUC1稳定敲除细胞系
MUC1氨基酸序列如下(人源；SEQ ID NO:2；其中第1184-1186位为CQC位点)：
MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTGSGHASSTPGGEKETSATQRSSVPSSTEKNAVSMTSSVLSSHSPGSGSSTTQGQDVTLAPATEPASGSAATWGQDVTSVPVTRPALGSTTPPAHDVTSAPDNKPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDNRPALGSTAPPVHNVTSASGSASGSASTLVHNGTSARATTTPASKSTPFSIPSHHSDTPTTLASHSTKTDASSTHHSSVPPLTSSNHSTSPQLSTGVSFFFLSFHISNLQFNSSLEDPSTDYYQELQRDISEMFLQIYKQGGFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAATSANL
利用CRISPR-Cas9系统构建Cas9-CTL(对照)/Cas9-MUC1质粒(靶向MUC1的gRNA序列为：5’-GCTGCTGCTCCTCACAGTGC-3’；CTL(对照)为GCACTACCAGAGCTAACTCA)，在MDA-MB-468细胞中，感染Cas9-CTL/Cas9-MUC1病毒，稳定敲除MUC1细胞系。在BT549 shWWP1-#1稳定表达细胞株中，感染Cas9-CTL/Cas9-MUC1病毒，得到WWP1及MUC1稳定双敲细胞系，并用puromycin筛选稳定转染的细胞株。该Cas9-MUC1也称为gMUC1；该Cas9-CTL也称为gCTL。
6、免疫印迹实验
配制裂解液：1ml NETN150 buffer(NaCl 150mM，EDTA 1mM，Tris 20mM pH 7.6，NP40 0.5％)+1μl蛋白酶抑制剂(1:1000)+1μl磷酸酶抑制剂(1:1000)(Sigma-Aldrich)。收集细胞，加入相应体积的裂解液，将样品定量、变性后上样至SDS-PAGE胶。电泳后将蛋白质转印至NC或PVDF膜上，用5％脱脂牛奶封闭后，将膜与相应的一抗在4℃条件下孵育过夜，用TBST洗5分钟/3次，然后将膜与HRP耦连的二抗孵育，用TBST洗5分钟/3次，ECL化学发光显影。
7、免疫共沉淀
配制裂解液：1ml NETN150 buffer(NaCl 150mM，EDTA 1mM，Tris 20mM pH 7.6，NP40 1％)+1μl蛋白酶抑制剂(1:1000)+1μl磷酸酶抑制剂(1:1000)。收集细胞后用裂解液，将样品与HA-beads/myc-beads(Santa Cruz，CA，USA)孵育，4℃摇转过夜后，离心，用裂解液洗涤3次以去掉非特异性结合的蛋白。加入SDS变性和煮沸后，将免疫共沉淀的蛋白质从beads中释放出来，得到的样品用SDS-PAGE分离，进行免疫印迹。
8、质谱
HEK293T细胞中瞬时表达MUC1-HA，以Vector-HA作为对照，48小时后收集细胞并用裂解液裂解，用HA-beads孵育过夜后，离心，用裂解液洗三次以去掉非特异性结合的蛋白。将免疫共沉淀下来的蛋白变性后上样至SDS-PAGE胶，考马斯亮蓝染色后，用考染洗脱液将胶洗至透明。从凝胶中切下条带，经过还原、氨基甲基化和胰蛋白酶消化，使用OrbitrapFusion LUMOS质谱仪(Thermo Fisher Scientific)分析测定肽段。
9、GST Pull-down实验
将pSUMO-WWP1质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞，重组的SUMO-WWP1蛋白经16℃IPTG诱导表达18h。含MUC1-CD或-AQA蛋白的GST-beads与重组的WWP1蛋白在4℃孵育12h，然后用NETN150缓冲液洗涤5次，对复合蛋白进行免疫印迹分析。
10、实时荧光定量PCR
使用Trizol试剂(Invitrogen，CA，Carlsbad)按照说明书抽提细胞的总RNA，采用M-MLV逆转录酶合成试剂盒(Promega Madison，WI，USA)将其反转录成cDNA。使用SYBRGreen PCR Master mix kit(Applied Biosystems，Warrington，UK)，通过比较各个基因的Ct值，对细胞内的各个基因的mRNA的相对水平进行比较分析。
11、免疫荧光实验
将细胞种在无菌圆片上，经过相应的处理后取出。用PBS洗涤后，用多聚甲醛固定10分钟，用Triton X-100透膜处理10分钟，用5％山羊血清(Gibco，Grand Island，NY，USA)在室温下封闭1h。加入相应的一抗于5％山羊血清中，在4℃下孵育过夜。将细胞在PBS中洗涤3次，加入相应的荧光二抗于5％山羊血清中，在37℃孵育2小时。PBS冲洗三次后，用DAPI(Sigma，Saint Louis，MO，USA)将圆片覆盖在载玻片上，进行封片处理后，用共聚焦显微镜观察并拍摄。
