CN1934256A - 针对滑膜蛋白基因启动子的诱杀核酸 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种针对滑膜蛋白基因启动子的诱杀核酸。此外,还是通过与滑膜蛋白基因启动子的转录因子结合可以抑制启动子活性的诱杀核酸,以及以下(a)包含序列号11或12所示碱基序列的诱导核酸,或者(b)包含在序列号11或12所示碱基序列中缺失,取代或添加了一个或多个碱基所得的碱基序列,并且具有抑制启动子活性功能的诱杀核酸。
Description
技术领域
本发明涉及一种针对滑膜蛋白(synoviolin)基因启动子的诱杀(decoy)核酸。
背景技术
类风湿性关节炎(以下,称为RA)是全身性的慢性炎症疾病,其在关节滑膜组织中表现异常增殖。本发明人鉴定出作为这种滑膜组织异常增殖必需基因的滑膜蛋白基因(WO 02/052007)。
滑膜蛋白基因编码的滑膜蛋白是通过利用抗滑膜细胞抗体的免疫筛选从类风湿性关节炎患者的滑膜细胞文库中克隆的膜蛋白质。由于使滑膜蛋白在小鼠中过表达时,在关节中发现了滑膜的增生,骨、软骨破坏,确认了酷似于关节炎的症状,提示滑膜蛋白参与软骨及骨组织的发生、分化,再生和代谢。此外,最近发现了滑膜蛋白还参与纤维症,癌症或脑神经疾病的发病(Genes Dev.2003 Vol.17:p.2436-49)。
由于一般认为滑膜蛋白的表达量在上述疾病中很重要,为了检索滑膜蛋白启动子的转录区域,通过切断小鼠滑膜蛋白基因的上游启动子区域研究具有各种长度的片段中的启动子活性,结果确定出其核心区域,确认了与转录因子的相互作用(Oncogene.2000 Vol.19:p.6533-48)。
发明内容
本发明的目的在于提供针对编码滑膜蛋白基因启动子的转录调节区域的部位的诱杀核酸。
本发明人为了解决上述问题进行了锐意研究。成功制备了针对滑膜蛋白基因的上述部位的诱杀核酸,由此完成了本发明。
也就是说,本发明如下所述。
(1)可与滑膜蛋白基因启动子的转录因子结合、抑制启动子活性的诱杀核酸。
本发明的诱杀核酸可以是例如以下(a)或(b)的诱杀核酸:
(a)包含序列号11或12所示碱基序列的诱杀核酸
(b)包含序列号11或12所示碱基序列中缺失,取代或添加了一个或多个碱基的碱基所得序列、并且具有抑制滑膜蛋白基因的启动子活性的功能的诱杀核酸。
此外,本发明的诱杀核酸可以是例如以下(a)或(b)的诱杀核酸:
(a)包含序列号11和12所示碱基序列诱杀核酸
(b)包含序列号11和12所示碱基序列中缺失,取代或添加了一个或多个碱基的碱基序列、并且具有抑制滑膜蛋白基因的启动子活性的功能的诱杀核酸。
作为抑制滑膜蛋白基因的启动子活性功能,可以是例如与启动子的转录因子结合的功能。
本发明的诱杀核酸可以基于选自下述任一部位的碱基序列进行设计:启动子的转录因子结合部位的EBS(Ets结合部位),SBS(Sp1结合部位)和ABS(AML结合部位)。
此外,本发明的诱杀核酸可以诱导滑膜细胞或者癌细胞凋亡。
(2)用于治疗或预防由滑膜蛋白基因表达引起的疾病的药物组合物,其含有上述诱导核酸。
本发明的药物组合物还可以含有药学上可接受的载体。作为本发明的药物组合物的适用对象疾病,可以是例如选自于类风湿性关节炎,纤维症,癌症和脑神经疾病中的至少一种。
(3)使用上述诱杀核酸抑制滑膜蛋白的转录因子的转录活性的方法。
(4)使用上述诱杀核酸抑制滑膜蛋白的启动子活性的方法。
(5)通过使用上述诱杀核酸抑制滑膜蛋白的启动子活性,由此抑制滑膜蛋白表达的方法。
(6)使用上述诱杀核酸,诱导滑膜细胞或者癌细胞凋亡的方法。
附图的简要说明
图1A是表示切割型滑膜蛋白启动子的活性的图。
图1B是表示切割型滑膜蛋白启动子的活性的图。
图1C是表示滑膜蛋白启动子的Ets结合部位和核心区域的图。
图1D是表示在启动子中导入变异时的转录活性的图。
图2A是表示进行凝胶迁移检测的结果的照片。
图2B是表示进行凝胶迁移检测的结果的照片。
图2C是表示进行凝胶迁移检测的结果的照片。
图2D是表示进行凝胶迁移检测的结果的照片。
图3A是表示滑膜蛋白启动子的转录活性的图。
图3B是表示滑膜蛋白启动子的转录活性的图。
图3C是表示通过利用RNAi敲除的NIH3T3细胞中的滑膜蛋白启动子的转录活性的图。
图4A是在2.2k和1k的滑膜蛋白启动子上结合了LacZ的质粒的构建图。
图4B是滑膜蛋白启动子在小鼠胚胎中的表达的照片。
图4C是滑膜蛋白启动子在小鼠胚胎中的表达的照片。
图5是表示诱杀核酸的序列的图。
图6是表示滑膜细胞中的滑膜蛋白的表达抑制确认试验的时间表。
图7A是表示RA滑膜细胞中滑膜蛋白启动子的表达的照片。
图7B是表示测定滑膜细胞中的滑膜蛋白表达抑制的WST-8测试的结果的图。
图7C是表示用Western印迹法确认滑膜细胞中滑膜蛋白表达的照片。
图8A是表示进行虫荧光素酶测试的结果的图。
图8B是表示通过利用诱杀ODN敲减滑膜蛋白的NIH3T3细胞中的细胞凋亡的照片和表示Western印迹法的结果的图。
图8C是表示通过利用RNAi敲减滑膜蛋白的NIH3T3细胞中的细胞凋亡的照片和表示Western印迹法的结果的图。
图9A是表示由EBS-1诱杀ODN产生的对滑膜蛋白表达的抑制的照片。
图9B表示过表达滑膜蛋白的NIH3T3细胞中由EBS-1诱杀ODN处理产生的细胞凋亡。
图10是表示使用EBS-1诱杀的对RA滑膜细胞中的滑膜蛋白RNA的抑制效果的图。
发明的最佳实施方式
下面,详细地说明本发明。
本发明的特征在于,提供针对编码滑膜蛋白基因启动子的转录调节区域的部位的诱杀核酸。
1.概要
本发明人以滑膜蛋白为中心进行了类风湿性关节炎病状分析。最近,在使用滑膜蛋白敲除小鼠的分析中,发现负责ERAD功能的滑膜蛋白的量与由ER压力引起的细胞凋亡诱导的阈值相关。
因此,为了阐明调节决定细胞凋亡诱导的感受性的滑膜蛋白的量转录系统,进行了启动子分析,通过使用小鼠细胞株和小鼠胚胎鉴定了负责滑膜蛋白的组成型表达的Ets结合部位(EBS;Ets binding site),证明了该元件为滑膜蛋白在体内表达所必需的。Ets是可在酵母至人中保守的转录因子。Ets区域形成30种或30种以上的家族,其中许多调节负责分化·增殖·细胞诱导的分子的转录活性(D.K.Watoson andA.Seth,;Oncogene.review issue.Dec 18;19(55);2000)。此外,还表明NIH3T3细胞中,由这种EBS介导的Ets家族的一员GABPα/β复合体参与该转录调控。
如果通过杂合(ヘテロノツクアウ)表达分析(小鼠中敲入LacZ),Northern,Western分析,滑膜蛋白的表达是普遍的,可以认为许多细胞中滑膜蛋白的表达是必要的。这还可以从滑膜蛋白敲除的小鼠的全身性的细胞凋亡抗进产生的胚胎致死推测得到。但是,其表达有强弱,在分泌能力高的细胞(胰腺,精巢,神经细胞)中其表达尤其高。这可以认为,在一部分细胞中滑膜蛋白的表达需要非常高。
