WO2006137514A1

WO2006137514A1 - シノビオリンの発現もしくは機能阻害物質を有効成分とする癌治療剤、および癌治療剤のスクリーニング方法

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Publication number: WO2006137514A1
Application number: PCT/JP2006/312582
Authority: WO
Inventors: Toshihiro Nakajima; Yukihiro Kato; Tadayuki Yamadera; Tetsuya Amano
Original assignee: Locomogene, Inc.
Priority date: 2005-06-23
Filing date: 2006-06-23
Publication date: 2006-12-28
Also published as: JPWO2006137514A1; US20080305102A1

Abstract

　シノビオリンの機能を阻害することにより、p53癌抑制タンパク質が活性化されることを見出した。シノビオリンの機能を阻害する物質は癌治療剤として有用である。また、シノビオリンの機能を阻害することにより、p53のユビキチン化が阻害されること、p53リン酸化タンパク質の活性が上昇すること等を見出した。当該知見に基づいて、効率的に癌治療剤をスクリーニング可能な方法が提供された。さらにシノビオリンタンパク質の自己ユビキチン化を制御することにより、リウマチ滑膜細胞の増殖が抑制されることを見出した。シノビオリンタンパク質の自己ユビキチン化を制御する物質は、抗リウマチ剤として有用である。また効率的に抗リウマチ剤をスクリーニングする方法が提供された。

Description

明細書

シノビォリンの発現もしくは機能阻害物質を有効成分とする癌治療剤、および癌治療剤のスクリーニング方法

技術分野

[0001] 本発明は、シノビオリンタンパク質の発現または機能阻害物質を有効成分とする p5 3タンパク質活性化剤、および p53タンパク質活性化剤を有効成分とする癌治療剤、並びに、癌治療剤のスクリーニング方法に関する。

また本発明は、シノビォリンタンパク質の自己ュビキチン化を制御する物質を有効成分とする抗リウマチ剤、および抗リウマチ剤のスクリーニング方法に関する。

背景技術

[0002] シノビオリンは、リウマチ患者由来滑膜細胞で過剰発現している膜タンパク質として発見された新規タンパク質である (特許文献 1参照)。そして、遺伝子改変動物を用いた研究により、シノビオリンは関節リウマチの発症に必須の分子であることが判明した。

[0003] タンパク質構造予測システムにより、シノビオリンは RING fingerモチーフを有することが示唆されている。このモチーフはタンパク質のュビキチンィ匕に重要な役割を果たす E3ュビキチンライゲースという酵素に多く見出されている力実際、シノビォリンが E 3ュビキチンライゲースの特徴のひとつである自己ュビキチンィ匕活性を有することが証明されている (特許文献 1参照)。

[0004] ところで、 p53遺伝子は、第 17染色体 pl3に位置しており、癌細胞の発生および増殖においてきわめて重要な癌抑制遺伝子である。 p53タンパク質は、 DNA上の特異的塩基配列 [5'-(A/T)GPyPyPy-3')]を認識し、 p21、 GADD45、 BAX等の特定の遺伝子の転写活性化を促す。また、（0その他の多くの遺伝子の転写を抑制すること、 G0SV4 0ラージ T抗原、アデノウイルス EIBタンパク質、パピローマウィルス E6などのウィルス性癌遺伝子産物、あるいは mdm2等の細胞性癌遺伝子産物と結合すること、（iii)ミスマツチを含む DNAと特異的に結合すること等の生理機能が知られている。

特許文献 1： WO02/052007 発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] 本発明は、癌を抑制する薬剤の提供を目的とする。より具体的には、 p53タンパク質の活性化剤、および該活性化剤を有効成分とする癌治療剤、並びに、該癌治療剤のスクリーニング方法の提供を課題とする。また、シノビォリンタンパク質の自己ュビキチン化を制御する物質を有効成分とする抗リウマチ剤、および抗リウマチ剤のスクリ一二ング方法の提供を課題とする。

課題を解決するための手段

[0006] 本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、シノビオリンホモノックアウト動物を詳細に解析したところ、野生型に比し、アポトーシスを起こしている細胞が多数観察され、また、アポトーシスの誘導に深く関与している p53タンパク質が核内に局在し、強く発現していることが判明した。そして、シノビォリンの機能を阻害することにより、 P53癌抑制遺伝子または p53癌抑制タンパク質が活性化されて癌細胞の増殖が阻止されることを見出した。

また本発明者らは、シノビォリンの機能阻害による P53タンパク質の活性ィ匕のメカ- ズムを解明すベぐさらに詳細な研究を行った。

[0007] そして本発明者らは、シノビオリンタンパク質の発現もしくは機能を阻害することによつて、リン酸ィ匕酵素により _P53力 Sリン酸化されて _P53が活性化されることを見出した。また、シノビォリンの発現もしくは機能を阻害することにより、 p53タンパク質のュビキチンィ匕が阻害され、その結果、 p53タンパク質が活性化されることが見出された。

[0008] さらに本発明者らによって、シノビォリンの発現もしくは機能を阻害することにより、シノビォリンと _P53タンパク質との結合が阻害され、その結果、 p53が活性ィ匕されることが示された。また、シノビォリンにおける p53タンパク質との結合部位を決定することに成功した。

[0009] 本発明者らによって見出された上述の知見から、シノビオリンタンパク質の発現もしくは機能を阻害する物質は、 p53タンパク質の活性化剤として有用であり、また、該活性化剤は癌治療剤となり得ることが示された。

[0010] さらに本発明者らは、本願によって見出された種々の知見を基に、新規癌治療薬の開発を目指し、 p53タンパク質のシノビオリンによるュビキチンィ匕を阻害する物質の取得を試みた。その結果、 p53タンパク質のュビキチンィ匕を阻害する物質として、低分子化合物 Compound X、 Yを実際に取得することに成功した。

[0011] 次に、 Compound X、 Yの培養癌細胞に対する細胞増殖への影響を調べたところ細胞増殖が抑制され、また、 Compound Yでは、細胞内の p53のタンパク発現量の増加がみられた。 Compound X、 Yが培養癌細胞においてシノビオリンによる p53のュビキチンィ匕反応阻害により P53のタンパク発現量を増加させることが示唆された。

[0012] 即ち、 Compound X、 Yがシノビォリンによる p53のュビキチン化を阻害することにより p53タンパク発現量を増力！]させ、抗癌作用を発揮すると考えられる。 p53の安定化、核内への集中的な局在を引き起こすことにより、放射線への感受性を高め治療効率を上げる、集学的治療の一環としての臨床応用も期待される。

[0013] 上述の知見は、該低分子化合物が癌治療剤として有用であることを示すとともに、本発明者らによって見出された知見に基づいて、癌治療剤を効率的にスクリーニングすることが可能であることを示すものである。

[0014] 上述の如く本発明者らは、シノビオリンタンパク質の発現もしくは機能を阻害する物質を含有する P53タンパク質活性化剤、および該活性化剤を含む癌治療剤、並びに、該癌治療剤のスクリーニング方法を開発することに成功し、本発明を完成させた。

[0015] 即ち本発明は、 p53タンパク質の活性化剤、および該活性化剤を有効成分とする癌治療剤、並びに、該癌治療剤のスクリーニング方法に関し、より詳しくは、〔1〕シノビォリンタンパク質の発現および Zまたは機能阻害物質を有効成分として含有する、 P53タンパク質活性化剤、

〔2〕前記発現および Zまたは機能阻害物質が、シノビオリンタンパク質と p53タンパク質との結合を阻害する活性を有する低分子化合物である、〔1〕に記載の p53タンパク質活性化剤、

〔3〕前記発現および Zまたは機能阻害物質が P53タンパク質のュビキチン化を阻害する機能を有する低分子化合物である、〔1〕に記載の p53タンパク質活性化剤、〔4〕前記発現および Zまたは機能阻害物質が、 P53リン酸化タンパク質を活性化する機能を有する低分子化合物である、〔1〕に記載の p53タンパク質活性化剤、 [5] 前記 p53リン酸ィ匕タンパク質力 ATMまたは ATRである、〔4〕に記載の p53タンパク質活性化剤、

〔6〕前記発現および Zまたは機能阻害物質が、以下の (a)〜 (c)力もなる群より選択される化合物である、〔1〕に記載の p53タンパク質活性化剤、

(a)シノビオリン遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸

(b)シノビオリン遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有する核酸

(c)シノビオリン遺伝子の発現を RNAi効果により阻害する作用を有する核酸

〔7〕前記発現および Zまたは機能阻害物質が、以下の (a)または (b)の化合物である、〔1〕に記載の p53タンパク質活性化剤、

(a)シノビオリンタンパク質および Zまたは P53タンパク質と結合する抗体

(b)シノビオリンタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するシノビオリンタンパク質変異体

〔8〕〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の p53タンパク質活性化剤を有効成分とする、癌治療剤、

〔9〕以下の工程 (a)〜（c)を含む、癌治療剤のスクリーニング方法、

(a)シノビオリン遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程

(b)前記細胞におけるシノビオリンタンパク質の発現量または活性を測定する工程

(c)被検化合物を接触させな!ヽ場合と比較して、発現量または活性を低下させる化合物を選択する工程

〔10〕以下の工程 (a)〜（c)を含む、癌治療剤のスクリーニング方法、

(a)シノビオリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有する DNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程

(b)前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程

(c)被検化合物を接触させな、場合と比較して、前記レポーター遺伝子の発現レべルを低下させる化合物を選択する工程

〔11〕以下の工程 (a)〜（c)を含む、癌治療剤のスクリーニング方法、

(a)シノビオリンタンパク質、 p53タンパク質、および被検化合物を接触させる工程

(b)シノビオリンタンパク質と p53タンパク質との結合活性を測定する工程 (c)被検化合物を接触させな!ヽ場合と比較して、前記結合活性を低下させる化合物を選択する工程

〔12〕以下の工程 (a)〜（c)を含む、癌治療剤のスクリーニング方法、

(b) p53タンパク質のュビキチン化を測定する工程

(c)被検化合物を接触させな、場合と比較して、前記ュビキチンィ匕を低下させる化合物を選択する工程

〔13〕以下の工程 (a)〜（c)を含む、癌治療剤のスクリーニング方法、

(a)シノビオリンタンパク質、 p53タンパク質、 p53リン酸化タンパク質、および被検化合物を接触させる工程

(b) p53タンパク質を基質とする p53リン酸ィ匕タンパク質のリン酸ィ匕活性を測定するェ程

(c)被検化合物を接触させな!ヽ場合と比較して、前記リン酸ィ匕活性を上昇させる化合物を選択する工程

〔14〕 p53リン酸化タンパク質が ATMまたは ATRである、〔13〕に記載のスクリー- ング方法、

〔15〕以下の（a)および (b)を構成要素として含む、癌治療剤スクリーニング用キット

(a)シノビオリンタンパク質

(b) p⁵3タンパク質

を、提供するものである。

[0016] さらに本発明は、本発明に記載の p53タンパク質活性化剤あるいは p53タンパク質活性化剤を有効成分とする癌治療剤を投与する工程を含む癌を予防もしくは治療する方法、および本発明に記載の p53タンパク質活性化剤の癌治療剤の製造における使用を提供するものである。

[0017] また本発明者らは、 ELISAによるシノビオリンタンパク質の自己ュビキチンィ匕反応を評価する系を構築し、それによつて得られた 2種の低分子化合物である No.32 (Comp ound X)および No.38 (Compound Y)が低濃度でリウマチ滑膜細胞（RASC)の増殖を抑制することを見出した。

[0018] 上述の知見は、該低分子化合物が抗リウマチ剤として有用であることを示すとともに

、本発明者らによって見出された知見に基いて、抗リウマチ剤を効率的にスクリー- ングすることが可能であることを示すものである。

[0019] 上述の如く本発明者らは、シノビオリンタンパク質の自己ュビキチンィ匕を制御する物質を有効成分とする抗リウマチ剤、および抗リウマチ剤のスクリーニング方法を開発することに成功した。

[0020] 即ち本発明は、さらに

〔16〕シノビォリンタンパク質の自己ュビキチン化を制御する機能を有する物質を有効成分として含有する、抗リウマチ剤、

〔17〕前記シノビオリンタンパク質の自己ュビキチン化を制御する機能を有する物質が低分子化合物である、〔16〕に記載の抗リウマチ剤、

〔18〕前記低分子化合物が、以下の一般式 (I)または (II)に記載の化合物である、〔1 7]に記載の抗リウマチ剤、

〔19〕リウマチ滑膜細胞増殖抑制効果を有することを特徴とする、〔18〕に記載の抗リウマチ剤、

〔20〕以下の工程 (a)〜（c)を含む、抗リウマチ剤のスクリーニング方法、

〔21〕以下の工程 (a)〜（c)を含む、抗リウマチ剤のスクリーニング方法、

(b)前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程

[22] 以下の工程 (a)〜（c)を含む、抗リウマチ剤のスクリーニング方法、

(a)シノビオリンタンパク質および被検化合物を接触させる工程

(b)シノビオリンタンパク質の自己ュビキチンィ匕を測定する工程

(c)被検化合物を接触させない場合と比較して、前記自己ュビキチンィ匕を制御する化合物を選択する工程

〔23〕シノビオリンタンパク質を構成要素として含む、抗リウマチ剤のスクリーニング用³ rット、を提供する。

さらに本発明は、本発明に記載のシノビオリンタンパク質の自己ュビキチン化を制御する機能を有する物質を有効成分とする抗リウマチ剤を投与する工程を含むリウマチ性疾患を予防もしくは治療する方法、および本発明に記載のの自己ュビキチンィ匕を制御する機能を有する物質の抗リウマチ剤の製造における使用を提供するものである。

図面の簡単な説明

[図 1]図 1は、シノビオリンホモノックアウトマウス胎仔線維芽細胞 (MEF)における蛍光免疫組織染色の結果を示す写真である。

[図 2]図 2は、 syno-/-の embryoにおける抗 p53抗体による免疫組織染色の結果を示す写真である。

[図 3]図 3は、 p53に関するウェスタンブロッテイングの結果を示す写真である。

[図 4]図 4は、 syno-/-の MEF培養細胞における p53のリン酸ィ匕部位を同定した結果を示す写真である。

[図 5]図 5は、シノビォリンに対する siRNA処理によって亢進した Serl5のリン酸化が力フェイン添カ卩によりどのように影響するかを調べたウェスタンブロッテイングの写真である。

[図 6]図 6は、シノビオリンに対する siRNA処理による、 p53および p21の発現が高まることを示すウェスタンブロッテイングの写真である。

[図 7]図 7は、フローサイトメーターによる細胞周期の観察結果を示す図である。

[図 8]図 8は、 Tissue arrayを、抗シノビオリン抗体 (lODa)を用いて免疫染色した結果を示す写真である。

[図 9]図 9は、 Tissue arrayを、抗シノビオリン抗体 (lODa)を用いて免疫染色した結果を示す写真である。

[図 10]図 10は、 GFP野生型 p53を導入した細胞における p53の局在を観察した写真である。

[図 11]図 11は、 GFP野生型 p53および FLAG野生型シノビオリンを Saos-2細胞に共発現させ、両導入遺伝子産物の局在を観察した写真である。 [図 12]図 12は、 GFP野生型 p53および FLAGシノビオリン C307Sを Saos-2細胞に共発現させ、両導入遺伝子産物の局在を観察した写真である。