12、细胞增殖曲线
将细胞种入96孔板中，使用cell counting kit 8(CCK8)检测细胞活力。将96孔板中的完全培养基吸弃，加入100μl含有CCK8试剂(1:10)的完全培养基，37℃孵育2h后，每天同一时间用Multiscan Spectrum酶标仪测定450nm处的吸光度。通过分析计算OD值间接反映活细胞数量和细胞活力。
13、克隆形成实验
将BT549细胞(1000个/孔)种于6孔板中。培养基每3天更换一次，9天后形成肉眼可见的克隆时停止培养。去掉培养基，PBS洗涤后，用甲醇固定15分钟，结晶紫染色20分钟，拍照。
14、成球实验
将细胞经过消化，离心后用PBS洗两遍去掉含有血清的培养基，计数后将相同细胞数的细胞种于DMEM/F12无血清培养基(含0.4％BSA，20ng/ml EGF，20ng/ml bFGF，50μg/ml胰岛素，1×B27)中，在超低吸附培养板(Corning，NY)中培养5-7天，计数每孔的成球数(Sphere数，直径>50μm)。收集所有细胞，用Triple Express(Gibco，Grand Island，NY，USA)消化，PBS洗2次后计数。将相同数目的细胞种于低吸附培养板中培养2周，以分析其二次成球能力。
15、划痕实验
待细胞达到100％汇合度后，用200μl的枪头在细胞中划一条直线。弃去培养基，用PBS洗涤3次，去除漂浮的细胞，然后加入无血清培养基。在10倍显微镜下拍摄0和48小时同一视野细胞迁移的照片。细胞迁移率＝(0h宽度-48h宽度)/0h宽度x100％。结果通过3次独立实验进行定量。
16、侵袭实验
将Transwell小室置于24孔板上，下腔加入含600μl含10％FBS的完全培养基。将细胞(2×104个/孔)加入含200ul无血清培养基的上室中，37℃，5％CO2培养24h。用棉签轻拭擦去上室的细胞，对下室的细胞用甲醇固定，用结晶紫染色。在10倍显微镜下不同视野拍照，计数迁移细胞数量并进行统计分析。
17、裸鼠荷瘤实验
将MDA-MB-468细胞(5×106/100ul PBS)皮下注射到6周龄BALB/c雌性裸鼠右侧。当肿瘤大小达到4mm×4mm时，将小鼠随机分为两组，以0.25mg/kg剂量的硼替佐米对小鼠腹腔注射，每周2次，连续2周，对照组给予等体积的PBS。每3天用游标卡尺监测肿瘤大小，并记录小鼠体重。体积计算公式为：V＝(长×宽2)/2。治疗结束后，小鼠被安乐死，肿瘤被分离并称重，进行免疫组织化学染色或免疫印迹研究。
18、乳腺癌临床样本的免疫组化染色实验
样本来自2010年10月至2015年5月行乳腺癌手术的乳腺癌患者，经中南大学湘雅医院知情同意，术后病理证实。石蜡切片脱蜡水化，然后用3％过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性。将小鼠抗人单克隆WWP1一抗(Abnova，America)1:2000稀释，兔抗人单克隆MUC1一抗(CST，America)1:2000稀释后，4℃孵育过夜。室温孵育1h相应的辣根过氧化物酶标记的二抗，用DAB显色，用苏木精复染后用树脂封片。根据阳性细胞比例(0:≤5％，1:<25％，2:<50％，3:<75％，4:≥75％)和染色强度(0:阴性，1:弱，2:中，3:强)，对样本中MUC1和WWP1的免疫组化结果进行打分，评分范围为0-12。
19、统计学分析
实施例中所有数据采用Graphpad Prism 6.0进行统计学分析和作图，数据使用means±SD表示，实验中数据均重复3次。组间比较采用unpaired Student’s t-test，以P值标注，NS代表无统计学差异；*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001；****表示P<0.0001。
实施例1、WWP1通过溶酶体途径降解MUC1
本发明人发现，WWP1是参与调控MUC1的E3泛素连接酶。本发明人在高表达MUC1而低表达WWP1的乳腺癌细胞系MDA-MB-468、T47D，以及肝癌细胞系Bel-7402中进行WWP1过表达。结果发现，过表达WWP1导致MUC1的表达水平下降(图1A-B)。
本发明人利用shWWP1-#1、shWWP1-#2，在低表达MUC1而高表达WWP1的乳腺癌细胞系BT549和SKBR3，以及非小细胞肺癌细胞系NCI-H197中对WWP1进行沉默。结果发现，沉默WWP1导致MUC1的表达升高(图1A-B)。
接下来，本发明人在HEK293T中对WWP1调控MUC1蛋白的降解机制进行研究。结果发现，瞬转浓度梯度的WWP1导致MUC1呈剂量依赖性的下降(图1C)。
利用CHX阻滞蛋白质合成。结果发现，WWP1过表达的情况下MUC1的半衰期明显缩短(图1D)。
