KR20150023287A - 침습성 및 다중약물 내성 병원체에 대한 퍼포린 2 방어 - Google Patents

침습성 및 다중약물 내성 병원체에 대한 퍼포린 2 방어 Download PDF

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Abstract

퍼포린-2 (P2)는 섬유아세포, 미세아교세포 및 마크로파지에 의해 발현되고 박테리아, 예를 들어, 미코박테리아 스메그마티스, 미코박테리움 아비움, 살모넬래, MRSA (약물 내성 스타폴로콕키), 대장균을 살해하는 원인이 있는 것으로 발견되었다. 스크리닝 분석에 의해 확인된 화합물은 P2에 대한 이 화합물들의 효과에 기초하여 선택된다. 감염성 질환, 특히, 박테리아 및 항생제-내성 박테리아의 치료시 화합물의 사용이 또한 제공된다.

Description

침습성 및 다중약물 내성 병원체에 대한 퍼포린 2 방어{PERFORIN 2 DEFENSE AGAINST INVASIVE AND MULTIDRUG RESISTANT PATHOGENS}
EFS - WEB 을 통해 텍스트 파일로 제출된 서열 목록에 대한 참조
서열 목록의 공식적인 사본은 EFS-Web을 통해 텍스트 파일로서 명세서와 동시에 제출되는데, 미국 정보 교환용 표준 코드 (American Standard Code for Information Interchange; ASCII)에 따르며, 파일명은 430333seqlist.txt이고, 생성일은 2013년 3월 12일이며 크기는 2 KB이다. EFS-Web에 등록된 서열 목록은 명세서의 일부이며 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
연방 자금 지원의 진술서
본 발명은 보조금 번호 CA109094 하에 정부 지원으로 이루어졌으며, 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 수여된다. 정부는 본 발명의 일부 권리를 갖고 있다.
본 발명의 분야
본 발명은 항생제, 및 신약 개발의 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 그것은 미생물 감염에 대한 신체의 자연 방어를 강화시키는데 유용한 방법 및 화합물에 관한 것이다.
퍼포린은 CD8 T-세포 및 NK 세포의 과립에서 발견된 세포 용해 단백질이다. 탈과립 시, 퍼포린은 스스로 표적 세포의 원형질 막으로 삽입되어, 구멍을 형성한다. 발명자의 실험실 (Lichtenheld, M. G., et al., 1988. Nature 335:448-451; Lowrey, D. M., et al., 1989. Proc Natl Acad Sci USA 86:247-25 1) 및 Shinkai et al (Nature (1988) 334:525-527)에 의한 퍼포린의 클로닝은 보체 성분 C9 및 퍼포린의 가상의 상동성을 확립하였다 (DiScipio, R. G., et al., 1984. Proc Natl Acad Sci USA 81:7298-7302).
퍼포린-1 및 퍼포린-2 (P2) 둘 다는 친수성, 수용성 전구체로서 합성된 구멍 형성자이다. 둘 다는 지질 이중층으로 삽입되고 이것의 내부에서 폴리머화되어 막을 스패닝(spanning)하는 큰 물이 채워진 구멍을 형성한다. 물이 채워진 구멍은 원통형 단백질-폴리머에 의해 만들어진다.
원통의 내부는 물이 채워진 구멍을 형성하기 때문에 친수성 표면을 가져야 하는 한편 원통의 외부는 지질 코어 내에 고정되기 때문에 소수성일 필요가 있다. 이 구멍 구조는 양친매성 나선 (나선 대 나선(helix turn helix))에 의해 형성되는 것으로 생각된다. 그것은 MAC-Pf (막 공격 복합체(membrane attack complex)/퍼포린) 도메인으로도 불리는 단백질 도메인의 일부이며, 이것은 대부분 퍼포린 및 C9 사이에 보존되고 다른 보체 단백질은 보체의 막 공격 복합체 (MAC)를 형성한다.
MAC/Pf 도메인을 가진 단백질을 예측하는 사람 및 쥐 마크로파지(macrophage)에서 발현된 mRNA (Mpg 1 또는 Mpeg 1-마크로파지 발현된 유전자로도 불림)는 처음에 Spilsbury (Blood (1995) 85:1620-1629)에 의해 설명되었다. 그 후에, 같은 mRNA (MPS-1로 명명됨)가 실험적 프리온 병(prion disease)에서 상향조정되는 것이 발견되었다. Desjardin의 그룹은 2D-겔 전기영동 및 질량 분석기에 의해 라텍스 비드가 공급된 마크로파지로부터 분리된 단백질 조성물을 분석하였다 (J Cell Biol 152:165-180, 2001). 저자들은 MPS-1 단백질에 해당하는 단백질 스폿을 발견하였다. Mah et al은 전복 연체동물(abalone mollusk)을 분석하였고 Mpeg1 유전자 패밀리에 상동성인 혈액에서 mRNA를 발견하였고 (Biochem Biophys Res Commun 316:468-475, 2004) 예측된 단백질이 CTL 퍼포린과 유사한 기능을 갖지만 그것은 연체동물의 선천적 면역 시스템의 일부라고 제안하였다.
본원에서 설명된 것들은 P2 발현 또는 활성의 조정에 관련된 조성물 및 방법이며, 미생물 감염의 치료에 유용한 것들을 포함한다.
도 1A-1C는 퍼포린-2가 ROS 및 NO의 살균 효과를 향상시킨다는 것을 나타낸다. 세포 내 살해는 10mM NAC로 ROS를, 10mM L-NAME로 NO를, 또는 3개의 P2-특이적 siRNA의 풀(pool)로 P2를 차단함으로써 억제되었다. 겐타마이신 보호 검정은 도 2A-2F에서와 같이 수행되었다. P-2 siRNA 또는 스크램블된(scrambled) siRNA로 트랜스펙션 후 24시간에, PEM은 (도 1A) 대장균(E. coli), (도 1B) 살모넬라 티피뮤리움(S. typhimurium), 또는 (도 1C) 미코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis)로 감염되었다. 억제자들은 감염 후 1시간에 추가되었고 검정에 걸쳐 유지되었다. 세포는 용해되었고 CFU는 감염 후 1시간 및 5시간에 결정되었다. 나타난 데이터는 2번의 복제로 3번의 실험을 나타낸다; 별표는 스튜던트 t-테스트(students t-test)에 기초한 유의성 (p<0.05)을 표시한다.
도 2A-2F는 퍼포린-2가 구멍-형성 단백질이라는 것을 나타낸다. (도 2A) P-2의 도메인 구조; TM, 막관통 도메인; Cyto, 세포질 도메인. 폴리머화된 퍼포린-2 막 병변의 전자 현미경 사진을 중성 Na 포스포텅스텐산으로 음성 염색하였다. (도 2B) 막-결합된, 폴리머화된 P-2의 개요. 내부 지름이 9.2nm인 염료가 채워진 구멍을 주목해야 한다. (도 2C) 높은 배율의 불완전 폴리머화된 복합체 (화살표). (도 2D) 화살표는 3차원 형태를 기술하는 사위면(oblique view)에서 폴리-P2 복합체의 극사위면(rare oblique view)을 가리킨다 (도 2E, 2F). 막-결합된 폴리-P2의 두 가지 타입의 측면도. (도 2G) 도 2A의 퍼포린-2와 같은 배율과 비교되는 유라닐 포르메이트로 염색된 CTL3의 막-결합된 퍼포린-1 (P-1); P-2 (9.2nm)와 비교하여 P-1에서 더 큰 지름의 구멍 (16nm)을 주목해야 한다.
도 3A-3I는 퍼포린-2가 마크로파지 및 미세아교세포에서 세포 내 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (intracellular methicillin-resistant S. aureus; MRSA), 살모넬라 티피뮤리움, 미코박테리움 아비움 (M. avium ), 미코박테리움 스메그마티스, 및 대장균을 살해한다는 것을 나타낸다. 세포는 방법에서 지시된 바와 같이 감염되었고, 잔류 세포 외 박테리아를 제거하기 위해 세척되었고, 겐타마이신이 추가되었다. 세포 내 생존율을 지시된 시간에 세포의 용해 및 콜로니 형성 유닛 (CFU)의 결정에 의해 측정되었다 (도 3A-3D): RAW, PEM 및 BV-2 미세아교세포에서 P-2의 P-2 siRNA 풀 넉다운(knockdown)은 그렇지 않으면 살해되는 병원성 박테리아의 세포 내 생존을 허용한다 (도 3E): P-2의 넉다운, P-2 siRNA 처리를 허용하는 RAW 세포에서 P-2 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석 (도 3F 및 3G): P-2-RFP 융합 단백질의 과발현은 벡터 대조군에 비해 박테리아의 향상된 살해로 이어진다 (도 3H): 내인성 P-2의 넉다운 및 마크로파지에서 P-2-RFP 융합 단백질 보충은 미코박테리움 스메그마티스에 대한 살해 활성을 회복시킨다. (도 3I): RAW 세포에서 P-2-보충 검정으로 P-2 및 P-2-RFP 발현의 웨스턴 블롯 분석. 나타난 그래프는 3번의 복제로 3번 이상의 실험을 나타낸다. 별표는 스튜던트 t-테스트를 하용하여 결정된 바와 같이 유의한 (p<0.05) 차이를 나타낸다.
도 4A-4D는 마크로파지에서 세포 내 퍼포린-2-GFP 배치를 나타낸다. RAW 세포는 P-2-GFP로 트랜스펙션되었고 24시간 후 고정되었고 다양한 세포 기관에 대하여 염색되었다. P-2-GFP는 ER (도 4A) 및 골지 막 및 트랜스-골지망(Golgi network) (도 4B)과 같은 곳에 배치되지만, 원형질 막 (도 4C) 또는 리소솜 (도 4D)은 아니다. 이미지의 하단 패널은 오버레이(overlay)에서 및 단색 이미지로서 지시된 섹션을 나타낸다. 동시 배치는 오버레이에서 노란색으로 나타난다.
도 5A, 5B는 RNA 및 단백질 수준에서 P-2 넉다운의 정량을 나타낸다. siRNA는 스크램블 대조군과 비교하여 도 5A, RAW 세포 및 도 5B, PEM에서 P2의 넉다운을 매개하였다. 막대 그래프는 정량적 Taqman™ RT-PCR에 의해 결정된 각 세포 타입에서 P-2 상대적 mRNA 발현을 나타낸다. P-2 mRNA 수준은 GAPDH로 표준화되었다. 웨스턴 블롯 분석은 단백질 수준이 치료된 샘플에서 mRNA 수준에 해당한다는 것을 나타낸다. 세포는 트랜스펙션 후 24시간에 분석을 위해 수확되었다.
도 6은 ROS 및 NOdml 억제자가 박테리아 성장을 직접적으로 억제하지 않는다는 것을 나타낸다. 대장균, 살모넬라 티피뮤리움 및 미코박테리움 스메그마티스는 NAC (10mM) 또는 L-NAME (10mM)의 존재시 또는 부재시 IMDM+10%FBS에서 5시간 동안 배양되었다. 박테리아 성장은 OD 600nM에서 분광광도계에 의해 배양 배지에 억제자의 추가 후 1시간 및 4시간에 측정되었다.
도 7은 퍼포린-2의 계통 발생학적 보존을 나타낸다. 여러 종 (Vector NTI, Invitrogen)의 예측된 단백질 서열의 정렬. MACPF 및 P-2 도메인은 박스로 둘러싸여 있고, 막관통 도메인이 박스로 둘러싸여 있고 노란색으로 강조된다. 세포질 도메인에서 보존된 티로신 및 세린은 각각 분홍색 및 회색으로 강조된다. 빨간 글씨체 및 노란 강조부분은 모든 종의 동일성을 지시하고, 파란 강조부분은 넷 이상의 서열의 동일성을 지시하며, 녹색은 보존적 대체를 지시한다.
도 8은 P-2-GFP 트랜스펙션 및 단백질 발현의 입증을 나타낸다. 293 세포에서 트랜스펙션된 P-2-GFP 발현의 웨스턴 블롯 분석; P-2-GFP는 P-2의 세포질 도메인 (P-2 cyto)에 대하여 발생된 다클론성 항혈청, 상업적 펩티드 항혈청 (P-2 Abcam), 및 항-GFP 항체을 사용하여 검출되었다. P-2-GFP는 대략 110 kD의 예상된 크기로 이동하였다.
도 9A-9D는 P-2가 마크로파지, 수지상세포 및 미세아교세포 및 세포주에서 세포 내 살균 활성을 매개한다는 것을 나타낸다. BMDM/DC는 GM-CSF의 존재시 10일 동안 골수로부터 분화되었고 그 다음에 48시간 동안 (도 9A) LPS (1mg/ml) 및 IFNα (100U/ml) 또는 (도 9B) 폴리(I:C) (3mg/ml)로 자극되었다. (도 9C) BV2 미세아교세포는 24시간 동안 IFNα(100U/ml)로 자극되었다. (도 9D) RAW 세포는 24시간 동안 LPS (1ng/ml) 및 IFNγ (100U/ml)로 자극되었다. 세포는 지시된 시점에 수확되었고 GAPDH에 비해 Taqman™ RT-PCR에 의해 P-2 메시지 발현(message expression)을 분석하였다.
도 10A-10E는 P2의 넉다운이 세포 내 살균 활성을 억제한다는 것을 나타낸다 (도 10A-10C). P-2 siRNA (쇄선 막대) 또는 스크램블 siRNA 대조군 (단일 검은색 막대)이 처리된 RAW 세포는 MOI 10에서 각각 미코박테리움 스메그마티스, MRSA, 및 살모넬라 티피뮤리움으로 감염되었다. (도 10D 및 10E) PEM 및 BMDM/DC는 P2 siRNA 또는 스크램블 siRNA 대조군이 처리되었고 MOI 10에서 미코박테리움 스메그마티스로 감염되었다. 살아있는 세포 내 박테리아는 겐타마이신 보호 검정으로 결정되었고 지시된 시점에 CFU 검정에 의해 열거되었다. 나타난 그래프는 세포: 박테리아 조합 당 적어도 3번의 실험을 나타낸다. 오차 막대는 2-3번 복제의 s.e.m.을 나타낸다. 별표는 스튜던트 t-테스트를 사용하여 유의한 차이를 나타낸다.
도 11A-11F는 P-2-RFP의 과발현이 세포 내 살해 활성을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 지시된 세포는 P-2-RFP 융합 단백질 (검은색 막대)을 함유하는 벡터 또는 대조군 빈 벡터 (마름모 막대)로 트랜스펙션되었고 재료 및 방법에서 설명된 바와 같이 MOI 10에서 지시된 박테리아로 감염되었다. 살아있는 박테리아는 지시된 시점에 CFU 검정에 의해 열거되었다. 나타난 그래프는 세포:박테리아 조합 당 적어도 3번의 실험을 나타낸다. 오차 막대는 2-3번 복제의 s.e.m.을 나타낸다. 별표는 스튜던트 t-테스트를 사용하여 유의한 차이를 나타낸다.
도 12A, 12B는 내인성 P-2 넉다운된 세포로의 P-2-RFP 트랜스펙션이 세포 내 살균 활성을 회복한다는 것을 나타낸다. 도 12A, BMDM/DC 또는 도 12B, RAW 세포는 siRNA targeting the P-2의 3' UTR을 표적화하는 siRNA 및 P-2-RFP 융합 단백질을 함유하는 벡터 또는 빈 벡터 단독으로 동시-트랜스펙션되었고 재료 및 방법에서 설명된 바와 같이 지시된 박테리아로 감염되었다. 빨간 선은 RFP 벡터 대조군과 비교하여 세포 내 박테리아 생존에 대한 P2RFPDML 효과를 지시하고 검은 선은 같은 실험 내에서 스크램블된 siRNA 대조군과 비교하여 박테리아 생존에 대한 P2 siRNA 처리 (3' UTR 단독 표적화)의 효과를 나타낸다. 오차 막대는 2-3번 복제로 3-4번의 개개의 실험의 s.e.m.을 나타낸다.
도 13A-13C는 P-2가 핵의 초기 엔도솜(endosome) 마커와 동시-배치되지 않는다는 것을 나타낸다. (도 13A) RAW 세포에 일시적으로 트랜스펙션되고 발현된 P2-GFP (왼쪽 패널) 및 GFP (오른쪽 패널)의 차등적 염색 패턴. P-2-GFP는 (도 13B) 초기 엔도솜 (EEA-1, 빨간 색) 또는 (도 13C) 핵 (Hoechst, 빨간 색)과 동시-배치되지 않는다. 이미지는 Leica SP5 역상 공초점 현미경(inverted confocal microscope) 및 40X 내물렌즈를 사용하여 촬영되었다.