[図 13]図 13は、 MBP-Synoviolin Δ ΤΜ- Hisによる GST- p53の in vitroュビキチン化反応を示す写真である。

[図 14]図 14は、シノビオリン RNAiによる RA滑膜細胞での p53 mRNA量を示すグラフである。

[図 15]図 15は、作製した p53結合ドメイン欠失体の概略図、および結合アツセィを行つた結果を示す図である。

[図 16]図 16は、 p53結合ドメイン欠失体と³⁵ S-p53について GSTプルダウンアツセィを行った結果を示す図である。

[図 17]図 17は、 A： Compound X、 Yの構造式を示す図である。 B: Compound X、 Yの p

53タンパク質ュビキチンィ匕反応阻害活性を示す写真である。

[図 18]図 18は、 Compound X、 Yの細胞毒性への影響を示す図である。

[図 19]図 19は、培養細胞における p53タンパク発現量に対する Compound Yの作用を示す写真である。

[図 20]図 20は、 ELISAを用いた in vitro自己ュビキチン化反応検出時における抗体濃度の影響を示す図である。

[図 21]図 21は、 ELISAを用いた in vitro自己ュビキチン化反応系におけるシノビオリン濃度の影響を示す図である。

[図 22]図 22は、 ELISAを用いた in vitro自己ュビキチン化反応におけるュビキチン化反応時間の影響を示す図である。

[図 23]図 23は、低分子化合物 No.32の細胞増殖抑制効果を示す図である。

[図 24]図 24は、低分子化合物 No.38の細胞増殖抑制効果を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を詳細に説明する。

正常細胞を紫外線等にさらすと、細胞内の p53が活性ィ匕して、その結果細胞増殖が阻止されることから、 p53の濃度を上昇させることにより、癌細胞の増殖を止めることができる。つまり、 p53が機能しない場合は、癌細胞の増殖が止められず、癌が進行することになる。事実、 p53変異は正常な個体の細胞にはほとんど見られないが、癌患者由来の細胞の約半数においてはこの p53の欠損又は点変異が起こっている。また、このような変異が起こっていない場合でも、 p53の制御機構に何らかの変異が生じて癌抑制機能が失われている。従って、癌の進行を抑えるには p53を有効に機能させることが必要である。

[0023] 本発明者らは、 p53タンパク質の活性ィ匕を癌治療の有効な方法の一つとするため、シノビオリン (synoviolin)の機能に着目した。そして、シノビオリンホモノックアウト動物を作製し、詳細に解析したところ、野生型に比してアポトーシスを起こしている細胞が多数観察された。即ち、シノビォリンの機能を阻害すると、アポトーシスに深く関与している p53タンパク質の活性ィ匕が促進され、シノビオリンの機能阻害が癌抑制につな力 ¾ことを見出した。

[0024] 本発明者らは、シノビオリンタンパク質の発現および Zまたは機能 (活性)を阻害（抑制）することによって、 p53タンパク質が活性ィ匕することを見出した。即ち本発明は、シノビオリンタンパク質の発現および Zまたは機能阻害物質を有効成分として含有する、 p53タンパク質活性化剤を提供する。

[0025] 本発明のシノビオリンタンパク質は、ヒトのシノビオリンタンパク質であることが好ましいが、その由来する生物種は特に制限されず、ヒト以外の生物におけるシノビオリンと同等なタンパク質 (シノビォリンのホモログ.オルソログ等)も本発明における「シノビォリンタンパク質」に含まれる。例えば、ヒト p53に相当するタンパク質を有し、かつ、ヒトのシノビォリンと同等なタンパク質を有する生物であれば、本発明を実施することは可能である。

[0026] シノビオリン、および p53のヒト並びにその他の生物における「相当するタンパク質」の名称、 mRNA、アミノ酸配列のァクセッション番号を、表 1に示す。

[0027] [表 1]

シノビオリン

生物種正式名称 mRNAのァクセッション番号 Proteinのァクセッション番号ヒ卜 Synoviolin AB024690. BAC57449 1

マウス Hrd1 NM 023249 NP 075738.1

ラッ卜 synoviolinl XM 341999 XP 342000.2

ゼブラフィッシュ MGC : 55735 BC044465 AAH44465.1

キイ口ショウジヨウ/くェ sip3 NM 143637 NP 651894.3

線虫 5M249 NM 073568 NP 505969.1

[0028] ヒトのシノビオリン遺伝子の公共遺伝子データベース Genbankにおけるァクセッション番号は、 AB024690 (配列番号： 1)である。

[0029] ヒトにおけるシノビオリンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号： 1に示す。また該塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号： 2に示す。上記以外のタンパク質であっても、例えば配列表に記載された配列と高い相同性 (通常 70%以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上 )を有し、かつ、シノビオリンタンパク質が有する機能 (例えば p53タンパク質と結合する機能、 p53リン酸化タンパク質の活性を阻害する機能、 p53のュビキチンィ匕を促進する機能等）を持つタンパク質は、本発明のシノピオリンに含まれる。上記タンパク質とは、例えば、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が付加、欠失、置換、挿入されたアミノ酸配列力もなるタンパク質であって、通常変化するアミノ酸数が 30アミノ酸以内、好ましくは 10アミノ酸以内、より好ましくは 5アミノ酸以内、最も好ましくは 3アミノ酸以内である。

[0030] 本発明における「シノビオリン遺伝子」には、例えば、配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAに対応する他の生物における内在性の遺伝子 (ヒトのシノビオリン遺伝子のホモログ等）が含まれる。

[0031] また、配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAに対応する他の生物の内在性の DNAは、一般的に、配列番号： 1に記載の DNAと高い相同性を有する。高い相同性とは、 50%以上、好ましくは 70%以上、さらに好ましくは 80%以上、より好ましくは 90 %以上 (例えば、 95%以上、さらには 96%、 97%、 98%または 99%以上)の相同性を意味する。この相同性は、 mBLASTアルゴリズム (Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA 87: 2264—8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7)によって決定することができる。また、該 DNAは、生体内から単離した場合、配列番号： 1に記載の DNAとストリンジヱントな条件下でノヽイブリダィズすると考えられる。ここで「ストリンジェントな条件」としては、例えば「2 X SSC、 0.1%SDS、 50°C」、「2 X SSC、 0.1%SDS、 42°C」、「1 X SSC、 0.1%SDS、 37°C」、よりストリンジェントな条件として「2 X SSCゝ 0.1%SDSゝ 65°C」、「0.5 X SSC、 0.1%SDSゝ 42°C」および「0.2 X SSC、 0.1 %SDS、 65°C」の条件を挙げることができる。当業者においては、他の生物におけるシノビオリン遺伝子に相当する内在性の遺伝子を、シノビオリン遺伝子の塩基配列を基に適宜取得することが可能である。なお、本明細書においては、ヒト以外の生物におけるシノビオリンタンパク質 (遺伝子）に相当するタンパク質 (遺伝子）、あるいは、上述のシノビォリンと機能的に同等なタンパク質 (遺伝子）を、単に「シノビオリンタンパク質 (遺伝子) Jと記載する場合がある。

[0032] 本発明の「シノビオリンタンパク質」は、天然のタンパク質のほか、遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質は、例えばシノビオリンタンパク質が発現して、ると考えられる細胞 (組織)の抽出液に対し、シノビオリンタンパク質に対する抗体を用いたァフィユティークロマトグラフィーを用いる方法により調製することが可能である。一方、組換えタンパク質は、シノビオリンタンパク質をコードする DNAで形質転換した細胞を培養することにより調製することが可能である。本発明の「シノビオリンタンパク質」は、例えば、後述のスクリーニング方法において好適に用いられる。

[0033] 本発明にお、て「発現」とは遺伝子からの「転写」あるいはポリペプチドへの「翻訳」及びタンパク質の「分解抑制」によるものが含まれる。「シノビオリンタンパク質の発現」とは、シノビオリンタンパク質をコードする遺伝子の転写および翻訳が生じること、またはこれらの転写 ·翻訳によりシノビオリンタンパク質が生成されることを意味する。また、「シノビォリンタンパク質の機能」とは、例えば、シノビォリンが p53と結合する機能、 p 53リン酸ィ匕タンパク質の活性を抑制する機能、 p53のュビキチン化を促進する機能、または p53の活性ィ匕を抑制する機能等を挙げることができる。 [0034] 上述の各種機能は、当業者においては、一般的な技術を用いて、適宜、評価 (測定)することが可能である。具体的には、後述の実施例に記載の方法、あるいは該方法を適宜改変して実施することができる。

[0035] 従って、「シノビオリンタンパク質の発現および Zまたは機能を阻害する」とは、野生型シノビォリン遺伝子またはタンパク質の量、機能または活性と比較して、その量、機能または活性を低下または消失させることをいう。上記「阻害」には、機能と発現の両者を阻害すること、およびどちらか一方を阻害することのいずれもが含まれる。

[0036] シノビオリンは p53のュビキチン化を促進するため、シノビォリンと p53との結合を阻害することにより、 p53のュビキチンィ匕を阻害することができる。また、 p53のュビキチン化を阻害することにより、 P53が活性化され癌が抑制される。

[0037] 本発明において「p53タンパク質活性化剤」とは、より具体的には p53タンパク質の発現および Zまたは機能を亢進 (上昇)させるような機能を有する薬剤と、うことができる。

[0038] 本発明の上記阻害物質としては、好ましくは、低分子化合物を挙げることができる。

従って、本発明の好ましい態様においては、シノビオリンタンパク質の発現および Z または機能を阻害する低分子化合物を有効成分として含有する、 P53タンパク質活性化剤を提供する。

[0039] 本発明者らによって、シノビオリンタンパク質の発現もしくは機能を阻害することにより、 p53タンパク質のュビキチンィ匕が阻害され、その結果、 p53タンパク質が活性ィ匕されることが見出された。

シノビオリンは、 p53のュビキチンィ匕を促進するものと考えられる。ュビキチン化とは、タンパク質の分解マーカー分子であるュビキチンによるタンパク質の翻訳後の修飾反応をいう。このュビキチンィ匕の生理的意義は、プロテオソーム系のタンパク質分解機構へ送られるためのタグ修飾として、従来認識されていた。そして、その後の研究により、現時点でのュビキチンィ匕の意義は、タンパク質機能を制御する可逆的タンパク質修飾システムとして位置づけられて、る。

[0040] ュビキチンィ匕は、具体的には、ュビキチン活性ィ匕酵素（E1)、ュビキチン結合酵素（ E2)およびュビキチンリガーゼ (E3)などの酵素が協同したカスケード反応を繰り返すことにより、基質となるタンパク質にュビキチン分子を枝状に結合させてポリュビキチン鎖を形成する過程をいう。このポリュビキチン鎖は、ュビキチン分子内の 48番目のリシン残基の ε -アミノ基を介して形成され、 26Sプロテアノームへの分解シグナルとなり、標的タンパク質を分解に導く。

[0041] 本発明は、シノビォリンの発現および Ζまたは機能を阻害することにより Ρ53を活性化させることを特徴とし、このような ρ53の活性ィ匕は、上記 ρ53のリン酸化機構とは別に、 ρ53のュビキチンィ匕が阻害されるという機構に着目したものである。

本発明におけるシノビオリンタンパク質の発現および Ζまたは機能を阻害する低分子化合物は、好ましくは、 _Ρ53タンパク質のュビキチンィ匕を阻害する機能を有するィ匕合物である。

[0042] 本発明者らは、後述の実施例に示すように、シノビォリンによる ρ53のュビキチンィ匕の促進活性を阻害する低分子化合物 (Compound X, Y)を同定することに成功した。本発明における低分子化合物として、例えば、本発明者らによって同定された以下の一般式 (iXCompound X)または一般式 (II)(Compound Y)で表される化合物を具体的に示すことができる。

[0043]

[0045] 上記一般式 (I)および (II)で表される化合物は、ナミキ商事 (AMBINTER)より取得可能である。（カタログ No.はそれぞれ、 A0420/0019436、 A1328/0060050である。）また、本発明において有効成分となる一般式 (I)または (II)の化合物は、該化合物において薬学的に許容される塩であってもよい。さらに、該化合物の塩にカ卩えて、例えば、該化合物の水和物、溶媒和物、異性体等が含まれる。これらの化合物も同様に P53活性ィ匕作用もしくは癌抑制作用を有することが期待される。

[0046] 本発明にお、て「塩」とは、本発明の化合物（一般式 (I)または（II)の化合物）と塩を形成し、かつ薬理学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば、無機酸塩、有機酸塩、無機塩基塩、有機塩基塩、酸性または塩基性アミノ酸塩などがあげられる。通常、本発明において「塩」とは、通常、薬学的に許容される塩を言う。

[0047] 無機酸塩の好ま、例としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などがあげられ、有機酸塩の好ましい例としては、例えば酢酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クェン酸塩、乳酸塩、ステアリン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、 p—トルエンスルホン酸塩などがあげられる。

[0048] 無機塩基塩の好ましい例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、ァンモ -ゥム塩などがあげられ、有機塩基塩の好ましい例としては、例えばジェチルァミン塩、ジエタノールアミン塩、メグルミン塩、 N, N，一ジベンジルエチレンジァミン塩などがあげられる。

[0049] 酸性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばァスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などが挙げられ、塩基性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばアルギニン塩、リジン塩、オル-チン塩などがあげられる。

本発明に係る化合物の単離，精製は、抽出、濃縮、留去、結晶化、ろ過、再結晶、各種クロマトグラフィーなどの通常の化学操作を適用して行うことができる。

[0050] 本発明にお、ては、化合物の構造式が便宜上一定の異性体を表すことがあるが、本発明には化合物の構造上生ずるすべての幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、立体異性体、互変異性体等の異性体および異性体混合物を含み、便宜上の式の記載に限定されるものではなぐいずれか一方の異性体でも混合物でもよい。従つて、本発明の化合物には、分子内に不斉炭素原子を有し光学活性体およびラセミ体が存在することがありうるが、本発明においては限定されず、いずれもが含まれる。

[0051] また、本発明に係る化合物にっ、て得られる種々の異性体 (例えば幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、回転異性体、立体異性体、互変異性体等)は、通常の分離手段、例えば再結晶、ジァステレオマー塩法、酵素分割法、種々のクロマトグラフィー（例えば薄層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィ一、等)を用いることにより精製し、単離することができる。

[0052] また本発明者らによって、シノビォリンが p53と結合し、 p53の機能を阻害する機能を有することが分力つた。つまり、シノビォリンの発現および Zまたは機能を阻害することにより、シノビォリンと p53との結合が阻害され、 p53の機能が活性ィ匕される。

従って、本発明におけるシノビオリンタンパク質の発現および Zまたは機能を阻害する低分子化合物は、好ましくは、シノビオリンタンパク質と p53タンパク質との結合（相互作用）を阻害する機能を有する化合物である。

[0053] シノビオリンタンパク質の p53結合ドメインは、例えば、シノビォリンのアミノ酸配列のうち、特定の領域を欠失させた、 p53結合ドメイン欠失体を数種類作製して、 ³⁵S-p53 について GSTプルダウンアツセィを行うことにより決定することができる。具体的には、上記のシノビォリンの P53結合ドメイン欠失体を GST-融合タンパク質として大腸菌等で発現させて、 ³⁵S-p53タンパク質とのタンパク質-タンパク質間結合を GSTプルダウンアツセィ法により確認する。

[0054] 上記方法により、シノビォリンにおける p53結合ドメインは、シノビオリンタンパク質に含まれるアミノ酸配列（配列番号： 2)の第 236から 270番目までの 35アミノ酸残基であることが判明した。

従って、上記の化合物として、例えば、シノビオリンタンパク質の 236位から 270位の 35アミノ酸領域をターゲットとして、 p53との結合を阻害する化合物が挙げられる。

[0055] また本発明者らによって、シノビオリンタンパク質の発現もしくは機能を阻害することによって、 p53タンパク質のアミノ酸残基の一部がリン酸化酵素によりリン酸化され、活性ィ匕することが見出された。

従って、本発明におけるシノビオリンタンパク質の発現および Zまたは機能を阻害する低分子化合物は、好ましくは、 p53リン酸ィ匕タンパク質を活性ィ匕する機能を有する化合物である。

[0056] p53タンパク質の活性ィ匕につながるリン酸ィ匕の対象となるアミノ酸残基は、 p53のアミノ酸配列のうちセリン残基であることが好ましぐ第 15番目のセリン残基 (Serl5)がさらに好ましい。

