KR101419999B1 - Ａｋｔ 음성 조절제로서의 Ｈａｄｅｓ의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Akt 음성 조절제로서의 Hades의 용도에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 Hades 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 Akt (단백질 키나아제 B) 음성(negative) 조절제 또는 항암제에 관한 것이다. 세린/트레오닌 키나아제인 Akt 는 세포 증식(proliferation), 생존(survival) 및 종양(tumor) 발달을 포함한 다양한 세포 프로세스들에서 기능한다. 본 발명자들은 RING 핑거 도메인 및 E3 유비퀴틴 리가아제 활성을 갖는, Akt 의 음성 조절인자인 Hades를 동정하였다.
본 발명에 따르면, Akt 는 Hades와 직접적으로 상호작용하여, Hades에 의해 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo)에서 유비퀴틴화된다. 따라서, 본 발명에 따른 Hades는 Akt를 분해하고 그 다운스티림 시그날링을 음성 조절함으로써 암세포의 증식 및 생존을 억제할 수 있으므로, 항암제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

Ａｋｔ 음성 조절제로서의 Ｈａｄｅｓ의 용도 {Use of Hades as a negative regulator of Akt}

본 발명은 Akt 음성 조절제로서의 Hades의 용도에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 Hades 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 Akt (단백질 키나아제 B) 음성(negative) 조절제 또는 항암제에 관한 것이다.

세린/트레오닌 키나아제인 Akt (단백질 키나아제 B)는 성장인자 및 인슐린과 같은 필수적인 세포 자극에 대한 응답에 관여한다 [1, 2]. Akt 활성화는 세포 증식(proliferation), 단백질 합성, 세포 성장, 세포 사이클 진행 및 아팝토시스(apoptosis)의 억제를 포함하는 다양한 생물학적 응답을 조절한다 [3]. Akt 는 혈소판-유래 성장인자, 인슐린, 표피성장인자, 염기성 섬유아세포 성장인자, 및 인슐린-유사 성장인자I를 통해 활성화된다 [2, 4, 5]. Akt 의 다운스트림 기질은 세포 및 분자 레벨에서 동정되었다. Akt 의 처음 동정된 기질인 글리코겐 신테이즈 키나아제 3 (GSK3)은 Akt 에 의해 직접 인산화를 통해 음성적으로 조절된다 [6]. Akt 가 GSK3 (특히 GSK3β) 활성을 저해하면, β-카테닌 안정화, 핵 위치화 및 유전자 활성화를 유도하게 된다 [7-9].

Akt 활성화의 여러가지 조절인자들이 동정되었으며, Akt 조절 시그날링 패스웨이에 대한 중요한 정보를 제공하였다. 포스파티딜리노시톨 3-키나아제 (PI3K) 및 포스파타제 및 텐신 호모로그 (PTEN)는 Akt 의 조절인자들이다 [10]. PI3K 는 Akt 인산화/활성화를 유도하는 반면, PTEN는 PI3K에 의해 포스파티딜리노시톨-4,5-비스포스페이트로부터 생성되는 포스파티딜리노시톨-3,4,5-트리포스페이트의 탈인산화를 통해 Akt 활성화를 저해한다 [2, 4, 11]. C1 도메인-함유 포스파타제 및 텐신 호모로그, 카르복시-말단 조절 단백질, Trb3, 및 Keratin K10과 같은 음성 조절인자들도 Akt 를 불활성화시킨다고 보고되었다 [12-15].

유비퀴틴-프로테아좀 시스템 (UPS)의 단백질분해 활성은 많은 세포 프로세스들에서 중요하다 [16]. 26S 프로테아좀에 의해 인식되어 파괴되는 폴리유비퀴틴-단백질 콘쥬게이트의 형성은 유비퀴틴 전달 반응의 케스케이드에 참여하는 3가지 성분들이 관여한다: 유비퀴틴-활성화 효소 (E1), 유비퀴틴-콘쥬게이팅 효소 (E2), 및 유비퀴틴 리가아제라고 불리우는 특이성 인자 (E3). E3 리가아제는 표적 단백질 선택의 특이성을 제어하며, 개별 표적 단백질들의 과다(abundance)를 제어한다 [16]. 비록 Akt 유비퀴틴화(ubiquitination)의 분자 패스웨이 및 생리학적 역할이 최근 연구되었지만 [17-22], Akt 유비퀴틴화에 대한 대부분은 불명확하게 남아 있었다.

여기서, 본 발명자들은 Hades를 Akt 의 새로운 E3 리가아제로서 동정하였다. 즉, 본 발명자들은 세포 증식(proliferation), 생존(survival) 및 종양(tumor) 발달을 포함한 다양한 세포 프로세스들에서 기능하는 Akt의 새로운 음성 조절인자로서 Hades를 동정하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 Akt 음성 조절제로서의 Hades의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 Hades 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 Akt 음성 조절제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 Hades 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 항암제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 Akt와 Hades의 상호작용을 이용한 Akt 음성 또는 양성 조절제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 Hades 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 Akt (단백질 키나아제 B) 음성(negative) 조절제를 제공한다.

상기 Hades 단백질은 Akt와 상호작용할 수 있는 cDNA 라이브러리 단백질들 중에서 동정한 것으로서 그리스 신하에서 이름을 따와 명명한 것이다. Hades 단백질은 UniProtKB accession number Q969V5로 기탁되어 있으며, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가진다. 상기 Akt (단백질 키나아제 B)는 세린/트레오닌 키나아제로서 세포 증식(proliferation), 세포 성장, 세포 사이클 진행 및 아팝토시스(apoptosis)의 억제를 포함하는 다양한 생물학적 프로세스에 관여하는 것으로 알려져 있다. 특히, Akt1은 아팝토시스를 억제함으로써 세포 생존 패스웨이에 관여한다고 알려져 있으며, Akt2는 인슐린 시그날링 패스웨이에서 중요한 시그날링 분자로서 알려져 있다. 본 발명의 Hades는 Akt1 및 Akt2 둘다에 효과적으로 상호작용하는 것이 확인되었다. 여기서, 음성(negative) 조절제란 상기 Akt 의 발현을 억제하거나 상기 Akt의 다운스트림 시그날링 패스웨이를 저해하는 조절인자를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 Hades를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 어떤 염기서열도 가질 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 Akt (단백질 키나아제 B) 음성(negative) 조절제를 제공한다.

본 명세서에 사용된 용어, "유전자"는 단백질 또는 폴리펩타이드를 생산하는데 필요한 코딩 서열을 포함하는 핵산 (예: DNA, RNA) 서열을 언급한다. 단백질 또는 폴리펩타이드는 완전한 길이의 코딩 서열에 의해 코딩되거나, 목적하는 활성 또는 기능적 특성이 유지되는 한, 코딩 서열의 일부분에 의해 코딩될 수 있다. 또한, 상기 용어는 구조 유전자의 코딩 영역 및 상기 유전자가 완전-길이의 mRNA의 길이에 상응하도록 말단에서 약 1 kb 이상의 거리로 5' 및 3' 말단의 코딩 영역에 인접하게 위치된 서열을 포함한다. 코딩 영역의 5'에 위치되고 mRNA에 존재하는 서열을 5'-비해독 서열로 언급한다. 코딩 영역의 3' 또는 아래에 위치되고 mRNA에 존재하는 서열을 3'-비해독 서열로 언급한다. 용어 "유전자"는 유전자의 cDNA와 게놈 형태 모두를 포함한다. 게놈 형태 또는 유전자의 클론은 "인트론" 또는 "삽입 영역" 또는 "삽입 서열"로 불리는 비-코딩 서열에 의해 방해되는 코딩 영역을 포함한다. 인트론은 핵 RNA (hnRNA)로 전사되는 유전자의 절편이다; 인트론은 조절 요소, 예를 들어 인핸서를 포함할 수 있다. 인트론은 핵 또는 초기 전사물로부터 제거되거나 "스플라이싱"된다; 따라서, 인트론은 mRN 전사물에는 존재하지 않는다. mRNA는 해독 동안 기능은 초기 폴리펩타이드의 아미노산의 서열 또는 순서를 특정하는 기능을 한다.

유전자 발현은 유전자에 코딩된 유전적 정보를 유전자의 (예를 들어, RNA 폴리머라제의 효소적 작용에 의한) 전사를 통해 RNA (예: mRNA rRNA, tRNA 또는 snRNA)로 전환시키고, 단백질 코딩 유전자에 대해, mRNA의 "해독"을 통해 단백질로 전환시키는 과정을 언급한다. 유전자 발현은 과정 중의 많은 단계에서 조절될 수 있다; "상향-조절" 또는 "활성화는 유전자 발현 산물의 생성을 증가시키는 조절을 언급하며, "하향-조절" 또는 "억제"는 산물을 감소시키는 조절을 언급한다. 상향-조절 또는 하향-조절에 관련되는 분자 (예: 전사 인자)를 종종 각각 "활성화제" 및 "억제제"라 부른다. 인트론을 포함하는 것에 추가하여, 유전자의 게놈 형태는 또한 RNA 전사물에 존재하는 서열의 5' 및 3' 말단 모두에 위치된 서열을 포함할 수 있다. 이들 서열은 "플랭킹 (flanking)" 서열 또는 영역이라 언급된다 (이들 플랭킹 서열은 RNA 전사물에 존재하는 비-해독 서열에 대해 5' 또는 3'로 위치된다). 5' 플랭킹 영역은 조절 서열, 예를 들어 유전자의 전사를 조절하거나 영향을 주는 프로모터 및 인핸서를 포함할 수 있다. 3' 플랭킹 영역은 전사의 종결, 전사후 절단 및 폴리아데닐화를 지시하는 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 Hades 유전자는 재조합 발현벡터에 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 Akt (단백질 키나아제 B) 음성(negative) 조절제를 제공한다. 이 경우 상기 Hades 유전자는 재조합 발현 벡터의 조절요소들과 작동가능하게 연결되어 삽입되어 있다.

본 명세서에 사용된 용어, "벡터"는 하나의 세포로부터 또 다른 세포로 DNA 절편을 전달하는 핵산 분자에 대해 사용된다. 벡터는 종종 플라스미드, 박테리오파아지 또는 식물 또는 동물 바이러스로부터 유래된다.

본 명세서에 사용된 용어, "발현 벡터"는 목적하는 코딩 서열 및 특정 숙주 유기체에서 작동적으로 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 적합한 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA를 언급한다. 원핵세포에서의 발현에 필요한 핵산 서열은 일반적으로, 다른 서열과 함께, 프로모터, 오퍼레이터 (임의), 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 인핸서, 및 종결 및 폴리아데닐화 시그널을 이용하는 것으로 공지되어 있다.

본 명세서에 사용된 용어, "재조합 발현 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질, 본 발명에서는 Hades 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

상기 본 명세서에서 사용된 용어, "작동가능하게 연결된 (operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

적합한 발현벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 등을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다.