所述结果说明，WWP1可以在蛋白水平上调控MUC1的降解。为了探究WWP1调控的MUC1降解究竟通过何种途径，本发明人在HEK293T中瞬转MUC1和WWP1，用溶酶体途径抑制剂CQ，以及蛋白酶体途径抑制剂MG132。结果发现，CQ可以明显阻断WWP1对MUC1的降解(图1E)。在肿瘤细胞系MDA-MB-468和Bel-7402中转入WWP1，检测内源性的MUC1，本发明人发现WWP1降解内源性MUC1也通过溶酶体途径(图1E)。
免疫荧光实验结果显示，MUC1与溶酶体标记物LAMP2共定位在WWP1表达时增加(图1F)。
WWP1的E3泛素连接酶活性有赖于其HECT结构域上C890位点，通过构建WWP1-C890A突变质粒，本发明人在HEK293T中转染了MUC1和WWP1及WWP1-C890A，发现WT可以调控MUC1蛋白的降解，而C890A突变体不能降解MUC1(图1G)，说明WWP1降解MUC1依赖其E3泛素连接酶活性。
上述结果说明，WWP1调控MUC1的降解，且其通过溶酶体途径发挥降解作用。
实施例2、WWP1通过降解MUC1抑制肿瘤的恶性转化
为了进一步探究WWP1调控MUC1降解具有何种生物学功能，本发明人通过CCK8试剂盒检测MDA-MB-468/CTL和MDA-MB-468/WWP1细胞的增殖能力。结果发现，MDA-MB-468/WWP1细胞的增殖能力与对照组相比明显下降(图2A)。这一结果在Bel-7402/CTL和Bel-7402/WWP1细胞株中进一步得到了证实(图2C)，说明过表达WWP1抑制肿瘤细胞的增殖能力。
进一步发现，沉默WWP1后，与对照组相比，MDA-MB-468/shWWP1细胞的增殖能力明显增强(图2B)。这一结果在NCI-H1975沉默WWP1细胞株中进一步得到证实(图2D)，说明沉默WWP1促进肿瘤细胞的增殖能力。
由于癌蛋白MUC1可以促进肿瘤的恶性特征，为了证明沉默WWP1后细胞的增殖能力增强是由于MUC1的累积引起的，本发明人在BT549/shWWP1细胞株中，利用CRISPR Cas9技术，对MUC1进行敲除(图2E左)。通过检测细胞的增殖能力。结果发现，与对照组相比，BT549/shWWP1细胞的增殖能力明显增强，进一步敲除MUC1导致细胞增殖减少(图2E右)。本发明人通过平板克隆实验检测上述细胞的克隆形成能力，也得到了一致的结论(图2F)。这一结果提示，WWP1通过靶向MUC1抑制肿瘤细胞的增殖能力。
为了检测WWP1是否能通过靶向MUC1抑制肿瘤细胞的迁移能力，本发明人进行Transwell实验。结果发现，与对照组相比，沉默WWP1的肿瘤细胞迁移能力明显增强，进一步敲除MUC1后明显抑制肿瘤细胞的迁移(图2G)。通过划痕实验得到了一致的结论(图2H)。
为了检测WWP1是否通过靶向MUC1抑制肿瘤细胞的干性，本发明人通过成球实验发现，与对照组相比，沉默WWP1的肿瘤细胞成球能力明显增强，进一步敲除MUC1后，明显抑制肿瘤细胞的成球能力(图2I)。
所述结果说明，WWP1通过降解MUC1抑制肿瘤细胞的恶性特征。
实施例3、WWP1不能降解MUC1-AQA和MUC1-K1231R突变体
本发明人在HEK293T中瞬时转染MUC1-HA，用Vector-HA作为对照，对细胞进行免疫共沉淀(co-IP)，证实了MUC1-HA与HEK293T细胞内源性WWP1之间的相互作用(图3A左)。并且，本发明人在BT549细胞中利用co-IP实验证明，内源性MUC1与WWP1相互作用(图3A右)。
本发明人推测MUC1-CQC(MUC1氨基酸序列的第1184-1186位)可能是MUC1与WWP1相互作用的基序，在GFP-CD的基础上对CQC位点突变为AQA，通过co-IP实验发现，GFP-AQA与WWP1的相互作用消失(图3B)。通过体外纯化GST-CD、GST-AQA和WWP1，GST-pull down实验进一步证实GST-AQA突变体无法与WWP1相互作用(图3C)。
这些结果说明，MUC1-CQC是MUC1与WWP1相互作用的位点。且本发明人的前期实验证明MUC1-K1231位点为WWP1泛素化的主要接受位点，为了进一步证实WWP1通过靶向MUC1使其泛素化而抑制细胞生长的模型，本发明人在MDA-MB-468/gMUC1细胞中重新表达了MUC1-WT或AQA和K1231R突变体，结果发现，回转MUC1-WT后仍能被WWP1所降解，而如果回转MUC1-AQA和MUC1-K1231R突变体，则不能被WWP1降解(图3D)。进一步地，本发明人推测阻断其相互作用位点或泛素化位点后，这些MUC1突变体的功能则不受WWP1所调控了。通过细胞增殖实验发现，与gCTL组相比，gMUC1组的细胞增殖速率明显下降。而回转MUC1-WT后可以明显促进细胞的增殖，但这一增殖可以被WWP1所抑制；回转MUC1-K1231R突变体的细胞增殖速率加快且不能被WWP1抑制；与MUC1-WT和MUC1-K1231R相反，MUC1-AQA未能修复细胞增殖缺陷(图3E)。此外，本发明人通过成球实验得到的结果与细胞增殖实验结果一致(图3F)。
这些结果共同支持了WWP1通过促进MUC1的泛素化和降解来抑制肿瘤细胞的生长和成球能力。