従って、上記の化合物として、例えば、 p53の 15位のセリン残基を基質とするリン酸化タンパク質の活性を上昇させる機能を有する化合物を挙げることができる。

[0057] p53の Serl5がリン酸ィ匕されると、 p53の発現が高まり、転写活性が亢進し、その結果転写産物が増加する。この p53の Serl5のリン酸化には、 ATM(ataxia-telangiectasia m utated)、 ATR(ataxia- telangiectasia related),等のリン酸化酵素が深く関与している。 ATMは、ヒトの常染色体性劣性遺伝疾患である毛細血管拡張性運動失調症の原因タンパク質であり、 DNAの損傷を感知して癌抑制遺伝子 p53をリン酸ィ匕することで細胞の増殖をコントロールする機能を有する。 ATRは、 ATMのファミリーの一つであるが、広範囲にわたる化学療法薬、紫外線の照射、あるいはタンパクリン酸ィ匕酵素の抑制により誘導され、かつ、 ATMが関与しない p53の活性ィ匕に関与するリン酸ィ匕酵素である。

[0058] ATMおよび ATRは、カフェインによりその機能が阻害されることが知られているが、本発明にお、ては、シノビォリンの発現および/または機能の阻害実験にカフェインを用いることにより、シノビォリンが ATMおよび ATR活性ィ匕を調節して、ることが判明した。 [0059] 即ち、カフェイン非存在下にお、て、シノビォリンの発現および/または機能を阻害すると p53が活性ィ匕される。一方、カフェイン存在下でシノビォリンの発現および/または機能を阻害すると、 p53の活性ィ匕は抑制される。また、カフェインにより ATMおよび ATRの活性 (p53のリン酸化）が阻害されることは知られて、る。

[0060] カフェインにより ATMおよび ATRの活性を阻害することにより、シノビォリンの発現および/または機能を阻害しても P53は活性ィ匕されな、ことから、シノビォリンの発現および/または機能を阻害すると、 ATMおよび ATRによる p53の活性ィ匕を誘導するとヽぅメ力-ズムが考えられる。そうすると、シノビォリンの発現および/または機能を阻害することによりこれらのリン酸ィ匕酵素活性が高められるといえる。従って、本発明は、シノビォリンの発現および/または機能を阻害することにより、リン酸化酵素の活性化を促進することを特徴とする。 ATMおよび ATRと同様の活性を有する酵素等 (p53をリン酸ィ匕する酵素等）は、 DNA-PKまたは GSK3 β等でも良い。

従って、本発明において「ρ53リン酸ィ匕タンパク質」とは、 ρ53を基質としてリン酸化し得るタンパク質であれば特に制限されないが、通常、 ATM、 ATR、 DNA-PKまたは GS K3 β等を指し、より好ましくは、 ATMもしくは ATRである。

[0061] p53の Serl5がリン酸ィ匕されることにより発現が誘導される物質としては、 p21というタンパク質が知られている。 p21は、サイクリン依存性リン酸化酵素（CDK)活性の阻害剤として機能し、 CDK活性を阻害することにより、細胞周期の調節を担うタンパク質である。 CDKは、細胞周期の抑制の要となり、そのパートナーであるサイクリンタンパク質と共に機能し、例えば、細胞の休止状態である G1期力も DNAの複製期である S期へのスムーズな移行を司る。癌細胞において、 p53が活性ィ匕されると、 CDK阻害剤である p21の発現が高まるため、癌細胞の G1期力も S期への移行が妨げられることにより癌が抑制される。従って、本発明は、上記のように、シノビォリンの発現および/または機能を阻害させることにより、 p53の活性化を高めて p21の発現を誘導させ、 CDKの阻害を起こすことにより癌を抑制することを特徴とする。

[0062] なお本発明における、上記低分子化合物は、天然由来の化合物または人工的に合成された化合物のいずれであってもよい。通常、当業者に公知の方法を用いることによって製造または取得可能な化合物である。また本発明の化合物は、後述のスクリ一二ング方法によって、取得することも可能である。

[0063] さらに本発明におけるシノビオリンタンパク質の発現および Zまたは機能阻害物質として、例えば以下の（a)または (b)の化合物を挙げることができる。

[0064] シノビオリンタンパク質および Zまたは P53タンパク質に結合する抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。

[0065] ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることができる。天然のシノピオリンタンパク質および Zまたは P53タンパク質、あるいは GSTとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物にぉ、て発現させたリコンビナント (組み換え)シノビオリンタンパク質および Zまたは P53タンパク質、またはその部分ペプチドをゥサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテイン A、プロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、シノビオリンタンパク質および/または p53タンノク質や合成ペプチドをカップリングしたァフィユティーカラム等により精製することにより調製する。

[0066] また、モノクローナル抗体であれば、例えばシノビオリンタンパク質および Zまたは P 53タンパク質若しくはその部分ペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞 (ハイブリドーマ）の中から、シノビオリンタンパク質および Zまたは P53タンパク質に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたノ、イブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテイン A、プロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、シノビォリンタンパク質および/または _P53タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたァフィユティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。

[0067] 本発明の抗体は、本発明のシノビオリンタンパク質および Zまたは P53タンパク質に結合するものであれば特に制限はなぐ上記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のほかにヒト抗体、遺伝子組み換えによるヒト型化抗体、さらにその抗体断片ゃ抗体修飾物であってもよい。上記抗体は、 p53との結合に関与するシノビオリンタンパク質の第 236から 270番目のアミノ酸領域を認識する抗体であることが好ましい。該抗体は、効果的にシノビォリンと P53との結合を阻害することが期待される。

[0068] 抗体取得の感作抗原として使用される本発明のシノビオリンタンパク質および Zまたは p53タンパク質はその由来となる動物種について制限されないが、哺乳動物、例えばマウスやヒト由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ま、。ヒト由来のタンパク質は、当業者においては本明細書に開示される遺伝子配列またはアミノ酸配列を用いて適宜取得することができる。

[0069] 本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質あるいはタンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、タンパク質のアミノ基 (N)末端断片やカルボキシ (C)末端断片が挙げられる。本明細書における「抗体」とはタンパク質の全長または断片に反応する抗体を意味する。

[0070] また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えば EBウィルスに感染したヒトリンパ球を in vitroでタンパク質、タンパク質発現細胞またはその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエ口一マ細胞、例えば U266と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイプリドーマを得ることもできる。

[0071] 本発明のシノビオリンタンパク質および Zまたは P53タンパク質に対する抗体は、シノビオリンタンパク質および/または p53タンパク質と結合することにより、シノビオリンタンパク質の発現もしくは機能を阻害し、例えば _P53タンパク質の活性ィ匕する効果が期待される。得られた抗体を人体に投与する目的 (抗体治療)で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型化抗体が好ま、。

[0072] さらに本発明のシノビオリンタンパク質の発現もしくは機能を阻害し得る物質として、シノビォリンタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するシノビオリンタンノク質変異体 (シノビオリンドミナントネガティブタンパク質)を挙げることができる。「シノビオリンタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するシノビオリンタンパク質変異体」とは、該タンパク質をコードする遺伝子を発現させることによって、内在性の野生型タンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク質を指す

。このようなシノビオリンドミナントネガティブタンパク質としては、例えば、 p53との結合を野生型シノビォリンと競合阻害するようなシノビオリンタンパク質変異体を挙げることができる。より具体的には、 p53との結合ドメインを含むシノビオリンタンパク質の部分断片ペプチドを挙げることができる。シノビオリンタンパク質のアミノ酸配列にぉ、て 2 36位〜 270位のアミノ酸領域を含む断片ペプチドは、上記ドミナントネガティブタンパク質の好まし、一例である。

[0073] 本発明にお、てシノビオリンタンパク質の発現および Zまたは機能阻害物質には、例えばシノビオリン遺伝子の転写もしくは該転写産物力の翻訳を阻害する物質が含まれる。本発明の上記物質の好ましい態様として、例えば以下の（a)〜（c)からなる群より選択される化合物 (核酸)を挙げることができる。

[0074] 本発明における「核酸」とは RNAまたは DNAを意味する。また所謂 PNA (peptide nu cleic acid)等の化学合成核酸アナログも、本発明の核酸に含まれる。 PNAは、核酸の基本骨格構造である五単糖 ·リン酸骨格を、グリシンを単位とするポリアミド骨格に置換したもので、核酸によく似た 3次元構造を有する。また所謂 LNA(Locked Nucleic Ac id)も本発明の核酸に含まれる。

[0075] 特定の内在性遺伝子の発現を阻害する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を阻害する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。即ち、三重鎖形成による転写開始阻害、 RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつある RNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエタソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのノ、イブリツド形成によるスプライシング阻害、 mRNAとのハイブリッド形成による核力細胞質への移行阻害、キヤッビング部位やポリ (A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、 mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を阻害する (平島および井上，新生化学実験講座 2核酸 IV遺伝子の複製と発現，日本生化学会編，東京化学同人， 1993, 319-347.)。

[0076] 本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用によりシノビオリン遺伝子の発現および Zまたは機能を阻害してもよい。一つの態様としては、シノビォリン遺伝子の mRNAの 5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは 3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、シノビオリン遺伝子の翻訳領域だけでなぐ非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは 3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで所望の動物（細胞）に形質転換することができる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される動物 (細胞）が有する内在性のシノビオリン遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写された RNAは標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは 90% 以上、最も好ましくは 95%以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子 (シノビオリン)の発現を効果的に阻害するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも 15塩基以上 25塩基未満であることが好ましいが、本発明のアンチセンス核酸は必ずしもこの長さに限定されず、例えば 100塩基以上、または 500塩基以上であってもよい。

[0077] 本発明のアンチセンス核酸は特に制限されな、が、例えば GenBankのァクセッション番号 AB024690で取得されるシノビォリン遺伝子の塩基配列（配列番号： 1)等をもとに作成することができる。

[0078] また、シノビオリン遺伝子の発現の阻害は、リボザィム、またはリボザィムをコードする DNAを利用して行うことも可能である。リボザィムとは触媒活性を有する RNA分子を指す。リボザィムには種々の活性を有するものが存在する力中でも RNAを切断する酵素としてのリボザィムに焦点を当てた研究により、 RNAを部位特異的に切断するリボザィムの設計が可能となった。リボザィムには、グループ Iイントロン型や RNase Pに含まれる Ml RNAのように 400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーへッド型ゃヘアピン型と呼ばれる 40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子，タンパク質核酸酵素， 1990, 35, 2191.)。

[0079] 例えば、ハンマーヘッド型リボザィムの自己切断ドメインは、 G13U14C15という配列の C15の 3'側を切断する力その活性には U14と A9との塩基対形成が重要とされ、 C1 5の代わりに A15または U15でも切断され得ることが示されている（Koizumi, M. et al.， FEBS Lett, 1988, 228, 228.) ₀基質結合部位が標的部位近傍の RNA配列と相補的なリボザィムを設計すれば、標的 RNA中の UC、 UUまたは UAという配列を認識する制限酵素的な RNA切断リボザィムを作出することができる（Koizumi, M. et al.， FEBS Le tt, 1988, 239, 285.、小泉誠および大塚栄子，タンパク質核酸酵素， 1990, 35, 2191. 、 Koizumi, M. et al, Nucl Acids Res, 1989, 17, 7059.)。

[0080] また、ヘアピン型リボザィムも本発明の目的に有用である。このリボザィムは、例えばタバコリングスポットウィルスのサテライト RNAのマイナス鎖に見出される（Buzayan, JM., Nature, 1986, 323, 349.)。ヘアピン型リボザィムからも、標的特異的な RNA切断リボザィムを作出できることが示されている（Kikuchi, Y. & Sasaki, N., Nucl Acids Res, 1991, 19, 6751.、菊池洋，化学と生物， 1992, 30, 112.)。このように、リボザィムを用いて本発明におけるシノビオリン遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を阻害することができる。

[0081] 内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖 RNAを用いた RNA干渉（RNA interference,以下「RNAi」と略称する）によっても行うことができる。

[0082] RNAi効果による阻害作用を有する核酸は、一般的に siRNAもしくは shRNAとも呼ばれる。 RNAiは、標的遺伝子の mRNAと相同な配列力もなるセンス RNAとこれと相補的な配列力なるアンチセンス RNAと力なる短鎖二本鎖 RNA (以下、「dsRNA」と略称する）を細胞等に導入することにより、標的遺伝子 mRNAに特異的かつ選択的に結合して破壊を誘導し、当該標的遺伝子を切断することにより標的遺伝子の発現を効率よく阻害する（抑制する）現象である。例えば、 dsRNAを細胞内に導入すると、その RN Aと相同配列の遺伝子の発現が抑制（ノックダウン)される。このように RNAiは、標的遺伝子の発現を抑制し得ることから、従来の煩雑で効率の低い相同組換えによる遺伝子破壊方法に代わる簡易な遺伝子ノックアウト方法として、または、遺伝子治療への応用可能な方法として注目されている。 RNAiに用いる RNAは、シノビオリン遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と必ずしも完全に同一である必要はないが、完全な相同性を有することが好まし、。

[0083] siRNAの設計は、以下の通り行うことができる。

(a)シノビオリンをコードする遺伝子であれば特に限定されるものではなぐ任意の領域を全てターゲット候補とすることが可能である。例えば、ヒトの場合では、 GenBan kァクセッション番号 AB024690 (配列番号： 1)の任意の領域を候補にすることができる。

(b)選択した領域から、 AAで始まる配列を選択し、その配列の長さは 19〜25塩基、好ましくは 19〜21塩基である。その配列の GC含量は、例えば 40〜60%となるものを選択するとよい。具体的には、配列番号： 1に示される塩基配列のうち、以下の塩基配列から選ばれる少なくとも 1つの配列を含む DNAを siRNAの標的配列として使用することができる。特に、（0 (配列番号: 3)、 GO (配列番号 :4)、(vi) (配列番号 : 8)、(vii) (配列番号: 9)、（viii) (配列番号 : 10)を標的とすることが好ましい。

[0084] (0 AA TGTCTGCATCATCTGCCGA GA (配列番号： 3)

(ii) AA GCTGTGACAGATGCCATCA TG (配列番号： 4)

(iii) AA AGCTGTGACAGATGCCATC AT (配列番号： 5)

(iv) AA GAAAGCTGTGACAGATGCC AT (配列番号： 6)

(v) AA GGTTCTGCTGTACATGGCC TT (配列番号： 7)

(vi) AA CAAGGCTGTGTACATGCTC TA (配列番号： 8) (vii) AA ATGTTTCCACTGGCTGGCT GA (配列番号： 9)

(viii) AA GGTGTTCTTTGGGCAACTG AG (配列番号： 10)

(ix) AA CATCCACACACTGCTGGAC GC (配列番号： 11)

(x) AA CACCCTGTATCCAGATGCC AC (配列番号： 12)

(xi) AA GGTGCACACCTTCCCACTC TT (配列番号： 13)

(xii) AA TGTTTCCACTGGCTGGCTG AG (配列番号： 14)

(xiii) AA GAGACTGCCCTGCAACCAC AT (配列番号： 15)

(xiv) AA CGTTCCTGGTACGCCGTCA CA (配列番号： 16)

[0085] siRNAを細胞に導入するには、 in vitroで合成した siRNAをプラスミド DNAに連結してこれを細胞に導入する方法、 2本の RNAをァニールする方法などを採用することができる。

[0086] また本発明の好ましい siRNAの一例として、配列番号： 18に記載されたセンス鎖と、配列番号： 19に記載されたアンチセンス鎖とをァニールさせた 2本鎖 RNAを示すことができる。該 RNAは、より具体的には、以下のような構造の RNA分子である。

5' GGU GUU CUU UGG GCA ACU G TT 3' (配列番号 : 1 8 )

3' TT CCA CAA GAA ACC CGU 瞧 (配列番号 : 1 9 )