본 발명에 있어서, 상기 Hades는 RING 핑거-도메인을 가지고 E3-유비퀴틴 리가아제(ligase) 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 Akt (단백질 키나아제 B) 음성(negative) 조절제를 제공한다. 본 발명의 실시예에서는 상기 Hades가 RING 핑거-도메인을 가지고 E3-유비퀴틴 리가아제(ligase) 활성을 갖는다는 것을 증명하였다.

본 발명에 있어서, 상기 Akt는 Hades와 직접 상호작용하고 Hades에 의해 유비퀴틴화(ubiquitinate)되는 것을 특징으로 하는 Akt (단백질 키나아제 B) 음성(negative) 조절제를 제공한다. 본 발명의 실시예에서는 상기 Akt가 Hades와 직접 상호작용하고 Hades에 의해 유비퀴틴화(ubiquitinate)된다는 것을 증명하였다.

본 발명에 있어서, 상기 Akt의 키나아제 도메인(KD)이 Hades와 주로 연합하여 상호작용하는 것을 특징으로 하는 Akt (단백질 키나아제 B) 음성(negative) 조절제를 제공한다. 본 발명의 실시예에서는 상기 Akt의 키나아제 도메인(KD)이 Hades와 주로 연합하여 상호작용한다는 것을 증명하였다.

본 발명에 있어서, 상기 Hades에 의한 유비퀴틴화에 의해 Akt가 분해되어 Akt의 발현이 억제되는 것을 특징으로 하는 Akt (단백질 키나아제 B) 음성(negative) 조절제를 제공한다. 본 발명의 실시예에서는 상기 Hades에 의한 유비퀴틴화에 의해 Akt가 분해되어 Akt의 발현이 억제된다는 것을 증명하였다.

본 발명에 있어서, 상기 Hades는 인산화(phosphorylation)에 의해 활성화된 Akt만을 특이적으로 유비퀴틴화하는 것을 특징으로 하는 Akt (단백질 키나아제 B) 음성(negative) 조절제를 제공한다. 본 발명의 실시예에서는 상기 Hades가 인산화(phosphorylation)에 의해 활성화된 Akt만을 특이적으로 유비퀴틴화한다는 것을 증명하였다.

본 발명에 있어서, 상기 Akt의 라이신 284가 Hades에 의한 유비퀴틴화의 주요 부위인 것을 특징으로 하는 Akt (단백질 키나아제 B) 음성(negative) 조절제를 제공한다. 본 발명의 실시예에서는 상기 Akt의 라이신 284가 Hades에 의한 유비퀴틴화의 주요 부위라는 것을 증명하였다.

본 발명에 있어서, 상기 Akt는 다운스트림 시그날링에 의해 세포 증식(proliferation), 아폽토시스(apoptosis)의 억제 및 세포 이주(migration)을 유도하는 것을 특징으로 하는 Akt (단백질 키나아제 B) 음성(negative) 조절제를 제공한다. Akt가 다운스트림 시그날링에 의해 세포 증식(proliferation), 아폽토시스(apoptosis)의 억제 및 세포 이주(migration)을 유도한다는 사실은 종래문헌들을 통해 널리 알려져 있다.

본 발명에 있어서, 상기 Hades는 암세포의 증식, 생존 및 세포 이주를 억제하는 것을 특징으로 하는 Akt (단백질 키나아제 B) 음성(negative) 조절제를 제공한다. 본 발명의 실시예에서는 상기 Hades가 Akt 의 다운스트림 시그날림을 음성적으로 조절함으로써 암세포의 증식, 생존 및 세포 이주를 억제한다는 것을 증명하였다. 본 발명의 실시예에서는 암세포의 대표적인 예로서, 자궁경부암세포인 HeLa 세포와 대장암세포인 HCT116을 대상으로 본 발명의 효과를 실험하였다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 Hades 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는, Akt (단백질 키나아제 B) 음성(negative) 조절제로 기능하는 것을 특징으로 하는 항암제를 제공한다. 본 발명의 실시예에서는 상기 Hades가 Akt 의 다운스트림 시그날림을 음성적으로 조절함으로써 암세포의 증식, 생존 및 세포 이주를 억제한다는 것을 증명하였다. 본 발명의 실시예에서는 암세포의 대표적인 예로서, 자궁경부암세포인 HeLa 세포와 대장암세포인 HCT116을 대상으로 본 발명의 효과를 실험하였다.

또한, 바람직하게는 본 발명의 항암제에 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 추가적으로 포함될 수 있다 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences and US Pharmacopoeia. 1984, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA] 참조).

본 명세서에서 사용된 "약제학적으로 허용되는"은 독성 또는 안정성 관점으로부터 인간을 포함하는 포유동물에 투여를 위해 적합함을 일반적으로 의미한다. 담체는 희석액, 부형제, 충전재, 접착제, 습윤제, 붕해제, 흡수 개선제, 계면 활성제, 흡수제 캐리어, 제약 분야에서 공통적으로 사용되는 광택제를 포함한다. 필요하다면, 향료나 감미료 등이 첨가될 수도 있다. 담체는 또한 pH, 삼투압, 점성, 무균도, 지질도, 용해도등 또다른 조건을 변형시키기 위해 약제학적으로 허용가능한 다른 부형제를 함유할 수 있다. 투여된 후 지속되거나 지연된 방출을 허용하는 약제학적으로 허용가능한 부형제 또한 포함될 수 있다.

적절한 부형제는 예를 들어 물, 샐린, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등이다. 또한, 원하는 경우, 투여되는 약제학적 조성물은 예를 들어 소듐 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올리에이트, 트리에탄아민 소듐 아세테이트 등과 같은 습윤제 또는 에멀젼제, pH 완충제 등과 같은 소량의 비독성 보조 물질을 함유할 수 있다.

본 발명의 항암제 조성물은 예컨대, 전신적 또는 경구 경로에 의한 투여 경로를 통해 주입될 수 있다. 전신적 투여의 바람직한 형태는 주사, 일반적으로 정맥 주사를 포함한다. 다른 주사 경로는 예컨대, 피하, 근육내 또는 복강이 사용될 수 있다. 전신적 투여의 대체적 수단은 담즙산 또는 푸시딘 산 또는 다른 계면 활성제과 같은 침투제를 사용한 경점막 및 경피 투여를 포한한다. 또한 본 발명의 항암제 조성물은 장용제 또는 캡솔화 제제, 경구 투여제로 제제화하는 것도 가능하다. 이들 항암제의 투여는 연고, 페이스트, 겔 등의 형태로 국소적 및/또는 부분적일 수 있다.

본 발명의 항암제 조성물이 핵산을 포함하는 양태에서, 핵산은 벡터에 포함될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 특정 양태에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 일부 양태에서, 아데노바이러스는 프로타민과 함께 제형화된다. 임의의 수의 바이러스 입자가 환자에게 투여될 수 있다. 특정 양태에서, 투여 당 약 10⁸ 내지 약 10¹⁴개의 바이러스 입자가 환자에게 투여된다.

핵산 조성물이 투여되는 본 발명의 일부 양태에서, 핵산 조성물은 하나 이상의 지질을 포함할 수 있다. 상술되는 어떠한 지질도 이러한 지질-핵산 조성물에 포함될 수 있다. 이러한 지질의 예는 DOTAP 및 콜레스테롤, 또는 이의 유도체를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "치료적 유효량"은 원하는 치료 요법에 따라 투여할 때, 원하는 치료적 효과 또는 반응을 일으키거나 원하는 이익을 제공하는 본 발명의 Hades 단백질 등 활성제의 함량을 의미한다. 실제로 투여되는 조성물의 양은 이상의 심각성, 투여되는 조성물, 나이, 체중, 및 각 환자의 반응, 선택된 투여 경로와 같은 치료하려는 질환에 속하는 환경에 기초하여, 의사에 의해 결정될 수 있으나, Hades 단백질인 의약의 경우, 암 환자에게 투여할 약학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양은 0.01 내지 10 ㎎/㎏/day 정도가 바람직하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계들을 포함하는 Akt (단백질 키나아제 B) 음성(negative) 조절제의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) 동물세포에 Akt와 Hades를 공-형질감염(cotransfection)시키는 단계; (b) 상기 형질감염된 동물세포에 임의의 약제를 처리하는 단계; 및, (c) 상기 동물세포에서 Akt와 Hades의 상호작용이 촉진되는지 여부를 결정하는 단계.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계들을 포함하는 Akt (단백질 키나아제 B) 양성(positive) 조절제의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) 동물세포에 Akt와 Hades를 공-형질전환(cotransfection)시키는 단계; (b) 상기 형질전환된 동물세포에 임의의 약제를 처리하는 단계; 및, (c) 상기 동물세포에서 Akt와 Hades의 상호작용이 저해되는지 여부를 결정하는 단계.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

세린/트레오닌 키나아제인 Akt 는 세포 증식(proliferation), 세포 생존(survival) 및 종양(tumor) 발달을 포함한 다양한 세포 프로세스들에서 기능한다. 그 동안 Akt 를 음성적으로 조절하는 메커니즘에 대한 연구는 탈인산화(dephosphorylation)-매개된 불활성화에 초점이 맞추어 졌다. 본 발명에서, 우리는 RING 핑거 도메인 및 E3 유비퀴틴 리가아제 활성을 갖는, Akt 의 음성 조절인자인 Hades를 동정하였다.. Akt 는 Hades와 직접적으로 상호작용하여, Hades에 의해 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo)에서 유비퀴틴화된다고 밝혀졌다. 다른 분자 측정법으로 인산화된 Akt 가 Hades에 의한 상호작용 및 유비퀴틴화 둘다를 위한 실질적인 표적이라는 것을 증명하였다. 이들 기능 연구들의 결과는 Hades에 의한 Akt 의 분해가 암세포의 증식 및 생존을 억제할 수 있다는 것을 제시한다. 이들 데이터는 Akt-유비퀴틴화 시그날링 네트워크에 대한 규명을 제공한다.

본 발명는 Akt 세포신호전달의 음성적 조절에 관한 Hades의 기능을 증명한 것이다. Hades는 Akt와 in vivo, in vitro상에서 직접적으로 결합하였으며, Akt의 키나아제 도메인 (kinase domain)을 통해 Hades와 결합됨을 밝혔다. 비록 Akt에는 3가지의이소폼이 존재하며, 이 이소폼들사이에 키나아제 도메인들은 90~95% 정도 아미노산서열이 동일하지만, Hades는 Akt1과 Akt2에 결합하며, Akt3에는 결합하지 않았다. 그리고 Akt와 가장 아미노산서열에서 동일한 SGK1도 Hades에 의해서 결합되거나Hades에 의해서 유비퀴틴화되지 않았다(도 2D). 뿐만아니라, Hades는Akt 인산화효소에의해서인산화되지않음을확인하였다.

