WO2005093067A1 - シノビオリン遺伝子のプロモーターに対するデコイ核酸 - Google Patents

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WO2005093067A1
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synoviolin
decoy
cells
promoter
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Toshihiro Nakajima
Kaneyuki Tsutimochi
Naoko Yagishita
Satoshi Yamasaki
Yukihiro Kato
Tetsuya Amano
Kaori Tamitsu
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Locomogene, Inc.
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Definitions

  • the present invention relates to a decoy nucleic acid for the promoter of a Synoviolin gene.
  • Rheumatoid arthritis is a systemic chronic inflammatory disease with abnormal proliferation of synovial tissue in joints.
  • the present inventors have identified the Synoviolin gene as a gene essential for abnormal growth of synovial tissue (WO 02/052007).
  • Synoviolin encoded by the synoviolin gene is a membrane protein that has been cloned from a synovial cell library of rheumatoid arthritis patients by immunoscreening using an anti-synovial cell antibody. When synoviolin was overexpressed in mice, synovial hyperplasia, bone and cartilage destruction were observed in the joints, and symptoms similar to arthritis were confirmed. The development of cartilage and bone tissue, differentiation, regeneration and metabolism The involvement of Synoviolin has been suggested. Recently, synopiolin has also been found to be involved in the development of fibrosis, cancer or cranial nerve diseases (Genes Dev. 2003 Vol. 17: p.2436-49).
  • Synoviolin promoter transcript region Since the expression level of Synoviolin is considered to be important in the above diseases, in order to search for the Synoviolin promoter transcript region, fragments having various lengths were obtained by cutting the upstream promoter region of the mouse Synoviolin gene. As a result of investigating promoter activity, the core region was identified and confirmed to interact with transcription factors (Oncogene. 2000 Vol. 19: p.6533-48). Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a decoy nucleic acid for a site encoding a transcriptional regulatory region of a Synoviolin gene promoter.
  • the present inventor has conducted intensive studies in order to solve the above problems. And Shinopio The present inventors succeeded in producing a decoy nucleic acid for the above site of the phosphorus gene, and completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • a decoy nucleic acid capable of inhibiting promoter activity by binding to a transcription factor of a synoviolin gene promoter.
  • decoy nucleic acid of the present invention examples include, for example, the following decoy nucleic acids (a) and (b).
  • decoy nucleic acid of the present invention examples include the following (a) or (b) decoy nucleic acid.
  • (b) consists of a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 or 12, and has a function of inhibiting the promoter activity of the synoviolin gene Decoy nucleic acid
  • the function of inhibiting the promoter activity of the synoviolin gene includes, for example, a function of binding to a promoter-specific transcription factor.
  • the decoy nucleic acid of the present invention has a base sequence at any site selected from the group consisting of EBS (Ets binding site), SBS (Spl binding site) and ABS (AML binding site), which is a transcription factor binding site of a promoter.
  • EBS Ets binding site
  • SBS Spl binding site
  • ABS AML binding site
  • the decoy nucleic acid of the present invention can induce apoptosis in synovial cells or cancer cells.
  • a pharmaceutical composition comprising the decoy nucleic acid for treating or preventing a disease caused by the expression of a Synoviolin gene.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the disease to which the pharmaceutical composition of the present invention is applied includes, for example, at least one selected from the group consisting of rheumatoid arthritis, fibrosis, cancer and cranial nerve disease. I can get lost.
  • FIG. 1A is a diagram showing the activity of a truncated Synoviolin promoter.
  • FIG. 1B shows the activity of the truncated Synoviolin promoter.
  • FIG. 1C is a diagram showing an Ets binding site and a core region of Synoviolin promoter.
  • FIG. 1D is a diagram showing the transcription activity when a mutation is introduced into a promoter.
  • FIG. 2A is a photograph showing the result of performing a gel shift assay.
  • FIG. 2B is a photograph showing the result of performing a gel shift assay.
  • FIG. 2C is a photograph showing the result of performing gel shift.
  • FIG. 2D is a photograph showing the result of performing a gel shift assay.
  • FIG. 3A shows the transcriptional activity of the Synoviolin promoter.
  • FIG. 3B shows the transcriptional activity of the Synoviolin promoter.
  • FIG. 3C shows the transcriptional activity of the synoviolin promoter in NIH3T3 cells knocked out using RNAi.
  • FIG. 4A is a construction diagram of a plasmid in which LacZ is linked to 2.2 k and 1 k synoviolin promoters.
  • FIG. 4B is a photograph showing the expression of the Synoviolin promoter in mouse embryos.
  • FIG. 4C is a T "photograph showing the expression of the Synoviolin promoter in the mouse embryo.
  • FIG. 5 is a diagram showing the sequence of a decoy nucleic acid.
  • FIG. 6 is a diagram showing a time schedule of a test for confirming the suppression of synoviolin expression in synovial cells.
  • FIG. 7A is a photograph showing the expression of the synoviolin promoter in RA synovial cells.
  • FIG. 7B is a diagram showing the results of WST-8 Atsay assaying the suppression of synoviolin expression in synovial cells.
  • FIG. 7C is a photograph showing the result of confirming the expression of Synoviolin in synovial cells by Western plotting.
  • FIG. 8A is a diagram showing the result of performing Lucifera-Zeetzsee.
  • FIG. 8B shows a photograph showing apoptosis in NIH3T3 cells in which synoviolin was knocked down using decoy ODN and a result of Western plotting.
  • FIG. 8C is a photograph showing apoptosis in NIH3T3 cells in which synopiolin was knocked down using RNAi, and a diagram showing the results of Western plotting.
  • FIG. 9A is a photograph showing suppression of synoviolin expression by EBS-1 decoy ODN.
  • FIG. 9B shows apoptosis by treatment with EBS-1 decoy ODN in NIH3T3 cells overexpressing Synoviolin.
  • FIG. 10 is a diagram showing the inhibitory effect of EBS-1 decoy on synoviolin RNA in RA synovial cells.
  • An object of the present invention is to provide a decoy nucleic acid for a site encoding a transcription regulatory region of a synoviolin gene promoter.
  • the present inventor has conducted a rheumatoid arthritis disease state analysis centering on Synoviolin. Recently, in an analysis using Synoviolin knockout mice, it was found that the amount of Synoviolin that plays a role in ERAD is involved in the threshold of apoptosis induction by ER stress.
  • Synoviolin expression is ubiquitous according to heterozygous knockout (LacZ knock in mouse) expression analysis, Northern and Western analysis, suggesting that synoviolin expression is required in many cells. This is also inferred from the fact that Synoviolin knockout mice are embryonic lethal due to systemic enhancement of apoptosis. However, its expression varies, and it is particularly strong in cells with high secretory capacity (eg, kidney, testis, and nerve cells). This suggests that some cells require very high synoviolin expression. Transcriptional regulation mechanisms include (i) constitutive gene expression, including the basic transcription complex, and (ii) inducible gene expression for certain stimuli. There is no TATA box or initiator sequence in the Synoviolin promoter. In the case of such a promoter configuration, transcription factors such as SP1 and Ets family are important in inducing the transcription (Rudge, Exp Cell Res. Mar 10; 274 (1): 45'55. 2002).
  • Specific transcription factors include GABPa, GABPj3, a complex of GABPa and GABP] 3, Etsl, Tel, Fli-1 and the like.
  • GABP ⁇ is a member of the Ets family having an Ets domain, and is a protein having 454 amino acids.
  • GABP o! Is ubiquitously expressed in cells, It forms a heterodimer with GABP) 3 through the Ets domain.
  • GABPa is known to form a heterotetramer using two Ets binding sites. It also has several features in the regulation of target gene transcription. First, GABPa has the ability to bind DNA by the Ets domain, but does not have the ability to activate transcription. In contrast, GABP / 3 has no DNA-binding ability, but induces transcriptional activity by forming a dimer with GABPa, and has even higher transcriptional activation ability by forming a heterotetramer. (Yu M.
  • GABP ⁇ can also act as an initiator in the expression of genes without a TATA box or genes with multiple transcription start points (Yu M. J Biol Chem Nov 14; 272 (46): 29060-7 1997; Kamura TJ Biol Chem Apr 25; 272 (17): 11361-8. 1997). Furthermore, despite its expression being ubiquitous, GABP ⁇ acts synergistically with the transcription factor of a partner that binds to other sites, thereby being responsible for the expression of genes involved in cell-specific differentiation and proliferation ( Schaeffer L, EMBO J. Jun 1; 17 (11): 3078-90. 1998).
  • GABP i3 is not an Ets family member, but is a cofactor of GABP ⁇ having 382 amino acids, forms a heterodimer with GABP ⁇ via an Ankyrin repeat sequence, and has a transcription activation domain.
  • Etsl is a human homolog of v-Ets discovered in 1983 as a proto-oncogene of retrovirus E26 that causes erythroblastosis in chickens, and is a protein with 441 amino acids.
  • Tel is a protein with 452 amino acids, and it is reported that it works in the Ets family to suppress transcription. Clinically, it is known that chromosomal translocation of t (12; 21) forms a fusion gene with AML1 and causes leukemia.
  • Fli-1 is composed of 452 amino acids and is known to form a fusion gene with EWS by t (11; 22) chromosomal translocation and to cause Ewing sarcoma.
  • the Ets family is a transcription factor with a domain called Ets that is conserved from yeast to humans. This domain forms over thirty families, many of which are responsible for the transcriptional activity of molecules responsible for differentiation, proliferation, and apoptosis (DK Watoson and A. Seth, Oncogene. Review issue. Dec 18; 19 (55); 2000).
  • a restriction enzyme In order to obtain the promoter region, there is a method of cutting out from the synoviolin gene or mouse / human genomic sequence using a restriction enzyme.
  • a convenient restriction enzyme site is not always present at an appropriate position, by using a primer provided with a restriction enzyme recognition site in advance, it is possible to amplify a desired promoter region by PCR. Obtainable.
  • SEQ ID NO: 1 exemplifies the full-length promoter sequence of the mouse Synoviolin gene
  • SEQ ID NO: 2 exemplifies the full-length promoter sequence of the human Synoviolin gene.
  • SEQ ID NO: 8 shows a nucleotide sequence encoding EBS-1 which is a promoter core region
  • SEQ ID NO: 9 shows a nucleotide sequence encoding ABS-1
  • SEQ ID NO: 10 shows a nucleotide sequence encoding SBS-1.
  • the present invention is a decoy nucleic acid (decoy oligonucleotide) that binds to the transcription factor and can suppress promoter activity.
  • the decoy nucleic acid of the present invention refers to a short decoy nucleic acid containing a binding site of a transcription factor. The nucleic acid is introduced into a cell, and the transcription factor binds to the nucleic acid, whereby the original genomic binding site of the transcription factor is obtained. Has the function of competitively inhibiting the binding to, resulting in suppression of the expression of the transcription factor.
  • a decoy nucleic acid is a nucleic acid or an analog thereof, comprising at least one nucleic acid sequence capable of binding to a target binding sequence.
  • decoy nucleic acids of the present invention include, for example, a nucleic acid capable of binding to a transcription factor binding to EBS-1 of a promoter, a nucleic acid capable of binding to a transcription factor binding to ABS of a promoter, and a nucleic acid capable of binding to SBS-1 of a promoter.
  • a nucleic acid capable of binding to a transcription factor, Oligonucleotides containing these complements, mutants thereof, or nucleic acids containing these in the molecule are exemplified.
  • the decoy nucleic acid can be designed as a single strand or a double strand including its complementary strand based on the above sequence of EBS-1, ABS or SBS-1.
  • the length is not particularly limited, and is 15 to 60 bases, preferably 20 to 30 bases.
  • a nucleic acid capable of binding to a transcription factor that binds to EBS-BS and / or a complementary strand thereof (SEQ ID NO: 12) is preferably used as a decoy nucleic acid.
  • SEQ ID NO: 11 a nucleic acid capable of binding to a transcription factor that binds to EBS-BS and / or a complementary strand thereof (SEQ ID NO: 12) is preferably used as a decoy nucleic acid.
  • the nucleic acid may be DNA or RNA, or may include modified nucleic acids and / or pseudonucleic acids within the nucleic acid. Further, these nucleic acids, mutants thereof, or nucleic acids containing these in a molecule may be single-stranded or double-stranded, and may be circular or linear. A mutant is defined as a nucleotide sequence in which one or several (e.g., 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 2, etc.) bases of the decoy nucleic acid sequence are deleted, substituted, or added. And a nucleic acid having a function of inhibiting the promoter activity of the Synoviolin gene, that is, a function of binding to a transcription factor. It may be a nucleic acid containing one or more of the above base sequences. ,
  • the decoy nucleic acid used in the present invention can be produced using a chemical synthesis method or a biochemical synthesis method known in the art.