(上記「I」は水素結合を表す。）

[0087] なお、上記 RNA分子は、一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有する siRNA(shRNA)であってもよい。 shRNAとは、ショートヘアピン RNA(short hairpin RNA)と呼ばれ、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有する RNA分子である。即ち、分子内において二本鎖 RNA構造を形成し得る分子もまた本発明の siRNAに含まれる。

[0088] また、本発明の好ま、態様としては、シノビオリン遺伝子の発現を RNAi効果により抑制し得る RNA (siRNA)であって、本明細書によって具体的に示された DNA配列（配列番号： 3〜16)を標的とする siRNA、または配列番号： 18および 19によって形成される siRNAの塩基配列において、例えば、 1もしくは少数の RNAが付加もしくは欠失された構造の二本鎖 RNAであっても、シノビオリン遺伝子の発現を抑制する機能を有するものであれば、本発明の siRNAに含まれる。

RNAi(siRNA)のために使用される RNAは、シノビオリン遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と完全に同一湘同)である必要はないが、完全な同一湘同)性を有することが好ましい。

[0089] RNAi機構の詳細については未だに不明な部分もある力 DICERといわれる酵素（R Nase III核酸分解酵素ファミリーの一種）が二本鎖 RNAと接触し、二本鎖 RNAが small i nterfering RNAまたは siRNAと呼ばれる小さな断片に分解されるものと考えられて!/、る。本発明における RNAi効果を有する二本鎖 RNAには、このように DICERによって分解される前の二本鎖 RNAも含まれる。即ち、そのままの長さでは RNAi効果を有さないような長鎖の RNAであっても、細胞にお!、て RNAi効果を有する siRNAへ分解されることが期待されるため、本発明における二本鎖 RNAの長さは特に制限されない。

[0090] 例えば、本発明のシノビオリン遺伝子の mRNAの全長もしくはほぼ全長の領域に対応する長鎖二本鎖 RNAを、例えば、予め DICERで分解させ、その分解産物を本発明の薬剤として利用することが可能である。この分解産物には、 RNAi効果を有する二本鎖 RNA分子 (siRNA)が含まれることが期待される。この方法によれば、 RNAi効果を有することが期待される mRNA上の領域を、特に選択しなくともよい。即ち、 RNAi効果を有する本発明のシノビオリン遺伝子の mRNA上の領域は、必ずしも正確に規定される必要はない。

[0091] 本発明の上記「RNAi効果を有する二本鎖 RNA」は、当業者においては、該ニ本鎖 RNAの標的となる本発明のシノビオリン遺伝子の塩基配列を基に、適宜作製することができる。一例を示せば、配列番号： 1に記載の塩基配列をもとに、本発明の二本鎖 RNAを作製することができる。即ち、配列番号： 1に記載の塩基配列をもとに、該配列の転写産物である mRNAの任意の連続する RNA領域を選択し、この領域に対応する二本鎖 RNAを作製することは、当業者においては、通常の試行の範囲内において適宜行ぃ得ることである。また、該配列の転写産物である mRNA配列から、より強い RNA i効果を有する siRNA配列を選択することも、当業者においては、公知の方法によって適宜実施することが可能である。また、一方の鎖 (例えば、配列番号： 1に記載の塩基配列）が判明して!/、れば、当業者にお!、ては容易に他方の鎖 (相補鎖)の塩基配列を知ることができる。 siRNAは、当業者においては市販の核酸合成機を用いて適宜作製することが可能である。また、所望の RNAの合成については、一般の合成受託サ一ビスを利用することができる。

[0092] また、本発明における siRNAは、必ずしも全てのヌクレオチドがリボヌクレオチド (RN A)でなくともよい。即ち、本発明において、 siRNAを構成する 1もしくは複数のリボヌクレオチドは、対応するデォキシリボヌクレオチドであってもよい。この「対応する」とは、糖部分の構造は異なるものの、同一の塩基種 (アデニン、グァニン、シトシン、チミン（ゥラシル)）であることを指す。例えば、アデニンを有するリボヌクレオチドに対応するデォキシリボヌクレオチドとは、アデニンを有するデォキシリボヌクレオチドのことを言う。また、前記「複数」とは特に制限されないが、好ましくは 2〜5個程度の少数を指す

[0093] さらに、本発明の上記 RNAを発現し得る DNA (ベクター)もまた、本発明のシノビオリン遺伝子の発現を抑制し得る化合物の好ましい態様に含まれる。例えば、本発明の上記二本鎖 RNAを発現し得る DNA (ベクター）は、該ニ本鎖 RNAの一方の鎖をコードする DNA、および該ニ本鎖 RNAの他方の鎖をコードする DNA力それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有する DNAである。本発明の上記 DNAは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、本発明の RNAをコードする DNAを公知の種々の発現ベクターへ適宜揷入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。

[0094] さらに、本発明の上記 RNAを発現し得る DNA (ベクター)もまた、本発明のシノビオリン遺伝子の発現を抑制し得る化合物の好ましい態様に含まれる。例えば、本発明の上記二本鎖 RNAを発現し得る DNA (ベクター）は、該ニ本鎖 RNAの一方の鎖をコードする DNA、および該ニ本鎖 RNAの他方の鎖をコードする DNA力それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有する DNAである。本発明の上記 DNAは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、本発明の RNAをコードする DNAを公知の種々の発現ベクターへ適宜揷入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。

[0095] また、本発明の発現阻害物質には、例えば、シノビォリンの発現調節領域 (例えば、プロモーター領域）と結合することにより、シノビォリンの発現を阻害する化合物が含まれる。該化合物は、例えばシノビォリンのプロモーター DNA断片を用いて、該 DN A断片との結合活性を指標とするスクリーニング方法により、取得することが可能である。また、当業者においては、所望の化合物について、本発明のシノビォリンの発現を阻害する力否かの判定を公知の方法、例えばレポーターアツセィ法等により適宜実施することができる。

[0096] さらに、本発明の上記 RNAを発現し得る DNA (ベクター)もまた、本発明のシノビオリン遺伝子の発現を阻害し得る化合物の好ま、態様に含まれる。例えば本発明の上記二本鎖 RNAを発現し得る DNA (ベクター）は、該ニ本鎖 RNAの一方の鎖をコードする DNA、および該ニ本鎖 RNAの他方の鎖をコードする DNA力それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有する DNAである。本発明の上記 DNAは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、本発明の RNAをコードする DNAを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。

本発明の上記ベクターの好ま、態様としては、シノビォリンの発現を阻害する siR NAを発現するベクターを挙げることができる。

[0097] また本発明の発現阻害物質には、例えばシノピオリンの発現調節領域 (例えば、プ口モーター領域）と結合することにより、シノビォリンの発現を阻害する化合物が含まれる。該化合物は例えばシノビォリンのプロモーター DNA断片を用いて、該 DNA断片との結合活性を指標とするスクリーニング方法により、取得することが可能である。また、当業者においては、所望の化合物について、本発明のシノビォリンの発現を阻害する力否かの判定を公知の方法、例えばレポーターアツセィ法等により適宜実施することができる。

[0098] 本発明の p53タンパク質活性化剤は、癌抑制タンパク質である p53を活性ィ匕することにより癌細胞の増殖を阻止する作用を有する。従って、本発明は、本発明の p53タンパク質活性化剤を有効成分とする、癌治療剤を提供する。

[0099] シノビォリンの発現もしくは機能を阻害すると、リン酸ィ匕酵素により p53がリン酸ィ匕されて p53が活性ィ匕し、サイクリン依存性リン酸ィ匕酵素阻害タンパク質である p21タンパク質の発現を高め、その結果、癌細胞の G1期から S期への移行を妨げることにより、癌の発生または増殖を抑制するものと考えられる。

従って、本発明の p53タンパク質活性化剤を含有する薬剤は、 p21タンパク質活性ィ匕剤、あるいは、細胞周期（特に G1期から S期への移行)阻害剤となり得る。

[0100] なお p53が関与する疾患については、上述の癌の他にも、例えば神経変性疾患が知られている（実験医学、増刊号、 2001、 p53研究の新たな挑戦、 p.122-127)。そのため本発明の p53タンパク質活性化剤は、神経変性疾患に対する治療剤ともなり得ると考えられる。

[0101] また、本発明の「癌治療剤」は、「癌細胞増殖抑制剤」、「癌細胞発生抑制剤」、「腫瘍増殖抑制剤」、「抗癌剤」、あるいは「制癌剤」と表現することも可能である。また、本発明において「治療剤」は、「医薬品」、「医薬組成物」、「治療用医薬」等と表現することちでさる。

[0102] なお、本発明における「治療」には、癌の発生を予め抑制し得る予防的な効果も含まれる。また、癌細胞 (組織）に対して、必ずしも、完全な治療効果を有する場合に限定されず、部分的な効果を有する場合であってもよい。

[0103] 本発明の薬剤は、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合し、医薬組成物として経口、あるいは非経口的に投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型とすることができる。非経口剤としては、注射剤、点滴剤、外用薬剤、あるいは座剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。外用薬剤には、経鼻投与剤、あるいは軟膏剤等を示すことができる。主成分である本発明の薬剤を含むように、上記の剤型とする製剤技術は公知である。

[0104] 例えば、経口投与用の錠剤は、本発明の薬剤に賦形剤、崩壊剤、結合剤、および滑沢剤等を加えて混合し、圧縮整形することにより製造することができる。賦形剤には、乳糖、デンプン、あるいはマン-トール等が一般に用いられる。崩壊剤としては、炭酸カルシウムやカルボキシメチルセルロースカルシウム等が一般に用いられる。結合剤には、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、あるいはポリビニルピロリドンが用いられる。滑沢剤としては、タルクゃステアリン酸マグネシウム等が公知である。

[0105] 本発明の薬剤を含む錠剤は、マスキングや、腸溶性製剤とするために、公知のコーティングを施すことができる。コーティング剤には、ェチルセルロースやポリオキシェチレングリコール等を用いることができる。

[0106] また注射剤は、主成分である本発明の薬剤を適当な分散剤とともに溶解、分散媒に溶解、あるいは分散させること〖こより得ることができる。分散媒の選択により、水性溶剤と油性溶剤のいずれの剤型とすることもできる。水性溶剤とするには、蒸留水、生理食塩水、あるいはリンゲル液等を分散媒とする。油性溶剤では、各種植物油ゃプロピレングリコール等を分散媒に利用する。このとき、必要に応じてパラベン等の保存剤を添加することもできる。また注射剤中には、塩ィ匕ナトリウムゃブドウ糖等の公知の等張化剤をカ卩えることができる。更に、塩ィ匕ベンザルコ-ゥムゃ塩酸プロ力インのような無痛化剤を添加することができる。

[0107] また、本発明の薬剤を固形、液状、あるいは半固形状の組成物とすることにより外用剤とすることができる。固形、あるいは液状の組成物については、先に述べたものと同様の組成物とすることで外用剤とすることができる。半固形状の組成物は、適当な溶剤に必要に応じて増粘剤を加えて調製することができる。溶剤には、水、ェチルアルコール、あるいはポリエチレングリコール等を用いることができる。増粘剤には、一般にベントナイト、ポリビュルアルコール、アクリル酸、メタクリル酸、あるいはポリビ -ルピロリドン等が用いられる。この組成物には、塩ィ匕ベンザルコ -ゥム等の保存剤を加えることができる。また、担体としてカカオ脂のような油性基材、あるいはセルロース誘導体のような水性ゲル基材を組み合わせることにより、座剤とすることもできる。

[0108] 本発明の薬剤を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の薬剤を注射により直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、ヘルぺスゥイノレスベクター、ワクシニアウイノレスベタター、レトロウイノレスベタター、レンチウィルスべクタ一等が挙げられ、これらのウィルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。

[0109] また、本発明の薬剤をリボソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。 siRNAや shRNAを保持させた小胞体をリポフエクシヨン法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内、動脈内等に全身投与する。癌組織等に局所的に投与することもできる。

[0110] 本発明の薬剤は、安全とされている投与量の範囲内において、ヒトを含む哺乳動物に対して、必要量 (有効量)が投与される。本発明の薬剤の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、最終的には医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。一例を示せば、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なる力例えばアデノウイルスの場合の投与量は 1日 1回あたり 10⁶〜10¹³個程度であり、 1週〜 8週間隔で投与される。

[Oil 1] また、 siRNAまたは shRNAを目的の組織または器官に導入するために、巿販の遺伝子導入キット（例えばアデノエクスプレス：クローンテック社)を用いることもできる。

[0112] 本発明の薬剤を使用する場合は、適用部位もしくは癌種は特に限定されず、脳腫瘍、舌癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、脾臓癌、胆道癌、胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、皮膚癌、各種白血病（例えば急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、成人型 T細胞白血病、悪性リンパ腫)、等を対象として適用される。上記癌は、原発巣であっても、転移したものであっても、他の疾患と併発したものであってもよ！/、。

[0113] また本発明は、シノビオリン遺伝子の発現量を指標とする、癌治療剤のスクリーニング方法を提供する。

シノビォリン遺伝子の発現量を低下 (抑制）させる化合物は、癌治療のための薬剤となることが期待される。本発明のスクリーニング方法によって、癌治療剤もしくは癌治療剤のための候補ィ匕合物を効率的に取得することができる。

[0114] 本発明の方法の好ましい態様は、以下の（a)〜（c)の工程を含む、癌治療剤のスクリーニング方法である。

(b)前記細胞におけるシノビオリン遺伝子の発現量を測定する工程

(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、発現量を低下させる化合物を選択する工程

[0115] 上記方法においてはまず、シノビォリン遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる。用いられる「細胞」の由来としては、ヒト、マウス、ラット等に由来する細胞が挙げられるが、これらに由来する細胞に特に制限されず、シノビオリンを発現するように形質転換された大腸菌、酵母等の微生物細胞を利用することも可能である。「シノピオリン遺伝子を発現する細胞」としては、内在性のシノビオリン遺伝子を発現している細胞、または外来性のシノビオリン遺伝子が導入され、該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。外来性のシノビオリン遺伝子が発現した細胞は、通常シノピオリン遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。該発現べクタ一は、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。

[0116] 本方法に用いる被検化合物としては、特に制限されないが、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられる。

[0117] シノビオリン遺伝子を発現する細胞への被検化合物の「接触」は、通常シノビオリン遺伝子を発現する細胞の培養液に被検化合物を添加することによって行うが、この方法に限定されない。被検化合物がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現する DNAベクターを、該細胞へ導入することにより、上記「接触」を行うことができる。

[0118] 本方法においては次いで、該シノビオリン遺伝子の発現量を測定する。ここで「遺伝子の発現」には、転写および翻訳の双方が含まれる。遺伝子の発現量の測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。

[0119] 例えば、シノビオリン遺伝子を発現する細胞から mRNAを定法に従って抽出し、この mRNAを铸型としたノーザンハイブリダィゼーシヨン法、 RT-PCR法、 DNAアレイ法等を実施することによって該遺伝子の転写量の測定を行うことができる。また、シノビオリン遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し、シノビオリンタンパク質の発現を SDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳量の測定を行うこともできる。さらに、シノビオリンタンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンプロッティング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳量の測定を行うことも可能である。シノビオリンタンパク質の検出に用!、る抗体としては、検出可能な抗体であれば特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。

[0120] 本方法にお!、ては、次、で、被検化合物を接触させな、場合 (対照）と比較して、該発現量を低下させる化合物を選択する。低下させる化合物は癌治療のための薬剤となる。

[0121] また本発明のスクリーニング方法の他の態様は、シノビオリンタンパク質の活性を指標とする方法である。上記方法は、例えば以下の（a)〜（c)の工程を含む、癌治療剤のスクリ一二ング方法である。

(a)シノビオリンタンパク質、または該タンパク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液と被検化合物を接触させる工程

(b)前記細胞におけるシノビオリンタンパク質の活性を測定する工程

(c)被検化合物を接触させなヽ場合と比較して、前記タンパク質の活性を低下させる化合物を選択する工程

[0122] 本方法においてはまず、シノビォリンタンパク質または該タンパク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液と被検化合物を接触させる。