본 발명에서 Hades와 Akt사이의 상호관계성은 Akt의 인산화상태에 매우 의존적임을 발견했으며, 이로써 Akt 단백질 안정성이 엄격하게 조절된다는 사실을 알았다. Akt의 인산화를 유도하는 혈청자극은 Akt와 Hades간의 결합력을 증가시켰으며, 따라서 Akt 유비퀴틴화 및 Akt 분해를 증가시켰다. 이러한 인산화-의존적 Akt 단백질분해는 인위적으로 유전조작하여 항상 활성화 상태로 유지할 수 있는 Akt (Myc/His-Akt-myr)를 제작 및 사용하여 재검증하였다. 면역침강법으로 실험한 결과, Hades는 Akt-myr와 결합하였지만, 인산화되지 않은 우성음성 돌연변이 Akt (Akt-DN)와는 결합하지 않았다. 게다가 Akt의 인산화를 저해하는 약물인 LY294002 및wortmannin를 세포에 처리한 결과 Hades를 통한 Akt의 분해가 저해됨을 보였다. 역으로 siRNA를 통한 Hades의 저발현유도는 Akt단백질 안정성을 증가시켰으며, p-Akt의 레벨도 증가되었다. 종합하자면, 본 데이터는 Hades는 p-Akt에 결합하는 것을 선호하며, 이로서 p-Akt의 분해가 촉진된다는것이다.

구조적으로살펴보자면, Akt는 그것의 효소활성담당 도메인에 존재하는 T-루프안에 아미노산 308번째 트레오닌(Thronine)에 인산화 및 비효소활성적 도메인인 C-말단에 위치한 473번째 세린(Serine)에 인산화됨으로써 완전활성을 나타내게된다 [40]. Akt의 비활성화 상태에서는 Akt 내 PH 도메인과 키나아제 도메인사이에 결합이 형성되어 상위의 인산이노시타이드-의존적 단백질인산화효소-1에 의한 Akt 의 루프내 인산화가 억제되어있다[37, 41]. 비록 정확한 구조적기전에 대해서는 완벽하게 알려지진 않았지만, 본 발명 결과들을 종합하자면 Akt의 인산화는 Akt의 키나아제 도메인안에서 Hades와 결합할 수 있는 부분을 노출시킨다고 결론내릴수있다. 첫째, 풀-다운 분석 데이터에서 Akt의 키나아제 도메인과 Hades사이에 결합이 형성됨을 알수있었다. 둘째, Akt의 인산화부분에 해당하는 것을 작은 펩타이드로 합성하여 경쟁적인 결합분석법을 실시한 결과 인산화된 펩타이드와 비인산화된 펩타이드사이에 Hades의 결합력에는 차이가없었다(미제시데이타). 셋째, 모방적으로 인산화의 형태를 띠는 Akt (T308D/S473D, 항상 활성화 형태를 모조한 유전자조작)도 Hades와 결합력을 가졌다. 따라서 이러한 결과들은 Hades와 결합에 있어서 Akt의 인산화잔기가 중요한것은아니라, 인산화됨으로나나타나는구조적변형이중요하다라는것이다.

유비퀴틴-프로테이좀시스템(UPS)에 의한 단백질분해는 다양한 세포내반응을 조절할수있다[16]. 먼저 UPS에 의한 Akt의 분해는 특수한 현상이 아니라 여러 다양한 세포에서 나타나는 광범위한 현상이라고 여러논문에서 보고하였다[42]. Hsp90의 존재하에서 Akt단백질은 안정화되며, 따라서 Hsp90 저해제는 Akt 분해를 유도한다[18]. 하지만, 본 발명에서 Hades에 의한 Akt의 분해는 Hsp저해제-유도적 Akt의 분해와는 관련이 없음을 알았다. Riesterer등은 VEGF 저해재 PTK787/ZK222584에 의한 VEGF 신호전달의 억제는 UPS에 의한 Akt의 분해가 유도된다고하였다[20, 42, 43]. 게다가, rapamycin이라는 약의 타겟으로 발굴된 단백질 mTOR의 저해재인 rapamycin을 처리하면 UPS-에의한 Akt 분해에 대한 VEGF의 보호기전이 없어짐이 보고되었다. Yan등은 해마신경에서 UPS에 의한 수지상 Akt의 분해가 선택적으로 일어난다고보고하였다[43]. 그들은 수지상 부분의 Akt 비안정화는 신경극성을 형성하는데 필요함을알아냈다. 이렇게 UPS에 의한 Akt의 분해가 여러 다른 세포적 조건하에서 일어남이 보고되었지만, UPS에 의한 Akt분해를 유발하는 특이적 E3 리가아제에 대해선 아직까지 불분명한 상태였다. 최근 tetratricopeptide repeat domain 3가 Akt-특이적 E3 리가아제이며, 핵안에서 Akt의 유비퀴틴화와 분해가 유발됨을 보고하였다[20]. 하지만 활성화된 Akt는 핵뿐만이아니라 세포질 및 세포막에 존재할 수 있어, 본 발명이 가지는 의미는 미토콘드리아에 존재하는 Hades[23]는 세포질에 존재하는 p-Akt를 음성적으로 조절한다는 것이다.

이전의 보고에서 Hades의 세포내 위치는 미토콘드리이며, Hades는 세포사멸신호전달을 활성화시킨다고 밝혔다[45]. 게다가, 다른 연구그룹에서 세포사멸이 일어나는 동안에 Akt의 분해는 카스파제(caspase)에 의존적으로 일어난다고 보고하였다[46]. 비록 본 발명에서 Hades에 의한 카스파제 활성화가 Akt 신호전달체계에 영향을미치는 것에 대한 가능성을 해결하진 못했지만, Hades-의존적 Akt의 분해는 카스파제 세포신호전달과 연관이 없어 보였다. 이유인즉은, 카스파제 저해재인 Z-VAD를 세포에 처리한 상태에서도 Hades에 의해서 Akt가 계속 분해되기 때문이다 (도 17).

현재까지, 폴리유비퀴틴-의존적 단백질분해에 해당하는 Akt 내 아미노산잔기에 대해서 보고되지 않았다. 비록 Akt-KD와 Hades가 결합하지만, Akt-PH와 Akt-HM부분에 유비퀴틴화될 수 있다는 가능성을 배제하지는 않았다. 도 5A에서 제시했듯이, Hades에 의해서 Akt-PH와 Akt-HM이 아닌 Akt의 키나아제 도메인 부분에서 유비퀴틴화가 일어남을 보였다. 그리고 과연 Hades에 의해서 유비퀴틴이 결합되는 Akt내 잔기를 알아내기 위해, 본 발명에서 Akt-KD내 11개의 라이신 잔기(lysine residue)부분을 점돌연변이시켜 실험에 사용하였다. 그 결과 Akt내 284번째 라이신 잔기의 점돌연변이는 Akt 유비퀴틴화를 억제하는데 충분한 결과를 얻었다. 그러나 우리의 실험으로 Akt 단백질 안정성에 관여하는 것이 284잔기 부분만 아니라 다른 부분일 수 있는 가능성은 배제할 수는 없다.

Akt효소는 하위의 여러 타겟물질의 인산화를 통해 세포성장과 세포이동에 관여하는 여러 세포내 과정을 촉진시키는데 중요한 역할을 담당하고 있다[36]. 본 발명에서 Hades의 암세포내 과발현은 세포성장 및 성장능력을 Hades의 E3 리가아제 활성 의존적으로 억제함을 증명하였다. GSK-3β와 TSC2는 잘 알려진 Akt의 하위 타겟 단백질로서 단백질 합성, 세포 증식, 분화, 이동 그리고 세포사멸억제를 조절하는 것으로 알려져 있다[47,48]. 여러 보고들에 따르면, GSK-3β의 세포사멸 촉진능력은 Akt에 의해GSK-3β내 9번째 아미노산인 세린(serine)잔기게 인산화 됨으로써 억제됨이 보였다[6]. 그리고 TSC2내 1462번째 트레오닌(threonine)잔기가 Akt에 의해서 인산화 되면, 인슐린 신호전달등을 위한 세포 성장 신호를 촉진한다고 보고되었다[49]. 따라서 Hades에 의한 세포 사멸 및 생존 억제는 Akt를 분해 및 그로인한 Akt 인산화 타겟 단백질GSK-3β와 TSC2의 인산화 수준도 저해됨으로 나타나는 결과임을 증명하였다. 뿐만아니라, Hades에 의한 Akt 신호전달의 억제는 pTOPFLASH리포터 및 상처치유 분석법을 통해 Hades는 Akt의 신호를 음성적으로 조절함으로써 이러한 세포 과정을 조절할 수 있다는 결과를 얻었다. 게다가 우리는 Hades를 통한NF-κB의 활성화는 Hades의 E3 리가아제 활성에 비의존적임을 밝혔으며, Akt를 통한NF-κB의 활성화는 Hades의 E3 리가아제 활성에 의존적으로 감소됨을 보였다. 최근에 Zhang 등은 Hades/GIDE와 RING도메인이 없는 Hades모두NF-κB의 활성을 약하게 나마 증가시킨다고 보고하였으며, IKKβ-KA and IκBα (SS/AA)의 과발현은 Hades에 의한NF-κB의 활성을 억제하였지만, Hades/GIDE를 통한 세포 성장 억제 효과는 억제하지 못함도 보고하였다. 따라서, Hades에 의한NF-κB의 활성화 기전의 아직 불분명하지만, NF-κB의 활성화는 Hades의 세포 성장 억제 능력과 관련이 없어 보인다. 그러므로, 비록 Hades는NF-κB의 활성을 증가시키지만, 이러한 현상은 Akt에 의한NF-κB기전과 다른 것으로 이해할 수 있다.

본 발명의 결과들은 Hades는 Akt를 음성적으로 조절하여, 관련 많은 세포 과정을 조절할 수 있음을 증명하였다. 본 발명의 결과들은 또한 Akt의 조절자로서 미래의 신규 타겟으로 임상적인 중요성을 가질 수 있는 가능성을 제공할 수 있다.

