CN1950512A - 重组穿孔素、其表达和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能够在细胞中驱动穿孔素表达的逆转录病毒载体和在细胞中表达重组穿孔素的方法。本发明也涉及从其衍生而来的重组穿孔素多肽和核酸分子及其用途。还包括使用该重组穿孔素分子的筛选测定法、由该筛选测定法鉴定的化合物及其用途。

Description

重组穿孔素、其表达和用途
本发明涉及能够在细胞中驱动穿孔素表达的逆转录病毒载体和在细胞中表达重组穿孔素的方法。本发明也涉及从其衍生而来的重组穿孔素多肽和核酸分子及其用途。还包括使用该重组穿孔素分子的筛选测定法、由该筛选测定法鉴定的化合物及其用途。
                        背景
穿孔素，由细胞例如细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤细胞(NK)分泌的膜破坏性蛋白，是通过颗粒胞吐途径而被靶向毁灭的被病毒感染或转化的细胞的死亡所必要的。许多研究已显示缺少穿孔素的动物或人受到严重的免疫抑制。例如，两个穿孔素等位基因都被靶向破坏的小鼠明显地对许多病毒和其他细胞内病原体例如单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)易感。在这些动物中也缺乏对许多实验性肿瘤的排斥，转移性扩散的可能性也常常提高。此外，超过50％的穿孔素缺乏性动物随着年龄增长产生出自发性的、高度侵袭性的B淋巴瘤，表明肿瘤免疫监视(tumour immunesurveillance)的丧失。在这些动物中产生的肿瘤可容易地移植入穿孔素缺乏性接受者中，但却被同系的(syngeneic)具有免疫能力的动物强烈排斥。
在CTL中，穿孔素从具有粒酶的分泌性颗粒(granule)中释放出来，粒酶属于具有促细胞凋亡活性(pro-apoptotic activity)的丝氨酸蛋白酶家族。和穿孔素相反，在粒酶中存在相当多的功能丰余性，尽管其具有明显不同的蛋白水解特异性。例如，粒酶A和B都有缺陷的小鼠只对选择的病毒例如脱脚病病毒具有异常的敏感性，但能够排斥许多在穿孔素缺乏性小鼠中自发产生的实验性肿瘤和淋巴瘤。总之，可以猜测穿孔素是所有颗粒介导的病毒和肿瘤免疫以及免疫稳态(immune homeostasis)不可缺少的唯一颗粒组分。
在人中，穿孔素缺乏的综合症状只有近年来才得以描述，因为已显示大约30％的表现罕见的常染色体隐性疾病家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(familial hemophagocytic lymphohistiocytosis)(FHL)的儿童在其两个穿孔素等位基因上都携带突变。FHL是噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(hemophagocytic lymphohistiocytosis)(HLH)的一种亚型，所述HLH还包括各种相关的偶然发生的无已知家族基础的免疫缺陷疾病。HLH和FHL的特征一般在于被活化的T淋巴细胞和巨噬细胞(组织细胞)在肝脏、脾脏、淋巴结和中枢神经系统中的大量和逐渐积累，然后导致红细胞和其他血细胞的吞噬作用。
这些儿童的细胞毒性细胞，特别是CTL，不能提供通过所述颗粒途径的对靶细胞的致命打击。因此，有缺陷的淋巴细胞不能清除抗原呈递细胞，导致巨噬细胞的不受控制的活化和积累以及炎性细胞因子的过量产生，表现为发烧，肝和脾的肿大，以及脾、肝和骨髓中的吞噬血细胞作用的临床综合症状。在组织学上，这些患者中的CTL和NK细胞一般表现出其裂解性颗粒(lytic granules)中的免疫反应性穿孔素的显著减少，这可以反映穿孔素蛋白的不稳定性，或增加的响应免疫攻击而引起的穿孔素的转化。总之，在HLH或FHL中的临床和病理学发现使人联想起病毒特异性T细胞和抗原呈递细胞的增加的扩增，以及在感染了病原体例如淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒的穿孔素缺乏性小鼠中见到的不能下调免疫应答。
尽管其明显的重要性，但在分子和细胞水平上穿孔素的功能仍然很不清楚。由于纯化的穿孔素不能诱导凋亡，因此认为其关键性作用涉及将粒酶精确地靶向靶细胞的细胞溶胶中，在那里其蛋白水解活性诱导细胞的凋亡程序。粒酶B，最强的促细胞凋亡的粒酶，通过在特异的天冬氨酸残基之后切割底物(Asp-ase活性)来模拟胱天蛋白酶的活性。Bid，Bcl-2家族的促细胞凋亡的成员，是粒酶B的特别重要的底物，因为截短的Bid可通过激活内源性细胞凋亡途径而引起细胞死亡，该途径集中于线粒体瓦解。粒酶A在碱性残基之后进行切割和诱导不依赖于胱天蛋白酶的DNA链切刻(nicking)，尽管已显示小鼠粒酶C可直接破坏线粒体的功能。以高浓度单独地使用纯化的穿孔素也可诱导靶细胞裂解，并且这种形式的细胞死亡也在一些生理相关条件下发生。
在分子水平上，很少了解穿孔素是如何发挥其功能的。据预测，穿孔素的羧基末端和突触结合蛋白家族的蛋白质的羧基末端非常相似，该家族的一些成员在神经元突触中参与囊泡运输(vesiculartrafficking)。一个漂亮的研究已产生了这样的证据，即在穿孔素的生物合成期间，其在靠近其羧基末端的部位被未知的蛋白酶切割，从而释放出附着有巨大的N联聚糖的短肽。预测该短肽使得可在该羧基末端结合钙和脂质，从而使穿孔素能够在CTL脱粒后插入靶细胞膜中。在发生钙依赖性构象变化后，认为残基210至245形成允许膜插入的两亲性螺旋结构，尽管还不清楚和表皮生长因子受体的富含半胱氨酸的结构域(残基375至410)相似的另一个区域的功能。对应于氨基末端的合成肽也已显示具有一些内源的裂解能力。然而，未检测该观测结果的生理学相关性。
因此，虽然其在针对病毒和被转化的细胞的免疫应答中有至关重要的重要性，并且尽管在超过15年以前独立地克隆了鼠和人cDNA，但在分子和细胞水平上对穿孔素的功能仍然了解不多。该缺乏显著进展的状况主要归因于缺乏用于进一步研究目的的能够合成和贮存该毒性蛋白的细胞系。
在广泛的研究学科(research disciplines)中，培养的细胞系的用途已极大地促进了对蛋白功能的研究。穿孔素的固有细胞毒性已产生了这样的特殊需要，即需要鉴定具备合适的自我保护手段以表达穿孔素而不破坏细胞器的细胞，所述蛋白在该细胞中被合成、运输和随后贮存。这样的细胞系的缺乏已成为穿孔素结构-功能研究的主要障碍。许多尝试(大多数是不成功的)涉及使用细菌表达系统来合成穿孔素。由于溶解度问题，在杆状病毒感染的昆虫细胞中进行穿孔素的表达不可靠，从而该方法未被广泛使用。因此，穿孔素分子的突变分析从未被描述过。
在查看文献后，逐渐明了的是，过去少数细胞曾经成功地用于穿孔素的表达。很明显，CTL和NK细胞是能够进行穿孔素合成的理想细胞，然而很少有这样的细胞系进行过培养。淋巴细胞生物学领域内的研究人员已采取使用刚分离的淋巴细胞、培养的淋巴细胞肿瘤或通过导入癌基因而永生化的少数细胞毒性细胞系。在每种情况下，缺点是在这些细胞中存在内源穿孔素，其使穿孔素的结构/功能研究复杂化。以前已显示，人穿孔素在小鼠CTL细胞系CTLL-R8中的表达干扰内源穿孔素的功能，这导致被转染的细胞系的减少的细胞毒性。理想地，结构/功能研究要求缺乏穿孔素表达的细胞系，但在该细胞系中，可能要重新导入穿孔素(野生型或突变的)。
本发明克服了，或至少缓解了一些现有技术的上述问题，并且这样做之后，提供了更有效和更合适的在细胞中重组地表达穿孔素或其片段或变体的方法。
对于在本说明书中包含的文献、做法、材料、设备、物品等的讨论仅是为了提供本发明的背景。并不暗示或代表这些资料中的任何一种或全部形成现有技术基础的一部分或者是在与本发明相关的领域内的公知常识，因为其在本申请的每一项权利要求的优先权日之前已在澳大利亚存在。
                       发明概述
逆转录病毒载体，该载体能够驱动穿孔素分子或其片段或变体在用所述载体转染的宿主细胞中表达。
在本发明的另一方面，提供了能够产生逆转录病毒颗粒的包装细胞，所述逆转录病毒颗粒携带能够驱动穿孔素或其片段或变体在细胞中表达的逆转录病毒载体。
在本发明的另一方面，提供了携带逆转录病毒载体的逆转录病毒颗粒，所述逆转录病毒载体能够驱动穿孔素或其片段或变体在细胞中的表达。
在本发明的另一方面，提供了用逆转录病毒载体转染的宿主细胞或细胞系，所述逆转录病毒载体能够驱动穿孔素或其片段或变体在所述细胞中的重组表达。
在本发明的另一方面，提供了在细胞中表达穿孔素或其片段或变体的方法，所述方法包括用能够驱动所述穿孔素或其片段或变体在所述细胞中表达的逆转录病毒载体转染细胞。
在另一方面，本发明提供了由此处描述的方法产生的重组穿孔素分子或其片段或变体。
鉴定调节穿孔素分子或其片段或变体的表达的化合物的方法，所述方法包括步骤：
提供用本发明的逆转录病毒载体转染的细胞，所述逆转录病毒载体能够驱动穿孔素或其片段或变体在所述细胞中表达；
将所述细胞暴露于受试化合物；和
确定所述受试化合物是否调节穿孔素分子或其片段或变体在所述细胞中的表达。
鉴定调节穿孔素分子或其片段或变体的活性的化合物的方法，所述方法包括步骤：
提供根据此处描述的本发明方法制备的分离的穿孔素分子或其分离的片段或变体；
将所述分离的穿孔素分子或其分离的片段或变体暴露于受试化合物和靶细胞；和
确定所述受试化合物是否调节穿孔素分子或其片段或变体对靶细胞的活性。
鉴定调节穿孔素分子或其片段或变体的活性的化合物的方法，所述方法包括步骤：
提供根据此处描述的本发明方法的表达穿孔素分子或其片段或变体的细胞；
将所述细胞暴露于受试化合物和靶细胞；和
确定受试化合物是否调节穿孔素分子或其片段或变体对靶细胞的活性。
在本发明的另一方面，提供了通过此处描述的筛选测定法鉴定的化合物。
在本发明的另一个方面，提供了药物组合物，该药物组合物包含此处描述的重组穿孔素分子，和/或通过此处描述的筛选测定法鉴定的激动剂或拮抗剂化合物，以及药学上可接受的媒介物(carrier)、赋形剂、稀释剂和/或佐剂。
在本发明的另一方面，提供了治疗受试者的预防性或治疗性方法，所述受试者具有患与不希望的穿孔素表达和/或活性相关的疾病的风险或对所述疾病易感，或者患有所述疾病。
                         附图
图1图解说明了人穿孔素的一级氨基酸序列和cDNA序列，显示了由在序列下面的彩色图例所标示的推定的穿孔素功能结构域。右边的数字表示从Met1起始密码子开始的核苷酸(小字体)和氨基酸(大字体)的编号。还描述了到目前为止在FHL疾病中鉴定的一些穿孔素基因突变。错义突变显示于实心的红色圆圈中，而移码突变或无义突变显示于空心圆圈中。
图2显示用于在RBL细胞中表达小鼠穿孔素和证实其细胞毒性功能的方法的简介。
图3显示鼠类干细胞质粒载体(MSCV)的示意图。编码小鼠穿孔素的cDNA被插入至多位点接头区域的EcoRI和XhoI位点中。该双顺反于质粒包含驱动目的基因、GFP cDNA和IRES表达的兼嗜性MSCV 5′长LTR，IRES允许从一条mRNA转录物上翻译GFP和第二目的蛋白。GFP的自主表达使得能够快速选择期望表达目的转基因的经转导的细胞。
图4显示效应器RBL细胞至EL-4靶细胞的IgE-依赖性交联的示意图。通过抗TNP IgE抗体将RBL细胞表面的Fcε受体和TNP标记的EL-4靶细胞胶联引发RBL细胞胞吐其颗粒内容物。
图5图解说明在用MSCV或MSCV-Pfp质粒DNA转染的293T细胞中，GFP表达水平的流式细胞术分析。将空的MSCV载体(上图)或包含WT穿孔素cDNA的MSCV(下图)和兼嗜性辅助质粒一起共转染入293T包装细胞中，以产生高滴度的病毒上清液。蓝色实线表示单独用所述辅助质粒转染的293T细胞的基线荧光。
图6显示在用从293T包装细胞获得的病毒上清液转导后，RBL细胞中的GFP表达的流式细胞术分析。A)用编码MSCV载体或包含穿孔素cDNA的MSCV的病毒上清液转导RBL细胞，3天后就GFP的表达分析所述细胞。分离少量(0.2至2.0％)表达明显高于背景(M1 gate)的荧光的细胞，扩增所述细胞，产生下图中的群体。B)和未转导的RBL细胞(实线)相比，扩增基于GFP转基因的高水平表达而分离的RBL细胞以产生这样的群体，即在该群体中超过90％的细胞正在表达GFP。
图7显示通过Western印迹法显示的穿孔素在RBL细胞中的表达。用大鼠抗小鼠穿孔素单克隆抗体(mAb)，P1-8来探测未转导的、空载体-转导的(MSCV)或穿孔素-转导的(MSCV-Pfp)的RBL细胞的全部细胞裂解产物。左边的标记表示蛋白大小标志物的迁移。
图8图解说明使用抗TNP IgE的RBL细胞的表面标记的流式细胞术分析。A)用许多不同的稀释度(1/2、1/20、1/50、1/100)的抗TNPIgE抗体标记RBL细胞以确定用于表面标记的最适宜浓度。通过和第二种生物素-缀合的抗小鼠IgE抗体温育，然后和链霉亲和素PerCP温育，经流式细胞术进行分析，来检测结合。B)在37℃或4℃下用抗TNP IgE抗体温育RBL细胞15或60分钟，以确定对于最大结合的最适宜条件。
图9显示在4小时51Cr释放测定法中检测到的表达穿孔素的RBL细胞对EL-4靶细胞的细胞毒性功能。用抗TNP IgE抗体标记对于穿孔素表达经重构的RBL细胞，并将所述细胞与用51Cr预载的TNP标记的EL-4细胞缀合。作为负对照，在缺少交联性IgE抗体或TNP的情况下进行所述测定法。将用空MSCV载体转导的RBL细胞用作RBL毒性的基础量度。以一系列效应器细胞：靶细胞比率温育所有细胞。数据点表示以三次重复进行的测定的平均值(+/-标准误差)。
图10显示穿孔素在用MSCV-Pfp转导的RBL群体中的表达。将4个独立的、产生高滴度的病毒上清液的293T转染物用于产生表达MSCV-Pfp的RBL细胞。通过用单克隆抗穿孔素抗体，P1-8进行探测，就穿孔素蛋白的表达对基于GFP转基因的高水平表达而分离的细胞进行分析。还用作为蛋白上样(protein loading)的指示剂的抗微管蛋白抗体探测膜。
图11显示在4小时51Cr释放测定法中测量的表达MSCV-Pfp的独立的RBL细胞系的细胞毒性功能。用装载有51Cr的EL-4靶细胞以一系列效应器-靶细胞比率温育4个独立的表达MSCV-Pfp的RBL群体。通过使用能够识别靶细胞上的表面TNP的抗TNP IgE抗体引发效应细胞脱粒。为进行测定，将用空MSCV载体转导的RBL细胞用作RBL毒性的基础量度。数据点是三次重复测定的平均值+/-标准误差。该测定代表6个实验。
图12显示小鼠穿孔素蛋白的示意图。显示了在FHL中鉴定的许多错义突变中的两个突变。将整合了患者5(P5＝G429E)和患者6(P6＝P345L)的氨基酸取代的穿孔素分子的cDNA亚克隆入MSCV载体中。还显示了推定的两亲性α螺旋、富含半胱氨酸的EGF-样结构域和C2磷脂结合结构域。数字表示被编号的穿孔素的残基，包括21个氨基酸的前导序列。
图13显示在用P5-Pfp和P6-Pfp cDNA转染的293T细胞中的GFP表达水平的流式细胞术分析。将编码P5-Pfp和P6-Pfp cDNAs的MSCVDNA构建体与兼嗜性辅助质粒一起共转染入239T包装细胞中，以产生高滴度的病毒上清液。蓝色实线表示单独用辅助质粒转染的293T细胞的基础荧光。
图14显示用从293T包装细胞转染物中获得的病毒上清液转导的RBL细胞中的GFP的表达。用编码P5-Pfp和P6-Pfp cDNAs的MSCV病毒上清液转导RBL细胞。分离表达高水平的转基因的细胞，并将其扩增以产生绿色实线标示的群体。用以紫色充填的剖面图(profile)显示未转导的亲本RBL细胞的基础荧光。
图15显示通过Western印迹法检测的RBL细胞中的穿孔素的表达。通过使用单克隆抗小鼠穿孔素抗体进行免疫印迹法，就穿孔素的表达来分析用WT-Pfp、P5-Pfp、P6-Pfp或空MSCV载体转导的RBL的裂解产物。针对微管蛋白再次检测膜以确保等量的蛋白上样。
图16显示用于测量表达WT或突变的穿孔素的RBL细胞的功能的4小时51Cr释放细胞毒性测定法。在4小时51Cr释放测定法中分析表达WT或突变的穿孔素(P5-Pfp或P6-Pfp)的RBL细胞杀死TNP-标记的EL-4细胞的能力。将用空MSCV载体转导的RBL细胞在所述测定法中用作负对照。
图17显示从RBL细胞分离胞质颗粒。A)通过破裂的表达WT-Pfp、P5-Pfp、P6-Pfp或空载体的RBL细胞的密度梯度分级来分级颗粒。通过使用单克隆抗穿孔素抗体P1-8的Western印迹法，就穿孔素的存在对梯度级分进行分析。B)显示在A)中显示的梯度级分中的β-氨基己糖苷酶的活性。
图18显示RBL颗粒中的穿孔素的免疫组织化学检测。使用抗穿孔素mAb，P1-8就它们的穿孔素的含量对表达空载体(MSCV)、WT-Pfp或突变的穿孔素(P5-pfp和P6-Pfp)的RBL细胞进行染色。使用生物素化的二抗、过氧化物酶标记的链霉亲和素和在抗原部位导致棕色沉淀的底物色素原来检测该信号。在放大倍率下还观察到所有被转导的RBL细胞内的颗粒。表达WT-Pfp的代表性RBL细胞显示在更高倍数(power)下观察到的典型染色。染色代表了来自在分开的三天进行的实验的5个视野。
图19显示Jurkat细胞被从RBL细胞分离的颗粒裂解，如在4小时51Cr释放测定法中所测定的。A)用从WT-Pfp和空MSCV转导的RBL细胞分离的颗粒温育Jurkat细胞。所述测定使用系列稀释的所述颗粒，并在加入或不加入EGTA的情况下进行。B)用从WT-Pfp RBL细胞分离的颗粒温育Jurkat细胞，并将其与从P5-Pfp和P6-Pfp RBL细胞分离的颗粒的功能进行比较。数据点是三次重复测定的平均值+/-标准误差。所述测定是3个这样的实验的代表。
图20显示红细胞被从RBL细胞分离的颗粒裂解，如通过血红蛋白释放所检测的。将从表达WT-Pfp、P5-Pfp或P6-Pfp的RBL细胞分离的颗粒和红细胞温育30分钟并测量血红蛋白的释放。还在EGTA存在的情况下和用空MSCV转导的RBL颗粒进行该测定。
图21显示通过穿孔素的免疫组织化学染色检测的RBL细胞的脱粒。用抗TNP IgE抗体标记用WT-Pfp或突变的穿孔素(P5-Pfp和6-Pfp)转导的RBL细胞，并在TNP-标记的EL-4细胞存在或不存在的情况下温育所述细胞以刺激所述RBL细胞脱粒。然后就它们的穿孔素的含量，使用抗穿孔素mAb，P1-8对所有细胞进行染色。使用生物素化的二抗、过氧化物酶标记的链霉亲和素和在抗原部位产生棕色沉淀的底物色素原来检测该信号。将用空MSCV转导的RBL细胞用作穿孔素染色的负对照。染色代表来自在分开的三天进行的实验的5个视野。
图22显示在RBL细胞中表达的T224W小鼠穿孔素的减少的细胞毒性活性和其截短。显示了来自TNP-标记的Jurkat细胞的穿孔素依赖性51Cr释放，该Jurkat细胞在抗TNP IgE存在的情况下和瞬时转染的、分选的RBL细胞共温育4小时。数据点表示三个重复样品的平均值±SD，其代表三个相似的测定。Western印迹(右边)显示，在两个独立转染实验(T224W-1和T224W-2)中表达的T224W穿孔素的截短(与WT和T224R穿孔素相比)。
图23显示T224W和G428E穿孔素在RBL细胞中的不同定位。(A)用抗穿孔素抗体PI-8展示和用曙红复染的、表达穿孔素的RBL细胞的免疫组织化学。(B)在通过和TNP-标记的靶细胞短暂温育而诱导脱粒后，如(A)中那样对未标记或用抗TNP IgE标记的RBL细胞进行染色(放大倍率，400X)。
图24显示在RBL细胞中表达的G428E小鼠穿孔素的减少的细胞毒性活性，但其具有正常的表观分子质量。(A)显示在稳定转导的RBL细胞中的穿孔素表达的Western印迹(和IL18/1L-21-激活的小鼠NK细胞以及表达空载体的细胞(GFP)相比较)。(B)来自TNP-标记的Jurkat细胞的穿孔素依赖性51Cr释放，该Jurkat细胞在抗TNPIgE存在的情况下与稳定表达WT或G428E穿孔素的RBL细胞共温育了4小时。数据点表示为三个独立的实验的平均值±SD。Western印迹(右边)显示，G428E和WT穿孔素一起共迁移。GFP是空载体对照。(C)裂解稳定过表达WT或G428E穿孔素或空载体(GFP)的RBL细胞，并在Percoll密度梯度上进行分级。然后通过Western印迹法和其β-氨基己糖苷酶活性就其穿孔素的含量对级分进行分析。
图25显示G428E突变显著地减少可溶性穿孔素的钙依赖性膜结合。在1mM CaCl2不存在(-)或存在(+)的情况下就其结合绵羊红细胞的能力对等量的重组WT和突变体穿孔素进行检测。在各情况下穿孔素的总输入量表示为(C)。
图26显示在HLH中鉴定的两个普通的穿孔素多态性(polymorphisms)和错义突变的定位。用框标示推定的穿孔素的结构域，数字表示各结构域的近似的氨基酸边界，将前导序列的第一个残基设为残基1。预测N末端具有裂解特性；两个低同源性的区域与其他哺乳动物蛋白质的结构域没有显著的相似性；两亲性α-螺旋和补体膜攻击复合体组分C5b至C9的区域同源；EGF-样结构域在结构上和遍在的EGF结构域相似，主要是由于高度保守的半胱氨酸残基导致的；C2结构域是负责穿孔素的膜结合的钙结合区域。星号标示的残基A91V和N252S是指猜测的穿孔素多态性。
图27显示A91V和共遗传的取代R232S的减少的表达和功能的部分丧失。显示了在遗传了A91V、R232H和双突变的A91V/R232H穿孔素的异卵双胞胎中鉴定的PRF1突变的作用。最上面的图显示来自RBL细胞的全部细胞提取物的Western印迹，所述RBL细胞表达各自的突变的穿孔素，并通过在材料和方法部分中描述的方法分选。该图显示4小时细胞毒性测定法，在该测定法中，以指定的效应器/靶(E/T)比率将瞬时转染并分选的RBL细胞用作效应细胞而将51Cr标记的Jurkat细胞用作靶细胞。显示的数据是4-9个独立实验的平均值±SE。为了清晰说明，在更大的标绘图中再次显示数据的子集(较低的E/T比率)。
图28显示在残基252上具有丝氨酸取代的穿孔素的正常表达和功能。Western免疫印迹显示D252S、D252N(如在人穿孔素中)和D252E(如在比目鱼穿孔素中)在瞬时转染的RBL细胞中的相对表达。线形图(中间)显示在51Cr释放细胞毒性测定中的D252S穿孔素(等同于人中的N252S)的裂解活性。条形图(底部)比较了移植到小鼠穿孔素上的在位置252处的穿孔素变体的裂解活性；在比目鱼穿孔素中发现D252E，在人穿孔素中发现D252N。显示的数据是平均值±SD，其代表三个独立的实验。
图29显示PRF1的错义突变对于穿孔素的表达和活性的影响的分析。转染RBL细胞，使其表达携带所列的每个错义突变的穿孔素，然后对所述细胞进行FACS分选，并将其用于Western印迹分析和51Cr释放细胞毒性测定法。除非另外指出，使用Jurkat T淋巴瘤细胞作为靶细胞，以30∶1、10∶1和2∶1的E/T比率在基于RBL的测定法中检测每个突变的穿孔素至少3次。根据HLH患者的基因型将突变分类：(A)在纯合子患者中鉴定的突变，(B)在双重杂合子中鉴定的突变，其中第二等位基因编码蛋白质的移码突变和提前终止突变，(C)于在PRF1的两个等位基因上都具有错义突变的双重杂合子中鉴定的突变。Western免疫印迹显示，在等量的FACS-分选的RBL细胞中突变的穿孔素的表达的相对水平。每个患者的原始参考以上标形式显示于第一栏。HLH诊断的年龄以月表示，如在对应的参考中所描述的。斜体字表示之前我们在别处分析的穿孔素突变。氨基酸保守性来源于哺乳动物和比目鱼穿孔素的氨基酸序列比对，如在PredictProtein(EMBL-Heidelberg)中的一样。
图30显示在穿孔素的残基232上的各种取代对RBL-介导的细胞毒性的影响。以E/T比率表明了使用转染的RBL细胞和Jurkat靶细胞的51Cr释放细胞毒性测定法，在该测定法中将R232C和R232H(在HLH患者中鉴定的取代)穿孔素的细胞毒性功能与WT和R232S(比目鱼)穿孔素的细胞毒性功能进行比较。
图31显示V183G穿孔素具有正常的功能，而C279Y取代导致穿孔素功能的丧失。以E/T比率表明了使用转染的RBL细胞和Jurkat靶细胞的51Cr释放细胞毒性测定法，在该测定法中将推定的穿孔素突变V183G穿孔素(最上方)和C279Y穿孔素(最下方)与WT穿孔素进行比较。
图32显示阻断穿孔素和粒酶B的增效促细胞凋亡功能的抑制剂化合物46553。以1∶10,000的稀释度使用穿孔素以获得通过穿孔素滴定确定的10-20％的杀伤力，如上文中所描述的。以1ug/ml使用粒酶B。
图例：P(穿孔素)，I(抑制剂化合物46553)，d或D(DMSO)和B(粒酶B)。
                      发明详述
细胞中逆转录病毒介导的重组穿孔素表达的方法
在本发明的一个方面，提供了在细胞中表达穿孔素或其片段或变体的方法，所述方法包括用能够在所述细胞中驱动所述穿孔素或其片段或变体重组表达的逆转录病毒载体转染细胞。
与细胞表达的标准方法例如通过CaPO4沉淀、lipofectamine或类似的试剂或者电穿孔相比，本发明特别涉及使用逆转录病毒系统表达重组穿孔素。
在整个本说明书和权利要求中，词“包含”并不表示不包括其他的添加物或组分或整数或步骤。
术语“穿孔素”、“溶细胞素”、“成孔蛋白(pfp)”和“C9-样蛋白”在此处可交换使用，优选地其包括以各种形式存在的穿孔素多肽和其片段，包括天然发生的或合成的变体。本发明包括的穿孔素的实例包括具有图1中所示的氨基酸序列的人穿孔素。本发明也包括小鼠和大鼠穿孔素同种型，虽然也考虑了来源于其他物种的穿孔素，包括由低等生物例如细菌产生的穿孔素。
穿孔素基因已被定位在小鼠的第10号染色体(Trapani等人，1990，J Exp Med，171：545-557)和人的第17号染色体(Shinkai等人，1989，Immunogenetics，30：452-457)上。已发现，外显示子1编码非翻译序列，而完整的蛋白由外显示子2的部分和外显子3的全部编码，该外显子3也包含3′非翻译区域。编码小鼠(Kwon等人，1989，Biochem Biophys Res Commun，158：1-10；Lowrey等人，1989，ProcNatl Acad Sci USA，86：247-251)、人(Lichtenheld和Podack，1989，J Immunol，143：4267-4274)和大鼠(Ishikawa等人，1989，J Immunol，143：3069-3073)穿孔素的穿孔素cDNA的克隆表明，在氨基酸水平上人和大鼠穿孔素具有大约68％的同一性，而小鼠和大鼠穿孔素具有大约86％的同一性。人和小鼠蛋白质在长度上都是534个氨基酸，然而人的前导肽序列(21个氨基酸)比小鼠的对应物长1个残基。穿孔素包含20个半胱氨酸残基，其在所有三个物种中是完全保守的，据认为这些残基形成了10个链内二硫键。