[0123] 次いで、シノビオリンタンパク質の活性を測定する。シノビォリンタンパク質の活性としては、例えば p53タンパク質との結合活性 (相互作用活性）、 p53タンパク質のュビキチンィ匕を促進させる活性、 p53リン酸ィ匕タンパク質の活性ィ匕を阻害する活性等が挙げられる。該活性の測定は当業者においては公知の手法、例えば、免疫沈降法、プルダウンアツセィ、酵母ツーハイブリッド法等によって適宜実施することができる。

[0124] さらに被検化合物を接触させない場合 (対照）と比較して、該タンパク質の活性を低下 (抑制）させる化合物を選択する。低下 (抑制）させる化合物は癌治療のための薬剤となる。

[0125] 本発明のスクリーニング方法の他の態様は、本発明のシノビオリン遺伝子の発現レベルを低下させる化合物をレポーター遺伝子の発現を指標として選択する方法である。 [0126] 本発明の上記方法の好ま、態様は以下の (a)〜 (c)の工程を含む、癌治療剤のスクリーニング方法である。

(b)前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程

[0127] 本方法においてはまず、シノビオリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有する DNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる。ここで「機能的に結合した」とは、シノビォリン遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、シノビォリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが結合して、ることを、う。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、シノビオリン遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。シノビオリン遺伝子の cDNA塩基配列に基づいて、当業者においては、ゲノム中に存在するシノビオリン遺伝子の転写調節領域を周知の方法により取得することが可能である。

[0128] 本方法に用いるレポーター遺伝子としては、その発現が検出可能であれば特に制限はなぐ例えば、 CAT遺伝子、 lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、および GFP遺伝子等が挙げられる。「シノビオリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有する DNAを含む細胞」として、例えば、このような構造が挿入されたベクターを導入した細胞が挙げられる。このようなベクターは、当業者に周知の方法により作製することができる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフエクシヨン法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。「シノビオリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有する DNAを含む細胞」には、染色体に該構造が挿入された細胞も含まれる。染色体への DNA構造の挿入は、当業者に一般的に用いられる方法、例えば、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により行うことができる。

[0129] 「シノビオリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有する DNAを含む細胞抽出液」とは、例えば、市販の試験管内転写翻訳キットに含まれる細胞抽出液に、シノビォリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有する DNAを添加したものを挙げることができる。

[0130] 本方法における「接触」は、「シノビオリン遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有する DNAを含む細胞」の培養液に被検化合物を添加する、または該 DNAを含む上記の市販された細胞抽出液に被検化合物を添カロすること〖こより行うことができる。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンノク質を発現する DNAベクターを、該細胞へ導入することにより行うことも可能である

[0131] 本方法においては、次いで、該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポ一ター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子が CAT遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフエ-コールのァセチルイ匕を検出することによって、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。レポーター遺伝子が lac Z遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、さらに、 GFP遺伝子である場合には、 GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。

[0132] 本方法においては、次いで測定したレポーター遺伝子の発現レベルを被検化合物の非存在下にお、て測定した場合 (対照）と比較して、低下 (抑制）させる化合物を選択する。低下 (抑制）させる化合物は、癌治療のための薬剤もしくは癌治療のための候補化合物となる。

[0133] また本発明のスクリーニング方法の別の態様としては、シノビオリンタンパク質と p53 タンパク質との結合活性を指標とする方法を挙げることができる。本発明のシノビオリンタンパク質は p53タンパク質に対して結合 (相互作用）活性を有するタンパク質である。従って、シノビオリンタンパク質と p53タンパク質の結合活性を指標として、該結合活性を低下 (抑制）させる物質を選択することにより、癌治療のための薬剤のスクリーニングを行うことが可能である。

[0134] 本発明の上記方法は例えば以下の（a)〜（c)の工程を含む、癌治療剤のスクリーニング方法である。

(b)シノビオリンタンパク質と p53タンパク質との結合活性を測定する工程

(c)被検化合物を接触させな!ヽ場合と比較して、前記結合活性を低下させる化合物を選択する工程

[0135] 本方法においてはまずシノビオリンタンパク質、 p53タンパク質、および被検化合物を接触させる。次ヽでシノビオリンタンパク質と p53タンパク質との結合活性を測定する。

[0136] 通常シノビオリンタンパク質と p53タンパク質との結合 (相互作用）活性を測定することは当業者にぉ、ては簡便に行、得ることであり、上記工程 (b)の結合活性の測定は、一般的な方法、例えば免疫沈降法およびプルダウンアツセィ等を利用して、適宜実施することが可能である。

[0137] また上記方法に使用するシノビオリンタンパク質および p53タンパク質は、変異を含まな、野生型タンパク質であることが好ま、が、結合 (相互作用）活性を有するものであれば、これらタンパク質の一部のアミノ酸が置換'欠失されたタンパク質 (ポリぺプチド)であってもよい。

[0138] 上記方法において用いられるシノビオリンタンパク質は、変異を含まない野生型タンパク質 (全長タンパク質)であることが好まヽが、 p53タンパク質との結合活性を保持している限り、その部分断片ペプチドであってもよぐまた、タンパク質の一部のアミノ酸配列が置換'欠失されたタンパク質 (ポリペプチド)であってもよい。

[0139] p53タンパク質との結合に関与するシノビオリンタンパク質における領域は、シノビォリンタンパク質のアミノ酸配列（配列番号： 2)における 236〜270位の領域である。従つて、本スクリーニング方法において、 236〜270位のアミノ酸領域を含むシノビオリンタンパク質の断片ポリペプチドを好適に使用することができる。

[0140] 上記方法は次ヽで、被検化合物を接触させな!/ヽ場合 (対照）と比較して、該結合活性を低下 (抑制）させる化合物を選択する。低下 (抑制）させる化合物は癌治療のための薬剤となる。

[0141] また本発明のスクリーニング方法の別の態様としては、 p53タンパク質のュビキチン化を指標とする方法を挙げることができる。本発明のシノビオリンタンパク質は、 p53タンパク質のュビキチン化を促進させる機能を有するタンパク質である。従って p53タンノク質のュビキチンィ匕を指標として、該ュビキチン化を低下 (抑制）させる物質を選択することにより、癌治療のための薬剤のスクリーニングを行うことが可能である。

[0142] 本発明の上記方法は、例えば以下の（a)〜（c)の工程を含む、癌治療剤のスクリーニング方法である。

(b) p53タンパク質のュビキチン化を測定する工程

[0143] 本方法においてはまずシノビオリンタンパク質、 p53タンパク質、および被検化合物を接触させる。次、で p53タンパク質のュビキチンィ匕の程度を測定する。

当業者においては、一般的な手法によって、 p53タンパク質のュビキチンィ匕の程度を測定することが可能である。

[0144] 一例を示せば、 GST-p53および MBP-Synoviolin Δ ΤΜ- Hisを用いて in vitroュビキチン化反応の測定を行う。まず pGEX/p53を保持した大腸菌 (BL21)抽出液より GST- p53を GSH-セファロース榭脂を用いて精製し、透析後の試料を用いて、 MBP-Synovi olin Δ ΤΜ- Hisおよび他の in vitroュビキチン化反応に用いる組成物（ATP、 PK- His- HA-Ub、 yeast El、 His-UbcH5c)を組み合わせて反応を行う。反応後、タンパク質を S DS-PAGEにより分離し、 PVDF膜上に転写して抗 p53抗体 (FL393あるいは DO- 1)により膜上の p53タンパク質を検出することによって、 in vitroュビキチンィ匕の測定を行うことがでさる。

[0145] 上記方法は次、で、被検化合物を接触させな、場合 (対照）と比較して、ュビキチン化の程度を低下 (抑制）させる化合物を選択する。低下 (抑制）させる化合物は癌治療のための薬剤もしくは癌治療のための候補ィ匕合物となる。

[0146] また本発明のスクリーニング方法の別の態様としては、 p53タンパク質を基質とする p 53リン酸ィ匕タンパク質のリン酸ィ匕活性を指標とする方法を挙げることができる。シノビォリンタンパク質は、 p53リン酸ィ匕タンパク質のリン酸ィ匕活性を阻害することにより、 p53 の活性を阻害する。従って、 p53リン酸ィ匕タンパク質の活性を上昇させる物質は、 p53 を活性化させる機能を有することが期待される。

[0147] 本発明は、以下の（a)〜（c)の工程を含む、癌治療剤のスクリーニング方法である。

[0148] 本方法にお!、てはまず、シノビォリンタンパク質、 p53タンパク質、および被検化合物を接触させる。次、で p53タンパク質を基質とした p53リン酸化タンパク質のリン酸化活性を測定する。

[0149] 本発明にお、て「p53リン酸化タンパク質」とは、上述のように、 p53を基質としてリン酸化し得るタンパク質であれば特に制限されないが、通常、 ATM、 ATR、 DNA-PKまたは GSK3 β等を指し、より好ましくは、 ATMもしくは ATRである。

[0150] 上記方法におヽて使用する p53リン酸化タンパク質は変異を含まなヽ野生型タンパク質であることが好まし、が、 p53タンパク質をリン酸ィ匕する活性を有するものであれば、 p53リン酸ィ匕タンパク質の一部のアミノ酸が置換'欠失されたタンパク質 (ポリぺプチド)であってもよい。

[0151] また基質となる p53タンパク質も、変異を含まない野生型タンパク質 (全長タンパク質 )であることが好ましいが、 p53リン酸ィ匕タンパク質によってリン酸ィ匕を受ける限り、その部分断片ペプチド (ペプチド断片）であってもよぐまた、タンパク質の一部のアミノ酸配列が置換'欠失されたタンパク質 (ポリペプチド)であってもよい。さらに好ましくは、リン酸ィ匕を受ける部位を含む、部分ポリペプチドもしくは該部位を含む変異ポリぺプチドであってもよい。

[0152] 上記方法にお!、て p53リン酸ィ匕タンパク質によってリン酸ィ匕を受ける p53タンパク質上の部位は特に制限されるものではないが、好ましくは P53タンパク質のアミノ酸配列 (例えば配列番号： 17に記載のアミノ酸配列）における 15位のセリン残基である。従つて、本方法においては、 15位のセリン残基を含む p53の断片ポリペプチドを好適に使用することができる。

p53リン酸ィ匕タンパク質のリン酸ィ匕酵素活性は、上述にように例えばリン酸ィ匕特異的抗体を用いたウェスタンプロット法等により測定することができる。

[0153] 上記方法においてはさらに、被検化合物を接触させない場合と比較して、前記 p53 リン酸ィ匕タンパク質のリン酸ィ匕活性を上昇させる化合物を選択する。通常、使用する p 53もしくは p53の断片ペプチドにおけるリン酸ィ匕の状態を指標として、適宜選択することができる。このようにして選択された化合物は、 p53リン酸ィ匕タンパク質の p53タンパク質を基質とするリン酸化活性を促進させ、その結果、癌細胞の増殖を阻害し、癌治療効果を有することが期待される。

[0154] また本発明は、本発明のスクリーニング方法を実施するために用いられる、各種薬剤 ·試薬等を含むキットを提供する。

[0155] 本発明のキットは、例えば本発明の上述の各種試薬の中から、実施するスクリー- ング方法にあわせて適宜選択することができる。例えば本発明のキットは、少なくとも本発明の（a)シノビオリンタンパク質、（b) p53タンパク質を構成要素とすることができる。本発明のキットには、さらに、本発明の方法において使用される各種試薬、容器等を含めることができる。例えば、抗シノビォリン抗体、抗リン酸化 Ser抗体、プローブ、各種反応試薬、細胞、培養液、対照サンプル、緩衝液、使用方法を記載した指示書等を適宜含めることができる。

[0156] 本発明の好ま、態様にぉ、ては、シノビオリンタンパク質の発現および Zまたは機能が阻害されているかどうかを検出する工程を含む、癌治療剤のスクリーニング方法である。従って、該スクリーニング方法において、シノビオリンタンパク質の検出の際に利用可能な、シノビオリン遺伝子に対するプローブもしくは該遺伝子の任意の領域を増幅するためのプライマー等のオリゴヌクレオチド、または、シノビオリンタンパク質を認識する抗体 (抗シノビオリンタンパク質抗体)も、本発明の癌治療剤スクリー- ング用キットの構成要素に含めることができる。

[0157] 上記オリゴヌクレオチドは、例えば、本発明のシノビオリン遺伝子の DNAに特異的にハイブリダィズするものである。ここで「特異的にハイブリダィズする」とは、通常のハイブリダィゼーシヨン条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件下 (ί列 X·は、サムフノレツグら, Molecular Cloning,し old Spring Harbour Laboratory Press, New York,USA,第 2版 1989に記載の条件）において、他のタンパク質をコードする DN Aとクロスハイブリダィゼーシヨンを有意に生じな、ことを意味する。特異的なハイプリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、シノビオリン遺伝子の塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。

[0158] 本発明においてハイブリダィゼーシヨンの条件としては、例えば「2 X SSC、 0.1 %SD S、 50。C」、「2 X SSC、 0.1%SDS、 42。C」、「1 X SSC、 0.1%SDS、 37°C」、よりストリンジェントな条件として「2 X SSC、 0.1%SDS、 65°C」、「0.5 X SSC、 0.1%SDS、 42°C」および「 0.2 X SSC、 0.1%SDS、 65°C」等の条件を挙げることができる。より詳細には、 Rapid- hy b buffer (Amersham Life Science)を用いた方法として、 68°Cで 30分間以上プレハイブリダィゼーシヨンを行った後、プローブを添加して 1時間以上 68°Cに保ってハイブリツド形成させ、その後 2 X SSC、 0.1%SDS中、室温で 20分間の洗浄を 3回行い、続いて 1 X SSC、 0.1%SDS中、 37°Cで 20分間の洗浄を 3回行い、最後に 1 X SSC、 0.1%SDS中、 50°Cで 20分間の洗浄を 2回行うことができる。その他、例えば Expresshyb Hybridizat ion Solution (CLONTECH)中、 55°Cで 30分間以上プレハイブリダィゼーシヨンを行つた後、標識プローブを添カ卩して 37〜55°Cで 1時間以上インキュベートし、 2 X SSC、 0.1 %SDS中、室温で 20分間の洗浄を 3回、 1 X SSC、 0.1%SDS中、 37°Cで 20分間の洗浄を 1回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダィゼーシヨン、ハイブリダィゼーシヨンや 2度目の洗浄の際の温度をより高く設定することにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。例えば、プレハイブリダィゼーシヨンおよびハイブリダィゼーシヨンの温度を 60°C、さらにストリンジヱントな条件としては 68°Cとすることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、プローブの塩基配列構成、反応時間等のその他の条件を加味し、条件を設定することができる。

[0159] 該オリゴヌクレオチドは、上記本発明のスクリーニング用キットにおけるプローブやプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常 15bp 100bpであり、好ましくは 17bp 30bpである。プライマーは、本発明のシノビオリン遺伝子の DNAの少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。

[0160] 本発明にお、て、胎児胚における p53の免疫染色を行ったところ、シノビォリンホモノックアウトマウス胎児胚では全身において P53が強く発現することが分力つた。また、シノビォリンホモノックアウトマウス胎児胚カも単離した胎仔線維芽細胞 (MEF)も、野生型から単離したものに比して強く発現しており、し力も p53は核内に強く局在した。この核局在は野生型ではまったく観察されな力つた。また、シノビォリンと p53を強発現させると、 p53は細胞質内にシノビォリンと共局在した。このことは、シノビオリンの発現および/または機能を阻害することにより、 P53を核内へ移行させることができることを意味する。