도 1은 Akt가 시험관내 및 생체내에서 Hades E3 유비퀴틴 리가아제와 상호작용하는 것을 보여주는 도면이다.
도 2는 Akt 의 유비퀴틴화 및 분해가 Hades에 의해 매개된다는 것을 보여주는 도면이다.
도 3은 pAkt 가 Hades에 의해 유비퀴틴화의 우선적(preferred) 기질이라는 것을 보여주는 도면이다.
도 4는 활성화된 Akt가 유비퀴틴 E3 리가아제 Hades의 우선적 표적이라는 것을 보여주는 도면이다.
도 5는 Akt 의 라이신 284 가 Hades-매개된 폴리유비퀴틴화를 위한 부위라는 것을 보여주는 도면이다.
도 6은 Akt 의 세포 성장 기능이 Hades에 의해 억제된다는 것을 보여주는 도면이다.
도 7은 siRNA-매개된 Hades 발현 제거가 내생적 Akt1 및 Akt2 단백질들을 안정화시키는 것을 보여주는 도면이다.
도 8은 Hades가 Akt1 분해를 유도하고 미토콘드리아에서 Akt1과 공동위치된다는 것을 것을 보여주는 도면이다.
도 9는 혈청이 Akt 단백질 안정성을 감소시키는 것을 보여주는 도면이다.
도 10은 젤다나마이신이 대조군 세포 및 Hades-결핍 세포 둘다에서 Akt 분해를 유도한다는 것을 보여주는 도면이다.
도 11은 Hades-매개된 Akt 단백질 분해가 워트만닌(wortmannin)에 의해 회복된다는 것을 보여주는 도면이다.
도 12는 라이신 284의 돌연변이가 Hades에 의한 이소적으로 발현된 Akt의 단백질 분해를 방지한다는 것을 보여주는 도면이다.
도 13은 shRNA 에 의한 HeLa 세포에서 Hades의 결핍이 세포 성장을 증가시킨다는 것을 보여주는 도면이다.
도 14는 Akt-매개된 세포 생존율 증가가 RING 도메인-의존적 방식으로 Hades에 의해 감소된다는 것을 보여주는 도면이다.
도 15는 내생적 Hades의 결핍이 세포 이주를 저해한다는 것을 보여주는 도면이다.
도 16은 Hades-유도된 NF-κB 활성화가 그것의 E3 리가아제 활성에 비의존적이고, Akt-유도된 NF-κB 활성화가 E3 리가아제 활성-의존적 방식으로 Hades에 의해 감소된다는 것을 보여주는도면이다.
도 17은 이소적으로 발현된 Akt 가 카스파제(caspase) 저해제 Z-VAD의 존재하에 HeLa 세포에서 Hades에 의해 분해된다는 것을 보여주는 도면이다.
도 18은 Hades가 HCT116 대장암(colon cancer) 세포주에서 콜로니 형성을 감소시키는 것을 보여주는 도면이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 플라스미드( plasmids )

Akt와 Hades의 코딩 염기서열 부분은 자궁경부암 세포주 HeLa에서 유래된 cDNA을 대상으로 PCR을 통해 증폭 및 분리하였다. 증폭된 인간 Akt1 cDNA는 pcDNA3.1-Myc/His (Invitrogen, Carlsbad, CA), pGEX6p (Promega, Madison, WI) 그리고 pET28 (Novagen, EMD Chemicals Inc. Merck, Darmstat, Germany) 벡터들에 클로닝하였다. HadescDNA는 pEGFP-C (Clontech, Mountain View, CA)와 pGEX6p 벡터들에 클로닝하였다. Akt유전자를 기능별로 나눈 부분들은 pcDNA3.1 (Invitrogen) 벡터에 클로닝 하였다. 우성음성돌연변이된 Akt유전자 (DN-Akt, T308A and S473A), Akt 아미노산 서열 내 라이신 잔기 (lysine residue)의 돌연변이체들 그리고 Hades의 RING 도메인-돌연변이 (Hades MT-C302S and C305S)들은 QuikChange site-directed mutagenesis kit (Stratagene, Santa Clara, CA)의 제품을 이용하여 해당 제품의 지시사항에 따라 만들었다. HA-유비퀴틴 (HA-Ub) 플라스미드 pMT123은 Dirk Bohmann (University of Rochester, Rochester, NY) 박사로부터 제공받았다. HA-Ub돌연변이형 유전자들은 (HA-Ub-K48R and HA-Ub-K63R)은 Zhijian Chen (University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX) 박사로부터 제공받았다. PCR에 사용된 프라이머 서열들은 하기 표 1에 나열되었다.

[표 1] Akt 및 Hades 의 구조체를 생성하기 위해 사용된 프라이머 서열들

실시예 2: 재조합 단백질 ( recombinant proteins )

GST 와 GST가 표지된 Hades (GST-Hades) 단백질들은 대장균 (Escherichia coli) BL21균주를 사용하여 37도의 온도에서 0.1 mM IPTG를 처리하여 1시간동안 발현시켜 얻었다. 그 균주세포들을 대상으로 NP-40 용해 버퍼 (lysis buffer) (50 mMTris-HCl, pH 7.5, 150 mMNaCl, 1% NP-40, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, lysozyme and protease inhibitors)를 사용하여 재현탁시켰다. 이 재조합 단백질들은 glutathione-sepharose 4B bead를 사용하여 해당 제품의 지시사항을 따라 추출하였으며, 추출된 것을 Slide-A-Lyzer dialysis cassette (Pierce, Rockford, IL)의 제품을 사용하여 투석시켰으며, 최종적으로 Amicon Ultra-15 device (Millipore, Billerica, MA)을 사용하여 농축하였다. His-Akt는 Millipore회사에서 구입하였다.

실시예 3: 항체 및 시약 ( Antibodies and reagents )

본 연구를 위해 사용한 항체는 다음과 같다. EFGP, Myc-tag, 인산화된 Akt (pAkt) (S308), pAkt (T473), Akt, pGSK-3β, TSC2, pTSC2 (T1462)의 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA)에서 구입하였으며, HA-tag, GSK-3β의항체는 Santa Cruz Biotechnology, (Santa Cruz, CA)에서구입하였으며, SGK1 하에는 Millipore에서 구입하여 사용하였다. Hades 다클론항체(polyclonal antibody)는 아미노산서열 N-SGERPKGIQETEEM-C 및 N-SRAKPEDRESLKSAC-C로 이루어진 펩타이드를 사용하여 토끼에 주입후 면역화시켜 항체를 추출하였다. 암세포내 인위적으로 플라스미드를 주입하는 형질감염(transfection)은Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen)을사용하여 수행하였다. Z-VAD 및 MG132는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입하여 사용하였다. LY294002 and wortmannin Cell Signaling Technology사에서 구입하였다. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt (MTS) assay kit는Promega사에서 구입하여 사용하였다.

실시예 4: 시험관내 단백질 결합 역가 측정 실험 ( in vitro binding assay )

35S-로 표지된 단백질 및 단백질집합체는 시험관내 전사/번역반응을 통해 얻어내었으며, 이를가지고 3 μg의 GST 혹은 GST-Akt 재조합단백질이 부착된glutathione-Sepharose 4B beads가 담긴 0.5% NP-40 버퍼를 혼합하여 37도에서 3시간반응시켰으며, 3번의 수세를 한후, 샘플을 SDS 샘플버퍼에 넣어끓였다. 결합된 단백질들의 분석은 SDS-PAGE를 통하여 autoradiography를 사용하여 현상함으로써 이루어졌다.

실시예 5: 면역침강 ( Immunoprecipitation )

면역침강실험은 CHAPS 버퍼 (0.5% CHAPS, 10 mMTris-HCl, pH 7.5, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 5 mM β-mercaptoethanol and 10% glycerol)에 현탁된 세포파쇄액을 영상 4도에서 해당항체와 같이 반응시켜 수행되었다. 후에 Protein A/G PLUS-Agarose beads (Santa Cruz Biotechnology)를 첨가하였으며, 2시간 더 반응시켜 수세하여 마무리시켰다.

실시예 6: 시험관내유비퀴틴화실험 ( in vitro ubiquitination assay )

곤충세포에서 정제된 His-Akt 혹은 λ-단백질 탈인산화효소(λ-PPase, New England Biolabs, Ipswich, MA)를 처리한 His-Akt를 150ng의 재조합 E1(Boston Biochem, Cambridge, MA)효소, 250 ng의 재조합 UbcH5C (Boston Biochem), 500 ng의GST-Hades와 5 ug His-ubiquitin (Boston Biochem)들과 함께 유비퀴틴화 버퍼(50 mMTris-HCl, pH 7.4, 5 mM MgCl2, 15 μM ZnCl2, 0.3 mM DTT, 0.006% DTT, 2 mM ATP, 10 U creatine phosphokinase and 10 mM phosphocreatine)안에서 상온 30도에서 90분간 반응시켰다. λ-단백질 탈인산화효소를 처리한 유비퀴틴화 반응은 His-Akt와 λ-PPase를 유비퀴틴화 버퍼안에서 상온 30도에서 1시간동안 반응시켰으며, 반응후 2배 농축된 탈인산화효소 저해제를 첨가하였다. 그후 그 반응혼합체에 E1, E2, GST-Hades와 유비퀴틴을 첨가하여 반응시켰다. 반응산물은 8% SDS-PAGE를 통해anti-Akt 항체를 사용하여 면역블로팅(immunoblotting)을 통해 분석되었다.

실시예 7: In vivo 유비퀴틴화실험( in vivo ubiquitination assay )

형질감염(transfection)후 MG132 처리된 세포들을 PBS로 수세한후 200 μl의 변성용해버퍼 (denaturing lysis buffer, 50 mMTris-HCl, pH 7.4, 0.5% SDS and 70 mM β-mercaptoethanol)를 첨가하여 vortexing 및 상온 95도에서 15분간 끓임으로서 완전히 세포를 용해시켰다. 용해된 세포액은 800 μl of CHAPS버퍼를 넣어 희석하였다. 그 희석된 세포액을 Akt 항체와 protein agarose A/G PLUS-Agarose beads를 첨가하여 면역침강시켰다. 반응후, beads는 CHAPS lysis buffer에 5번수세한후, 끓였다. 유비퀴틴화된 Akt는 anti-HA항체를 사용한 면역블로팅을 통해 현상되었다. His-풀다운 실험(His-pull down assay)은 변성된 세포액을 먼저 800 μl의 버퍼 A (50 mM NaH2PO4, 300 mMNaCland 10 mM imidazole, pH 8.0)를 첨가하여 희석한후, Ni-NTA bead를 첨가하여 상온 4도에서 밤새 반응시켰다. 그 beads는 버퍼B(50 mM NaH2PO4, 300 mMNaCl and 20 mM imidazole, pH 8.0)를사용하여 5번 수세되었으며, 그후 bead에 결합된 단백질들은 SDS-PAGE 샘플버퍼를 넣고 끓여서 용리시켰다. 그 용리된 단백질들은 anti-HA항체를 사용하여 면역블로팅하였다.

실시예 8: RNA 간섭 ( RNA interference )

Hades를 타겟하는 siRNA는 Ambion사에서 구입하였다. 먼저 Hades siRNA (100 pmol)를 LipofectamineRNAiMAX (Invitrogen)를 통해 혈청이 없는 배지상태에서 HEK293 세포(5×105 cells)에 형질도입시켰으며, 그후 정상배지로 교환시켜, 48 시간를 더반 응시켜 마무리하였다.

실시예 9: 세포생존능력실험 ( cell viability assay )

세포생존능력은 일반적인 MTS 실험을 통해 관찰하였다. 결과는 그래프로 제시하였으며, 대조군을 통해 비교치를 퍼센트로 나타내었다.