指出由穿孔素的孔和由补体MAC(特别是C9)形成的孔的相似性的早期功能性研究激励着对所述两种蛋白之间的结构和功能相似性的寻找。然而，一级序列的分析显示，所述两种蛋白只在穿孔素分子的中心附近的300个氨基酸的延展长度上具有20％的同源性(Shinkai等人，1988，Nature，334：525-527)，而剩下的部分没有显示出丝毫相似性。在该中心部分是两个具有甚至更高同源性的区域。残基211-241对应于补体蛋白中的区域，该区域显示较高的两亲性特征。已提出，当附着至膜上时，在分子中发生了明显的构象变化，导致该两亲性α-螺旋区域的暴露，使得能够插入脂膜。第二个强保守性的结构域是残基376-409之间的区域，该区域与也在MAC蛋白中发现的表皮生长因子(EGF)-样重复结构域具有相似性(Shinkai等人，1988，Nature，334：525-527)。存在于该区域中的6个保守的半胱氨酸可形成分子内二硫键，所述二硫键对保持功能上重要的结构作出贡献，或者它们可以是和其他穿孔素单体聚集形成功能性孔的位点。氨基末端的100个残基和羧基末端的150个残基对于穿孔素来说是完全独特的。在由Ojcius和同事进行的研究(Ojcius等人，1991，Proc Natl Acad SciUSA，88：462-4625)中，使用对应于34个N末端残基的合成的肽表明该区域具有强的膜破坏性特性。
如此处所用的，术语“天然的”优选地是指具有在自然界中发生的氨基酸序列的穿孔素多肽分子(例如，天然的蛋白质)。天然的穿孔素或天然发生的穿孔素，可被鉴定为杀细胞性颗粒的主要组分中的一种，发现在进行还原和SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳时，其以大约66kDa的分子质量迁移，而在非还原性条件下迁移更慢(70-75kDa)，这暗示着在其天然形式中存在紧密的二硫键形成的结构。在钙离子(Ca2+)存在的情况下，穿孔素单体聚集形成了横跨脂双层的管状结构，产生环形的伤口(直径在6和20nm之间变动)，据认为，通过不断地招募额外的单体，该伤口直径逐渐增大。
穿孔素的变体可显示和天然的穿孔素多肽或其片段具有至少80％的同一性的氨基酸序列。还涉及这样的实施方案，在该实施方案中，变体包含这样的氨基酸序列，即该氨基酸序列和天然的穿孔素多肽或其片段具有至少90％的同一性，优选地至少95％的同一性，更优选地至少98％的同一性，更加优选地至少99％的同一性，或最优选地至少99.9％的同一性。可通过目测和数学计算确定同一性百分数。在天然发生的其变体和片段中提供了保持天然生物学活性的天然穿孔素的变体或其基本上相似的等同物。此处也提供了没有显著生物学活性的天然发生的变体。这些变体也可来源于已知的HLH或FHL突变，或可以是根据经验获得的或推导的变体。
穿孔素的变体优选地包括这样的多肽，所述多肽基本上和穿孔素的天然形式同源，但因为一个或多个缺失、插入或取代，其具有不同于天然形式的氨基酸序列的氨基酸序列。优选的实施方案包含这样的多肽，当和天然的序列相比，所述多肽包含1至10个氨基酸残基的缺失、插入或取代。给定的序列可被例如具有相似的物理化学特性的残基替代。一个脂肪族残基对另一个脂肪族残基的这样的保守取代的实例是，例如Ile、Val、Leu或Ala相互之间的替代；一个极性残基对另一个极性残基的取代，例如Lys和Arg、Glu和Asp、或Gln和Asn之间的取代；或者一个芳香族残基对另一个芳香族残基的取代，例如Phe、Trp或Tyr相互之间的取代。其他保守的取代，例如，包括具有相似的亲疏水性特征的整个区域的取代，在本领域是熟知的。也可通过天然穿孔素多肽的截断来产生变体。本发明包括的其他变体包括，但不限于，去糖基化的穿孔素多肽或其片段，或当和天然的穿孔素相比时表现出增加的糖基化的多肽。也包括具有增加的水合作用的穿孔素多肽变体。“保守性氨基酸取代”是这样的取代，即在该取代中用具有相似侧链的氨基酸残基替代一个氨基酸残基。在本领域中已定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分枝的侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，穿孔素多肽的氨基酸残基优选地用来自相同的侧链家族的另一种氨基酸的替代。在优选的实施方案中，可通过例如饱和诱变沿着全部或部分穿孔素的编码序列随机地引入突变，可就穿孔素的活性筛选所得的突变体以鉴定这样的变体，该变体和天然的穿孔素相比，表现出相同的、减少的或增加的穿孔素活性。诱变后，可通过此处描述的方法重组地表达被编码的蛋白质，和测定所述蛋白质的活性。
优选地，穿孔素多肽的变体将用作激动剂(模拟的)或用作拮抗剂。穿孔素的激动剂可提高穿孔素的活性或基本上保持相同的或部分的穿孔素天然发生形式的生物学活性。通过例如竞争性地调节穿孔素介导的活性，穿孔素的拮抗剂可抑制所述多肽的天然发生形式的一种或多种活性。因此，可通过用有限功能的变体进行处理来引发特定的生物学效应。优选地，和用穿孔素的天然发生形式处理受试者相比，用具有穿孔素的天然发生形式的部分生物学活性的变体处理受试者在受试者中产生更小的副作用。
如此处所用的，术语“穿孔素活性”、“穿孔素的生物学活性”等优选地是指穿孔素多肽的细胞裂解活性；即，其结合至靶细胞膜并聚合形成导致细胞裂解的孔-样跨膜通道的能力。所述活性也包括与其他毒素例如颗粒毒素(granule toxin)和其他分子协同作用诱导凋亡的能力。所述靶细胞可以是能够被天然的穿孔素裂解的任何细胞。
可由本领域技术人员，通过许多本领域已知的方法来评估穿孔素的生物学活性，所述方法包括，但不限于，靶细胞裂解的测量，粒酶B分子至靶细胞的递送，靶细胞膜破坏的测量(例如通过离子转运上的改变)、靶细胞中凋亡的诱导、囊泡运输的修饰和靶细胞死亡的总体评估。所述靶细胞可以是红细胞(RBC)，从而测量穿孔素活性的普通方法是通过RBC裂解测试来进行的。其也可以是任何有核的细胞。
在优选的实施方案中，所述变体是穿孔素基因的突变种。更优选地，所述突变种是在患有HLH，更优选(FHL)的个体中鉴定的穿孔素基因。
HLH和更优选地遗传连锁的FHL是作为常染色体隐性性状遗传的先天性疾病，其属于一组噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(haemophagocytic lymphohistiocytosis)综合征，其临床特征在于发烧、肝脾大和全血细胞减少症。此外，在HLH或FHL期间，一般发生神经受累(neurological involvement)，其表现形式可包括惊厥、脑神经麻痹、共济失调和在最终阶段的昏迷(Haddad等人，1997)。和临床症状相关的经常性发生的异常包括高甘油三酯血症、低纤维蛋白原血症和提高的细胞因子(例如IL-1、IL-6、TNF和IFN-Y)水平。在组织学上，存在CD8+T细胞和巨噬细胞的过度扩增，它们渗透至数个器官例如脾脏、肝脏、骨髓(BM)、淋巴结和中枢神经系统。在各种组织(特别是骨髓和肝脏)中通过组织细胞摄取血细胞(特别是红细胞)(即吞噬血细胞作用)和释放炎性细胞因子的证据导致大规模的组织坏死、器官衰竭和最终儿童的死亡。临床(发烧，脾大)、实验室(细胞减少症、高甘油三酯血症和/或低纤维蛋白原血症)以及形态学上的(吞噬血细胞作用)特征的结合用作该疾病的诊断标准，然而通常在死后进行所述诊断，这暗示着该疾病诊断的困难性。目前，HLH和更优选地FHL只有化学治疗和骨髓移植相结合才能治愈。该治疗方案的侵入性和通常使体质衰弱的性质突出了鉴定新的和改善的治疗策略的重要性。据认为，HLH或FHL中的临床图像(clinical picture)是由于细胞裂解性淋巴细胞不能清除感染性病原体造成的，类似于在用LCMV感染的穿孔素GKO小鼠中观察到的发病机理，在该小鼠中，病毒特异性T细胞的增加的扩增和不能下调免疫应答是主要的特征。据认为，在缺少穿孔素依赖性细胞毒性机制的情况下，抗原呈递细胞(APC)继续给非功能性淋巴细胞呈递活化和增殖信号。尽管还未确定该婴儿疾病的单一成因感染因子，但病毒感染，特别是疱疹类病毒(EB病毒和巨细胞病毒)的感染，已在患有FHL的患者中被检测到(Imashuku等人，1999)。已发现穿孔素基因的编码区中的突变占HLH或FHL病例的大约30％，但这没有减少缺陷也可能存在于控制穿孔素的表达或活化的调控因子的水平上的可能性。
表1提供了优选的穿孔素突变，其列出了至今在FHL中鉴定的突变中的一些和概述了预计影响所述蛋白的编码序列和功能的无义突变、错义突变和移码突变谱。例如，在Trp374上的导致提前终止密码子的突变是到目前为止最频繁报导的突变。该残基位于富含半胱氨酸的EGF结构域中并且在人、小鼠和大鼠基因中是保守的。大量的错义突变存在于在所有三种物种之间保守的残基上，暗示着这些残基对所述蛋白的功能是至关重要的。在图1中通过图的方式提供了在穿孔素分子的特定结构域内发生的突变的位置。特别吸引人的是这样的错义突变，即所述错义突变将会被证明在评价这些至关重要的残基是如何参与穿孔素的功能方面是无价的。
表1：在FHL中鉴定的穿孔素基因的突变
  突变的类型   序列改变   氨基酸#   预测的效果   保守的残基   结构域
  小鼠   大鼠
  错义缺失插入错义错义错义错义无义缺失错义错义错义无义错义错义错义错义错义错义错义错义错义缺失错义缺失缺失无义插入错义错义   3 G→A50 C缺失50 T插入116 C→A133 G→A148 G→A160 C→T190 C→T207 C缺失283 T→C445 G→A836 G→A657 C→A658 G→A662 C→T671 T→A673 C→T694 C→T695 G→A755 A→G781 G→A836 G→A853-855 AAG缺失1034 C→T1083 G缺失1090-1091 CT缺失1122 G→A1182 T插入1286 G→A1304 C T   1171739455054646995149183219220221224225232232252261279285345361364374394429435   Met→Leu移码移码Pro→HisGly→ArgVal→MetArg→SerGln→终止移码Trp→ArgGly→SerVal→GlyTry→终止Gly→SerThr→IleIle→AspArg→TrpArg→CysArg→HisAsn→SerGlu→LysCys→Tyr移码Pro→Leu移码移码Trp→终止移码和终止Gly→GluThr→Met   YesNoNoYesYesYesYesYesYesYesYesYesYesYesYesYesNoYesYesNoYesYesNoYesYesNoYesYesYesYes   NoNoNoYesYesYesYesNoYesYesYesNoYesYesYesYesNoYesYesNoYesYesNoYesYesNoYesYesYesYes   前导序列前导序列N-末端N-末端N-末端N-末端N-末端-----跨膜跨膜跨膜跨膜跨膜----EGF-样结构域EGF-样结构域C2结构域C2结构域
前导序列＝在分子的N末端的信号肽。跨膜＝推定的两亲性α螺旋结构域。
C2结构域＝由Uellner等人(1997，Embo J，16：7287-7296)通过分子建模鉴定的C2钙结合结构域。氨基酸和核苷酸编号包括21个氨基酸的前导肽。
穿孔素突变和多态性也在下面的实施例部分进行详细描述，其包括A91V、N252S、R225W和G429E。
失活性错义穿孔素突变的目录，作为经表征的HLH或FHL突变的结果现已进行汇编，其可能为穿孔素的分子和细胞功能提供了新的见解。假设地，穿孔素功能中的这些缺陷可在许多水平发生，包括mRNA的不稳定性、有缺陷的蛋白折叠或加工、错误地运输至细胞裂解性颗粒或有缺陷的从CTL中的释放。缺陷的第二类别应当对应于穿孔素从CTL中的释放的下游，和涉及功能例如钙结合和附着或插入至脂双层，或导致粒酶B的有缺陷的运输。
本申请人已对两个穿孔素点突变的性质进行了描绘并且第一次获得这样的惊人发现，即两个突变的变体都能够通过颗粒胞吐进行释放，所述两个点突变产生单个氨基酸取代，Gly428Glu和Pro344Leu，或保守的穿孔素序列中的等价位置。已推导出，在小鼠序列中突变发生在Gly428和Pro 344，而在人序列中，突变发生在Gly 429和Pro 345上。类似的点突变可在其他物种的穿孔素序列中在所述穿孔素序列中的等价的Gly和/或Pro部分发生.Gly和/或Pro部分发生。这些发现意味着，在具有这些突变的患者的CTL中观察到的穿孔素的耗损是由于在免疫攻击期间穿孔素的异常调节的(dysregulated)释放导致的。
因此，在优选的实施方案中，当和天然的穿孔素相比时，穿孔素多肽变体具有减少的生物学活性。在另一优选的实施方案中，穿孔素多肽变体包含发生在保守的穿孔素多肽序列中的Gly和/或Pro残基上的错义突变，所述残基等同于小鼠穿孔素序列中的G428和/或P344或人穿孔素序列中的Gly429和/或Pro345。在另一优选的实施方案中，穿孔素多肽变体包含错义突变G428E和/或P344L，所述残基也是由本申请人发现的在小鼠和大鼠穿孔素多肽中都保守的残基。在另一优选的实施方案中，穿孔素多肽变体包含错义突变G429E和/或P345L，所述残基也是由本申请人发现的在人穿孔素多肽中保守的残基。
在另一优选的实施方案中，穿孔素变体是包含天然穿孔素多肽或其片段和附着至其上的额外结构域的融合蛋白，其中所述额外的结构域可以是天然发生的或合成的。优选地，本发明的融合蛋白包含许多被加入至穿孔素多肽或其片段或变体的氨基酸，通常加入至所述重组穿孔素多肽的氨基末端。这些融合蛋白可用作这样的目的，所述目的选自，但不限于：1)增加重组穿孔素多肽的表达；增加重组穿孔素多肽的溶解度；和通过用作亲和纯化中的配体来帮助重组穿孔素多肽的纯化。通常，在融合部分与重组穿孔素多肽之间的连接处引入蛋白水解切割位点以使得在融合蛋白纯化之后，所述重组穿孔素多肽能够与融合部分分离。这些酶，和其关连识别序列，包括凝血因子Xa、凝血酶和肠激酶。可通过使用本领域技术人员已知的融合表达载体例如pGEX、pMAL和pRIT5产生典型的融合蛋白，所述载体分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或A蛋白融合至靶重组多肽。
如此处所用的，术语“片段”优选地是指穿孔素多肽或其变体的部分。这样的片段优选地包含天然的穿孔素多肽或其变体的至少1个氨基酸残基，更优选地至少5个氨基酸残基，更加优选地至少10个氨基酸残基，和更为优选地至少20个氨基酸残基。
在另一优选的实施方案中，穿孔素多肽的片段可包含免疫原性或抗原性区域。因此片段可包含被免疫球蛋白识别(即，特异性结合)的穿孔素多肽或其变体的部分。
在另一优选的实施方案中，穿孔素多肽的片段可由具有生物学活性的C-末端结构域构成。这样的片段一般可使用这样的技术来进行鉴定，所述技术是在鉴定穿孔素活性中本领域技术人员熟知的技术，如在上文中描述的。穿孔素多肽片段也可通过就其与穿孔素特异性抗体和/或抗血清反应的能力筛选片段来进行鉴定。如果抗血清和抗体特异性地结合穿孔素多肽或其变体或片段(即，其在酶联免疫吸附测定法[ELISA]或其他免疫测定法中和穿孔素反应，并且在可检测的水平上不和不相关的多肽反应)，那么其是“穿孔素特异性的”。可以如此处所描述的，使用熟知的技术(参见，例如，Harlow和Lane， Antibodies： A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)制备这样的抗血清和抗体。
穿孔素分子也包括天然发生的或合成的核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列编码上文中描述的穿孔素多肽或其片段或变体。术语“核酸分子”包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如，mRNA)和通过例如使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链的或双链的，但优选地是双链的DNA。
如此处所用的，“天然发生的”核酸分子优选地是指具有在自然界中发生(例如，编码天然蛋白质)的核苷酸序列的RNA或DNA分子。
如此处所用的，术语“基因”和“重组基因”优选地是指这样的核酸分子，所述核酸分子包含编码穿孔素多肽的开放阅读框架，并且还可包含非编码调控序列，和内含子。
例如，穿孔素核酸分子优选地包含这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列和图1中所示的核苷酸序列具有至少大约60％、优选地至少65％、更优选地至少70％、更加优选地至少75％、更加优选地至少80％、更加优选地至少85％、更加优选地至少90％、更加优选地至少91％、更加优选地至少92％、更加优选地至少93％、更加优选地至少94％、更加优选地至少95％、更加优选地至少96％、更加优选地至少97％、更加优选地至少98％、最优选地至少99％或更高的同源性。在长度大于或等于参照序列(例如图1中的序列)的核酸分子的情况下，将其和全长的参照序列进行比较。当分离的核酸分子短于参照序列例如短于图1中描述的序列时，和相同长度的参照序列的区段(不包括同源性计算所需要的任何环)进行比较。穿孔素核酸分子可来源于任何物种，包括，但不限于，人、大鼠、小鼠、鸟、马和低等生物例如细菌。
根据本发明，通过本领域技术人员已知的任何手段可用逆转录病毒载体转染(或转导)细胞。这些手段包括，但不限于，电穿孔、脂质体的使用和CaPO4沉淀。
逆转录病毒载体
本发明开发了使用逆转录病毒载体来“携带”编码穿孔素、其片段或变体的核酸分子，以转染最终表达穿孔素、其片段或变体的细胞。因此，在本发明的另一个方面，提供了能够在用所述载体转染的细胞中驱动穿孔素或其片段或变体表达的逆转录病毒载体。
如此处所用的，术语“逆转录病毒载体”优选地是指这样的基因转移媒介物，其利用逆转录病毒复制周期的特性，例如高感染效率和通过病毒传递的信息稳定地共线性整合入靶细胞染色体中。
用于本发明的逆转录病毒可来源于许多种类的逆转录病毒，包括，但不限于，莫洛尼鼠白血病病毒、鼠干细胞病毒、脾坏死病毒、逆转录病毒例如劳斯肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽类造白细胞组织增生病毒、长臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒。在优选的实施方案中，所述逆转录病毒质粒载体是鼠干细胞病毒(MSCV)载体或其衍生物。更优选地，特别是当用于人或小鼠原代细胞的转染时，所述逆转录病毒质粒载体是pLXSN(GenBank目录号 M28248)。
逆转录病毒载体优选地包含一个或多个启动子。可使用的合适的启动子包括，但不限于，逆转录病毒长末端重复(LTR)；SV40启动子；和人巨细胞病毒(CMV)启动子(如Miller等人，Biotechniques，第7卷，No.9，980-990(1989))，或任何其他启动子(例如，细胞启动子例如真核细胞启动子，包括，但不限于，组蛋白、pol III和β-肌动蛋白启动子)。可使用的其他病毒启动子包括，但不限于，腺病毒启动子、胸苷激酶(TK)启动子和B19细小病毒启动子。根据此处包含的教导，本领域技术人员可容易地选择合适的启动子。
编码穿孔素多肽或其片段或变体的核酸序列，优选地被置于合适的启动子控制之下。可使用的合适的启动子包括，但不限于，腺病毒启动子，例如腺病毒主要后期启动子；或异源启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸道合胞病毒(RSV)启动子；可诱导的启动子，例如MMT启动子，即金属硫蛋白启动子；热激启动子；白蛋白启动子；ApoAI启动子；人珠蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；逆转录病毒LTRs；P-肌动蛋白启动子；和人生长激素启动子。启动子也可以是控制编码穿孔素或其片段或变体的基因的天然启动子。
在另一优选的实施方案中，本发明的逆转录病毒载体还包含合适的标记基因(此处称为“可选择的标记”)，这样可容易地选择经转导的细胞。优选地，可选择的标记是给经转化的细胞提供抗生素抗性的药物抗性基因、给经转化的细胞提供用于其检测的酶活性的报告基因，或可通过本领域已知的方法在经转化的细胞中被检测的惰性蛋白质。例如，可选择的标记可以是绿色荧光蛋白，该蛋白在经转化的细胞中表达后，可在紫外光下通过光学显微镜显像来检测。在另一实施方案中，N2/ZipTKNEO载体(TKNEO，1991，Blood，78：310-317)和PM5neo载体(1995，Exp.Hematol，23：630-638)都包含新霉素抗性基因(新霉素磷酸转移酶)作为它们的可选择的标记。因此，通过它们对抗生素(新霉素，G418，等)的抗性识别用这些载体转染的细胞，所述抗生素被所述基因产物失活。
包装细胞
在优选的实施方案中，本发明包括将逆转录病毒载体转染入“包装细胞”中的进一步的步骤。因此，在本发明的另一个方面，提供了用能够在细胞中驱动穿孔素或其片段或变体重组表达的逆转录病毒载体转染的包装细胞。优选地，所述包装细胞能够产生能够进一步感染宿主细胞以表达重组穿孔素的感染性颗粒。
因此，在本发明的另一个方面，提供了携带这样的逆转录病毒载体的逆转录病毒颗粒，所述逆转录病毒载体能够在细胞中驱动穿孔素或其片段或变体的表达。
如此处所用的，术语“包装细胞”优选地是指包含这样的元件的细胞，所述元件是通过提供在重组病毒载体中缺少的元件来产生感染性重组病毒所必需的。一般地，这样的包装细胞包含一种或多种能够表达病毒结构蛋白(例如gag、pol和env)的表达盒，但其不包含包装信号(例如psi)。因此，包装细胞可通过其自身只形成空毒粒颗粒。在该一般方法中，将逆转录病毒导入包装细胞中，从而产生“生产者细胞”。因此，该生产者细胞生产包含这样的逆转录病毒载体的毒粒颗粒，所述逆转录病毒载体包含编码穿孔素或其片段或变体的多核苷酸序列。
使用包装细胞可确保不产生具有复制能力的病毒，否者所述病毒可在宿主内部产生不受控制的感染。包装细胞表达编码病毒的衣壳(包裹病毒颗粒的核蛋白核心或核酸的蛋白质外壳)的蛋白质，编码这些蛋白质的基因在包装细胞的基因组的不同位点上。这可预防较为可能的重组事件，否则该重组事件可使载体DNA获得产生具有复制能力的逆转录病毒所需的基因。优选地，所述包装细胞系将产生这样的逆转录病毒，该逆转录病毒能够进行感染，但只包含编码穿孔素或其片段或变体的RNA、其启动子和可使穿孔素基因能够正确表达的LTR′s。
可容易地制备具有上述逆转录病毒载体构建体的适合使用的包装细胞(参见，例如，PCT公开号WO 95/30763和WO 92/05266)，并将其用于建立用于重组载体颗粒生产的生产者细胞系(也称作载体细胞系)。在本发明的特别优选的实施方案中，从人(例如HT1080细胞)或貂亲本细胞系产生包装细胞系，从而允许产生可在人血清中以失活的状态存活的重组逆转录病毒。
包装细胞的实例包括，但不限于，PG13(ATCC CRL-10686)、PG13/LNc8(ATCC CRL-10685)、PA317(ATCC CRL-9078)、美国专利号5,278,056中描述的细胞株系、GP+E-86(ATCC CRL-9642)、GP+envAm-12(ATCC CRL-9641)、293T、PE501、PA317.psi.-2、.psi.-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、.psi.CRE、.psi.CRIP、GP+E-86、GP+envAm12和Miller，Human Gene Therapy，1：5-14(1990)(以其全文在此引用作为参考)中描述的DNA细胞系。更加优选地，所述包装细胞来源于HEK 293 101细胞。
逆转录病毒载体可通过任何本领域已知的方法转导所述包装细胞。这些方法包括，但不限于，电穿孔、脂质体的使用和CaPO4沉淀。
在优选的包装和生产者细胞中，有毒的包膜蛋白序列和核壳序列都被稳定地整合入细胞中。然而，一个或多个这些序列也可以附加体形式存在，和基因表达可在附加体上发生。
在优选的实施方案中，所述包装细胞系是第二代包装细胞系。在另一个优选的实施方案中，所述包装细胞系是第三代包装细胞系。
已发现，包含前病毒(其中包装性信号已被删除)的简单的包装细胞导致不希望的具有复制能力的病毒通过重组快速地产生。为了提高安全性，已产生第二代细胞系，其中前病毒的3′LTR被删除。在这样的细胞中，两次重组是产生野生型病毒所必需的。其他改进包括将gag-pol基因和env基因引导在分开的构建体上，即所谓的第三代包装细胞系。按顺序导入这些构建体以防止在转染期间发生重组。
在断裂构建体(split-construct)，第三代细胞系中，通过改变密码子可获得重组的进一步减少。基于遗传密码子冗余性的该技术旨在减少分开的构建体之间，例如gag-pol和env开放阅读框架中交叠区域之间的同源性。
包装细胞系用于提供封装所必需的基因产物和提供用于高滴度载体颗粒产生的膜蛋白。所述包装细胞可以是体外培养的细胞，例如组织培养细胞系。合适的细胞系包括，但不限于，哺乳动物细胞例如来源于鼠成纤维细胞的细胞系或人细胞系。优选地，所述包装细胞系是人细胞系，例如，HEK 293、HEK 293T、TE671或HT1080。
可选择地，包装细胞可以是来源于待治疗的个体的细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、血细胞或成纤维细胞。可从个体分离所述细胞，并离体地施用包装和载体组分，然后重新施用自体包装细胞。
优选地，所述包装细胞系产生感染性逆转录病毒载体颗粒(毒粒)，所述逆转录病毒载体颗粒包含编码上述穿孔素或其片段或变体的多核苷酸序列。然后可将这些逆转录病毒载体颗粒用于体外或体内地转导宿主细胞，以表达编码穿孔素或其片段或变体的多核苷酸序列。因此，在本发明的另一个方面，提供了携带能够在细胞中驱动穿孔素或其片段或变体表达的逆转录病毒载体的逆转录病毒颗粒。