转录调控系统中有(i)含有基本转录复合体的组成型基因表达,和(ii)针对某种刺激的诱导型基因表达。滑膜蛋白的启动子中不存在TATA盒,起始密码子。这种启动子构成时,SP1和Ets家族等转录因子在其转录诱导中十分重要(Rudge,Exp Cell Res.Mar 10:274(1):45-55,2002)。
作为具体的转录因子,可以是例如GABPα,GABPβ,GABPα和GABPβ的复合体,Ets1,Tel,Fli-1等。
GABPα是具有Ets区域的Ets家族的一员,其是具有454个氨基酸的蛋白质。GABPα在细胞中普遍表达,通过Ets区域,与GABPβ形成异二聚体。进而,还已知GABPα通过2个Ets结合部位形成异四聚体。此外,在目的基因的转录调控中具有几个特征。首先,GABPα通过Ets区域具有DNA结合能力,但没有转录活化能力。与之相反,GABPβ没有DNA结合能力,但通过与GABPα形成二聚体诱导转录活性,通过形成异四聚体发挥更高的转录活性(Yu M.J Biol Chem Nov14;272(46):29060-7.1997)。此外,GABPα在不具有TATA盒的基因以及具有多个转录起始点的基因的表达中可以起到起始密码子的作用(Yu M.J Biol Chem Nov 14;272(46):29060-7.1997;Kamura T.J BiolChem Apr 25;272(17):11361-8,1997)。此外,GABPα与其表达的普遍性无关,通过与结合于其它位点的同伴(partner)转录因子协同作用,负责参与细胞特异性的分化·增殖的基因的表达(SchaefferL,EMBO.J.Jun 1;17(11):3078-90.1998)。
GABPβ不是Ets家族成员,其是具有382个氨基酸的GABPα的辅助因子,其通过锚蛋白(Ankyrin)重复序列与GABPα形成异二聚体,具有转录活性区域。
Ets1是作为1983年在鸡中引起成红细胞增多症的反转录病毒E26的癌原基因表达的v-Ets的人同系物,其是具有441个氨基酸的蛋白质。
Tel是具有452个氨基酸的蛋白质,据报道在Ets家族中,其起转录抑制作用。已知,在临床上,其通过t(12:21)染色体转座与AML1形成愈合基因,引起白血病。
Fli-1由452个氨基酸构成,通过t(11:22)染色体转座与EWS形成愈合基因,产生尤文肉瘤。
从酵母到人Ets家族是保守的,被称为Ets的区域的转录因子。该区域形成30种或30种以上的家族成员,其中许多调节负责分化·增殖·细胞诱导的分子的转录活性(D.K.Watoson andA.Seth,;Oncogene.review issue.Dec 18;19(55);2000)。
为了获得启动子区域,有使用限制性酶从滑膜蛋白基因或小鼠和人基因组序列等中切除的方法。但是,由于方便的限制酶位点一般未必存在于适当的位置,通过使用预先设计了限制酶识别位点的引物,用PCR扩增可以获得所希望的启动子区域。此外,根据已经了解的启动子区域的碱基序列信息,也可以通过化学合成所希望的启动子区域。由此提示作为转录因子结合部位,除EBS之外还存在ABS和SBS。通过以下方法判断转录因子实际上是否与该位点结合:对各位点进行变异,确认其转录活性降低,以及用凝胶迁移测试(电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shift assay):EMSA)分析,然后确认转录因子与原来的探针结合,而但导入单碱基变异后不结合。
这里,序列号1中举例说明了小鼠滑膜蛋白基因的全长启动子序列,序列号2中举例说明了人滑膜蛋白基因的全长启动子序列。
此外,序列号8中举例说明了编码启动子核心区域EBS-1的碱基序列,序列号9中举例说明了编码ABS-1的碱基序列,序列号10中举例说明了编码SBS-1的碱基序列。
2.诱杀核酸
本发明是一种与上述转录因子结合可以抑制启动子活性的诱杀核酸。本发明的诱杀核酸是指含有转录因子的结合部位的短的诱杀核酸,向细胞中导入这种核酸,通过转录因子与这种核酸结合,可以竞争性抑制转录因子原来与基因组结合部位的结合,其结果是,具有可以抑制该转录因子的表达的功能。典型地是,诱杀核酸是核酸或其类似物,其至少含有一种可以与目的结合序列结合的核酸序列。
本发明的优选诱杀核酸的实例可以是,例如可以与结合于启动子的EBS-1的转录因子结合的核酸,可以与结合于启动子的ABS的转录因子结合的核酸,可以与结合于启动子的SBS-1的转录因子结合的核酸,含有其互补体的寡核苷酸,它们的变异体或者含有上述核酸的核酸。诱杀核酸,可以根据上述EBS-1,ABS,SBS-1的序列,设计为单链,或含有其互补链的双链。对其长度没有特别的限定,可以为15-60个碱基,优选20-30个碱基。
本发明中,可以优选使用例如可以与结合于EBS-1的转录因子结合的核酸(序列号11)和/或其互补链(序列号12)作为诱杀核酸。
核酸可以是DNA,也可以是RNA,该核酸中也可以包括经修饰的核酸和/或拟核酸。此外,这些核酸,其变异体,或含有这些核酸或其变异体的核酸分子可以是单链或双链,也可以是环状。所谓变异体,是指包含在上述核酸序列中缺失,取代或添加1个或多个(例如1-10个,1-5个或1-2个)碱基的碱基序列后所得的核酸序列,并且具有抑制滑膜蛋白基因的启动子活性的功能,即与转录因子结合的功能的核酸。也可以是含有1个或1个以上上述碱基序列的核酸。
本发明的诱杀核酸可以采用本领域公知的化学合成法或生物化学合成法制造。例如,可以使用作为一般的基因重组技术使用的利用DNA合成装置的核酸合成法。此外,也可以在分离或合成作为模板的碱基序列后,使用PCR法或采用克隆载体的基因扩增法。进而,也可以通过使用限制酶等切割由该方法获得的核酸,通过DNA连接酶进行结合从而制备出所希望的核酸。进而,为了获得在细胞中更稳定的诱杀核酸,可以在碱基等上添加烷基化,酰化等化学修饰。诱杀核酸的变异体的制备方法采用本领域公知的方法,例如,也可以通过位点特异性突变诱导法等合成。位点特异性突变诱导法是本领域中公知的方法,可以使用市售的试剂盒,例如GeneTailorTMSite-Directed MutagenesisSystem(Invitro gene公司制),TaKaRa Site-Directed MutagenesisSystem(Mutan-K,Mutan-Super Express Km等(TaKaRabio公司制))等,也可以应用其他的方法。
使用诱杀核酸时启动子的转录活性的分析可以采用一般实行的虫荧光素酶测试,凝胶迁移测试,CAT测试,采用作为细胞凋亡的特异性标记的锚定蛋白V的染色方法,Western印迹法,FACS分析法,RT-PCR法等。用于实施这些测试的试剂盒也可商购(例如,promega双虫荧光素酶测试试剂盒)。
例如在虫荧光素酶测试时,在目的基因的转录起始点上游连结萤火虫虫荧光素酶基因作为报告基因。此外,为了补正测试对象的细胞间的导入效率,也可以在细胞中同时导入在启动子的下游连接有细胞肥大病毒(CMV)β半乳糖苷酶(β-gal)基因作为报告基因的载体。向细胞的导入可以采用例如磷酸钙法等。在所定时间培养后回收导入了载体的细胞,通过冻融等方式破坏细胞后,用一定量细胞提取液测定虫荧光素酶和β-gal活性。