실시예 10: 집락형성분석법 ( Clonogenic survival assay )

먼저 자궁경부암세포주인 HeLa세포에 녹색형광단백질(EGFP)이 코딩된 대조군 플라스미드, EGFP가 표지된 Hades, 혹은 Hades MT유전자를 형질도입시켰다. 2 주후, 생긴 콜로니 (colonies)를 고정화시키고, 0.1% crystal violet를 가지고 염색하여 결과를 분석하였다. 부착비의존성 소프트-아가분석법(anchorage-independent soft-agar assay)은위에서 언급된 플라스미드들이 형질도입된 HeLa세포를 .45% low-melting 아가로즈와 10% 우태아혈청이 포함된 DMEM배지 3 ml에 첨가한후, 0.9% 아가로즈와 10% 우태아혈청이 포함된 DMEM 2ml를 추가적으로 첨가해 표면을덮었으며, 2주간 배양하여 콜로니를 관찰하였다.

실시예 11: 루시퍼레이즈리포터유전자분석법( luciferase reporter gene assay )

본실험은 TCF-반응 루시퍼레이즈 플라스미드인 pTOPFLASH (upstate)를 사용하였다. pTOPFLASH벡터에는 6개의 TCF-반응사이트가 존재한다. 이벡터를 형질도입시켜 48시간동안 반응한후, 루시퍼레이즈 활성을 β-galactosidase를 대조군으로하여 몇배 증가되었는지 분석하였다. 해당결과는 3번의 독립적인 실험들을 바탕으로 평균낸값이다.

실시예 12: 전장( full - length ) 인간 cDNA 라이브러리 구축

전장 인간 cDNA 라이브러리를 구축하기위해, 먼저 자궁경부암 HeLa 세포와 간(liver) Chang 세포로 부터 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 해당 제조사의 지시사항을 토대로 total RNA를 추출하였다. 노멀라이즈된 전장 cDNA 라이브러리는 SMART cDNA library construction kit (Clontech, Mountain View, CA)와 TRIMMER-cDNA normalization kit (Evrogen, Russia) 제품을 사용하여 해당 제조사의 지시사항을 토대로 제작하였다. 노멀라이즈된 cDNA는 CHROMA SPIN-400 column (Clontech)을 통해 크기별로 분별하였으며, 500 bp이상의 모든 cDNA를 대상으로 유전자 기법을 통하여 SfiI 제한효소 반응 사이트가 삽입되도록 변형하였다. 그 후 pcDNA3.1(+) 벡터 (Invitrogen)에 클로닝하였으며, TOP10 대장균에 형질전환하였다.

실시예 13: 신규 Akt -결합 가능 단백체 선별 실험

시험과내 결합 분석법을 통해 결합 양성적인 단백질 집합체가 발견되면, 해당 cDNA 집합체를 다시 세부적으로 나누어 한개의 양성적인 cDNA 클론이 분리될때까지 계속 실험하였다. Akt에 결합 양성적 클론들은 염기서열 분석을 통해 나온 정보를 NCBI 유전자 데이타베이스를 통해 확인하였다.

실시예 14: 준세포분획( subcellular fractionation )

자궁경부암 HeLa 세포를 100-mm 플레이트에 약 70% 정도의 군집을 가지도록 키운다음, 5 μg의 EGFP-MULAN-WT 혹은 EGFP-MULAN-MT를 Myc/His-Akt1-myr (2 μg)과 함께 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)를 이용하여 해당 제조사의 지시사항을 토대로 세포 안으로 형질도입시켰다. 그 후, 세포를 24시간 동안 계속 배양하였다. 배양된 세포를 수확한 후, NKM buffer (1 mM Tris-HCl (pH 7.4), 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 7.5 mM MgCl2)에 재 현탁하였다. 해당 세포를 Dounce homogenizer를 이용하여 세포파쇄를 시켰으며, 2 M sucrose (최종 농도: 0.25M)를 첨가하여 상온 4도에서 12,000 x g의 세기로 5분동안 원심분리 시켰다. 원심분리 후 상층액을 새로운 튜브로 옮겼으며, 다시 7,000 x g의 세기로 상온 4도에서 15분동안 원심분리 하였다. 미토콘드리아 펠렛들을 현탁 버퍼(10 mM Tris-HCl (pH 6.7), 0.15 mM MgCl2, 0.25 mM sucrose, protease inhibitor cocktail)로 재 현탁시켜 다시 9,500 x g의 세기로 상온 4도에서 10분동안 원심분리 하였다. 원심분리 후 펠렛은 미토콘드리아 분획이며, 상층액은 세포질 분획이다. 그 세포질 및 미토콘드리아 단백질들은 10-15% SDS-PAGE 및 해당 항체들을 이용하여 면역블로팅을 통해 분석되었다.

실시예 15: 면역형광분석법( immunofluorescence assay )

형질도입된 세포를 유리 커버슬립(coverslip)에 배양시킨 후, 4% 포름알데하이드로 상온에서 5분동안 반응시켜 고정화 하였으며, PBS로 2번 수세하여 남은 용액을 제거한 후, permeabilization 버퍼(0.5% Triton X-100 in PBS)에 3분동안 반응시켰다. 고정화된 세포를 PBS에 5% BSA와 2% goat serum이 담긴 것을 이용하여 30분 동안 반응시켜 블러킹하였으며, anti-myc 항체 (1:200 in PBS)를 상온 4도에서 밤세 반응시켰다. 그 후 PBS로 세번 수세하여 남은 것들을 제거하였고, fluorescein Texas red가 표지된 2차 항체 (1:500 in PBS)를 이용하여 추가적으로 1시간동안 반응시켰다. 그 커버슬립을 뒤집은 다음Vectashield (Vector Laboratories, USA)에 단단히 고정화 시켜 confocal laser-scanning microscope (FV-1000 Spectral, Olympus, Japan)를 이용하여 형광분석을 실시 하였다.

실시예 16: 렌티바이러스 합성 및 감염

먼저, Hades shRNA가 코딩된 pLKO 벡터(Sigma)를 미생물에 주입시킨 것을 구입하였으며, 이러한 미생물로부터 해당 벡터를 순수분리하였다. LKO shRNA 렌티바이러스 벡터는 Lipofectamine 2000을 통하여 pLKO-MULAN shRNA, packaging 플라스미드 (pCMV-Δ8.2) 그리고 VSVG 플라스미드를 293T 세포에 형질 도입시켜 생산되었다. 형질 도입 후 48시간 후에, 바이러스가 포함된 배지를 모와 0.45-μm 구멍을 가지는 필터를 통하여 걸러 바이러스를 농축하였다. 6-well 플레이트에 자궁경부암 HeLa 세포를 배양시킨 후, 그 해당 바이러스를 polybrene과 함께 처리하였으며, 6 시간 후, 배지를 새로 교환시켜 준다음, 마지막으로1 μg/ml puromycin이 첨가된 배지로 72시간 배양시켰다. 최종적으로 대조군 shRNA 와 Hades shRNA가 발현되는puromycin-resistant HeLa 세포을 선택하여 실험에 사용하였다.

실시예 17: 통계분석

통계분석은χ2검정법, 피셔의정확검정법(Fisher’s exact test) 그리고Spearman등위상관계수분석법을통해수행되었다. P<0.05는통계적으로유의하다라고말할 수 있다.

[실험결과]

도 1은 Akt가 시험관내 및 생체내에서 Hades E3 유비퀴틴 리가아제와 상호작용하는 것을 보여주는 도면이다. (A) Akt 및 Hades 사이의 시험관내 상호작용. 풀-아운 분석법을 사용하여 35S-메티오닌-라벨된 Akt를 GST-태그된 Hades (GST-Hades)과의 상호작용에 대해 시험하였다. (B) Akt 및 Hades 사이의 생체내 연합. 지시된대로 플라스미드로 형질감염시킨후, HEK293 세포를 MG132로 처리한 다음, 항-Akt 항체로 면역침강시키고 항-EGFP로 면역블로팅시켰다. 면역글로불린 G를 음성 대조군으로 사용하였다. (C) Hades 및 Akt 이소폼들 사이의 내생적 상호작용. MG132-전처리된 HeLa 세포를 Akt 이소폼-특이적 항체들로 면역침강시키고 항-Hades 항체를 사용하여 면역블로팅을 실시하였다. (D) Akt 결실 돌연변이의 플라스미드의 기능적 도메인 구조 및 지도. (E) Akt 의 KD가 Hades와 상호작용한다. 풀-다운 분석법을 사용하여 35S-메티오닌-라벨된 Akt 결실 돌연변이들을 GST-Hades와의 상호작용에 대해 시험하였다.

도 2는 Akt 의 유비퀴틴화 및 분해가 Hades에 의해 매개된다는 것을 보여주는 도면이다. (A) 세포의 Akt 단백질 레벨이 RING-의존적 방식으로 프로테아좀 분해 패스웨이를 통해 Hades에 의해 감소되었다. 지시된대로 플라스미드로 형질감염시킨후, HEK293 세포를 MG132로 처리한 다음, 지시된 항체들로 면역블로팅시켰다. GST의 이소적 발현 레벨을 형질감염 대조군으로 정규화(normalize)하였다. (B) Akt는 시험관내에서 Hades에 의해 유비퀴틴화되었다. 시험관내 유비퀴틴화 분석법을 실시예에 기재된 대로 실시하였다. (C) Akt 는 생체내에서 Hades에 의해 유비퀴틴화되었다. 지시된대로 플라스미드로 형질감염시킨 후, HEK293 세포를 MG132로 처리한 다음, 실시예에 기재된 대로 생체내 유비퀴틴화 분석을 실시하였다. (D) Akt 의 유비퀴틴화는 Hades siRNA 형질감염에 의해 제거되었다. 지시된대로 siRNAs 및 HA-Ub 플라스미드로 형질감염시킨후에, HEK293 세포를 12시간동안 1 μM MG132로 처리한 다음, 생체내 유비퀴틴화 분석을 실시하였다. (E) K48-링크된 폴리유비퀴틴화가 Hades-의존적 Akt 유비퀴틴화를 책임진다. 지시된대로 HeLa 세포를 플라스미드로 형질감염시킨후, 생체내 유비퀴틴화를 실시하였다.