宿主细胞
在本发明的另一个方面，提供了用逆转录病毒载体转染的宿主细胞或细胞系，所述逆转录病毒载体能够在所述细胞中驱动穿孔素或其片段或变体的表达。
优选地，宿主细胞或细胞系是任何物种的真核细胞或细胞系，其选自胚胎干细胞、胚胎癌细胞、造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质形成细胞、内皮细胞、支气管上皮细胞和免疫细胞。宿主细胞也可以是低等生物例如细菌的细胞。优选地，真核细胞是免疫细胞，其选自嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和天然杀伤细胞。更优选地，免疫细胞是嗜碱性粒细胞，和更加优选地，免疫细胞是大鼠嗜碱细胞性白血病(RBL)细胞。
细胞组合物
在另一个方面，本发明提供了用这样的逆转录病毒载体转染的细胞的组合物，所述逆转录病毒载体能够驱动此处描述的穿孔素分子、其片段或变体的表达。此处使用的“细胞的组合物”优选地是指分散的细胞的体外制剂。在培养的细胞的情况下，其由至少10％和更优选地50％的受试者的细胞的制剂组成。可选择地，细胞的组合物可以指从已被施入前面提到的逆转录病毒表达载体的受试者中(体内地或离体地)获得的生物组织。“受试者”，如此处所用的，优选地是指哺乳动物，例如，人，或指非人动物，包括，但不限于，马、牛、山羊、大鼠或小鼠。
分离的重组穿孔素和其片段、变体或突变形式
在另一个方面，本发明提供了由此处描述的方法产生的重组穿孔素分子。在优选的实施方案中，所述重组穿孔素分子是分离的或纯化的穿孔素分子，其为此处描述的重组穿孔素多肽或其片段或变体；或者是编码所述穿孔素的核酸分子。从前述的细胞的组合物中分离重组穿孔素分子是另一优选的实施方案。
优选地，“分离的或纯化的”穿孔素分子基本上不含细胞材料或来自产生该蛋白质的细胞或组织来源的其他污染性蛋白质。术语“基本上不含”优选地是指这样的穿孔素多肽的制剂，所述制剂具有低于大约30％、20％、10％和更优选地5％(按干重计算)的非穿孔素分子(在此处也称为“污染分子”)。穿孔素多肽优选地还基本上不含培养基，即，培养基占有低于大约20％、更优选地低于大约10％、和最优选地低于大约5％的所述蛋白质制剂的体积。
术语“分离的或纯化的穿孔素分子”也指这样的穿孔素核酸分子，该核酸分子是从存在于该核酸的天然来源中的其他核酸分子中分离出来的。例如，对于基因组DNA，术语“分离的”包括从与所述基因组DNA天然地相关联的染色体分离的核酸分子。优选地，“分离的”核酸不含有在基因组DNA中天然地侧翼连接该核酸的序列(即，位于该核酸的5′和/或3′末端的序列)，所述基因组DNA是所述核酸所来源的生物的基因组DNA。例如，在各种实施方案中，分离的核酸分子可以包含少于大约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在基因组中天然地侧翼连接该核酸分子的5′和/或3′核苷酸序列，所述基因组DNA是所述核酸所来源的细胞的基因组DNA。此外，“分离的”核酸分子，例如cDNA分子，当通过重组技术产生时可以基本上不含有其他细胞材料，或培养基，或当通过化学合成时可以基本上不含有化学前体或其他化学药品。
筛选测定法
在本发明的另一个方面，提供了筛选调节穿孔素表达和/或活性的化合物的方法，所述方法包括步骤：
获得用逆转录病毒载体转染的宿主细胞或获得穿孔素的样品，所述逆转录病毒载体驱动重组穿孔素或其片段或变体的表达；
将所述细胞或穿孔素暴露于受试化合物；和
确定所述受试化合物是否结合所述穿孔素和/或调节所述穿孔素的表达和/或活性。
优选地，筛选测定法包含表达本发明的穿孔素分子的宿主细胞。这样的宿主细胞优选来源于上文中所描述的哺乳动物、酵母、果蝇(Drosophila)或大肠杆菌(E.coli)。然后将表达穿孔素分子的细胞(或包含表达的穿孔素多肽的细胞级分)暴露于受试化合物以观察与穿孔素分子的结合，或穿孔素表达和/或活性的调节。
在另一优选的实施方案中，提供了筛选调节穿孔素活性的化合物的方法，所述方法包括步骤：
获得用逆转录病毒载体转染的宿主细胞或获得穿孔素的样品，所述逆转录病毒载体驱动重组穿孔素或其片段或变体的表达；
将所述细胞或穿孔素暴露于受试化合物和靶细胞；和确定所述受试化合物是否调节所述穿孔素对所述靶细胞的活性。
可直接将所述靶细胞暴露于宿主细胞和受试化合物的混合物。可选择地，可在从混合物中除去宿主细胞后，将所述靶细胞暴露于受试化合物和由宿主细胞产生的重组穿孔素的混合物。重组穿孔素的活性的测定不一定需要宿主细胞的持续存在。
筛选测定法也可使用优选地以分离的形式存在的穿孔素样品来检测受试化合物对穿孔素的作用。所述化合物可以通过直接作用于穿孔素分子来抑制穿孔素活性，或其可在靶细胞上阻断穿孔素，从而阻止穿孔素发挥作用。以两种方式中的任一方式，靶向穿孔素，从而其直接的活性不能作用于靶细胞。
通过筛选测定法鉴定的化合物优选地结合穿孔素分子或其片段或变体，和激活(激动剂)或抑制(拮抗剂)穿孔素的表达和/或活性。优选地，经鉴定的化合物(例如，天然的或合成的蛋白质或药物)增加(激动剂)和/或降低(拮抗剂)天然的穿孔素的活性。
在本发明的另一个可选择的方面，提供了筛选调节穿孔素表达和/或活性的化合物的方法，所述方法包括步骤：
获得能够被穿孔素裂解的靶细胞；
获得穿孔素的样品；
将所述细胞或穿孔素暴露于受试化合物；和
确定所述受试化合物是否调节靶细胞从而使穿孔素对靶细胞的活性受到调控。
这一筛选影响穿孔素活性的化合物的可选择的方法旨在鉴定这样的化合物，所述化合物可调节靶细胞、靶细胞上的受体或相互作用的分子例如穿孔素被靶向的靶细胞的表面上的配体，从而调节所述细胞，使其对穿孔素的反应变弱或对穿孔素的反应变得更强。该筛选方法鉴定了不改变穿孔素本身，但改变穿孔素作用的靶细胞或受体的化合物。可以以通过任何方法获得的分离的穿孔素形式提供穿孔素。优选地，以通过此处描述的方法产生的重组穿孔素来提供其。
如此处所用的，术语“穿孔素活性”、“穿孔素的活性”等优选地是指穿孔素多肽的细胞裂解活性；即，其结合靶细胞膜并聚合形成导致细胞裂解的孔-样跨膜通道的能力。所述靶细胞可以是能够被天然的穿孔素裂解的任何细胞。在优选的实施方案中，通过所述筛选测定法鉴定的化合物激活或抑制一种或多种上文中描述的穿孔素活性。
如此处所用的，术语“穿孔素的表达”、“穿孔素表达”等优选地是指编码穿孔素或其片段或变体的多核苷酸的浓度，或可以是指穿孔素多肽或其片段或变体的浓度。
可由本领域技术人员通过许多本领域已知的方法来评估穿孔素的活性，所述方法包括，但不限于，靶细胞裂解的测量、粒酶B分子至靶细胞的递送、靶细胞膜破坏的测量(例如通过离子转运上的变化)、靶细胞中凋亡的诱导、囊泡运输的修饰和靶细胞死亡的总体评估。
可由本领域技术人员通过许多本领域已知的方法来评估穿孔素的表达，所述方法包括，但不限于，编码穿孔素的信使RNA(mRNA)(优选由宿主细胞表达)的测量，例如通过Northern印迹分析或定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)，以及宿主细胞中穿孔素多肽的测量，例如通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射性免疫测定法(RIA)、Western印迹法或通过上文中描述的穿孔素活性的间接测定，从而生物样品中的穿孔素的浓度直接(但不一定线性地)和穿孔素活性的水平成比例。
在另一方面，提供了通过筛选测定法鉴定的调节穿孔素表达和/或活性的化合物。这些化合物包括许多化学种类，尽管它们通常是有机分子，优选地具有高于50和低于大约2,500道尔顿的分子量的小有机化合物。这些化合物可包含对于和蛋白质发生结构相互作用特别是氢键所必需的官能团，其一般至少包含胺基、羰基、羟基或羧基，优选地至少两个官能化学基团。所述化合物也可以包含用一种或多种上述官能团取代的环状的碳结构或杂环结构和/或芳香或多芳香结构。所述化合物也可包含生物分子，包括但不限于，肽、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、结构类似物或组合。然而，本发明不限于这些化合物。
所述化合物可包括，但不限于1)肽，例如可溶性肽，包括以Ig为尾部的融合肽，和随机肽文库(参见，例如，Lam等人，1991，Nature354：82-84；Houghten等人，1991，Nature 354：84-86)和来源于组合化学的由D-和/或L-构型氨基酸构成的分子文库的成员；2)磷酸肽(例如，随机和部分简并、定向的磷酸肽文库的成员，参见，例如，Songyang等人，1993，Cell 72：767-778)；3)抗体(例如，多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、抗独特型抗体、嵌合抗体和单链抗体，以及Fab、F(ab′)2、Fab表达文库片段和抗体的表位结合片段)；和4)小有机和无机分子。
可从广泛的来源(例如，但不限于合成的或天然的化合物的文库)获得所述化合物。合成的化合物文库可从例如Maybridge Chemical Co.(Trevillet，Cornwall，UK)、Comgenex(Princeton，N.J.)、BrandonAssociates(Merrimack，N.H.)、和Microsource(New Milford，Conn.)商购获得。罕见的化学文库可从Aldrich Chemical Company，Inc.(Milwaukee，Wis.)获得。包含细菌、真菌、植物或动物提取物的天然化合物文库可从例如Pan Laboratories(Bothell，Wash.)获得。此外，可获得许多用于随机和定向合成许多种类的有机化合物和生物分子的方法，包括随机寡核苷酸的表达。
可选择地，可产生以细菌、真菌、植物和动物提取物形式存在的天然化合物的文库。可容易地获得用于合成分子文库的方法(参见，例如，DeWitt等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6909；Erb等人，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11422；Zuckermann等人，1994，J.Med.Chem.37：2678；Cho等人，1993，Science261：1303；Carell等人，1994，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2059；Carell等人，1994，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2061；和Gallop等人，1994，J.Med.Chem.37：1233)。此外，可通过常规的化学、物理和生物化学方法(参见，例如，Blondelle等人，1996，Trends inBiotech.14：60)容易地修饰天然的或合成的化合物文库和化合物，和可将它们用于产生组合文库。在另一个方法中，先前鉴定的药物试剂可接受定向或随机的化学修饰，例如乙酰化、烷基化、酯化、酰胺化，并可就调节穿孔素的活性来筛选类似物。
用于产生组合文库的许多方法在本领域是已知的，包括涉及生物学文库的那些方法；在空间上可定址的(addressable)平行固相或溶液相文库；需要去褶合(deconvolution)的合成文库法；‘一珠一化合物’文库法；和使用亲和层析选择的合成文库法。所述生物学文库法限定于多肽或肽文库，而其他四种方法可用于多肽、肽、非肽寡聚物、或化合物的小分子文库(K.S.Lam，1997，Anticancer DrugDes.12：145)。
可通过本领域公知的方法就确定化合物是否竞争性地结合在共同结合位点处来在溶液中筛选文库。这些方法可包括在溶液中(例如，Houghten，1992，Biotechniques 13：412-421)，或在珠上(Lam，1991，Nature 354：82-84)，在芯片上(Fodor，1993，Nature 364：555-556)，在细菌或孢子中(Ladner，美国专利号5,223,409)，在质粒中(Cull等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1865-1869)，或在噬菌体上(Scott和Smith，1990，Science 249：386-390；Devlin，1990，Science 249：404-406；Cwirla等人，1990，Proc.Nat.Acad.Sci.USA97：6378-6382；Felici，1991，J.Mol.Biol.222：301-310和Ladner，专利号5,223,409)筛选文库。
筛选测定法中包含各种其他试剂。这些包括试剂如盐、中性蛋白质(例如，白蛋白、去污剂等)，所述试剂用于促进最佳的蛋白质-蛋白质结合和/或减少非特异性或背景相互作用。可使用提高测定法的功效的试剂，例如蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、抗微生物试剂等。以任何顺序加入产生所需的结合的组分。在有利于最佳活性的任何温度(一般在4℃和40℃之间)下进行温育。优选地就最佳活性选择温育时间，但也可最优化所述温育时间以有利于快速高通量的筛选。一般地，0.1至1小时就足够了。优选地，以不同的受试试剂浓度平行进行多个测定混合物的测定以获得对这些浓度的不同反应。一般地，这些浓度中的一个用作负对照，即，0浓度或低于检测水平的浓度。
针对已知的药物活性化合物的模拟物的设计也是开发基于“先导”化合物的药物的已知方法。当所述活性化合物难以合成或合成成本昂贵时或当其不适合用于特定的施用方法(例如，肽一般是不适合于口服组合物的活性试剂，因为其易于被消化道中的蛋白酶快速降解)时，这可以是希望的。模拟物设计、合成和检测一般用于避免对于靶性质的大规模的分子筛选。
当设计模拟物时，首选想要确定在决定靶性质中是至关重要和/或重要的化合物的特殊区域。在肽的情况下，可通过系统性地改变肽中的氨基酸残基(例如，通过依次替换各残基)来进行该确定。这些构成化合物的活性区域的部分或残基被称作其的“药效团”。
一旦发现药效团，就根据其物理性质(例如，立体化学、键、大小和/或电荷)，使用来自一系列来源的数据(例如光谱技术、X射线衍射数据和NMR)建立其结构模型。可将计算机分析、相似性作图(其模仿药效团的电荷和/或体积而不是原子之间的键)和其他技术用于该建模过程。
在该方法的变化形式中，建立化合物和其结合配偶体的三维结构的模型。当所述化合物和/或结合配偶体在结合后改变构象时，这样做可以特别有用，在模拟物的设计中其可使模型考虑到这一构象变化。
然后选择模板分子，和可将模拟药效团的化学基团移植至模板上。可方便地选择模板分子和移植至其上的化学基团，从而可容易地合成模拟物，所述模拟物可能是药学上可接受的，其在体内不降解并保持先导化合物的生物学活性。然后筛选已建立的模拟物以确定其展现靶性质的的程度，或确定其抑制靶性质至何种程度。然后可进行进一步的最优化或修饰以获得一个或多个用于体内或临床检测的终模拟物。
药物组合物
在本发明的另一个方面，提供了这样的药物组合物，该药物组合物包含此处描述的重组穿孔素分子，和/或通过此处描述的筛选测定法鉴定的激动剂或拮抗剂化合物(此处也称作“活性化合物”)以及药学上可接受的媒介物、赋形剂、稀释剂和/或佐剂。
可单独地使用本发明的药物组合物或可和其他化合物例如治疗性化合物一起使用。
这样的组合物一般包括用能够驱动重组穿孔素、穿孔素多肽或其片段或变体表达的逆转录病毒载体转染的细胞或生物组织、编码所述穿孔素的核酸分子、或穿孔素特异性抗体以及药学上可接受的媒介物、赋形剂、稀释剂和/或佐剂。如此处所用的，术语“药学上可接受的媒介物”优选地包括与药物施用相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。也可将补充的活性化合物整合入组合物中。
配制药物组合物，使其和其想要的施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外，例如，静脉内、皮内、皮下、经口(例如，吸入)、透皮(局部)、透粘膜和直肠施用。用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可包括下列组分：无菌稀释剂例如用于注射的水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成的溶剂；抗细菌剂例如苯甲醇或羟苯甲酸甲脂；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸；缓冲物例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，和用于调节渗透压的试剂例如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱例如盐酸或氢氧化钠来调节pH。肠胃外制剂可封装在由玻璃或塑料制造的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适合注射使用的药物组合物包括无菌水性溶液(当为水溶性时)或用于无菌可注射溶液或分散体的即时制剂的分散体和无菌粉末。对于静脉内施用，合适的媒介物包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL.TM.(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸缓冲盐溶液(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且其流动性应当达到容易注射的程度。在生产和贮存条件下其应当是稳定的，并且其必须是防腐的，能够抵抗微生物例如细菌和真菌的污染作用。所述媒介物可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇或液体聚乙二醇等)和其合适的混合物的溶剂或分散介质。可通过例如使用包衣例如卵磷脂，在分散体的情况下通过保持所要求的颗粒大小，或者通过使用表面活性剂，来保持适当的流动性。可通过加入各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来防止微生物的作用。在许多情况下，优选地在组合物中包含等渗剂，例如，糖、多元醇如甘露醇或山梨醇、或氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝或明胶可导致可注射组合物的长时吸收。
可通过将活性化合物以所需的量整合入合适的溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液，所述溶剂按要求具有上面例举的一种成分或成分的组合。一般地，通过将活性物质整合入无菌媒介物中来制备分散体，所述媒介物包含基本分散介质和所需要的来自上面例举的成分中的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥法和冷冻干燥法，所述方法产生活性成分和来自其前面无菌过滤的溶液的任何额外的想要的成分。
口服组合物一般包含惰性稀释剂或可食用的媒介物。为了口服治疗性施用，可将活性化合物与赋形剂整合，并以片剂、锭剂或胶囊剂(例如，明胶胶囊)的形式使用。也可通过使用用作嗽口剂的流体媒介物制备口服组合物。可将药物相容性粘合剂和/或佐剂材料作为组合物的部分包含在组合物中。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可包含下列成分中的任何成分、或性质相似的化合物：粘合剂例如微晶纤维素、西黄蓍胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖，崩解剂例如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂例如胶体二氧化硅；甜味剂例如蔗糖或糖精；或矫味剂例如薄荷、水杨酸甲酯或橙矫味剂(orange flavouring)。
对于通过吸入的施用，以喷雾剂的形式从含有合适的推进剂例如气体如二氧化碳的加压容器或分配器中，或喷雾器中递送化合物。
全身性施用也可以是通过透粘膜或透皮方式的施用。对于透粘膜或透皮施用，在制剂中使用适合于要渗透的屏障的渗透剂。这样的渗透剂在本领域是公知的，其包括，例如，对于透粘膜施用，去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。可用鼻部喷雾剂或栓剂来实现透粘膜施用。可以以栓剂(例如，用常规的栓剂基体例如可可脂和其他甘油酯)的形式或用于直肠递送的滞留型灌肠剂的形式制备化合物。
对于透皮施用，可将活性化合物配制成本领域公知的油膏、软膏、凝胶或乳膏。
在一个实施方案中，活性化合物用将会防止所述化合物从身体中快速清除的媒介物进行制备，例如受控释放制剂，包括植入物和微囊化的递送系统。可使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚羟基乙酸、胶原、聚原酸酯(polyorthoesters)和聚乳酸。用于制备这些制剂的方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。也可通过商购从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.获得所述材料。也可将脂质体混悬剂(包括用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向经感染的细胞的脂质体)用作药学上可接受的媒介物。可根据本领域技术人员已知的方法，例如，美国专利号4,522,811中描述的方法制备这些材料。
以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物对于施用的容易性和剂量的统一是有利的。此处使用的“剂量单位形式”优选地是指物理上分开的单位，该单位适合作为用于待治疗的受试者的单位剂量；每个单位包含预先确定量的活性化合物和所需要的药物媒介物，该量经计算可产生想要的治疗效果。
可通过标准的药学方法在细胞培养物或实验动物中测定这些化合物的毒性和治疗效果，例如，测定LD50(使群体的50％致死的剂量)和ED50(对群体的50％有治疗效果的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比例是治疗指数，其可表示为比例LD50/ED50。表现出高治疗指数的化合物是优选的。尽管可使用表现出毒副作用的化合物，但应当小心地设计将这些化合物靶向受影响的组织位点的递送系统，以便使对未感染的细胞的潜在损害降至最低，从而减少副作用。
获自细胞培养测定法和动物研究的数据可用于配制一系列用于人的剂量。所述剂量优选地在包括具有很少毒性或无毒性的ED50的循环浓度的范围之内。依赖于所使用的剂型和所采用的施用途径，所述剂量可在该范围内变化。对于用于本发明的方法的任何化合物，最初可根据细胞培养测定法估计治疗有效剂量。可在动物模型中配制达到包含在细胞培养中测定的IC50(即，获得症状的半最大抑制的受试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围的剂量。这些信息可用于更准确地确定人中的有用剂量。可通过例如高效液相色谱来测量血浆中的水平。
确定个体的有效剂量的另一个实例是能够直接测定受试者血清中的“游离的”和“结合的”化合物的水平。这些测定法可使用通过分子印记技术建立的抗体模拟物和/或“生物传感器”。将能够调节穿孔素活性的化合物用作模板或“印记分子”，以使在它们用催化剂进行聚合之前在空间上对可聚合的单体进行组织。随后除去被印记的分子，留下聚合物基质，该基质包含所述化合物的重复的“负像”并且能够在生物测定条件下选择性地重新结合所述分子。该技术的详细综述可参见Ansell，R.J.等人(1996)Current Opinion inBiotechnology 7：89-94和Shea，K.J.(1994)Trends in PolymerScience 2：166-173。这些“被印剂的”亲和基质适合于配体结合测定法，其中固定的单克隆抗体组分被经适当地印记的基质替代。在该方法中这些基质的使用的实例可参见Vlatakis，G.等人(1993)Nature361：645-647。通过使用同位素标记，可容易地监控调节穿孔素的表达或活性的化合物的“游离”浓度，所述浓度用于IC50的计算。也可设计这些“被印记的”亲和基质，使其包含这样的荧光基团，在靶化合物的局部和选择性结合后，所述荧光基团的光子发射特性产生可测量的变化。使用合适的光纤设备可容易地实时检测这些变化，反过来使得可基于其个体的IC50快速地最优化受试者中的剂量。在Kriz，D.等人(1995)Analytical Chemistry 67：2142-2144中讨论了这样的“生物传感器”的初步实例。
如此处所定义的，重组穿孔素分子的治疗有效量(即，有效剂量)优选地在大约0.001至30mg/kg体重、更优选地大约0.01至25mg/kg体重、更加优选地大约0.1至20mg/kg体重、和更为优选地大约1至10mg/kg、2至9mg/kg、3至8mg/kg、4至7mg/kg、或5至6mg/kg体重的范围内变化。可在大约1至10周之间、优选地2至8周之间、更优选地3至7周之间和更加优选地大约4、5或6周之内每周一次地施用组合物。本领域技术人员会认识到，某些因素可影响有效地治疗受试者所需的剂量和时间安排，所述因素包括使用的特定化合物的活性，受试者的年龄、体重、一般健康状态、性别和饮食，施药的时间，施药的途径，排泄速率，任何药物组合，表达或活性被调控的程度，疾病或病症的严重度，以前的治疗和其他疾病的存在。
对于抗体，优选的剂量一般是10mg/kg至20mg/kg。然而，如果抗体要在脑中起作用，那么50mg/kg至100mg/kg的剂量通常是合适的。一般地，部分人抗体和完全人抗体在人体内具有比其他抗体更长的半寿期。因此，通常可能施用更低的剂量和施用更少的次数。可使用修饰例如脂化(lipidation)来稳定抗体和增强吸收和组织渗透(例如，进入脑)。Cruikshank等人((1997)J.Acquired ImmuneDeficiency Syndromes and Human Retrovirology 14：193)描述了用于抗体的脂化的方法。