实施例4、蛋白酶体途径抑制剂促进WWP1降解MUC1
本发明人首次发现WWP1通过溶酶体途径引导MUC1降解。本发明人推测蛋白酶体抑制剂可能通过激活自噬，同时阻碍WWP1通过蛋白酶体途径降解其他底物，增强WWP1介导的MUC1溶酶体降解。利用乳腺癌细胞株MDA-MB-468，使用蛋白酶体途径抑制剂伊沙佐米(ixazomib)、卡非佐米(carfilzomib)、硼替佐米(bortezomib，BTZ)，以及自噬溶酶体途径抑制剂MHY1485(mTOR的激活剂)和HCQ，分别处理细胞并检测自噬水平和MUC1蛋白水平(图4A)。结果发现，三种蛋白酶体途径抑制剂均能明显下调MUC1的蛋白水平明显，且LC3-II/I的比例也较DMSO组有所上升，说明通过应用蛋白酶体途径抑制剂，可激活自噬进而降解MUC1。
本发明人利用BT549沉默WWP1细胞株，探究BTZ降解MUC1与WWP1的关系。结果发现，在对照组中，BTZ处理使得LC3-II/I呈剂量依赖性的上升，此时MUC1也显著下调，而在沉默WWP1后，即使用BTZ处理，MUC1的水平并未有明显变化，结果提示BTZ降解MUC1这一现象有赖于WWP1的存在(图4B)，不仅是BTZ，本发明人使用另外一种蛋白酶体途径抑制剂ixazomib得到了一致的结论(图4C)。
本发明人进一步在T47D中稳转WWP1发现下调MUC1蛋白水平的下调，BTZ处理T47D/WWP1后进一步下调MUC1(图4D)，说明在WWP1过表达时进一步使用BTZ可显著抑制MUC1的表达。
本发明人在MDA-MB-468/gCTL和MDA-MB-468/gMUC1稳转株中，使用了更低剂量的BTZ(2nM)。结果发现，MDA-MB-468/gCTL组用低剂量的BTZ处理后MUC1的蛋白水平无明显变化，但在过表达WWP1后，同样剂量的BTZ可显著下调MUC1。
此外，本发明人也检测了自噬的水平，发现低剂量的BTZ处理细胞时，仍旧可以激活自噬，进而促进WWP1对MUC1的降解(图4E)。
通过增殖实验和成球实验发现，在MUC1和WWP1双阳性的肿瘤细胞中，使用BTZ可明显抑制细胞的增殖能力(图4F)和成球能力(图4G)。
这些结果证实，蛋白酶体途径抑制剂可以促进WWP1降解MUC1，应用BTZ可有效抑制WWP1/MUC1阳性肿瘤细胞的生长和肿瘤起始/干细胞的自我更新。
实施例5、Bortezomib有效抑制WWP1/MUC1阳性移植瘤生长
为了进一步研究BTZ靶向抑制WWP1/MUC1阳性肿瘤生长中的作用，本发明人分别将MDA-MB-468/gCTL和MDA-MB-468/gMUC1细胞扩增，并分别过表达vector或WWP1，进行裸鼠皮下成瘤实验。待肿瘤大小达到4mm×4mm时，将小鼠随机分为两组，给予0.25mg/kg剂量的BTZ治疗小鼠，对照组给予等体积的PBS，每周给药2次，监测小鼠肿瘤体积。由于MDA-MB-468/gMUC1+Vector和MDA-MB-468/gMUC1+WWP1组的肿瘤生长速度明显减弱，达不到可以给药的标准，因此只针对MDA-MB-468/gCTL+Vector和MDA-MB-468/gCTL+WWP1组小鼠给予BTZ治疗实验，给药两周后停药并继续观察，监测肿瘤的体积并绘制生长曲线。结果发现，与MDA-MB-468/gCTL+Vector相比，MDA-MB-468/gCTL+WWP1组肿瘤生长较慢；给予BTZ治疗后，MDA-MB-468/gCTL+Vector肿瘤体积显著下降(图5A-5B)；MDA-MB-468/gCTL+WWP1给予BTZ治疗两周后，小鼠肿瘤体积明显缩小，有两只小鼠的肿瘤消失；而MDA-MB-468/gMUC1+Vector和MDA-MB-468/gMUC1+WWP1组的各五只小鼠中，均只有三只发肿瘤，且肿瘤生长呈缓慢的趋势，两组的肿瘤体积无明显差异。该结果提示，过表达WWP1有效抑制MUC1阳性移植瘤生长，BTZ有效抑制WWP1/MUC1阳性移植瘤生长(图5A-5B)。本发明人对肿瘤分离后称重，得到了一致的结论(图5C)。
过表达WWP1或BTZ处理对小鼠的体重影响不大，仅在MDA-MB-468/gCTL+WWP1+BTZ组中体重略有减轻(图5D)。
本发明人通过免疫组化染色检测每组移植瘤中MUC1和WWP1的表达，结果显示在MDA-MB-468/gCTL+Vector给予PBS组MUC1的蛋白水平最高；不论BTZ处理和WWP1过表达均可降低MUC1的蛋白水平；二者联用对MUC1水平的抑制效果最明显(图5E)。
这些基于移植瘤的实验结果与前面细胞实验结论一致，即MUC1阳性的肿瘤其生长速度明显快于MUC1阴性的肿瘤；BTZ可通过抑制MUC1的表达有效抑制WWP1/MUC1阳性移植瘤生长，揭示了一种针对MUC1癌蛋白的新治疗策略。
实施例6、在乳腺癌患者组织中MUC1与WWP1呈负相关
为了进一步验证MUC1与WWP1在蛋白水平的相关性，本发明人收集了108例乳腺癌病人样本，通过免疫组化染色(IHC)检测样本中的MUC1和WWP1的表达，分析发现MUC1与WWP1在乳腺癌病人中呈明显的负相关(图6A-6B)。