根据这些分析,显示出在使用诱杀核酸时滑膜蛋白的转录活性受到抑制,滑膜细胞,癌细胞等的凋亡得以诱导。
3.含有诱杀核酸的药物组合物
本发明涉及一种用于治疗或预防滑膜蛋白基因的表达引起的疾病的药物组合物,其含有1种或1种以上的上述诱导核酸。本发明的诱杀核酸只要具有与目的结合序列的结合活性,即可作为本发明的药物组合物使用。
作为本发明的药物组合物的适用疾病,可以是例如类风湿性关节炎,纤维症,癌症和脑神经疾病等细胞增殖性疾病以及脑神经疾病。当本发明的药物组合物适用于疾病时,上述疾病可以是单独的情况,也可以是多种疾病并发的情况。
本发明的药物组合物作为癌症的治疗剂使用时,癌症的种类没有特别的限定,可以用于脑肿瘤,舌癌,咽癌,肺癌,乳癌,食道癌,胃癌,胰腺癌,胆管癌,胆囊癌,十二指肠癌,大肠癌,肝癌,子宫癌,卵巢癌,前列腺癌,肾癌,膀胱癌,横纹肌肉瘤,纤维肉瘤,骨肉瘤,软骨肉瘤,皮肤癌,各种白血病(例如急性骨髓性白血病,急性淋巴性白血病,慢性骨髓性白血病,慢性淋巴性白血病,成人型T细胞白血病,恶性淋巴瘤)等对象。
上述癌可以是原发癌,也可以是转移性癌,也可以是与其它疾病并发的癌。
作为脑神经系统疾病,可以是例如阿尔茨海默症,帕金森病,多谷氨酰胺(ポリグルタミン)症。
本发明的药物组合物中的诱杀剂可以被吸收到患者的细胞中或目的组织的细胞中的形式使用。
含有本发明的诱杀核酸的药物组合物的给药形式可以是口服,非口服给药中的任一种。口服给药时,可以通过适当的剂型,例如片剂,丸剂,糖衣剂,胶囊,液剂,凝胶,糖浆,膏剂,悬浮液给药。非口服给药时,可以是例如经肺剂型(例如,使用喷雾器等的剂型),经鼻给药剂型,经皮给药剂型(例如,软膏,乳剂),注射剂型等。注射剂型时,可以通过例如点滴等静脉内注射,肌肉内注射,腹腔内注射,皮下注射等在全身或局部直接或间接对患部给药。
在使用本发明的药物组合物作为基因治疗剂时,除了通过注射直接给药本发明的药物组合物的方法外,还可以是例如用整合了核酸的载体给药的方法。作为上述载体,可以是例如腺病毒载体,腺伴随病毒载体,疱疹病毒载体,痘病毒载体,反转录病毒载体,慢病毒载体等,通过使用这些病毒载体可以有效给药。
此外,也可以在脂质体等磷脂小胞体中导入本发明的药物组合物,以该小胞体给药。通过脂质转染法将载有本发明的药物组合物的小胞体导入到指定细胞中。于是,获得的细胞从例如静脉内,动脉内等全身给药。还可以在脑等处局部给药。为了将本发明的药物组合物导入到目的组织或器官中,还可以使用市售的基因导入试剂盒(例如AdenoExpress:CLONTECH公司)。作为用于形成脂质体结构的脂质,可以使用磷脂,胆固醇类和含氮脂质等,一般磷脂是最佳的,可例举有磷脂酰胆碱,磷脂酰丝氨酸,磷脂酰甘油,磷脂酰肌醇,磷脂酰乙醇胺,磷脂酸,心磷脂,神经鞘髓磷脂,蛋黄卵磷脂,大豆卵磷脂,溶血卵磷脂等天然磷脂,或者按照常规方法给天然磷脂添加了氢的磷脂。此外,可以使用磷酸双十六酯,二硬脂酰磷脂胆碱,二棕榈酰磷脂酰胆碱,二棕榈磷脂胆碱乙醇胺,二棕榈酰磷脂酰胆碱丝氨酸,桐酰磷脂酰胆碱,桐酰磷脂酰乙醇胺等合成磷脂。
脂质体的制备方法如果是可以容纳诱杀剂的方法则没有特别的限定,可以用惯用的方法,例如逆相蒸发法(Szoka,F等人,Biochim.Biophys.Acta,Vol.601 559(1980)),乙醚注射法(Deamer,D.W.:Ann.N.Y.Acad.Sci.,Vol.308 250(1978)),表面活性剂法(Brunner,J等人:Biochim.Biophys.Acta,Vol.455 322(1976))等制备。
含有这些磷脂的脂质类可以单独使用,但是也可以两种或两种以上合用。此时,还可以通过使用分子内有带乙醇胺和胆碱等的阳性基的原子团的脂质,使阴性的诱杀核酸的结合率增加。这些脂质体形成时除主要磷脂之外一般还可以使用已知为一般脂质体形成用添加剂的胆固醇类,十八烷胺,α-生育酚等添加剂。这样获得的脂质体中,为了促进向患者的细胞或目的组织的细胞内的吸收,可以添加膜融合促进物质,例如仙台病毒,灭活仙台病毒,从仙台病毒中纯化的膜融合促进蛋白质,聚乙二醇等。
本发明的药物组合物可以按照常规方法制剂化,还可以含有药学上允许的载体。这种载体可以是添加物,可以是例如水,药学上允许的有机溶剂,胶原,聚乙烯醇,聚乙烯吡咯烷酮,羧乙烯聚合物(carboxyvinyl polymer),羧甲基纤维素钠,聚丙烯酸钠,海藻酸钠,水溶性葡聚糖,羧甲基淀粉钠,果胶,甲基纤维素,乙基纤维素,黄原酸胶(xanthan gum),阿拉伯树胶,酪蛋白,琼脂,聚乙二醇,双甘油,甘油,丙二醇,凡土林,石蜡,硬脂醇,硬脂酸,人血清白蛋白,甘露糖醇,山梨糖醇,乳糖,作为药物添加物可允许的表面活性剂等。
上述添加物可以根据本发明的治疗剂的剂型从上述物质中单独或适当组合进行选择。例如,作为注射用制剂使用时,可以使用将纯化的诱杀核酸溶解于溶剂(例如生理盐水,缓冲液,葡萄糖溶液等)中,在其中加入Tween 80,Tween 20,明胶,人血清白蛋白等形成的制剂。或者,为了在使用前形成溶解的剂型,也可以是经冷冻干燥的溶剂。作为冷冻干燥赋形剂,例如,可以是如下物质。即,甘露醇,葡萄糖,乳糖,蔗糖,甘露醇,山梨糖醇等糖类,玉米,小麦,稻,马铃薯或其它植物来源的淀粉等淀粉,甲基纤维素,羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠等纤维素,阿拉伯树胶,西黄蓍胶等树胶,明胶,胶原等。
根据需要,可以使用交联的聚乙烯吡咯烷酮,琼脂,海藻酸或其盐(例如,海藻酸钠)等的崩解剂或助溶剂。
本发明的药物组合物的给药量根据年龄,性别,症状,给药途径,给药次数,剂型而不同。给药方法根据患者的年龄,症状进行适当选择。有效给药量是减轻疾病的症状或状态的诱杀核酸的量。这种核酸的治疗效果和毒性,可以通过细胞培养或实验动物中标准的药学方法,例如ED50(对组中50%有效治疗的用量)或LD50(对组中50%致死的用量)确定。
治疗效果和毒性效果之间的用量比为治疗系数,可表示为ED50/LD50。本发明的药物组合物的给药量,例如每次每1kg体重为0.1μg-100mg,优选为1-10μg。但是,上述治疗剂不受这些给药量限制。以腺病毒给药时的给药量为每天每次106-1013个左右,间隔1-8周给药。但是,本发明的药物组合物不受这些给药量限制。
以下,通过实施例更具体地说明本发明。但是,本发明不限于这些实施例。
实施例1
本实施例是关于构建用于制备滑膜蛋白启动子的质粒的实施例。
从小鼠(C57B1/6系)的基因组中获得含有滑膜蛋白基因的5’至3’约7.5k的基因组,亚克隆到SyB/pBluescript中。然后,用XhoI和NcoI处理滑膜蛋白基因的启动子区域,取出约2.2k的片段,插入到PGV-B2(TOYO INK GROUP公司)中(SyG-2.2k)。以该约2.2k的片段作为全长启动子(序列号1)。进而,从全长启动子的5’端削去一部分区域,制备成启动子区域缩短的构建体。整理所制备的启动子,如表1所示。