도 3은 pAkt 가 Hades에 의해 유비퀴틴화의 우선적(preferred) 기질이라는 것을 보여주는 도면이다. (A) Hades 및 Akt 사이의 상호작용은 인산화된 Akt에 의존적이다. 혈청-결핍된 HeLa 세포를 6시간동안 10% 혈청 또는 인슐린과 MG132로 처리하였다. 다음 Akt 항체로 면역침강 분석법을 실시한 후, 항-Hades 항체로 면역블로팅을 실시하였다. (B) 세포의 pAkt 레벨이 Hades에 의해 감소되었다. 실싱예에 기재된대로 HeLa 세포를 플라스미드로 형질감염시켰다. 24시간 인큐베이션후에, 배지를 무혈청 배지로 교체시키고, 이어서 세포를 2시간동안 10% 혈청으로 자극시켰다. 세포를 용해시키고 지시된대로 항체로 면역블로팅시켰다. (C) 세포의 pAkt 단백질이 Hades에 의해 유비퀴틴화되었다. 지시된대로 플라스미드로 형질감염시킨 후, HeLa 세포를 18시간동안 무혈청 배지에서 인큐베이팅시켰다. 세포를 10 μM LY294002로 처리한 후, 10 μM MG132의 존재하에 10% 혈청으로 자극시켰다. 세포 용해물을 지시된 항체들로 면역침강시키고 면역블로팅시켰다. (D) pAkt 의 탈인산화는 시험관내에서 Hades-매개된 Akt 유비퀴틴화를 감소시켰다. 시험관내 유비퀴틴화 분석법을 Sf9 세포 및 λ-PPase로부터 유래된 정제된 인간 Akt 단백질로 실시하였다. 유비퀴틴화된 Akt 및 pAkt를 지시된 항체들로 면역블로팅에 의해 검출하였다. (E) Hades siRNA 처리는 Akt 단백질 안정성을 증가시켰다. HeLa 세포를 대조군 및 Hades siRNA로 형질감염시키고 지시된 시간동안 40 μg/ml 사이클로헥시미드로 처리하고, 그 후 Akt 단백질 턴오버(turnover)를 면역블로팅을 통해 조사하였다.

도 4는 활성화된 Akt가 유비퀴틴 E3 리가아제 Hades의 우선적 표적이라는 것을 보여주는 도면이다. (A) Hades는 생체내에서 영구(constitutively) 활성 Akt와 상호작용하였다. 지시된대로 플라스미드로 형질감염시킨 후, HEK293 세포를 MG132로 처리한 다음, 항-myc 항체로 면역침강시키고 지시된 항체들로 면역블로팅시켰다. (B) 활성화된 Akt는 생체내에서 Hades에 의해 효율적으로 유비퀴틴화되었다. 지시된대로 플라스미드로 형질감염시킨후, HEK293 세포를 MG132로 처리한 다음, 실시예에 기재된 대로 생체내 유비퀴틴화 분석을 실시하였다. (C) Hades-매개된 Akt의 단백질 분해는 LY294002에 의해 저해되었다. HEK293 세포를 지시된대로 플라스미드로 공형질감염시켰다. 24시간 인큐베이션후에, 세포를 4시간 동안 10 μM LY29402로 처리하였다. 세포를 용해시키고 지시된 항체들로 면역블로팅시켰다. GST의 이소적 발현 레벨을 형질감염 대조군으로 정규화하였다. 그래프는 3회 실험들로부터 Akt 의 상대 강도의 평균( mean) ± SD를 나타낸다.

도 5는 Akt 의 라이신 284 가 Hades-매개된 폴리유비퀴틴화를 위한 부위라는 것을 보여주는 도면이다. (A) Akt 의 KD가 Hades에 의해 유비퀴틴화된다. 일련의 Akt 결실 구조체를 35S-메티오닌의 존재하에 전사시키고 번역시켰다. 상기 35S-라벨된 Akt 돌연변이들을 시험관내 유비퀴틴화 분석법을 통해 Hades에 의해 유비퀴틴화시켰다. (B) Akt 의 라이신 284가 폴리유비퀴틴화 부위이다. HEK293 세포를 지시된대로 플라스미드로 공형질감염시켰다. 형질감염시킨지 24시간 후에, 세포를 10 μM MG132로 처리하고, 실시예에 기재된대로 생체내 유비퀴틴화 분석을 실시하였다. 전체 세포 용해물을 지시된 항체들로 면역블로팅에 의해 분석하였다. (C) K284R-Akt는 WT Akt 보다 더 안정하였다. HeLa 세포를 지시된 플라스미드로 공형질감염시킨 후, 40 μg/ml 사이클로헥시미드로 처리하였다. 세포를 지시된 항체들로 면역블로팅시겼다.

도 6은 Akt 의 세포 성장 기능이 Hades에 의해 억제된다는 것을 보여주는 도면이다. (A) 세포 성장이 Hades에 의해 완화되었다. HeLa 세포에 지시된대로 플라스미드로 형질감염시킨 후, 생존 세포의 개수를 매 24시간마다 헤모사이토미터를 사용하여 계수하였다. 그 결과는 3회의 독립된 실험들을 대표한다. (B) Hades는 투여량-의존적 방식으로 세포 생존을 저해한다. HeLa 세포를 지시된대로 플라스미드로 형질감염시켰다. 24시간 인큐베이션후에, 세포 생존율을 MTS 분석법으로 결정하였다. (C) Hades는 클론원성 성장을 억제한다. HeLa 세포를 지시된대로 플라스미드로 형질감염시킨 후, 2주간 G418 (500 μg/ml) 함유 배지에서 인큐베이션시키고, 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. (D) Hades는 부착(anchorage)-비의존적 성장을 저해한다. 소프트-아가 분석법을 지시된 플라스미드로 형질감염된 HeLa 세포로 실시하였다. 시딩(seeding)한지 2주후 콜로니를 계수하였다. 그 결과는 3회의 독립된 실험들을 대표한다 (평균 ± SD 도시). 통계학적 유의성을 위해 스튜던트 t-검정을 사용하였다 (*P < 0.05). (E, F, G) Akt 다운스트림 시그날링이 Hades에 의해 조절된다. HeLa 세포를 지시된 Hades 플라스미드 (E) 및 Hades siRNA (F)로 형질감염시켰다. 24시간 인큐베이션후에, 세포를 용해시키고 지시된 항체들로 면역블로팅시켯다. HeLa 세포를 TCF/LEF1 리포터 플라스미드, pTOPFLASH 및 지시된 다른 플라스미드들로 공형질감염시켰다. 24시간 인큐베이션후에, 세포를 용해시키고, TCF 응답 요소로 구동된 리포터 루시퍼라제 활성을 결정하였다 (G). (H, I) Hades는 Akt-유도된 세포 이주를 저해하지만 (H), K284R-Akt-유도된 세포 이주는 저해하지 않았다 (I). HeLa 세포를 지시된대로 플라스미드로 공형질감염시켰다. 48시간 형질감염후에, 100% 컨플루언트(confluent) 세포들을 스크래치하여 상처를 형성시켰다. 상처를 유도한지 72시간후에, 세포의 이주를 위상차 현미경에서 가시화하였다. (J) K284R-Akt-발현 세포들의 세포 성장이 Hades에 의해 저해되지 않는다. HeLa 세포를 지시된대로 플라스미드로 형질감염시킨후, 생존 세포들의 개수를 매 24시간마다 헤모사이토미터를 사용하여 계수하였다.

도 7은 siRNA-매개된 Hades 발현 제거가 내생적 Akt1 및 Akt2 단백질들을 안정화시키는 것을 보여주는 도면이다. HeLa 세로를 Hades 특이적 siRNA로 형질감염시켯다. Akt 이소폼들에 대한 Hades 제거의 효과는 Akt 이소폼-특이적 항체들로 면역블로팅하여 결정하였다.

도 8은 Hades가 Akt1 분해를 유도하고 미토콘드리아에서 Akt1과 공동위치된다는 것을 것을 보여주는 도면이다. (A) Hades는 세포질(cytosol) 및 미토콘드리아 둘다에서 Akt1 분해를 유도하였다. HeLa 세포를 지시된 플라스미드로 공형질감염시키고, 세포질 및 미토콘드리아 분획들을 분리하였다. 지시된 항체들로 면역블로팅하여 세포질 및 미토콘드리아 분획에서 Hades에 의한 Akt1 분해의 효과를 결정하였다. 투블린 및 Bcl-xL를 각각 세포질 및 미토콘드리아 마커로 사용하였다. (B) Hades 와 Akt1-WT (top) 및 Akt1-myr (bottom)의 공동위치화를 HeLa 세포에서 조사하엿다. HeLa 세포를 지시된 플라스미드로 공형질감염시키고, 세포를 4시간동안 MG132 (10 μM)의 존재하에 인큐베이팅하고, 고정화한 후 공초점 현미경으로 가시화하였다. DAPI 염색을 사용하여 핵을 보이게 하였다. 약어: cyto, 세포질l; mito, 미토콘드리아

도 9는 혈청이 Akt 단백질 안정성을 감소시키는 것을 보여주는 도면이다. HeLa 세포를 20시간동안 혈청-결핍시키고, 한세트의 세포들을 10% 우태아 혈청으로 자극하였다. 이어서 세포를 0, 3, 6, 12, 및 24 시간동안 40 μg/ml 시클로헥시미드로 처리하고, 내생적 Akt 단백질 안정성을 면역블로팅을 사용하여 조사하였다.

도 10은 젤다나마이신이 대조군 세포 및 Hades-결핍 세포 둘다에서 Akt 분해를 유도한다는 것을 보여주는 도면이다. HeLa 세포를 음성 대조군 siRNA 또는 Hades siRNA로 형질감염시킨 다음, 하룻밤 젤다나마이신 (50 nM)으로 처리하엿다. Hades 및 Akt의 단백질 레벨을 면역블로팅에 의해 검출하였다.

도 11은 Hades-매개된 Akt 단백질 분해가 워트만닌(wortmannin)에 의해 회복된다는 것을 보여주는 도면이다. HEK293 세포를 지시된대로 플라스미드로 공형질감염시켰다. 24 시간 인큐베이션후에, 세포를 4시간동안 10 μM 워트만닌으로 처리하였다. 세포를 용해시키고 지시된 항체들로 면역블로팅시켰다.

도 12는 라이신 284의 돌연변이가 Hades에 의한 이소적으로 발현된 Akt의 단백질 분해를 방지한다는 것을 보여주는 도면이다. HEK293 세포를 EGFP-Hades 또는 대조군 EGFP 용 플라스미드와 조합으로 Akt 의 야생형 또는 라이신 돌연변이 용 플라스미드로 공형질감염시켰다. 형질감염시킨지 24시간후에, 세포를 용해하고 지시된 항체들로 면역블로팅하였다.

도 13은 shRNA 에 의한 HeLa 세포에서 Hades의 결핍이 세포 성장을 증가시킨다는 것을 보여주는 도면이다. HeLa 세포를 음성 대조군 shRNA 또는 Hades shRNA를 발현하는 렌티바이러스(lentivirus)로 감염시켰다. 세포를 2주간 5 μg/ml 푸로마이신으로 선택하였다. 세포 성장은 매 24시간 마다 헤모사이토미터를 사용하여 계수함으로써 결정하였다. 데이터는 3회 독립 실험들의 평균으로 나타내었다 (평균 ± SD 도시).