将乳腺癌病人分型，发现MUC1与WWP1在乳腺癌各个亚型中均呈明显的负相关(图6C-6F)。
这些结果表明，在肿瘤组织中MUC1与WWP1的表达呈负相关。
实施例7、筛选方法
细胞：重组表达WWP1和MUC1的293T细胞。
测试组：培养所述重组表达WWP1和MUC1的293T细胞，给予候选物质；
对照组：培养所述重组表达WWP1和MUC1的293T细胞，不给予候选物质。
分别检测测试组和对照组中WWP1和MUC1的相互作用情况，特别是WWP1对于MUC1的泛素化降解情况，并进行比较。如果测试组中WWP1和MUC1的相互作用显著强于对照组，WWP1对于MUC1的泛素化降解显著高于对照组，就表明该候选物是抑制肿瘤的潜在物质。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海交通大学医学院
<120> WWP1通过溶酶体途径降解癌蛋白MUC1抑制肿瘤及其应用
<130> 213078
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 922
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ala Thr Ala Ser Pro Arg Ser Asp Thr Ser Asn Asn His Ser Gly
1 5 10 15
Arg Leu Gln Leu Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Leu Lys Arg Lys
20 25 30
Lys Asn Trp Phe Gly Thr Ala Ile Tyr Thr Glu Val Val Val Asp Gly
35 40 45
Glu Ile Thr Lys Thr Ala Lys Ser Ser Ser Ser Ser Asn Pro Lys Trp
50 55 60
Asp Glu Gln Leu Thr Val Asn Val Thr Pro Gln Thr Thr Leu Glu Phe
65 70 75 80
Gln Val Trp Ser His Arg Thr Leu Lys Ala Asp Ala Leu Leu Gly Lys
85 90 95
Ala Thr Ile Asp Leu Lys Gln Ala Leu Leu Ile His Asn Arg Lys Leu
100 105 110
Glu Arg Val Lys Glu Gln Leu Lys Leu Ser Leu Glu Asn Lys Asn Gly
115 120 125
Ile Ala Gln Thr Gly Glu Leu Thr Val Val Leu Asp Gly Leu Val Ile
130 135 140
Glu Gln Glu Asn Ile Thr Asn Cys Ser Ser Ser Pro Thr Ile Glu Ile
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Thr Thr Ala Arg Leu Ala Val Glu Gly Thr Asn Gly Ile Asp Asn His
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195 200 205
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210 215 220
Lys Asn Thr Pro Ala Pro Lys Pro Leu Ala Ser Glu Pro Ala Asp Asp
225 230 235 240
Thr Val Asn Gly Glu Ser Ser Ser Phe Ala Pro Thr Asp Asn Ala Ser
245 250 255
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Ser Ser Glu Asn Asn Glu Cys Ile Pro Ser Thr Ser Ala Glu Leu Glu
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Ser Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ser Arg Gln Pro Asp Gly Cys Met
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Thr Thr Gln Trp Glu Asp Pro Arg Thr Gln Gly Leu Gln Asn Glu Glu
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<211> 1200