表1制备的启动子一览表(小鼠)
名称 | 区域* | 序列号1中所示碱基序列的区域 |
-2201/+843(全长) | 以TS(转录起始点)为起点(+1)上游(5’侧)2201位碱基,下游(3’侧)843位碱基的区域 | 1-3043 |
-1233/+843 | 以TS为起点上游1233位碱基,下游843位碱基的区域 | 969-3043 |
-1060/+843 | 以TS为起点上游1060位碱基,下游843位碱基的区域 | 1142-3043 |
-503/+843 | 以TS为起点上游503位碱基,下游843位碱基的区域 | 1699-3043 |
-322/+843 | 以TS为起点上游322位碱基,下游843位碱基的区域 | 1880-3043 |
-200/+843 | 以TS为起点上游200位碱基,下游843位碱基的区域 | 2002-3043 |
-108/+843 | 以TS为起点上游108位碱基,下游843位碱基的区域 | 2094-3043 |
-84/+843 | 以TS为起点上游84位碱基,下游843位碱基的区域 | 2118-3043 |
-73/+843 | 以TS为起点上游73位碱基,下游843位碱基的区域 | 2129-3043 |
-65/+843 | 以TS(转录起始点)为起点上游65位碱基,下游843位碱基的区域 | 2137-3043 |
-39/+843 | 以TS(转录起始点)为起点上游39位碱基,下游843位碱基的区域 | 2163-3043 |
-10/+843 | 以TS(转录起始点)为起点上游10位碱基,下游843位碱基的区域 | 2191-3043 |
*区域 在向上游(5’侧)时TS(序列号1的第2201位t)的1个5’侧的碱基计为-1,向下游(3’侧)时TS计为+1。
并且,人的滑膜蛋白基因的切割型启动子可以按与小鼠相同方式制成(序列号2)。这种情况的切割位点的位置示于表2。
表1制备的启动子一览表(人)
名称 | 区域* | 序列号2中所示碱基序列的区域 |
-2201/+892(全长) | 以TS(转录起始点)为起点(+1)上游(5’侧)2201位碱基,下游(3’侧)892位碱基的区域 | 1-3092 |
-1233/+892 | 以TS为起点上游1233位碱基,下游892位碱基的区域 | 969-3092 |
-1060/+892 | 以TS为起点上游1060位碱基,下游892位碱基的区域 | 1142-3092 |
-503/+892 | 以TS为起点上游503位碱基,下游892位碱基的区域 | 1699-3092 |
-322/+892 | 以TS为起点上游322位碱基,下游892位碱基的区域 | 1880-3092 |
-200/+892 | 以TS为起点上游200位碱基,下游892位碱基的区域 | 2002-3092 |
-108/+892 | 以TS为起点上游108位碱基,下游892位碱基的区域 | 2094-3092 |
-84/+892 | 以TS为起点上游84位碱基,下游892位碱基的区域 | 2118-3092 |
-73/+892 | 以TS为起点上游73位碱基,下游892位碱基的区域 | 2129--3092 |
-65/+892 | 以TS(转录起始点)为起点上游65位碱基,下游892位碱基的区域 | 2137-3092 |
-39/+892 | 以TS(转录起始点)为起点上游39位碱基,下游892位碱基的区域 | 2163-3092 |
-10/+892 | 以TS(转录起始点)为起点上游10位碱基,下游892位碱基的区域 | 2191-3092 |
*区域 在向上游(5’侧)时TS(序列号1的第2201位t)的1个5’侧的碱基计为-1,向下游(3’侧)时TS计为+1。
下面,为了制备上述小鼠来源的启动子的变异体,采用通过重叠延伸的特异性位点诱变法(Molecular cloning,CSHL Press,3rdedition,2001年,chapter 13)制备成SyG-2.2kG-76T/BV2。使用的引物
如下所示。
1.EBS-1m(G-76T):GCGCCGCCGTAAGTGAGGT(序列号3)
2.ABSm(G-68T):AAGTGAGTTGTCTTACCCCC(序列号4)
3.SBS-1m(G-92A,C-91A):ACTCCGCCAAGCCCCGCGCC(序列号5)
采用50μl反应液中含有1pmol SyB/pBluescript,100pmol引物,0.2mM dNTPs,5U聚合酶,10mM Tris-HCl(pH8.3)和50mMKCl的反应组成液,在以下的PCR条件下进行PCR。
PCR条件
第一阶段:94℃,1分钟→(94℃,30秒→55℃,30秒→72℃,1分钟)×25
第二阶段:第一个循环:94℃,30秒→55℃,30秒→用29分钟冷却至30℃→30℃,1分钟→用9分钟回升至72℃→72℃,1分钟→(94℃,30秒→55℃,30秒→72℃,1分钟)×25次
EBS-1m(G-76T)是用于使序列号1所示碱基序列的第2125位(自TS向上游第76位(-76))的G变异成T的引物,ABSm(G-68T)是用于使序列号1所示碱基序列的第2133位(自TS向上游第68位(-68))的G变异成T的引物,SBS-1m(G-92A,C-91A)是用于使序列号1所示碱基序列的第2112位(自TS第-91位)的C变异成A并且使序列号1所示碱基序列的第2111位(自TS第-92位)的G变异成A的引物。
实施例2
本实施例是关于滑膜蛋白启动子的功能分析的实施例。
为了了解滑膜蛋白的量的调节机制,进行了启动子分析。并且,通过转基因小鼠(LacZ敲入)的分析以及Northern和Western的结果清楚了滑膜蛋白普遍地表达。
首先,滑膜蛋白启动子克隆后,使含有从翻译起始位点起的2.2k的区域与虫荧光素酶载体结合。使用各种细胞(下述),以从上游侧削去的构建体,研究了其转录活性。并且,使用添加了10%失活的胎牛血清的DMEM培养基(Life Technologies,Inc.)培养细胞。
使用的细胞
ATDC5:源于小鼠畸胎癌细胞AT805的亚株。软骨和色素细胞特异的。碱性磷酸酶阳性。
HEK293:人胎儿肾脏来源的细胞
NIH3T3:小鼠胚胎来源的成纤维细胞
转染和报告基因测试通过以下方式进行。
以2×104/孔将细胞置于24孔板中。24小时后,用FUGENE6试剂盒,按照试剂盒(Biochem.Roche公司)的手册表达。
此外,为了补正转染的效率,使用CMV-β-gal各50ng,进而只导入载体,使总量均为200ng。