可将此处描述的本发明的核酸分子插入载体和用作基因治疗载体。优选地，将所述核酸分子插入逆转录病毒载体，最优选地插入逆转录病毒载体pLXSN。通过例如静脉内注射、局部施用(参见，美国专利号5,328,470)或通过趋实体性注射(stereotactic injection)(参见，例如，Chen等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3054-3057)可将基因治疗载体递送给受试者。基因治疗载体的药物制剂可包含在可接受的稀释剂中的所述基因治疗载体，或可包含将基因递送媒介包埋在其中的缓释基质。可选择地，当可从重组细胞中完整地产生完全的基因递送载体，例如逆转录病毒载体时，药物制剂可包含一种或多种产生所述基因递送系统的细胞。
可将药物组合物和用于施用的说明书一起装入容器、包装或分配器中。
治疗方法
在本发明的另一个方面，提供了治疗受试者的预防性或治疗性方法，该受试者处于易患与不希望的穿孔素表达和/或活性相关的疾病的风险中或患有所述疾病。
在优选的实施方案中，所述预防性或治疗性方法包括给受试者施用治疗剂以治疗、治愈、缓解、减轻、改变、医治、改善、改良或影响疾病、疾病的症状或对疾病易感的体质的步骤，所述受试者具有与不希望的穿孔素表达和/或活性相关的疾病、所述疾病的症状或对所述疾病易感的体质，如上文所描述的。
在另一优选的实施方案中，所述预防性或治疗性方法包括这样的步骤，即给从受试者获得的分离的组织或细胞施用治疗剂，并将所述组织或细胞重新导入受试者以治疗、治愈、缓解、减轻、改变、医治、改善、改良或影响疾病、疾病的症状或对疾病易感的体质，所述受试者具有与不希望的穿孔素表达和/或活性相关的疾病、所述疾病的症状或对所述疾病易感的体质，如上文所描述的。
“治疗剂”包括，但不限于，此处描述的小分子、肽、抗体、核酶和反义寡核苷酸。对于治疗的预防性和治疗性方法，可基于获自药物基因组学领域的知识，特异地改造或修饰这些治疗法。“药物基因组学(pharmacogenomics)”，如此处所用的，优选地是指将基因组技术例如基因测序、统计遗传学和基因表达分析应用于临床开发中的和市售的药物。更优选地，所述术语是指患者的基因如何决定其对药物的响应(例如，患者的“药物响应表型”或“药物响应基因型”)的研究。因此，本发明的另一个方面提供了根据个体的药物响应基因型改造该个体的预防性或治疗性治疗法的方法，所述治疗法使用本发明的穿孔素分子或调节穿孔素表达和/或活性的试剂(例如通过此处描述的筛选测定法鉴定的那些试剂)。药物基因组学可使临床医师或内科医师将预防性或治疗性治疗法靶向可从所述治疗法获得最多利益的患者和避免对将遭受和药物相关的毒性副作用的患者进行该治疗。
如果穿孔素的表达和/或活性过剩，那么可获得几种治疗方法。在一个优选的方法中，给受试者施用的治疗剂是以对抑制穿孔素表达和/或活性有效的量存在的、上文中描述的、与药学上可接受的媒介物一起的抑制剂化合物(拮抗剂)，从而其可治疗、治愈、缓解、减轻、改变、医治、改善、改良或影响所述疾病、所述疾病的症状或对所述疾病易感的体质。例如，可施用能够和内源穿孔素竞争结合的穿孔素分子的可溶形式。这些竞争者的优选的实施方案包含穿孔素多肽的片段，所述片段能够结合天然的穿孔素，从而抑制其生物学活性，但不具有它们自身的固有的穿孔素活性。穿孔素拮抗剂也可包括抗体或其抗原结合片段(包括，例如，多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、抗独特型抗体、嵌合抗体或单链抗体，和FAb、F(ab′)2和FAb表达文库片段、scFV分子和其表位结合片段)、寡核苷酸或穿孔素片段或结合天然穿孔素多肽并抑制所述天然穿孔素的生物学活性的其他小分子。
所述拮抗剂也可采用这样的化合物的形式，即所述化合物影响靶细胞，从而可修饰靶细胞，使之不再对穿孔素作出反应或对穿孔素的反应减少。此处，治疗不是直接针对穿孔素自身，而是针对靶细胞。这使得能够更精确地靶向被穿孔素靶向的细胞，从而保护这些细胞免受进一步的攻击。
通过本领域已知的任何诊断或预后测定法或其组合，本领域技术人员可鉴定穿孔素表达和/或活性过度的病状和想要减少所述表达和/或活性的地方。例如，如在上文中描述的，可就穿孔素的表达和/或活性分析从受试者获得的生物学样品(例如，血液、血清、血浆、尿液、唾液和/或来源于其的细胞)。这样的病状包括，但不限于，青少年糖尿病(I型或胰岛素依赖型)、移植物抗宿主病、慢性或急性同种异体移植排斥和任何其他与细胞毒性T淋巴细胞或天然杀伤细胞介导的免疫病理学相关的病状。
因此，在优选的实施方案中，本发明的预防性和治疗性治疗方法可用于治疗和/或预防免疫介导的病状，例如，但不限于青少年糖尿病(I型或胰岛素依赖型)、移植物抗宿主病、慢性或急性同种异体移植排斥和与细胞毒性T淋巴细胞或天然杀伤细胞介导的免疫病理学相关的病状。
对于治疗其中想要增加穿孔素表达和/或活性的病状，也可获得几种方法。在一个优选的方法中，给受试者施用的治疗剂是和药学上可接受的媒介物组合的重组穿孔素多肽或通过前述的筛选测定法鉴定的化合物，其激活内源穿孔素的表达和/或活性，即上述的激动剂，从而可治疗、治愈、缓解、减轻、改变、医治、改善、改良或影响所述疾病、所述疾病的症状或对所述疾病易感的体质。这样的激动剂的优选的实施方案包括能够结合天然的穿孔素以增加其生物学活性的穿孔素多肽的片段、和其片段和变体。穿孔素的激动剂还可包括抗体或其抗原结合片段(包括，例如，多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、抗独特型抗体、嵌合抗体或单链抗体，和FAb、F(ab′)2和FAb表达文库片段、scFV分子和其表位结合片段)，或者结合天然的穿孔素多肽并增强所述天然穿孔素的生物学活性的其他小分子。
相反地，至于拮抗剂，本发明也提供了这样的化合物，所述化合物是可修饰靶细胞以使所述细胞变得对穿孔素更具有反应性的激动剂。该化合物有助于修饰可被靶向以被穿孔素清除的细胞。可将用于本方法的化合物附着于鉴定部分(例如抗体)，以使所述部分鉴定需要清除的细胞。
优选地将激动剂用于病状(其中想要增加穿孔素的活性)的治疗性和预防性目的，所述病状包括，但不限于，与病毒感染相关的疾病(例如人免疫缺陷病毒(HIV)和丙型肝炎)、各种癌症(例如淋巴瘤)和结核病。优选地，将激动剂用于治疗其中希望增强细胞裂解性T淋巴细胞活性的病状。也可将激动剂用于与穿孔素缺乏(例如HLH和更优选地FHL)的治疗性和预防性目的。
因此，在优选的实施方案中，本发明的预防性和治疗性治疗方法可用于治疗和/或预防病毒感染(例如人免疫缺陷病毒(HIV)和丙型肝炎)、各种癌症(例如淋巴瘤)、结核病、其中通常希望增强细胞裂解性T淋巴细胞活性的病状和与穿孔素缺乏相关的病状例如HLH和更优选地FHL。
可选择地，可将基因疗法用于影响需要该治疗的受试者的细胞对穿孔素的内源表达，所述受试者包括，但不限于，大鼠、小鼠、狗、猫、牛、马、兔子、猴子和最优选地人。例如，包含驱动穿孔素或其生物学活性片段表达的逆转录病毒载体的生产者细胞(如在上文中所描述的)可被施用给受试者以在体内改造细胞，使所述细胞在体内表达重组穿孔素多肽。对于基因疗法的综述，参见例如，第20章，GeneTherapy and other Molecular Genetic-based TherapeuticApproaches，(和此处引用的参考文献)，Human Molecular Genetics，Strachan T.和Read A.P.，BIOS Scientific Publishers Ltd(1996)。
此外，根据本发明，还可以使用抑制靶基因表达的反义分子和核酶分子以降低靶基因表达的水平。此外，可将三股螺旋分子用于降低靶基因表达的水平。
如此处所用的，术语“反义”优选地是指与编码上文中描述的穿孔素或其片段或变体的核酸互补，例如与双链cDNA分子的编码链互补或与编码穿孔素或其片段或变体的mRNA序列互补的核苷酸序列。反义核酸优选地与整个穿孔素编码链互补，或只与其部分互补。在另一实施方案中，反义核酸分子与编码穿孔素或其片段或变体的核苷酸序列的编码链的“非编码区”(例如，5′和3′非翻译区)反义。
可这样设计反义核酸以使其与穿孔素的整个编码区互补，但更优选地其是这样的寡核苷酸，即该寡核苷酸只是与穿孔素mRNA的编码或非编码区的部分反义。例如，反义寡核苷酸可与围绕穿孔素mRNA的翻译起始位点的区域互补。反义寡核苷酸在长度上可以是，例如，大约7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80或更多个核苷酸。
可通过使用本领域已知的方法，使用化学合成和酶促连接反应来构建本发明的反义核酸。例如，可使用天然发生的核苷酸或经各种修饰的核苷酸通过化学的方法合成反义核酸(例如，反义寡核苷酸)，所述经各种修饰的核苷酸被设计用来增加所述分子的生物学稳定性或增加反义和有义核酸之间形成的双螺旋的物理稳定性，例如，可使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。也可使用这样的表达载体通过生物学的方法来产生反义核酸，在所述表达载体中，以反义的方向亚克隆了核酸(即，从插入的核酸转录的RNA对于目的靶核酸来说具有反义方向)。
在本发明的另一实施方案中，根据本发明，还可使用抑制靶基因表达的穿孔素短干扰性核酸分子(siRNA)以降低靶基因表达的水平。
术语“穿孔素短干扰性核酸(perforin short interferingnucleic acid)”、“穿孔素siNA”、“穿孔素短干扰性RNA”、“穿孔素siRNA”、“穿孔素短干扰性核酸分子”、“穿孔素短干扰性寡核苷酸分子”、或“化学修饰的穿孔素短干扰性核酸分子”，如此处所用的，优选地是指能够抑制或下调穿孔素基因表达的任何核酸分子，例如通过以序列特异性的方式介导RNA干扰(“RNAi”)或基因沉默。化学修饰也可用于本发明的任何siNA序列。例如，siNA可以是包含自我互补的有义和反义区域的双链多核苷酸分子，其中所述反义区域包含和编码穿孔素或其部分的核苷酸序列互补的核苷酸序列，而有义区域具有对应于编码穿孔素或其部分的核苷酸序列的核苷酸序列。可从两个分开的寡核苷酸来装配siNA，其中一条链是有义链，而另一条链是反义链，其中所述反义和有义链是自我互补的(即，每条链包含与另一条链中的核苷酸序列互补的核苷酸序列；例如在反义链和有义链形成双螺旋或双链结构的地方，例如其中双链区为大约19个碱基对)；反义链包含与编码穿孔素或其部分的核苷酸序列互补的核苷酸序列，而有义链包含对应于编码穿孔素或其部分的核苷酸序列的核苷酸序列。可选择地，从单个寡核苷酸装配siNA，其中siNA的自我互补的有义和反义区域通过基于核酸或基于非核酸的连接体连接。siNA可以是具有发夹二级结构的多核苷酸，该发夹结构具有自我互补的有义和反义区域，其中反义区域包含与在分开的靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，而有义区域具有对应于编码穿孔素或其部分的核苷酸序列的核苷酸序列。siNA可以是具有两个或多个环结构的环状单链多核苷酸，茎部包含自我互补的有义和反义区域，其中反义区域包含与编码穿孔素或其部分的核苷酸序列互补的核苷酸序列，而有义区域具有对应于编码穿孔素或其部分的核苷酸序列的核苷酸序列，其中可在体内或体外加工环状多核苷酸以产生能够介导RNAi的活性siNA分子。siNA也可包含这样的单链多核苷酸，所述单链多核苷酸具有与编码穿孔素或其部分的核苷酸序列互补的核苷酸序列(例如，当这些siNA分子不要求对应于编码穿孔素或其部分的核苷酸序列的核苷酸序列存在于siNA分子中时)，其中单链多核苷酸可进一步包含末端磷酸基团，例如5’-磷酸或5’，3’-二磷酸。在优选的实施方案中，本发明的siNA分子包含分开的有义和反义序列或区域，其中所述有义和反义区域通过本领域已知的核苷酸或非核苷酸连接体分子共价连接，或可选择地通过离子相互作用、氢键、范德华相互作用、疏水相互作用和/或堆垛(stacking)相互作用而非共价地连接。在另一实施方案中，本发明的siNA分子包含与编码穿孔素或其部分的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明的siNA分子以导致抑制穿孔素基因表达的方式与编码穿孔素的核苷酸序列相互作用。如此处所用的，siNA分子不必被限定于只含有RNA的分子，相反地还可包括含有经化学修饰的核苷酸的分子或与非核苷酸组合的分子。在某些优选的实施方案中，本发明的siNA分子缺少含有2′-羟基(2′-OH)的核苷酸。然而，这样的siNA分子可具有含有一个或多个具有2′-OH基团的核苷酸的附着的连接体或其他附着的或结合的基团、部分或链，所述siNA分子不要求核糖核苷酸存在于siNA分子中以支持RNAi。任选地，本发明的siNA分子在大约5、10、20、30、40或50％的核苷酸位置上可包含核糖核苷酸。经修饰的本发明的siNA分子也可称为短干扰性经修饰的寡核苷酸“siMON”。如此处所用的，术语siNA优选地表示等同于用于描述能够介导序列特异性RNAi的核酸分子的其他术语，例如短干扰性RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微-RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰性寡核苷酸、短干扰性核酸、短干扰性经修饰的寡核苷酸、经化学修饰的siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)、翻译沉默等。此外，如此处所用的，术语RNAi优选地表示等同于用于描述序列特异性RNA干扰的其他术语，例如转录后基因沉默或实验胚胎学(epigenetics)。例如，本发明的siNA分子可用于在实验胚胎学上于转录后水平或转录前水平来沉默基因。在非限制性的实例中，通过本发明的siNA分子的穿孔素基因表达的实验胚胎学调控可以是由siNA介导的染色质结构的修饰从而改变穿孔素基因表达而造成的。
一般给受试者施用(例如，通过在组织位点直接注射)本发明的反义和短干扰性RNA分子，或在原位产生所述分子，以使其和编码穿孔素的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合，从而抑制所述穿孔素的表达，例如通过抑制转录和/或翻译。可选择地，可修饰所述分子以使其靶向选择的细胞，然后进行全身性施用。对于全身性施用，可这样修饰反义分子或siRNA分子，即使其特异性地结合表达在选择的细胞表面上的受体或抗原，例如通过将所述分子连接至和细胞表面受体或抗原结合的肽或抗体。也可使用载体或通过病毒机制(例如逆转录病毒或腺病毒感染递送)将所述分子递送至细胞。为获得足够的所述分子的细胞内浓度，使用其中将所述分子置于合适的启动子控制之下的载体构建体。
在另一个实施方案中，本发明的反义核酸分子是α-异头核酸分子。α-异头核酸分子和互补RNA形成特殊的双链杂交物，在所述双链中，和一般的α-单位相反，链相互之间平行排列(Gaultier等人，(1987)Nucleic Acids.Res.15：6625-6641)。反义核酸分子也可包含2′-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等人，(1987)Nucleic Acids Res.15：6131-6148)或嵌合型RNA-DNA类似物(Inoue等人，(1987)FEBSLett.215：327-330)。
在另一个实施方案中，本发明的反义核酸是核酶。对于编码穿孔素的核酸分子具有特异性的核酶可包含一个或多个与此处公开的穿孔素cDNA的核苷酸序列互补的序列，和具有已知的负责mRNA切割的催化序列的序列(参见美国专利号5,093,246，或Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334：585-591)。例如，可构建四膜虫L-19 IVS RNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸序列与在编码穿孔素的mRNA中待切割的核苷酸序列互补(参见，例如，Cech等人，美国专利号4,987,071；和Cech等人，美国专利号5,116,742)。可选择地，穿孔素mRNA可用于从RNA分子库中选择具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA(参见，例如，Bartel，D.和Szostak，J.W.(1993)Science 261：1411-1418)。
在另一实施方案中，可通过将与穿孔素的调控区(例如，穿孔素启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列靶向该调控区以形成三股螺旋结构来抑制穿孔素的表达，所述三股螺旋结构阻止了穿孔素基因在靶细胞中的转录(一般参见，Helene，C.(1991)Anticancer Drug Des.6(6)：569-84；Helene，C.等人(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660：27-36；和Maher，L.J.(1992)Bioassays 14(12)：807-15)。可通过产生所谓的“曲折(switchback)”核酸分子来增加可被靶向形成三股螺旋的潜在序列。以交替的5′-3′、3′-5′方式合成曲折分子，这样可使其和双螺旋的第一条链碱基配对，接着和另一条链碱基配对，从而消除了对在双螺旋的一条链上要存在相当大的嘌呤或嘧啶段落的需要。
也可在碱基部分、糖部分或磷酸主链上对反义分子进行修饰，从而改善例如所述分子的稳定性、杂交性或溶解度。例如，可对核酸分子的脱氧核糖磷酸主链进行修饰以产生肽核酸(参见Hyrup B.等人(1996)Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1)：5-23)。此处所用的术语“肽核酸”或“PNA”是指核酸模拟物，例如，DNA模拟物，其中脱氧核糖磷酸主链被假肽主链替代，只保留4个天然的核碱基。PNA的中性主链可使其在低离子强度下与DNA和RNA进行特异性杂交。可使用在Hyrup B.等人(1996)同上；Perry-O′Keefe等人Proc.Natl.Acad.Sci.93：14670-675中描述的标准固相肽合成方案进行PNA寡聚物的合成。
穿孔素核酸分子的PNAs可用于治疗性和诊断性应用。例如，PNAs可用作反义或反基因试剂，以用于序列特异性地调控基因表达，例如通过诱导转录或翻译阻碍或者抑制复制。穿孔素核酸分子的PNAs也可用于分析基因中的单个碱基对突变(例如，通过PNA指导的PCR锁止技术(PCR clamping))；当和其他酶(例如，S1核酸酶(Hyrup B.(1996)同上))一起使用时用作人造限制性酶；或用作DNA测序或杂交的探针或引物(Hyrup B.等人(1996)同上；Perry-O′Keefe同上)。
在其他实施方案中，反义分子可包含其他附着的基团例如肽(例如，用于在体内靶向宿主细胞受体)，或帮助转运穿过细胞膜(参见，例如，Letsinger等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6553-6556；Lemaitre等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：648-652；PCT公开号WO88/09810)或血脑屏障(参见，例如，PCT公开号WO89/10134)的试剂。此外，可用杂交触发的切割试剂(参见，例如，Krol等人(1988)BioTechniques 6：958-976)或嵌入剂(参见，例如，Zon(1988)Pharm.Res.5：539-549)来修饰反义分子。所以，可将寡核苷酸缀合至另一个分子(例如，肽、杂交触发的交联剂、转运剂或杂交触发的切割试剂)。
可能的是，使用反义分子、siRNA、核酶和/或三股螺旋分子以减少或抑制突变基因表达也可以减少或抑制由正常靶基因等位基因产生的mRNA的转录(三股螺旋)和/或翻译(反义分子、核酶)，这样存在的正常靶基因产物的浓度可以低于正常表型所需的浓度。在这样的情况下，可通过基因疗法的方法将编码和表达表现正常靶基因活性的靶基因多肽的核酸导入细胞。
另一种可将核酸分子用于治疗或预防特征在于不希望的穿孔素表达和/或活性的疾病的方法是通过使用对于穿孔素具有特异性的适体(aptamer)分子。适体是具有使其能够特异性地结合蛋白质配体的三级结构的核酸分子(参见，例如，Osborne等人(1997)Curr.Opin.Chem.Biol.1(1)：5-9；和Patel，D.J.(June 1997)Curr.Opin.Chem.Biol.1(1)：32-46)。因为在许多情况下核酸分子可能比治疗性蛋白质分子更方便地被导入靶细胞中，因此适体提供了这样的方法，通过该方法，可在不导入可能具有多能性效果的药物或其他分子的情况下特异性地降低穿孔素的活性。
和与不希望的穿孔素表达和/或活性相关的疾病或病状的治疗一起，也可考虑药物基因组学(即，个体的基因型和该个体对外源化合物或药物的反应之间的关系的研究)。在治疗剂的机制上的差异可通过改变药物活性药物的剂量和血液浓度之间的关系而导致严重的毒性或治疗失败。因此，内科医师或临床医师可考虑应用在相关药物基因组学研究中获得的知识来确定是否施用治疗剂以调节穿孔素的表达和/或活性，以及改变这样的治疗的剂量和/或治疗方案。
药物基因组学涉及在对药物的反应方面临床上显著的遗传变异，该变异是由于受影响的人中的改变了的药物处置和异常作用造成的。参见，例如，Eichelbaum，M.等人(1996)Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.23(10-11)：983-985和Linder，M.W.等人(1997)Clin.Chem.43(2)：254-266。一般地，可区分两种类型的药物基因组学状况。作为改变药物对身体的作用方式(改变的药物作用)的单因子进行遗传的遗传状况，或作为改变身体对药物的作用方式(改变的药物代谢)的单因子进行遗传的遗传状况。这些药物基因组学状况可作为罕见的遗传缺陷或作为天然发生的多态性发生。
鉴定预知药物反应的基因的一个药物基因组学方法，称作“全基因组关联分析法(genome-wide association)”，主要基于由已知的基因相关标记物构成的人基因组的高分辨率图谱(例如，由60,000-100,000个人基因组上的多态性或可变位点构成的“双等位(bi-allelic)”基因标记物图谱，其中每个位点具有两个变体)。可将这样的高分辨率遗传图谱和统计学上显著数目的患者中的每一位患者的基因组图谱进行比较，以鉴定与特定的观察到的药物反应或副作用相关的标记物，所述患者参加了II/III期药物试验。可选择地，可从人基因组中大约1千万个已知的单核苷酸多态性(SNPs)的组合产生这样的高分辨率图谱。如此处所用的，“SNP”是发生在一段DNA中的单个核苷酸碱基中的一般改变。例如，SNP可在每1000个DNA的碱基中发生一次。SNP可能涉及疾病的进展，然而，绝大部分SNP可能与疾病无关。如果遗传图谱基于这样的SNPs的发生，则依赖于其个体基因组中的SNPs的特定模式，可将个体分类成不同的遗传类别。以这样的方式，考虑到在这些遗传上相似的个体中共同存在的性状，可修改治疗方案使之适合遗传相似的个体的群体。
可选择地，可使用称为“候选基因方法”的方法鉴定预知药物反应的基因。根据该方法，如果已知编码药物的靶(例如，穿孔素)的基因，那么在群体中可相当容易地鉴定该基因的所有共同变体，并且可确定相对于另一个基因版本具有一个基因版本是否和特定的药物反应相关。
可选择地，可使用称为“基因表达特性作图(gene expressionprofilling)”的方法鉴定预知药物反应的基因。例如，被施予药物(例如，根据本发明的穿孔素分子或穿孔素表达的调节剂)的动物的基因表达可提供表明与毒性相关的基因途径是否已经打开的指示。
从超过一个的上述药物基因组学方法产生的信息可用于确定个体的预防性或治疗性治疗的合适的剂量和治疗方案。该知识，当用于按剂量给药或药物选择时，可避免不利的反应或治疗失败，从而在用前述治疗剂治疗受试者时，增强了治疗或预防功效。
可在临床试验中监控试剂(例如，药物)对穿孔素的表达和/或活性的影响。例如，可在表现出减少的穿孔素表达和/或活性的受试者的临床试验中，监控通过此处描述的筛选测定法鉴定的化合物对于增加穿孔素表达和/或活性的有效性。可选择地，在表现出增加的穿孔素表达和/或活性的受试者的临床试验中，监控通过筛选测定法确定的试剂对于降低穿孔素表达和/或活性的有效性。在这些临床试验中，穿孔素的表达和/或活性，和优选地涉及例如与不希望的穿孔素表达和/或活性相关的病状的其他基因(即，代用标记(surrogate markers))可用作特定细胞的表型的“读出器(read out)”或标记。
本领域技术人员也会充分认识到上述的治疗方法可以以许多相互之间的组合方式或者与目前在本领域中使用的其他治疗方案组合的方式使用。
现在将更全面地描述用于本发明的方法的实例。然而，应当理解，下列描述仅仅是举例说明性的，并且无论如何不应当被当作对上述的发明概要的限制。
                       实施例
实施例1：野生型小鼠穿孔素在RBL细胞中的表达
A.穿孔素的表达
下列描述包括用于野生型小鼠穿孔素的重组表达、分析和评估的材料和方法。
i)细胞培养
将细胞系RBL-2H3(美国模式培养物保藏所-ATCC)、293T(人胚胎肾)和EL-4(小鼠胸腺瘤)培养在Dulbecco′s改良的Eagle′s(DME)培养基中，该培养基补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺(Commonwealth Serum Laboratories，Parkville，Melbourne，Australia(CSL))和各100μg/ml的链霉素和青霉素(Gibco，GrandIsland，New York)。将细胞系在37℃下、10％的CO2中培养在加湿的培养箱中。为了收获RBL-2H3和293T细胞，用PBS洗涤细胞一次，加入胰蛋白酶-EDTA溶液(CSL，Australia)以将细胞从组织培养瓶上分离下来。在使用前用PBS洗涤细胞一次。