도 14A-14J는 타입 1-및 타입 2-인터페론에 의해 상향조정된다. 쥐 배아 섬유아세포 (도 14A), 직장암 세포주 (도 14B), 근아세포 세포주 (도 14C), 및 난소 세포주 (도 14D)에 14시간 동안 100 U/ml 인터페론-α, 인터페론-β 및 인터페론-γ가 처리되었다. LPS는 1 ng/ml로; IL-1α는 10 U/ml로, IL-1β는 1 ng/ml로, 및 TNFα는 20 ng/mL로 처리되었다. 인간 배아 신장 세포주 (도 14E) 및 자궁경부암 세포주 (도 14F)에 인간 IFN-α가 150 U/ml로, IFN-β 및 IFN-γ는 100 U/ml로 처리되었다. BV2 미세아교세포 세포주는 P-2 mRNA 및 단백질을 상향조정하기 위해 14시간 동안 100 U/ml의 쥐 인터페론-γ로 자극되었다. 14시간 동안 IFN-γ 처리된 mEF (mEF), 또는 14시간 동안 IFN-γ 처리 후 1시간 동안 25 mM MG-132로 처리된 mEF (mEF+MG132) (도 14G). 인간 1차 케라틴 생성 세포는 지시된 재조합 인간 IFN 처리로 단백질 발현이 분석되었다 (도 14H). mEF는 대장균 또는 미코박테리움 스메그마티스와 함께 처리되었다. 지시된 시점에서, 세포가 수확되었고 P-2 mRNA에 대하여 분석되었고 Taqman™ PCR에 의해 감염되지 않은 대조군과 비교하였다 (도 14I). mEF는 자극되지 않거나, 100 U/ml의 IFN-α로 14시간 동안 자극되었다. 자극 후, mEF는 미코박테리움 스메그마티스로 감염되었고 지시된 시점에 콜로니 형성 유닛에 대하여 분석되었다.
도 15A-15F는 박테리아의 폴리-퍼포린-2 구멍을 나타낸다. mEF에 14시간 동안 쥐 인터페론-α가 처리되었고, 그 다음 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (도 15A, 15B) 또는 미코박테리움 스메그마티스 (도 15D, 15E)으로 감염되었다. 감염 5시간 후, mEF는 세제로 용해되었고, 온전한 박테리아가 수확되었고 투과 전자 현미경 검사를 위해 음성 염색하였다. P-2 cDNA를 과발현하는 HEK293 세포막은 양성 대조군의 역할을 하도록 가공되었다 (도 15C). 대장균의 보체 구멍의 막 공격 복합체 (MAC)는 comparison19에 대하여 나타난다 (도 15F).
도 16A-16L은 내인성 퍼포린-2의 넉다운이 세포 내 박테리아 성장을 향상시킨다는 것을 나타낸다. 마우스 직장암 CMT-93은 P-2 siRNA 풀, 또는 P-2-RFP로 일시적으로 트랜스펙션되었다. 스크램블 siRNA 또는 RFP가 또한 트랜스펙션되었고 각각 P-2 siRNA 및 P-2-RFP에 대한 대조군의 역할을 하는 것으로 분석되었다. 모든 트랜스펙션은 감염 전 24시간에 수행하였다. 감염 전 14시간에, 세포는 100U/ml의 종 특이적 IFN-γ와 함께 배양되었다. 감염 후 지시된 시점에서, 세포가 용해되었고 CFU 분석을 위해 배치되었다. (도 16A-16D) mEF는 감염 전 24시간에 P-2 siRNA로 트랜스펙션되었고 siRNA 내성 P-2-RFP cDNA로 보충되었다. 감염 전 14시간에, 인터페론-α이 추가되었다. mEF는 늦은 로그 단계 살모넬라 티피뮤리움으로 감염되었다. 지시된 시점에서, mEF는 용해되었고 콜로니 형성 유닛에 대하여 분석되었다. 마우스 성상세포 (도 16F), 인간 췌장암 (도 16G), 인간 방광암 (도 16H), 마우스 근아세포 (도 16I), 인간 자궁경부암 (도 16J), 마우스 난소암 (도 16K), 인간 탯줄 정맥 내피 세포 (도 16L)는 감염 전 24시간에 종 특이적 P-2 siRNA 또는 스크램블 siRNA로 트랜스펙션되었고, 감염 전 14시간에 종 특이적 IFN-γ로 자극되었다. 세포는 지시된 박테리아로 감염되었고 CFU 결정을 위해 지시된 시점에서 용해되었다.
도 17A-17J는 P-2가 리소자임에 대한 세포 내 박테리아의 민감도를 증가시킨다는 것을 나타낸다. (도 17A-17C) Middlebrook 7H11 한천 플레이트상에 플레이팅된(plated) 미코박테리움 스메그마티스 미세콜로니의 위상 광학 현미경 (50x 배율)에 의해 촬영된 대표 이미지. (도 17A) mEF와 함께 배양 전 플레이팅된 미코박테리움 스메그마티스 (도 17B) IFN-γ로 5시간 감염 후 플레이팅된 미코박테리움 스메그마티스가 얼음 위에서 30분 대조군 (리소자임 없음) 배양으로 mEF를 사전 활성화하였다. (도 17C) IFN-γ로 5시간 감염 후 플레이팅된 미코박테리움 스메그마티스는 mEF 용해 후 얼음 위에서 30분 리소자임 배양으로 mEF를 사전 활성화하였다. (도 17D) 미코박테리움 스메그마티스로 감염된 mEF에 대한 리소자임 정량, 퍼센트는 5시간 감염에서 각 플레이팅된 샘플로부터 유래된다. 결과는 각 실험에서 기술적 복제로의 5번의 실험으로 구성된다. 1000개의 박테리아가 계수되었고 볼록하고 정상적인 형태 사이가 구별되었고 볼록함의 퍼센트가 보고된다. (도 17E-17G): mEF는 스크램블 siRNA (도 17E), P-2 siRNA (도 17F), 및 P-2-RFP (도 17G)로 감염 전 24시간에 트랜스펙션되었고 14시간 동안 IFN-α로 자극되었고, 그 다음 MRSA로 감염되었다. 지시된 시점에서, 진핵세포가 용해되어 세포 내 박테리아를 수확하였고 6개의 동일한 분획으로 나누어졌다. 박테리아 용해물의 이 동일한 분획들로부터, 절반에 리소자임이 처리되었고 나머지에는 버퍼가 제공되었다. 리소자임 활성을 허용하기 위해 얼음 위에서 30분 처리 후, 박테리아가 배치되어 리소자임의 효과를 분석하였다. (도 17H-17J) 마우스 직장암 세포주, CMT-93은 스크램블 siRNA (도 17H), P-2 siRNA (도 17I), 또는 P-2-RFP (도 17J)로 일시적으로 트랜스펙션되었고 IFN-γ로 자극되었다. 처리 후, 이 세포들은 미코박테리움 스메그마티스로 감염되었다. 지시된 시점에서, 진핵세포들은 용해되었고 리소자임-매개된 살해에 대하여 분석되었다.
도 18A-18I는 P-2가 인간 및 마우스 조직에서 타입 1-및 타입 2-인터페론으로 유도 가능하다는 것을 나타낸다. (도 18A-18D) 쥐 P-2 mRNA 전사물은 결장 세포암 (도 18A), 흑색종 (도 18B), 1차 뇌막성 섬유아세포 (도 18C), 1차 성상세포 (도 18D)에서 타입 1 및 타입 2 인터페론 처리 후 유도 가능하다. (도 18E-18I) 방광암 (도 18E, 18F), 췌장암 (도 18G), 1차 케라틴 생성 세포 (도 18H), 및 탯줄 정맥 내피 세포 (도 18I)에서 타입 1-및 타입 2-인터페론 처리 후 인간 P-2 mRNA의 유도.
도 19A-19G는 P-2 siRNA로 mRNA 넉다운의 효능을 나타낸다. P-2 전사는 ㄷ다음 조건에 대하여 측정되었다: 트랜스펙션 하지 않음, P-2 siRNA 트랜스펙션, 또는 스크램블 siRNA. 모든 세포들은 14시간 동안 100U/ml의 IFN-γ로 자극되었다 (도 19A-19D). 다음 마우스 라인은 siRNA 처리 후 P-2 넉다운의 대표적인 샘플링(sampling)이다. 이것들은 mEF (도 19A), 직장암 (도 19B), 뇌막성 섬유아세포 (도 19C), 및 성상세포 (도 19D)를 포함한다. 게다가, 다음 인간 세포주는 또한 인간 P-2 특이적 siRNA를 사용하여 P-2 전사 넉다운의 대표적인 샘플링의 역할을 할 것이다. 이것들은 HUVEC (E), 췌장암 (도 19F), 및 방광암 (도 19G)을 포함한다. ￥는 P-2 전사물이 45 주기 동안 qRT-PCR에 의해 검출되지 않았다는 것을 지시한다.
도 20A, 20B는 진핵세포를 살해하는 방해받지 않는 세포 내 박테리아 복제를 허용한다. 트리판 블루 제외에의 해 결정된 바와 같이 미코박테리움 스메그마티스로의 감염 후 완전히 살아있는 세포의 계수 (도 20A) 및 siRNA-처리된 mEF의 생존력 (도 20B). 데이터는 4번의 개개의 실험으로부터 나타난다.
도 21A-21AF는 퍼포린-2 넉다운이 다양한 세포 타입에서 세포 내 박테리아 성장을 향상시킨다는 것을 나타낸다. 다음 세포들은 감염 전 24시간에 P-2 siRNA 또는 스크램블 siRNA로 일시적으로 형질전환되었다: (도 21A-21C) 쥐 C2C12 근아세포, (도 21D-21F) 쥐 난소 MOVAC 5009, (도 21G-21I) 사람 HeLa 자궁암, (도 21J-21L) 사람 탯줄 정맥 내피 세포 (HUVEC), (도 21M-21P) 쥐 난소 MOVAC 5447, (도 21Q-21T) CT-26 결장암, (도 21U-21X) 쥐 B16F10 흑색종 (도 21Y-21AB) 인간 MIA-PaCa-2 췌장암, (도 21AC-21AF) 인간 UM-UC-9 방광암. 감염 전 14시간에, 세포들은 100U/ml의 종-특이적 IFN-γ으로 배양되었다. 감염 후 지시된 시점에서, 세포가 용해되고 CFU 분석을 위해 플레이팅되었다.
도 22A-22C는 P-2 상보성은 내인성 P-2의 넉다운의 넉다운으로 세포에서 살해 활성을 회복시킨다는 것을 나타낸다. P-2 siRNA로 트랜스펙션된 및 siRNA 내성 P-2 cDNA로 동시-트랜스펙션된 mEF 세포는 (도 22A) 미코박테리움 스메그마티스, (도 22B) 대장균, 및 (도 22C) MRSA에 대한 살해 활성을 회복시킬 수 있다.
도 23A-23C는 리소자임 단독은 CFU를 감소시키지 않는다는 것을 나타낸다. MRSA (도 23A), 대장균 (도 23B), 및 미코박테리움 스메그마티스 (도 23C)에 리소자임의 효과에 대한 이 각각의 박테리아의 민감도를 결정하기 위해 처리되었다. 세 번의 별개의 실험은 리소자임의 추가와 함께, 또는 하지 않고, 30분 동안 얼음 위에서 배양 전 및 후 CFU 계수로 나타난다.
도 24A-24L은 리소자임이 퍼포린-2의 살균 활성을 향상시킨다는 것을 나타낸다. 퍼포린-2은 상기 무반응 박테리아에서 리소자임의 살균 활성을 조정할 수 있다. 리소자임의 증가된 활성은 대장균으로 감염된 mEF (도 24A-24C), 미코박테리움 스메그마티스로 감염된 mEF (도 24D-24F), 대장균으로 감염된 CMT-93 (도 24G-24I), 및 MRSA로 감염된 CMT-93에 대하여 나타난다.
도 25A-C는 P-2 결핍이 제어되지 않은 및 치명적인 박테리아 성장으로 이어진다는 것을 나타낸다. (a) P-2+/+(), P2-/-() 및 P-2+/-() 한 배 새끼의 하루에 한 번 중량 측정. 마우스는 20mg 스트렙토마이신을 받았고 24시간 후 구강-위 위관 영양법에 의해 105 또는 102 살모넬라 티피뮤리움 RL144를 받았다. n=10 및 15 (분석: 각 열에 대하여 다중 언페어드(unpaired) t-테스트). (b) 장에서 혈액, 간 및 비장으로 살모넬라 티피뮤리움의 전염 (분석: 크러스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 테스트). (c) siRNA P-2 넉다운 PEM ()과 비교하여 유전적 P2-/-PEM ()에서 살모넬라 티피뮤리움의 제어의 부족; 재료 및 방법에서 설명된 CFU 검정 (분석: 언페어드 t-테스트).
도 26A-F는 P-2가 보편적으로 발현되고 살모넬라 티피뮤리움, 미코박테리움 스메그마티스 및 아비움, 및 MRSA에 대하여 살균성이라는 것을 나타낸다. (a). 인간 혈액의 PMN 및 마크로파지의 웨스턴 블롯 분석 및 siRNA 처리된 HL60-유래된 PMN의 CFU 검정. P-2 특이적 () 및 스크램블 대조군 () siRNA 트랜스펙션된 HL60/PMN 세포는 지시된 박테리아로 감염되었고 방법에서 설명된 바와 같이 지시된 시간에 CFU 분석되었다. (b) 지시된 바와 같이 박테리아 감염 후 IFN-유도된 장 상피 CMT93 세포의 CFU 검정. 세포는 P-2 특이적 () 또는 스크램블 대조군 ()에 대하여 siRNA로 및 P-2-RFP () 또는 RFP ()에 대하여 플라스미드-cDNA로 트랜스펙션되었고 감염 전 IFN-γ로 하룻밤 동안 자극되었다. (c) (d) 1차 인간 탯줄 내피 세포 (HUVEC) 또는 자궁 상피 세포 (HeLa)에서 IFN-γ에 의해 유발된 P-2는 미코박테리움 스메그마티스를 살해한다 (및 다른 박테리아-미도시). (e) P-2-RFP 트랜스펙션에 의해 RAW 마크로파지로부터 미코박테리움 아비움의 완전한 제거 (f) MEF에서 내인성 P-2 넉다운의 P-2-RFP로의 보충. 트랜스펙션된 P-2 siRNA 및 P-2-RFP 및 IFN-γ 활성화된 MEF에 이어서 살모넬라로 감염의 CFU 검정 및 웨스턴 블롯 분석; P-2 siRNA+RFP (), P-2 siRNA+P-2-RFP (), 및 스크램블 siRNA+RFP (). t-테스트에 의한 통계분석.
도 27A-E는 박테리아가 P-2를 차단하기 위한 메커니즘을 갖고 있다는 것을 나타낸다. (a) 살모넬라는 나이브(naive) MEF에서 P-2 mRNA 유발을 차단한다 (IFN에 의해 활성화되지 않음). 지시된 살모넬라 및 대장균 균주로 감염 후 상대적 P-2 mRNA 수준. (b) 클라미디아 트라코마티스(C. trachomatis)는 HeLa 세포에서 P-2 mRNA 발현의 IFN-매개된 유발을 차단한다. 클로람페니콜 (Cm) 처리된 클라미디아(chlamydiae)는 P-2 mRNA를 유발한다. 데이터는 3배수 샘플의 평균 ± 표준 편차로 나타난다. (c) 장변원성 대장균 (EPEC)은 그것들이 CIF 플라스미드를 운반하면 P-2 매개된 살해를 차단한다. (d) P-2 메시지 수준 진피 및 표피는 미-치유성 만성 궤양의 모서리로부터 잘라낸다. 피부 샘플은 만성 피부 궤양에 대하여 인접한 절반 및 먼 절반으로 나누어지고, 인접한 P-2 mRNA 수준 대 먼 P-2 mRNA 수준의 비율이 묘사된다. t-테스트에 의한 통계분석; n=10.
도 28A-D는 P-2가 박테리아-함유 액포로 위치 이동한다는 것을 나타낸다. (a). 단백질 도메인 구조, 막 소낭 내 P-2의 예측된 막관통 배향, 및 포유동물 종에서 세포질 도메인의 서열 보존. (b) P-2 siRNA의 대표적 공초점 이미지 및 살모넬라로 감염 후 5분에 일시적으로 P-2-GFP (녹색) 트랜스펙션된 BV2; DAPI에 의해 염색된 DNA, 적외선 색, 흰색으로 나타남. 전체 세포를 나타내는 1.2m의 세 개의 수직 슬라이드가 나타난다. (c) P-2 siRNA의 대표적 공초점 이미지 및 일시적으로 P-2-RFP 트랜스펙션된 BV2 미세아교세포는 5분 동안 대장균-GFP (녹색)로 감염되었고, 그 다음 고정되고 이미지화되었다. (d) 감염되지 않은 세포에서 P-2-GFP의 핵 주위 배치; 형광 발광 및 해당 단계 이미지가 나타난다.