[0161] さらに、シノビオリンホモノックアウトマウス胎仔 MEFでは、高い放射線感受性または紫外線感受性を示した。従って、本発明において、癌細胞中のシノピオリンの発現および/または機能を阻害して P53を癌細胞の核に移行させた後に、癌細胞に対して放射線照射または紫外線照射を行うと、癌細胞の増殖を効果的に抑制することができる。放射線照射手段は、特に限定されるものではないが、例えば γ線を l 10Gy照射することができる。また、紫外線照射は、紫外線 (波長 100 400 好ましくは 290 400 nm)を、適当な紫外線照射装置 (フナコシ社、デルマレイ社、キーエンス社製等)を用いて照射することができる。

[0162] さらに、核に局在化した p53を含む細胞 (特に癌細胞）に、さらに抗癌剤を接触させることにより、効率良く癌を抑制することが可能である。あるいは、上記核に局在化した P53を含む癌細胞の周囲の脈管 (例えば血管またはリンパ管）に塞栓を施すことで、癌を抑制することもできる。

[0163] 「抗癌剤」には、アルキル化剤、代謝拮抗薬、微小管阻害薬、白金錯化合物、分子標的治療薬などが含まれる。これらの抗癌剤の具体例として以下のものを挙げることができる力これらに限定されるものではない。

ぐアルキル化剤 >

マスタード系：シクロホスフアミド (エンドキサン）、メルファラン等

アジリジン系：チォテパ等

ァノレキノレスノレホン系：ブスノレファン等

ニトロソ尿素系：ニムスチン、口ムスチン等

く代謝拮抗薬〉

葉酸誘導体：メトトレキセート等

プリン誘導体:メルカプトプリン、ァザチォプリン等

ピリミジン誘導体： 5—フルォロウラシル、テガフール、カルモフール等

く微小管阻害薬〉

ビンカァノレカロイド：ビンクリスチン、ビンブラスチン等

タキサン：パクリタキセル、ドセタキセル等

くホルモン類似薬〉

タモキシフェン、エストロゲン等

く白金錯化合物〉

シスプラチン、カルポプラチン等

く分子標的治療薬〉

イマ二チブ、リツキシマブ、ゲフィ二チブ等

抗癌剤を癌細胞に接触させるための方法は、 p53が核に局在化した細胞が含まれる細胞または組織 (癌細胞または癌組織）に、抗癌剤を添加する方法、あるいは担癌患者または担癌動物に抗癌剤を投与する方法などが採用される。この場合の抗癌剤の処理量は、特に限定されるものではないが、添加する場合には 100 pM〜100 /ζ Μ 、好ましくは 1 ηΜ〜10 /ζ Μである。動物体内に投与するときは、例えば抗癌剤としてエンドキサンを使用するときは、 0.1〜100 mg/kg/day、好ましくは 2〜25 mg/kg/dayである。エンドキサン以外の抗癌剤についても、当業者は投与量または添加量を適宜設定することができる。 [0165] 核に局在化した p53を含む癌細胞の周囲の脈管に塞栓を施すには、 p53が核に局在化した癌細胞が含まれる細胞集団または組織の周囲の血管に血栓を形成させてもよぐ血管またはリンパ管については脂肪による塞栓、空気やガスによる塞栓を形成させてもよい。

[0166] また本発明は、本発明の p53タンパク質活性化剤あるいは p53タンパク質活性化剤を有効成分とする癌治療剤を個体 (例えば、患者等)へ投与することを特徴とする、癌を予防もしくは治療する方法に関する。本発明の予防もしくは治療方法における個体とは、好ましくはヒトである力特に制限されず非ヒト動物であってもよい。

[0167] 個体への投与は、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など当業者に公知の方法により行うことができる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。

[0168] さらに本発明は、本発明の p53タンパク質活性化剤の癌治療剤の製造における使用に関する。

[0169] また本発明は、シノビォリンタンパク質の自己ュビキチン化を制御する機能を有する物質を有効成分として含有する、抗リウマチ剤を提供する。本発明の上記物質としては、好ましくは低分子化合物を挙げることができる。即ち本発明の好ましい態様においては、シノビオリンタンパク質の自己ュビキチン化を制御する機能を有する低分子化合物を有効成分として含有する、抗リウマチ剤を提供する。

[0170] 具体的には本発明者らは、シノビォリンタンパク質の自己ュビキチン化反応を評価するアツセィ系を構築することに成功し、そのアツセィ系カもシノビオリンタンパク質の自己ュビキチン化を制御する機能を有する上記一般式 (I) (Compound X)または一般式 (Π) (Compound Y)で表される 2種の低分子化合物を取得することに成功した。

[0171] 従って本発明の好ましい態様においては、上記一般式 (I)または (II)に記載の化合物を有効成分として含有する抗リウマチ剤を提供する。

[0172] 上記一般式 (I)または (II)で表される化合物については、それぞれ上述した通りである。

[0173] また本発明において抗リウマチ剤における有効成分となる一般式 (I)または (II)に記載の化合物は、該化合物において薬学的に許容される塩であってもよい。さらに該化合物の塩に加えて、例えば該化合物の水和物、溶媒和物、異性体等が含まれる。これらの化合物も同様に抗リウマチ作用を有することが期待される。

[0174] 本発明において「塩」とは、本発明の化合物（一般式 (I)または (II)に記載の化合物）と塩を形成し、かつ薬理学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば、無機塩、有機酸塩、無機塩基塩、有機塩基塩、酸性または塩基性アミノ酸などが挙げられる。通常本発明において「塩」とは薬学的に許容される塩をいう。また上記塩の好まし、態様にっ、ては上述した通りである。

[0175] また本発明者らは、上述の一般式 (I)または (II)に記載の化合物がそれぞれリウマチ滑膜細胞 (RASC)の増殖抑制効果を有することを見出した。即ち本発明の好ま U、態様においては、上記一般式 (I)または (II)に記載の化合物がリウマチ滑膜細胞増殖抑制効果を有することを特徴とする、抗リウマチ剤を提供する。

[0176] 本発明の抗リウマチ剤は、上述のようにリウマチ滑膜細胞の増殖を抑制する効果を有する。例えばリウマチ性疾患の一つである慢性関節リウマチ (RA)では、リウマチ滑膜細胞の過増殖や活性ィ匕が主な病変として知られている。そのため、リウマチ滑膜細胞の増殖を抑制することができれば、慢性関節リウマチを含むリウマチ性疾患の治療に有用であると考えられる。

[0177] 本発明における「リウマチ」には、いわゆるリウマチ性疾患が含まれ、具体的には、リゥマチ：関節リウマチ、急性関節リウマチ、慢性関節リウマチ、悪性関節リウマチ、若年性関節リウマチなどを例示することができる。また上記リウマチ性疾患は、他の疾患と併発したものであってょ、。

[0178] 本発明の「抗リウマチ剤」は、「リウマチ滑膜細胞増殖抑制剤」、「リウマチ滑膜細胞発生抑制剤」、「リウマチ治療剤」、「リウマチ性疾患治療剤」、「抗リウマチ薬」、あるいは「抗リウマチ性疾患薬」と表現することもできる。

[0179] なお本発明における「治療」には、リウマチ性疾患の発症を予め抑制し得る予防的な効果も含まれる。またリウマチ滑膜細胞が増殖している組織に対して、必ずしも完全な治療効果を有する場合に限定されず、部分的な効果を有する場合であってもよい。 [0180] 本発明の薬剤については上述した通りである。また本発明の薬剤を使用する場合は、適用部位もしくはリウマチ性疾患の種類は特に限定されず、例えばリウマチ：関節リウマチ、急性関節リウマチ、慢性関節リウマチ、悪性関節リウマチ、若年性関節リゥマチなどが対象として適用される。上記リウマチ性疾患は、他の疾患と併発したものであってよい。

[0181] また本発明は、シノビオリン遺伝子の発現量を指標とする、抗リウマチ剤のスクリーユング方法を提供する。シノビオリン遺伝子の発現量を低下 (抑制）させる化合物は、リウマチ性疾患の治療のための薬剤となることが期待される。本発明の抗リウマチ剤のスクリーニング方法によって、抗リウマチ剤または抗リウマチ剤のための候補ィ匕合物を効率的に取得することができる。

[0182] 本発明の抗リウマチ剤のスクリーニング方法の好ましい態様は、以下の（a)〜（c)の工程を含む方法である。

(b)前記細胞におけるシノビオリン遺伝子の発現量または活性を測定する工程

(c)被検化合物の非存在下にお!、て測定した場合と比較して、発現量または活性を低下させる化合物を選択する工程

[0183] 上記スクリーニング方法の各工程については、上述した通りである。本スクリーニング方法によって選択されたィ匕合物は、抗リウマチ剤もしくは抗リウマチ剤のための候補ィ匕合物となる。

[0184] また本発明の抗リウマチ剤のスクリーニング方法の他の態様は、レポーター遺伝子の発現を指標として、シノビオリン遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する方法である。

[0185] 本発明の上記スクリーニング方法の好ましい態様は、以下の（a)〜（c)の工程を含む、抗リウマチ剤のスクリーニング方法である。

(b)前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程

[0186] 上記スクリーニング方法の各工程については、上述した通りである。本スクリーニング方法によって選択されたィ匕合物は、抗リウマチ剤もしくは抗リウマチ剤のための候補ィ匕合物となる。

[0187] また本発明者らは、シノビォリンの自己ュビキチンィ匕反応を評価するアツセィ系を構築することに成功した。詳しくは以下の実施例に示すように、 ELISAによる簡便なアツセィ系を構築し、 ATP存在下の場合に、抗 HA抗体濃度および二次抗体濃度、 GST- Syno Δ ΤΜ濃度および反応時間に依存して、シノビォリンの自己ュビキチンィ匕反応を示すシグナルが増強することを見出した。そして、当該アツセィ系によってスクリー- ングされた上記一般式 (I)または (II)に記載の低分子化合物力 Sリウマチ滑膜細胞の増殖抑制効果を示し、抗リウマチ効果を有することを初めて見出した。

[0188] すなわち本発明の抗リウマチ剤のスクリーニング方法の他の態様は、シノビオリンタンパク質の自己ュビキチン化を指標とする方法である。本発明のシノビオリンタンパク質の自己ュビキチンィ匕を制御する物質を選択することにより、抗リウマチ剤のスクリーユングを行うことが可能である。本発明の上記方法は例えば以下の（a)〜（c)の工程を含む、抗リウマチ剤のスクリーニング方法である。

[0189] 本方法においてはまず、シノビオリンタンパク質および被検化合物を接触させる。

次いで、シノビオリンタンパク質の自己ュビキチンィ匕の程度を測定する。当業者においては例えば以下の実施例に記載される手法によって、シノビオリンタンパク質の自己ュビキチンィ匕の程度を測定することが可能である。

[0190] 上記方法は次、で、被検化合物を接触させな、場合 (対照）と比較して、自己ュビキチン化の程度を制御する化合物を選択する。制御する化合物は、抗リウマチ剤もしくは抗リウマチ剤のための候補ィ匕合物となる。

[0191] なお本発明にお、て「制御する」とは、上方制御（例えば促進)あるいは下方制御（例えば抑制）が含まれる。

[0192] また本発明は、本発明の抗リウマチ剤のスクリーニング方法を実施するために用いられる各種薬剤 ·試薬等を含むキットを提供する。

[0193] 本発明のキットは、例えば本発明の上述の各種試薬の中力実施するスクリーニング方法にあわせて適宜選択することができる。例えば本発明の抗リウマチ剤のスクリ一-ング用キットは、少なくとも本発明のシノビオリンタンパク質を構成要素とすることができる。本発明のキットには、さらに本発明の方法において使用される各種試薬、容器等を含めることができる。例えば、抗シノビォリン抗体、プローブ、各種反応試薬、細胞、培養液、対照サンプル、緩衝液、使用方法等を記載した指示書等を含めることがでさる。

[0194] また本発明は、本発明のシノビオリンタンパク質の自己ュビキチンィ匕を制御する機能を有する物質を有効成分とする抗リウマチ剤を個体 (例えば患者等)へ投与することを特徴とする、リウマチ性疾患を予防または治療する方法に関する。本発明の予防もしくは治療方法における個体とは、好ましくはヒトであるが、特に制限されず非ヒト動物であってもよい。個体への投与については、上述した通りである。

[0195] さらに本発明は、本発明のシノビオリンタンパク質の自己ュビキチンィ匕を制御する機能を有する物質の抗リウマチ剤の製造における使用に関する。

[0196] なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

実施例

[0197] 以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

[0198] 〔実施例 1〕 MEF培養細胞における p53の活性ィ匕の検討

シノビオリンホモノックアウトマウス（syno-/-)胎児線維芽細胞 (MEF)における p53を免疫蛍光染色により確認した。

すなわち、免疫染色法は、 MEFを常法に従いスライドガラス上に固定し、抗 p53抗体 (マウスモノクローナル抗体 BD : Becton, Dickinson社）を用いて免疫染色を行った。 3 %牛血清アルブミン（BSA)で 30分ブロッキングを行った標本に、 0.3% BSAで希釈した抗 p53抗体 (BD： 10 μ g/mL)を室温で 60分免疫反応させた。反応後の標本を PBSで洗浄後、 TRITC標識抗マウス IgG抗体 (Dako社)を 2次抗体として免疫反応させた。抗 P53抗体に免疫反応する抗原の確認は、蛍光顕微鏡で行った。

その結果、野生型に比し、 syno-/-の MEF培養細胞では p53の発現上昇、及び核内移行を起こして、る細胞が多数確認された（図 1、「MEF-/-」のパネル)。

[0199] 〔実施例 2〕 syno- /-マウスにおける p53活性ィ匕の検討

syno-/-マウスにおける p53活性ィ匕の検討を、 embryoを用い免疫染色により行った。すなわち、 syno-/-の胎仔における免疫染色は、常法に従い組織をスライドガラス上に固定し、ベクタスティン ABCキット (VECTOR社)を用いて行った。ブロッキング試薬で 30分ブロッキングした標本に対して、 5 g/mLに希釈した抗 p53抗体 FL393を室温で 60分間免疫反応させた。反応後の標本を PBSで洗浄し、 HRP標識抗ゥサギ IgG 抗体を 2次抗体として免疫反応させた。抗 p53抗体に免疫反応する抗原は、 HRP活性に基づく 3,3'-ジァミノべンジジン四塩酸塩の発色により確認した。対比染色としてメチルダリーン染色を行った。

この結果、 syno-/-の embryoにおける p53が安定化及び発現上昇して!/、ることが確認された（図 2)。

[0200] 〔実施例 3〕 p53に対するシノビォリンの効果

syno-/-の MEF培養細胞における p53をウェスタンブロッテイングにより検出した。すなわち、各種細胞を細胞破砕液（50 mM Tris- HCl (pH 8.0)、 150 mM NaCl、 1% NP40、 1 mM PMSF、 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS)、 2 μ g/mL Leupeptin、 2 μ g/ mL Aprotinin, 2 μ g/mL Pepstatin)を用いて細胞破砕画分を調製した。その後、 SDS ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE)により細胞破砕画分を分離した。 SDS-PAG E後、細胞由来タンパク質は、エレクトロブロッテイング法により-トロセルロース（NC) 膜に転写した。この NC膜に対し、 5%スキムミルクをカ卩えた Tris buffered saline (TBS)で室温、 1時間ブロッキングした後、抗 p53抗体 c- terminal aa;195- 393または FL393を 5% スキムミルクを加えた TBSで希釈して室温、 1時間免疫反応させた。反応後の NC膜を 0.1% Tween20/TBSで洗浄し、 horse radish peroxidase (HRP)標識抗ゥサギ IgG抗体を 2次抗体として室温、 1時間免疫反応させ、 0.1% Tween20/TBSで洗浄し、 HRP活性を検出することにより目的抗原を検出した。 HRP活性の検出には ECLキット (Amersha m社）を用いた（Clinical Chemistry. 25, pi 531, 1979) ₀