  • a nucleic acid synthesis method using a DNA synthesizer generally used as a gene recombination technique can be used.
  • a PCR method or a gene amplification method using one cloning vector may be used.
  • the desired nucleic acid may be produced by cleaving the nucleic acid obtained by these methods using a restriction enzyme or the like and ligating the nucleic acid using a DNA ligase.
  • a method for producing a decoy nucleic acid mutant can also be synthesized using a method known in the art, for example, by site-directed mutagenesis.
  • Site-directed mutagenesis methods are well known in the art, and commercially available kits such as the GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc. (Yukara Bio Inc.) can be used. Etc. can be used. .
  • the analysis of the transcriptional activity of a promoter using a decoy nucleic acid is generally performed by a staining method using annexin V, which is a specific marker of Luciferase, Gelshift, CAT, and Apotosis. Western plotting, FACS analysis, RT-PCR, etc. can be employed. Kits for performing these assays are also commercially available (eg, promega dual luciferase assay kit).
  • a luciferase gene is ligated as a report upstream of the transcription start site of the target gene.
  • a vector in which the cytomegalovirus (CMV) ⁇ galactosidase (; 8-gal) gene was linked to the downstream of the promoter as a reporter was simultaneously added to the cells. May be introduced.
  • CMV cytomegalovirus
  • 8-gal galactosidase
  • the cells into which the vector has been introduced are collected after culturing for a predetermined time, and the cells are disrupted by freeze-thawing or the like, and then luciferase and / 3-gal activity are measured using a fixed amount of cell extract.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating or preventing a disease caused by the expression of a synoviolin gene, comprising one or more of the above decoy nucleic acids.
  • the decoy nucleic acid of the present invention can be used as a pharmaceutical composition of the present invention as long as it has a binding activity to a target binding sequence.
  • the diseases to which the pharmaceutical composition of the present invention is applied include cell proliferative diseases and / or cranial nerve diseases such as rheumatoid arthritis, fibrosis, cancer and brain neuropathy.
  • the disease may be a single case or a combination of a plurality of diseases.
  • the type of cancer is particularly limited. No, brain, tongue, pharynx, lung, breast, esophagus, stomach, knee, biliary, gallbladder, duodenum, colon, liver, uterus, ovary, prostate, prostate, kidney Bladder cancer, rhabdomyosarcoma, fibrosarcoma, osteosarcoma, chondrosarcoma, skin cancer, various leukemias (e.g. acute myeloid leukemia, acute lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic lymphocytic leukemia, adult T cells Applicable for leukemia, malignant lymphoma, etc.
  • leukemias e.g. acute myeloid leukemia, acute lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic lymphocytic leukemia, adult T cells Applicable for leukemia, malignant lymphoma, etc.
  • the above-mentioned cancer may be a primary tumor, a metastasized tumor, or a disease associated with another disease.
  • cerebral nervous system disease examples include Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and Polydalmin's disease.
  • the medical composition of the present invention is used in such a form that the decoy is taken into the cells of the affected area or the cells of the target tissue.
  • the administration form of the pharmaceutical composition containing the decoy nucleic acid of the present invention can be any of oral and parenteral administration.
  • oral administration it can be administered in an appropriate dosage form, for example, tablets, pills, dragees, capsules, solutions, gels, syrups, slurries, and suspensions.
  • parenteral administration a pulmonary dosage form (for example, using a nephrizer), a nasal dosage form, a transdermal dosage form (for example, ointment or cream), an injection dosage form and the like can be mentioned.
  • an injection preparation it can be directly or indirectly administered systemically or locally to the affected site by intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection or the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention When used as a gene therapy agent, a method of directly administering the pharmaceutical composition of the present invention by injection and a method of administering a vector into which a nucleic acid has been incorporated can be mentioned.
  • the above vectors include adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, herpes virus vectors, vaccinia virus vectors, retrovirus vectors, lentivirus vectors, and the like. By using these virus vectors, It can be administered efficiently.
  • the endoplasmic reticulum retaining the pharmaceutical composition of the present invention is introduced into predetermined cells by the lipofection method. Then, the obtained cells are systemically administered, for example, from a vein or an artery. It can also be administered locally to the brain and the like.
  • a commercially available gene transfer kit (for example, AdenoExpress: Clontech) can also be used to introduce the light pharmaceutical composition into a target tissue or organ.
  • phospholipids As the lipid for forming the liposome structure, phospholipids, cholesterol nitrogen sulfide, and the like are used.In general, phospholipids are preferable, and phosphatidyl choline, phosphatidyl serine, phosphatidyl glycerol, and phosphatidylino are generally used. Examples include natural phospholipids such as citol, phosphatidylethanolamine, phosphatidic acid, cardiolipin, sphingomyelin, egg yolk lecithin, soybean lecithin, and lysolecithin, and hydrogenated products thereof according to a conventional method.
  • natural phospholipids such as citol, phosphatidylethanolamine, phosphatidic acid, cardiolipin, sphingomyelin, egg yolk lecithin, soybean lecithin, and lysolecithin, and hydrogenated products thereof according to a conventional method.
  • synthetic phospholipids such as dicetyl phosphate, distearoyl phosphatidylcholine, dipalmitoyl phosphatidylcholine, dipalmitoyl phosphatidylethanolamine, dipalmitoyl phosphatidylserine, eleostearoyl phosphatidylcholine, and eleostearoyl phosphatidylethanolamine can be used.
  • the method for producing the ribosome is not particularly limited as long as the decoy is retained, and a conventional method, for example, a reverse phase evaporation method (Szoka, F et al., Biochim. Biophys. Acta, Vol. 601 559) (1980)), ether injection method (Deamer, DW: Ann. ⁇ ⁇ Y. Acad. Sci., Vol. 308 250 (1978)), surfactant method (Brunner, J et al .: Biochim. Biophys. Acta , Vol. 455 322 (1976)).
  • a reverse phase evaporation method Szoka, F et al., Biochim. Biophys. Acta, Vol. 601 559) (1980)
  • ether injection method Deamer, DW: Ann. ⁇ ⁇ Y. Acad. Sci., Vol. 308 250 (1978)
  • surfactant method Brunner, J et al .: Biochim. Biophys. Acta
  • lipids including phospholipids can be used alone, but two or more lipids can be used in combination.
  • a compound having an atomic group having a positive group in the molecule such as ethanolamine-choline
  • ribosome formation additives such as cholesterols, stearylamine, and tocopherol
  • the ribosomes obtained in this manner include membrane fusion promoters such as Sendai virus, inactivated Sendai virus, and Senda virus in order to promote the uptake of the diseased cells or target tissues into the cells.
  • a membrane fusion-promoting protein purified from polyethylene, polyethylene glycol, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated according to a conventional method, and is pharmaceutically acceptable. It may include an acceptable carrier.
  • Such carriers may be additives, such as water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, propyloxyvinyl polymer, sodium carboxymethyl cellulose, sodium polyacrylate, Sodium alginate, water-soluble dextran, carboxymethylsuccinate, pectin, methylcellulose, ethylcellulose, xanthan gum, gum arabic, casein, agar, polyethylene glycol, diglycerin, glycerin, propylene glycol, cellulose , Paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin, mannitol, sorbitol, lactose, and surfactants acceptable as pharmaceutical additives.
  • the above-mentioned additives are selected singly or in appropriate combination from the above depending on the dosage form of the therapeutic agent of the present invention.
  • a solvent eg, physiological saline, 'buffer, glucose solution, etc.
  • Tween80, Tween 20, gelatin, human serum albumin, etc. are added thereto. Additional ones can be used.
  • it may be freeze-dried to give a dosage form that dissolves before use.
  • the lyophilization excipient include the following.
  • saccharides such as mannitol, glucose, lactose, sucrose, mannitol, sorbitol, starch such as corn, wheat, rice, potato or starch derived from other plants, methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose or sodium carboxymethylcellulose And gum such as cellulose, arabic gum, tragacanth gum, gelatin, collagen and the like.
  • disintegrating or solubilizing agents may be employed, such as cross-linked polyvinyl pyrrolidone, agar, alginic acid or a salt thereof (eg, sodium alginate).
  • the dose of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on age, sex, symptoms, administration route, administration frequency, and dosage form.
  • the administration method is appropriately selected according to the age and symptoms of the patient.
  • An effective dose is an amount of decoy nucleic acid that reduces the symptoms or condition of the disease. Therapeutic effects and toxicity of such nucleic acids can be assessed using standard pharmaceutical procedures in cell culture or laboratory animals, such as ED50 (a therapeutically effective dose in 50% of the population) or LD50 ( Dose that is lethal for 50%).
  • the dose ratio between therapeutic and toxic effects is the therapeutic index and it can be expressed as the ED50 / LD50.
  • the dose of the pharmaceutical composition of the present invention is, for example, 0.1 ⁇ g to 100 mg, preferably 1 to 10 g per kg of body weight per dose. However, the above therapeutic agents are not limited to these doses. Dosage for administration of adenovirus, a 10 6 ⁇ 10i 3 or so per day, administered in one week 1-8 week intervals. However, the pharmaceutical composition of the present invention is not limited to these dosages.
  • This example is an example relating to the construction of a plasmid for producing Synoviolin promoter overnight. .
  • EBS-lm G-76T: GCGCCGCCGTAAGTGAGGT (SEQ ID NO: 3)
  • PCR was performed using a reaction composition containing 1 pmol SyB / pBluescript, 100 pmol primer, 0.2 mM dNTPs 5 U polymerase, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3) and 50 mM KC1 in 50 l of the reaction solution. The PCR was performed under the following PCR conditions.
  • Second stage 1st cycle: 94, 1 minute ⁇ 55, 30 seconds Cool down to 30 ° C over 29 minutes ⁇ 30 ° C, 1 minute ⁇ 72 ° C over 9 minutes ⁇ 72 ° C, 1 Minute ⁇ (94 ° C, 30 seconds-55 ° C, 30 seconds ⁇ 72: 1 minute) X 25 times
  • EBS-lm (G-76T) is a primer for mutating the 2125th G of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 (the 76th (-76) upstream from TS) to a T
  • ABSm (G-68T) is a primer for mutating the 2133th (68th (-68) upstream from TS) G of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 to T
  • SBS-lm (G-92A, C-9lA) is the C at position 2112 (-91 from TS) of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 as A
  • the 2111th (TS) of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 Power, et al.-92) is a primer for mutating G to A.
  • This example is an example relating to functional analysis of the Synoviolin promoter.
  • a promoter analysis was performed.
  • Synoviolin has been found to be expressed in ubiquitous form based on analysis of transgenic mice (LacZ knock in) and the results of Northern and Western.
  • a region containing 2.2 k from the translation initiation site was ligated to a luciferase vector.
  • various cells described below, their transcriptional activity was examined with the construction cut from the upstream side. Cells were cultured in DMEM medium (Life Technologies, Inc.) supplemented with 10% inactivated fetal serum. did.
  • ATDC5 A mouse teratocai'cinoma cell AT805-derived substrain. Cartilage and pigment cell specific. Alkaline phosphatase positive.
  • HEK293 Human embryonic kidney-derived cells
  • NIH3T3 mouse embryo-derived fibroblasts
  • the transfection and reporter assembly were performed as follows.
  • the cells were prepared at 2 ⁇ 10 4 / well in 24-well plates. Twenty-four hours later, expression was performed using the FUGENE 6 kit according to the kit (Biochem. Roche) manual.
  • the protein was recovered 30 hours after the transfection. First, the medium was discarded, washed with PBS, and the cell lysate was recovered using 100 ⁇ l of Passive lysis buffer TM (Promega). Next, 201 of the cell lysate was transferred to a 96-well plate, and luciferase activity was measured in a luminometer overnight. Furthermore, after the ⁇ -gal activity was measured with a plate reader, the Luc value was divided by the 3-gal value and corrected. In addition, ⁇ -gal staining was performed as follows.
  • / 3-galactosidase was stained using X-gal (5-bromo-4-chloro-3D-indole-jS-D-galactopyranoside Sigma). Embryos were fixed with 4% paraformaldehyde for 20 minutes, immersed in X-gal solution, and stained at 37 for 12-24 hours. After staining, the cells were washed with PBS and fixed again with 4% phenol formaldehyde.
  • the transcription activity was reduced from 10% to 30% at 12 bases from -84 to -73 bp (FIGS. 1A and 1B).
  • the region from -114 to -1 containing that region had 94% homology with mouse and human, and further had 100% homology with 12 bases.
  • the base was found to have EBS (Ets binding site) (Fig. 1C).
  • the present inventors introduced mutations in the transcription factor binding sequence in the region before and after that region, and examined the effect of transcription on transcription using several cell lines.