도 29A-C는 퍼포린-2에 의한 기공 형성을 나타낸다. (a) Hek-293 막에서 폴리-P-2 구멍의 전자 현미경 사진. 흰색 화살표는 9.2 ± 0.5nm 내부 지름의 염료가 채워진 구멍을 가진 전형적인 폴리머화 고리 구조를 나타낸다. 검은 화살표는 불완전하게 및 불규칙적으로 폴리머화된 복합체를 가리킨다. 중성 Na-포스포텅스테이트로 음성 염색. (c,d) IFN-γ 유발된 MEF의 감염 후 미코박테리움 스메그마티스 (c) 및 MRSA (d)에서 폴리머화된 P-2 막 병변의 전자 현미경 사진. 박테리아 막이 방법에서 설명된 바와 같이 분리되었고 투과 전자 현미경 관찰을 위해 음성 염색되었다. 흰색 화살표는 추정상 P-2를 폴리머화함으로써 생성된 흰색 좁은 보더에 의해 둘러싸인 박테리아 세포 벽의 원형 검은색, 염료가 채워진 구멍을 가리킨다. 검은색 화살표는 불규칙한 폴리머를 가리킨다.
도 30: (A) 직장 상피 암 세포에서 P-2 siRNA 넉다운은 살모넬라 티피뮤리움, 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MRSA, 임상적 분리체) 및 미코박테리움 스메그마티스의 세포 내 복제를 유발한다; P-2-RFP 과발현은 세포 내 박테리아의 살해를 증가시킨다. (B) P-2-RFP 트랜스펙션은 내인성 P-2가 넉다운될 때 살해 활성을 회복시키지만 RFP 트랜스펙션은 아니다. (C) P-2의 넉다운 및 P-RFP로 보충, 웨스턴 블롯. 세포는 P-2의 3' UTR에 특이적인 P-2-siRNA 또는 RFP 또는 P-2-RFP와 함께 스크램블된 siRNA로 트랜스펙션 전 24시간에 트랜스펙션되었으며, 내인성 P-2의 3' UTR이 결핍된다.-16시간에 세포는 P-2-RNA를 유발하기 위해 100U/ml IFN-γ와 함께 배양되었다. 0시간에 세포는 30의 MOI에서 박테리아와 함께 1시간 동안 배양되었고, 외부 박테리아를 제거하기 위해 세척하였고 세포 외 박테리아의 성장을 방지하기 위해서 겐타마이신으로 재배치되었다. 숙주 세포는 용해물에서 결정된 NP40 및 CFU로 지시된 시간에 용해되었다.
P-2 siRNA에 의한 P-2의 넉다운이 세포 내 CFU를 증가시키고 P-2 차단이 박테리아 복제를 허용한다는 것을 지시하며, 숙주 세포를 살해한다는 것을 주목해야한다 (지시된 바와 같음, 살모넬라 제외). P-2-RFP로 트랜스펙션 (P-2 C-말단 RFP 융합)은 세포 내 박테리아의 살해를 증가시키거나 (3개의 왼쪽 패널) P-2가 넉다운될 때 P-2 활성을 회복시키지만 RFP로 트랜스펙션은 아니다.
도 31: P-2가 넉다운될 때 및 RIS 및 NO만 존재할 때 세포 내 박테리아 복제 (빨간 원). P-2, ROS 및 NO가 존재할 때 양호한 살해 (녹색 단색 구체). P-2+NO (검은 단색 삼각형) 또는 P-2+ROS (다이아몬드)로 살해를 중재한다. P-2 넉다운의 효율성 (오른쪽 패널). 세포: IFN 처리된, 티오글리콜레이트 유도된, 복막 마크로파지 및 살모넬라 티피뮤리움.
도 32: (a) P-2-GFP, RASA2 및 LC3-RFP는 흡수된 박테리아에서 동시 배치된다. 두 상단 패널: DAPI (DNA), RASA-2 항체로 염색되고 P-2-GFP 및 LC3-RFP로 트랜스펙션된 IFN 활성화된 BV2. 모든 다른 패널: BV2는 살모넬라 티피뮤리움으로 5분 동안 100:1로 감염되었고 그 다음 파라-포름알데히드로 고정되었다. 패널에서 지시된 바와 같은 형광발광 표지. DAPI 염색 및 P-2-GFP에 의해 지시된 바와 같이 하나의 세포 외 박테리아 (화살표) 및 여러 살해된 세포 내 박테리아 (별표)를 주목해야 한다. RASA2 및 LC3-RFP의 동시 배치. (b) IFN 활성화된 BV-2의 감염의 5분 내에 P-2-RFP의 대장균-GFP 함유 액포로의 위치 이동 (단계에서 화살표)
도 33: P-2-GFP로 트랜스펙션되고 RASA2 항체로 염색된 감염되지 않은 휴식기 RAW 세포에서 핵 주위 막에서/위에서 P-2 및 RASA2의 동시 배치.
도 34: (a) IFN으로 mEF의 활성화는 P-2 mRNA 발현을 증가시키고 (왼쪽, Taqman PCR) 미코박테리아의 세포 내 살해를 향상시킨다 (오른쪽, 겐타마이신 보호 검정). (b) 살아있는 WT 살모넬라는 mEF에서 P-2 유발을 저해한다. 열사 및 PhoP 돌연변이 살모넬라 및 대장균 K12는 P-2를 유발한다. mEF가 감염되었고 1시간 후 세척되고 겐타마이신에서 플레이팅되었다.
도 35: (a) RASA2의 siRNA 넉다운은 BV2에 의한 미코박테리아의 세포 내 살해를 억제하고 세포 내 복제를 허용한다 (단색 막대). (b) P-2-GFP의 항-GFP로의 면역침강 및 P-2-GFP로 트랜스펙션된 RAW 세포에서 RASA2의 풀 다운(pull down).
도 36: mEF는 세포 내 MRSA를 살해하고 진핵세포 막에서 폴리 P-2와 유사한 세포 벽 손상을 발생시킨다. 왼쪽 패널 mEF의 세제 용해에 의한 감염 4시간 후 얻어진 MRSA 세포 벽; 유라닐 포르메이트로 음성 염색. 오른쪽: HEK293 막에서 폴리 P-2 복합체; Na 포스포-텅스테이트로 음성 염색됨 기준 자: 400Å. 세포 벽/막 구멍의 유사한 지름 (90Å)을 주목해야 한다.
도 37: Atg14L 또는 P-2의 siRNA 넉다운은 BV2 미세아교세포에서 세포 내 박테리아의 살해를 차단하고 복제를 가능하게 한다. 겐타마이신 보호 검정에서 결정된 미코박테리아의 세포 내 살해 또는 생존.
도 38: (a) P-2, (b) Atg14L, (c) Atg16L, (d) Atg5의 siRNA 넉다운은 mEF에서 살모넬라 복제를 가능하게 한다. mEF에서 P-2는 P-2가 넉다운될 때 복제하는 살모넬라의 세포 내 복제를 방지한다. 본원에서 나타난 데이터와 일치하는 오토파지(autophagy)의 넉다운에 대하여 동일한 효과가 보고되었다.
도 39: 3-MA는 P-2-넉다운 (a-c에서 빨간 선)과 유사한 mEF (c에서 파란선)에서 vps34를 억제하고 살모넬라의 복제를 허용한다. 스크램블 siRNA (파란 색, 패널 a)와 유사한 파빌로마이신 (파란색, 패널 b)은 살모넬라의 P-2 매개된 세균 발육 억제(bacteriostasis)를 억제한다.
도 40: 퍼포린-2 메커니즘의 모델.
정의
본 발명을 더 상세히 설명하기 전에 다음 정의가 본원에서 본 발명을 설명하기 위해 사용된 용어의 의미 및 범위를 예시하고 정의하기 위해 제시된다.
용어 "조정하다"는 언급된 활성 중 어떤 것이, 예를 들어, 증가되거나, 향상되거나, 작용되거나 (작용제로서 역할을 하거나), 촉진되거나, 상향조정되거나, 줄어들거나, 감소되거나, 저해되거나, 차단되거나, 하향조정되거나 길항작용된다는 (길항제로서 역할을 하는) 것을 의미한다. 조정은 베이스라인 값보다 1배, 2배, 3배, 5배, 10배, 100배, 등 이상으로 활성을 "증가시키거나" "상향조정"할 수 있다. 조정은 또한 베이스라인 값보다 낮게 활성을 줄이거나 하향조정할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이 "감소" 또는 "하향조정"은 적어도 적절한 대조군에 비해 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 감소를 의미한다. 조정은 또한 베이스라인 값으로 활성을 표준화할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한" 성분/담체, 등은 합리적인 이익/위험 비율로 과도한 부작용 (예를 들어, 독성, 과민증, 및 알레르기 반응) 없이 인간 및/또는 동물 사용에 적합한 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "안전한 양 및 유효량"은 본 발명의 방식으로 사용될 때 합리적인 이익/위험 비율로 과도한 부작용 (예를 들어, 독성, 과민증, 및 알레르기 반응) 없이 원하는 치료적 반응을 수득하기 위해 충분한 성분의 양을 나타낸다. "치료적 유효량"은 원하는 치료적 반응을 수득하기 위해 효과적인 본 발명의 화합물의 양을 의미한다.
용어 "환자" 또는 "개체"는 본원에서 교체 가능하게 사용되고, 치료되는 포유동물 대상을 나타내며, 인간 환자가 바람직하다. 일부 경우에서, 본 발명의 방법은 실험 동물에서, 가축 적용에서 (예를 들어, 고양이, 개, 말, 소, 양, 및 돼지), 및 마우스, 래트, 및 햄스터를 포함하는 설치류; 및 영장류를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 질환에 대한 동물 모델의 개발에서 사용을 발견한다.
"치료"는 장애의 발달을 방지하거나 이것의 병리 또는 증상을 변화시킬 의도로 수행된 개입이다. 따라서, "치료"는 치료적 치료 및 예방적인 또는 방지를 위한 측정 둘 다를 나타낸다.
"표적 분자"는 퍼포린-2의 발현, 기능 또는 활성에 영향을 미치거나 이것들을 조정하는 어떤 분자도 포함한다. 이것은, 예를 들어, 표 1의 것들, 및 확인되어야 하는 것들을 포함한다.
본 발명에 따르면, 통상적인 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 면역학, 세포 생물학 및 당업계 내 다른 관련 기술이 이용될 수도 있다. 그 중에서도, 예를 들어, Sambrook et al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York; Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York; Ausubel et al., eds. (2005) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Bonifacino et al., eds. (2005) Current Protocols in Cell Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coligan et al., eds. (2005) Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, Inc. : Hoboken, NJ; Coico et al., eds. (2005) Current Protocols in Microbiology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coligan et al., eds. (2005) Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, Inc. : Hoboken, NJ; Enna et al., eds. (2005) Current Protocols in Pharmacology John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Hames et al., eds. (1999) Protein Expression: A Practical Approach. Oxford University Press: Oxford; Freshney (2000) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. 4th ed. Wiley-Liss를 참고하면 된다. 상기 나열된 The Current Protocols은 매년 여러 번 업데이트 된다.
치료적 조성물
구체예는 시험관 내 및 생체 내 둘 다에서, 퍼포린-2의 발현, 기능 또는 활성을 조정하는 화합물의 확인에 관한 것이다. 취해진 접근법 중 하나는 P2의 발현, 기능 또는 활성을 조정하는 분자를 확인하는 것이었다. 이 분자들은 이스트 혼성화 시스템 (yeast hybrid system)에 기초하여 확인되었고, 이어지는 실시예 섹션에서 더 상세히 설명되었다. 퍼포린-2 발현, 기능 또는 후보 치료제에 의한 어떤 활성의 조정도 병원성 유기체, 특히 항생제에 대산 내성을 발달시킨 것들 및 이것을 발달시킬 가능성이 큰 것들, 예를 들어, 박테리아에 의한 감염의 방지 또는 치료에 효과적일 것이다.
한 구체예에서, 시험관 내 또는 생체 내에서 퍼포린-2 (P2)의 기능, 활성 또는 발현을 조정하는 방법은 시험관 내에서 세포에 접촉하는 단계 또는 환자에게 투여하는 단계를 포함하며, P2 발현, 기능 또는 활성과 관련된 하나 이상의 표적 분자의 기능, 활성 또는 발현을 조정하는 적어도 하나의 제제의 유효량이 제공된다.
또 다른 구체예에서, 퍼포린-2의 발현, 기능 또는 활성을 조정하는 적어도 하나의 제제를 확인하는 방법이 제공되며, 방법은 퍼포린-2 발현, 기능 또는 활성과 관련된 하나 이상의 표적 분자를 발현하는 세포를 적어도 하나의 제제와 접촉하는 단계; 퍼포린-2 발현, 기능 또는 활성과 관련된 하나 이상의 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성을 측정하는 단계; 및 하나 이상의 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성을 대조군과 비교하는 단계를 포함하며, 상기 하나 이상의 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성을 조정하는 적어도 하나의 제제와 접촉시키고 이로 인해 퍼포린-2의 발현, 기능 또는 활성을 조정하는 제제를 확인한다.
일부 구체예에서, P2 기능, 활성 또는 발현과 관련된 하나 이상의 표적 분자는 src, 유비퀴틴 컨쥬게이팅 효소 E2M, GAPDH, P21RAS/gap1m, 갈렉틴 3, 유비퀴틴 C (UCHL1), 프로테아솜, vps34, ATG5, ATG7, ATG9L1, ATG14L, ATG16L, LC3, Rab5, 단편, 또는 이것들의 관련된 분자를 포함한다. 표적 분자와 결합된 분자는 이 표적 분자가 참여하는 다양한 경로에 수반된 어떤 세포 내 분자, 이 분자들, 신호 전달 경로와 관련된 분자, 이 표적 분자의 전사 및 번역을 조정하는 분자도 될 수 있다.
다른 구체예에서, 적어도 하나의 제제는 퍼포린-2 발현, 기능 또는 활성과 관련된 하나 이상의 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성을 상향조정한다. 대안으로, 적어도 하나의 제제는 퍼포린-2 발현, 기능 또는 활성과 관련된 하나 이상의 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성을 하향조정한다.
일부 구체예에서, P2 발현, 기능 또는 활성은 P2 기능, 발현 또는 활성과 관련된 하나 이상의 표적 분자의 기능, 활성 또는 발현을 상향조정하는 적어도 하나의 제제의 투여에 의해 상향조정된다.
일부 구체예에서, P2 발현, 기능 또는 활성은 P2 기능, 발현 또는 활성과관련된 하나 이상의 분자의 기능, 활성 또는 발현을 하향조정하는 적어도 하나의 제제의 투여에 의해 하향조정된다.
일부 경우에서, 표적 분자 중 일부를 상향조정하고 다른 표적 분자의 기능, 활성 또는 발현을 억제하거나 일정하게 유지하는 것이 바람직할 수도 있다. 따라서, 일부 구체예에서, P2 발현, 기능 또는 활성은 P2 기능, 발현 또는 활성에 관련된 적어도 두 개의 분자의 기능, 활성 또는 발현을 독립적으로 상향조정하거나 하향조정하는 적어도 하나의 제제의 투여에 의해 상향조정된다.
다른 구체예에서, P2 발현, 기능 또는 활성은 P2 기능, 발현 또는 활성에 관련된 적어도 두 개의 분자의 기능, 활성 또는 발현을 독립적으로 상향조정하거나 하향조정하는 적어도 하나의 제제의 투여에 의해 하향조정된다.
또 다른 구체예에서, P2 발현, 기능 또는 활성은 P2 기능, 발현 또는 활성에 관련된 적어도 두 개의 분자의 기능, 활성 또는 발현을 독립적으로 상향조정하거나 하향조정하는 적어도 두 개의 제제의 조합의 투여에 의해 상향조정된다.
일부 구체예에서, P2 발현, 기능 또는 활성은 P2 기능, 발현 또는 활성에 관련된 적어도 두 개의 분자의 기능, 활성 또는 발현을 독립적으로 상향조정하거나 하향조정하는 적어도 두 개의 제제의 조합의 투여에 의해 하향조정된다.
다른 구체예에서, P2 발현, 기능 또는 활성의 조정은 P2 분자의 발현, 기능 또는 활성을 직접적으로 조정하는 제제를 투여하는 선택적 단계를 포함한다. 이러한 분자는 P2의 전사 또는 번역을 억제하는 것일 수도 있다. 예를 들어, 미국 공개 번호 제20090142768호를 참고하면 되고, 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
다른 구체예에서, 제제는 소분자, 단백질, 펩티드, 펩티드, 변형된 펩티드, 변형된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 합성 분자, 천연 분자, 유기 또는 무기 분자, 또는 이것들의 조합을 포함한다.
다른 양태에서, 퍼포린-2 발현, 기능 또는 활성에 관련된 하나 이상의 표적 분자는 감염성 유기체의 것이다. 일부 구체예에서, 감염성 유기체는 박테리아이다. 특정 구체예에서, 박테리아는 살모넬라 티피뮤리움 또는 대장균일 수도 있다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 표적 분자는 PhoP 또는 데아미다제일 수도 있다.