转染后30小时后回收蛋白质,首先,除去培养基后,用PBS清洗,使用100μl被动裂解缓冲液TM(Promega公司)回收细胞裂解物。然后将20μl该细胞裂解物移到96孔板中,用光度计测定虫荧光素酶活性。进而,用读板器测定β-gal后,Luc值除以β-gal值进行补正。并且,以如下方式进行了β-gal染色。也就是说,β-半乳糖苷酶用X-gal进行染色(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖,Sigma公司)。用4%多聚甲醛固定胚胎20分钟后,浸入X-gal溶液后,37℃下染色12-24小时。染色后,用PBS清洗,再次用4%多聚甲醛固定。
其结果是,在-84至-73bp的12个碱基中其转录活性降低了10%至30%(图1A,B)。
含有该区域的-114至-1中,人具有与小鼠94%同源性,进而在12个碱基中,具有100%同源性。通过使用计算机的生物信息分析软件(http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCHJ.html)进行了分析,结果表明这12个碱基中存在EBS(Ets结合部位)(图1C)。
然后,本发明人在含有该区域的前后区域中的转录因子结合序列中导入变异,采用几个细胞系,研究了对该部位的转录的影响。
如图1D中可见,通过EBS的点变异,几乎所有的细胞系中其活性降低了约9%至40%左右。因此,认为该EBS是负责滑膜蛋白的组成型表达所必需的元件(以后表示为EBS-1)。
实施例3
本实施例是鉴定与EBS-1(-89至-65)结合的转录因子的实施例。
Ets家族形成30种或30种以上的家族,所有均具有DNA结合区域Ets区域。此外,其中心序列为GGAA,一般认为与该序列相连的序列对于与该序列的结合中很重要。
首先,使用含有其12个碱基序列的探针,研究了转录因子实际上是否与该序列结合。该转录因子的结合试验通过凝胶迁移测试(EMSA)进行。
EMSA如下进行。
探针
EBS-1WT(-89至-65):CCCCGCGCCGCCGGAAGTGT(序列号6)
EBS-1WT(-89至-65):CCCCGCGCCGCCGTAAGTGT(序列号7)
通过使25个碱基序列的有义链和反义链在90℃下退火10分钟制备了EMSA用的探针。
接着,混合T4核酸酶激酶,缓冲液和γ32P,使混合液在室温下反应30分钟。将反应液过MicroSpin G-25柱(Amersham Pharmacia Biotech公司),通过离心对收集的柱级分进行分离,获得了经标识的探针。使用每1μl放射活性为3000cpm或以上的探针。
混合10μg蛋白质,反应缓冲液和探针,使之于室温下反应30分钟。超迁移的情况下,在反应前,使之在4℃下与探针反应1小时。用非变性凝胶以100v,50mA使该反应液电泳3小时左右。使凝胶干燥后,用Fuji BAS2000通过自动射线照相术进行分析。
其结果表明,由于使用NIH3T3的核提取液的凝胶迁移,形成了四个条带(图2A的a,b,c,d位置的条带)。进而,通过冷竞争(coldcompetition)(使用未经标识的竞争试验),其所有条带均消失,在导入了1个碱基变异的探针中没有发现这种抑制(图2)。
然后,为了研究哪一个Ets家族结合,在进行Ets1/Pea3,Ets探针的冷竞争时,受到Ets1/Pea3的探针竞争性抑制,这种抑制由于该变异而消失(图2B,第5和6泳道)。
这被认为,与Ets1/Pea3的探针(Santa Cruz公司)结合的因子可能是Ets1,Pea3,GABPα等的转录因子。进而,使用各种抗体,进行超迁移试验时,GABPα和Tel超迁移,Fli-1显示出抑制效果(图2的第5和6泳道,图2C的第6,7,8和10,11,12泳道)。此外,以GABPα,Fli-1,Ets1的体外翻译产物进行凝胶迁移试验时,在所有物质中均发现了超迁移。由此表明多个Ets家族与该序列结合。
然后,对于由超迁移的GABPα产生的与GABPβ的复合体形成进行了研究。用各体外翻译产物进行了凝胶迁移试验。此时,在GABPα蛋白质中加入了GABPβ蛋白质的泳道7中,发现了新的条带a,b(复合体)的形成(图2D)。进而,如果加入GABPα抗体,其复合体a,b消失超迁移(supershift)(图2D,泳道8,9)。此外,加入GABPβ抗体时,复合体a的形成受到抑制(图2D,泳道10,11)。
由此表明GABPα/β通过滑膜蛋白启动子的EBS-1形成复合体(图2D)。
实施例4
本实施例确认了NIH3T3中通过Ets家族的转录调控以及GABPα和Fli-1,Ets1对滑膜蛋白转录活性的效果。
为了分别评价与EBS-1结合的转录因子对细胞内的滑膜蛋白的转录活化能力,进行了转录活化测试。
(1)ODN的寡聚物的制备和细胞提取液的制备
通过化学合成获得20个核苷酸长度的寡脱氧核苷酸(ODN)。通过正义和反应寡核苷酸的退火制备诱杀(decoy)ODN。将对数生长期的细胞进行胰蛋白酶处理,移入96孔板(1×103细胞/孔)中。24小时后,以每孔20pmol的诱杀ODN加入孔中,用LipofectAMINE(Invitrogen公司,SanDiego,CA),按照试剂盒的说明书进行3天转染。为了确定具有诱杀ODN的细胞的增殖,用Alamar Blue(Biosource International公司),按照试剂盒的说明书进行细胞增殖的测试。
(2)RNAi的寡聚物制备和细胞提取液的制备
通过化学合成获得21个核苷酸长度的RNA。按照Elbashir等人的方法(Elbashir,S.M.,Nature.411:494-498,2001)制备siRNA。将对数生长期的细胞进行胰蛋白酶处理,移入96孔板(1×103细胞/孔)中。24小时后,以每孔20pmol的siRNA加入孔中,用LipofectAMINE(Invitrogen公司,San Diego,CA),按照试剂盒的说明书进行3天转染。为了确定siRNA细胞的增殖,用Alamar Blue(Biosource International公司),按照试剂盒的说明书进行细胞增殖的测试。
(3)结果
获得了以下结果:NIH3T3细胞中,Fil-1抑制滑膜蛋白转录活性,GABPα使其转录活性增加(图3A,B)。此外,还发现通过RNAi敲除GABPα,GABPβ的NIH3T3细胞中,滑膜蛋白的转录降低(图3C)。由此认为在NIH3T3中,GABPα/β复合体负责滑膜蛋白的表达。
进而,为了证明该GABPα/β复合体通过EBS-1负责滑膜蛋白的表达,使用带有EBS-1(G-76T)变异体和EBS-1野生型的启动子(-200至+843)进行了转录活性。
其结果是,变异体均没有被活化,而野生型中发现了约3倍的转录活化。
(4)Western印迹
最后,用200nM的诱杀处理NIH3T3后,通过Western印迹评价滑膜蛋白的表达。
Western印迹分析如下述方式进行。即,回收细胞培养物,使之溶解于含有1%NP-40,25mM Tris-HCl,pH 6.8,0.25%SDS,0.05%2-巯基乙醇和0.1%甘油的溶液中。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离出透明的细胞裂解物的等份试样。将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上,用抗滑膜蛋白的单克隆抗体进行免疫印迹法。通过结合过氧化物酶的山羊抗小鼠免疫球蛋白和ECL检测系统(Amersham Pharmacia Biotech公司)检测结合的抗体。