  • EBS-1 synopiolin
  • a transcription factor that binds to EBS-1 (-89 to -65) was identified.
  • One Ets family forms more than 30 families, all of which have an Ets domain that is a DNA binding domain.
  • the central sequence is GGAA, and it is thought that the sequence following the sequence is important for binding to the sequence.
  • EMSA was performed as follows.
  • EBS-1 WT (from -89 to -65): CCCCGCGCCGCCGGAAGTGT (SEQ ID NO: 6)
  • EBS-1 MT (-89 to -65): CCCCGCGCCGCCGTAAGTGT (SEQ ID NO: 7)
  • a probe for EMSA was prepared by annealing a sense base and an antisense strand of a 25 base sequence at 90 ° C for 10 minutes.
  • T4 nuclease one Zekinaze the buffer first and ⁇ 32 P were mixed, the mixture was reacted at room temperature for 30 minutes.
  • the reaction solution was passed through a MicroSpin G-25 column (Amersham Pharmacia Biotech), and the collected fraction of the column was separated by centrifugation to obtain a labeled probe.
  • the radioactivity used was 30000 cpm or more per 1 ⁇ 1.
  • This example confirms the transcriptional control of Ets family 1 in NIH3T3 and the effects of GABP o; Fli-1, and Etsl on Synoviolin transcriptional activity.
  • ODN oligodeoxyribonucleotide
  • the decoy ODN was prepared by annealing sense and antisense oligonucleotides. Exponentially growing cells were trypsinized and transferred to 96-Pell plates (1x103 cells / Pell). Twenty-four hours later, 20 pmol of decoy ODN per well was placed in the well, and transfection was performed for 3 days using LipofectAMINE (Invitrogen, San Diego, CA) according to the kit instructions. To determine the growth of cells with the decoy ODN, cell proliferation assays were performed using Alamar Blue (Biosource International) according to the kit instructions. (2) Preparation of RNAi oligo and preparation of cell extract
  • NA was obtained by chemical synthesis.
  • the siR TA was prepared according to the protocol of Elbashir et al. (Elbashir, SM, Nature 411: 494-498. 2001). Cells in the logarithmic growth phase were trypsinized and transferred to 96-Pell plates (1 ⁇ 10 3 cells / Pell). Twenty-four hours later, 20 pmol of siRNA was placed in each well, and transfection was performed for 3 days using LipofectAMINE (Inviti'ogen, San Diego, CA) according to the kit instructions. To determine the growth of the siRNA cells, a cell growth assay was performed using Alamar Blue (Biosource International) according to the instructions for the drying (FIG. 7B).
  • the EBS-1 (G-76T) mutant and the EBS-1 wild type Transcriptional activity was performed using a promoter (-200 to +843).
  • NIH3T3 was treated with 200 nM decoy, and then the expression of Synoviolin was evaluated by Eastern blotting.
  • This example relates to identification of a site essential for synoviolin expression in a mouse embryo.
  • transgenic mice were prepared by overexpressing a plasmid in which LacZ was linked to the Synoviolin promoter.
  • Four types of Tg were produced by overexpressing a promoter with a single-base mutation in each of the 2.2-k and 1-k promoters. 4A)
  • Tg mice Construction of transgenic (Tg) mice and preparation of Tg mice were performed as follows.
  • LacZ staining was performed using 11.5 to 14.5 d.p.c (ays post coitus: embryo) embryos of synopiolin.
  • the transgenic mice transfected with 2.2k and 1k pro ⁇ and overnight showed staining at almost the same site as the hetero knockout mice.
  • the transgenic mice with the 2.2 k and 1 k promoters in which the single nucleotide mutation was introduced and the expression position of both were randomized depending on the system (Fig. 4B). .
  • This example confirms suppression of synoviolin expression in RA synovial cells.
  • decoy nucleic acids SEQ ID NOS: 11 and 12 that bind to GABPa that binds to EBS-1 and negative control decoy nucleic acids (SEQ ID NOs: 13 and 14) were also designed (FIG. 5).
  • ODNs 20 nucleotides in length were obtained by chemical synthesis.
  • Decoy ODM was made by annealing sense and antisense oligonucleotides.
  • the decoy nucleic acid was introduced into the cells as follows. That is, human rheumatoid synovial cells in the logarithmic growth phase were treated with trypsin, and cultured in DMEM containing 10% FCS at 1.0 ⁇ 10 3 cells / well in 96-well plates.
  • OPTI-MEM I Reduced-Serum Medium 45 x L mixed with the above decoy 0DN (2O uM) 51 1
  • OPTI-MEM I Reduced-Serum Medium 50 / i L mixed with Lipofectamine 2000 l'L , And pipetted lightly, and then left for 10 minutes. This was added to the cells in 10 L portions evenly. After culturing for 24 hours, 10/2 L of FCS was added, and the mixture was stirred gently and allowed to stand for 3 days of transfection (Fig. 6). The cells were used for cell proliferation according to the instructions of the kit.
  • ECL Plus kit (Amersham) was used for detection of HRP activity.
  • the NC membrane was blocked with TBS supplemented with 0.03% Tween 20 containing 5% skim milk for 1 hour at room temperature, and then anti-Synoviolin antibody or anti-] 3actin antibody was treated with TBS supplemented with 0.03% Tween 20 supplemented with 0.5% skim milk.
  • the immune reaction was carried out at room temperature for 1 hour.
  • the NC membrane was washed with 0.03% Tween 20 / TBS, and subjected to an immunoreaction at room temperature for 1 hour using a HRP-recognizing anti-Peagle IgG antibody as a secondary antibody. was detected to detect the target antigen.
  • This example confirms the functional effect of EBS-1 on synoviolin expression.
  • EBS-1 on synoviolin expression was examined.
  • ES S_1 decoy a decoy ODN (hereinafter referred to as "ES S_1 decoy") targeting EBS- -77 / -72) and introducing this EBS-1 decoy into NIH3T3 cells.
  • the effect of the EBS-1 decoy was confirmed by luciferase Atsui.
  • ATSEY was performed.
  • sample plasmid 100 ng
  • CMV- endogenous control DNA
  • FUGENE6 TM Fugene-containing cell sorting vector
  • Transfection was performed according to the manual (Roche) and added to a 24-well plate. After 30 hours of cultivation, the culture medium was aspirated, washed with PBS, cells Passive lysis buffer TM and (p rome g a, Inc.) was added to 100 L. The residue of the cell lysate was pelleted, the supernatant was recovered, and the luciferase activity and j3-gal activity were measured immediately.
  • the thickness Si buffer cell extracts 7 L (60 mM Na 2 HP0 4, 40 mM NaH 2 P0 4, 1 mM MgCl 2, 50 mM) 3 - Merukapute evening Bruno - le, 0.665 mg / ml Beauty nitrophenyl - j3 -D-galactoside) was added, followed by incubation at 37 ° C for 30 minutes. The 1.0 M Na 2 C0 3 160 ⁇ L and reaction was quenched by the addition, the absorbance was measured at 420 nm.
  • NIH3T3 cells were treated with trypsin, washed twice with cold PBS, and suspended in IX annexin-binding buffer (Vybi'ant apoptosis assay kit, Invitrogen) to prepare a concentration of IxlO 6 cells / ml. 100 il of cell suspension was used per test. Five Of FITC-labeled Annexin V and 1 l of PI standard curve II solution, incubate at room temperature for 15 minutes, add 400 1 of IX Annexin binding buffer, mix slowly, and analyze by FACSCalibur (Becton Dickinson) Was performed. In addition, Synoviolin is induced by ER stress: Since it has resistance to 7-potosis, the following experiment was performed to clarify the relationship between the amount of Synoviolin and apoptosis.
  • IX annexin-binding buffer Vybi'ant apoptosis assay kit, Invitrogen
  • NIH3T3 cells were prepared, and 24 hours later, GFP or Shinobi Shiroin siRNA (25 nM) was transfected into NIH3T3 cells using LIPOFECTAMINE 2000 (lnvitrogen) and incubated for 84 hours.
  • GFP or Shinobi Shiroin siRNA 25 nM was transfected into NIH3T3 cells using LIPOFECTAMINE 2000 (lnvitrogen) and incubated for 84 hours.
  • an EBS-1 decoy ODN was prepared in the same manner as described above, and this was transfected into NIH3T3 cells.
  • FIG. 8B the upper panel shows the results of Western blotting
  • the lower panel is a photomicrograph of NIH3T3 cells ( ⁇ 100).
  • Fig. 8C the upper panel shows the results of Western blotting.
  • the lower panel is a photomicrograph of NIH3T3 cells ( ⁇ 100).
  • NIH3T3 cells overexpressing Synoviolin were prepared and the effects of EBS-1 decoy nucleic acid were examined.
  • a stable cell line overexpressing Synoviolin 24 hours after transfection of NIH3T3 cells by LIPOFECTAMINE 2000 (Invitrogen), the cells were passaged by diluting them 10-fold with fresh growth medium. On the next day, a selection medium (containing 0.511 g / ml of G418) was added to obtain a clone stably expressing the HA-Synoviolin-HAHA / pcDN_A3 expression vector. In addition, HA-p cDNA3 empty vector was used as a control. Western blotting was performed using an antibody against the HA tag to confirm expression from the plasmid in each cell line.
  • EBS-1 decoy ODN Experiments were performed on apoptosis induction by the EBS-1 decoy ODN as follows. 84 hours after transfection of EBS'l decoy with FUGENE6 TM (Roche) reagent, cells were collected, placed in a microtube, and labeled with Annexin V-FITC. FACS analysis was used to determine the distribution of live and apoptotic cells. Furthermore, Western blotting using Synoviolin antibody was also performed. The ⁇ -actin antibody was used as a control, and the HA- 'antibody was used to confirm constant expression.
  • FIGS. 9A and 9B The results are shown in FIGS. 9A and 9B.
  • Synopioline-overexpressing cells acquired resistance to apoptosis induced by EBS-1 decoy (Fig. 9A, B).
  • apoptosis was quantified by FACS using Annexin V, apoptosis occurred in 51.1% of normal NIH3T3 cells, whereas the ratio was 29.8% in synoviolin overexpressing cells.
  • Figure 9B Of the scrambled and EBS-1 decoy panels in Figure 9B, the left picture is a micrograph of NIH3T3 cells at 1C0 magnification.
  • RASCs Human rheumatoid synovial cells (RASCs) in the logarithmic growth phase were treated with trypsin and cultured in DMEM containing 10% FCS at 1.5 ⁇ 10 4 cells / well in a 6-well plate. After 18 to 24 hours, the cells were washed once with DMEM with FCS and without antibiotics, and 1000 aL of DMEM without FCS and without antibiotics was added.
  • Reagents were TaqMan Universal PGR Master Mix (Roche) and Applied
  • hsGAPDH Human GAPDH
  • the cycle consisted of one cDNA extension reaction at 50 ° C for 10 min at 95 ° C.
  • the PCR amplification reaction was carried out 50 times at 95 ° C for 15 seconds and 601 minutes, and after a final extension reaction at 72 ° C for 5 minutes, the mixture was stored at 4 :.
  • RNA expression was performed using the software provided with the real-time PCR device.
  • the value of the Synoviolin gene expression was corrected by dividing by the expression level of hsGAPDH.
  • a decoy nucleic acid encoding a synoviolin gene promoter.
  • the decoy nucleic acid of the present invention can competitively bind to this transcription factor at the transcription factor binding site of synoviolin, and as a result, the activity of the nonoviolin promoter can be suppressed.
  • the decoy nucleic acid of the present invention is useful for treating various diseases such as rheumatism.