퍼포린-2 발현, 기능 또는 활성에 관련된 하나 이상의 표적 분자가 감염성 유기체의 것인 이러한 경우에, 하나 이상의 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성의 하향조정은 퍼포린-2의 발현, 기능 또는 활성을 상향조정할 수 있다. 대안으로, 하나 이상의 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성의 상향조정은 퍼포린-2의 발현, 기능 또는 활성을 하향조정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 퍼포린 2의 발현, 기능 또는 활성을 차례로 조정하는 분자의 발현, 기능 또는 활성을 조정하는 화합물 또는 후보 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 화합물은, 예를 들어, 세포가 퍼포린 2 단백질을 발현하는 것을 유발하고, P2의 조립을 허용하고, 올바른 조립을 허용하고, P2의 위치 이동을 허용할 수도 있다. 바람직한 후보 치료제는 항균 효과를 향상시키는 마크로파지와 같은 면역학적 세포에서 P2 발현을 증가시킨다.
이와 같이, 이 구체예들은 P2의 발현, 기능 또는 활성을 증가시키는데, 예를 들어, 세포ㅍ에서 P2 mRNA의 번역을 증가시키는데 효과적인 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 이러한 화합물은 P2와 관련된 분자를 표적화할 것이다. 그것의 가장 기본적인 형태에서, 이러한 방법은 테스트 화합물 및 퍼포린 2 단백질 생산의 증가가 일어나는지의 결정과 함께, 각각 특정 표적 분자 및 내인성 또는 외인성 퍼포린 2 유전자 또는 cDNA를 발현하는 세포를 노출하는 단계를 수반한다.
한 구체예에서, 후보 치료제를 확인하는 방법은 src, 유비퀴틴 컨쥬게이팅 효소 E2M, GAPDH, P21RAS/gap1m, 갈렉틴 3, 유비퀴틴 C (UCHL1), 프로테아솜, 또는 이것의 단편을 포함하는 하나 이상의 표적 분자를 발현하는 세포를 접촉시키는 단계; 분자의 발현, 기능 또는 활성을 측정하는 단계; 분자의 발현, 기능 또는 활성을 대조군과 비교하는 단계를 포함한다. 바람직하게, 후보 치료제는 표적 분자 중 하나 이상의 발현, 기능 또는 활성을 매개한다. 다른 구체예에서, 후보 치료제는 복수의 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성을 조정한다. 바람직하게, 후보 치료제는 표적 분자 중 하나 이상의 발현, 기능 또는 활성을 상향조정한다. 일부 양태에서, 후보 치료제는 표적 분자 중 하나 이상의 발현, 기능 또는 활성을 하향조정한다.
바람직한 구체예에서, 하나 이상의 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성의 조정은 퍼포린-2 (P2) 분자의 발현, 기능 또는 활성을 조정한다. 바람직하게, 하나 이상의 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성의 상향조정은 퍼포린-2 (P2) 분자의 발현, 기능 또는 활성을 상향조정한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성의 하향조정은 퍼포린-2 (P2) 분자의 발현, 기능 또는 활성을 하향조정한다.
또 다른 구체예에서, 퍼포린-2의 발현, 기능 또는 활성을 조정하는 후보 제제를 확인하는 방법은 분석 표면을 src, 유비퀴틴 컨쥬게이팅 효소 E2M, GAPDH, P21RAS/gap1m, 갈렉틴 3, 유비퀴틴 C (UCHL1), 프로테아솜, vps34, ATG5, ATG7, ATG9L1, ATG14L, ATG16L, LC3, Rab5, PhoP, 데아미다제, 이것들의 단편 또는 관련된 분자를 포함하는 하나 이상의 표적 분자와 접촉시키는 단계; 표적 분자를 하나 이상의 후보 제제와 접촉시키고 하나 이상의 표적 분자 또는 이것들의 관련된 분자에 결합하거나 이것들을 혼성화하는 제제를 확인하는 단계; 및 퍼포린-2의 발현, 기능 또는 활성의 조정을 위해 하나 이상의 후보 제제를 검정하고, 이로 인해 후보 제제를 확인하는 단계를 포함한다.
치료제가 표적 분자에 대한 그것의 효과를 측정함으로써 후보물질인 것으로 간주되면, 제제는 퍼포린-2 분자에 대하여 더 스크리닝된다. 이것들은 분석 표면, 예를 들어, 바이오칩에 배치된 펩티드 또는 올리고뉴클레오티드에 의한 것일 수도 있거나, P2를 발현하는 세포의 형태일 수도 있다. 바람직한 후보 치료제는 P2 분자의 발현, 기능, 또는 활성을 상향조정하고 또한 박테리아와 같은 감염성 유기체의 살해를 증가시킨다. 일부 양태에서, 확인된 후보 치료제는 P2 분자의 발현, 기능, 또는 활성을 하향조정한다.
다른 구체예에서, P2 분자의 발현, 기능 또는 활성을 검정하는 검정은 세포 검정, 면역-검정, 효모 히브리드(hybrid) 시스템 검정, 혼성화 검정, 핵산 기반 검정, 고-처리율 스크리닝 검정 또는 이것들의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 확인된 후보 제제는 또한 복제의 억제, 성장의 억제, 또는 감염성 유기체, 예를 들어, 박테리아의 사멸에 대하여 검정된다.
세포가 사용되는 방법에서, 대조군 세포, 표적 분자를 발현하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 테스트 세포, 표적 분자가 내인성인 세포, 퍼포린 2 발현 벡터를 갖는 세포, 또는 어떤 조합이 제공된다. 이 방법에서, 테스트 세포는 테스트 화합물과 접촉되는 반면에, 대조군 세포는 아니다. 그 다음 당업자들은 표적 분자의 발현이 잠재적 또는 후보 치료제를 확인하기 위한 산출량 판독 파라미터로서 사용되면, 테스트 화합물의 부재시 키워진 대조군 세포보다 더 많은 리포터 단백질을 생산할 때 테스트 화합물을 잠재적 치료제로서 확인할 수 있다. 이러한 테스트 화합물은 미생물 및 종양 세포와의 싸움에서 신체의 자체 면역 시스템을 강화하는 효과적인 항생제 또는 항암 화합물인 것으로 추정된다. 테스트는 또한 기능적 수준에서 추가의 결정요인을 포함할 수 있으며, 이것에 의해 세포는 공동 배양에서 박테리아와 같은 미생물을 살해하는 그것들의 능력에 대하여 테스트된다.
감염성 박테리아의 예는 제한은 아니지만 다음을 포함한다: 대장균(Escherichia coli), 장변원성 대장균 (EPEC), 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MRSA), 미코박테리움 아비움 인트라셀룰라레 (미코박테리움 아비움), 살모넬라 티피뮤리움 (S. typhimurium), 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori), 보렐리아 부르고도르페리(Borrelia burgdorferi), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 미코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis; BCG), 미코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 미코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis), 미코박테리움 인트라셀룰라레(Mycobacterium intracellulare), 스타필로코쿠스 아우레우스, 네이세리아 고노뢰애(Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 스트렙토코쿠스 피로게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 헤모필루스 인플루엔재(Haemophilus influenzae), 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catharralis), 클레브시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 코리네박테리움 디프테리애(Corynebacterium diphtheriae), 클로스트리듐 퍼프링게네스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 엔테로박터 애로게네스(Enterobacter aerogenes), 클레브시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 파스튜렐라 물토시다(Pasturella multocida), 대장균 (E.coli) 및 트레포네마 팔리듐(Treponema pallidum); 다음과 같은 감염성 균류: 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 히스토플라스마 캡슐라튬(Histoplasma capsulatum), 콕시디오이데스 임미티스(Coccidioides immitis), 블라스토미세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans); 및 다음과 같은 감염성 원생생물: 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 레이시마니아 도노바니(Leishmania donovani) 및 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii); 뿐만 아니라 감염성 균류, 예를 들어, 히스토플라스모시스(histoplasmosis), 칸디디아시스(candidiasis), 크립토코코시스(cryptococcosis), 블라스토미코시스(blastomycosis) 및 에오시디오도미코시스(eocidiodomycosis)를 유발하는 것들; 뿐만 아니라 칸디다 종(Candida spp.), 즉, 칸디다 알비칸스(C. albicans), 칸디다 파라프실로시스(C. parapsilosis), 칸디다 크루세이(C. krusei), 칸디다 글라브라타(C. glabrata), 칸디다 트로피칼리스(C. tropicalis), 또는 칸디다 루시타니애(C. lusitaniae); 토룰로푸스 종(Torulopus spp.), 즉, 토룰로푸스 글라브라타(T. glabrata); 아스페르질루스 종(Aspergillus spp.), 종, 아스페르질루스 푸미갈루스(A. fumigalus), 히스토플라스마 종(Histoplasma spp.), 즉, 히스토플라스마 캡슐라튬(H. capsulatum); 크립토코쿠스 종(Cryptococcus spp.), 즉, 크립토코쿠스 네오포르만스(C. neoformans); 블라스토미세스 종(Blastomyces spp.), 즉, 블라스토미세스 더마틸리디스(B. dermatilidis); 푸사리움 종(Fusarium spp.); 트리코피톤 종(Trichophyton spp.), 슈달레스체리아 보이디이(Pseudallescheria boydii), 콕시디오이데스 임미츠(Coccidioides immits), 및 스포로트릭스 셰네키이(Sporothrix schenekii).
스크리닝 검정
P2의 퍼포린 2 (P2) 발현, 기능, 또는 활성에 대한 약물 스크리닝 검정은 P2의 항균 효과를 증가시키거나 감소시키는 분자의 확인에 기초한다. 이와 같이, P2의 항균 활성과 상호작용하거나 이에 영향을 미치는 분자 중 어떤 것에도 영향을 미치는 어떤 분자도 치료용 후보 제제가 될 수 있다.
한 구체예에서, 스크리닝은 표적 분자를 발현하는 각 세포 배양물을 멤버 화합물의 다양한 라이브러리와 접촉시키는 단계를 포함한다. 화합물 또는 "후보 치료제" 또는 "제제"는 어떤 유기적, 무기적, 소분자, 단백질, 항체, 압타머(aptamer), 핵산 분자, 또는 합성 분자일 수도 있다.
후보 제제는 많은 화학적 등급을 포함하지만, 전형적으로 그것들은 작은 유기 화합물을 포함하는 유기 화합물, 올리고뉴클레오티드를 포함하는 핵산, 및 펩티드이다. 작은 유기 화합물은 적합하게, 예를 들어, 약 40 또는 50 이상, 하지만 약 2,500 미만의 분자량을 가질 수도 있다. 후보 제제는 단백질 및/또는 DNA와 상호작용하는 기능적 화학적 기를 포함할 수도 있다.
후보 제제는 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리를 포함하는 다양한 공급원으로부터 얻을 수도 있다. 예를 들어, 많은 수단이 다양한 유기 화합물 및 생분자의 무작위 및 관련된 합성에 이용 가능하며, 무작위로 추출된 올리고뉴클레오티드의 발현을 포함한다. 대안으로, 예를 들어, 박테리아, 균류 및 동물 추출물의 형태의 천연 화합물의 라이브러리가 이용 가능하거나 쉽게 생산된다.
화학적 라이브러리: 조합 화학반응의 개발은 수백 내지 수천 가지의 별개의 화합물의 신속하고 경제적인 합성을 허용한다. 이 화합물들은 전형적으로 효율적인 스크리닝을 위해 설계된 소분자의 적당한-크기의 라이브러리에서 배열된다. 조합 방법은 새로운 화합물의 확인에 적합한 편견이 없는 라이브러리를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 게다가, 이전에 결정된 생물학적 활성을 갖는 단일 모체 화합물로부터 유래된 더 작고, 덜 다양한 라이브러리가 생성될 수 있다. 다른 경우에서, 중요한 효소의 억제자와 같이 조합 화학반응에 의해 생산된 치료적으로 적절한 생물학적 분자를 특이적으로 표적화하기 위한 효과적인 스크리닝 시스템의 부족은 이 공급원들의 최적의 사용을 방해한다.
조합 화학적 라이브러리는 화학적 합성 또는 생물학적 합성에 의해, 시약과 같이, 많은 화학적 "구성요소"를 결합시킴으로써 생성된 다양한 화합적 화합물의 컬렉션이다. 예를 들어, 펩티드 라이브러리와 같은 선형 조합 화학적 라이브러리는 특정 화합물 길이 (즉, 펩티드 화합물에서 아미노산의 수)에 대하여 많은 수의 조합에서, 및 잠재적으로 모든 가능한 방법으로 화학적 구성 요소(아미노산)의 세트를 결합시킴으로써 형성된다. 백만 가지의 화학적 화합물은 예를 들어, 화학적 구성 요소의 조합의 혼합을 통해 합성될 수 있다.
"라이브러리"는 2 내지 50,000,000개의 다양한 멤버 화합물로 구성될 수도 있다. 바람직하게, 라이브러리는 적어도 48개의 다양한 화합물, 바람직하게는 96개 이상의 다양한 화합물, 더 바람직하게는 384개 이상의 다양한 화합물, 더 바람직하게는, 10,000개 이상의 다양한 화합물, 바람직하게는 100,000개 이상의 다양한 화합물 및 가장 바람직하게는 1,000,000개의 다양한 멤버 화합물을 포함한다. "다양한"은 라이브러리에서 50% 이상의 화합물이 라이브러리의 어떤 다른 멤버와 동일하지 않은 화학적 구조를 가진다는 것을 의미한다. 바람직하게, 라이브러리에서 75% 이상, 더 바람직하게 90% 이상 및 가장 바람직하게 약 99% 이상의 화합물은 컬렉션의 어떤 다른 멤버와 동일하지 않은 화학적 구조를 갖는다.
조합 화학적 라이브러리의 제조법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 재검토를 위해서는, Thompson et al., Synthesis and application of small molecule libraries, Chem Rev 96:555-600, 1996; Kenan et al., Exploring molecular diversity with combinatorial shape libraries, Trends Biochem Sci 19:57-64, 1994; Janda, Tagged versus untagged libraries: methods for the generation and screening of combinatorial chemical libraries, Proc Natl Acad Sci USA. 91:10779-85, 1994; Lebl et al., One-bead-one-structure combinatorial libraries, Biopolymers 37:177-98, 1995; Eichler et al., Peptide, peptidomimetic, and organic synthetic combinatorial libraries, Med Res Rev. 15:481-96, 1995; Chabala, Solid-phase combinatorial chemistry and novel tagging methods for identifying leads, Curr Opin Biotechnol. 6:632-9, 1995; Dolle, Discovery of enzyme inhibitors through combinatorial chemistry, Mol Divers. 2:223-36, 1997; Fauchere et al., Peptide and nonPeptide lead discovery using robotically synthesized soluble libraries, Can J. Physiol Pharmacol. 75:683-9, 1997; Eichler et al., Generation and utilization of synthetic combinatorial libraries, Mol Med Today 1: 174-80, 1995; and Kay et al., Identification of enzyme inhibitors from phage-displayed combinatorial peptide libraries, Comb Chem High Throughput Screen 4:535-43, 2001을 참고하면 된다.
화학적 다양성 라이브러리를 생성하는 다른 화학반응이 또한 사용될 수 있다. 이러한 화학반응은 펩토이드 (PCT 공개 번호 제WO 91/19735호); 암호화된 펩티드 (PCT 공개 제WO 93/20242호); 무작위 생-올리고머 (PCT 공개 번호 제WO 92/00091호); 벤조디아제핀 (미국 특허 번호 제5,288,514호); 히단토인, 벤조디아제핀 및 디펩티드와 같은 디버소머(diversomer) (Hobbs, et al., Proc . Nat . Acad . Sci. USA, 90:6909-6913 (1993)); 비닐 위치 펩티드 (Hagihara, et al., J. Amer . Chem. Soc. 114:6568 (1992)); β-D-글루코스 스캐폴딩(scaffolding)된 비펩티드성 펩티도미메틱 (Hirschmann, et al., J. Amer . Chem . Soc., 114:9217-9218 (1992)); 작은 화합물 라이브러리의 유사한 유기 합성 (Chen, et al., J. Amer . Chem . Soc., 116:2661 (1994)); 올리고카바메이트 (Cho, et al., Science, 261:1303 (1993)); 및/또는 펩티딜 포스포네이트 (Campbell, et al., J. Org . Chem. 59:658 (1994)); 핵산 라이브러리 (Ausubel, Berger and Sambrook, 상기를 참고하면 된다); 펩티드 핵산 라이브러리 (예를 들어, 미국 특허 번호 제5,539,083호를 참고하면 된다); 항체 라이브러리 (예를 들어, Vaughn, et al., Nature Biotechnology, 14(3):309-314 (1996) 및 제PCT/US96/10287호를 참고하면 된다); 카르보히드레이트 라이브러리 (예를 들어, Liang, et al., Science, 274:1520-1522 (1996) 및 미국 특허 번호 제5,593,853호를 참고하면 된다); 작은 유기 분자 라이브러리 (예를 들어, 벤조디아제핀, Baum C&E News, January 18, page 33 (1993)을 참고하면 된다); 이소프레노이드 (미국 특허 번호 제5,569,588호); 티아졸리디논 및 메타티아자논 (미국 특허 번호 제5,549,974호); 피롤리딘 (미국 특허 번호 제5,525,735호 및 제5,519,134호); 모폴리노 화합물 (미국 특허 번호 제5,506,337호); 벤조디아제핀 (미국 특허 번호 제5,288,514호); 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
조합 라이브러리의 제조용 장치는 상업적으로 이용 가능하다 (예를 들어, 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem. Tech, Louisville Ky., Symphony, Rainin, Woburn, Mass., 433A Applied Biosystems, Foster City, Calif., 9050 Plus, Millipore, Bedford, Mass.를 참고하면 된다). 게다가, 많은 조합 라이브러리는 자체로 상업적으로 이용 가능하다 (예를 들어, ComGenex, Princeton, N.J., Asinex, Moscow, Ru, Tripos, Inc., St. Louis, Mo., ChemStar, Ltd., Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, Pa., Martek Bio sciences, Columbia, Md., etc.를 참고하면 된다).