其结果是,EBS-1野生型中经处理的滑膜蛋白的表达降低约一半。
根据这些数据,显示滑膜蛋白的转录通过EBS-1的介导被GABPα/β控制。
实施例5
本实施例是涉及鉴定小鼠胚胎中滑膜蛋白表达所必需的部位的实施例。
然后,为了在小鼠胚胎中确认EBS-1在体内的效果,制备滑膜蛋白启动子上结合了LacZ的质粒过表达的转基因小鼠。制备了下述4种过表达Tg启动子,即全长为2.2k和1k的启动子,以及这两种启动子分别引入了1个碱基变异的启动子(图4A)。
转基因(Tg)小鼠用构建体和Tg小鼠的制备如下述方式进行。
用NotI和NcoI从SyG-2.2k/BV2中切出约2.2k的片段后,插入到SyTB/pBluescript中,制成SyL-2.2kwt/Bluescript。进而,用从SyG取出的片段分别制成SyL-2.2kmG-76T/pbs,SyL-200wt/pBluescript和SyL-200mG-76T/pBluescript。对各构建体,分别使用QIAGEN质粒试剂盒(QIAGEN公司制)纯化后,将经SacI线性化的DNA直接显微注射到BDF小鼠(C57BL/6N和DBA/2N的交配产生的小鼠仔)的受精卵的核内,移植到代孕母体的卵管中。分别,从由8-9个母体子宫中诞生的小鼠的尾部分别提取基因组,通过southern印迹法进行Tg小鼠的确认。
为了研究这些Tg小鼠的滑膜蛋白的表达,根据胚胎进行X-gal染色。将敲入了该LacZ的敲除小鼠的胚胎中的LacZ的表达与这次制备的4种Tg小鼠的表达进行比较研究。
使用滑膜蛋白的11.5-14.5d.p.c(days post coitus:胎龄)的胚胎,进行LacZ染色。可发现导入2.2k和1k的启动子的转基因小鼠与杂合小鼠几乎在相同部位染色。令人惊讶的是,确认了,导入了引入了1个碱基变异的2.2k和1k的启动子的转基因小鼠,其表达部位均根据其系统不同随机变化(图4B)。
据报道,如果没有转录活化必需的区域,可以获得与上述结果相同的结果(pax5,colla2等)。由此表明EBS-1是滑膜蛋白的转录所必需的部位。
进而,用13.5d.p.c的胚胎比较其表达和GABPα的表达,结果查明几乎在同样的部位表达(图4C)。根据以上结果可以表明,在胚胎发生时,也与体外结果相同,GABPα通过EBS-1控制滑膜蛋白的表达。
实施例6
本实施例是确认RA滑膜细胞中滑膜蛋白的表达抑制的实施例。
在对类风湿性关节炎的滑膜细胞中由EBS-1介导的GABPα的效果进行研究,结果在使用滑膜细胞的核提取液的凝胶迁移中,通过GABPα也可以获得与使用NIH3T3的各提取液时相同的超迁移(supershift)。进而,为了确认该EBS-1在风湿病滑膜细胞中的重要性,即由GABPα通过EBS-1介导的转录调控是否与滑膜蛋白的表达抑制相关,最终形成滑膜细胞的增殖抑制,对由EBS-1产生的滑膜蛋白的表达抑制进行了研究。
首先,还涉及了与结合于上述EBS-1的GABPα结合的诱杀核酸(序列号11,12)和阴性对照的诱杀核酸(序列号13,14)(图5)。通过化学合成获得20个核苷酸长度的ODN。通过正义寡核苷酸和反义寡核苷酸的退火制备诱杀ODN。
如下所示,在细胞中导入诱杀核酸。也就是说,用胰蛋白酶对数生长期的人风湿病滑膜细胞,在96孔板中用含有10%FCS的DMEM以1.0×103细胞/孔培养。18-24小时后,用没有FCS,没有抗生素的DMEM清洗一次,添加90μL没有FCS,没有抗生素的DMEM。向50μLOPTI-MEM I Reduced-Serum Medium和1μL Lipofectamine 2000的混合物中加入45μL OPTI-MEM I Reduced-Serum Medium与5μL上述诱杀ODN(20μM)的混合物,轻轻吹吸混合后放置10分钟。在细胞中无一遗漏地添加平均10μL所述混合物。培养24小时后,加入10μLFCS,轻轻混合后放置进行3天转染(图6)。用该细胞根据试剂盒的说明书提供给细胞增殖测试。
HRP活性的检测使用ECL Plus试剂盒(Amersham公司)。
其结果,可以发现其表达降低约一半(图7A)。
上述细胞培养24小时后,供WST-8测试,同时用这种24小时后细胞破碎液裂解细胞,进行Western印迹。用细胞计数试剂盒(CellCounting Kit)-8(Dojindo公司)进行WST-8测试,将上述24小时培养后的细胞中添加到细胞计数试剂盒-8(Dojindo公司),测定4小时后的吸光度(450nm)。Western印迹,用细胞破碎液,15mM Tris(pH 7.5),200mMNaCl,0.5%NP40,0.1%SDS,1mM PMSF,2μg/mL亮肽酶素(leupeptin),2μg/mL抑肽酶(aprotinin),2μg/mL胃酶抑素(pepstatin)调制后,通过SDS-PAGE分离,通过电印迹法(electroblot转印到硝酸纤维素(NC)膜上。用加入了5%脱脂乳的0.03%Tween 20添加TBS,在室温下对该NC膜阻断1小时后,用加入了抗滑膜蛋白抗体或抗β肌动蛋白抗体和5%脱脂乳的0.03%Tween 20添加TBS,在室温下免疫反应1小时。用0.03%Tween 20/TBS清洗反应后的NC膜,以经HRP标识的抗兔IgG抗体作为第二抗体,在室温下免疫反应1小时,用0.03%Tween20/TBS清洗,通过检测HRP活性检测目的抗原。
WST-8测试的结果示于图7B中,Western印迹的结果示于图7C中。如图7B所示,scramble诱杀核酸导入细胞(阴性对照),EBS-1诱杀核酸导入细胞中细胞增殖活性被显著地抑制,图7C中可见,Western印迹中也发现滑膜蛋白蛋白质生成量减少。
根据以上结果显示,在RA细胞中,如果使用上述诱杀核酸,启动子活性受抑制。
实施例7
本实施例是确认滑膜蛋白表达中EBS-1功能性效果的实施例。
(1)虫荧光素酶测试
对滑膜蛋白表达中EBS-1功能的效果进行了研究。首先,以EBS-1(-77/-72)为目标,合成诱杀ODN(以下称为“EBS-1诱杀”),通过在NIH3T3细胞中导入该EBS-1诱杀,用虫荧光素酶测试确认了滑膜蛋白的调节中EBS-1诱杀的效果。通过采用FITC的免疫化学分析,确认了导入NIH3T3细胞的EBS-1诱杀的效果为80%或以上,然后进行测试。