  • SEQ ID NO: 4 Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 5 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 6 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 7 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 11 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 12 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 13 synthetic DNA SEQ ID NO: 14: synthetic DNA

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Abstract

本発明は、シノビオリン遺伝子のプロモーターに対するデコイ核酸である。また、シノビオリン遺伝子のプロモーターの転写因子と結合してプロモーター活性を阻害することができるデコイ核酸、並びに以下の(a) 配列番号１１若しくは１２に示される塩基配列からなるデコイ核酸、又は、(b) 配列番号１１若しくは１２に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、プロモーター活性を阻害する機能を有するデコイ核酸である。

Description

シノピオリン遺伝子のプロモーターに対するデコイ核酸 技術分野
本発明は、 シノビオリン遺伝子のプロモーターに対するデコイ核酸に関する。 背景技術 明
関節リウマチ (以下、 RA という）は、 関節の滑膜組織に異常な増殖が見られる 全身性の慢性炎症性疾患である。 本発明田者は、 この滑膜組織の異常増殖に必須の 遺伝子としてシノビオリン (Synoviolin)遺伝子を同定している (WO 02/052007)。 シノビオリン遺伝子がコードしているシノビオリンは、 関節リゥマチ患者の滑 膜細胞ライブラリーから-、 抗滑膜細胞抗体を用いた免疫スクリーニングによりク ローニングされた膜タンパク質である。 シノビオリンをマウスで過剰発現させた 場合、 関節では、 滑膜の増生、 骨、 軟骨破壊が認められ、 関節炎と酷似した症状 が確認されたため、 軟骨 ·骨組織の発生、 分化、 再生および代謝へのシノビオリ ンの関与が示唆されている。 また、 最近では、 シノピオリンが線維症、 癌又は脳 神経疾患の発症にも関与することが見出されている（Genes Dev. 2003 Vol. 17: p.2436-49)。
シノビォリンの発現量は上記の疾患において重要であると考えられるため、 シ ノビオリンプロモーターの転写領域を検索するために、 マウスシノビオリン遺伝 子の上流プロモーター領域を切断して種々の長さを有する断片についてプロモー 夕一活性を調べた結果、 そのコア領域が特定され、 転写因子と相互作用すること が確認されている（Oncogene.2000 Vol. 19: p.6533-48)。 発明の開示
本発明は、 シノビオリン遺伝子のプロモーターの転写調節領域をコードする部 位に対するデコイ核酸を提供することを目的とする。
本発明者は、 上記課題を解決するために鋭意研究を行った。 そして、 シノピオ リン遺伝子の上記の部位に対するデコイ核酸を作製することに成功し、 本発明を 完成するに至った。
すなわち、 本発明は以下のとおりである。
(1) シノビオリン遺伝子のプロモーターの転写因子転写因子と結合してプロモー 夕一活性を阻害することができるデコイ核酸。
本発明のデコイ核酸は、 例えば以下の （a) 又は （b) のデコイ核酸を例示す ることができる。
(a) 配列番号 1 1若しくは 1 2に示される塩基配列からなるデコイ核酸
(b) 配列番号 1 1若しくは 1 2に示される塩基配列において 1若しくは数個の 塩基が欠失、 置換若しくは付加された塩基配列からなり、 かつ、 シノビオリン遺 伝子のプロモーター活性を阻害する機能を有するデコイ核酸
また、 本発明のデコイ核酸は、 例えば以下の （a) 又は （b) のデコイ核酸を 例示することができる。
(a) 配列番号 1 1及び 1 2に示される塩基配列からなるデコイ核酸
(b) 配列番号 1 1及び 1 2に示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基 が欠失、 置換若しくは付加された塩基配列からなり、 かつ、 シノビオリン遺伝子 のプロモータ一活性を阻害する機能を有するデコイ核酸
シノビオリン遺伝子のプロモーター活性を阻害する機能としては、 例えばプロ モー夕一の転写因子と結合する機能が挙げられる。
本発明のデコイ核酸は、 プロモーターの転写因子の結合部位である EBS(Ets binding site), SBS(Spl binding site)及び ABS(AML binding site)からなる群 から選ばれるいずれかの部位の塩基配列に基づいて設計することができる。
また、 本発明のデコイ核酸は、 滑膜細胞、 又は癌細胞にアポトーシスを誘導す ることができる。
(2) 上記デコイ核酸を含む、 シノビオリン遺伝子の発現に起因する疾患を治療又 は予防するための医薬組成物。
本発明の医薬組成物は、 さらに、 薬学的に許容可能なキャリア一を含むもので もよい。 本発明の医薬組成物の適用の対象となる疾患としては、 例えば、 関節リ ゥマチ、 線維症、 癌及び脳神経疾患からなる群から選ばれる少なくとも 1つが挙 げられる。
(3) 上記デコイ核酸を用いて、 シノビォリンの転写因子の転写活性を阻害する方 法。
(4) 上記デコイ核酸を用いて、 シノピオリンのプロモーター活性を阻害する方法。 (5) 上記デコイ核酸を用いて、 シノビォリンのプロモーター活性を阻害すること により、 シノビォリンの発現を抑制する方法。
(6) 上記デコイ核酸を用いて、 滑膜細胞、 又は癌細胞にアポトーシスを誘導する 方法。 図面の簡単な説明
図 1 Aは、 切断型シノビオリンプロモーターの活性を示す図である。
図 1 Bは、 切断型シノビオリンプロモーターの活性を示す図である。
図 1 Cは、 シノビオリンプロモータ一の Ets 結合部位及びコア領 を示す図 である。
図 1 Dは、 プロモータ一に変異を導入したときの転写活性を示す図である。 図 2 Aは、 ゲルシフトアツセィを行なった結果を示す写真である。
図 2 Bは、 ゲルシフトアツセィを行なった結果を示す写真である。
図 2 Cは、 ゲルシフ卜アツセィを行なった結果を示す写真である。
図 2 Dは、 ゲルシフトアツセィを行なった結果を示す写真である。
図 3 Aは、 シノビオリンプロモーターの転写活性を示す図である。
図 3 Bは、 シノビオリンプロモーターの転写活性を示す図である。
図 3 Cは、 RNAi を利用してノックアウトした NIH3T3 細胞にお W "るシノビ オリンプロモーターの転写活性を示す図である。
図 4 Aは、 2.2 kと 1 kのシノビオリンプロモーターに LacZを結 したプラ スミドの構築図である。
図 4 Bは、 マウス胚におけるシノビオリンプロモーターの発現を示 "写真であ る。
図 4 Cは、 マウス胚におけるシノビオリンプロモーターの発現を示 T"写真であ る。 図 5は、 デコイ核酸の配列を示す図である。
図 6は、 滑膜細胞中のシノビオリンの発現抑制確認試験の夕ィムスケジュール を示す図である。
図 7 Aは、 RA 滑膜細胞におけるシノビオリンプロモーターの発現を示す写真 である。
図 7 Bは、 滑膜細胞中のシノビォリンの発現抑制を測定した WST-8 アツセィ の結果を示す図である。
図 7 Cは、 滑膜細胞中のシノビオリンの発現をウェスタンプロッティングで確 認した結果を示す写真である。
図 8 Aは、 ルシフェラ一ゼアツセィを行った結果を示す図である。
図 8 Bは、 デコイ ODNを利用してシノビオリンをノックダウンした NIH3T3 細胞におけるアポト一シスを示す写真及びウェスタンプロッティングの結果を示 す図である。
図 8 Cは、 RNAiを利用してシノピオリンをノックダウンした NIH3T3細胞に おけるアポトーシスを示す写真及びウェスタンプロッティングの結果を示す図で ある。
図 9 Aは、 EBS-1デコイ ODNによるシノビォリンの発現抑制を示す写真であ る。
図 9 Bは、 シノビオリンを過剰発現した NIH3T3細胞における EBS-1デコイ OD N処理によるアポトーシスを示す。
図 1 0は、 EBS-1デコイを用いた、 RA滑膜細胞におけるシノビオリン RNAに 対する抑制効果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明は、 シノビオリン遺伝子のプロモーターの転写調節領域をコードする部 位に対するデコイ核酸を提供することを特徴とするものである。
1 . 概要
本発明者は、 シノビオリンを中心とした関節リウマチ病態解析を行っている。 最近、 シノビオリンノックアウトマウスを用いた解析において、 ER ストレスに よるアポトーシス誘導の域値に ERAD の機能を担うシノビォリンの量が関与し ていることを見出した。
そこで、 アポト一シス誘導の感受性を決定するシノビオリンの量を調節する転 写機構を解明するためにプロモーター解析を行い、 マウス細胞株及びマウス胚を 用いてシノビオリンの構成的発現を担う Ets 結合部位 （EBS； Ets binding site) を同定し、 そのエレメントがインビポにおいてシノビォリンの発現に必須 であることを証明した。 Ets は、 酵母からヒトまで保存されている転写因子であ る。 Ets ドメインは、 30 種類以上のファミリーを形成し、 その多くが分化 -増 殖 · アポトーシスを担う分子の転写活性を担っている（D.KWatoson and A.Seth,; Oncogene. review issue. Dec 18； 19(55) ； 2000)。 また、 NIH3T3細胞 において、 その EBS を介し Ets ファミリーの一つ GABP oi / )3複合体がその転 写制御に関与していることを示した。
シノビオリンの発現は、 ヘテロノックアウト (LacZ knock in mouse) の発現 解析、 ノーザン、 ウェスタンによる解析によればュビキタスであり、 多くの細胞 においてシノビオリンの発現が必要とされていることが考えられる。 このことは、 シノビオリンノックァゥ卜マウスが全身性のアポトーシス亢進にて胎生致死であ ることからも推察される。 但し、 その発現には強弱があり、 特に分泌能力の高い 細胞 （塍臓、 精巣、 神経細胞） においてその発現が強い。 このことは、 一部の細 胞においては、 シノビオリンの発現が非常に高く要求されていると考えられる。 転写制御機構には、 （i)基本転写複合体を含む構成的遺伝子発現と、 （ii)ある剌 激に対する誘導的遺伝子発現とがある。 シノビオリンのプロモーターには TATA ボックス、 イニシエータ一配列が存在しない。 このようなプロモータ一構成の場 合、 SP1 や Ets ファミリ一等の転写因子がその転写誘導において重要である (Rudge, Exp Cell Res. Mar 10;274(1):45'55. 2002)。
具体的な転写因子としては、 GABP a、 GABP j3 , GABP aと GABP ]3との複 合体、 Etsl、 Tel、 Fli-1などが挙げられる。
GABP αは、 Ets ドメインをもつ Ets ファミリ一の一つであり、 454 ァミノ 酸を有するタンパク質である。 GABP o!は、 細胞においてュビキタスに発現し、 Ets ドメインを介し、 GABP )3とへテロ 2量体を形成する。 さらに、 GABP aは、 2つの Ets 結合部位を使用して、 ヘテロ 4量体を形成することが知られている。 また、 ターゲット遺伝子の転写制御においていくつかの特徴を有する。 まず、 GABP aは Ets ドメインによる DNA結合能は有するが、 転写活性化能は有しな い。 これに対し、 GABP /3は、 DNA 結合能は有しないが、 GABP aと 2量体を 形成することにより転写活性を誘導し、 ヘテロ 4量体を形成することによりさら に高い転写活性化能を発揮する (Yu M. J Biol Chem Nov 14； 272(46)： 29060-7. 1997)。 また、 GABP αは、 TATA ボックスを持たない遺伝子や、 複数の転写開 始点をもつ遺伝子の発現においてイニシエータ一として働くことができる (Yu M. J Biol Chem Nov 14； 272(46): 29060-7. 1997； Kamura T.J Biol Chem Apr 25； 272(17)： 11361-8. 1997)。 さらに、 GABP αはその発現がュビキタスであるにも 関わらず、 他の部位に結合するパートナーの転写因子と相乗的に働くことにより、 細胞特異的な分化 ·増殖に関与する遺伝子の発現を担う （Schaeffer L， EMBO J. Jun 1；17(11)： 3078-90. 1998)。
GABP i3は Etsファミリ一ではないが、 382アミノ酸を有する GABP αのコフ ァクタ一であり、 Ankyrin リピート配列を介し GABP αとへテロ 2量体を形成 し、 転写活性ドメインを有する。
Etsl は、 1983 年に鶏に赤芽球症を起こすレトロウイルス E26 の癌原遺伝子 として発見された v-Etsのヒトホモログであり、 441アミノ酸を有するタンパク 質である。
Tel は、 452 アミノ酸を有するタンパク質であり、 Ets ファミリ一の中でも、 転写抑制に働くことが報告されている。 臨床的には、 t (12；21) の染色体転座に より AML 1と癒合遺伝子を形成し、 白血病を起こすことが知られている。
Fli-1は、 452アミノ酸からなり、 t (11;22) 染色体転座により EWSと癒合遺 伝子を形成し、 ユーィング肉腫を起こすことが知られている。
Ets ファミリ一は、 酵母からヒトまで保存された Ets と呼ばれるドメインを もつ転写因子である。 このドメインは、 30 種類以上のファミリーを形成し、 そ の多くが分化 ' 増殖 · アポト一シスを担う分子の転写活性を担っている (D.K.Watoson and A.Seth,; Oncogene. review issue. Dec 18； 19(55)； 2000)。 プロモーター領域を得るには、 シノビオリン遺伝子又はマウスゃヒトゲノム配 列等から、 制限酵素を用いて切り出す方法がある。 しかしながら、 一般的に都合 のよい制限酵素部位が適切な位置に存在するとは限らないため、 予め制限酵素認 識部位を設けたプライマーを用いることにより、 PCR で所望のプロモーター領 域を増幅することにより得ることができる。 また、 既に判明しているプロモータ 一領域の塩基配列情報をもとにして、 所望のプロモーター領域を化学合成するこ とも可能である。 このようにして、 転写因子結合部位として EBS の他に ABS 及び SBS の存在が示唆される。 実際に転写因子がその部位に結合するかどうか は、 それぞれの部位を変異させ、 その転写活性が低下することや、 ゲルシフトァ ッセィ （electrophoretic mobility sldft assay： EMSA)で解析して、 転写因子が 元来のプローブには結合するが、 一塩基変異導入後では結合しないことを確認す ることにより判断する。