소분자: 소분자 테스트 화합물은 처음에는 유기 또는 무기 화학적 라이브러리의 멤버일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "소분자"는 약 3,000 달톤 이하의 분자량의 작은 유기 또는 무기 분자를 나타낸다. 소분자는 조합 화학절 라이브러리의 천연 생성물 또는 멤버일 수도 있다. 다양한 분자의 세트가 전하, 방향성, 할로겐 결합, 가요성, 크기, 측쇄의 길이, 소수성, 및 강성과 같이 다양한 기능을 커버하기 위해 사용되어야 한다. 소분자를 합성하는데 적합한 조합 기술은, 예를 들어, Obrecht and Villalgordo, Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compound Libraries, Pergamon-Elsevier Science Limited (1998)에 의해 예시된 바와 같이 업계에 알려져 있고, "분열 및 풀" 또는 "유사한" 합성 기술, 고체-단계 및 용액-단계 기술, 및 암호화 기술과 같은 것들을 포함한다 (예를 들어, Czarnik, Curr . Opin . Chem . Bio., 1:60 (1997)을 참고하면 된다. 게다가, 많은 소분자 라이브러리가 상업적으로 이용 가능하다.
바람직한 구체예에서, 화합물은 고 산출량 스크리닝으로서 표적 분자 및/또는 P2 중 하나 이상을 발현하는 유발성 또는 비유발성 프로모터를 갖는 벡터를 포함하는 세포에 대하여 검정된다. 사용된 세포는 또한 표적 분자 및/또는 P2를 내인성으로 발현하는 세포일 수 있다. 리포터 분자는 같거나 다른 분자일 수도 있지만, 리포터 분자는 바람직하게 다르다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다수의 세포를 함유하는 위치의 정렬을 제공하는 단계; 세포에서 리포터 분자로부터 신호를 얻기 위해 세포를 함유하는 위치 각각에서 다수의 세포를 스캐닝(scanning)하는 단계; 신호를 디지털 데이터로 전환하는 단계; 및 디지털 데이터를 활용하여 세포 내 리포터 분자의 분포, 환경 또는 활성을 결정하는 단계를 포함하는 세포 분석 방법을 제공하며, 세포는 하나 이상의 형광발광 또는 루시퍼라제 리포터 분자를 함유한다.
신약 개발 패러다임의 주요 구성요소는 세포 내 이온, 대사산물, 거대분자, 및 세포 소기관의 일시적 및 공간적 분포, 함량, 및 활성을 측정하기 위해 사용된 형광 및 발광 시약의 점점 증가하는 패밀리이다. 이 시약들의 등급은 살아있는 및 고정된 세포에서 분자의 분포 및 양을 측정하는 표지 시약, 시간 및 공간에서 신호 전달 사건을 보고하기 위한 환경적 지표, 및 살아있는 세포 내에서 표적 분자 활성을 측정하기 위한 발광 단백질 바이오센서(biosensor)를 포함한다. 단일 세포에서 여러 시약을 조합하는 다중파라미터는 신약 개발에 있어서 강력한 새로운 도구이다.
이 방법은 특이적 세포 구성요소에 대한 발광 또는 형광 분자의 높은 친화도에 의존한다. 특이적 성분에 대한 친화도는 이온 상호작용, 공유 결합 (이것은 단백질-기반 색소포, 형광단, 및 발광단과의 화학적 융합을 포함한다), 뿐만 아니라, 소수성 상호작용, 전위, 및 일부 경우에, 세포 구성요소 내 단순 인트랩먼트(entrapment)와 같은 물리력에 의해 통제된다. 발광 프로브는 소분자, 표지된 거대분자, 또는 유전적으로 조작된 단백질일 수 있으며, 녹색 형광 단백질 키메라를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
당업자들은 본 발명에서 사용될 수 있는 다양한 형광 리포터 분자를 인식할 것이며, 단백질, 인지질, RNA 및 DNA 혼성화 프로브와 같은 형광 표지된 생분자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 유사하게, 결합 또는 연결의 특정 화학적 속성을 갖도록 특이적으로 합성된 형광 시약은 형광 리포터 분자로서 사용되었다 (Barak et al., (1997), J. Biol . Chem. 272:27497-27500; Southwick et al., (1990), Cytometry 11:418-430; Tsien (1989) in Methods in Cell Biology, Vol. 29 Taylor and Wang (eds.), pp. 127-156). 형광 표지된 항체는 세포 또는 조직과 같은 복합체로서 분자의 혼합물에서 단일 분자 표적에 부착하는 그것들의 높은 정도의 특이성으로 인해 특히 유용한 리포터 분자이다.
발광 프로브는 살아있는 세포 내에서 합성될 수 있거나 확산, 촉진된 또는 활성 수송, 신호-서열-매개된 수송, 및 세포 내 이입(endocytotic) 또는 음세포 작용(pinocytotic) 흡수를 포함하는 여러 비-기계적 방식을 통해 세포로 수송될 수 있다. 기계적 대용량 로딩 방법은, 업계에 잘 알려져 있으며, 또한 발광 프로브를 살아있는 세포에 로딩하기 위해 사용될 수 있다 (Barber et al. (1996), Neuroscience Letters 207:17-20; Bright et al. (1996), Cytometry 24:226-233; McNeil (1989) in Methods in Cell Biology, Vol. 29, Taylor and Wang (eds.), pp. 153-173). 이 방법들은 전기천공 및 스크레이프(scrape)-로딩, 비드-로딩, 임팩트(impact)-로딩, 주사기-로딩, 고장성 및 저장성 로딩과 같은 다른 기계적 방법을 사용한다. 추가적으로, 세포는 GFP와 같이, 이전에 설명된 원하는 단백질에 커플링된 리포터 분자를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다 (Chalfie and Prasher 미국 특허 번호 제5,491,084; Cubitt et al. (1995), Trends in Biochemical Science 20:448-455).
세포에 있으면, 발광 프로브는 특이적 및 높은 친화도 상호작용 또는 신호-서열-매개된 수송과 같이 분자 표적화의 다른 방식의 결과로서 그것들의 표적 도메인을 축적한다. 형광 표지된 리포터 분자는 리포터의 위치, 양 및 화학적 환경을 결정하는데 유용하다. 예를 들어, 리포터가 친유성 막 환경 또는 더 수성 환경에 있는지가 결정될 수 있다 (Giuliano et al. (1995), Ann . Rev . of Biophysics and Biomolecular Structure 24:405-434; Giuliano and Taylor (1995), Methods in Neuroscience 27.1-16). 리포터의 pH 환경이 결정될 수 있다 (Bright et al. (1989), J. Cell Biology 104:1019-1033; Giuliano et al. (1987), Anal . Biochem. 167:362-371). 킬레이트 기를 갖고 있는 리포터가 Ca++와 같은 이온에 결합하는지, 또는 아닌지가 결정될 수 있다 (Bright et al. (1989), In Methods in Cell Biology, Vol. 30, Taylor and Wang (eds.), pp. 157-192; Shimoura et al. (1988), J. of Biochemistry (Tokyo) 251:405-410; Tsien (1989) In Methods in Cell Biology, Vol. 30, Taylor and Wang (eds.), pp. 127-156).
게다가, 유기체 내 특정 세포 타입은 특이적으로 표지도리 수 있고, 다른 세포 타입에서 발생하지 않을 수도 있는 구성요소를 함유할 수도 있다. 그러므로, 리포터 분자는 특이적 세포 내 특이적 구성요소, 뿐만 아니라, 혼합된 세포 타입의 집단 내 특이적 세포를 표지하도록 설계될 수 있다.
당업자들은 형광성을 측정하기 위한 다양한 방법을 인식할 것이다. 예를 들어, 일부 형광 리포터 분자는 들뜸 또는 방출 스펙트럼에서 전하를 나타내고, 일부는 하나의 형광 리포터가 형광성을 잃어버리는 공명 에너지 전송을 나타내는 한편, 두 번째는 형광성에서 커지고, 일부는 형광성의 손실 (퀸칭(quenching)) 또는 등장을 나타내는 한편, 일부는 회전 움직임을 보고한다 (Giuliano et al. (1995), Ann . Rev. of Biophysics and Biomol . Structure 24:405-434; Giuliano et al. (1995), Methods in Neuroscience 27:1-16).
전체 과정은 완전히 자동화될 수 있다. 예를 들어, 샘플 재료의 샘플링은 복수의 단계로 달성될 수도 있으며, 이것은 샘플 용기로부터 샘플을 빼내는 단계 및 빼낸 샘플의 적어도 일부를 테스트 세포 배양물 (예를 들어, 유전자 발현이 조정되는 세포 배양물)로 전달하는 단계를 포함한다. 샘플링은 또한 추가적인 단계, 특히 및 바람직하게, 샘플 제조 단계를 포함할 수도 있다. 하나의 접근법에서 단 하나의 샘플이 자동-샘플러(auto-sampler) 프로브로 동시에 빼내지고 동시에 단 하나의 샘플이 프로브에 있다. 다른 구체예에서, 다수의 샘플은 용매에 의해 분리된 자동-샘플러 프로브로 들어올 수도 있다. 다른 구체예에서, 다수의 프로브가 자동 샘플링에 동시에 사용될 수도 있다.
일반적인 경우, 샘플링은 수동으로, 반자동 방식으로 또는 자동 방식으로 행해질 수 있다. 샘플은 샘플 용기로부터 수동으로, 예를 들어 피펫이나 주사기-타입 수동 프로브로 회수될 수 있고, 이어서 수동으로 특성화 시스템의 로딩 포트 또는 주사 포트에 송달될 수 있다. 반자동 프로토콜에서는 프로토콜의 일부 양태는 자동으로 행해지지만(예를 들어, 송달), 일부 다른 양태는 수동 개입을 필요로 한다(예를 들어, 공정 제어 라인의 앞에서 샘플의 회수). 그러나, 샘플(들)은 완전 자동화된 방식으로, 예를 들어 오토-샘플러로 샘플 용기로부터 회수되고 특성화 시스템으로 송달되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따라서, 하나 이상의 시스템, 방법 또는 둘 다는 복수의 샘플 물질을 확인하기 위해서 사용된다. 수동 또는 반자동 시스템 및 방법도 가능하지만, 자동화된 시스템 또는 방법이 이용되는 것이 바람직하다. 여러 가지 로봇 또는 자동 시스템이 정해진 프로토콜에 따라서 고체, 유체, 액체 또는 기체 형태의 물질의 취급, 접촉, 디스펜싱 또는 다른 조작을 위한 정해진 동작을 자동으로 또는 프로그래밍 방식으로 제공하기 위해서 이용할 수 있다. 이러한 시스템은 물질의 기계적 특성을 결정하는데 있어서 시스템을 보조하기 위한 여러 가지 하드웨어, 소프트웨어 또는 둘 다를 포함하도록 개조되거나 확장될 수 있다. 로봇 시스템을 확장하기 위한 하드웨어 및 소프트웨어는, 제한은 아니지만 센서, 트랜스듀서, 데이터 취득 및 조작 하드웨어, 데이터 취득 및 조작 소프트웨어 등을 포함할 수 있다. 예시적인 로봇 시스템은 CAVRO Scientific Instruments(예를 들어, Model NO. RSP9652)이나 BioDot(Microdrop Model 3000)로부터 상업적으로 입수할 수 있다.
일반적으로, 자동화된 시스템은 합성, 조성, 위치 정보 또는 기질과 관련하여 위치된 물질 라이브러리와 관련된 다른 정보와 같은 정보로 프로그래밍될 수 있는 적합한 프로토콜 설계 및 실행 소프트웨어를 포함한다. 프로토콜 설계 및 실행 소프트웨어는 전형적으로 로봇이나 다른 자동화된 장치 또는 시스템을 제어하기 위한 로봇 제어 소프트웨어와 통신한다. 또한, 프로토콜 설계 및 실행 소프트웨어는 반응 측정 하드웨어로부터 데이터를 수집하기 위한 데이터 취득 하드웨어/소프트웨어와 통신한다. 일단 데이터가 데이터베이스에 수집되면, 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고, 더 구체적으로 후보 약물의 특성을 결정할 수 있거나, 또는 데이터는 수동 분석될 수 있다.
제약 조성물
더 나아가, 퍼포린-2의 발현, 기능 또는 활성을 조정하거나, 또는 퍼포린-2 발현, 기능 또는 활성과 관련된 하나 이상의 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성을 조정하는 제제의 치료적 유효량의 투여를 포함하는 감염성 질환 유기체에 의한 감염으로 고통받는 대상의 치료 방법이 제공된다.
바람직한 구체예에서, 감염성 질환 유기체로 고통받는 환자의 치료 방법은 src, 유비퀴틴 콘쥬게이팅 효소 E2M(Ubc12), GAPDH, P21RAS/gap1m(RASA2), 갈렉틴 3, 유비퀴틴 C(UCHL1), 프로테아솜, vps34, ATG5, ATG7, ATG9L1, ATG14L, ATG16L, LC3, Rab5, 퍼포린-2, 이들의 단편 또는 관련 분자를 포함하는 하나 이상의 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성을 조정하는 제제의 치료적 유효량을 환자에 투여하는 것을 포함한다.
src, 유비퀴틴 콘쥬게이팅 효소 E2M(Ubc12), GAPDH, P21RAS/gap1m(RASA2), 갈렉틴 3, 유비퀴틴 C (UCHL1), 프로테아솜, vps34, ATG5, ATG7, ATG9L1, ATG14L, ATG16L, LC3, Rab5, 퍼포린-2 또는 이들의 어떤 관련된 분자의 활성 변이체 및 단편들이 본원에 제공된 방법에서 사용될 수 있다. 이러한 활성 변이체는 본원에 제공된 다양한 표적 분자 중 어느 것에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 포함할 수 있으며, 활성 변이체는 생물학적 활성을 보유하고, 그러므로 퍼포린-2 발현, 기능 또는 활성을 조정한다.
다른 바람직한 구체예에서, 화합물은 본원에 구현된 방법에 의해 확인된 치료제를 포함한다.
또한, 본 발명은 치료제 중 하나 이상을 함유하는 제약 조성물을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 체내 사용에 적합하며, 본 발명의 약학적 활성제의 유효량을 단독으로 또는 하나 이상의 제약학적으로 허용되는 담체와 조합하여 포함한다. 이 제제는 독성이 있다 해도 매우 낮다는 점에서 특히 유용하다. 병리상태를 가진 환자, 예를 들어 본 발명의 방법에 의해서 치료되는 환자는 포유류, 또는 더 구체적으로 사람일 수 있다. 실제로 제제는 이들의 바람직한 생물학적 활성을 발휘하기에 충분한 양으로 투여된다.
본 발명의 제약 조성물은, 예를 들어 상이한 표적 분자에 대해 서로 독립적으로 작용할 수 있는 둘 이상의 제제를 함유할 수 있다. 일부 예에서, 본 발명의 하나 이상의 화합물을 함유하는 본 발명의 제약 조성물은 항염제, 면역자극제, 화학치료제, 항균제 등과 같은 다른 유용한 조성물과 조합하여 투여된다. 또한, 본 발명의 조성물은 상기 설명된 세포독성제, 세포분열억제제, 또는 화학치료제, 예컨대 알킬화제, 항대사물질, 유사분열 억제제 또는 세포독성 항생제와 조합하여 투여될 수 있다. 일반적으로, 이러한 조합에 사용하기 위한 공지된 치료제의 현재 이용가능한 제형이 적합할 것이다.