その結果、ウェスタンブロッテイングにより syno-/-の MEF培養細胞における p53発現量が増加して、ることが確認された（図 3)。

[0201] 〔実施例 4〕 syno-/-の MEF培養細胞における p53のリン酸ィ匕部位の同定

本実施例においては、抗 p53抗体を用いたウェスタンブロッテイングにより p53のリン酸ィ匕部位の同定を行った。

すなわち、 p53 (配列番号： 17)の異なるセリン残基のリン酸ィ匕を認識する 4種の抗リン酸化 p53モノクローナル抗体（Phospho- p53(serl5)、 Phospho- p53(ser20)、 Phospho -p53(ser37)および Phospho-p53(ser46) ; Cell Signaling社）を用いて、 MEF細胞のタンパク質を SDS-PAGEで分離し、ウェスタンブロッテイング法を行った。ウェスタンブロッティング法の操作は、一次抗体として抗リン酸化 p53モノクローナル抗体を、そして標識抗体として抗マウス IgGヒッジ -HRPを用いる他は実施例 3に記載のとおりである。その結果、 syno-/-の MEF培養細胞において、 p53のアミノ酸配列（配列番号： 17) 中、第 15番目のセリン残基のリン酸ィ匕が顕著であった（図 4)。図 4において、左上のパネル力第 15番目のセリン残基がリン酸ィ匕されたものである。 53kDa付近のバンドが顕著に濃く表れている。

[0202] 〔実施例 5〕 Serl5のリン酸化亢進のメカニズムの解明

細胞株として野生型の P53を発現して、ることが確認されて、る RKO (ヒト大腸がん由来細胞株)を 60 mmプレートに l.OxlO⁵細胞/プレート /2 mLで細胞を播種し、 Oligofe ctamineを用いて GFPおよびシノビオリンに対する siRNAオリゴヌクレオチドをトランスフェタトした後、 72時間後に Serl5のリン酸化に重要な ATM(ataxia-telangiectasia mutat ed)および ATR(ATM and Rad3 related)の阻害剤であるカフェイン (10 mM)を添カロし、リン酸化 Serl5-p53に対する抗体 Phospho-p53(serl5)を用いてウェスタンブロッテイングを行った。

その結果、シノビォリンに対する siRNAによって亢進した Serl5のリン酸ィ匕はカフエイン添加（添加後 12時間、 24時間）により、完全に阻害された（図 5)。シノビオリンの発現を阻害すると、 ATMおよび ATRによる p53の活性ィ匕を誘導することが示唆された。 [0203] 〔実施例 6〕 p53により誘導される p21の発現にシノビォリンが及ぼす影響

RKO細胞をシノビォリンに対する siRNA処理し、 p53の転写産物である p21の発現の変化をウェスタンブロッテイングで検討した。

すなわち、細胞株として野生型の p53を発現して、ることが確認されて、る RKO (ヒト大腸がん由来細胞株)を 60 mmプレートに l.OxlO⁵細胞/プレート /2 mLで細胞を播種し、 Oligofectamineを用いて GFPおよびシノビオリンに対する siRNAオリゴヌクレオチドをトランスフエタトした。 72時間後に細胞を回収し調製した。調製したタンパク質を SDS -PAGEで分離し、抗 p21ポリクローナル抗体（Santa Cruz社）を用いて、ウェスタンブ口ッティング法を行った。ウェスタンブロッテイング法の操作は、一次抗体として抗 p21ポリクローナル抗体を、そして標識抗体として抗マウス IgGヒッジ -HRPを用いる他は実施例 3に記載のとおりである。

その結果、シノビォリンに対する siRNA処理によって、 p53の発現が高まると同時に、 p21の発現も増加した。この効果は 72時間で明確に示された（図 6)。

[0204] 〔実施例 7〕シノビオリン発現阻害による、細胞周期への影響等の検討

本実施例においては、リウマチ患者由来滑膜細胞におけるシノビオリンを、 RNAi効果により阻害した際の細胞周期への影響の検討を行った。

RA滑膜細胞を 10 cmディッシュに 9.0xl0⁴細胞で播種し、シノビオリン siRNA (最終濃度 25 nM)をトランスフエタトした後、フローサイトメーターにより細胞周期を観察した。その結果、 siRNA 25 nM(h589)では、 G0/G1期における細胞周期の遅延が見られた（図 7)。

[0205] siRNAとしては h589を用いた。

なお、 h589とは、以下のセンス鎖およびアンチセンス鎖をァニールさせた 2本鎖 RN Aを意味する。

センス鎖 h589 : GGU GUU CUU UGG GCA ACU G TT (配列番号： 18) アンチセンス鎖 h589 : CAG UUG CCC AAA GAA CAC C TT (配列番号： 19) [0206] 〔実施例 8〕癌組織におけるシノピオリンの発現の検討

Tissue array (CHEMICON社： 10 common human cancer tissue with normal human tissue)を、抗シノビオリン抗体 (lODa)を用いて免疫染色した。免疫染色に使用した抗体濃度は 8 g/mLであり、使用したキットはシンプルスティン MAX (M)である。

その結果、正常組織でのシノビォリンの発現は、大腸、腎、肺、卵巣、精巣、皮膚および乳腺で認められたのに対し、神経およびリンパ節では認められな力つた。また、各腫瘍組織においてシノピオリンの発現が確認され、特に、発現が明らかに亢進して V、ると判断された組織は、神経'リンパ節であった（図 8および図 9)。

[0207] 〔実施例 9〕培養細胞中でシノビオリンおよび p53を共発現させた場合の各々の局在への影響

3種類のプラスミド、 GFP- p53、 FLAG- synoviolin、および FLAG- synoviolin C307S( ュビキチン (Ub)化活性なし)を Saos- 2細胞に導入した。

[0208] 各プラスミドは、以下の通りである。

GFP-p53 : Green fluorescence proteinと野生型 p53のフュージョン蛋白発現 FLAG-synoviolin： FLAGタグつき野生型シノビオリン発現

FLAG-synoviolin C307S (ュビキチン（Ub)化活性なし)： FLAGタグつき失活型シノビォリン発現

[0209] FuGene6 (Roche)によるトランスフエクシヨン処理して 24時間後に 10%ホルマリンで固定し、 400倍希釈一次抗体 α -FLAG抗体、 200倍希釈二次抗体 α -mouse IgG-TRIT C、 1 M DAPIで核を染色して、その局在を観察した。

[0210] その結果、野生型 p53は強発現させると核に局在することが観察された（図 10)。野生型シノビオリンは強発現すると細胞質 (特に核周辺）に局在した。また、野生型 _P53 と野生型シノビオリンを強発現させると、本来核に局在する p53が核周辺に細力、ドット状に分布し、シノビォリンと共局在していることが観察された（図 11)。野生型 p53とシノビオリン C307S mutantを強発現させると、 p53が細胞質内に大きなドットを形成し、シノビオリンと共局在して、ることが観察された（図 12)。

以上のことから、シノビォリンと p53は一定条件下で共局在することが示された。ュビキチンィ匕活性の有無でその局在の形態が変化することが考えられる。

[0211] 〔実施例 10〕 MBP- Synoviolin Δ ΤΜ- Hisによる GST- p53の in vitroュビキチン化の検討シノビォリンの細胞内における増減により _P53の細胞内タンパク質量の変動が観察されており、シノビォリンによる p53の制御が示唆されている。そこで、シノビォリンが直接 p53をュビキチン化（Ub)するか否かを調べるために、 GST-p53および MBP-Synovi olin Δ ΤΜ- Hisを用いて in vitroュビキチン化反応の検討を行った。

[0212] GST-p53 :N末端側に GSTを融合させた p53を大腸菌内で発現させ、それを精製して得た画分。

MBP-Synoviolin Δ ΤΜ- His :N末端側に MBP, C末端側に Hisタグを融合させたシノピオリンを大腸菌内で発現させ、それを精製して得た画分。

[0213] pGEX/p53を保持した大腸菌 (BL21)を 500 mLの LB培地で培養し、 IPTGによる誘導後 (1 mM、 30°C、 6 h)、培養液より 0.5% NP-40を含む緩衝液を用いて大腸菌抽出液を調製した。

大腸菌抽出液より GST- p53を GSH-セファロース榭脂を用いて 0.1% NP- 40存在下で精製した。その透析後の試料を用いて、 MBP-Synoviolin Δ ΤΜ- Hisおよび他の in vit roュビキチン化反応に用いる組成物（ATP、 PK- His- HA- Ub、 yeast El、 His- UbcH5 c)を組み合わせて反応を行った（図 13)。反応後、タンパク質を 7.5% SDS-PAGEにより分離し、 PVDF膜上に転写して抗 p53抗体 (FL393あるいは DO- 1)により膜上の p53タンパク質を検出した。また、 GST-p53の添加量を変化させて同様の反応および検出を行った。

[0214] その結果、 GST-p53精製画分および MBP-Synoviolin Δ TM- Hisを含む全ての組成物を添カ卩した場合に、約 90kDaの位置を中心として p53由来のラダー状のシグナルが観察された（図 13)。これらの結果から、シノビォリンが直接 p53のュビキチンィ匕に関与していると言える。従って、シノビォリンの発現および/または機能を阻害することにより、 p53のュビキチンィ匕を抑制できることが示された。

[0215] 〔実施例 11〕 RNAi下におけるシノビオリン、 p53 mRNA量の検討

本実施例では、シノビオリン RNAi条件下において、シノビォリンおよび関連遺伝子について、経時的に mRNA量の変化を検討することでシノピオリンが細胞周期、アポト一シスなどへ及ぼす影響を検討した。

RA滑膜細胞を 30000 cells/ 10 cmディッシュで播種し、定法に従い 25 nM siRNA(No . 589)をトランスフエクシヨンし、細胞培養 4日間の間、経時的に細胞を回収し、 mRNA を得た。 1 μ gの mRNAをテンプレートとし、ランダムプライマーを用いて逆転写反応を行い、 cDNAを得た。得られた cDNAについて、 ABI TaqMan Gene expression assay ( GEX)を用いて、定量を行った。対照遺伝子を 18S rRNAとして mRNA量を算出した。

GEX試薬ターゲットアツセィ No. (アツセィ ID)は、シノビォリンが Hs00381211_ml、 p5 3が Hs00153340_mlである。

その結果、シノビオリン siRNA存在下では、シノビオリン mRNA量が減少する力 p53 の mRNA量は変化して!/、な!/、ことが確認された（図 14)。

[0216] 〔実施例 12〕シノビォリンの p53結合ドメインの決定

GST-Synoviolinと p53が in vitroプルダウンアツセィで結合し、それにはシノビオリンタンパク質のアミノ酸配列（配列番号： 2)の第 236から 270番目までの 35アミノ酸残基が必要十分である。

そこで、本実施例では、さらに、シノビォリンカ ¾53に結合するために必要なドメインを同定するために、図 15に示すように、シノビォリンの p53結合ドメイン欠失体を作製して、 ³⁵S-p53につ!/、て以下の通り GSTプルダウンアツセィを行った（図 16)。

[0217] 100 μ Lの Competent cell (BL- 21株）を 1 μ Lの各 GSTタンパク質をコードしたプラスミドで形質転換した。各 GSTタンパク質とプラスミドの名前は以下のとおりであった。

GSTタンパク質：プラスミド

uST： pGEX-6P-l (Pharmacia Biotech)

GST-Syno A TM 236—617： pGEX— 5— 1 / S A TM

GST-Syno A TM 236-270： p6- 3

GST-Syno A TM 271-617： pST490

[0218] 4 mLの LB- Amp+に接種し、 37°Cでー晚培養した。翌日 Pre- cultureの OD600を測定し、 15 mLの LB-Amp+に OD600=3.0相当を接種した（終濃度 0.2)。 25°C恒温槽で約 2hr培養し、 OD600=0.6〜0.8になったことを確認した後、恒温槽に氷をカ卩えて 20 °Cに冷却し、培養容器を 10分つけて 20°Cまで冷却した。 0.1 M IPTGを 15 ja L (終濃度 = 0.1 mM、通常の 1/1000)、 1 mM ZnClを 150 L (終濃度 =10 M)カロえて、 20°C

2

で 4hr震盪培養し GSTタンパク質の発現を誘導した。誘導後、遠心して細胞を回収した（5000 rpm、 5min、 4°C) ₀ 1 mL PBS (-)に細胞を再懸濁し、エツペンドルフチューブに移し、細胞を回収した（14000 rpm、 lmin、 4°C) ₀上清を全て吸い取った後、 500 L の PBS (-) I Z (PBS (-) / lO ^ M ZnCl )に再懸濁し、液体窒素で凍結、 20°Cで保存

2

した。翌日—20°Cのサンプルを 37°Cの恒温槽に lOminつけて融かし、次に氷水中につけて 0°Cまで冷却した。以下のプロテアーゼ阻害剤を混合し、 1サンプルあたり 6.5 μしカ口た。

[0219] 100 mM PMSF (Final 1 mM) 20 μ L

Aprotinin (Final 0.1%) 2 μ L

0.5 mg/mL PepstatinA (Final 0.5 μ g/mL) 2 μ L

1 mg/mL Leupeptin (Pinal 1 μ g/mL) 2 μ L

[0220] 各サンプルを超音波破砕した（Power Level 7、 15秒、 3回）。一回ごとに氷水中に 3 0秒つけて冷却した。次に 500 μ Lの 2 X GST Buffer / Z (2% TritonX- 100、 720 mM N aCl、 1 x PBS (-)、 ΙΟ ^ Μ ZnCl、 10 mM j8 - Mercaptoethaol、 2 mM PMSFゝ 0.1% aprot

2

inin)を加え混合後、さらに超音波破砕した（Power Level 7、 15秒、 1回）。破砕した液を 14000rpm 30min 4°Cで遠心した。この間に lmLの 1 x PBS (-)で 200 μ Lの 80%-slurry Glutathione Sepharoseビーズを 3回洗い、 160 Lの 1 x PBS (―)をカ卩え、 50%— slurryに調整した。遠心後の上清 lmLに 80 Lの 50%- slurry Glutathione Sepharoseビーズを加え、 4°Cで 2hr Rotationして GSTタンパク質をビーズに結合させた。 1 mLの 1 x GST- Buffer I Z (1% TritonX— 100、 360 mM NaCl、 0.5 x PBS (-)ゝ 5 ^ M ZnCl、 5 mM β—m

2

ercaptoethanoU 1 mM PMSF, 0.05% aprotinin)で 4回ビーズを洗った。遠心は 2000 rp m、 lmin、 4°Cで行った。残った上清を全てきれいに吸いとつた後、 60 Lの 1 x GST- Buffer I Zをカロえ、合計 100 μ Uこした。このうち 10 μ Lを等量の 2 X SDS Sample Buffer と混ぜ、 100°C、 5min、ヒートブロックで熱し、 10 Lずつ 10%ゲルに Applyした。同時に 0.25〜4 μ gの BSAも Applyした。泳動（150 V 50min)、 CBB染色（未使用のもので 30mi n)、脱色（lhrを 2回）、グリセロール水（30〜60min)、（ゲル乾（80°C、 lhr)して、 GSTタンパク質の発現、回収効率をチェックした。翌日、 ³⁵S-p53の In vitro Translationを行つた。まず、以下の試薬を混合した。