(ii)编码野生型小鼠穿孔素的质粒载体的产生
在图2中描述了使用逆转录病毒转导进行在RBL细胞中的野生型小鼠穿孔素(Pfp)的表达的总体策略。该策略以概述的形式提供了下面概括的实验方案。
iii)Pfp cDNA亚克隆入MSCV
为了将Pfp cDNA亚克隆入鼠干细胞逆转录病毒载体，MSCV(由Prof.Steve Jane，Royal Melbourne Hospital，Melbourne友好地提供)中，使用在5’整合了EcoRI和XhoI位点的寡核苷酸(Geneworks，Australia)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出1.8kb的DNA片段。
有义：5′CTC GAATTCGCATCATGGCCACGTGC 3′；
反义：5′CTAT CTCGAGTTACCACACAGCCCCACTG 3′。
用于该反应的模板DNA是含有穿孔素cDNA的pEF-PGKpuroA构建体，所述穿孔素cDNA是先前使用RT-PCR从来自小鼠淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞系，IMS-II的RNA扩增出的。在50μl体积中进行PCR，在Pfu聚合酶缓冲液中包含：5ng模板DNA、2.5个单位的Pfu聚合酶(Promega，NSW，Australia)、50uM dNTP混合物和12.5pmol的每种引物。在PTC-200 Peltier Thermal cycler(MJ Research Inc.Massachusettes)中进行反应，所述反应由下列循环构成：1个循环，在94℃下进行2分钟(变性)；然后25个循环，在94℃下进行30秒，60℃下进行30秒(退火)，72℃下进行4.5分钟(合成)，和最后1个循环，在72℃下进行7分钟。通过在1％(w/v)的琼脂糖/TBE(89mM Tris-硼酸盐pH8.0，89mM硼酸，2mM EDTA)凝胶上进行电泳来分离PCR产物，并通过加入1μl溴化乙锭(10mg/ml)来显现产物。从胶上将DNA条带切割下来，并根据厂商说明书使用Jetsorb DNA Gelextraction kit(Genomed，Inc.USA)进行纯化。
通过用EcoRI和XhoI(Promega，NSW，Australia)进行消化来制备用于亚克隆的纯化的PCR产物。反应体系含有EcoRI和XhoI(各1U)、100ng DNA、适合于各酶的限制性酶缓冲液，将其在37℃下温育过夜。在14℃下，使用T4DNA连接酶(Promega，Australia)(1U)将经消化的cDNA(60μg)与先前用EcoRI和XhoI消化的MSCV DNA(50ng)在连接酶缓冲液中连接过夜。
(iv)感受态细菌的转化
将大肠杆菌菌株Top 10F细菌(100μl)和4μl MSCV-Pfp连接混合物(上述)混合并在冰上温育30分钟。将细菌加热至42℃并维持45秒，然后置于室温下5分钟。加入Luria-Bertani液体培养基(LB-液体培养基)(900μI)，并将混合物在37℃下摇动培养1小时。然后将转化反应体系涂板在补充有氨苄青霉素和四环素(各10μg/mL)的LB培养基板上，并在37℃培养过夜。随机挑拣转化子，并将其在2ml补充有10μg/mL氨苄青霉素和四环素的LB-液体培养基中于37℃下培养过夜以进行进一步分析。
(v)质粒DNA的小规模制备
按照厂商说明书使用miniprep plasmid purification kit(MoBio Lab Inc.USA)从细菌细胞中分离来自所述过夜培养物的质粒DNA。通过用EcoRI和XhoI进行限制性酶消化和进行琼脂糖凝胶电泳来确认质粒的同一性。对含有cDNA插入的Miniprep克隆进行全长测序以证实没有引入PCR相关的突变。使用自动Big Dye Terminator反应方案(按照厂商说明书)进行测序，并在University of New SouthWales(Australia)的自动DNA分析装置上进行分析。
(vi)质粒DNA的大规模制备
经测序的Pfp DNA的大规模制备通过“碱裂解”法获得，并在CsCl-溴化乙锭梯度上进行纯化。通过在4000rpm下在RC-C Sorval离心机(Sorval Instruments，Du Pont)中离心10分钟从500ml于LB-液体培养基中的过夜培养物之中沉淀出细菌，所述LB-液体培养基补充有氨苄青霉素和四环素(50μg/ml)。将沉淀重悬浮在10ml溶液1(50mM葡萄糖，25mM TrisCl，pH8，10mM EDTA，pH8)中，在冰上于20ml溶液2(0.2M NaOH，1％SDS)中裂解10分钟，并在冰上于15ml溶液3(3M醋酸钾，pH4.8)中中和pH值10分钟。通过在4000rpm下离心10分钟除去细胞碎片，并将含有质粒DNA的上清液通过粗棉布(cheesecloth)进行过滤。在冰上通过加入35ml异丙醇使DNA沉淀15分钟，并在4℃下以12,000rpm沉淀15分钟。用70％的乙醇洗涤沉淀，然后再用无水乙醇洗涤沉淀，在室温下干燥并重悬浮在10ml ddH2O中。通过向质粒DNA中加入10.7g CsCl和500μl溴化乙锭溶液(10mg/ml)来建立CsCl梯度。在3200rpm下对沉淀碎片离心5分钟后，将样品加载至Beckman Polyllomor Bell-top Quick-seal离心管(Beckman Instruments Inc.，CA，USA)中，并在Beckman TL-100超速离心机(Beckman Instruments Inc.)中于20℃下以55,000rpm离心过夜。用26号针回收DNA条带，通过用等体积的异戊醇洗涤样品3次来提取溴化乙锭，在4℃下用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA过夜。在4℃下以13,000rpm沉淀样品15分钟，在70％的乙醇中洗涤DNA，干燥，并重悬浮在TE缓冲液pH7.4中。通过在1％的琼脂糖凝胶上显现和在260nm处测量吸光度来对DNA进行定量。
(vii)使用逆转录病毒表达系统的Pfp的表达
使用逆转录病毒表达系统的穿孔素的表达利用了MSCV载体(图3)的几个特性。该双顺反子质粒包含数个使得能够选择经转导的细胞的特性：1)兼嗜性MSCV 5′长末端重复(LTR)；2)绿色荧光蛋白(GFP)的cDNA；3)脑心肌炎内部核糖体进入位点(IRES)；和4)细菌复制起始位点和氨苄青霉素抗性基因。IRES允许两个基因在同一条mRNA链上被转录，因此可将标记置于要转录的主基因的下游，所述两个基因将被分开翻译。使细胞在紫外光下发荧光的GFP的表达，用作穿孔素的代用标记，并且使得可以选择表达高水平转基因的细胞。
(viii)用于Pfp表达的重组病毒的产生
将编码穿孔素基因的MSCV DNA(MSCV-Pfp)瞬时转染入293T包装细胞系中，该包装细胞系将病毒颗粒分泌至以后用于感染RBL细胞的培养物上清液中。兼嗜性辅助质粒的共转染提供了具有病毒包膜蛋白的逆转录病毒DNA，所述包膜蛋白被大量哺乳动物细胞上的兼嗜性受体识别，从而促进外源基因的递送。首先，将293T细胞(5×105)涂板在100mm的皮氏培养皿中过夜，在转染前3小时，用新配制的完全DMEM替换所述培养基。按照厂商说明书通过磷酸钙沉淀法(Gibco)用MSCV载体DNA或MSCV-Pfp DNA转染细胞。在转染的当天，通过将25μl 2M CaCl2、10μg质粒DNA(10mM Tris-Cl，pH7.5中)、10μg编码gag和pol基因的辅助质粒和水混合，产生200μl的终体积，来制备DNA-CaCl2溶液。还制备由100μl 500mM HEPES-NaOH(pH7.1)、125μl 2M NaCl、10μl 150mM NaHPO4-NaH2PO4(pH7.0)和水组成的终体积为1ml的沉淀缓冲液。向200μl沉淀缓冲液中逐滴加入200μl DNA-CaCl2溶液并不断地搅拌该混合物。将所述混合物在室温下保持30分钟，将所得的细沉淀加入至293T包装细胞的培养皿中。将细胞暴露于所述DNA沉淀24小时，然后用新配制的完全DMEM替换培养基。48小时后，收获细胞并就GFP的表达对细胞进行分析。通过使用FACScan(Becton Dickinson，San Hose，CA)的流式细胞术测量的GFP的表达确定了转染效率，所述转染效率是上清液中的病毒滴度的指征。收集来自效率最高的转染(＞30％表达GFP的细胞)的培养物上清液，并以1.5ml的等分试样贮存以用于RBL细胞的转导(参见下面)。
(ix)使用富含病毒的上清液的RBL细胞的转导
为进行使用逆转录病毒的转导，将RBL细胞以(1ml完全DME-M中2×105)置于6孔板中。在4μg/ml polybrene存在的情况下，将细胞和逆转录病毒上清液以12小时的间隔混合6次，让其恢复72小时，然后在FACStar细胞分选器上通过流式细胞术分析GFP的表达。选择具有最大GFP表达(高达5％的细胞)的群体中的细胞用于进一步的扩增，并就穿孔素表达和功能分析进行筛选。
B.Pfp表达的分析
(i)细胞裂解物的制备
通过Western印迹法来分析用MSCV-Pfp转导的RBL细胞的裂解物以就蛋白质表达进行筛选。收获细胞并将其在NP-40裂解缓冲液(25mM Hepes缓冲液，pH7，0.25mM NaCl，2.5mM EDTA，0.1％Nonidet-P40(NP-40)，0.5mM DTT，和蛋白酶抑制剂的混合物(Roche，Germany))中重悬浮(2×107/ml)。将细胞在冰上温育20分钟，然后在13000rpm下沉淀以除去细胞碎片。在等体积的含有还原剂的2X样品缓冲液(1.52g Tris碱，20ml甘油，2g SDS，2ml 2-巯基乙醇，1mg溴酚蓝，pH6.8，用水加至100ml)中稀释收集的上清液，在95℃下煮沸5分钟，并加载到10％(w/v)的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶上。
(ii)蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫检测
按照Mini-Protean II Electrophoresis Cell(Bio-Rad，USA)说明书装配聚丙烯酰胺凝胶。通过4.5％积层胶(0.8ml 30％丙烯酰胺/双，2.95ml ddH2O、1.25积层缓冲液，50μl 10％APS，10μl TEMED)和10％分离胶(2.75ml 30％丙烯酰胺/双，3.25ml ddH2O、2ml分离缓冲液、50μl 10％APS，10μl TEMED)解析蛋白质样品。在160V下在走样缓冲液(0.1％SDS，25mM Tris-HCl，192mM甘氨酸)中进行电泳。使用Trans-Blot SD Semi Dry Transfer Cell(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)将通过SDS-PAGE分离的蛋白质转移至Western转移缓冲液(48mM Tris，39mM甘氨酸，20％甲醇，pH9.2)中的硝酸纤维素‘Immobilon’膜(Millipore Bedford，MA)上。在14V、0.5A下进行转移30分钟。在5％脱脂奶粉/PBS中封闭蛋白质与膜的非特异性结合1小时，然后用初级大鼠抗小鼠穿孔素抗体，PI-8(母液浓度1.7mg/ml；由Dr H.Yagita，Juntendo University School of Medicine，Tokyo，Japan友好地提供)进行探测，所述抗体在5％的脱脂牛奶缓冲液中作1/1000的稀释。在0.05％/Tween PBS中洗涤膜(3×8分钟)，然后用缀合有辣根过氧化物酶(HRP)的第二山羊抗大鼠抗体(1/10000稀释度)在室温下温育1小时来检测结合的大鼠Ig。如前面一样洗涤膜，通过使用Enhanced Chemiluminescence(ECL)Detection System(Amersham International，UK)并暴露于X-OMAT AR Imaging胶片(Eastman Kodack company，Rochester，NY，USA)来显现结合的抗体。也可用抗微管蛋白抗体(Sigma)(1/3000)来探测在该Western印迹法中使用的膜以确保相等的蛋白质上样。
(iii)使用抗TNP IgE抗体标记RBL细胞：标记条件的最优化
如在下文中描述的，在4小时51Cr释放测定法(参见2.5节)中评估表达MSCV-Pfp的RBL细胞杀死小鼠胸腺瘤EL-4靶细胞的能力。所述测定法(以前由Shiver等人，1991进行过描述)包括使用抗三硝基苯基(TNP)IgE抗体，该抗体将RBL细胞上的Fcε受体与TNP-标记的靶细胞交联，从而刺激颗粒分泌(图4)。为确定对于抗TNP IgE结合的最佳浓度，在各种条件下标记RBL细胞，并通过流式细胞术检测表面结合。用不同稀释度的含有抗TNP IgE抗体(母液浓度2μg/ml)的杂交瘤培养物上清液(由Prof M.Hogarth，Austin ResearchInstitute，Melbourne，Australia友好地提供)标记1×106个细胞。在PBS中建立1/2、1/10、1/50或1/100的抗体稀释度，并在37℃下温育1小时。洗涤细胞3次，然后用1.25μg/ml的生物素缀合的抗小鼠IgE抗体(PharMingen)温育细胞1小时。在加入0.5μg/ml的链霉亲和素-PerCP以进行通过流式细胞术的分析之前洗涤细胞3次。为确定抗体结合的最佳条件，在1/2稀释度的抗TNP IgE杂交瘤上清液中温育细胞，在37℃下温育15或60分钟，在4℃下温育15或60分钟。为进行表面标记的检测，如上所述温育细胞并通过流式细胞术进行分析。
C.Pfp细胞裂解功能的评估
(i)使用51Cr和TNP对EL-4靶细胞进行双重标记
EL-4细胞用51Cr加载和用TNP半抗原进行标记以将该细胞用作下面概述的细胞的细胞毒性测定法中的靶细胞。用简单的DME培养基洗涤细胞2次，在100μl相同的培养基中重悬浮细胞。在37℃下用100μCi 51Cr标记细胞1小时，并用简单的培养基洗涤3次以除去51Cr。然后用TNP标记所述细胞，通过在37℃下将细胞以5×106/ml重悬浮在1mM TNBS(Fluka)溶液(pH7.4)中进行该标记过程。在PBS中洗涤细胞3次，然后以1×106/ml悬浮在1％牛血清白蛋白(BSA)/DME培养基中以用于细胞毒性测定法。
(ii)使用IgE抗体标记RBL细胞
通过将RBL细胞以5×106/ml重悬浮在含有抗体的PBS中，用抗TNP IgE抗体标记该细胞。在37℃下温育细胞1小时，然后在PBS中洗涤细胞3次，并以1×107/ml重悬浮在含有1％BSA(CSL，Australia)的DME-M中以用于细胞毒性测定法。
(iii)51铬释放细胞毒性测定法
通过将IgE-标记的效应细胞和51Cr/TNP标记的靶细胞以一系列效应细胞：靶细胞的比率在200μl含有1％BSA的培养基中混合来在51Cr释放测定法中评估细胞死亡。在96孔V形底微量滴定板中进行实验。通过仅使用培养基温育靶细胞来确定51Cr的自发释放，和通过加入HCl至1M的终浓度来确定最大释放。作为负对照，向反应体系中加入EGTA(最终为2mM)。4小时后，将板在1500rpm下离心，收获100ul上清液，并通过Wizard 1470 Gamma计数器测量释放的放射性。
细胞毒性表示为减去自发释放后的特异性51Cr释放百分数。如下计算特异性裂解百分数：100×[(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)]。
A.使用逆转录病毒表达系统在RBL细胞中表达穿孔素
使用基于MSCV载体的逆转录病毒介导的方法在RBL细胞中获得了穿孔素的表达。使用MSCV-Pfp构建体进行的293T包装细胞的转染产生了富含用于转导RBL细胞的逆转录病毒的培养基。转染后3天，就GFP的表达对293T细胞进行流式细胞术分析，将其评估为转染效率的估计。以面已在大量的实验中显示，在超过30％的293T细胞中的GFP表达是培养物上清液中存在高达1.5×107pfu/ml感染性病毒的病毒滴度的可靠指征(Dr.S Jane，Royal Melbourne Hospital，私人通讯)。因此一般不进行正式的病毒噬斑测定法。如图5中所示，转染后3天，超过50％的用MSCV-Pfp质粒转染的293T细胞具有强荧光，表明GFP表达。这和在使用空MSCV载体DNA的情况下看到的GFP的表达水平相当。如所预期的，单独用辅助质粒(蓝色实线)转染的293T细胞不表达GFP。
然后，用来源于293T细胞转染的病毒上清液转导RBL细胞。然后以相似的方式，使用GFP作为表达穿孔素的RBL细胞的标记，进行流式细胞术分析。图6A中的柱状图揭示出表达高水平的GFP的小群体(一般在0.1和5％之间)，该小群体被描述为M1门控区域(M1 gatedregion)。分离和扩增空MSCV-和MSCV-Pfp-感染的细胞，从而产生其中超过95％的细胞表达代用标记的群体(图6B)。连续的分析显示GFP在连续培养超过8周的细胞中稳定表达。
然后就蛋白质的表达通过Western印迹法对经转导而表达MSCV-Pfp的RBL细胞进行分析。如图7所示，在用MSCV-Pfp转导的RBL细胞中鉴定了对应于穿孔素的67kDa免疫反应性条带，但在亲本RBL细胞中或用未修饰的空载体转导的RBL细胞中都未显示任何的穿孔素表达。
B.使用IgE抗体的RBL细胞的最佳标记条件
作为细胞毒性测定法的前奏，用抗TNP IgE抗体标记RBL细胞以确定IgE结合(作为温度、时间和抗体浓度的函数)的最佳条件。用各种抗体浓度温育的RBL细胞的流式细胞术分析显示，1/2或1/10的释放度获得饱和的结合水平(图8A)。为标记RBL细胞以进行细胞毒性测定法(参见下一节)，选择1/2的稀释度。图8B显示当温度和温育时间变化时的抗体结合的水平。在37℃下温育1小时发生最高水平的结合，在4℃下温育1小时产生几乎等同的结合。温育15分钟导致稍微较低的结合。为制备RBL细胞以进行细胞毒性测定法，推断在37℃下以1/2的抗体稀释度温育细胞1小时。
C.表达MSCV-Pfp的RBL细胞获得强细胞毒性
为测试表达MSCV-Pfp的RBL细胞的裂解潜能，用抗TNP IgE抗体标记这些细胞，并将其用作杀死TNP-标记的靶细胞的效应细胞。在4小时51Cr释放测定法中评估靶细胞的死亡。如图9所示，表达穿孔素的细胞表现强的抵抗TNP-标记的EL-4细胞的细胞毒性。在40∶1这一最高的E∶T比率处，RBL细胞能够诱导大约60％的特异性51Cr释放，随着效应细胞：靶细胞比率下降，该细胞死亡水平逐渐降低。如所预期的，用空MSCV载体转导的RBL细胞不能裂解靶细胞，表明当该非细胞毒性细胞系表达穿孔素时，其被赋予了强细胞毒性。在缺少抗TNP IgE抗体的情况下，用RBL细胞没有观察到裂解活性，表明与靶细胞的有效结合和脱粒是裂解所必需的。类似地，未用TNP标记的EL-4靶细胞不能被效应细胞识别或杀死。还以时间-进程测定法(time-courseassay)重复了细胞毒性实验，以确定靶细胞的最大裂解发生的时间。在6小时时，观察到最大51Cr释放，超过该时间点直至24小时观察到51Cr释放的稳定态。因而决定标准的细胞毒性测定法应当进行4小时，因为该时间点产生和在6小时后观察到的裂解水平相似的裂解水平。
D.穿孔素表达的重复性：表达MSCV-Pfp的独立的RBL细胞系的产生
为了评估该方法的重复性，产生多个表达MSCV-Pfp的独立的RBL细胞系。重复本章通篇描述的方案：通过用MSCV-Pfp构建体转染293T细胞产生4个另外的独立的病毒上清液，然后用所述病毒上清液转导RBL细胞，从而产生称为MSCV-Pfp#2-5的RBL群体。Western印迹法揭示出，4个RBL群体都表达几乎相同水平的穿孔素蛋白质，然而MSCV-Pfp#5，当和微管蛋白上样对照相比时，表达稍微更高的水平(图10)。然后将这些群体用于标准的51Cr测定法以确定通过MSCV-Pfp获得的裂解的正常范围(图11)。在效应器：靶的比率为40∶1时，对于4个表达穿孔素的群体，发现裂解在40％至60％的范围内。如所预期的，使用早先在图8中所讨论的负对照RBL细胞未观察到显著的裂解。为评估在不同的天时通过RBL细胞观察到的细胞毒性上的变化，对所有4个群体重复多次(n＝6)该测定法，在效应器：靶的比率为40∶1时，计算出56％+/-3％的51Cr释放的平均值。以这种方式，可将在以后章节中要调查的突变体的功能与该标准化的杀伤水平相比较。
实施例2：通过RBL细胞中的逆转录病毒表达而进行的两个错义穿孔素突变(G429E和P345L)的功能分析
A.突变的小鼠穿孔素cDNAs的构建
将在患者5(G429E)和患者6(P345L)中鉴定的突变(图12)引入用于在RBL细胞中表达的重组穿孔素cDNA之中。编码突变的穿孔素cDNA的MSCV质粒分别被称作P5-Pfp和P6-Pfp。使用被插入MSCV的野生型穿孔素cDNA(WT-Pfp)作为模板(参见实施例1)，使用定点诱变PCR反应和下列引物导入突变：
对于P5(G429E)突变的导入：
有义：5′AGAACATCTGTGGGAAGACTACACCACAG 3′；
反义：5′CTGTGGTGTAGTCTTCCCACAGATG 3′；
对于P6(P345L)突变的导入：
有义：5′CTACAGCCTGGAGCTCCTGCACACATTAC 3′；
反义：5′GTAATGTGTGCAGGAGCTCCAGGCTGTAG 3′。
按照Quickchange Site Directed mutagenesis kit说明书(Stratagene，CA)中的厂商说明书建立PCR，在Pfu聚合酶缓冲液中包含：50ng模板DNA(WT-Pfp MSCV质粒)、2.5个单位的Pfu聚合酶、50uM dNTP混合物、125ng的每种引物。PCR由下列循环组成：1个循环，在95℃下进行30秒；14个循环，在95℃下进行30秒，在55℃下进行1分钟和在68℃下进行5分钟(2分钟/Kb质粒长度)。完成后，在37℃下用10U的DpnI酶消化PCR混合物1小时以消化掉亲本DNA模板，同时让新合成的突变的DNA保持完整。使用靶向甲基化和半甲基化的DNA的DpnI内切核酸酶选择性地消化亲本DNA。然后用来源于PCR的整合了想要的突变的DNA转化XL-10 Gold超感受态细胞。为进行转化，将1μl的经消化的DNA加入至100μl的XL-10Gold感受态细胞中，并置于冰上30分钟。在42℃下热激细胞45秒，置于冰上2分钟，并在涂板于Amp LB琼脂板上之前，用200μl LB-液体培养基在37℃下温育细胞30分钟。
按照实施例1中概述的方法进行小量和大规模的DNA制备。对cDNA克隆进行测序以确定只有想要的突变已被导入(测序方案参见实施例1)。然后将P5-Pfp和P6-Pfp插入物亚克隆入用EcoRI-XhoI消化的MSCV载体DNA中。
B.突变的穿孔素蛋白在RBL细胞中的表达
使用实施例1中最优化的方案获得P5-Pfp和P6-Pfp在RBL细胞中的表达。简而言之，该方案包括转染293T细胞以产生富含病毒的上清液，转导RBL细胞和进行细胞分选以分离表达高水平GFP标记的RBL细胞。如上文中在实施例1中所描述的，就蛋白质的表达对全部的细胞裂解物进行分析。
C.P5和P6突变的Pfp的功能与WT-Pfp的细胞裂解功能的比较在前面(实施例1)概述的4小时51Cr释放细胞毒性测定法中分析表达P5-Pfp或P6-Pfp的RBL细胞对抗EL-4靶细胞的细胞裂解功能。使用实施例1中描述的表达WTPfp的RBL细胞作为穿孔素功能的正对照，使用用空MSCV载体转导的RBL细胞作为负对照。
D.从RBL细胞分离溶酶体颗粒
通过Davis等人(J Immunol Methods.2003，276(1-2)：59-68)所描述的对细胞内容物进行氮气空泡形成(nitrogen cavitation)和percoll密度分级来从RBL颗粒分离WT-Pfp、P5-Pfp或P6-Pfp。在PBS中洗涤RBL细胞(1×109)三次，然后以1×108/ml重悬浮于松弛缓冲液(relaxation buffer)(100mM KCl，3.5mM MgCl2，1mM PIPES pH6.8，1.25mM EGTA)中，在旋转平台上于4℃下在氮气空泡形成装置中在450psi下裂解所述细胞20分钟。在突然减压后收集细胞裂解物，通过在4℃下以2000rpm离心10分钟来除去细胞核。用1ml松驰缓冲液洗涤细胞核2次，并将上清液和来自第一次洗涤的上清液汇集在一起。在2000rpm下再离心汇集的上清液5分钟以除去所有细胞碎片。然后通过将8ml经调节的percoll(45ml percoll和5ml 10x松弛缓冲液)和12ml含有1mM ATP的松弛缓冲液混合来形成40％的percoll密度梯度。将5ml细胞裂解物加载至每个梯度上，并在4℃下以20,000rpm离心35分钟。迁移至梯度的稠密区域的细胞毒性颗粒通过使用连接至注射器的长脊椎穿刺针从该梯度的底部收获1ml级分来进行收集。在超速离心机(Beckman Coulter)中在4℃下以100,000rpm浓缩(单个地)所述级分3小时，并通过将颗粒洗入小体积的重悬浮缓冲液中而从沉淀的percoll表面获得颗粒。为了释放穿孔素，通过在等体积的2M NaCl中重悬浮和三个在液氮中冷冻与在37℃的水浴中解冻的循环来破裂颗粒。
(i)β-氨基己糖苷酶测定法
向30ul 8mM在水中的对硝基苯基N-乙酰基-β-D氨基葡糖苷(Sigma)和10ul 0.5M醋酸钠溶液(pH5.0)中加入50ul冻融的颗粒提取物。在室温下30分钟后通过加入150ul 50mM NaOH来终止反应，并在405nm下测量样品的光密度。
(ii)通过颗粒提取物的Jurkat细胞的裂解