ここで、 配列番号 1にマウスシノビオリン遺伝子の全長プロモーター配列を、 配列番号 2にヒトシノビオリン遺伝子の全長プロモーター配列を例示する。
また、 配列番号 8にプロモーターコア領域である EBS-1 をコードする塩基配 列を、 配列番号 9に ABS-1をコードする塩基配列を、 配列番号 1 0に SBS-1を コードする塩基配列を示す。
2 . デコイ核酸
本発明は、 上記転写因子に結合し、 プロモー夕一活性を抑制することができる デコイ核酸 （デコイオリゴヌクレオチド） である。 本発明のデコイ核酸は、 転写 因子の結合部位を含む短いおとり核酸を意味し、 この核酸を細胞内に導入し、 転 写因子がこの核酸に結合することにより、 転写因子の本来のゲノム結合部位への 結合が競合的に阻害され、 その結果、 その転写因子の発現が抑制されるような機 能を有する。 代表的には、 デコイ核酸は核酸又はその類似体であり、 標的結合配 列に結合しうる核酸配列を少なくとも一つ含む。
本発明の好ましいデコイ核酸の例は、 例えばプロモーターの EBS-1 に結合す る転写因子と結合し得る核酸、 プロモーターの ABS に結合する転写因子と結合 し得る核酸、 プロモーターの SBS-1 に結合する転写因子と結合し得る核酸、 こ れらの相補体を含むオリゴヌクレオチド、 これらの変異体、 又はこれらを分子内 に含む核酸などが挙げられる。 デコイ核酸は、 上記 EBS-1、 ABS又は SBS-1の 配列をもとに、 1本鎖、 又はその相補鎖を含む 2本鎖として設計することができ る。 長さは特に限定されるものではなく、 15〜60 塩基、 好ましくは 20〜30 塩 基である。
本発明においては、 例えば： EBS-Ι ·に結合する転写因子と結合し得る核酸 （配 列番号 1 1 ) 及び/又はその相補鎖 （配列番号 1 2 ) をデコイ核酸として好まし く使用することができる。
核酸は、 DNAでも RNAでもよく、 またはその核酸内に修飾された核酸及び/ 又は擬核酸を含んでいてもよい。 またこれらの核酸、 その変異体、 又はこれらを 分子内に含む核酸は、 1本鎖又は 2本鎖であってもよく、 また環状でも線状でも よい。 変異体とは、 上記デコイ核酸配列の 1又は数個 （例えば 1 個〜 10 個、 1 個〜 5個又は 1個〜 2個等） の塩基が、 欠失、 置換又は付加された塩基配列から なり、 かつ、 シノビオリン遺伝子のプロモーター活性を阻害する機能、 すなわち、 転写因子と結合する機能を有する核酸をいう。 上記塩基配列を 1つまたはそれ以 上含む核酸であってもよい。 ，
本発明で用いられるデコイ核酸は、 当業界で公知の化学合成法又は生化学的合 成法を用いて製造することができる。 例えば、 遺伝子組換え技術として一般的に 用いられる DNA合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。 また、 銬型となる塩基配列を単離又は合成した後に、 PCR 法又はクローニングベクタ 一を用いた遺伝子増幅法を使用することもできる。 さらに、 これらの方法により 得られた核酸を、 制限酵素等を用いて切断し、 DNA リガーゼを用いて結合する ことにより所望の核酸を製造してもよい。 さらに、 細胞内でより安定なデコイ核 酸を得るために、 塩基等にアルキル化、 ァシル化等の化学修飾を付加することが できる。 デコイ核酸の変異体の作製方法は、 当業界で公知の方法を用いて、 たと えば、 部位特異的突然変異誘発法等によって合成することもできる。 部位特異的 突然変異誘発法は当分野において周知であり、 市販のキッ ト、 例えば GeneTailor™ Site-Directed Mutagenesis System (インビトロジェン社製） 、 TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System ( Mutan-K、 Mutan-Super Express Km等 （夕カラバイオ社製） ） を使用することができる。 などを用いる ことができる。 .
デコイ核酸を使用した場合のプロモーターの転写活性の解析は、 一般的に行な われるルシフェラ一ゼアツセィ、 ゲルシフトアツセィ、 CAT アツセィ、 アポト —シスの特異的マーカ一であるァネキシン Vを用いた染色方法、 ウエスタンプロ ッティング法、 FACS解析法、 RT-PCR等を採用することができる。 これらのァ ッセィを行なうためのキッ トも市販されている （例えば promega dual luciferase assay kit) 。
例えばルシフエラ一ゼァッセィの場合は、 目的遺伝子の転写開始点の上流にレ ポー夕一としてホ夕ルルシフェラーゼ遺伝子を連結する。 また、 アツセィの対象 となる細胞間の導入効率を補正するために、 サイトメガロウィルス （CMV) ^ガ ラクトシダ一ゼ（；8 -gal)遺伝子をレポーターとしてプロモーターの下流につない だベクターを細胞に同時に導入してもよい。 細胞への導入は、 例えばリン酸カル シゥム法等を採用することができる。 ベクタ一を導入した細胞は所定時間培養し た後に回収し、 凍結—融解等によって細胞を破壊した後、 一定量の細胞抽出液を 用いてルシフェラーゼ及び /3 -gal活性を測定する。
これらの解析により、 デコイ核酸を使用した場合には、 シノビォリンの転写活 性が阻害され、 滑膜細胞、 癌細胞などのアポ卜一シスが誘導されることが示され る。
3 . デコイ核酸を含む医薬組成物
本発明は、 上記のデコイ核酸を 1又はそれ以上含む、 シノビオリン遺伝子の発 現に起因する疾患を治療又は予防するための医薬組成物に関する。 本発明のデコ ィ核酸は、 標的結合配列への結合活性を有する限り、 本発明の医薬組成物として 用いられる。
本発明の医薬組成物の適用疾患としては、 関節リウマチ、 線維症、 癌及び脳神 経疾患などの細胞増殖性疾患及び/又は脳神経疾患が挙げられる。 本発明の医薬 組成物を疾患に適用するにあたり、 上記疾患は単独の場合であっても複数の疾患 が併発した場合であってもよい。
本発明の医薬組成物を癌の治療剤として使用する場合は、 癌の種類は特に限定 されず、 脳腫瘍、 舌癌、 咽頭癌、 肺癌、 乳癌、 食道癌、 胃癌、 膝臓癌、 胆道癌、 胆嚢癌、 十二指腸癌、 大腸癌、 肝癌、 子宮癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 腎癌、 膀胱癌、 横紋筋肉腫、 線維肉腫、 骨肉腫、 軟骨肉腫、 皮膚癌、 各種白血病 （例えば急性骨 髄性白血病、 急性リンパ性白血病、 慢性骨髄性白血病、 慢性リンパ性白血病、 成 人型 T細胞白血病、 悪性リンパ腫） 等を対象として適用される。
上記癌は、 原発巣であっても、 転移したものであっても、 他の疾患と併発した ものであってもよい。
脳神経系疾患としては、 例えばアルツハイマー、 パーキンソン病、 ポリダル夕 ミン病が挙げられる。
本発明の医学的組成物は、 デコイが患部の細胞内または目的とする組織の細胞 内に取り込まれるような形態で用いられる。
本発明のデコイ核酸を含有する医薬組成物の投与形態は、 経口、 非経口投与の いずれでも可能である。 経口投与の場合は、 適当な剤型、 例えば錠剤、 丸剤、 糖 衣剤、 カプセル、 液剤、 ゲル、 シロップ、 スラリー、 懸濁物により投与が可能で ある。 非経口投与の場合は、 経肺剤型 （例えばネフライザ一などを用いたもの） 、 経鼻投与剤型、 経皮投与剤型 （例えば軟膏、 クリーム剤） 、 注射剤型等が挙げら れる。 注射剤型の場合は、 例えば点滴等の静脈内注射、 筋肉内注射、 腹腔内注射、 皮下注射等により全身又は局部的に直接的又は間接的に患部に投与することがで さる。
本発明の医薬組成物を遺伝子治療剤として使用する場合は、 本発明の医薬組成 物を注射により直接投与する方法のほか、 核酸が組込まれたベクタ一を投与する 方法が挙げられる。 上記ベクターとしては、 アデノウイルスベクター、 アデノ随 伴ウィルスベクタ一、 ヘルぺスウィルスベクタ一、 ワクシニアウィルスベクタ一、 レトロウイルスベクター、 レンチウィルスベクタ一等が挙げられ、 これらのウイ ルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。
また、 本発明の医薬組成物をリボソームなどのリン脂質小胞体に導入し、 その 小胞体を投与することも可能である。 本発明の医薬組成物を保持させた小胞体を リポフエクシヨン法により所定の細胞に導入する。 そして、 得られる細胞を例え ば静脈内、 動脈内等から全身投与する。 脳等に局所投与することもできる。 本発 明の医薬組成物を目的の組織又は器官に導入するために、 市販の遺伝子導入キッ ト (例えばアデノエクスプレス ： クローンテック社) を用いることもできる。 リ ポソーム構造を形成するための脂質としては、 リン脂質、 コレステロール類ゃ窒 素 S旨質等が用いられるが、 一般に、 リン脂質が好適であり、 ホスファチジルコリ ン、 ホスファチジルセリン、 ホスファチジルグリセロール、 ホスファチジルイノ シトール、 ホスファチジルエタノールァミン、 ホスファチジン酸、 カルジオリピ ン、 スフインゴミエリン、 卵黄レシチン、 大豆レシチン、 リゾレシチン等の天然 リン脂質、 あるいはこれらを定法に従って水素添加したものが挙げられる。 また、 ジセチルホスフェート、 ジステアロイルホスファチジルコリン、 ジパルミトイル ホスファチジルコリン、 ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン、 ジパ ルミ トイルホスファチジルセリン、 エレォステアロイルホスファチジルコリン、 エレォステアロイルホスファチジルエタノールァミン等の合成リン脂質を用いる ことができる。
リボソームの製造方法は、 デコイが保持されるものであれば特に限定されるも のではなく、 慣用の方法、 例えば、 逆相蒸発法 (Szoka、 Fら、 Biochim. Biophys. Acta, Vol. 601 559 (1980))、 ェ一テル注入法 (Deamer、 D.W.: Ann. Ν· Y. Acad. Sci., Vol.308 250 (1978))、 界面活性剤法（Brunner、 J ら： Biochim. Biophys. Acta, Vol. 455 322 (1976))等を用いて製造できる。
これらのリン脂質を含む脂質類は単独で用いることができるが， 2種以上を併 用することも可能である。 このとき、 エタノールアミンゃコリン等の陽性基をも つ原子団を分子内に有するものを用いることにより、 電気的に陰性のデコイ核酸 の糸吉合率を増加させることもできる。 これらリボソーム形成時の主要リン脂質の 他に一般にリボソーム形成用添加剤として知られるコレステロール類、 ステアリ ルァミン、 ひ一トコフエロール等の添加剤を用いることもできる。 このようにし て得られるリボソームには、 患部の細胞又は目的とする組織の細胞内への取り込 みを促進するために、 膜融合促進物質、 例えば、 センダイウィルス、 不活化セン ダイウィルス、 センダウィルスから精製された膜融合促進タンパク質、 ポリェチ レンダルコール等を添加することができる。
本発明の医薬組成物は、 常法にしたがって製剤化することができ、 医薬的に許 容されるキヤリァ一を含むものであってもよい。 このようなキヤリァ一は添加物 であってもよく、.水、 医薬的に許容される有機溶剤、 コラーゲン、 ポリビニルァ ルコール、 ポリビニルピロリ ドン、 力ルポキシビ二ルポリマー、 カルポキシメチ ルセルロースナトリウム、 ポリアクリル酸ナトリウム、 アルギン酸ナトリウム、 水溶性デキストラン、 カルボキシメチルス夕一チナトリゥム、 ぺクチン、 メチル セルロース、 ェチルセルロース、 キサンタンガム、 アラビアゴム、 カゼイン、 寒 天、 ポリエチレングリコ一ル、 ジグリセリン、 グリセリン、 プロピレングリコー ル、 ヮセリ ン、 パラフィン、 ステアリルアルコール、 ステアリン酸、 ヒト血清ァ ルブミン、 マンニトール、 ソルビトール、 ラクト一ス、 医薬添加物として許容さ れる界面活性剤等が挙げられる。
上記添加物は、 本発明の治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組 み合わせて選ばれる。 例えば、 注射用製剤として使用する場合、 精製されたデコ ィ核酸を溶剤 (例えば生理食塩水、'緩衝液、 ブドウ糖溶液等）に溶解し、 これに Tween80、 Tween 20、 ゼラチン、 ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用す ることができる。 あるいは、 使用前に溶解する剤形とするために凍結乾燥したも のであってもよい。 凍結乾燥用賦形剤としては、 例えば以下のものが挙げられる。 すなわち、 マンニトール、 ブドウ糖、 ラクト一ス、 スクロース、 マンニト一ル、 ソルビトール等の糖類、 トウモロコシ、 コムギ、 イネ、 ジャガイモまたは他の植 物由来のデンプン等のデンプン、 メチルセルロース、 ヒドロキシプロピルメチル セルロース又はカルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース、 ァラビ ァゴム、 トラガカントゴム等のゴム、 ゼラチン、 コラーゲン等などである。
所望により、 架橋されたポリビニルピロリドン、 寒天、 アルギン酸又はその塩 (例えば、 アルギン酸ナトリウム） 等の崩壊剤又は可溶化剤を使用することがで ぎる。
本発明の医薬組成物の投与量は、 年齢、 性別、 症状、 投与経路、 投与回数、 剤 型によって異なる。 投与方法は、 患者の年齢、 症状により適宜選択する。 有効投 与量は、 疾患の徴候又は状態を軽減するデコイ核酸の量である。 このような核酸 の治療効果及び毒性は、 細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順、 例 えば ED5O(集団の 50%において治療的に有効な用量)、 あるいは LD50(集団の 50 %に対して致死的である用量)によって決定され得る。
治療効果と毒性効果との間の用量比は治療係数であり、 ED50/LD50 として 表され得る。 本発明の医薬組成物の投与量は、 例えば 1回につき体重 1 kgあた り 0.1 ^ g〜100 mg、 好ましくは l〜10 gである。 但し、 上記治療剤はこれら の投与量に制限されるものではない。 アデノウイルスを投与する場合の投与量は、 1 日 1回あたり 106〜10i3個程度であり、 1週〜 8週間隔で投与される。 但し、 本発明の医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。
以下、 実施例により本発明をより具体的に説明する。 ただし、 本発明はこれら 実施例に限定されるものではない。
〔実施例 1〕
本実施例は、 シノビオリンプロモ一夕一の作製のためのプラスミド構築に関す る実施例である。 .