조합 치료법(또는 "공-치료법")은 치료적 조성물과 적어도 제2 제제의 투여를 포함하며, 이들 치료제의 공-작용으로부터 유익한 효과를 제공하도록 의도된 특정 치료 섭생의 일부로서 투여된다. 조합의 유익한 효과는, 제한은 아니지만 치료제들의 조합으로부터의 결과인 약동학적 또는 약역학적 공-작용을 포함한다. 이들 치료제들의 조합 투여는 전형적으로 규정된 시간 기간에 걸쳐서 수행된다(선택된 조합에 따라서 일반적으로 분, 시간, 일 또는 주).
조합 치료법은, 일반적으로 그런 것은 아니지만, 본 발명의 조합을 우연히 임의로 가져오는 분리된 단일치료법 섭생의 일부로서 이들 치료제 중 둘 이상의 투여를 포괄하도록 의도된다. 조합 치료법은 순차적 방식의 이들 치료제의 투여, 즉 각 치료제가 상이한 시간에 투여되는 것은 물론, 이들 치료제의, 또는 치료제 중 적어도 두 가지의 실질적 동시 방식의 투여를 포괄하도록 의도된다.
실질적 동시 투여는, 예를 들어 각 치료제를 고정 비율로 갖는 단일 캡슐을 대상에 투여하거나, 또는 각 치료제의 단일 캡슐을 나란히 대상에 투여함으로써 달성될 수 있다. 각 치료제의 순차적 또는 실질적 동시 투여는, 제한은 아니지만 국소 경로, 경구 경로, 정맥내 경로, 근육내 경로, 및 점막 조직을 통한 직접 흡수를 포함하는 적절한 경로에 의해서 행해질 수 있다. 치료제들은 동일한 경로 또는 상이한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 선택된 조합의 제1 치료제는 주사에 의해서 투여될 수 있고, 조합의 나머지 치료제는 국소 투여될 수 있다.
제제는 제약학적으로 유용한 조성물을 제조하기 위한 공지된 방법에 따라서 조제될 수 있으며, 여기서 화합물은 제약학적으로 허용되는 담체 비히클과 혼합되어 조합된다. 치료적 제제는 원하는 정도의 순도를 갖는 활성 원료를 선택적인 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제와 혼합함으로써 저장을 위해 동결건조된 제제나 수성 용액의 형태로 제조된다(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제는 이용된 용량 및 농도에서 수혜자에게 비독성이며, 버퍼, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당 알코올, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN™(ICI Americas Inc., 미국 뉴저지주 브릿지워터), PLURONICS™(BASF Corporation, 미국 뉴저지주 마운트올리브) 또는 PEG를 포함한다.
생체내 투여에 사용되어야 하는 제제는 멸균되고 발열원이 없어야 한다. 이것은 동결건조 및 복원 전이나 후에 멸균 여과막을 통한 여과에 의해서 쉽게 달성된다.
투여 경로는 공지된 방법, 예를 들어 정맥내, 복강내, 뇌내, 근육내, 안구내, 동맥내 또는 병소내 경로에 의한 주사 또는 주입, 국소 투여, 또는 지속 방출 시스템에 의한 것에 따른다.
본 발명의 제약 조성물의 용량 및 바람직한 약물 농도는 고안된 특정 용도에 따라서 변할 수 있다. 투여의 적절한 용량이나 경로의 결정은 보통 의사의 기술에 들어간다. 동물 실험은 사람의 치료법을 위한 효과적인 투약의 결정을 위한 신뢰할 수 있는 지침을 제공한다. 효과적인 투약의 종간 규모조정은 Mordenti, J. and Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" In Toxico-kinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96에 공개된 원리에 따라서 수행될 수 있다. 본 발명에서 경구 투여를 위한 제제는 다음과 같이 존재할 수 있다: 분리된 단위, 예컨대 캡슐, 샤세 또는 정제로서, 각각은 정해진 양의 활성제를 함유한다; 분말 또는 과립; 수성 액체 또는 비수 액체 중 활성제의 용액 또는 현탁액; 수중유 액체 에멀젼 또는 유중수 액체 에멀젼; 또는 볼루스 등.
경구 투여를 위한 조성물의 경우(예를 들어, 정제 및 캡슐), 용어 "허용되는 담체"는 비히클, 예컨대 통상의 부형제, 예를 들어 결합제, 예를 들어 시럽, 아카시아, 젤라틴, 소르비톨, 트래거캔스, 폴리비닐피롤리돈(포비돈), 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨카복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 수크로오스 및 녹말; 충전제 및 담체, 예를 들어 옥수수 녹말, 젤라틴, 락토오스, 수크로오스, 미세결정질 셀룰로오스, 카올린, 만니톨, 디칼슘포스페이트, 염화나트륨 및 알긴산; 및 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 스테아레이트 및 다른 금속 스테아레이트, 글리세롤 스테아레이트 스테아르산, 실리콘 유체, 활석 왁스, 오일 및 콜로이드 실리카를 포함한다. 향미제, 예컨대 페퍼민트, 윈터그린 오일, 체리향 등도 또한 사용될 수 있다. 쉽게 식별할 수 있는 제형을 제조하기 위해 착색제를 첨가하는 것이 바람직할 수 있다. 정제는 또한 본 분야에 잘 알려진 방법에 의해서 코팅될 수 있다.
정제는 선택적으로 하나 이상의 부속 원료와 함께 압축 또는 성형에 의해서 제조될 수 있다. 압축 정제는 적합한 기계에서, 선택적으로 바인더, 윤활제, 불활성 희석제, 보존제, 표면활성 또는 분산제와 혼합된 분말이나 과립과 같은 자유 유동 형태의 활성제를 압축함으로써 제조될 수 있다. 성형 정제는 적합한 기계에서 불활성 액체 희석제로 적진 분말형 화합물의 혼합물을 성형함으로써 제조될 수 있다. 정제는 선택적으로 코팅되거나 금이 새겨질 수 있고, 활성제의 지연 또는 제어 방출을 제공하도록 조제될 수 있다.
경구 투여에 적합한 다른 제제는 향미 있는 베이스, 일반적으로 수크로오스 및 아카시아 또는 트래거캔스에 활성제를 포함하는 로젠지; 불활성 베이스, 예컨대 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로오스 및 아카시아에 활성제를 포함하는 캔디형 알약; 및 적합한 액체 담체에 활성제를 포함하는 구강청결제를 포함한다.
비경구 제제는 일반적으로 멸균될 것이다.
제어된 또는 지속 방출 조성물은 친유성 데포(예를 들어, 지방산, 왁스, 오일)에 제제를 포함한다. 또한, 중합체(예를 들어, 폴록사머 또는 폴록사민)로 코팅된 미립자 조성물 및 조직-특이적 수용체, 리간드 또는 항원에 대해 지정된 항체와 결합되거나 또는 조직-특이적 수용체의 리간드와 결합된 화합물이 본원에서 고려된다. 본원에 제시된 조성물의 다른 구체예들은 비경구, 폐, 코 및 구강을 포함하는 다양한 투여 경로를 위한 미립자 형태 보호 코팅, 프로테아제 억제제 또는 침투 증진제를 통합한다.
투여되었을 때 주로 화합물은 점막 표면이나 순환계로부터 빠르게 청소되며, 따라서 비교적 짧게 살아 있는 약학적 활성을 도출할 수 있다. 결론적으로, 치료 효능을 지속하기 위해서 생물활성 화합물의 비교적 큰 용량의 빈번한 투여가 필요할 수 있다. 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜과 폴리프로필렌글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리프롤린과 같은 수용성 중합체의 공유 부착에 의해 변형된 화합물은 상응하는 미변형 화합물보다 정맥내 주사 후 실질적으로 더 긴 혈중 반감기를 나타낸다고 알려져 있다. 이러한 변형은 또한 수성 용액에서 화합물의 용해도를 증가시키고, 응집을 제거하고, 화합물의 물리화학적 안정성을 증진시키고, 화합물의 면역원성 및 반응성을 크게 감소시킬 수 있다. 결과적으로, 이러한 중합체-화합된 애덕트는 미변형된 화합물보다 덜 자주 또는 더 적은 용량의 투여에 의해서 원하는 생체내 생물학적 활성이 달성될 수 있다.
충분한 양은, 제한은 아니지만 약 1μg/kg 내지 약 100μg/kg, 약 100μg/kg 내지 약 1mg/kg, 약 1mg/kg 내지 약 10mg/kg, 약 10mg/kg 내지 약 100mg/kg, 약 100mg/kg 내지 약 500mg/kg 또는 약 500mg/kg 내지 약 1000mg/kg을 포함할 수 있다. 양은 10mg/kg일 수 있다. 조성물의 제약학적으로 허용되는 형태는 제약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
활성 성분을 함유하는 치료적 조성물의 제조는 본 분야에서 잘 이해되고 있다. 전형적으로, 이러한 조성물은 비인두에 송달되는 폴리펩티드의 에어로졸, 또는 액체 용액이나 현탁액인 주사제로서 제조되지만, 주사 전에 액체에서 용액이나 현탁액으로 만들기에 적합한 고체 형태도 또한 제조될 수 있다. 제조물은 또한 에멀젼화될 수 있다. 주로 활성 치료 원료는 제약학적으로 허용되며 활성 원료와 양립가능한 부형제와 혼합된다. 적합한 부형제는, 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로오스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 조합이다. 이에 더하여, 원한다면 조성물은 활성 원료의 유효성을 증진시키는 습윤 또는 유화제, pH 완충제와 같은 보조 물질을 소량 함유할 수 있다.
활성 성분은 중화된 제약학적으로 허용되는 염 형태로서 치료적 조성물로 조제될 수 있다. 제약학적으로 허용되는 염은 산 부가 염(폴리펩티드의 자유 아미노기와 함께 형성됨)을 포함하며, 이들은 무기산, 예컨대 예를 들어 염산 또는 인산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산으로 형성된다. 자유 카복실기로부터 형성된 염들은 또한 무기 염기, 예컨대 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 수산화철, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유래될 수 있다.
본원에 제공된 치료적 조성물의 성분 또는 성분들은 비경구, 경점막, 예를 들어 구강, 코, 폐, 또는 직장, 또는 경피 방식으로 도입될 수 있다. 바람직하게, 투여는 비경구 투여로서, 예를 들어 정맥내 주사를 통해서 투여되며, 또한 제한은 아니지만 동맥내, 근육내, 피내, 피하, 복강내, 심실내, 및 두개내 투여도 포함된다. 용어 "단위 투약"은 본원에 제공된 치료적 조성물을 언급하며 사용되었을 때 사람에 대한 단위 용량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 말하며, 각 단위는 필요한 희석제, 즉 담체 또는 비히클과 함께 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 활성 물질의 정해진 양을 함유한다.
다른 구체예에서, 활성 화합물은 소포, 특히 리포솜에서 송달될 수 있다(참조 Langer (1990) Science 249:1527-1533; Treat et al, in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; 일반적으로 앞의 같은 책 참조).
또 다른 구체예에서, 치료적 화합물은 제어된 방출 시스템에서 송달될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 정맥내 주입, 이식가능한 삼투 펌프, 경피 패치, 리포솜 또는 다른 투여 방식을 사용하여 투여될 수 있다. 한 구체예에서, 펌프가 사용될 수 있다(Langer, supra; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al. (1980) Surgery 88:507; Saudek et al. (1989) N. Engl. J. Med. 321:574 참조). 다른 구체예에서, 중합성 물질이 사용될 수 있다(Medical Appli-cations of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York(1984); Ranger and Peppas (1983) J Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 참조; 또한 Levy et al. (1985) Science 228:190; During et al. (1989) Ann. Neurol. 25:351; Howard et al. (1989) J Neurosurg. 71:105 참조). 또 다른 구체예에서, 제어된 방출 시스템은 치료 표적, 즉 뇌나 종양 근처에 위치될 수 있으며, 따라서 전신 투약의 일부만 필요하다(예를 들어, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984) 참조). 다른 제어된 방출 시스템이 리뷰로서 Langer (1990) Science 249:1527-1533에 논의된다.
상기 제시된 활성 성분의 투여가 감염성 질환 유기체에 의한 감염에 대한 효과적인 치료 섭생이 되는 대상은 바람직하게 사람이지만, 어떤 동물일 수도 있다. 따라서, 당업자에 의해서 쉽게 인정되는 대로, 본원에 제공된 방법 및 제약 조성물은 어떤 동물, 특히 포유류, 제한은 아니지만 집 동물, 예컨대 고양이 또는 개 대상, 농장 동물, 예컨대 제한은 아니지만 소, 말, 염소, 양 및 돼지 대상, 야생 동물(야생에서 살든지 동물원에서 살든지), 연구 동물, 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 염소, 양, 돼지, 개, 고양이 등을 포함하는 동물에, 즉 수의학적 용도를 위한 투여에 특히 적합하다.
본원에 제공된 치료 방법 및 조성물에서 활성 성분의 치료적 유효 용량이 제공된다. 치료적 유효 용량은 본 분야에 잘 알려진 대로 환자 특징(나이, 체중, 성별, 상태, 합병증, 다른 질환 등)에 기초하여 통상의 숙련된 의료 업무원에 의해서 결정될 수 있다. 또한, 추가의 통상적 연구가 수행됨에 따라 다양한 환자에서 다양한 상태의 치료를 위한 더욱 구체적인 정보가 적절한 용량 수준에 관하여 출현할 것이며, 당업자는 수혜자의 치료 내용, 나이 및 일반적 건강을 고려하여 적절한 투약방식을 확인할 수 있다. 일반적으로, 정맥내 주사 또는 주입의 경우, 용량은 복강내, 근육내 또는 다른 투여 경로보다 낮을 수 있다. 투약방식 일정은 순환 반감기, 및 사용된 제제에 따라서 변할 수 있다. 조성물은 치료적 유효량으로 용량 제제와 양립가능한 방식으로 투여된다. 투여될 필요가 있는 활성 성분의 정확한 양은 의사의 판단에 따르며, 각 개체에 특유하다. 그러나, 적합한 용량은 매일 개체의 킬로그램 체중당 활성 원료가 약 0.1 내지 20, 바람직하게 약 0.5 내지 약 10, 더 바람직하게 1 내지 수 밀리그램의 범위일 수 있고, 이것은 투여 경로에 의존한다. 또한, 초기 투여 및 부스터 샷을 위한 적합한 섭생은 가변적이지만, 초기 투여와 후속 주사 또는 다른 투여에 의한 1시간 이상 간격의 뒤따른 반복 투약에 의해 정형화된다. 또는 달리, 혈중 10 나노몰 내지 10 마이크로몰의 농도를 유지하기에 충분한 연속 정맥내 주입이 고려된다.
또한, 본원에 제공된 적어도 하나의 단백질과 다른 치료적으로 효과적인 약물, 예컨대 항생제 또는 화학치료제를 포함하는 건조 분말 제제가 고려된다.
경구 고체 제형이 본원에서 사용하기 위해 고려되며, 이것은 일반적으로 본원에 참고로 포함되는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. 1990(Mack Publishing Co. Easton PA 18042)-Chapter 89에 설명된다. 고체 제형은 정제, 캡슐, 알약, 트로쉐 또는 로젠지, 샤세 또는 펠릿을 포함한다.
또한, 리포솜 또는 프로테이노이드 캡슐화가 본 발명의 조성물을 조제하는데 사용될 수 있다(예를 들어, 미국특허 제4,925,673호에 보고된 프로테이노이드 마이크로스피어로서). 리포솜 캡슐화가 사용될 수 있으며, 리포솜은 다양한 중합체로 유도체화될 수 있다(예를 들어, 미국특허 제5,013,556호). 치료제를 위한 가능한 고체 제형의 설명이 여기 참고로 포함되는 Marshall, K. In: Modern Pharmaceutics Edited by G.S. Banker and C.T. Rhodes Chapter 10, 1979에 주어진다. 일반적으로, 제제는 성분 또는 성분들(또는 그것의 화학적으로 변형된 형태)과 위 환경에 대한 보호, 및 장에서 생물학적으로 활성인 물질의 방출을 허용하는 불활성 원료를 포함할 것이다.
또한, 상기 유도체화된 성분 또는 성분들의 경구 제형이 구체적으로 고려된다. 성분 또는 성분들은 유도체의 경구 송달이 유효하도록 화학적으로 변형될 수 있다. 일반적으로, 고려되는 화학적 변형은 성분 분자 자체에 적어도 하나의 부분의 부착이며, 여기서 상기 부분은 (a) 단백질 가수분해의 억제; 및 (b) 위나 장으로부터 혈류로의 흡수를 허락한다. 또한, 성분 또는 성분들의 전체적인 안정성의 증가와 체내에서 순환 시간의 증가가 바람직하다. 이러한 부분의 예들은 폴리에틸렌글리콜, 에틸렌글리콜과 프로필렌글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리프롤린을 포함한다(Abuchowski and Davis (1981) "Soluble Polymer-Enzyme Abducts" In: Enzymes as Drugs, Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY, pp. 367-383; Newmark, et al. (1982) J Appl. Biochem. 4: 185-189). 사용될 수 있는 다른 중합체들은 폴리-1,3-디옥솔란 및 폴리-1,3,6-티옥소칸이다. 상기 나타낸 대로 제약학적 용법을 위해서는 폴리에틸렌글리콜 부분이 바람직하다.