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
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85 90 95
Asp Val Thr Ser Val Pro Val Thr Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Thr
100 105 110
Pro Pro Ala His Asp Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Lys Pro Ala Pro
115 120 125
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr
130 135 140
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser
145 150 155 160
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His
165 170 175
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
180 185 190
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro
195 200 205
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr
210 215 220
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser
225 230 235 240
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His
245 250 255
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
260 265 270
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro
275 280 285
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr
290 295 300
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser
305 310 315 320
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325 330 335
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
340 345 350
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro
355 360 365
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405 410 415
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Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro
515 520 525
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr
530 535 540
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Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro
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645 650 655
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
660 665 670
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675 680 685
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705 710 715 720
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Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
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Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro
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Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr
770 775 780
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser
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Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro
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Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr
850 855 860
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Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His
885 890 895
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
900 905 910
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro
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Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val Thr Ser
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Ala Ser Gly Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ser Thr Leu Val His Asn Gly
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Thr Ser Ala Arg Ala Thr Thr Thr Pro Ala Ser Lys Ser Thr Pro Phe
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Ser Ile Pro Ser His His Ser Asp Thr Pro Thr Thr Leu Ala Ser His
995 1000 1005
Ser Thr Lys Thr Asp Ala Ser Ser Thr His His Ser Ser Val Pro Pro
1010 1015 1020
Leu Thr Ser Ser Asn His Ser Thr Ser Pro Gln Leu Ser Thr Gly Val
1025 1030 1035 1040
Ser Phe Phe Phe Leu Ser Phe His Ile Ser Asn Leu Gln Phe Asn Ser
1045 1050 1055
Ser Leu Glu Asp Pro Ser Thr Asp Tyr Tyr Gln Glu Leu Gln Arg Asp
1060 1065 1070
Ile Ser Glu Met Phe Leu Gln Ile Tyr Lys Gln Gly Gly Phe Leu Gly
1075 1080 1085
Leu Ser Asn Ile Lys Phe Arg Pro Gly Ser Val Val Val Gln Leu Thr
1090 1095 1100
Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln
1105 1110 1115 1120
Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile
1125 1130 1135
Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser
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Gly Ala Gly Val Pro Gly Trp Gly Ile Ala Leu Leu Val Leu Val Cys
1155 1160 1165
Val Leu Val Ala Leu Ala Ile Val Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Val Cys
1170 1175 1180