为了进行向NIH3T3细胞的瞬间转染,使FUGRENE6TM(Roche公司),按照手册(Roche公司),以试样质粒(100ng)和内在对照DNA(50ngCMV-β-半乳糖苷酶表达载体)转染,添加于24孔板上。培养30小时后,吸收培养液,用PBS清洗,在细胞中加入100μL被动裂解缓冲液TM(Passive lysis bufferTM)(Promega公司)。使这种细胞裂解物的残渣作为颗粒沉淀,回收上清,立即测定虫荧光素酶活性和β-gal活性。为了测定细胞提取物中的虫荧光素酶活性,在100μL测试缓冲液(0.25mMATP,10mM MgCl2,100mM磷酸钾,pH7.8)中添加20μL细胞溶解液。用MicroLumat Plus(Perkin Elmer-Cetus公司)测定荧光。β-gal测试如下述方式进行。即,在7μL细胞提取物中加入100μL测试缓冲液(60mMNa2HPO4,40mM NaH2PO4,1mM MgCl2,50mM β-巯基乙醇,0.665mg/ml邻硝基苯-β-D-半乳糖苷酶)后,在37℃下温育30分钟。加入160μL 1.0M Na2CO3后,使反应停止,测定420nm处的吸光度。虫荧光素酶测定值均用相对于经质粒CMV-β-半乳糖苷酶表达的β-半乳糖苷酶的转染效率标准化(补正),作为与所得值相对的虫荧光素酶活性。进而,这些值相对于SyG-200/+843,求出平均值。
其结果是,在使用导入了EBS-1诱杀的细胞的提取物的虫荧光素酶测试中,与仅用转染试剂的情况相比,EBS-1诱杀中降低至28.4%,因此显示转录受到抑制(图8A)。
(2)通过膜联蛋白V染色
用胰蛋白酶处理NIH3T3细胞,用冷PBS清洗2次,悬浮于1×膜联蛋白结合缓冲液(Vybrant apoptosis assay kit,Invitrogen公司)中,调整成1×106细胞/ml的终浓度。平均每1试验,使用100μl细胞悬浮液。加入5μg的经FITC标识的膜联蛋白V和1μl的PI校正曲线用溶液,室温下温育15分钟后,加入400μl 1×膜联蛋白结合缓冲液,充分搅拌后,通过FACSCalibur(Becton Dickinson公司)进行分析。
此外,由于滑膜蛋白对由ER压力诱导的细胞凋亡具有抵抗性,因此为了解滑膜蛋白的量与细胞凋亡的关系,进行了以下实验。
调制NIH3T3细胞,24小时后,借助LIPOFECTAMINE 2000(Invitrogen公司)用GFP或滑膜蛋白的siRNA(25nM)转染NIH3T3细胞,温育84小时。此外,以与上述相同方式制备EBS-1诱杀ODN,将其转染NIH3T3细胞。
其结果是,用EBS-1诱杀核酸观察滑膜蛋白的转录抑制产生的影响时,NIH3T3细胞中细胞凋亡被诱导(图8B)。图8B中,上图显示了western印迹的结果,下图是NIH3T3细胞的显微镜照片(100倍)。同样,在NIH3T3细胞中,通过滑膜蛋白的RNAi使滑膜蛋白的表达量降低时,细胞凋亡被诱导(图8C)。图8C中,上图显示了western印迹的结果,下图是NIH3T3细胞的显微镜照片(100倍)。
(3)FACS分析
进而,制备过表达滑膜蛋白的NIH3T3细胞,研究EBS-1诱杀核酸产生的影响。
对于表达滑膜蛋白的稳定细胞株的建立,在利用LIPOFECTAMINE 2000(Invitrogen公司)转染NIH3T3细胞24小时后,用新鲜生长培养基将细胞稀释10倍,然后传代。次日,添加选择培养基(含有0.5μg/ml G418),获得稳定表达HA-Synoviolin-HAHA/pcDNA3表达载体的克隆。并且,应用对照或HA-pcDNA3空载体。为了确认质粒在各细胞株中的表达,用针对HA标记的抗体进行western印迹。
对由EBS-1诱杀ODN产生的细胞凋亡诱导,进行如下实验。
用FUGENE6TM(Roche公司)试剂进行EBS-1诱杀的转染,84小时后,回收细胞,装入微管(Microtube)中,用膜联蛋白V-FITC标记。通过FACS分析,测定活细胞和发生凋亡的细胞的分布状态。进而,还进行了采用滑膜蛋白抗体的western印迹。并且,使用β-肌动蛋白抗体作为对照,使用HA抗体作为稳定表达的确认用抗体。
结果示于图9A和图9B中。在滑膜蛋白过表达细胞中,获得了对由EBS-1诱杀产生的细胞凋亡的抗性(图9A,图9B)。此外,通过使用膜联蛋白V的FACS进行细胞凋亡的定量时,在常规NIH3T3细胞中51.1%发生了凋亡,但是滑膜蛋白过表达的细胞中,该比例为29.8%(图9B)。图9B的scramble和EBS-1诱杀的图中,左侧的照片是100倍的倍率下的NIH3T3细胞的显微镜照片。
根据上述内容显示,如果通过EBS-1的介导抑制转录调节,滑膜蛋白的表达受到抑制,NIH3T3细胞的凋亡被诱导。
实施例8
本实施例是通过实时PCR确认EBS-1诱杀抑制滑膜蛋白RNA的表达的实施例。
用胰蛋白酶处理对数生长期的人风湿病滑膜细胞(RASCs),在6孔板中用含有10%FCS的DMEM以1.5×104细胞/孔培养。18-24小时后,用有FCS,没有抗生素的DMEM清洗一次,添加100μL没有FCS,没有抗生素的DMEM。在49μL OPTI-MEM I Reduced-Serum Medium(血清减少的培养基)和1μL Lipofectamine 2000的混合物中加入47.5μL OPTI-MEM I Reduced-Serum Medium与2.5μL上述诱杀ODN(终浓度100μM)或2.5μL滑膜蛋白siRNA(终浓度20μM)的混合物,轻轻吹吸混合后放置10分钟。在细胞中无一遗漏地添加平均10μL所述混合物。培养24小时后,轻轻混合后放置,通过以下方法进行转染。
转染试剂添加84小时后,用Isogene(Nippon gene公司)用苯酚提取法从细胞中提取总RNA,进行RT(real time,实时)-PCR。
试剂使用TaqMan Universal PCR Master Mix(Roche公司)和从Applied Biosystems公司购买的以下探针。
滑膜蛋白:HS00381211_ml HRD1
hsGAPDH:Human GAPDH
即,将0.5μL探针,1μL RNA,5μL TaqMan Universal PCRMaster Mix,3.5μL纯水分装于PCR管中,用AppliedBio RT-PCR 7500进行RT-PCR。
循环,作为cDNA延伸反应进行1次50℃2分钟,95℃10分钟,接着作为PCR扩增反应95℃15秒,60℃1分钟的循环进行50次,最后72℃下进行5分钟最终的延伸反应后,于4℃保存。
用实时PCR装置附属的分析软件进行了RNA量表达的分析。用滑膜蛋白基因的表达量除以hsGAPDH的表达量进行补正。
其结果表明,使用EBS-1诱杀时,滑膜蛋白RNA的表达受到抑制(图10)。
工业上利用的可能性
通过本发明,可以提供与滑膜蛋白基因的启动子相关的诱杀核酸。本发明的诱杀核酸可以在滑膜蛋白的转录因子结合部位与该转录因子竞争性结合,其结果是,可以抑制滑膜蛋白启动子的活性。这意味着本发明的诱杀核酸对于风湿病等各种疾病的治疗有用。
序列表文本
序列号3:合成DNA
序列号4:合成DNA
序列号5:合成DNA
序列号6:合成DNA
序列号7:合成DNA
序列号11:合成DNA
序列号12:合成DNA
序列号13:合成DNA
序列号14:合成DNA
序列表
<110>Locomogene,Inc.