성분(또는 유도체)의 경우 방출 장소는 위, 소장(십이지장, 공장 또는 회장) 또는 대장일 수 있다. 당업자는 위에서는 용해하지 않지만 십이지장이나 장의 다른 곳에서 물질을 방출하는 제제를 이용할 수 있다. 바람직하게, 방출은 단백질(또는 유도체)의 보호에 의해서 또는 위 환경을 지나서, 예컨대 장에서 생물학적으로 활성인 물질의 방출에 의해서 위 환경의 해로운 효과를 회피할 것이다.
충분한 위 저항성 확보를 위해 적어도 pH 5.0까지 불침투성인 코팅이 필수적이다. 장 코팅으로 사용되는 더욱 흔한 불활성 원료의 예들은 셀룰로오스아세테이트 트리멜리테이트(CAT), 히드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트(HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트(PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트(CAP), Eudragit L, Eudragit S, 및 Shellac이다. 이들 코팅은 혼합된 필름으로 사용될 수 있다.
코팅 또는 코팅의 혼합물이 또한 정제에 사용될 수 있으며, 이것은 위에 대한 보호를 의도하지는 않는다. 이것은 당 코팅, 또는 정제를 삼키는 것을 더 쉽게 하는 코팅을 포함할 수 있다. 캡슐은 건조 치료제, 즉 분말의 송달을 위한 경질 외피(예컨대 젤라틴)로 구성될 수 있고, 액체 형태의 경우 연질 젤라틴 외피가 사용될 수 있다. 샤세의 외피 재료는 두꺼운 녹말이나 다른 먹을 수 있는 종이일 수 있다. 알약, 로젠지, 성형된 정제 또는 정제 가루약의 경우에는 수분 질량화 기술이 사용될 수 있다.
펩티드 치료제가 입자 크기 약 1mm의 과립 또는 펠릿 형태의 미세한 다중미립자로서 제제에 포함될 수 있다. 캡슐 투여를 위한 물질의 제제는 또한 분말, 가볍게 압축된 플러그 또는 심지어 정제일 수 있다.
불활성 물질로 치료제의 부피를 희석하거나 증가시킬 수 있다. 이들 희석제는 탄수화물, 특히 만니톨, a-락토오스, 무수 락토오스, 셀룰로오스, 수크로오스, 변형된 덱스트란 및 녹말을 포함할 수 있다. 칼슘 트리포스페이트, 마그네슘 카보네이트 및 염화나트륨을 포함하는 어떤 무기염이 또한 충전제로 사용될 수 있다. 일부 상업적으로 이용가능한 희석제는 Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress 및 Avicell이다.
고체 제형으로 치료제의 조제시 붕해제가 포함될 수 있다. 붕해제로 사용되는 물질은, 제한은 아니지만 녹말에 기초한 상업적 붕해제인 Explotab를 포함해서 녹말을 포함한다. 나트륨 녹말 글리콜레이트, Amberlite, 나트륨 카복시메틸셀룰로오스, 울트라아밀로펙틴, 나트륨 알기네이트, 젤라틴, 오랜지 껍질, 산 카복시메틸셀룰로오스, 천연 스폰지 및 벤토나이트가 모두 사용될 수 있다. 붕해제의 다른 형태는 불용성 양이온 교환 수지이다. 분말형 검은 붕해제 및 바인더로 사용될 수 있고, 이들은 아가, 카라야 또는 트래거캔스와 같은 분말형 검을 포함할 수 있다. 알긴산과 그것의 나트륨염도 붕해제로서 유용하다. 바인더는 경질 정제를 형성하기 위해 치료제를 함께 고정하도록 사용될 수 있으며, 아카시아, 트래거캔스, 녹말 및 젤라틴과 같은 천연 생성물로부터의 물질을 포함한다. 다른 것들은 메틸셀룰로오스(MC), 에틸셀룰로오스(EC) 및 카복시메틸셀룰로오스(CMC)를 포함한다. 폴리비닐피롤리돈(PVP) 및 히드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC)는 둘 다 치료제를 과립화하기 위해 알콜계 용매에 사용될 수 있다.
조제 과정 동안 점착을 방지하기 위해서 치료제의 조제시 항마찰제가 포함될 수 있다. 윤활제는 치료제와 작업대 벽 사이의 층으로 사용될 수 있으며, 이들은 제한은 아니지만, 마그네슘염과 칼슘염을 포함하는 스테아르산, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 액체 파라핀, 식물성 오일 및 왁스를 포함할 수 있다. 가용성 윤활제, 예컨대 나트륨라우릴설페이트, 마그네슘라우릴설페이트, 다양한 분자량의 폴리에틸렌글리콜, Carbowax 4000 및 6000도 또한 사용될 수 있다.
조제 동안 약물의 유동 특성을 개선할 수 있고, 압축 동안 재배열을 돕기 위한 활택제가 첨가될 수 있다. 활택제는 녹말, 활석, 발열 실리카 및 수화된 실리코알루미네이트를 포함할 수 있다.
수성 환경에서 치료제의 용해를 돕기 위해 계면활성제가 습윤제로서 첨가될 수 있다. 계면활성제는 음이온성 세정제, 예컨대 나트륨라우릴설페이트, 디옥틸나트륨설포석시네이트 및 디옥틸나트륨설포네이트를 포함할 수 있다.
양이온성 세정제가 사용될 수 있으며, 염화벤잘코늄 또는 염화벤제토뮴을 포함할 수 있다. 계면활성제로서 제제에 포함될 수 있는 가능한 비이온성 세정제의 리스트는 라우로매크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유 10, 50 및 60, 글리세롤모노스테아레이트, 폴리소르베이트 40, 60, 65 및 80, 수크로오스 지방산 에스테르, 메틸셀룰로오스 및 카복시메틸셀룰로오스이다. 이들 계면활성제는 단독으로 또는 상이한 비율의 혼합물로서 단백질 또는 유도체의 제제에 존재할 수 있다.
단백질(또는 유도체)의 흡수를 잠재적으로 증진시키는 첨가제는, 예를 들어 지방산 올레산, 리놀레산 및 리놀렌산이다.
한 구체예에서, 방법은 본원에 제공된 퍼포린-2 발현, 기능 또는 활성과 관련된 다양한 표적 분자 중 어느 것, 또는 퍼포린-2 발현, 기능 또는 활성과 관련된 하나 이상의 표적 분자의 기능 또는 활성을 조정하는 본원에 제공된 다양한 제제 중 어느 것을 대상에 투여하기 위한 바이러스의 사용을 포함한다. 투여는 재조합 레트로바이러스, 재조합 아데노-관련 바이러스, 재조합 아데노바이러스, 및 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스와 같은, 본원에 제공된 표적 분자 또는 제제 중 어느 것을 발현하는 바이러스의 사용에 의해서 이루어질 수 있다(예를 들어, Mulligan, Science 260:926 (1993), Rosenberg et al, Science 242:1575 (1988), LaSalle et al, Science 259:988 (1993), Wolff et al, Science 247: 1465 (1990), Breakfield and Deluca, The New Biologist 5:203 (1991) 참조).
본원에 제공된 다양한 표적 분자 또는 제제 중 어느 것을 암호화하는 유전자가 재조합 바이러스 벡터, 예를 들어 아데노바이러스 벡터(예를 들어, Kass-Eisler et al, Proc. Nat'lAcad. Sci. USA 90:11498 (1993), Kolls et al, Proc. Nat' lAcad. Sci. USA 91:2X5 (1994), Li et al, Hum. Gene Ther. 4:403(1993), Vincent et al, Nat. Genet. 5:130 (1993) 및 Zabner et al, Cell 75:207 (1993)), 아데노바이러스-관련 바이러스 벡터(Flotte et al, Proc. Nat'l Acad. Set USA 90:10613 (1993)), 알파바이러스, 예컨대 샘리키숲열 바이러스 및 신드비스 바이러스(Hertz and Huang, J Vir. 66:857 (1992), Raju and Huang, J. Vir. 55:2501 (1991), 및 Xiong et al, Science 243:1188 (1989)), 헤르페스 바이러스 벡터(예를 들어, 미국특허 No. 4,769,331, 4,859,587, 5,288,641 및 5,328,688), 파보바이러스(Koering et al, Hum. Gene Therap. 5:457 (1994)), 수두 바이러스 벡터(Ozaki et al, Bio-chem. Biophys. Res. Comm. 193:653 (1993), Panicali and Paoletti, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79:4927 (1982)), 수두 바이러스, 예컨대 카나리아 수두 바이러스 또는 우두 바이러스(Fisher-Hoch et al, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:317(1989) 및 Flexner et al, Ann. N. Y. Acad. Sci. 5(59:86 (1989)), 및 레트로바이러스(예를 들어, Baba et al, J. Neurosurg 79:729 (1993), Ram et al, Cancer Res. 53:83 (1993), Takamiya et al, J. Neurosci. Res 55:493 (1992), Vile and Hart, Cancer Res. 55:962 (1993), Vile and Hart, Cancer Res. 55:3860 (1993), 및 Anderson et al, 미국특허 No. 5,399,346)를 사용하여 송달될 수 있다. 다양한 구체예에서, 바이러스 벡터 자체, 또는 바이러스 벡터를 함유한 바이러스 입자가 아래 설명된 방법에서 이용될 수 있다.
하나의 시스템의 예시로서, 아데노바이러스, 이중가닥 DNA 바이러스가 이종성 핵산 분자의 송달을 위한 잘 특성화된 유전자 전달 벡터이다(리뷰는 Becker et al, Meth. Cell Biol. 45:161 (1994); Douglas and Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)을 참조한다).
아데노바이러스 시스템은 (i) 비교적 큰 DNA 삽입체를 수용할 수 있는 능력, (ii) 높은 역가까지 성장될 수 있는 능력, (ii) 광범위한 포유류 세포 타입을 감염시킬 수 있는 능력, 및 (iv) 편재하며 조직 특이적이고 조정가능한 프로모터를 포함하는 많은 상이한 프로모터와 함께 사용될 수 있는 능력을 포함하여 몇몇 이점을 제공한다. 이에 더하여, 아데노바이러스는 이 바이러스가 혈류에서 안정하기 때문에 정맥내 주사에 의해서 투여될 수 있다.
아데노바이러스 게놈의 일부가 결실된 아데노바이러스 벡터를 사용하여 직접 라이게이션에 의해서 또는 공-트랜스펙션된 플라스미드와의 동종성 재조합에 의해서 바이러스 DNA에 삽입체가 통합된다. 예시적인 시스템에서, 바이러스 벡터로부터 필수 E1 유전자가 결실되며, 이 바이러스는 E1 유전자가 숙주 세포에 의해 제공되지 않는 한 복제하지 않을 것이다. 무손상 동물에 정맥내 투여되었을 때 아데노바이러스는 우선 간을 표적으로 한다. E1 유전자 결실을 가진 아데노바이러스 송달 시스템은 숙주 세포에서 복제할 수 없지만, 숙주의 조직은 암호화된 이종성 단백질을 발현하고 가공할 것이다. 숙주 세포는 또한 상응하는 유전자가 분비 신소 서열을 포함한다면 이종성 단백질을 분비할 것이다. 분비된 단백질은 이종성 유전자를 발현한 조직으로부터 순환계로 들어갈 것이다(예를 들어, 매우 혈관화된 간).
더욱이, 바이러스 유전자의 다양한 결실을 함유하는 아데노바이러스 벡터는 벡터에 대한 면역 반응을 감소시키거나 제거하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 아데노바이러스는 E1-결실되며, 추가로 E2A 또는 E4의 결실을 함유한다(Lusky et al, J. Virol. 72:2022 (1998); Raper et al, Human Gene Therapy 9:671 (1998)). 또한, 면역 반응을 감소시키기 위한 E2b의 결실이 보고되었다(Amalfitano et al, J. Virol. 72:926 (1998)). 전체 아데노바이러스 게놈을 결실시킴으로써 이종성 DNA의 매우 큰 삽입체가 수용될 수 있다. 소위 말하는 "거트리스" 아데노바이러스로서 모든 바이러스 유전자가 결실된 것의 생성이 이종성 DNA의 큰 삽입체의 삽입에 특히 유익하다(리뷰는 Yeh. and Perricaudet, FASEBJ. 11:615 (1997)를 참조한다).
치료적 유전자를 발현할 수 있는 재조합 바이러스의 높은 역가의 스톡이 표준 방법을 사용하여 감염된 포유류 세포로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스가 Brandt et al., J Gen. Virol. 72:2043 (1991), Herold et al., J. Gen. Virol. 75:1211 (1994), Visalli and Brandt, Virology 185:419(1991), Grau et al, Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 30:2474(1989), Brandt et al, J. Virol. Meth. 36:209 (1992), 및 Brown and MacLean (eds.), HSV Virus Protocols(Humana Press 1997)에 설명된 대로 Vero 세포에서 제조될 수 있다.
재조합 바이러스로 치료된 대상이 사람일 때, 치료법은 체세포 유전자 치료법이 바람직하다. 즉, 재조합 바이러스에 의한 사람의 바람직한 치료는 사람 점라인의 일부를 형성할 수 있고, 대대로 전해질 수 있는(즉, 사람 점라인 유전자 치료법) 핵산 분자를 세포에 도입하는 것을 수반하지 않는다.
감염성 유기체
본원에서 사용된 "감염성 유기체"는, 제한은 아니지만 예를 들어 박테리아, 바이러스, 진균, 기생충 및 원충을 포함할 수 있다.
심각한 사람 질환을 야기하는 특히 바람직한 박테리아는 그램 양성 유기체; 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스(MRSA), 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis) 및 E. faecium, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae) 및 그램 음성 유기체: 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 버크홀디아 세파시아(Burkholdia cepacia), 잔토모나스 말토필라(Xanthomonas maltophila), 에스체리키아 콜리(Escherichia coli), 장병원성 E. coil(EPEC), 엔테로박터(Enterobacter spp.), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)를 포함하는 클라미디아(Chlamydia spp.), 및 살모넬라(Salmonella spp.)이다.
다른 바람직한 구체예에서, 박테리아는 그램 음성 박테리아이다.
예들은 슈도모나스 아에루기노사; 버크홀디아 세파시아; 잔토모나스 말토필리아; 에스체리키아 콜리; 엔테로박터; 클렙시엘라 뉴모니아에; 살모넬라를 포함한다.
또한, 본 발명은 미코박테리움(Mycobacterium spp.), 미코박테리움 투베쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica); 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 트리파노소마 부루세이(Trypanosoma brucei), 레이슈마니아 멕시카나(Leishmania mexicana), 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum), 스타필로코쿠스 아우레우스, 구제역 바이러스 및 크리티디아 파스시쿨라타(Crithidia fasciculata)에 의한 감염을 포함하는 질환의 치료 방법, 뿐만 아니라 골다공증, 자가면역, 주혈흡충증, 말라리아, 종양 전이, 이염성백질이영양증, 근이영양증 및 위축의 치료 방법을 제공한다.