도 14는 Akt-매개된 세포 생존율 증가가 RING 도메인-의존적 방식으로 Hades에 의해 감소된다는 것을 보여주는 도면이다. HeLa 세포를 Myc/His-Akt-myr와 조합으로 대조군 EGFP, EGFP-태그된 야생형 Hades (EGFPHADES-WT) 또는 RING 도메인 돌연변이 Hades (EGFP-HADES-MT) 용 플라스미드들로 형질감염시켰다. 형질감염한지 24시간후에, 세포 생존율을 MTS 분석법을 사용하여 결정하였다. 3회 독립 실험들을 실시하였다. 그 결과는 3회 독립 실험들을 대표한다 (평균 ± SD 도시). 스튜던트 t-검정을 사용하여 통계적 유의성을 결정하였다 (*P < 0.05).

도 15는 내생적 Hades의 결핍이 세포 이주를 저해한다는 것을 보여주는 도면이다. 렌티바이러스-매개된 Hades-결핍 세포 및 대조군 세포를 인큐베이팅하고, 100% 콘플루언트 세포들을 스크래치하여 상처를 형성하였다. 세포 이주는 상처를 형성하기 위해 스크래칭한지 72시간후에 위상차 현미경으로 가시화하였다.

도 16은 Hades-유도된 NF-κB 활성화가 그것의 E3 리가아제 활성에 비의존적이고, Akt-유도된 NF-κB 활성화가 E3 리가아제 활성-의존적 방식으로 Hades에 의해 감소된다는 것을 보여주는도면이다. HeLa 세포를 EGFP 대조군, EGFP-HADES-WT, 또는 EGFP-HADES-MT로 형질감염시키거나, 또는 NF-κB 루시퍼라제 리포터 플라스미드 및 β-갈락토시다제 플라스미드와 함께 Myc/His-Akt-WT 용 플라스미드로 공형질감염시켰다. 24시간 인큐베이션후에, 세포를 용해시키고, 리포터 루시퍼라제 활성을 결정하였다.

도 17은 이소적으로 발현된 Akt 가 카스파제(caspase) 저해제 Z-VAD의 존재하에 HeLa 세포에서 Hades에 의해 분해된다는 것을 보여주는 도면이다. HEK293 세포를 Myc/His-Akt-WT의 조합으로 EGFP-HADES-WT 또는 EGFP-HADES-MT용 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염시킨지 24시간후에, 세포를 Z-VAD (10 μM)로 처리하고 4시간 더 인큐베이팅하였다. 세포 추출물을 지시된 항체들로 면역블로팅시켰다.

도 18은 Hades가 HCT116 대장암(colon cancer) 세포주에서 콜로니 형성을 감소시키는 것을 보여주는 도면이다. (a) 암세포는 형태학적으로 특이적이게 콜로니를 형성하면서 자라는 특성이 있다. 이를 확인하여 얼마만큼의 콜로니가 생성되었는지 확인하기위해, 먼저 EGFP 벡터, EGFP-Hades WT 벡터, EGFP-Hades MT 벡터를 Lipofectamin 2000을 통해 해당 제조사의 지시사항으 바탕으로 대장암 세포 HCT116에 형질 도입시켰다. 그 후, 벡터내에 포함된 항생제인 puromycin이 포함된 배지에서 2주동안 배양시켜 콜로니를 생성시켰으며, 그 후 고정화 시키고, 0.1% crystal violet을 가지고 최종적으로 염색하여 콜로시 숫자를 분석하였다. (B) (a)에서 나타나는 콜로니 숫자를 그래프로 나타낸 것이다.

결과 1: Akt 가 Hades E3 유비퀴틴 리가아제와 상호작용한다

Akt 와 상호작용하는 단백질들을 동정하기 위하여, HeLa 및 간 창(Chang) 세포들로부터 유래된 인간 전장 cDNA 라이브러리를 제조하였다 (Supplementary Materials and Methods). cDNA 라이브러리로부터 시험관내(in vitro) 전사 및 번역된 단백질 푸울(pool)을 변형된 SMART 기술로 인간 Akt1-결합 단백질에 대하여 스크리닝하였다. 본 발명에서, 모든 실험들은 인간 Akt1를 사용하여 실시하였으며, 이는 달리 특정하지 않는 한 ‘Akt’로 표시된다. 상기 라이브러리로부터, 여러 양성(positive) cDNA 클론들을 분리하였으며, 분리된 클론들중에서 하나의 클론이 주요 Akt-결합 파트너로 동정되었다 (데이터 미도시). 이 클론은 여러 추정상 기능적 도메인들을 함유하였다: N 말단에 트랜스멤브레인 (TM) 도메인 또는 시그날 펩타이드, 단백질 중간에 제2 TM 도메인, 및 C 말단에 RING 핑거 도메인 (즉, E3 리가아제 도메인의 표식). 본 발명은 이 클론과 Akt 사이의 기능적 커뮤니케이션에 초점을 맞춘 반면, Li et al. [23] 은 이 단백질을 NF-κB의 미토콘드리아 유비퀴틴 리가아제 활성인자를 의미하는 MULAN이라고 명명하였다.

시험관내 풀-다운(pull-down) 연구는 Akt 가 Hades와 물리적으로 상호작용한다는 것을 보여주었다 (도 1A). 내생적(endogenous) Akt 및 Hades 사이의 분자간 연합은 공면역침강(coimmunoprecipitation) 분석법을 이용하여 조사하였다 (도 1B). 인간 Akt 는 3가지 이소폼(isoforms)을 가진다: Akt1, Akt2 및 Akt3. Akt 이소폼-특이적 면역침강 분석법은 Hades가 Akt1 및 Akt2 와 상호작용하나 Akt3와는 상호작용하지 않는다는 것을 보여주었다 (도 1C). 또한, Hades 결핍은 Akt1 및 Akt2 의 단백질 레벨은 증가시키나 Akt3는 그러하지 않았다 (도 7). Akt2는 미토콘드리아로 전위되나 Akt3는 그렇지 않다고 보고되었다 [24]. Akt1의 미토콘드리아 전위는 논란이 있다 [24-26]. 그러나, 본 발명의 실험은 Akt1가 미토콘드리아로 전위될 수 있음을 밝혔다 (도 8A). 또한, 공초점 현미경은 Akt1가 Hades와 공동위치(colocalize)한다는 것을 밝혔다 (도 8B). 일련의 Akt 결여 돌연변이체들을 이용한 시험관내 결합 분석법은 Akt 의 키나아제 도메인이 Hades와 주로 연합한다는 것을 밝혔다 (도 1D 및 1E).

결과 2: Akt 유비퀴틴화 및 분해는 Hades 에 의해 직접 조절된다

Akt 및 Hades사이의 상호작용의 기능적 역할을 결정하기 위하여, Hades가 Akt 를 위한 E3 리가아제로서 기능하는지 조사하였다. Hades 발현은 E3 리가아제 활성-의존적 방식으로 Akt 단백질 레벨의 감소를 초래하였다. 또한, 프로테아좀 저해제 MG132는 이러한 세포내 Akt 단백질 레벨의 감소를 완전히 회복시켰다 (도 2A, 레인 5). 다음, 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo) 유비퀴틴화 분석법은 재조합 및 내생적 Akt 단백질들이 Hades에 의해 E3 리가아제 활성-의존적 방식으로 유비퀴틴화된다는 것을 증명하였다 (도 2B 및 2C). 그 반대 현상이 Hades siRNA-유도된 넉다운 세포에서 관찰되었다. Hades siRNA 형질감염(transfection)은 HEK293 세포에서 Akt 유비퀴틴화의 저해를 초래하였다 (도 2D, 좌측 패널). 흥미롭게도, Akt 와 높은 상동성을 갖는 혈청/글루코코르티코이드 조절 키나아제 1 (SGK1) [27] 는 내생적 Hades의 결핍에 의해 영향을 받지 않았다 (도 2D, 우측 패널).

다양한(diverse) 기질-유비퀴틴 구조를 생성할 수 있는 능력은 서로 다른 운명을 갖는 단백질들을 표적하는 데 중요하다 [28]. 이를 위해서, 라이신 48 또는 63이 아르기닌으로 돌연변이된 HA-태그된 유비퀴틴 (HA-Ub WT, HA-Ub K48R, 및 HA-Ub K63R)을 발현하는 HeLa 세포에서 생체내 유비퀴틴화 분석을 실시하였다. 도 2E에서 보여지듯이, Ub K48R는 Hades-매개된 Akt 유비퀴틴화를 완전히 폐기시키지만, Ub WT 및 Ub K63R는 그렇지 않았다. 이는 K48-링크된 유비퀴틴화 체인이 Akt 의 Hades-매개된 유비퀴틴화 동안에 형성된다는 것을 가르킨다. 이들 결과는 Hades E3 리가아제가 Akt 를 특이적으로 표적화하여 그것의 유비퀴틴화 및 후속 분해를 유도한다는 것을 보여준다.

결과 3: pAkt 는 Hades E3 유비퀴틴 리가아제의 우선적( preferential ) 표적이다

Akt 키나아제 활성의 상향조절이 세린 308 및 트레오닌 473의 인산화에 의해 엄격히 제어되기 때문에 [29], Akt의 활성/불활성 상태가 Hades에 의한 Akt 분해에 영향을 주는지 시험하였다. 이 가설을 시험하기 위해, 우선 성장인자의 자극하에 내생적 Hades 와 Akt 사이의 상호작용을 시험하였다. 흥미롭게도, 내생적 Hades 와 Akt 사이의 상호작용이 HeLa 세포에서 혈청 및 인슐린의 존재하에 검출되었다 (도 3A). 유사하게, Hades-유도된 Akt 분해는 혈청-자극된 HEK293 세포에서 우선적으로 유도되었다 (도 3B). 또한, 생체내 유비퀴틴화 분석법은 혈청 자극이 Hades에 의한 내생적 Akt 유비퀴틴화를 유도한다는 것을 증명하였다 (도 3C). 또한, Akt 의 인산화를 저해하는 PI3K 저해인자인 LY294002는 혈청-자극된 HEK293 세포에서 Hades-유도된 Akt 유비퀴틴화를 억제하였다 (도 3C, 레인 5 내지 8). 이들 관찰은 Akt 활성화 상태 및 Hades-매개된 분해 사이의 연관관계를 제시한다. 이 가설을 증명하기 위해, 인산화된 세린, 트레오닌 및 타이로신 잔기들로의 활성을 갖는 λ-PPase [30, 31]의 존재하에 시험관내 유비퀴틴화 분석법을 실시하였다. λ-PPase 로의 처리는 Akt 잔기들의 인산화를 효율적으로 제거하여 Akt 유비퀴틴화를 저해하였다 (도 3D).