在37℃下在100ul不含补充物的RPMI培养基中用50μCi 51铬标记Jurkat细胞1小时。然后在含有或不含有2mM EGTA的HBSS缓冲液(CSL Ltd.)中重悬浮51Cr-标记的细胞。为进行测定，将在Hank′s缓冲盐溶液(HBSS)中重悬浮的2×104个细胞加入96孔V形底平板的小孔中。将颗粒级分#8(通过Western分析测定含有最高穿孔素含量)在HE缓冲液中进行系列稀释，并将其和靶细胞以200μl的终体积在37℃下温育4小时。通过仅用HE缓冲液温育靶细胞来确定51Cr的自发释放，和通过加入HCl至1M的终浓度来确定最大释放。4小时后，在1500rpm下将板进行离心，收获100μl上清液，在Wizard 1470 Gamma计数器中测量释放的放射性。细胞毒性表示为减去自发释放后的特异性51Cr释放百分数。如下计算特异性裂解百分数：100×[(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)]。
(iii)红细胞裂解测定法
洗涤绵羊红细胞(sRBC)3次，然后以108/mL在150mM NaCl中重悬浮。为进行测定，在v-形底96孔板中，在2mM CaCl2存在的情况下，于37℃将50ul冻/融的颗粒提取物[级分#8(参见上面)]和20μl sRBC悬浮液一起温育30分钟。对于最大的血红蛋白释放，用水裂解红细胞。将板在1500rpm下离心5分钟，并通过测量405nm处的光密度来估计释放入上清液中的血红蛋白。细胞裂解表示为最大血红蛋白释放的百分数。
(iv)RBL细胞中的穿孔素的免疫过氧化物酶染色
在进行染色步骤前一天，将大约1×105个细胞播种在8孔细胞培养玻片(chamber slide)的每一个孔中。在室温下将细胞在固定缓冲液(3.7％的在PMED中的低聚甲醛)中固定10分钟，然后在PBS中洗涤3次。然后加入透化缓冲液(Permeabilisation buffer)(0.1％Triton-X，0.5％BSA)并保持5分钟，和如前所述洗涤细胞。在室温下用高碘酸(0.5％)处理细胞10分钟，漂洗细胞，通过和0.3％H2O2温育15分钟来淬灭内源过氧化物。向小孔中加入封闭缓冲液(1％BSA/1％脱脂奶粉/PBS)并保持30分钟，和如前所述洗涤细胞2次。然后加入单克隆抗小鼠穿孔素抗体，P1-8(1/1000稀释度或2μg/ml)。在PBS中洗涤3次后，加入生物素-缀合的驴抗大鼠IgG抗体(JacksonImmunoResearch，USA)(1/600的稀释度)，和如前所述洗涤细胞。在室温下将链霉亲和素-HRP(Dako)和细胞温育10分钟，洗涤3次，和通过加入色原DAB(Dako)并再温育10分钟来检测HRP信号。用曙红对细胞进行对染以显现细胞核。
(v)RBL细胞的脱粒
诱发RBL细胞胞吐其颗粒内容物以评估穿孔素的释放。如前面所描述的，将空MSCV转导的RBL细胞，或表达WT-Pfp、P5-Pfp或P6-Pfp的细胞(1×105)播种在小孔中，并用抗TNP IgE抗体(PBS中1/2的稀释度)在37℃下标记30分钟。在PBS中洗涤细胞3次，然后向效应细胞中加入1×106个TNP-标记的EL-4细胞(参见实施例1)并在37℃下温育30分钟。然后用PBS洗涤细胞3次以除去EL-4细胞。为了比较脱粒前和脱粒后的其穿孔素含量，如前面所描述的对RBL细胞进行免疫染色。
A.使用逆转录病毒表达系统在RBL细胞中表达穿孔素
本研究的目的是使用RBL表达系统来表征两个在FHL患者中表达的穿孔素的突变形式(P5和P6)的生物合成和功能。因此，使用实施例1中最优化的用于表达WT小鼠穿孔素的方法学，将等同于人P5和P6突变的突变导入用于在RBL细胞中表达的小鼠穿孔素之中。所考虑的残基(G429和P345)在人、小鼠和大鼠穿孔素中是不变的，暗示着功能的保守。
两步骤逆转录病毒转导过程再一次涉及首先用质粒DNA转染293T细胞，产生对于转导RBL细胞所需的富含病毒的上清液。在用P5-Pfp和P6-Pfp表达构建体转染后，对293T细胞的分析表明超过50％的细胞表达GFP，暗示着在培养物上清液中具有高病毒滴度(图13)。荧光水平与在用WT-Pfp和空MSCV构建体转染的293T细胞中观察到的荧光相当(参见实施例1和图5)。在逆转录病毒转导后，再次分选表达GFP标记的RBL细胞小群体，并将其通过培养进行再扩增以产生具有一致高的GFP转基因表达的细胞群体。扩增的群体的分析确认了表达GFP的细胞的选择，因为超过90％的用编码P5-Pfp和P6-Pfp的病毒转导的细胞现在具有很强的荧光(图14)。总之，这些表达特性表明，突变的穿孔素的表达以和WT-Pfp(关于WT-Pfp的表达，参见实施例1)相似的方式发生。
对扩增的RBL群体的Wester印迹分析(使用P1-8mAb检测穿孔素)显示，具有67kDa的表观分子量的穿孔素蛋白存在于每个经转导而表达P5-Pfp和P6-Pfp穿孔素的细胞群体中，而不存在于用空载体转导的细胞中(图15)。当和微管蛋白上样对照相比较时，突变的穿孔素蛋白和WT-Pfp的表达水平相似，这暗示着将各个FHL突变导入穿孔素中不影响该蛋白质在RBL细胞中的稳定性。
B.由表达WT和突变的Pfp的RBL细胞介导的细胞毒性
为了检验导入的突变对穿孔素功能的影响，在使用TNP-标记的EL-4细胞作为靶细胞的4小时51Cr释放测定法中，将表达P5-Pfp或P6-Pfp的RBL细胞的细胞裂解能力和表达WT-Pfp的细胞进行比较(图16)。和用表达WT-Pfp的RBL细胞所观察到的强细胞毒性明显地相反，作为对于表达突变的穿孔素的RBL群体的响应从靶细胞中释放的51Cr大大降低。该结果在数个实验中和以多个E∶T比率进行重复。观察到的细胞毒性的缺乏不是由于所述蛋白质的表达水平上的差异而造成的，如前面通过Western印迹法所显示的。
C.WT和突变的穿孔素被定位于RBL的细胞质颗粒中
研究穿孔素在RBL细胞中的亚细胞分布以检测和WT-Pfp相比，P5或P6突变体穿孔素在运输至溶酶体颗粒方面的任何差异。通过Percoll-分级的RBL细胞裂解物的Western印迹法显示，穿孔素定位在级分#6-10中，峰值穿孔素含量存在于级分#8中(图17A)。峰值穿孔素表达也和最大β-氨基己葡糖苷酶(β-hexo-glucosaminidase)活性一致(图17B)，该酶是溶酶体颗粒的酶标记(Schwartz和Austen，1980；J Invest Dermatol.1980，74(5)：349-53)。这表明WT和突变的穿孔素定位在分泌性颗粒和溶酶体内。这些发现也和前面的数据一致，在所述数据中，级分6-8被鉴定为RBL细胞的富含颗粒的级分。
通过免疫组织化学染色进一步确定穿孔素至分泌性颗粒的亚细胞定位。如图18中所示，表达WT-Pfp、P5-Pfp和P6-Pfp的RBL细胞关于穿孔素的染色很强，而空载体转导的RBL细胞未显示任何染色。事实上，关于穿孔素，100％的细胞被染色，这和早前对GFP表达的流式细胞术分析一致，在超过95％的RBL细胞中发现GFP的表达(图15)。在高放大倍数下，观察到点状细胞质染色，这和穿孔素的溶酶体定位一致。对于突变的P5-Pfp和P6-Pfp，在高放大倍数下也观察到类似的点状染色。
D.研究P5-Pfp和P6-Pfp的脱粒功能：通过颗粒内容物的有核和去核靶细胞的裂解
上面提供的结果暗示，P5-Pfp和P6-Pfp都正常地被生物合成、运输和贮存于细胞质颗粒中，每种突变的形式不能诱导靶细胞死亡。然而，这两种突变的穿孔素也可能都不能通过胞吐作用从RBL细胞释放。通过纯化裂解颗粒并将其直接作用于靶细胞来检验该可能性。因此，将P5-Pfp和P6-Pfp从其细胞内区室中解离出来，避开脱粒方面的潜在的缺陷。然后就其裂解有核的Jurkat细胞和无核的sRBC的能力来检验WT和突变的穿孔素。如图19A所示，WT-Pfp导致Jurkat细胞大量裂解，随着颗粒被稀释，显现出清楚的剂量依赖性效应。在受试颗粒的最高浓度上，观察到稍微较低的细胞毒性水平，可能归因于一些抑制性颗粒组分的存在，所述组分可能充当钙离子的清除剂。通过稀释颗粒至1/32，观察到大约65％的特异性裂解。通过加入乙二醇四乙酸(ethyleneglycotetraacetic acid)(EGTA)(钙离子的螯合剂)完全抑制了该裂解功能，表明裂解是通过穿孔素介导的机制进行的。来源于空MSCV转导的RBL细胞的颗粒不诱导Jurkat细胞的裂解。明显地和WT穿孔素相反，在Ca2+存在的情况下，包含P5-Pfp和P6-Pfp的颗粒不能导致靶细胞的任何损害(图19B)。
在相似的实验中，将破裂的颗粒和无核的并对穿孔素介导的膜损害更敏感的sRBC混合(Shiver和Henkart，Cell.1991，64(6)：1175-81)。如通过在1/8的稀释度下的血红蛋白释放所检测到的，WT-Pfp导致几乎完全的RBC裂解，并直至稀释度达到1/64时观察到显著的裂解(图19C)。溶血是在测定中加入的颗粒材料的量的函数，其被EGTA抑制，当用Jurkat细胞靶时。包含P5-Pfp或P6-Pfp的颗粒都不能导致sRBC的裂解。
E.研究P5-Pfp和P6-Pfp的脱粒功能：脱粒前和粒后细胞质颗粒中的穿孔素含量的显现
使用免疫组织化学直接检查WT-Pfp、P5-Pfp和P6-Pfp从RBL细胞释放的能力。通过用抗TNP IgE抗体标记RBL细胞，并将其和TNP-标记的EL-4细胞一起温育，来刺激RBL细胞以使之释放其颗粒。未受刺激的RBL细胞表达几乎相同数量的WT-Pfp、P5-Pfp和P6-Pfp(图20)。在和TNP-标记的EL-4细胞一起温育后，RBL细胞中染色的水平显著降低，表明穿孔素胞吐。无论WT-Pfp、P5-Pfp或P6-Pfp表达与否，该染色上的减少是相似的。这暗示着，P5和P6穿孔素同样能够从颗粒中被胞吐，观察到的细胞毒性的缺乏是由于在靶细胞水平上的穿孔素功能障碍造成的。
实施例3：两个与家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症相关的推定的多态性(R225W和G429E)的功能分析。
本研究阐明了在噬血细胞性淋巴组织细胞增多症中穿孔素功能障碍的细胞基础，和证明了本发明的方面作为研究穿孔素的“结构-功能”相互关系的手段的用途。
A.细胞培养
在加湿的培养箱中，在37℃下，在DMEM培养基中培养细胞系RBL-2H3细胞(大鼠嗜碱性粒细胞白血病；美国模式培养物保藏所)(在本说明书中其被称为RBL)和293T(人胚胎肾)，所述培养基补充有10％FCS、2mM谷氨酰胺和各为100μg/ml的链霉素和青霉素。将JurkatT细胞培养在含有上述补充物的RPMI-1640培养基中。在37℃下使用胰蛋白酶-EDTA溶液(CSL Ltd.)使RBL和293T细胞脱离培养瓶。
B.RBL细胞的瞬时转染
成熟的人和小鼠穿孔素各具有534个氨基酸。然而，人穿孔素的前导序列比小鼠的长1个氨基酸。这导致常规氨基酸编号上的差异，这样在HLH患者#5中在位点225和429上突变的氨基酸(如Stepp，S.E.等人，1999，Science，286：1957-1959所描述的)对应于小鼠蛋白质中的残基224和428，如在下面的实验中指出的。重要的是，精氨酸225是非保守性残基，在小鼠穿孔素中存在的是苏氨酸。为证明精氨酸和苏氨酸在该位点的等价性，我们产生了T224R变体，然后，产生了T224W突变体，其对应于患者#5(11)中的R225W。按照厂商说明书使用Transformer(Stratagene)定点诱变系统导入突变。将所得的和WT cDNA克隆入pIRES2-EGFP表达载体(CLONTECHLaboratories，Inc.)。将表达Fcε受体的RBL细胞在175cm2的瓶中培养至接近汇合，收获细胞，洗涤细胞两次，并将其以107个细胞/ml重悬浮于不含血清的DMEM中。将200μl所述细胞悬浮液和20μg含有WT或突变的穿孔素cDNA或者只含有载体DNA的pIRES2-EGFP混合，在室温下温育10分钟，并在4mm的电穿孔小杯和Bio-RadLaboratories脉冲发生器中，在500μF和0.25V下进行电穿孔。在室温下10分钟后，将细胞转移至完全DMEM中。18-20小时后收获细胞，并通过流式细胞术(FACStar；Beckton Dickinson)分选表达GFP的细胞。
C.RBL细胞中的重组逆转录病毒的产生和穿孔素的稳定表达
按照厂商说明书使用Quick-Change定点诱变系统(Stratagene)产生对应于人G429E(在患者#5中的另一个穿孔素等位基因中鉴定的)的错义穿孔素突变，G428E。将编码小鼠WT和G428E穿孔素的cDNAs亚克隆入逆转录病毒表达载体MSCV中，所述表达载体包含用于GFP表达的内部核糖体进入位点。为进行RBL细胞的逆转录病毒转导，通过磷酸钙沉淀法通过将MSCV质粒和兼嗜性包装质粒一起共转染入293T细胞来产生病毒上清液。
48小时后，收获病毒上清液，并在3天内每12小时将其加入至RBL细胞。然后通过流式细胞术纯化具有最大GFP表达的细胞群体(高达总细胞的5％)，并就穿孔素的表达对所述细胞进行分析。
D.评估转染的RBL细胞的细胞毒性
如上所述，在4小时51Cr释放测定法中使用Jurkat T细胞分析RBL细胞的细胞毒性能力。简而言之，在37℃下用1mM PBS(pH7.4)中的三硝基苯磺酸溶液来衍生51Cr-标记的Jurkat细胞的表面15分钟，用不含补充物的DMEM洗涤细胞3次。收集经转染的RBL细胞，并在37℃下将其和抗三硝基苯酚IgE mAb(2μg/ml)一起温育15分钟，用不含补充物的DMEM洗涤细胞3次。在96孔板中，在37℃下在200μl不含血清的DMEM(补充有1％BSA)中，以各种效应器对靶(E∶T)的比率共温育RBL和Jurkat细胞4小时。然后收获上清液，并在gamma计数器中测量释放的51Cr。使用经5％Triton X-100裂解的细胞来估计Jurkat细胞的总51Cr含量。百分比特异性铬释放计算为100×([实验释放×自发释放]/[总释放-自发释放])，其显示为平均值±SD。
E.从RBL细胞中分离溶酶体颗粒
通过氮气空泡形成和Percoll密度分级从109个稳定表达性RBL细胞中分离穿孔素。为了区分富含颗粒的级分和其他亚细胞级分，如下测量RBL颗粒标记酶，β-氨基己糖苷酶的活性。在室温下，将50μL的每个级分与30μL 8mM的对硝基苯基N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷(Sigma-Aldrich)和10μL 0.5M醋酸钠(pH5.0)混合30分钟。通过加入150μL 50mM NaOH来终止反应，并在405nm处测量吸光度。
F.重组穿孔素的表达和膜结合测定法
根据厂商说明书，使用Bac-to-Bac试剂盒(Invitrogen)将穿孔素cDNA克隆入pFastBac载体中并在培养于SF900-II SFM培养基中的Sf-21细胞中过表达，和纯化穿孔素。获得少量重组WT和G428E穿孔素突变蛋白。
为研究穿孔素的钙依赖性膜结合，将2×106个绵羊RBCs重悬浮于200μL补充有1mM CaCl2的20mM Hepes-150mM NaCl缓冲液(pH7.4)中。向所述细胞悬浮液中加入纯化的穿孔素的等分试样，在冰上放置5分钟。在16,000g下沉淀细胞10秒，立即取出上清液，将细胞在冰冷的水中进行裂解。在4℃下，在16,000g下将裂解物离心20分钟。再次洗涤沉淀，将其溶解在SDS-PAGE上样缓冲液中，并通过Western印迹法进行分析。
G.免疫过氧化物酶染色
在染色前的1天，在8孔细胞培养玻片的每一个小孔中播种大约1,000个RBL细胞，并培养过夜。在一些实验中，通过用TNP-标记的肿瘤靶细胞短暂温育来诱导细胞进行脱粒。在室温下将RBL细胞在3.7％的低聚甲醛中固定10分钟，在PBS中清洗3次，在0.1％TritonX-100、0.5％BSA中透化5分钟，然后如前所述洗涤细胞。用高碘酸(0.5％)处理细胞10分钟，并用0.3％H2O2淬灭内源过氧化物酶活性15分钟。在加入小鼠抗穿孔素mAb P1-8之前，加入封闭缓冲液(PBS中的1％BSA/1％脱脂奶粉)并保持30分钟。通过用生物素化的驴抗大鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories)、链霉亲和素-HRP(Dako)温育10分钟和用色原二氨基联苯胺(Dako)来检测结合的Ig。最后，用曙红对细胞进行对染并通过光学显微镜观察。
H.Western印迹法
在10％SDS-PAGE(Tris-甘氨酸)凝胶上解析来自稳定的或瞬时转染的RBL细胞的细胞裂解物或颗粒提取物，将其转移至PVDF膜上，使用大鼠抗穿孔素mAb PI-8和抗大鼠HRP-缀合的Ig就穿孔素的含量进行分析。采用化学发光(Amersham Biosciences)检测信号。
G.结果
电穿孔的效率高达40％，每次电穿孔获得高达106个表达GFP的细胞。尽管G429在人、小鼠和大鼠穿孔素中是保守的，但R225是不是不变的并且对应于小鼠穿孔素中的T224。为确认在该位置上精氨酸和苏氨酸的功能等同性，我们产生了表达T224R小鼠穿孔素的RBL细胞，并且发现其在51Cr释放测定法中和转染了WT穿孔素的细胞一样有效。然而，表达在相同位置具有色氨酸的穿孔素(T224W)导致细胞裂解功能的完全丧失(图22)。如所预期的，WT蛋白具有67kD的表观分子质量；然而，色氨酸的导入导致截短的(～45kD)穿孔素的出现(图22)，这暗示着所述突变有助于穿孔素的蛋白水解切割/加工。此外，经转染的细胞的免疫组织化学分析显示T224W的错误定位，这可能是由于丢失推定的信号基元造成的。WT穿孔素产生了和包装在分泌性颗粒中一致的点状外观，而T224W穿孔素产生了遍布RBL细胞的细胞质的弥散染色(图23A)。当我们类似地分析通过患者#5共遗传的G428E(在人中为G429E)突变的效果时，我们观察到和表达WT穿孔素的RBL细胞相比，51Cr释放水平减少(数据未显示)。为精确地定量该减少的活性，我们产生了稳定地表达WT和G428E穿孔素的细胞系。在流式细胞仪上分析经逆转录病毒转导的RBL细胞，分选出发最强荧光的细胞(总群体的0.2-5％)，并通过培养进行扩增，在数天后产生～93％的GFP阳性细胞。这些细胞以和IL-18/IL-21-激活的小鼠原代NK细胞等同的水平表达穿孔素(图24A)。穿孔素表达和细胞毒性功能在许多周的连续培养的过程中保持稳定(未描述)。和我们的瞬时转染实验一致，表达WT穿孔素的RBL细胞在广泛的E∶T比率范围内有效地裂解Jurkat靶细胞(图24B)。为确定WT和G428E穿孔素之间在细胞裂解活性上的差异，比较了产生等同的51Cr释放水平所需的E∶T比率。我们发现，表达相似水平的G428E的RBL细胞诱导铬释放的效率要低3至4倍(图24B)。
然后我们继续研究G428E穿孔素的细胞毒性降低的原因。如通过免疫印迹法所证实的(图24B)，这不是因为蛋白质的切割或降解而造成的。为排除不正确的至分泌性颗粒的运输，我们检查了WT和G482E穿孔素在稳定转导的RBL细胞中的细胞内定位。发现颗粒中存在正常数量的突变的穿孔素，这进一步排除了基因转录、mRNA稳定性或翻译或者蛋白质折叠上的显著缺陷。当在Percoll梯度上对表达WT或G428E穿孔素的RBL细胞的裂解物进行分级和通过Western印迹进行分析时，穿孔素一致地位于含有最大β-己糖酰胺酶(β-hexosamidase)活性的级分中(图24C)，该酶是溶酶体-样分泌性颗粒的标记。还通过免疫组织化学染色确认了穿孔素的正确靶向，因为WT和G428E穿孔素均显示不可区分的点状细胞质染色(图23A)。G428E穿孔素也通过胞吐作用释放，其效率和RBL Fcε受体交联时的WT穿孔素一样(图23B)。因为G428E穿孔素以和WT穿孔素等同的水平表达并且被正确地靶向颗粒和从颗粒释放(图23和图24，B和C)，因此所述突变可能影响穿孔素的突触后(postsynaptic)功能。为检验该可能性，我们使用杆状病毒表达系统产生并纯化了重组WT和G428E穿孔素，并测试了其以钙依赖性方式结合绵羊RBC膜的能力。WT穿孔素显示了强的钙依赖性血浆膜结合，基本上所有加入的穿孔素都结合，而G428E穿孔素的结合显著减少(图25)。和该发现一致，重组G428E突变体的细胞裂解活性是WT穿孔素的～5％(未描述)。尽管许多年来RBL细胞被用作穿孔素功能的读出器，但该模型的明显缺点是穿孔素在不存在粒酶B的情况下会发挥其细胞裂解作用。将靶细胞暴露于重组G428E穿孔素和粒酶B不能拯救穿孔素表型(未描述)。因此，我们的发现强烈地暗示着，G428E穿孔素的活性降低是由于减少的靶细胞膜结合造成的，而不是缺少粒酶造成的。
这是第一次成功地确定天然发生的穿孔素突变的功能基础的研究，当所述突变共遗传时，导致在HLH中观察到的灾难性的免疫抑制。令人惊奇的是，我们证实穿孔素功能的部分丧失可能足以产生致命的疾病。T224W突变(对应于人中的R225W)导致蛋白质的不稳定性和RBL细胞毒性功能的完全丧失，而G428E(人中为G429E)只是部分失活，因为RBL细胞保持～25-30％的WT裂解活性。基于我们的RBL测定法的结果，可以预测表达等量的T224W穿孔素和G428E穿孔素的CTL将具有一些残留的但显著减少的细胞毒性活性。事实上，患者#5的NK细胞确实表现出对照样品的～15％的裂解活性。我们的数据和在该情况下的临床发现一致，这提供了这样的证据，即我们的实验方法将会为理解在HLH中鉴定的其他穿孔素突变提供坚实的基础。
实施例4：与家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症相关的两个推定的多态性(A91V和N252S)和22个错义穿孔素突变的功能分析
A.突变的穿孔素cDNAs的构建
按照厂商说明书(Stratagene)使用Transformer或QuickChange试剂盒对在pKS(+)Bluescript中克隆的小鼠穿孔素cDNA进行突变(需要时提供寡核苷酸引物序列)。为避免在和临床病例比较时发生混淆，在本研究的整个过程中，我们使用人穿孔素的氨基酸编号。在穿孔素的人和小鼠形式中，突变的残基的相对位置是一样的。将WT或突变的穿孔素P39H、G45E、V50M、D70Y、C73R、A91V、W95R、G149S、F157V、V183G、G220S、T221I、H222R、H222Q、I223D、R232C、R232H、N252S、E261K、C279Y、R299C、D313V、R361W和Q481P克隆入pIRES2-EGFP表达质粒(BD Biosciences Clontech)中。比目鱼中发现的两个等位基因取代，R232S和Q481E，表达水平相似。对每个穿孔素cDNA的两条链都进行全长测序以检查定点诱变的保真度。使用Qiagen Maxi试剂盒纯化所得的表达质粒。
B.RBL细胞的瞬时转染
培养表达Fcε的RBL细胞，并如上面实施例3B中所描述的那样瞬时转染所述细胞。18-20个小时后，使用流式细胞术(FACStar，Beckton-Dickinson)收集表达BGFP的细胞。许多报导表明，在HLH患者的NK细胞中缺少穿孔素的表达，暗示着突变的蛋白质的遗传不稳定性。为了解释该问题，并在给出大量的分析的样品情况下，我们必须能够可靠地比较穿孔素变体的表达水平。因此，在分选转染的细胞之前，使用CalibRITE FITC-标记的荧光珠(Beckton-Dickinson)对FACStar流式细胞仪进行校准。我们发现，在每目的基础上，该方法为我们提供了可重复的WT穿孔素表达和可比较的细胞毒性的水平。
在上面实施例3中描述的4小时51Cr释放测定法中使用Jurkat T细胞作为靶细胞对RBL细胞的细胞毒性进行分析。在10％SDS-PAGE(Tris-甘氨酸)凝胶上解析来自瞬时转染的RBL细胞的细胞裂解物，然后通过免疫印迹法就穿孔素或微管蛋白的表达进行分析，所述免疫印迹法使用P1-8抗穿孔素抗体或抗微管蛋白抗体，接着用第二种偶联了HRP的抗大鼠或抗小鼠免疫球蛋白。通过化学发光(Amersham-Pharmacia)来检测信号。
C.结果
在本实验中，我们进行了22个怀疑导致HLH的PRF1的错义突变的功能分析，所述突变定位在各种不同的穿孔素结构域，如图26中所示。为了在与其他基因座中的潜在缺陷隔离的情况下分析所述突变对穿孔素功能的影响，我们如前面实施例3中所描述的在RBL细胞中表达WT或突变的穿孔素，然后确定其裂解它们所缀合的Jurkat靶细胞的能力。使用该方法，我们能够区分各种穿孔素分子的可能突触前(pre-synaptic)和突触后(post-synaptic)的功能障碍。我们也进行了穿孔素序列的两个改变(A91V和N252S)的详细分析，所述两个改变至今一直被认为是PRE1的多态性。
(i)怀疑的穿孔素多态性，A91V的功能分析
基于为获得给定水平的靶细胞死亡需要大约2倍的RBL细胞，A91V穿孔素的细胞毒性活性和WT相比相应地下降了大约50％(图27)。按照相同的标准，R232H穿孔素的活性比A91V稍微下降一些，其产生了大约30％的WT穿孔素活性。重要的是，双突变A91V/R232H蛋白质完全失活。通过Western印迹对于蛋白质表达水平的分析揭示出，和WT蛋白质相比，A91V、R232H的表达减少，而A91V/R232H穿孔素减少的程度更大。这些观察数据暗示着，两种突变都影响穿孔素的折叠和稳定，都可能在RBL测定法中对其细胞毒性产生负面影响。我们还如上面实施例3F中所描述的，使用杆状病毒表达系统产生了重组人A91V和WT穿孔素。我们发现A91V的裂解活性减少至WT穿孔素的＜10％(此处未显示数据)。此外，纯化的A91V的功能不稳定，因为在4℃下贮存48小时后，其裂解活性快速地降低至不可检测的水平。作为比较，WT在这些贮存条件下可稳定数月。基于该基础，我们提出，A91V取代导致蛋白质错误折叠，该错误折叠最可能是导致其在RBL细胞中的稳定性降低的原因。该不稳定性在从用杆状病毒感染的昆虫细胞中纯化出的穿孔素的情况下增加，可能是由于昆虫细胞内缺乏合适的细胞内陪伴分子和/或改变的氧化还原环境造成的。总之，上述测定表明A91V取代是一种不寻常类型的PRF1多态性，因为其具有高等位基因频率，但明显地导致减少的稳定性，从而导致穿孔素裂解活性的部分丧失。我们认为A91V的细胞毒性活性的水平通常可能基本上足以预防HLH，如果第二个等位基因是WT，或甚至当所述突变以纯合状态遗传亦如此，因为健康群体的1-4％是该情况。
(ii)怀疑的穿孔素多态性，N252S的功能分析