Gln Cys Arg Arg Lys Asn Tyr Gly Gln Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg
1185 1190 1195 1200
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> shRNA
<400> 3
ctcgcttggg cgagagtaa 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> shRNA
<400> 4
aggtactttg ttgatcata 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> shRNA
<400> 5
acaagaacaa caacattca 19

Claims (10)

1.MUC1下调剂在制备抑制肿瘤的组合物中的应用；其中，所述MUC1下调剂包括选自下组：
(a)蛋白酶体途径抑制剂，及WWP1或其上调剂的组合；
(b)WWP1或其上调剂。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为MUC1阳性的肿瘤；较佳地，所述肿瘤为MUC1阳性的实体瘤；更佳地，所述肿瘤包括：乳腺癌，肝癌，肺癌，前列腺癌，甲状腺癌，结肠癌，指宫颈癌，卵巢癌，胃癌，胰腺癌。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白酶体途径抑制剂为蛋白酶体20S催化核心的抑制剂；较佳地，包括：硼替佐米，伊沙佐米，卡非佐米，奥泼佐米，马利佐米，达拉唑米；或
所述WWP1上调剂包括选自下组：(a)增强WWP1活性的物质；(b)增强WWP1的表达、稳定性或有效作用时间的物质；较佳地，所述WWP1上调剂包括选自：重组表达WWP1的表达构建物，增强WWP1对MUC1的泛素化和降解作用的多肽或化合物，WWP1的化学上调剂，促进WWP1基因启动子驱动能力的上调剂，WWP1基因特异性microRNA的下调剂。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抑制肿瘤包括：抑制肿瘤细胞的恶性特征，抑制肿瘤细胞的增殖能力，抑制肿瘤细胞的迁移/转移，抑制肿瘤细胞的生长和成球能力，抑制肿瘤细胞的生长和肿瘤起始/干细胞的自我更新；或
所述WWP1或其上调剂通过溶酶体途径降解MUC1，从而抑制肿瘤；或
所述WWP1通过促进MUC1的泛素化和降解来抑制肿瘤；或
所述蛋白酶体途径抑制剂促进WWP1降解MUC1。
5.一种用于抑制肿瘤的组合物，其特征在于，其包括：蛋白酶体途径抑制剂，以及WWP1或其上调剂。
6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述蛋白酶体途径抑制剂为蛋白酶体20S催化核心的抑制剂；较佳地包括：硼替佐米，伊沙佐米，卡非佐米，奥泼佐米，马利佐米，达拉唑米；或
所述WWP1上调剂包括选自下组：(a)增强WWP1活性的物质；(b)增强WWP1的表达、稳定性或有效作用时间的物质；较佳地，所述WWP1上调剂包括选自：重组表达WWP1的表达构建物，增强WWP1对MUC1的泛素化和降解作用的多肽或化合物，WWP1的化学上调剂，促进WWP1基因启动子驱动能力的上调剂，WWP1基因特异性microRNA的下调剂。
7.WWP1与MUC1相互作用的复合体应用，用于作为筛选抑制肿瘤的药物或化合物的靶标，筛选或制备抑制肿瘤的药物。
8.一种筛选抑制肿瘤的潜在物质的方法，包括：
(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达WWP1与MUC1相互作用的复合体；和
(2)检测所述体系中WWP1与MUC1相互作用的情况；若所述候选物质在统计学上促进WWP1对MUC1的泛素化和降解，则该候选物质是抑制肿瘤的潜在物质。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到所述表达体系中；和/或
步骤(2)包括：检测所述体系中WWP1与MUC1相互作用情况；并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达体系；若所述候选物质在统计学上WWP1对MUC1的泛素化和降解，则该候选物质是抑制肿瘤的潜在物质。
10.特异性识别或扩增WWP1和MUC1的试剂的用途，用于制备诊断或预后肿瘤的诊断试剂或诊断试剂盒；所述肿瘤为MUC1阳性的肿瘤，较佳地为MUC1阳性的实体瘤；
较佳地，在诊断或预后时，利用所述试剂进行分析：
若WWP1低表达或正常表达、且MUC1高表达，则适于以MUC1下调剂治疗，所述MUC1下调剂包括：(a)蛋白酶体途径抑制剂，及WWP1或其上调剂的组合；或(b)WWP1或其上调剂。
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