<120>针对滑膜蛋白启动子的诱杀核酸
<130>PCT05-0020
<150>JP 2004-92570
<151>2004-03-26
<160>14
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>3046
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>1
gcaagagacc ttattttgtt tttcgagaca gggtttctct gtgtagccct ggctgtccta 60
gaactcactc tgtagaccag gctggcctcg aactcagaaa tccgcctgcc tctgcctccc 120
gagtgctggg attaaaggta ggcgccacca cgcccagctt tttttttttt agataggatc 180
tcactctata gctgtacgct ggcctcagat ttatgatgct cttcctgcct cagtctccca 240
attttctggg attgtaggag tgggccacta tgctctgctc actacatgat ttcagaggtt 300
gagtagacct gaactgaaga ccagacaagg gagccctccc tcgacatctt ggggccaggg 360
aagttgaagc cataggatca gaggaaatgt ggcaagaaaa aaggccaaca tggacacaga 420
acttaaataa aaacagacag aggaagtaag acagatatat acctggggga gaggagggat 480
tgccacaaaa tgtaggagat tttcaagaat gggggaggat gagtgtgtag ggttaaaggt 540
agccagtaga agttcatagc tagccttatg gaggaaggaa aggggagcca tctcgggatg 600
ttaactgtta aagacaacag gtggtggtga agatggctga gaccaagagc acagggctga 660
ggggcagaca ggcactgaca ctgctaccct ttaatacagt tcctcctgtt gtgatcccca 720
accataatta cttcgttgct acttcataac tgtaattttg ctagttatga attgtaagta 780
aacgtctgat atgcaggata tctcatttgt gacccctgtg taacggtttg attcccaaag 840
ggcttacgac tcacaggttg agagccagcc actgccttaa agtcgtctag aatcagtttt 900
ctttcttttt tgacagacaa gatgtttaat tccgttgtac tgaaggaaag ccattttatg 960
tatttttctt aagtgctcta tcagtaatga caattctgaa agcccctgtg ttatatttta 1020
acaacacagt cacctccggt tctgtattca ctgtccgtgt tgtgactccc acagtataaa 1080
ttcctccagt tgatcttcat gaattcttat atttgatccc cccccccctt aggcctctga 1140
attccgagtg agtccgagtt aaaaatggga ggagcaccct ctagctgata aacctgggta 1200
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acagacagaa tcagctcaga acaaagggtc tggctatctc ccagggatga acacgcacgc 1320
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ctagaaataa ctggcgttct gttttatgtc agtccggaca cgcaagcact gctccttttg 1440
cgggccccgt aagcatcccc ccaggcggga tagggatccc cggcctatgg actgcgcttt 1500
ctcagctggc atccagctgc cttggcaccc agtccggggc cactctgcct acagacccta 1560
gcaaccactc acctgctttt ctttccctat aggccagaaa tttttccttt cttttctcat 1620
tggtccgcgt aactttatcg caaccaatcg gcggtacacg ggaacaaact cactcctaca 1680
caacctgcgt tggggggagg taacctggga agacctatat ctgttttctg caccgctatt 1740
tttttccgag aagcacttaa cttcttaccg tgtcgtagct atccctggaa tgaggcgctt 1800
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ggagggagtt tagggtggtg attctacaac ggcgactagc aagtggcggg cttcagccct 1980
ttcccgctgc tctcctggtc gcgaccacac gtcacagctc tcgctcgttc cggttgctcg 2040
cgcagggggt ggggagtgtt gttaaccgga gcggctgccg cagtcgcggt gattgagcgt 2100
actccgccgc gccccgcgcc gccggaagtg aggtgtctta cccccgaagt tccggttcgc 2160
agggggtggg gagtgttgtt aaccggagcg gctgccgcag tcgcggtgat tgagcgtgct 2220
cgcggcgctg ggctcctggt gagtgggcct ggtcctgatt ggggttgggg ggtcggcgtc 2280
taggaccttg tcctttgggg tcactgcgat cagcccgccc cgctgcgttc ggccgccagt 2340
tttcggcctg tcagatggct ggagacctta ggcggcggcg cggccaccgt tccagaggcc 2400
gggccccgcc tgcgaggttc gcaactccta gcgttcacag gtgcgcgact gtgaggcgac 2460
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<210>2
<211>3092
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
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<213>人工的
<220>
<223>合成DNA
<400>14
ggctaagtag ggtacggcaa 20
Claims (13)
1.一种诱杀核酸,其可与滑膜蛋白基因的启动子的转录因子结合抑制启动子活性。
2.以下(a)或(b)的诱杀核酸:
(a)包含序列号11或12所示碱基序列的诱杀核酸
(b)包含在序列号11或12所示碱基序列中缺失,取代或添加了一个或多个碱基所得的碱基序列、并且具有抑制滑膜蛋白基因的启动子活性的功能的诱杀核酸。
3.以下(a)或(b)的诱杀核酸:
(a)包含序列号11和12所示碱基序列的诱杀核酸
(b)包含在序列号11和12所示碱基序列中缺失,取代或添加了一个或多个碱基所得的碱基序列、并且具有抑制滑膜蛋白基因的启动子活性的功能的诱杀核酸。
4.根据权利要求2或3所述的诱杀核酸,所述抑制滑膜蛋白基因的启动子活性的功能是与滑膜蛋白基因的启动子的转录因子结合的功能。
5.根据权利要求1-4任一项中记载的诱杀核酸,其是根据选自于EBS,SBS和ABS中的任一转录因子结合部位的碱基序列设计的。
6.根据权利要求1-5任一项中记载的诱杀核酸,其可以诱导滑膜细胞或者癌细胞凋亡。
7.用于治疗或预防由滑膜蛋白基因表达引起的疾病的药物组合物,其含有权利要求1-6任一项中记载的核酸。
8.根据权利要求7记载的药物组合物,其还含有药学上可接受的载体。
9.根据权利要求7或8记载的药物组合物,所述疾病是选自类风湿性关节炎,纤维症,癌症和脑神经疾病中的至少一种。
10.使用权利要求1-6任一项中记载的核酸抑制滑膜蛋白的转录因子的转录活性的方法。
11.使用权利要求1-6任一项中记载的核酸抑制滑膜蛋白的启动子活性的方法。
12.通过使用权利要求1-6任一项中记载的核酸抑制滑膜蛋白的启动子活性,从而抑制滑膜蛋白表达的方法。
13.使用权利要求1-6任一项中记载的核酸诱导滑膜细胞或者癌细胞凋亡的方法。
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