为阐明N252S取代对穿孔素功能的影响，我们产生了几种穿孔素突变，即D252N、D252E和D252S，并分析它们在RBL细胞毒性测定法中的活性，其结果显示于图28中。我们发现所有这些取代保持WT穿孔素的活性。假定是共显性表达，这些观察数据暗示，携带N252S等位基因和失活突变(存在于他们的其他PRF1等位基因28中)的个体将具有～50％的正常穿孔素活性，这与其他人在HLH患者中观察到的CTL活性的水平一致。综合起来，我们的数据和流行病学研究9表明，单独的N252S取代不能是产生疾病的原因，而是另外的基因缺陷可能是导致疾病的原因。因此，我们得出结论，N252S可能代表真正的PRF1多态性。
(iii)和HLH相关的错义突变的功能分析
在本研究中，我们根据在各种HLH患者中报导的等位基因的组合将穿孔素突变分组。图29A显示在纯合子患者中发现的等位基因的结果的概括；图29B显示和穿孔素的无效突变(null mutation)(通常为截短)共表达的等位基因的对应数据；而图29C涉及只在复合的杂合子患者(其在两个等位基因上都具有错义突变)中鉴定的等位基因。选择该方法，因而无论可能与否，我们的发现可能能够用于解释相应的临床报导。我们通过调查给定的突变是否导致突触前或突触后功能障碍来开始我们对错义突变的分析。RBL细胞中的表达水平的分析揭示出，大部分穿孔素突变导致不稳定的/未折叠的蛋白质。因此，根据Western印迹分析，和WT相比，具有突变P39H、G45E、G45R、V50M、D70Y、W95R、G149S、G220S、T221I、H222R、R232C、R232H、E261K、C279Y、R299C、R361W或Q481P的穿孔素在RBL细胞中不能被检测到或大大减少。突变的蛋白的突触前缺陷可能涉及其错误折叠或异常运输，从而导致降解。在基于RBL细胞的51Cr释放测定法中，所有不稳定的穿孔素变体具有最小的可检测的细胞毒性活性(图29A-C)。我们还通过基因工程改造了氨基酸取代R232S(图30)和Q481E(图29B)，以反映在比目鱼穿孔素中对应的位置上发现的残基。和R232H(也参见，图27)不同，R232S具有正常的活性，而R232C(在一个HLH患者中报导的)14也具有严重减少的功能(图30)。比目鱼Q481E穿孔素也具有WT表达水平(图29B)和活性(数据未显示)。此处分析的另一组穿孔素突变的表达与上述那些突变相当不同。和显示低的表达的临床报道相反，V183G(图31)和H222Q穿孔素以和WT(图29B)等同的水平在RBL细胞中进行表达(图29B)，C73R、F157V和D313V穿孔素的表达水平仅仅稍微地减少(图30B)。随后，我们使用51Cr释放细胞毒性测定法分析这些突变的穿孔素的细胞毒性性质。我们惊奇地发现，曾被认为和HLH相关的V183G穿孔素的裂解活性不能和WT蛋白质的活性区分(图31)。我们得出结论，V183G突变不可能导致患者V(图29C)的HLH，即使第二个等位基因具有失活性的C219Y取代。根据我们的实验观察数据和氨基酸保守性的缺乏，我们推测V183G取代是真正的PRF1的多态性，而在相应的患者中的HLH可能是由一些其他不依赖于穿孔素的机制产生的。此外，穿孔素突变没有表现出对WT穿孔素的功能具有明显的‘占优势性的负面’效应，因为该性质预期会在患者的父母中影响穿孔素的功能。保守的组氨酸的突变，H222Q，导致穿孔素在RBL细胞中的正常表达，但转染的RBL细胞不具有可检测的细胞毒性活性(数据未显示)。对于非保守性取代的残基C73R、F157V和D313V突变观察到类似的结果，和WT穿孔素相比，所述突变在RBL细胞中的表达水平只是稍微地减少。
总之，我们已提供了迄今报道的与HLH相关的PRF1的错义突变和多态性的全面的功能分析。我们的数据表明，突变的穿孔素的不稳定性是比突触后功能障碍更普遍的造成与穿孔素相关的HLH的原因。我们证实，A91V突变是“多态性”的不寻常情况，因为其显著地影响了穿孔素的稳定性和细胞裂解活性，最可能是由于穿孔素的不正确折叠造成的。健康人群中有相当大的比例以纯合状态携带A91V，这一事实和我们的实验发现相符，我们的实验发现是该取代仍然保持相当高比例的WT功能。
实施例5：筛选具有穿孔素抑制剂活性的化合物
A.试剂
用于本研究的试剂如下：
HEPES(Sigma Aldrich Cat No.H-4034)
NaCl(BDH Cat No.10241.45)
CaCl2·2H2O(BDH Cat No.10070.44)
BSA(Sigma Aldrich Cat No.A-2153)
聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯(Tween 20；Sigma Aldrich Cat No.P-7949)
Triton X-100(Sigma Aldrich)
Perkin Elmer SpectraMax 384孔平板(Cat No.6007849)。
B.研究方案
(i)测定法概述
  靶：   穿孔素(小鼠)
  靶类别：   裂解性蛋白质
  与计划相关的测定：
  测定技术：   细胞吸光度测定法
  测定形式：   384孔
  所研究的可选择的测定技术/状况
  最优化的可选择的测定法：
  酶：   母液，汇集的纯化的穿孔素(～250μg/ml)@4℃
  测定法底物：   绵羊红细胞
  联系人：   Annette De Bono-PMCI(9656 3725)
  递送日期   08-01-2004
(ii)测定法动力学和特征：
  [酶]或稀释倍数   ～1.5nM(0.1μg/ml)终浓度(1∶2500)
  [底物](μM)：   107个红细胞/孔
  底物动力学(Km和Vmax)：   N/A
  [ATP](对于激酶)：   N/A
  ATP动力学(对于激酶，Km和Vmax)   N/A
  测定法温育时间(分钟)   15分钟
  测定法时间线性(分钟)：   10-15分钟
  S/B   12-16
  Z’-系数   0.8-0.9
  测定中的最终[DMSO]％：   0.2％
  DMSO耐受性：   在1％DMSO情况下无显著抑制
  受试的参照抑制剂(IC50，以nM表示)：
  酶溶液的稳定性：   22℃下2-4小时无活性损失
  光敏感性：   无
(iii)测定法试剂和材料：
  内容物  来源   备注
  缓冲液A   10mM HEPES，pH7.4150mM NaCl0.01％BSA(级分V)0.01％Tween20  Sigma H-4034BDH 10241.45Sigma A-2153Sigma P-7949   RTRT新配RT
  酶溶液   级冲液A中1∶500  来自PMCI   RT
  RBC缓冲液   缓冲液A加上1.875mM CaCl2 BDH 10070.44
  细胞工作溶液   RBC缓冲中2.5×108个细胞/ml(107个细胞/孔)  来自UniMelb Vet School的绵羊RBCs   RT
  0％对照   仅10μl缓冲液A
  100％对照   10μl 2.5％Triton X-100  Sigma X-100
  板   384孔透明平底  Packard SpectraMax 384(Cat no.6007849)
  读数器   Envision(Perkin Elmer)  ABS@650 protocol
(iv)测定方法：
用“穿孔素针钉工具转移(Perforin-pintool transfer)”方法，使用MiniTrak IX分别向10μl 0.5μg/ml缓冲液A中的穿孔素或对照中加入0.1μl化合物/DMSO，并通常与化合物一起预温育至少30分钟。然后用Zymark“Perforin2v4”方法使用MultiDrop将40μl绵羊RBCs加入至RBC缓冲液中。绵羊RBC的裂解导致反应混合物的浊度发生变化，而细胞裂解的抑制导致浊度读数变化的减少或消除。因为通常将抑制剂化合物溶解在DMSO中，因此可将相同浓度的DMSO用作穿孔素的抑制的负对照。在使用DMSO的小孔中，穿孔素裂解没有被抑制，并且浊度上的变化和在缺少DMSO或抑制剂化合物的情况下观察到的等同。
开始时(t＝0分钟)读取样品在650nm的吸光度(在Envision中；使用Envision读数器，自动化ABS@650nm)，在37℃下温育15分钟，然后在650nm读取吸光度以评估反应混合物的浊度的变化。
C.实验程序
初级穿孔素介导的裂解测定法基于细胞浊度的测量，该浊度通过在650nm的波长处测量吸光度来检测。因此，所述测定法通过测量化合物对穿孔素介导的绵羊RBC的裂解的抑制来确定该化合物的效力。绵羊RBC的裂解导致反应混合物的浊度发生变化，而细胞裂解的抑制导致浊度读数变化的减少或消除。因为通常将抑制剂化合物溶解在DMSO中，所以用相同浓度的DMSO作为穿孔素的抑制的负对照。在使用DMSO的小孔中，穿孔素裂解没有被抑制，并且浊度上的变化和在缺少DMSO或抑制剂化合物的情况下观察到的等同。
(i)初次筛选
在20μM的化合物终浓度下进行初次筛选。测定化合物作为单个点。
(ii)第二次筛选-化合物稀释平板形式
建立5个点的剂量-响应，其使用在V形聚丙烯384孔平板(Matrical，Cat No.MP101-3-PP)中作系列稀释的(对于每一个稀释系列更换移液器(pipette)的尖管)化合物母液(在列#23和#24中的对照)，将来自所述384孔平板的0.5μl稀释的化合物分配至单块测定板(SpectraMax透明，平底，384孔板，Perkin Elmer Cat No.6007849)的每一个小孔中，即每个单块测定板具有高达64个受试化合物。
(iii)化合物浓度
  稀释no.   100％DMSO中的化合物浓度   测定法中化合物的终浓度
  1   10000μM   100μM
  2   2000μM   20μM
  3   400μM   4μM
  4   80μM   0.8μM
  5   16μM   0.16μM
(iv)数据分析
使用软件ActivityBaseTM，版本5.0.10(ID Business SolutionsLtd)分析获自每个重复的实验的数据。使用基于MS Excel的程序XLfit(版本3.0.5)以使数据符合这样的4参数逻辑(logistic)函数，从而推算产生穿孔素介导的细胞裂解的50％抑制(IC50)的受试化合物的摩尔浓度，所述函数具有式：
               y＝A+(B-A)/(1+((C/x)^D))
其中：
A是曲线的底部平台(plateau)，即，最终的最小y值；
B是曲线的上部平台，即，最终的最大y值；
C是在50％的y值时，X的值。当A+B＝100时，其提供了log IC50的值；
D是Hill倾斜系数(slope factor)。在该模型中，当y随着X的增加而减小时，返回到了正值。
X是初始已知的x值；和
Y是初始已知的y值。
D.结果
(i)初次筛选的数据
  化合物的编号   在初次筛选中具有≥60％的裂解抑制   在第二次筛选中IC50≤100μM   在第二次筛选中IC50≤20μM
  101，024   612    333 *   132*
(ii)第二次筛选
接着使用和初次筛选中所用的方法相同的方法以及384孔的形式，以100μM、20μM、4μM、0.8μM和0.16μM检测初次筛选中鉴定的所有612种化合物。在这612种化合物中进一步确认了333种以可重复的方式抑制小鼠穿孔素对于绵羊RBC的裂解，其IC50＜100mM。在这333种化合物中，观察到132种具有最大的效力，被定义为以IC50＜20μM抑制绵羊RBC的裂解。
(iii)第三次筛选
就抑制小鼠穿孔素的裂解作用，第三次检测具有IC50＜20mM的132种化合物中的129种。在该情况下，在100mM、25mM、5mM和1mM下检测每种抑制剂(参见下表)。如下改变用于绵羊RBC裂解测定法的方法：
在96孔V形底平板中，向穿孔素或对照中加入化合物/DMSO并预温育30分钟。如上所述制备所有试剂。然后加入绵羊RBC(如上所述制备的)，并将板在37℃下温育15分钟。然后在环境温度下将板以1500rpm离心3分钟。用移液器从每个测试小孔中收集上清液，并通过测量541nm处的吸光度来定量血红蛋白的释放。通过在相同体积的蒸馏水中重悬浮相同数量的绵羊RBC来确定最大的从RBC中的血红蛋白释放，裂解的负对照由在相同体积的不含穿孔素的缓冲液A中温育相同数目的绵羊RBC组成。每种化合物的裂解抑制百分数显示表中。
  ％裂解抑制
  化合物ID No   100μM   25μM   5μM   1μM
  81690   99.4   101.3   102.6   14.6
  83430   100.3   101.2   100.4   4.4
  85062   99.24   97.7   96.5   -22.6
  86745   98.9   91.5   101.1   -6.2
  86830   98.1   100.6   102.6   10.8
  87634   94.4   99.1   102.6   53.7
  90683   100.1   101.6   103.26   12.5
  91500   96.7   72.9   103.3   13.2
  91507   32.6   16.8   74.7   14.1
  93511   96.7   100.7   102.5   47.5
  93694   99.4   101.2   103.5   0.08
  95199   96.5   100.9   102.7   9.9
  96634   87.5   87.3   100.1   85.2
  97497   100.8   101   102.4   34.8
  97753   93.6   100.1   91.9   38.1
  98602   97.9   101.3   103.1   30.2
  98714   99.1   101.2   102.8   -11.4
  98796   99.6   101.3   103.5   32.2
  98853   98.7   101.5   103   56.9
  98890   100.1   101.4   103.1   43.6
  99593   97.9   100.7   102.8   52.7
  99719   97.9   101   102.9   48.7
  99746   96.6   102   102.9   91.1
  100904   93.3   54.4   85.8   20.8
  101334   59.8   88.1   20.9   1.8
  102196   98.7   100.4   96.4   7.7
  81459   95.9   100.7   72.4   -20.7
  ％裂解抑制
  化合物ID No   100μM   25μM   5μM   1μM
  7816   99.8   101.7   102.9   18
  77033   82.2   88.2   64.3   8.8
  56384   99.4   100.7   100.8   10.3
  53476   98.7   101.3   98.6   90.2
  54349   33.5   97.4   102.9   26.8
  53700   80   91.7   100.8   98.5
  51550   97.5   100   102.8   24.8
  51346   99   101.4   102.9   86.2
  35654   96.8   99.9   102.4   94.4
  34488   99.7   100.9   101.1   98.2
  34231   99.9   101.4   102.9   86.7
  33744   93.7   92.8   81.9   -36.9
  33465   99.7   100.1   102   21.9
  32846   96.7   97.1   99.1   86.3
  32845   85.5   99.3   101.8   -2.3
  31622   97.9   100.3   102.1   33.9
  17306   96.7   100.3   102.6   94.7
  17020   97.6   100.7   102.5   3.3
  16612   95.8   102.2   101.6   1.6
  14621   95.4   96.8   102.6   35.7
  14279   99.7   104.1   102.1   99.4
  13729   97.8   99.9   101.4   26.6
  13655   98.5   101.3   101.9   -4.9
  5857   99.1   102.6   102.6   77.8
  49391   99.6   103.4   103.1   95.1
  46553   98.4   99.2   103.2   97.4
  44146   99.4   100.4   101.8   76.4
  40217   98.1   99.1   102.6   79.7
  40021   98.8   49.5   100.2   10.8
  39822   97.7   93   102.9   78.1
  37011   37.3   78.3   96.4   94.4
  37003   97.5   101.1   101.9   22.2
  36892   99.2   96.6   42.1   7.5
  36837   99.9   98.1   101.2   -8.5
  88403   98.8   101.5   98.3   0.2
  88082   94.3   102.2   101.2   0.08
  88071   84.8   92.7   97.9   91.6
  86792   99.1   97.9   97.5   32.3
  86737   99.7   97.7   96.9   50.5
  86671   96.7   93.8   101.6   83.9
  85851   98.2   98.1   91.1   55.9
  85368   99.5   103.6   98.6   16
  84575   96.02   101.4   86.8   -4.3
  83514   96.3   101.6   97.98   -8.3
  83439   98.4   103.5   99.2   89.5
  82708   98.7   101.6   101   98.5
  82465   91.2   97.5   102.1   -10
  80405   83.7   100.8   101.9   5.8
  80377   97.6   103.5   98.8   22.7
  ％裂解抑制
  化合物ID No   100μM   25μM   5μM   1μM
  77708   88.5   94.6   102.5   10.2
  77367   96.9   99.9   59.4   96.5
  76429   86.3   87.7   75.3   3.4
  75689   98.2   99.5   102.9   92.2
  74871   98.1   102.4   101.6   11.2
  74470   92.9   103.4   100.9   5.4
  74401   97.8   104   102.1   5.9
  74043   93.2   103.8   102.8   36.4
  73303   96.6   102   68.9   31.4
  72176   99.5   104.2   100.9   7.2
  71998   99.8   104.5   98.9   15.9
  69026   99.5   104.6   98.4   19.3
  67186   97.3   101.9   80.2   15.4
  65683   89.5   103.2   53.3   56.6
  64537   92.2   96.6   88.3   9.4
  64234   67.1   87.7   3.9   13.7
  60658   88.4   105.8   102.2   49.6
  59160   75.1   95.6   98.3   23.9
  58388   25.3   108.1   102.3   11.2
  57871   105.6   106.7   76.1   15.3
  57806   105   106.5   103.4   101.3
  57777   105.1   106.6   103.5   99.1
  56930   106.4   106.9   103.2   105.8
  34488   106.3   106.6   103.4   106.1
  33465   105.7   105.7   102.9   80.7
  17020   106.1   106.7   56.3   64.8
  14279   106.4   106.9   97.4   97.8
  13655   75.1   74.7   -13.4   19.3
  A1   84.2   77.8   22.4   70.6
  A2   105.9   103.5   98.1   105.6
  A3   34.7   94.7   55.4   93.6
  B1   13.9   95.3   14.6   80.9
  B2   102.6   106.2   101.5   104.8
  B3   29.7   44.3   22.7   51.2
  C1   89.1   102.9   45.9   101.3
  C2   105.6   105.3   100.7   104.3
  C3   105.7   92.8   1.1   99.8
  D1   108.3   105.3   79.9   93.9
  D2   105.4   106.5   98.8   78.6
  D3   102.1   105.5   24.1   85.4
  E1   104.2   106.1   99.9   93.7
  E2   103.3   106.5   58.2   97.2
  E3   105   106.5   63.8   98.4
  F1   19.5   44.6   19.8   83.6
  F2   -2.2   40.6   11.6   81
  F3   70.3   100.6   42.8   74.2
  G1   101.8   105.8   50.1   95.3
  G2   101.2   106.1   100.6   104.7
  ％裂解抑制
  化合物ID No   100μM   25μM   5μM   1μM
  G3   103.4   103.5   98   104.4
  H1   100   101.6   99.1   104.9
  H2   101.6   104.6   58.8   101.3
结果证明，在100μM和25μM的情况下，大多数化合物能够抑制穿孔素诱导的红细胞裂解，当以1μM使用时，其中许多化合物仍然相当有效。当以1μM使用时，大约30％的所述化合物仍然是有效的。
(iii)在存在0.1％、0.5％和1％BSA情况下的绵羊红细胞测定法，化合物浓度为20μM
在所述129种化合物中，我们选择46种最有效的化合物(在20μM)，连同负对照，在各种浓度的牛血清白蛋白(BSA)存在的情况下进行SRBC裂解测定法。我们发现当BSA以0.1％存在时，所述化合物中的22种仍然能够抑制小鼠穿孔素达到至少60％的程度。
  ％裂解抑制
  化合物ID No   0.1％   0.50％   1.00％
  93511   38.4   -6.1   -9.2
  96634   91   9   -7
  98853   32   30   34
  99746   4.5   -4   -3
  53476   57   43   22
  53700   -11   -10   -10
  51346   77   28   39
  35654   30   -3   1.3
  34488   7   2   3
  34231   94   72   44
  32846   91   64   11
  31622   72   80   62
  17306   -5   2   -10
  17020   93   61   64
  14279   96   52   25
  5857   101   102   92
  49391   102   107   108
  46553   100   100   95
  40217   97   109   107
  39822   82   45   33
  88071   7   2   -16
  86792   13   34   37
  ％裂解抑制
  化合物ID No   0.1％   0.50％   1.00％
  86671   59   63   84
  85851   76   67   15
  84575   32   -12   20
  83439   100   93   88
  82708   0   -2   7.7
  77367   94   83   50
  75689   29   18   19
  74871   -3   25   8.5
  67186   37   45   28
  64537   88   64   58
  62030   74   19   7
  57871   51   22   27
  57806   83   14   4
  57777   60   47   27
  56930   109   113   115
  34488   27   15   9
  33465   91   49   32