マウス（C57B1/6 系）のゲノムより、 シノビオリン遺伝子を含む 5 ' から 3 ' ま で約 7.5 k のゲノムを SyB/pBluescript にサブクローニングした。 その後、 シ ノビオリン遺伝子のプロモ一夕一領域を Xhol と Ncolで処理し、 約 2.2 kの断 片を抜き出し、 PGV-B2CTOYO 11^¾ 01 01^社)の中に揷入した(8 0-2.2 ]1)。 こ の約 2.2 kの断片を全長プロモー夕一とした （配列番号 1 ) 。 さらに、 全長プロ モーターの 5 ' 側から一部の領域を削除し、 プロモータ一領域を短くしたコンス トラクトを作製した。 作製したプロモータ一をまとめると表 1の通りである。
表 1 作製したプロモータ一一覧表 （マウス)
Figure imgf000015_0001
領域は、 上流 (5'側）に向かうときは TS (配列番号 1の第 2201番の t) の 1個 5'側の塩基を- 1 として数え、 下流 (3'側)に向かうときは TSを +1として数える。 なお、 ヒトのシノビ才リン遺伝子の切断型プロモータ一も、 マウスの場合と同 様に作成することがで者る （配列番号 2 ) 。 この場合の切断部位の位置を表 2に 示す。 表 2 作製したプロモー夕——覧表 （ヒト）
Figure imgf000016_0001
* 領域は、 上流 (5'側)に向かう ときは TS (配列番号 1の第 2201番の t) の 1個 5'側の塩基 を- 1として数え、 下流 (3'側)に向かうときは TSを +1として数える。 次に上記マウス由来プロモーターの変異体を作製するため、 オーバーラップ伸 長による部位特異的変異誘発法 (Molecular cloning, CSHL Press, 3 edition, 2001年， chapter 13) を用いて SyG'2.2 kG-76T/BV2を作製した。 使用したプ ライマーを以下に示す。
1 . EBS-lm(G-76T): GCGCCGCCGTAAGTGAGGT (配列番号 3 )
2 . ABSm(G-68T): AAGTGAGTTGTCTTACCCCC (配列番号 4 ) 3 . SBS-lin(G-92A;C-91A): ACTCCGCCAAGCCCCGCGCC (配列番号 5 )
PCRは、 反応液 50 l中、 1 pmol SyB/pBluescript, 100 pmolプライマ一、 0.2 mM dNTPs 5 Uポリメラーゼ、 10 mM Tris-HCl(pH8.3)及び 50 mM KC1 を含む反応組成液を用いて、 以下の PCR条件で行なった。
PCR条件
第一段階： 94 ° (：、 1分→ (94 °C、 30秒— 55 °C、 30秒→72°C、 1分） X 25 回
第二段階： 1サイクル目 ： 94 で、 1分→55 、 30秒 29分かけて 30 °Cま で冷やす→30 °C、 1分→9分かけて 72 °Cに→72 °C、 1分→ (94 °C、 30秒— 55 °C、 30秒→72 ：、 1分） X 25回
EBS-lm(G-76T) は、 配列番号 1に示す塩基配列の第 2125 番目 （TS から上 流に向かって 76番目（-76)) の Gを T に変異させるためのプライマ一であり、 ABSm(G-68T) は、 配列番号 1に示す塩基配列の第 2133 番目 （TS から上流に 向かって 68番目（-68)) の Gを Tに変異させるためのプライマ一であり 、 SBS- lm(G-92A，C-9lA)は、 配列番号 1に示す塩基配列の第 2112 番目 （TS から- 91 番目） の Cを Aに、 かつ、 配列番号 1に示す塩基配列の第 2111番目 （TS力、ら- 92番目） の Gを Aに変異させるためのプライマーである。 〔実施例 2〕
本実施例は、 シノビオリンプロモーターの機能解析に関する実施例である。 シノビオリンの量の調節機構を解明するために、 プロモータ一解析を行った。 なお、 シノビオリンは、 トランスジエニックマウス（LacZ knock in)の解析、 並 びにノーザン及びウエスタンの結果よりュビキタスに発現していることがわかつ ている。
まず、 シノピオリン プロモーターのクロ一ニング後、 翻訳開始点より 2.2 k を含む領域をルシフェラ一ゼベクターに結合させた。 様々な細胞 (下記）を用いて、 上流側から削ったコンストラクシヨンにてその転写活性を調べた。 なお、 細胞は、 10%不活化ゥシ胎児血清添加 DMEM培地 (Life Technologies, Inc.)を用いて培養 した。
使用した細胞
ATDC5：マウス teratocai'cinoma 細胞 AT805 由来の亜株。 軟骨および色素 細胞特異的。 アルカリフォスファターゼ陽性。
HEK293： ヒト胎児腎臓由来細胞
NIH3T3: マウス胎仔由来線維芽細胞
トランスフエクションとレポーターァッセィは以下の通り行なった。
細胞を 2 X 104/ゥエルにて 24 ゥエルプレートに準備した。 その 24 時間後、■ FUGENE 6キットを使用し、 キット（Biochem. Roche社）のマニュアルに従って 発現した。
またトランスフエクシヨン効率の補正のため、 CMV- /3 -galを各 50 ng使用し、 さらに全ベクターのみを入れて全量を 200 ngにそろえた。
トランスフエクシヨン後 30 時間でタンパク質を回収した。 まず、 培地を捨て た後、 PBSで洗い、 Passive lysis buffer™ (Promega社）を 100 x l用いて細胞 溶解物を回収した。 次にその細胞溶解物の 20 1を 96ゥエルプレートに移した 後、 ルミノメ一夕一にてルシフェラ一ゼ活性を測定した。 さらに、 β -gal 活性 をプレートリーダ一にて測定した後、 3 -gal 値で Luc 値を割り補正した。 なお、 ^ -gal 染色は以下のとおり行なった。 すなわち、 /3 -ガラクトシダーゼは X-gal を用い、 染色した （5-ブロモ -4-クロ口- 3-インドリ レ - jS -D-ガラクトピラノシド Sigma社)。 胚を 4% パラホルムアルデヒドで 20分間固定し、 X-gal溶液に浸し た後、 37 でで 12時間〜 24時間染色した。 染色後、 PBSで洗浄し、 再度 4% ノ\° ラホルムアルデヒドで固定した。
その結果、 -84から- 73 bpの 12塩基においてその転写活性が 10 %から 30 % に低下した （図 1 A、 B) 。
その領域を含む- 114から- 1 においては、 マウスとヒ卜で 94%の相同性を有し、 さらに 12 塩基においては、 100 %の相同性であった。 コンピュータを用いたバ ィ ォっ ノ フ ォ マアイ ク ス角 析ソ フ 卜 (http：〃 www.cbrc.]p/i'esearch/ab/ TFSEARCHJ.html)にて解析を行った結果、 その 12塩基に EBS(Ets結合部位） が存在することが判明した (図 1C)。 次に本発明者は、 その領域を含む前後の領域における転写因子結合配列に変異 を導入し、 いくつかの細胞系を用いて、 その音 立の転写に及ぼす影響について検 討した。
図 1D にみられるように EBS の点変異により、 ほぼすベての細胞系にてその 活性が約 9%から 40%程度に低下した。 これらのことから、 この EBSは、 シノ ピオリンの構成的発現を担う必須のエレメントであると考えられた （以後 EBS- 1とする） 。
〔実施例 3〕
本実施例は、 EBS-1(- 89から- 65)に結合する転写因子を同定したものである。 Ets ファミリ一は 30種類以上のファミリーを形成し、 すべて DNA結合ドメ インである Ets ドメインを有する。 またその中心配列は GGAAであり、 その配 列への結合にはその配列に続く配列が重要であると考えられている。
まず、 その 12塩基配列を含んだプローブを使用し、 実際にその配列に転写因 子が結合するかどうか検討した。 この転写因子の結合試験は、 ゲルシフトアツセ ィ（EMS A)により行った。
EMSAは以下の通り行った。
プローブ
EBS-1 WT (-89から- 65): CCCCGCGCCGCCGGAAGTGT (配列番号 6 ) EBS-1 MT (-89から -65): CCCCGCGCCGCCGTAAGTGT (配列番号 7 )
EMSA 用のプローブは、 25 塩基配列のセンス鎖とアンチセンス鎖を 90°Cで 10分ァニーリングさせることにより作製した。
次に、 T4 ヌクレア一ゼキナーゼ、 バッファ一およびァ 32P を混合し、 混合液 を室温で 30 分反応させた。 反応液を MicroSpin G-25 カラム（Amersham Pharmacia Biotech 社）に通し、 採取されたカラムのフラクションを遠心にて分 離し、 標識したプロ一ブを得た。 放射活性は 1 ^ 1あたり 30000 cpm以上のもの を使用した。
10 z gのタンパク質、 反応バッファー及びプローブを混ぜ、 室温で 30分反応 させた。 スーパーシフトの場合は、 プローブと反応させる前に 1時間 4 °Cで反応 させた。 その反応液を非変性ゲルにて 100 v、 50 mAで 3時間程度泳動させた。 ゲルを乾燥させた後、 Fuji BAS2000を用いオートラジオグラフィ一にて解析し た。
その結果、 NIH3T3 の核抽出液を使用したゲルシフ トにより、 4つのバンド (図 2 A の a、 b、 c、 d の位置のバンド）が形成される ことが判明した。 さらに cold competition (標識していないプローブを用いた競合試験）により、 そのすベ てのバンドが消失し、 1塩基変異を入れたプローブにおいてはその阻害が見られ なかった （図 2A) 。
次に、 どの Ets ファミリーが結合するかを検討するため、 Etsl/Pea3、 Ets プ ローブの cold competitionを行ったところ、 Etsl/Pea3のプローブで競合阻害さ れ、 その変異によりその阻害が消失した (図 2B、 5と 6番のレーン)。
' このことは、 Etsl/Pea3プローブ (Santa Cruz社）に結合する因子である Ets 1、 Pea 3、 GABP 等の転写因子である可能性が考えられた。 さらにさまざまな抗 体を使用して、 スーパ一シフト試験を行ったところ、 &ΑΒΡ αと Telがス一パー シフトし、 Fli-1は阻害効果を示した (図 2Bの 5， 6番のレーン、 図 2Cの 6、 7、 8 と 10、 11、 12番のレーン)。 また、 GABP a、 Fli-1. Etsl のインビトロ翻訳 産物でゲルシフト試験を行ったところ、 そのすべてにスーパ一シフ卜が見られた。 これらのことから、 この配列には複数の Ets ファミリーが結合することが示さ れた。
次に、 スーパ一シフトした GABP aによる GABP |3との複合体形成について 検討を行なった。 それぞれインビトロ翻訳産物を用い、 ゲルシフト試験を行った ところ、 GABP O!タンパク質に GABP ]3タンパク質を il口えたレーン 7において、 新たなバンド a、 b (複合体)の形成が認められた （図 2D) 。 さらに、 GABP o!抗 体を加えるとその複合体 a、 bが消失しスーパ一シフト した （図 2D、 レ一ン 8、 9) 。 また GABP /3抗体を加えたところ、 複合体 aの形成が阻害された （図 2D、 レーン 10、 11) 。
これらのことから、 GABP o; / i3は、 シノビオリン プロモーターの EBS-1 に て複合体を形成することがわかった （図 2D) 。 〔実施-例 4〕
本実施例は、 NIH3T3 における Ets ファミリ一による転写制御および GABP o;と Fli-1、 Etsl のシノビオリン転写活性に対する効果を確認したもので ある
それぞれ EBS-1 に結合する転写因子の細胞内でのシノビォリンの転写活性化 能を評価するため、 転写活性化アツセィを行った。
(1) ODNのオリゴ作製と細胞抽出液の作製