상기 결과들은 혈청 또는 성장인자가 내생적 Akt 의 안정성을 감소시키는지를 시험하도록 이끌었다. 흥미롭게도, Akt 단백질 레벨이 혈청-결핍된 세포에서 약간 감소되었고 혈청-자극된 세포에서 상당히 증가된다는 것을 발견하였으며, 이는 인산화된 Akt가 비인산화된 Akt 보다 더 효율적으로 분해된다는 것을 가리킨다 (도 9). 또한, 혈청-유도된 Akt 분해가 Hades 결핍에 의해 저해된다는 것 (도 3E)과 siRNA-유도된 Hades 결핍이 투여량-의존적 방식으로 Akt 및 pAkt 의 단백질 레벨을 증가시킨다는 것 (도 6F)을 밝혀냈다. 또한, 젤다나마이신(geldanamycin)은 대조 세포 및 Hades-결핍 세포 둘다에서 Akt 분해를 유도하였으며, 이는 Hades-유도된 Akt 분해가 Hsp90 저해제-유도된 Akt 분해에 비의존적이라는 것을 제시한다 (도 10). 총체적으로, 이들 결과는 Hades가 유비퀴틴화를 위해 pAkt를 우선적으로 표적화한다는 것을 가리킨다.

결과 4: 활성화된 Akt 는 Hades 의 폴리유비퀴틴화 표적이다

Akt 활성화는 도메인간 형태 변화 -매개된 인산화에 의해 유도된다 [32, 33]. 다음 우리는 Hades에 의한 영구 활성 Akt 의 세포내 조절을 공면역침강 분석법으로 시험하였다. 미리스토일레이션 시그날-부착 Akt (Akt-myr)는 Akt 의 영구(constitutively) 활성 형태이다 [34]. 공면역침강 실험은 Hades가 이소적으로(ectopically) 발현된 기능적 활성 Akt (Myc/His-Akt-WT 및 Myc/His-Akt-myr)와는 상호작용을 하나, HEK293 세포에서 우성-음성 Akt (Myc/His-Akt-DN)와는 상호작용하지 않는다는 것을 보여주었다 (도 4A). 우리는 Akt 의 유비퀴틴화가 형질감염된 HEK293 세포에서 Akt 활성화에 의존적이라는 것을 생체내 유비퀴틴화 실험을 이용하여 확인하였다 (도 4B). 유사하게, LY294002는 Akt 인산화를 완전히 저해하였으며 Hades-매개된 Akt 분해를 대부분 차단하였다 (도 4C, 레인 4, 5, 및 6). 다른 PI3K/Akt 저해제인 워트만닌(wortmannin) [35] 또한 Hades-매개된 Akt 분해를 차단하였다 (도 11). 이들 결과는 Hades가 pAkt에 우선적으로 결합하여 그것의 분해를 촉진한다는 것을 가리키며, 이는 Hades가 활성 pAkt 를 음성적으로 조절한다는 우리의 결과들과 일치한다.

결과 5: Akt 내의 라이신 284은 Hades 에 의한 유비퀴틴화의 주요부위이다

Akt 는 N-말단의 플렉스트린 상동성 (PH) 도메인, 중앙의 촉매 키나아제 도메인 (KD) 및 C-말단의 짧은 조절 소수성 모티프 (HM)로 구성된다 [36]. Akt 의 인산화는 구조변화를 유도하여 PH 및 HM 도메인들이 KD 도메인으로부터 분리된다 [37]. 시험관내 결합 분석법은 Hades가 Akt-KD뿐만 아니라 Akt WT도 특이적으로 유비퀴틴화한다는 것을 증명하였다 (도 5A). 우리는 다음 Akt-KD의 어떤 라이신 잔기가 단백질 안정화 및 유비퀴틴화에 필요한지를 결정하였다. Akt 단백질 안정화 및 라이신 잔기의 돌연변이사이의 연관관계를 평가하기 위해, 부위-지정 돌연변이에 의해 추정상 유비퀴틴-콘쥬게이션 잔기들(K158, K163, K170, K183, K189, K214, K276, K284, K289, K297 및 K307) 의 Akt 라이신 (K) 에서 아르기닌 (R)으로의 돌연변이들을 생성하였다. 도 12에서 보여지듯이, Akt K284R 의 분해는 Akt WT 및 다른 Akt 돌연변이들에 비해 저해되었다. 또한, 우리는 생체내 유비퀴틴화 분석법을 통해 Akt K284R 가 유의적으로 감소된 유비퀴틴화를 나타낸다는 것을 확인하였다 (도 5B). 또한, 사이클로헥시미드 체이즈 분석법은 Hades가 Akt WT에 비해 Akt K284R의 안정성을 감소시키지 않는다는 것을 보여주었다 (도 5C). 상기 결과는 Akt 내의 라이신 284가 Hades-매개된 Akt 유비퀴틴화의 특이적 잔기라는 것을 가리킨다.

결과 6: Hades 에 의한 Akt 시그날링의 음성 조절

Akt 는 세포 사이클 진행, 세포 생존 및 세포 성장을 조절하는데 중요한 역할을 한다 [38]. 우리는 EGFP-Hades-WT을 발현한느 세포의 성장이 EGFP-Hades-MT 또는 대조 EGFP를 발현하는 세포들의 성장에 비해 유의적으로 억제된다는 것을 발견하였다 (도 6A). Hades-결핍된 세포는 대조군 세포에 비해 더 빨리 성장하였다 (도 13). Hades는 농도-의존적 방식으로 HeLa 세포의 증식을 억제하였다 (도 6B). MTS 분석법은 또한 Akt-매개된 세포 생존율의 증가가 HeLa 세포에서 Hades 과발현에 의해 감소된다는 것을 보여주었다 (도 14). Hades에 의한 세포 성장 저해는 클론원성 및 부착(anchorage)-비의존적 소프트 아가 분석법에 의해 확인하였다 (도 6D). EGFP-Hades-WT 를 발현하는 HeLa 세포는 EGFP-Hades-MT 또는 대조 EGFP를 발현하는 세포들의 콜로니 형성에 비해 콜로니 형성의 50% 감소를 나타내었다 (도 6C). 이들 결과는 Hades가 Akt 다운스크림 시그날링 패스웨이를 조절한다는 것을 가리킨다. GSK-3/β-카테닌/TCF 시그날링은 PI3K/Akt-매개된 세포 생존 및 증식의 중요한 다운스트림 패스웨이이다 [6, 39]. 도 6E에서, 우리는 둘다 Akt 다운스트림 표적 단백질인 GSK-3β 및 TSC2의 인산화가 RING 리가아제 활성-의존적 방식으로 Hades에 의해 억제된다는 것을 보여주었다 (도 6E). 또한, 반대 현상이 Hades siRNA-의존적 방식으로 관찰되었다 (도 6F). TCF/LEF1 응답 요소-구동된 루시퍼라제 시스템에서, pTOPFLASH 리포터 활성을 측정하여 Hades에 의한 Akt 다운스트림 시그날링의 저해를 확인하였다 (도 6G). 합쳐보면, 이들 결과는 Hades가 Akt 시그날링 패스웨이를 조절함으로써 세포 성장을 억제한다는 것을 가리킨다. 우리는 다음 생체내 상처 치유 분석법을 이용하여 Akt-유도된 세포 이주(migration)에 대한 Hades의 효과를 평가하였다. 이소적으로 발현된 WT Hades는 RING 리가아제 MT Hades 보다 더 잘 HeLa 세포 이주를 억제하였으며 (도 6H), Hades siRNA 형질감염은 HeLa 세포 이주를 증가시켰다 (도 15). 이는 Hades E3 리가아제가 Akt 및 그것의 다운스트림 시그날링을 효율적으로 억제한다는 것을 가리킨다.

또한, 우리는 Hades에 의해 조절되는, 세포 성장 및 세포 이주에 대한 Akt K284R의 효과를 시험하였다. Hades는 그것이 Akt-K284R-유도된 세포 성장을 억제하는 것보다 더 효율적으로 Akt-유도된 세포 성장을 억제하였다 (도 6J). 유사하게, Akt-K284R-유도된 세포 이주는 Akt WT-유도된 세포 이주와 대조적으로 Hades에 의해 저해되지 않았다 (도 6I). 이들 결과는 Hades E3 리가아제가 라이신 284에서 Akt 의 유비퀴틴화에 의해 Akt 기능을 효율적으로 억제한다는 것을 가리킨다.

Akt 는 NF-κB 를 활성화한다고 알려졌으며, Hades는 NF-κB 활성화제라고 보고되었다 [23,45]. 따라서, Hades가 NF-κB 활성을 유도하는지 또는 Akt 를 저해하여 NF-κB 활성을 억제하는지 불명확하다. 이 문제를 해결하기 위하여, 우리는 NF-κB-결합 부위를 함유하는 리포터 플라스미드 (NF-κB 루시퍼라제 리포터)를 이용하여 NF-κB 활성을 시험하였다. HeLa 세포를 EGFP 대조군, EGFP-Hades-WT 및 EGFP-Hades-MT로 형질감염시키거나 Myc/His-Akt WT 용 플라스미드들로 공형질감염(cotransfecte)시켰다. 이들 형질감염된 HeLa 세포들에서, Hades WT 및 Hades MT는 NF-κB 활성을 증가시켰으나 (최대 3배), Akt WT에 의한 NF-κB 활성의 상향조절 (최대 7배)은 Hades E3 리가아제-의존적 방식으로 감소되었다 (도 16). 이 결과는 Hades가 NF-κB 활성을 상향조절할 수 있지만, 그 효과는 Akt-매개된 NF-κB 패스웨이에 비의존적이라는 것을 가리킨다.

본 발명자들은 RING 핑거 도메인 및 E3 유비퀴틴 리가아제 활성을 갖는, Akt 의 음성 조절인자인 Hades를 동정하였다. 본 발명에 따르면, Akt 는 Hades와 직접적으로 상호작용하여, Hades에 의해 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo)에서 유비퀴틴화된다. 따라서, 본 발명에 따른 Hades는 Akt를 분해하고 그 다운스티림 시그날링을 음성 조절함으로써 암세포의 증식 및 생존을 억제할 수 있으므로, 항암제로 유용하게 사용될 수 있다.

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13. 다음 단계들을 포함하는 Akt (단백질 키나아제 B) 음성(negative) 조절제의 스크리닝 방법:
    (a) 동물세포에 Akt와 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 Hades를 공-형질감염(cotransfection)시키는 단계;
    (b) 상기 형질감염된 동물세포에 임의의 약제를 처리하는 단계; 및
    (c) 상기 동물세포에서 Akt와 Hades의 상호작용(interaction)이 촉진되는지 여부를 확인하여, 상호작용이 촉진되면 Akt 음성 조절제로 결정하는 단계.
14. 다음 단계들을 포함하는 Akt (단백질 키나아제 B) 양성(positive) 조절제의 스크리닝 방법:
    (a) 동물세포에 Akt와 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 Hades를 공-형질전환(cotransfection)시키는 단계;
    (b) 상기 형질전환된 동물세포에 임의의 약제를 처리하는 단계; 및
    (c) 상기 동물세포에서 Akt와 Hades의 상호작용(interaction)이 저해되는지 여부를 확인하여, 상호작용이 저해되면 Akt 양성 조절제로 결정하는 단계.

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