  A2   61   6   27
  B1   31   -1
  B3   17.8   5.4   1.5
  D1   -2.5   48   74
  D2   5   10   7
  F1   16.9   11.4   1.3
  F3   17.8   5.4   1.5
(iv)在 HE缓冲液中，在0.1％BSA存在的情况下有核(Jurkat)细胞上的穿孔素抑制
然后在0.1％BAS存在的情况下，在80μM、20μM、5μM和1μM下通过51Cr释放测定法就其抑制有核细胞(Jurkat T淋巴瘤细胞)的能力对这样的化合物进行检测，所述化合物在0.1％BSA存在的情况下仍然能够抑制绵羊RBC的穿孔素裂解达到超过60％的程度。在HE缓冲液或RPMI介质中检测所述化合物，下面显示的数据是对于HE的数据。
  ％对于Jurkat上的51Cr释放的抑制
  化合物ID No.   80μM   20μM   5μM   1μM
  93511   94.5   99.7   100.8   100.5
  96634   91.8   92.8   91   77.2
  99746   74.7   92.3   98.9   95.5
  53476   98.2   101.3   82.3   13.1
  53700   77.3   97.9   78.8   28.8
  ％对于Jurkat pgk上的51Cr释放的抑制
  化合物ID No   80μM   20μM   5μM   1μM
  35654   76.1   88.2   53.2   2.8
  34488   -3.6   -2.8   -1.9   -0.8
  84231   98.2   105.5   93.3   56
  32846   97   99.8   100.2   101.2
  31622   59.2   17.1   2.7   5.6
  17306   91.2   91.8   12   1.3
  17020   88.4   12   1   0.2
  14279   98.7   30.5   -2.1   -0.4
  5857   96.1   99   88.3   61.1
  49391   94.5   97.5   99.6   49.4
  46553   95.6   95.3   97.3   96.7
  40217   99   90.8   92.3   51.8
  39822   97.5   96.6   25.1   8.2
  88071   65.3   40.5   -3.1   -5.7
  86792   98.7   93.9   46.2   6
  86671   97.9   88.2   73.9   31.1
  85851   84.2   33.4   10.6   6.2
  83439   74.4   93.6   99.4   78.7
  82708   38.1   30.7   5.8   2.9
  77367   95.3   104.9   99.5   86.8
  75689   76.4   65.3   30.3   3.4
  74871   95.9   90   19.4   2.4
  87186   0.1   3.8   7.8   6
  64537   81.4   85.2   82.8   48.5
  62030   88.6   88.5   41   3.5
  57871   1.3   -2.6   5.6   8.1
  57806   97.3   100.3   96.9   37.4
  57777   100.7   24.7   13.6   12.9
  56930   90.3   91.9   98.8   74.3
  34488   0.3   0.9   0.9   -3.6
  33465   82.6   10   5.8   6.6
  B3   4   5.6   12.4   13
结果显示在80μM下，36种化合物中的30种抑制穿孔素达到60％或更大的程度；在20μM下，36种化合物中的24种抑制穿孔素达到60％或更大的程度；在5μM下，36种化合物中的17种抑制穿孔素达到60％或更大的程度；和在1μM下，36种化合物中的9种抑制穿孔素达到60％或更大的程度。
(v)在 RPMI缓冲液中，在0.1％BSA存在的情况下对有核Jurkat细胞的穿孔素裂解的抑制
  ％对于Jurkat上的51Cr释放的抑制
  化合物ID No   20μM   5μM  1.25μM   0.3μM   .08μM
  46553   98   96  90   87   48
  96634   90   53  40   38   30
  32846   100   100  86   53   20
  05857   82   43  20   10   0
  83439   22   34  10   7   10
  56930   82   95  70   42   23
  57806   93   50  40   40   32
  49391   100   100  97   77   36
  40217   100   93  62   43   25
  93511   100   98  80   40   20
99746 100 92 55 18 10
  53700   18   -  -   -   -
  86671   83   40  16   20   8
  64537   90   50  30   20   10
  83430   98   70  40   22   10
  35654   85   48  25   15   18
  54376   98   70  30   18   10
(vi)作用的特异性—为了检测抑制剂是否特异性地抑制穿孔素，或者是否还能够阻断肺炎球菌毒素肺炎球菌溶血素(PLO)的裂解功能，在20μM下就其抑制由PLO诱导的绵羊RBC裂解的能力对下表中的抑制剂进行检测。没有抑制剂具有显著的对PLO的抑制作用，表明其特异地抑制穿孔素。
  化合物ID No.   ％在20μM时化合物对PLO的抑制
  81690   -37.4
  83430   26.7
  85062   -17.8
  86745   -11.4
  86830   -6.9
  87634   -14.8
  90683   7.43
  91500   7.29
  91507   23
  93511   -17.8
  93694   5.3
  95199   -1.7
  96634   -14.9
  97497   -6.4
  97753   -21.9
  98602   -5.8
  98714   38.8
  98796   -34.7
  98853   -6
  98890   1.82
  99593   -4.3
  99719   19.3
  99746   -11.6
  100904   5.5
  101334   -35.2
  102196   -13.7
  81459   16.5
  7816   -12.8
  77033   2.24
  56384   -12.9
  53476   28.2
  54349   15.6
  化合物ID No.   ％在20μM时对PLO的抑制
  53700   -21.4
  51550   8.2
  51346   13.8
  35654   -3.9
  34488   -3.3
  34231   2.8
  33744   -14.4
  33465   21.9
  32846   -25.4
  32845   -19.9
  31622   12
  31330   -6
  17306   -1.8
  17020   11.6
  16612   -0.5
  14621   17.9
  14279   -8.11
  13729   -11.8
  13655   -13.9
  5857   15.5
  49391   -5.7
  46553   -31.7
  44146   -43.1
  40217   14.1
  40021   -18.1
  39822   5.5
  37011   -10.02
  37003   18.8
  36892   1.05
  36837   -1.4
  88403   0.91
  88082   10.2
  88071   -22
  86792   11.3
  86737   2.7
  86671   -10.9
  85851   8.73
  85368   -3
  84575   -2.7
  83514   -27.9
  83439   -5.7
  82708   -22.4
  82465   0
  80405   -15.5
  80377   9.2
  77708   7.08
  77367   -9.5
  76429   -3.4
  化合物ID No.   ％在20μM时对PLO的抑制
  75689   9.89
  74871   -5.2
  74470   -16.9
  74401   -11.6
  74043   -19.1
  73303   6.4
  71998   -6.7
  69026   -13.6
  67186   -2.5
  65683   -13.7
  64537   -31.6
  64234   -4.7
  62030   -42.3
  60658   12.7
  59160   -15.6
  58388   3.5
  57871   -20.7
  57806   15.7
  57777   9
  56930   -19.6
  34488   4.6
  33465   0.8
  17020   11.6
  14279   -8.11
  13655   -13.9
  A1   21.9
  A2   -20.9
  A3   -23.1
  B1   -20.1
  B2   -30.9
  B3   -2.9
  C1   10.5
  C2   -14.8
  C3   -24.2
  D1   -30.8
  D2   -46.4
  D3   -36.7
  E1   -66.7
  E2   -50.9
  E3   -21.8
  F1   -57.9
  F2   -56.9
  F3   -48.7
  G1   -23.4
  G2   -46.1
  G3   -30.99
  H1   -45.2
  H2   -20.6
(vii)在绵羊红细胞裂解测定法中的小鼠和人穿孔素的抑制(在1μM下使用的化合物)
使用小鼠穿孔素进行所有上述的穿孔素抑制剂的筛选。就其抑制作为对于小鼠和人穿孔素的响应的绵羊RBC裂解的能力同时检测下表中的化合物。
  小鼠穿孔素   人穿孔素
  化合物ID No.   ％在1μM时的裂解抑制
  93511   23.9   94.4
  96634   65.2   101.6
  99746   34.4   102.2
  53700   96.7   103.9
  35654   47.3   101.9
  34488   97.8   104.3
  34231   27.5   102.9
  32846   89.4   103.3
  17306   41.6   98.7
  46553   69.2   103.7
  88071   18.4   80.2
  82708   94.2   101.2
  77367   93.1   93.3
  75689   99.4   100.5
  62030   99.8   103.80
  57806   95.78   104.0
  34488   97.7   104.3
  E1   1.4   22.2
结果证明，每种化合物都能够抑制人穿孔素，其抑制能力近似等于或甚至稍大于对小鼠穿孔素的抑制能力。例如，化合物ID no.53700抑制小鼠穿孔素达96.7％的程度，和抑制人穿孔素达103.9％的程度。
然后选择化合物46553，并就其阻断穿孔素和粒酶B在诱导Jurkat细胞的凋亡中的协同作用的能力进行测定。结果证实抑制剂化合物46553完全阻断Jurkat细胞的凋亡(图32)。对于抑制剂化合物34231、77367和32846也已观察到类似的效果(此处未显示数据)。
最后，应当理解可产生各种其他的修饰和/或改变而不背离此处概括的本发明的精神。

Claims (62)

1.一种逆转录病毒载体，该载体能够在用所述载体转染的宿主细胞中驱动穿孔素分子或其片段或变体的表达。
2.权利要求1的逆转录病毒载体，其进一步包含编码穿孔素分子或其片段或变体的多核苷酸。
3.权利要求1或2的逆转录病毒载体，该载体来源于莫洛尼鼠白血病病毒、鼠干细胞病毒、脾坏死病毒、劳斯肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽类造白细胞组织增生病毒、长臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒。
4.权利要求3的逆转录病毒载体，其来源于鼠干细胞病毒(MSCV)。
5.权利要求4的逆转录病毒载体，其是pLXSN。
6.权利要求1至5中任一项的逆转录病毒载体，其中所述穿孔素分子是天然的穿孔素分子。
7.权利要求1至6中任一项的逆转录病毒载体，其中所述变体是由包含核酸缺失、插入和/或取代的多核苷酸序列编码的突变的穿孔素分子。
8.权利要求7的逆转录病毒载体，其中所述变体是由在患有噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)和/或家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(FHL)的个体中鉴定的多核苷酸序列编码的突变的穿孔素分子。
9.权利要求8的逆转录病毒载体，其中所述变体是由在患有FHL的个体中鉴定的多核苷酸序列编码的突变的穿孔素分子。
10.权利要求7的逆转录病毒载体，其中所述变体是由包含选自下列的突变的多核苷酸序列编码的突变的穿孔素分子：
i)3 G→A取代
ii)50 C缺失
iii)50 T插入
iv)116 C→A取代
v)133 G→A取代
vi)148 G→A取代
vii)160 C→T取代
viii)190 C→T取代
ix)207 C缺失
x)283 T→C取代
xi)445 G→A取代
xii)836 G→A取代
xiii)657 C→A取代
xiv)658 G→A取代
xv)662 C→T取代
xvi)671 T→A取代
xvii)673 C→T取代
xviii)694 C→T取代
xix)695 G→A取代
xx)755 A→G取代
xxi)781 G→A取代
xxii)836G→A取代
xxiii)853-855 AAG缺失
xxiv)1034 C→T取代
xxv)1083 G缺失
xxvi)1090-1091 CT缺失
xxvii)1122 G→A取代
xxviii)1182 T插入
xxix)1286 G→A取代
xxx)1304 C→T取代。
11.包含权利要求1至10中任一项的逆转录病毒载体的包装细胞。
12.权利要求11的包装细胞，其选自HEK 293、HEK 293T、TE671、HT1080、PG13(ATCC CRL-10686)、PG13/LNc8(ATCC CRL-10685)、PA317(ATCC CRL-9078)、美国专利号5,278,056中描述的细胞株系、GP+E-86(ATCC CRL-9642)、GP+envAm-12(ATCC CRL-9641)、293T、PE501、PA317.psi.-2、.psi.-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、.psi.CRE、.psi.CRIP、GP+E-86和GP+envAm12。
13.权利要求12的包装细胞，其是HEK 293细胞。
14.权利要求13的包装细胞，其是HEK 293T细胞。
15.包含权利要求1至10中任一项的逆转录病毒载体的逆转录病毒颗粒。
16.用权利要求1至10中任一项的逆转录病毒载体转染的细胞。
17.权利要求16的细胞，其是原核细胞或选自胚胎干细胞、胚胎癌细胞、造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质形成细胞、内皮细胞、支气管上皮细胞和免疫细胞的真核细胞。
18.权利要求15的细胞，其中所述免疫细胞选自嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和天然杀伤细胞。
19.权利要求18的细胞，其是嗜碱性粒细胞。
20.权利要求19的细胞，其是大鼠嗜碱细胞性白血病(RBL)细胞。
21.表达穿孔素分子或其片段或变体的方法，所述方法包括用权利要求1至10中任一项的逆转录病毒载体转染细胞。
22.表达穿孔素分子或其片段或变体的方法，所述方法包括将细胞暴露于权利要求15的逆转录病毒颗粒。
23.权利要求21或22的方法，其中所述穿孔素分子是天然的穿孔素分子。
24.权利要求21或22的方法，其中所述变体是由包含核酸缺失、插入和/或取代的多核苷酸序列编码的突变的穿孔素分子。
25.权利要求24的方法，其中所述变体是由在患有噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)和/或家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(FHL)的个体中鉴定的多核苷酸序列编码的突变的穿孔素分子。
26.权利要求25的方法，其中所述变体是由在患有FHL的个体中鉴定的多核苷酸序列编码的突变的穿孔素分子。
27.权利要求24的方法，其中所述变体是由包含选自下列的突变的多核苷酸序列编码的突变的穿孔素分子：
i)3 G→A取代
ii)50 C缺失
iii)50 T插入
iv)116 C→A取代
v)133 G→A取代
vi)148 G→A取代
vii)160 C→T取代
viii)190 C→T取代
ix)207 C缺失
x)283 T→C取代
xi)445 G→A取代
xii)836 G→A取代
xiii)657 C→A取代
xiv)658 G→A取代
xv)662 C→T取代
xvi)671 T→A取代
xvii)673 C→T取代
xviii)694 C→T取代
xix)695 G→A取代
xx)755 A→G取代
xxi)781 G→A取代
xxii)836 G→A取代
xxiii)853-855 AAG缺失
xxiv)1034 C→T取代
xxv)1083 G缺失
xxvi)1090-1091 CT缺失
xxvii)1122 G→A取代
xxviii)1182 T插入
xxix)1286 G→A取代
xxx)1304 C→T取代。
28.权利要求21至27中任一项的方法，其中所述细胞是原核细胞或选自胚胎干细胞、胚胎癌细胞、造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质形成细胞、内皮细胞、支气管上皮细胞和免疫细胞的真核细胞。
29.权利要求28的方法，其中所述免疫细胞选自嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和天然杀伤细胞。
30.权利要求29的方法，其中所述细胞是嗜碱性粒细胞。
31.权利要求30的方法，其中所述细胞是大鼠嗜碱细胞性白血病(RBL)细胞。
32.权利要求21至31中任一项的方法，其进一步包括分离所述表达的穿孔素分子或其片段或变体的步骤。
33.由权利要求32的方法产生的分离的穿孔素分子或分离的其片段或变体。
34.权利要求33的分离的穿孔素分子，其是天然的穿孔素分子。
35.权利要求33的分离的穿孔素分子，其中所述变体是由包含核酸缺失、插入和/或取代的多核苷酸序列编码的突变的穿孔素分子。
36.权利要求35的分离的变体穿孔素分子，其是由在患有噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)和/或家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(FHL)的个体中鉴定的多核苷酸序列编码的突变的穿孔素分子。
37.权利要求36的分离的变体穿孔素分子，其是由在患有FLH的个体中鉴定的多核苷酸序列编码的突变的穿孔素分子。
38.权利要求35的分离的变体穿孔素分子，其是由包含选自下列的突变的多核苷酸序列编码的突变的穿孔素分子：
i)3 G→A取代
ii)50 C缺失
iii)50 T插入
iv)116 C→A取代
v)133 G→A取代
vi)148 G→A取代
vii)160 C→T取代
viii)190 C→T取代
ix)207 C缺失
x)283 T→C取代
xi)445 G→A取代
xii)836 G→A取代
xiii)657 C→A取代
xiv)658 G→A取代
xv)662 C→T取代
xvi)671 T→A取代
xvii)673 C→T取代
xviii)694 C→T取代
xix)695 G→A取代
xx)755 A→G取代
xxi)781 G→A取代
xxii)836 G→A取代
xxiii)853-855 AAG缺失
xxiv)1034 C→T取代
xxv)1083 G缺失
xxvi)1090-1091 CT缺失
xxvii)1122 G→A取代
xxviii)1182 T插入
xxix)1286 G→A取代
xxx)1304 C→T取代。
39.鉴定调节穿孔素分子或其片段或变体的表达的化合物的方法，所述方法包括步骤：
提供权利要求16至20中任一项的细胞；
将所述细胞暴露于受试化合物；和
确定所述受试化合物是否调节穿孔素分子或其片段或变体在所述细胞中的表达。
40.权利要求39的方法，其中确定所述受试化合物是否调节穿孔素分子或其片段或变体的表达，包括这样的步骤，即将所述穿孔素分子或其片段或变体在所述细胞中的表达与所述穿孔素分子或其片段或变体在未被暴露于所述受试化合物的细胞中的表达进行比较。
41.鉴定调节穿孔素分子或其片段或变体的活性的化合物的方法，所述方法包括步骤：
提供权利要求33至38中任一项的分离的穿孔素分子或分离的其片段或变体；
将所述分离的穿孔素分子或分离的其片段或变体暴露于受试化合物和靶细胞；和
确定所述受试化合物是否调节所述穿孔素分子或其片段或变体对所述靶细胞的活性。
42.鉴定调节穿孔素分子或其片段或变体的活性的化合物的方法，所述方法包括步骤：
提供权利要求16至20中任一项的细胞，所述细胞表达穿孔素分子或其片段或变体；
将所述细胞暴露于受试化合物和靶细胞；和
确定所述受试化合物是否调节所述穿孔素分子或其片段或变体对所述靶细胞的活性。
43.权利要求41或42的方法，其中所述确定所述受试化合物是否调节所述穿孔素分子或其片段或变体对所述靶细胞的活性的步骤包括这样的步骤，即将所述穿孔素分子或其片段或变体对所述靶细胞的活性与所述穿孔素分子或其片段或变体对未暴露于所述受试化合物的靶细胞的活性进行比较。
44.权利要求43的方法，其中穿孔素分子或其片段或变体对靶细胞的活性鉴定为所述穿孔素分子或其片段或变体裂解所述靶细胞的能力。
45.由权利要求39至44中任一项的方法鉴定的化合物。
46.由权利要求39或40的方法鉴定的化合物，其中所述化合物能够抑制穿孔素分子或其片段或变体在细胞中的表达。
47.权利要求39或40的方法鉴定的化合物，其中所述化合物能够增加穿孔素分子或其片段或变体在细胞中的表达。
48.权利要求41至44中任一项的方法鉴定的化合物，其中所述化合物能够抑制穿孔素分子或其片段或变体对细胞的活性。
49.权利要求41至44中任一项的方法鉴定的化合物，其中所述化合物能够增强穿孔素分子或其片段或变体对细胞的活性。
50.抑制穿孔素分子或其片段或变体在细胞中的表达的方法，所述方法包括将所述细胞暴露于权利要求46的化合物。
51.增加穿孔素分子或其片段或变体在细胞中的表达的方法，所述方法包括将所述细胞暴露于权利要求47的化合物。
52.抑制穿孔素分子或其片段或变体对细胞的活性的方法，所述方法包括将所述细胞暴露于权利要求48的化合物。
53.增强穿孔素分子或其片段或变体对细胞的活性的方法，所述方法包括将所述细胞暴露于权利要求49的化合物。
54.包含权利要求33至38中任一项的穿孔素分子或其片段或变体以及药学上可接受的媒介物、赋形剂、稀释剂和/或佐剂的药物组合物。
55.包含权利要求46的化合物和药学上可接受的媒介物、赋形剂、稀释剂和/或佐剂的药物组合物。
56.包含权利要求47的化合物和药学上可接受的媒介物、赋形剂、稀释剂和/或佐剂的药物组合物。
57.包含权利要求48的化合物和药学上可接受的媒介物、赋形剂、稀释剂和/或佐剂的药物组合物。
58.包含权利要求49的化合物和药学上可接受的媒介物、赋形剂、稀释剂和/或佐剂的药物组合物。
59.治疗受试者的预防性或治疗性方法，所述受试者具有患与不希望的穿孔素表达和/或活性相关的疾病的风险或对所述疾病易感，或者患有所述疾病，所述方法包括给所述受试者施用治疗有效剂量的权利要求46或48的化合物的步骤。
60.治疗受试者的预防性或治疗性方法，所述受试者具有患与不希望的穿孔素表达和/或活性相关的疾病的风险或对所述疾病易感，或者患有所述疾病，所述方法包括给所述受试者施用治疗有效剂量的权利要求47或49的药物组合物的步骤。
61.权利要求59的预防性或治疗性方法，其中所述疾病选自青少年糖尿病(I型或胰岛素依赖型)、移植物抗宿主病、慢性或急性同种异体移植排斥以及与细胞毒性T淋巴细胞介导的免疫病理学相关的疾病。
62.权利要求60的预防性或治疗性方法，其中所述疾病选自病毒感染(例如人免疫缺陷病毒(HIV)和丙型肝炎)、癌症(例如淋巴瘤)、结核病以及与穿孔素缺乏相关的病状，例如HLH和FHL。
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