20 ヌクレオチド長のオリゴデォキシリボヌクレオチド (ODN)は化学合成によ り得た。 decoy (デコイ） ODN はセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドのァ ニーリングにより作製した。 対数増殖期の細胞をトリプシン処理し、 96-ゥエル プレート（1x103細胞/ゥエル）に移した。 24時間後、 1 ゥエルあたり 20 pmol の デコイ ODN をゥエルに入れ、 LipofectAMINE(Invitrogen 社、 San Diego, CA)を用いてキットの説明書に従って 3日間トランスフエクシヨンを行った。 デ コィ ODN を有する細胞の増殖を決定するために、 Alamar Blue(Biosource International社)を用いて、 キットの説明書に従って細胞増殖アツセィを行った。 (2) RNAiのオリゴ作製と細胞抽出液の作製
21ヌクレオチド長の : NAは化学合成により得た。 siR TAは Elbashirらのプ 口トコ一ル （Elbashir, S.M., Nature 411： 494-498. 2001) に従って作製した。 対数増殖期の細胞をトリプシン処理し、 96-ゥエルプレート（1X103細胞/ゥエル） に移した。 24 時間後、 1 ゥエルあたり 20 pmol の siRNA をゥエルに入れ、 LipofectAMINE (Inviti'ogen社， San Diego, CA)を用いてキッ卜の説明書に従つ て 3日間トランスフエクシヨンを行った。 siRNA 細胞の増殖を決定するために、 Alamar Blue (Biosource International 社)を用いて、 干ッ卜の説明書に feつて 細胞増殖ァッセィを行った (図 7B)。
(3) 結果
NIH3T3 において、 Fli-1 はシノビオリン転写活性を抑制し、 GABP o;はその 転写活性を増加させる結果が得られた （図 3A、 B) 。 ま 、 GABP , GABP j3 の RNAiにてノックァゥトした NIH3T3細胞では、 シノビオリンの転写も低下 が認められた. （図 3C) 。 これらのことから NIH3T3において、 GAJBP a / j8複合 体がシノビオリンの発現を担っていることが考えられた。
さらに、 その GABP a/ ]3複合体力 S EBS-1を介してシノビオリンの転写活性を 担っていることを証明するため、 EBS-1(G-76T)変異体および EBS- 1野生型の有 するプロモータ一 (-200から +843)を使用し転写活性アツセィを行つた。
その結果、 変異体が全く活性化されないにもかかわらず、 野生型では約 3倍の 転写活性化がみられた。
(4)ウエスタンプロッティング
最後に NIH3T3 を 200 nMのデコイで処理した後、 シノビオリンの発現をゥ エスタンブロッテイングにて評価した。
ウエスタンブロッテイング解析は以下の通り行った。 すなわち、 糸田胞培養物を 回収し、 1% NP-40, 25 mM ris_HCl、 pH 6.8、 0.25% SDS、 0.05% 2-メルカ ブトエタノール及び 0.1%グリセロールを含む溶液中で溶解させた。 透明な細胞 溶解物のァリコートを SDS-ポリアクリルアミドゲル上で分離した。 分離した夕 ンパク質をニトロセルロース膜に移し、 抗シノビオリンモノク口一ナル抗体を用 いてィムノブロットを行った。 結合した抗体を、 ペルォキシダ一ゼ 吉合ャギ抗マ ウス免疫グロブリン及び E CL検出システム (Amersham Pharmacia Biotech社） により検出した。
その結果、 EBS-1 野生型で処理したシノビォリンの発現は約半分に低下した。 これらのデータから GABP a / /3により EBS-1を介して、 シノビォリンの転写 が制御されていることが示された。
〔実施例 5〕
本実施例は、 マウス胚におけるシノビオリンの発現に必須の部位の同定に関 するものである。
次に、 マウスの胚においてインビポにおける EBS-1 の効果を確認するため、 シノビオリンプロモーターに LacZを結合したプラスミドを過剰発現させたトラ ンスジエニックマウスを作製した。 Tgは全長 2.2 kと 1 kのプロモ一夕一とそ れぞれ 1塩基変異を入れたプロモーターを過剰発現させた 4種類を作製した （図 4A)
トランスジエニック（Tg)マウス用のコンストラクシヨンと Tgマウスの作製は 以下の通り行なった。
SyG-2.2k/BV2 から Notl と Ncol で約 2.2 k の断片を抜き出した後、 SyTB/pBluescript へ挿入し、 SyL- 2.2kiwt/Blue script を作製した。 さ らに、 SyL-2.2kmG-76T/pbs 、 SyL-200wt/pBluescript 及 び SyL'2 O0mG- 76T/pBluescript を、 それぞれ SyG より取り出した断片を用いて作製した。 各 構築物について、 それぞれ QIAGEN Plasmid Kit (QIAGEN社)を使用し精製後、 Sealにて線状化した DNAを BDFマウス（C57BL/6Nと DBA/2Nの交配による 仔マウス）の受精卵の核内に直接マイクロインジェクションし、 仮親の卵管に移 植した。 それぞれ、 8から 9母胎より誕生したマウスの尾からゲノムを抽出し、 サザンプロット法にて Tgマウスであることの確認を行った。
これらの Tgマウスからシノビォリンの発現を検討するため、 胚による X-gal 染色を行った。 その LacZ をノックインしたノックアウトマウスの胚における LacZの発現と今回作製した 4つの Tgマウスの発現を比較検討した。
シノピオリンの 11.5から 14.5 d.p.c( ays post coitus：胎齢）の胚を使用し、 LacZ染色を行った。 2.2 kと 1 kのプロ^ &一夕一を導入したトランスジエニック マウスは、 ヘテロノックアウトマウスとほぼ同じ部位に染色がみられた。 驚いた ことに、 1塩基変異を導入した 2.2 kと 1 kのプロモーターを導入したト ランス ジエニックマウスは、 そのどちらも発現 15位がその系によりランダムになること が確認された （図 4B) 。
転写活性化に必要な領域がなくな ¾と、 上記結果と同様の結果が得られること が報告されている (pax5、 collla2等)。 これらのことから、 EBS'lは、 シノビォ リンの転写に必須の部位であることが判明した。
さらに、 その発現と GABP aの発現を 13.5 d.p.cの胚を用いて比較しだところ、 ほぼ同様の部位に発現していることが半【J明した（図 4C)。 以上の結果より 、 胚発 生においても、 インビトロの結果と同欉、 GABP a力 S EBS-1 を介してシノビォ リンの発現を制御していることが示された。 〔実施例 6〕
本実施例は、 RA 滑膜細胞におけるシノビォリンの発現抑制を確認したもので める。
関節リウマチの滑膜細胞における EBS-1 を介した GABP aの効果について検 討を行ったところ、 滑膜細胞の核抽出液を甩いたゲルシフトにおいても、 NIH3T3 の各抽出液のときと同様に GABP o!にてスーパ一シフトが得られた。 さらにその EBS-1 のリウマチ滑膜細胞における意義、 すなわち GABP aによる EBS-1 を介した転写制御がシノビォリンの発現抑制につながり、 最終的に滑 S宴 細胞の増殖抑制となるかことを確認するため、 EBS-1 デコイによるシノビオリ ンの発現抑制について検討した。
まず、 上記の EBS-1に結合する GABP aと結合するデコイ核酸 （配列番号 11、 12) およびネガティブコントロールのデコイ核酸 （配列番号 13、 14) も設計し た （図 5 ) 。 20 ヌクレオチド長の ODN は化学合成により得た。 デコイ ODM はセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドのァニ一リングにより作製した。 以下のように、 デコイ核酸を細胞に導入した。 すなわち、 対数増殖期のヒトリ ゥマチ滑膜細胞をトリプシン処理し、 10%FCSを含む DMEMにて 96ゥエルプ レートに 1.0 X 103細胞/ゥエルで培養した。 18〜24時間後、 FCS 無し、 抗生物 質無しの DMEMで一度洗浄し、 FCS無し、 抗生物質無しの DMEM 90 Lを添 加した。 OPTI-MEM I Reduced-Serum Medium 45 x L、 上記のデコイ 0DN(2O u M)5 1 を混ぜだものを OPTI-MEM I Reduced-Serum Medium 50 /i L、 Lipofectamine 2000 l 'L を混ぜたものに加え、 弱くピペッティングした後 lO 分間放置した。 これを細胞に 10 Lずつまんべんなく添加した。 24時間培養後、 FCS を 10/2 L加え、 軽くかき混ぜて放置して 3日間トランスフエクシヨンを行 つた （図 6 ) 。 この細胞を用いてキットの説明書に従って細胞増殖アツセィに供 した。
HRP活性の検出には ECL Plusキット (Amersham社)を用いた。
その結果、 約半分にその発現の低下が認められた （図 7 A) 。
上記の細胞を 24時間培養後、 WST-8アツセィに供するとともに、 この 24 P寺 間後細胞破砕液にて細胞を溶解し、 ウエスタンブロッテイングを行った。 wsr- 8アツセィは Cell Counting Kit-8(Dojindo社）を用い 上記 24時間培養後の細 胞に Cell Counting Kit-8(Dojindo社、 WST-8)を添加し、 4時間後の吸光度 (450 nm)を測定して行った。 ウェスタンブロッテイング ま、 細胞破碎液 15 mM Tris(pH 7.5)、 200 mM NaCL 0.5% NP40、 0.1% SIDS、 1 mM PMSF、 2 ji g/mL リュ一ぺプチン（leupeptin)、 2 g/ mL ァプ CIチニン（aprotinin)、 2 g/mL ぺプスタチン (pepstatin)にて調製後、 SDS-PAGIE により分離し、 エレク トロブロッテイング法によりニトロセルロース （NC) .膜に転写した。 この NC 膜に対し、 5 %スキムミルクを加えた 0.03 %Tween 20 添加 TBSで室温、 1時間 ブロッキングした後、 抗シノビオリン抗体又は抗 ]3ァクチン抗体を 0.5 %スキム ミルクを加えた 0.03% Tween20添加 TBSで室温、 1 間免疫反応させた。 反応 後の NC膜を 0.03 % Tween 20/TBSで洗浄し、 HRP鎮識抗ゥサギ IgG抗体を 2 次抗体として、 室温、 1 時間免疫反応させ、 0.03 % T een 20/TBS で洗浄し、 HRP活性を検出することにより目的抗原を検出した。
WST-8アツセィの結果を図 7 Bに、 ウエスタンプロ、ッティングの結果を図 7 C に示す。 図 7 B に示すとおり、 スクランブルデコイ核 «導入細胞 (ネガティブコ ントロール)に比べ、 EBS- 1 デコイ核酸導入細胞では慶位に細胞増殖活性が抑制 されており、 図 7 Cに見られるとおり、 ウエスタンブ！ =3ッティングにおいてもシ ノビオリンタンパク質生成量の減少が見られた。
以上の結果から、 RA 滑膜細胞において、 上記デコ 核酸を用いるとプロモー 夕一活性が抑制されることが示された。
〔実施例 7〕
本実施例は、 シノビオリン発現における EBS- 1 の機能的な効果を確認した ものである。
( 1 ) ルシフェラーゼアツセィ
シノビオリン発現における EBS- 1 の機能的な効^の検討を行った。 まず、 EBS- -77/-72)を標的とするデコイ ODN (以下、 『ES S_ 1 デコイ』 という）を合 成し、 この EBS- 1デコイを NIH3T3細胞に導入することにより、 シノビオリン の調節における EBS- 1 デコイの効果をルシフェラーゼアツセィにより確認した。 FITC を用いた免疫化学分析により、 NIH3T3 細胞に導入された EBS-1 デコイ の効果は 80 %以上であることを確認してからアツセィを行った。