[0221] TNT Reticulocyte Lysate 25 μ L TNT Reticulocyte Buffer 2 μ L

Amino Acids Mixture (-Met) 1 μ L

DEPC— treated Water 15 ^ L

RNase Inhibitor 1 μ L

TNT polymerase 1 μ L

³⁵S- Met 4 μ L

Plasmid ρ53 · ΗΑ)_ 1 u_L

Total 50 (し

[0222] 30°C恒温槽で 1.5〜2.5hr保温し、 In vitro Translationした。この間に G-25カラムのふたを緩めて軽く遠心（2500 rpm、 lmin、 4°C)し、 100 μ Lの PuU-down Buffer V (20 m M HEPES pH 7.9、 150 mM NaCl、 0.2% Triton X- 100)を乗せてさらに遠心し、カラムを洗った。このカラムに In vitro Translation溶液を 50 μ L全量乗せて遠心した（2500 r pm、 lmin、 4°C) ₀さらに 200 μ Lの PuU- down Buffer Vを乗せて、再度遠心した（2500r pm、 lmin、 4°C) ₀これを In vitro Translation Product (IvTL)として用いた。そのうち 4 μ Lを、 16 μ Lの Milli— Q、 20 μ Lの 2 x SDS Bufferと混ぜ、 On put 10%とした。 30 μ gの GSTタンパクが結合したビーズを含んだ 1 mLの PuU-down Buffer Vに 120 μ Lの IvTL を加え、 4°Cで lhr Rotationした。遠心（10000rpm、 lmin、 4°C)した後、上清を 370 L ずつ GST、各 GST- Synoviolinビーズを含んだ 1 mLの PuU- down Buffer Vにカロえ、 4°C で lhr Rotationした。このビーズを 1 mLの PuU-down Buffer Vで 4回洗った。この時上清は必ず 100 Lぐらい残し、ビーズを吸い取らないようにした。遠心は 2500 rpm、 lmi n、 4°Cで行った。上清を吸いとつた後、 40 μ Lの 1 x SDS Sample Bufferをカ卩えて、 Pull -downサンプルとした。 On put 10%と PuU-downサンプルを 100°Cで 5min、熱し、 - 20°C で保存した。翌日サンプルを 37°Cの恒温槽で lOmin温め、 10 /z Lずつ 10%ゲルに Appl yした。泳動（150 V 50min)、 CBB染色（30min)、脱色（lhr x 2)、グリセロール水（30 〜60min)、ゲル乾（80°C、 lhr)した後、 IP Plateに露光させた。 14時間後、露光した IP Plateを BASで読み取り、 ImageGaugeで定量した。また C.B.B.染色したゲルはフィルムスキャナーで読み取った。

[0223] その結果、 p53結合ドメイン欠失体は結合活性をほぼ完全に失って、た。また、図 1 5から、 p53結合ドメインは 236から 270アミノ酸の 35アミノ酸の一ヶ所のみであると考えられる。

[0224] 〔実施例 13〕シノビォリンによる p53ュビキチン化活性に対する Compound X, Yの影響

シノビォリンによる GST-p53の in vitroュビキチンィ匕反応を解析することを目的として、同反応における Compound X、 Yの影響を調べた。 Compound X、 Yの化学構造式を図 17Aに示す。

GST- p53存在下で、 MBP- Syno A TM- Hisを用いた in vitroュビキチン化反応系に、 Compound X、 Yの濃度を変化させて（75, 150,300,600 M)添カ卩した。反応後、タンパク質を 7.5% SDS-PAGEにより分離し、 PVDF膜上に転写して抗 p53抗体、 FL393 (Sa nta Cruz Biotechnology.Incjにより恢出し 7こ。

その結果、 Compound X、 Yは GST_p53のュビキチンィヒ反応に対して、濃度依存的に阻害効果を示した (図 17B)。

[0225] 〔実施例 14〕 Compound X、 Yの細胞毒性への検討

RKO細胞（ヒト大腸癌由来細胞株、 ATCC:CRL-2577)を 96穴マイクロタイタープレ一 KFALCON,non coated)に 1000 cells/100 L/wellで 10%牛胎児血清含 Eagle's Mi nimum Essential Medium播種し 24時間培養した。

Compound X、 Yを 10%牛胎児血清含 Eagle's Minimum Essential Mediumに溶解し、各 well 10 μ Lずつ添カ卩し、 24〜72時間培養を行った。

培養後、各 wellにっき、 WST-8 (2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)- 5-(2,4-disulfophenyl)-2H- tetrazolium, monosodium salt)を添カ卩し、 2〜4時間後の 4 50 應における吸光度を測定し (参照波長 750 nm)細胞生存率を算出した（図 18)。算出方法は以下の計算式による。

^[0226] (検体) -（ブランク）

細胞生存率（0/0 ) = (陰性コントロール) - (ブランク）

[0227] その結果、 Compound X、 Yにより、細胞増殖が抑制された（図 18)。

[0228] 〔実施例 15〕培養細胞における p53タンパク発現量に対する Compound X, Yの影響

RKO細胞を Compound Yで処理し、 p53の蛋白質発現量の変化をウェスタンブロッテイングで検討した。すなわち、 RKO細胞を 10 cmプレートに 5.0 X 10⁵細胞/プレートで細胞を播種し、 24時間培養後、 Compound Yを終濃度 5、 10、 20 μ Μで添カ卩した。 24 時間後に細胞を回収し、細胞溶解液を調製した。タンパク質を SDS-PAGEで分離し、抗 ρ53抗体（FL393, Santa Cruz社）を用いて、ウェスタンブロッテイング法を行った。ゥエスタンブロッテイング法の操作は、一次抗体として抗 p53抗体を、そして標識抗体として抗ヒ HgGゥサギ -HRPを用いる他は実施例 3に記載のとおりである。その結果、 Co mpound Yにより p53のタンパク質発現量が上昇した（図 19)。

[0229] 〔実施例 16〕 ELISAによるシノビォリンの自己ュビキチン（auto-Ub)化反応評価系の構築

ELISAによる簡便な自己ュビキチン化反応のアツセィ系を構築し、自己ュビキチン化反応を阻害する化合物を評価する事を目的とした。

まず、 ELISA法を用いたシノビオリン自己ュビキチン化反応検出系における抗体濃度の検討を行った。

即ち、 ATP(10 mM)存在下あるいは非存在下で、 His- El(human, 125 ng), His- PK- HA-Ub(1.6 μ g), His-UBE2G2(0.8 μ g), GST— Syno Δ ΤΜ(0.4 μ g)と混合し、 in vitro ュビキチンィ匕反応 (30 /z 1)を 37°Cで 1時間行った。反応液に 70 1の 0.5 M EDTAを添加して反応停止後、予め PBST/10% Skim milkで 2時間ブロッキングした glutathione co ated ELISA用プレート (Reacti- Bind, PIERCE)に、反応停止後の混合液を添加して室温で 1時間振盪した。廃液後、 200 1の PBSTで 3回洗浄した。 PBSTで希釈した抗 HA 抗体（1/2000, 1/4000, 1/8000)を 100 1ずつ分注し、室温で 1時間振盪した。廃液後、 200 1の PBSTで 3回洗浄した。 PBSTで希釈した抗ゥサギ IgG抗体（1/1000, 1/20 00, 1/4000)を 100 1ずつ分注し、室温で 30分間振盪した。廃液後、 200 1の PBST で 3回洗浄した。 100 1の OPD発色液を添カ卩し、室温で 15分間振盪後、 50 1の 2 N 硫酸を 50 1添加して反応停止後、プレートリーダーにより 492應における吸光度を測定した（図 20)。

[0230] 次に、 ELISA法を用いたシノビオリン自己ュビキチン化反応検出系における GST-S yno Δ ΤΜ濃度の検討を行った。

即ち、 ATP(10 mM), His- El(human, 125 ng), His- PK- HA- ΙΛ)(1.6 g), His- UBE2 G2(0.8 μ g), GST-Syno Δ ΤΜ(0.83、 1.7、 3.3、 6.7、 13.3 ng/ μ 1)を混合し in vitroュビキチン化反応 (30 /z 1)を 37°Cで 1時間行った。反応液に 70 1の 0.5 M EDTAを添カロして反応停止後、予め PBST/10% Skim milkで 2時間ブロッキングした glutathione coated ELISA用プレート (Reacti- Bind,PIERCE)に、反応停止後の混合液を添加して室温で 1時間振盪した。廃液後、 200 1の1¾3丁で3回洗浄した。 PBSTで希釈した抗 HA抗体 (1/2000)を 100 1ずつ分注し、室温で 1時間振盪した。廃液後、 200 1の1¾3丁で3回洗浄した。 PBSTで希釈した抗ゥサギ IgG抗体（1/2000)を 100 1ずつ分注し、室温で 3 0分間振盪した。廃液後、 200 1の1¾3丁で3回洗浄した。 100 1の OPD発色液を添カロし、室温で 15分間振盪後、 50 1の 2 N硫酸を 50 1添加して反応停止後、プレートリーダ一により 492 應における吸光度を測定した（図 21)。

[0231] 最後に、 ELISA法を用いたシノビオリン自己ュビキチンィ匕反応検出系における反応時間の検討を行った。

即ち、 ATP(10 mM), His- El(human, 125 ng), His- PK- HA- ΙΛ)(1.6 g), His- UBE2 G2(0.8 μ g), GST-Syno Δ ΤΜ(200 ng)を混合し in vitroュビキチン化反応 (30 μ 1)を 37 °Cで 15, 30, 60, 120分間行った。反応液に 70 μ 1の 0.5 M EDTAを添カ卩して反応停止後、予め PBST/10% Skim milkで 2時間ブロッキングした glutathione coated ELISA用プレート (Reacti-Bind, PIERCE)に、反応停止後の混合液を添加して室温で 1時間振盪した。廃液後、 200 1の1¾3丁で3回洗浄した。 PBSTで希釈した抗 HA抗体（1/1000) を 100 1ずつ分注し、室温で 1時間振盪した。廃液後、 200 1の PBSTで 3回洗浄した。 PBSTで希釈した抗ゥサギ IgG抗体（1/2000)を 100 1ずつ分注し、室温で 30分間振盪した。廃液後、 200 1の PBSTで 3回洗浄した。 100 1の OPD発色液を添カ卩し、室温で 15分間振盪後、 50 1の 2 N硫酸を 50 1添加して反応停止後、プレートリーダーにより 492 應における吸光度を測定した（図 22)。

その結果、今回構築した ELISA系では、 ATP存在下の場合に、抗 HA抗体濃度および二次抗体濃度（図 20)、 GST-Syno Δ ΤΜ濃度（図 21)および反応時間（図 22)に依存してシグナルの増強が認められた。

[0232] 〔実施例 17〕低分子化合物のリウマチ滑膜細胞 (RASC)に対する効果

シノビオリン自己ュビキチンィ匕を指標としたスクリーニングによりデザインされた 2種の低分子化合物 (No.32 (Compound X)、 38 (Compound Y) )のリウマチ滑膜細胞 (RAS C)に対する効果を評価する為、まず、 RASCに対する増殖抑制効果を検討した。検体は No. 32 (Compound X)、 38 (Compound Y)と命名した低分子化合物を使用した。 RASCには HFLS- RA(Cell applications inc., Code CA40405)を用いた。 RASCを 96 well microtiter plateに 1000 cells I wellで播種し、 10%ゥシ胎児血清含 DMEM (KOH JIN BIO)により 24時間培養を行った。その後、検体を細胞に、終濃度 50 Mから 1/2 ずつ段階希釈して添カ卩し、 1、 24、 48時間後に 3- (4,5- dimethylthiazo卜 2- yl)- 2,5- diph enyltetrazoliumbromide(MTT)を終濃度 0.5 mg/mLとなるように添加し、 2時間後に培地を吸引し、残ったフオルマザンを dimethyl sulfoxide 50 μ Lで溶解し、 540 nmにおける吸光度を測定した。細胞および検体を添加していない群を 0%、検体を添加していない群を 100%としたときの、検体を添加した群の吸光度を細胞生存率として算出したその結果、各化合物において、 72時間培養後の IC50値は No.32で 20 M、 No.38で約 6 Mであった（図 23、 24)。これらの低分子化合物は低濃度で RASC細胞増殖抑制効果を示し、抗リウマチ効果を有すると考えられた。

配列表フリーテキスト

[0233] 配列番号： 18：合成オリゴヌクレオチド (DNA/RNA混合物）

配列番号：19 :合成オリゴヌクレオチド (DNA/RNA混合物）

産業上の利用可能性

[0234] 本発明により、シノビオリンタンパク質の発現もしくは機能の阻害物質を有効成分として含有する、 _P53タンパク質活性化剤が提供される。この薬剤は癌治療剤として有用である。

また本発明者らによって見出された知見に基づいて開発されたスクリーニング方法を利用することにより、癌治療剤の候補ィ匕合物を効率的に取得することが可能であるさらに、本発明者らによって見出された種々の知見は、 p53の癌抑制作用のメカ- ズムを解明するための学術的研究に対しても大いに貢献するものと期待される。また、本発明の p53タンパク質活性化剤は、 p53に関連する癌抑制作用の解明のための研究用試薬としても有用である。

また本発明により、シノビオリンタンパク質の自己ュビキチン化を制御する物質を有効成分として含有する、抗リウマチ剤が提供される。本発明者らによって見出された知見に基いて開発されたスクリーニング方法を利用することにより、抗リウマチ剤の候補ィ匕合物を効率的に取得することが可能である。

Claims

請求の範囲

[1] シノビオリンタンパク質の発現および Zまたは機能阻害物質を有効成分として含有する、 p53タンパク質活性化剤。

[2] 前記発現および Zまたは機能阻害物質が、シノビオリンタンパク質と P53タンパク質との結合を阻害する活性を有する低分子化合物である、請求項 1に記載の p53タンパク質活性化剤。

[3] 前記発現および Zまたは機能阻害物質が P53タンパク質のュビキチン化を阻害する機能を有する低分子化合物である、請求項 1に記載の p53タンパク質活性化剤。

[4] 前記発現および Zまたは機能阻害物質が、 P53リン酸ィ匕タンパク質を活性ィ匕する機能を有する低分子化合物である、請求項 1に記載の p53タンパク質活性化剤。

[5] 前記 p53リン酸ィ匕タンパク質力 ATMまたは ATRである、請求項 4に記載の p53タンパク質活性化剤。

[6] 前記発現および Zまたは機能阻害物質が、以下の (a)〜 (c)からなる群より選択される化合物である、請求項 1に記載の p53タンパク質活性化剤。

[7] 前記発現および Zまたは機能阻害物質が、以下の (a)または (b)の化合物である、請求項 1に記載の p53タンパク質活性化剤。

[8] 請求項 1〜7のいずれかに記載の p53タンパク質活性化剤を有効成分とする、癌治療剤。

[9] 以下の工程 (a)〜（c)を含む、癌治療剤のスクリーニング方法。

[10] 以下の工程 (a)〜（c)を含む、癌治療剤のスクリーニング方法。

(b)前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程

[11] 以下の工程 (a)〜（c)を含む、癌治療剤のスクリーニング方法。

[12] 以下の工程 (a)〜（c)を含む、癌治療剤のスクリーニング方法。

(b) p53タンパク質のュビキチン化を測定する工程

[13] 以下の工程 (a)〜（c)を含む、癌治療剤のスクリーニング方法。

[14] p53リン酸ィ匕タンパク質が ATMまたは ATRである、請求項 13に記載のスクリーニング方法。

[15] 以下の（a)および (b)を構成要素として含む、癌治療剤スクリーニング用キット。

(a)シノビオリンタンパク質 (b) p⁵3タンパク質

[16] シノビオリンタンパク質の自己ュビキチン化を制御する機能を有する物質を有効成分として含有する、抗リウマチ剤。

[17] 前記シノビオリンタンパク質の自己ュビキチン化を制御する機能を有する物質が低分子化合物である、請求項 16に記載の抗リウマチ剤。

[18] 前記低分子化合物が、以下の一般式 (I)または (II)に記載の化合物である、請求項

17に記載の抗リウマチ剤。

リウマチ滑膜細胞増殖抑制効果を有することを特徴とする、請求項 18に記載の抗リゥマチ剤。

以下の工程 (a)〜（c)を含む、抗リウマチ剤のスクリーニング方法。

(a)シノビオリン遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程 (b)前記細胞におけるシノビオリンタンパク質の発現量または活性を測定する工程

[21] 以下の工程 (a)〜（c)を含む、抗リウマチ剤のスクリーニング方法。

(b)前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程

[22] 以下の工程 (a)〜（c)を含む、抗リウマチ剤のスクリーニング方法。

[23] シノビオリンタンパク質を構成要素として含む、抗リウマチ剤のスクリーニング用キッ