NIH3T3 細胞への一過性トランスフエクシヨンを行うため、 試料プラスミド (100 ng)及び内在コントロール DNA(CMV- ;S -ガラクトシダ一ゼ発現べクタ一 50 ng)を FUGENE6TM(Roche社）を用いて、 マニュアル (Roche社）に従ってトラ ンスフエクシヨンして、 24ゥエルプレートに添加した。 30時間培養後、 培養液 を吸引し、 PBSで洗い、 細胞に Passive lysis buffer TM (promega社）を 100 L を加えた。 その細胞溶解物の残渣をペレットとして沈殿させ、 上清を回収し、 す ぐにルシフェラ一ゼ活性及び j3 -gal 活性を測定した。 細胞抽出物中のルシフエ ラーゼ活性を測定するために、 細胞溶解液 20 Lをアツセィバッファ（0.25 mM ATP, 10 mM MgCl2、 100 mMリン酸カリゥム、 pH 7.8)100 i Lに添加した。 発光は MicoLumat Plus(Perkin Elmer- Cetus社)で測定した。 ]3 -galアツセィ は以下のとおり行った。 すなわち、 細胞抽出物 7 L にアツセィバッファ（60 mM Na2HP04、 40 mM NaH2P04、 1 mM MgCl2,50 mM )3 -メルカプトェ夕ノ —ル、 0.665 mg/ml びニトロフエニル - j3 -D-ガラクトシド）を lOO ^ L加えた後、 37°Cで 30分間ィンキュベーションした。 1.0 M Na2C03を 160 ^ L加えて反応 を停止させて、 420 nmで吸光度を測定した。 ルシフェラーゼ測定値は全て、 プ ラスミド CMV- /3 -ガラクトシダ一ゼで発現した ]3 -ガラクトシダーゼに対するト ランスフエクシヨン効率で標準化 （補正） し、 得られた値を相対ルシフェラーゼ 活性とした。 さらに、 これらの値を SyG-200/+843に対して相対化し、 平均を求 めた。
その結果、 EBS-1 デコイを導入した細胞の抽出物を用いたルシフェラ一ゼァ ッセィでは、 トランスフエクション試薬のみの場合と比べて、 EBS-1 デコイで は、 28.4%まで低下しており、 それにより、 転写が抑制された （図 8 A) ことが 示された。
( 2 ) ァネキシン Vによる染色
NIH3T3細胞をトリプシン処理し、 冷 PBSで 2回洗浄し、 I Xァネキシン結合 ノ、ッファ（Vybi'ant apoptosis assay kit, Invitrogen社）に懸濁し、 IxlO6細胞/ ml の濃度となるように調製した。 1試験あたり、 細胞懸濁液 100 i lを使用した。 5 の FITC標識ァネキシン Vおよび 1 lの PI検量線甩溶液を加え、 室温で 15 分間インキュベートした後、 400 1の I Xァネキシン結合バッファを加え、 ゆつ くり撹拌した後、 FACSCalibur(Becton Dickinson社）により解析を行なった。 また、 シノビオリンは ERストレスにより誘導される： 7ポト一シスに抵抗性を 有することから、 シノビォリンの量とアポトーシスの関係を明らかにするために 以下の実験を行なった。
NIH3T3細胞を調製し、 24時間後に GFP又はシノビ才リンの siRNA(25 nM) を、 LIPOFECTAMINE 2000(lnvitrogen社）を用いて NIH3T3細胞にトランス フエクシヨンし、 84 時間インキュベートした。 また、 記と同様にして EBS-1 デコイ ODNを作製し、 これを NIH3T3細胞にトランスフエクシヨンした。
その結果、 EBS-1 デコイ核酸を用いてシノピオリンの転写阻害による影響を みたところ、 NIH3T3 細胞においてアポトーシスが誘導された （図 8 B) 。 図 8 B において、 上パネルはウエスタンブロッテイングの結果を示し、 下パネルは NIH3T3細胞の顕微鏡写真である（100倍)。 同様に、 NIH3T3細胞において、 シ ノビォリンの RNAi によりシノビォリンの発現量を低 "Fさせたところ、 アポト 一シスが誘導された （図 8 C) 。 図 8 C において、 上パネルはウエスタンブロッ ティングの結果を示し、 下パネルは NIH3T3細胞の顕微鏡写真である（100倍)。
( 3 ) FACS解析
さらに、 シノビオリンを過剰発現する NIH3T3細胞を作製し、 EBS-1 デコイ 核酸による影響を検討した。
シノビオリンを過発現する安定細胞株の樹立については、 LIPOFECTAMINE 2000(Invitrogen社）による NIH3T3細胞へのトランスァェクシヨンから 24時間 後、 細胞を新鮮増殖培地で 10 倍希釈して継代した。 翌日、 選択培地 (G418 を 0.511 g/ml 含有）を添加し、 HA-Synoviolin-HAHA/pcDN_A3 発現べクタ一を安定 発現するクローンを得た。 なお、 対照として又は HA-p cDNA3 空ベクターを使 用した。 各細胞株においてプラスミドからの発現を確認するため、 HA タグに対 する抗体を用いてウエスタンプロッティングを行った。
EBS-1 デコイ ODN によるアポト一シス誘導については、 次の通り実験を行 つた。 FUGENE6™ (Roche社)試薬による EBS'lデコイのトランスフ クシヨンを 行って 84 時間後に、 細胞を回収してマイクロチューブに入れ、 ァネキシン V- FITC でラベルした。 FACS 分析により、 生細胞とアポトーシスを起こした細胞 との分布状態を測定した。 さらに、 シノビオリン抗体を用いたウエスタンブロッ ティングも行った。 なお、 対照として^ -ァクチン抗体を使用し、 定発現の確 認用として HA- '抗体を使用した。
結果を図 9 A 及び図 9 B に示す。 シノピオリン過剰発現細胞では、 EBS-1 デ コィによるアポトーシスに対する抵抗性が獲得された （図 9 A、 図 B) 。 加え て、 ァネキシン Vを用いた FACS によるアポトーシスの定量化を行なったとこ ろ、 通常の NIH3T3細胞においては 51.1 %がアポト一シスを起こしていたが、 シノビオリン過剰発現細胞では、 その割合が 29.8%であった （図 9 B) 。 図 9 B のスクランブルと EBS-1 デコイのパネルのうち、 左側の写真は、 1C0 倍の倍率 による NIH3T3細胞の顕微鏡写真である。
以上のことから、 EBS-1 を介して転写調節を抑制すると、 シノピオリンの発 現が抑制され、 NIH3T3細胞のアポトーシスが誘導されることが示された。
〔実施例 8〕
本実施例は、 EBS-1デコイがシノビオリン RNAの発現を抑制することを、 リ アルタイム PCRにより確認したものである。
対数増殖期のヒトリウマチ滑膜細胞 (RASCs)をトリプシン処理し、 10 % FCS を含む DMEMにて 6ゥエルプレートに 1.5X104細胞/ゥエルで培養した。 18〜 24時間後、 FCS有り、 抗生物質無しの DMEMで一度洗浄し、 FCS無し、 抗生 物質無しの DMEM 1000 a L を添加した。 OPTI-MEM I RecL ced-Serum Medium 47.5 /x L, 上記の EBS-1デコイ ODN(final 100 M)2.5 ^ L あるいは シノビオリン siRNAtfinal 20 ϋ Μ)2.5 \ 混合したものを 0 TTI-MEM I Reduced-Serum Medium 49 x L、 Lipofectamine 2000 の混合物に加え、 弱くピベッティングした後 10分間放置した。 これを細胞に ずつまんべ んなく添加した。 24 時間培養後、 軽くかき混ぜて放置し、 以下の方法により、 トランスフエクシヨンを行った。 · トランスフエクシヨン試薬添加 84時間後、 細胞から Isogene (二ツボンジーン 社)を用いたフエノール抽出法で全 RNAを抽出し、 RT(resl time)-PCRを行った。 試薬は TaqMan Universal PGR Master Mix (Roche社》及び Applied
Biosystems社より購入した以下のプローブを用いた。
シノビオリン： HS00381211— ml HRD1
hsGAPDH： Human GAPDH
すなわちプロ一ブ 0.5 L、 RNA 1 L、 TaqMan Univers al PGR Master Mix 5 L、 精製水 3.5 Lを PGRチューブに分注後混合し、 アプライドバイオ RT- PCR 7500 を用いて RT-PCRを行った。
サイクルは、 cDNA伸長反応として 50 2分、 95 °C 10 を 1回、 続けて
PCR増幅反応として 95 °C 15秒、 60 1分を 50回行い、 最後に 72 °C 5分最 終伸長反応を行った後 4 :で保存した。
RNA量発現の解析はリアルタイム PCR 装置付属の解ネ i ソフトを用いて行った。 シノビオリン遺伝子発現量は hsGAPDHの発現量で割ることにより値を補正し た。
その結果、 EBS-1デコイを用いた場合、 シ.ノビオリン RINAの発現が抑制され たことが明らかとなった （図 1 0 ) 。 産業上の利用可能性
本発明により、 シノビオリン遺伝子のプロモーターに園するデコイ核酸が提供 される。 本発明のデコイ核酸は、 シノビォリンの転写因チ結合部位において、 こ の転写因子と競合的に結合することができ、 その結果、 、ンノビオリンプロモータ 一の活性を抑えることができる。 このことは、 本発明のデコイ核酸がリウマチ等 の各種疾患の治療に有用であることを意味する。 配列表フリーテキス卜
配列番号 3 ：合成 DNA
配列番号 4 ：合成 DNA
配列番号 5 ：合成 DNA 配列番号 6 ：合成 DNA 配列番号 7 ：合成 DNA 配列番号 1 1 ：合成 DNA 配列番号 1 2 ：合成 DNA 配列番号 1 3 ：合成 DNA 配列番号 1 4 ：合成 DNA

Claims

I . シノビオリン遺伝子のプロモーターの転写因子と結合してプロモーター活性 を阻害することができるデコイ核酸。
2 . 以下の （a) 又は （b) のデコイ核酸。
(a) 配列番号 1 1若しくは 1 2に示される塩基配列からなるデコ 核酸
(b) 配列番号 1 1若しくは 1 2に示される塩基配列において 1若しくは数個の 請
塩基が欠失、 置換若しくは付加された塩基配列からなり.、 かつ、 シノビオリ ン遺伝子のプロモータ一活性を阻害する機能を有するデコイ核 ¾
3 . 以下の （a) 又は （b) のデコイ核酸。
(a) 配列番号 1 1及び 1 2に示される塩基配列からなるデコイ核酸
(b) 配列番号 1 1及び 1 2に示される塩基配列囲において 1若しく は数個の塩基 が欠失、 置換若しくは付加された塩基配列からなり、 かつ、 シ ノピオリン遺 伝子のプロモータ一活性を阻害する機能を有するデコイ核酸
4 . シノビオリン遺伝子のプロモー夕一活性を阻害する機能が、 シ ノビオリン遺 伝子のプロモーターの転写因子と結合する機能である、 請求項 2 又は 3記載の 核酸。
5 . EBS、 SBS及び ABSからなる群から選ばれるいずれかの転写因子結合部位 の塩基配列に基づいて設計された請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載の核酸。
6 . 滑膜細胞、 又は癌細胞にアポトーシスを誘導することができる、 請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の核酸。
7 . 請求項 1〜6のいずれか 1項に記載の核酸を含む、 シノビオリ ン遺伝子の発 現に起因する疾患を治療又は予防するための医薬組成物。
8 . さらに、 薬学的に許容可能なキャリア一を含む、 請求項 7記載の医薬組成物。
9 . 疾患^、 関節リウマチ、 線維症、 癌及び脳神経疾患からなる群から選ばれる 少なくとも 1つである、 請求項 7又は 8記載の医薬組成物。
1 0 . 請求項 1〜 6のいずれか 1項に記載の核酸を用いて、 シノビォリンの転写 因子の転写活性を阻害する方法。
I I . 請求項 1〜6のいずれか 1項に記載の核酸を用いて、 シノビォリンのプロ モータ一活性を阻害する方法。
2 . 請求項 1〜6のいずれか 1項に記載の核酸を用いて、 シノピオリンのプロ モーター活性を阻害することにより、 シノビオリンの発現を抑制する方法。3 . 請求項 1〜6のいずれか 1項に記載の核酸を用いて、 滑膜細胞、 又は癌細 胞にアポトーシスを誘導する方法。
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