다른 예들은 동물 및 사람의 병원성 원충, 정복합체충문 또는 육질편모충류의 세포내 활성 기생충, 트리파노소마, 플라스모디아, 레이슈마니아, 바베시아 및 테일레리아, 크립토스포리디아, 사크로시스티다, 아모에바, 코시디아 및 트리코모나디아를 포함한다. 이들 화합물은, 예를 들어 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum)에 의해서 야기된 말라리아 트로피카(Malaria tropica), 플라스모디움 비박스(Plasmodium vivax) 또는 플라스모디움 오발레(Plasmodium ovale)에 의해서 야기된 말라리아 테르티아나(Malaria tertiana)의 치료 및 플라스모디움 말라리아에(Plasmodium malariae)에 의해서 야기된 말라리아 퀴아르타나(Malaria quartana)의 치료에도 또한 적합하다. 이들은 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii)에 의해서 야기된 톡소플라즈마증, 예를 들어 이소스포라 벨리(Isospora belli)에 의해서 야기된 콕시디아증, 사르코시스티스 슈호미니스(Sarcocystis suihominis)에 의해서 야기된 장 주육포자충증, 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica)에 의해서 야기된 이질, 크립토스포리디움 파붐(Cryptosporidium parvum)에 의해서 야기된 크립토스포리디움증, 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi)에 의해서 야기된 샤가스병, 트리파노소마 브루세이 로데시엔스 또는 감비엔스(Trypanosoma brucei rhodesiense 또는 gambiense)에 의해서 야기된 수면병, 피부 및 내장뿐만 아니라 다른 형태의 레이쉬마니아증의 치료에도 또한 적합하다. 이들은 테일레리아 파바(Theileria parva) 같은 동물의 병원성 원충, 소 이스트코스트 열병을 일으키는 병원체, 트리파노소마 콘골렌스콘골렌스(Trypanosoma congolense congolense) 또는 트리파노소마 비박스 비박스(Trypanosoma vivax vivax), 트리파노소마 부루세이 부루세이(Trypanosoma brucei brucei), 아프리카에서 나가나 소 질환을 일으키는 병원체, 수라증을 일으키는 트리파노소마 부루세이 에반시(Trypanosoma brucei evansi), 바베시아 비게미나(Babesia bigemina), 소 및 물소에서 텍사스 열병을 일으키는 병원체, 바베시아 보비스(Babesia bovis), 유럽 소 바베시아 감염증뿐만 아니라 개, 고양이 및 양에서 바베시아 감염증을 일으키는 병원체, 양, 소 및 돼지에서 주육포자충을 일으키는 사르코시스티스 오비카니스 및 오비펠리스(Sarcocystis ovicanis 및 ovifelis) 병원체, 크립토스포리디아(Cryptosporidia), 소 및 조류에서 크립토스포리디움증을 일으키는 병원체, 아이메리아 및 이소스포라 종들, 토끼, 소, 양, 염소, 돼지 및 조류에서, 특히 닭 및 칠면조에서 콕시디아증을 일으키는 병원체에 의해서 감염된 동물의 치료에도 또한 적합하다. 리케치아는 리케치아 펠리스(Rickettsia felis), 리케치아 프로와제키(Rickettsia prowazekii), 리케치아 리켓시(Rickettsia rickettsii), 리케치아 티파이(Rickettsia typhi), 리케치아 코노리(Rickettsia conorii), 리케치아 아프리카에(Rickettsia africae)와 같은 종들을 포함하며, 티푸스, 리케치아두창, 부톤네즈열, 아프리카 틱바이트 열병, 로키산 홍반열, 호주 진드기 티푸스, 플랜더스섬 홍반열 및 퀸즈랜드 진드기 티푸스와 같은 질환을 일으킨다. 이들 질환의 치료에서 본 발명의 화합물이 다른 제제와 조합될 수 있다.
본 발명에 따른 사람 질환과 관련되거나 야기하는 특히 바람직한 진균은 (제한은 아니지만) 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 히스토플라스마 네오포르만스(Histoplasma neoformans), 코시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis) 및 페니실리움 마르네페이(Penicillium marneffei)를 포함한다.
트랜스제닉 동물
퍼포린-2의 기능적 활성은 트랜스제닉 방식으로 평가될 수 있다. 이와 관련해, 트랜스제닉 마우스 모델이 사용될 수 있다. 퍼포린-2 유전자는 트랜스제닉 마우스를 이용한 상보 연구에 사용될 수 있다. 후보 유전자의 야생형 유전자좌에 상응하는 바이러스 벡터, 또는 코스미드 클론(또는 파지 클론)을 포함하는 트랜스제닉 벡터가 분리된 퍼포린-2 유전자를 사용하여 구성될 수 있다. 코스미드가 트랜스제닉 마우스에 공개된 과정을 사용하여 도입될 수 있다[Jaenisch (1988) Science 240:1468-1474]. 유전적 의미에서 트랜스젠은 억제인자 돌연변이로 작용한다.
또는 달리, 퍼포린-2 유전자의 발현이 파괴된 트랜스제닉 동물 모델이 제조될 수 있다. 유전자 산물의 표현형 효과를 평가하기 위한 한 가지 표준 방법은 유전자를 결실시키거나 비활성화하는 녹아웃 기술을 이용하는 것이다. 본원에서 사용된 용어 "파괴" 또는 "녹아웃"은 세포에서 DNA 서열에 의해서 암호화된 단백질의 적어도 일부의 발현의 부분적 또는 완전한 억제를 말한다. "부분적" 억제 또는 비활성화는 유전자 발현이 유전자가 파괴되지 않았을 때의(즉, 야생형) 유전자 발현과 비교하여 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상까지 감소된다는 것을 의미한다. "완전한 억제"는 기능적 단백질이 전혀 발현되지 않는다는 것을 의미한다(즉, 유전자 발현의 100% 억제).
녹아웃은 이형접합성 돌연변이체와 동형접합성 돌연변이체를 모두 포함한다. 본원에서 사용된 "이형접합성" 유전자 파괴 또는 녹아웃은 하나의 결함 있는 대립형질과 하나의 야생형 대립형질을 포함한다. "동형접합성" 유전자 파괴 또는 녹아웃은 결함 있는 두 대립형질을 포함한다. 예를 들어, 동형접합성 녹아웃 마우스는 유전자의 두 대립형질의 파괴를 모두 포함하고, 이형접합성 녹아웃 마우스는 유전자의 하나의 대립형질의 파괴를 포함한다. 유전자 또는 녹아웃을 언급하면서 본원에서 사용된 "야생형"은 유전자의 자생, 비-돌연변이 또는 비-파괴된 형태를 말한다.
퍼포린-2 유전자가 파괴된 트랜스제닉 동물이 본원에 제공된다. 한 구체예에서, 퍼포린-2 단백질을 암호화하는 유전자의 파괴를 포함하는 트랜스제닉 마우스가 제공된다. 일부 구체예에서, 퍼포린-2 유전자의 파괴는 이형접합성 또는 동형접합성일 수 있다.
특정 구체예에서, 동형접합성 파괴는 퍼포린-2 유전자를 비활성화하고, 트랜스제닉 마우스에서 기능적 퍼포린-2 단백질의 발현을 억제한다.
다른 구체예에서, 유전자 파괴는 퍼포린-2 유전자를 부분적으로 비활성화한다. 특정 구체예에서, 유전자 파괴는 이형접합성이다.
이러한 구체예에서, 트랜스제닉 퍼포린-2 녹아웃 마우스는 야생형 마우스와 비교하여 세포내 병원체에 의한 감염에 대해 증가된 민감성을 나타낸다.
또한, 퍼포린-2 유전자 파괴를 포함하는 트랜스제닉 마우스로부터 유래된 기관, 조직, 세포, 또는 세포주이 본원에 제공된다.
또는 달리, 넌센스 및 앰버 돌연변이와 같은 돌연변이, 또는 비활성 단백질의 발현을 초래하는 돌연변이를 도입하기 위해 재조합 기술이 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 퍼포린-2 유전자는 야생형 동물에서 안티센스 방향으로 발현되었을 때 이들의 표현형 효과를 검사함으로써 시험될 수 있다. 이 접근법에서, 돌연변이체 표현형을 초래하는 야생형 대립형질의 발현이 억제된다. RNAxRNA 듀플렉스 형성(안티센스-센스)은 mRNA의 정상적인 취급을 방지하며, 그 결과 야생형 유전자 효과의 부분적 또는 완전한 제거를 가져온다. 이 기술은 조직 배양물에서 TK 합성을 억제하고, 초파리에서 Kruppel 돌연변이와 마우스에서 Shiverer 돌연변이의 표현형을 생성하기 위해서 사용되었다[Izant et al. Cell (1984) 36:1007-1015; Green et al. (1986) Annu. Rev. Biochem. 55:569-597; Katsuki et al. (1988) Science 241.-593-595]. 이 접근법의 중요한 이점은 전체 동족 mRNA의 발현의 효과적인 억제를 위해 유전자의 아주 적은 일부만 발현이 필요하다는 것이다. 안티센스 트랜스젠은 그 자신의 프로모터나 적절한 세포 타입에서 발현된 다른 프로모터의 제어하에 있을 것이며, SV40 polyA 부위의 상류에 위치될 것이다. 이 트랜스젠은 트랜스제닉 마우스를 제조하는데, 또는 유전자 녹아웃 기술을 사용함으로써 사용될 것이다.
본 개시에서는 본 발명의 바람직한 구체예들만 설명되지만, 몇몇 예들은 여러 목적으로 설명된다. 본 발명이 다양한 다른 조합 및 환경에서 사용할 수 있다는 것과 여기 표현된 본 발명의 개념의 범위 내에서 변화 또는 변형이 있을 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 예를 들어 당업자는 본원에 설명된 구체적인 물질 및 과정에 대한 많은 등가물을 단지 통상적 실험을 사용하여 확인할 수 있거나, 또는 인정할 것이다. 이러한 등가물은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
본 출원에 인용된 모든 간행물 및 특허 문헌은 각 개별 간행물 또는 특허 문헌이 그렇게 개별적으로 나타내는 것과 마찬가지로 동일한 범위까지 모든 목적에서 적절한 부분에 참고로 포함된다. 이 문헌에서 다양한 참고자료들 인용되었다 해서 출원인이 어떤 특정 참고자료를 자신의 발명에 대한 "선행기술"로서 인정하는 것은 아니다.
본원에 개시된 방법 및 조성물의 비제한적 예들은 다음과 같다:
1. 퍼포린-2(P2) 발현, 기능 또는 활성과 관련된 하나 이상의 분자의 기능, 활성 또는 발현을 조정하는 적어도 하나의 제제의 유효량을, 시험관내에서 세포와 접촉시키거나 또는 환자에 투여하는 단계; 및 P2의 기능 또는 발현을 조정하는 단계를 포함하는, 시험관내 또는 생체내에서 P2의 기능, 활성 또는 발현을 조정하는 방법.
2. 구체예 1에 있어서, P2 기능, 활성 또는 발현과 관련된 하나 이상의 분자는 src, 유비퀴틴 콘쥬게이팅 효소 E2M, GAPDH, P21RAS/gap1m, 갈렉틴 3, 유비퀴틴 C(UCHL1), 프로테아솜, 또는 이들의 단편을 포함하는 방법.
3. 구체예 2에 있어서, P2 발현, 기능 또는 활성은 P2 기능, 발현 또는 활성과 관련된 하나 이상의 분자의 기능, 활성 또는 발현을 상향조정하는 적어도 하나의 제제의 투여에 의해서 상향조정되는 방법.
4. 구체예 2에 있어서, P2 발현, 기능 또는 활성은 P2 기능, 발현 또는 활성과 관련된 하나 이상의 분자의 기능, 활성 또는 발현을 하향조정하는 적어도 하나의 제제의 투여에 의해서 하향조정되는 방법.
5. 구체예 2에 있어서, P2 발현, 기능 또는 활성은 P2 기능, 발현 또는 활성과 관련된 적어도 두 분자의 기능, 활성 또는 발현을 독립적으로 상향조정 또는 하향조정하는 적어도 하나의 제제의 투여에 의해서 상향조정되는 방법.
6. 구체예 2에 있어서, P2 발현, 기능 또는 활성은 P2 기능, 발현 또는 활성과 관련된 적어도 두 분자의 기능, 활성 또는 발현을 독립적으로 상향조정 또는 하향조정하는 적어도 하나의 제제의 투여에 의해서 하향조정되는 방법.
7. 구체예 2에 있어서, P2 발현, 기능 또는 활성은 P2 기능, 발현 또는 활성과 관련된 적어도 두 분자의 기능, 활성 또는 발현을 독립적으로 상향조정 또는 하향조정하는 적어도 두 제제의 조합의 투여에 의해서 상향조정되는 방법.
8. 구체예 2에 있어서, P2 발현, 기능 또는 활성은 P2 기능, 발현 또는 활성과 관련된 적어도 두 분자의 기능, 활성 또는 발현을 독립적으로 상향조정 또는 하향조정하는 적어도 두 제제의 조합의 투여에 의해서 하향조정되는 방법.
9. 구체예 2에 있어서, P2 분자의 발현, 기능 또는 활성을 직접 조정하는 제제를 투여하는 선택적 단계를 포함하는 방법.
10. 구체예 9에 있어서, 분자는 P2의 전사 또는 번역을 억제하는 방법.
11. 구체예 1에 있어서, 제제는 소 분자, 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 변형된 펩티드, 변형된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 합성 분자, 천연 분자, 유기 또는 무기 분자, 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
12. src, 유비퀴틴 콘쥬게이팅 효소 E2M, GAPDH, P21RAS/gap1m, 갈렉틴 3, 유비퀴틴 C(UCHL1), 프로테아솜, 또는 이들의 단편을 포함하는 하나 이상의 표적 분자를 발현하는 세포를 접촉시키는 단계; 분자의 발현, 기능 또는 활성을 측정하는 단계; 분자의 발현, 기능 또는 활성을 대조군과 비교하는 단계; 및 후보 치료제를 확인하는 단계를 포함하는, 후보 치료제를 확인하는 방법.
13. 구체예 12에 있어서, 후보 치료제는 표적 분자 중 하나 이상의 발현, 기능 또는 활성을 조정하는 방법.
14. 구체예 12에 있어서, 후보 치료제는 복수의 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성을 조정하는 방법.
15. 구체예 12에 있어서, 후보 치료제는 표적 분자 중 하나 이상의 발현, 기능 또는 활성을 상향조정하는 방법.
16. 구체예 12에 있어서, 후보 치료제는 표적 분자 중 하나 이상의 발현, 기능 또는 활성을 하향조정하는 방법.
17. 구체예 12에 있어서, 하나 이상의 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성의 조정은 퍼포린-2(P2) 분자의 발현, 기능 또는 활성을 조정하는 방법.
18. 구체예 17에 있어서, 하나 이상의 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성의 상향조정은 퍼포린-2(P2) 분자의 발현, 기능 또는 활성을 상향조정하는 방법.
19. 구체예 17에 있어서, 하나 이상의 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성의 하향조정은 퍼포린-2(P2) 분자의 발현, 기능 또는 활성을 하향조정하는 방법.
20. 구체예 12에 있어서, 표적 분자는 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 발현된 산물인 방법.
21. src, 유비퀴틴 콘쥬게이팅 효소 E2M, GAPDH, P21RAS/gap1m, 갈렉틴 3, 유비퀴틴 C(UCHL1), 프로테아솜, 또는 이들의 단편 또는 관련된 분자를 포함하는 하나 이상의 표적 분자를 분석 표면과 접촉시키는 단계; 표적 분자를 하나 이상의 후보 치료제와 접촉시키는 단계; 및 하나 이상의 표적 분자 또는 그것의 관련된 분자와 결합하거나 혼성화하는 제제를 확인하는 단계를 포함하는, 후보 치료제를 확인하는 방법.
22. 구체예 21에 있어서, 확인된 후보 치료제는 퍼포린-2 분자의 발현, 기능 또는 활성의 조정에 대해 분석되는 방법.
23. 구체예 22에 있어서, 확인된 후보 치료제는 P2 분자의 발현, 기능 또는 활성을 상향조정하는 방법.
24. 구체예 22에 있어서, 확인된 후보 치료제는 P2 분자의 발현, 기능 또는 활성을 하향조정하는 방법.
25. 구체예 22에 있어서, P2 분자의 발현, 기능 또는 활성을 분석하기 위한 분석은 세포 분석, 면역 분석, 효모 혼성체 시스템 분석, 혼성화 분석, 핵산 기반 분석, 고-처리량 스크리닝 분석 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
26. 구체예 22에 있어서, 확인된 후보 제제는 감염성 유기체의 복제의 억제, 성장의 억제, 또는 사멸에 대해 분석되는 방법.
27. 구체예 26에 있어서, 감염성 유기체는 세포내 또는 세포외 박테리아인 방법.
28. 구체예 1 또는 구체예 21의 방법에 의해서 확인된 제제의 치료적 유효량을 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 감염성 질환 유기체로 고통받는 환자의 치료 방법.
29. 구체예 1 또는 구체예 21의 방법에 의해서 확인된 화합물.
30. 구체예 29의 화합물을 포함하는 제약 조성물.
31. 환자의 샘플을 얻는 단계; src, 유비퀴틴 콘쥬게이팅 효소 E2M, GAPDH, P21RAS/gap1m, 갈렉틴 3, 유비퀴틴 C(UCHL1), 프로테아솜, 퍼포린-2, 이들의 단편 또는 관련된 분자를 포함하는 하나 이상의 분자를 분석하는 단계; 및 발현, 기능 또는 활성을 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 병원성 감염의 위험에 처한 개체를 확인하는 방법.
32. 구체예 31에 있어서, 대조군과 비교하여 하향조정된 발현 수준, 감소된 활성 또는 기능을 갖는 것으로 확인된 개체는 감염의 위험에 대한 예후가 있을 수 있는 방법.
33. 퍼포린-2의 발현, 기능 또는 활성을 조정하는 적어도 하나의 제제를 확인하기 위한 방법으로서,
(a) 퍼포린-2 발현, 기능 또는 활성과 관련된 하나 이상의 표적 분자를 발현하는 세포를 적어도 하나의 제제와 접촉시키는 단계;
(b) 퍼포린-2 발현, 기능 또는 활성과 관련된 상기 하나 이상의 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 하나 이상의 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성을 대조군과 비교하는 단계를 포함하며,
여기서 적어도 하나의 제제와의 접촉은 상기 하나 이상의 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성을 조정하며, 이로써 퍼포린-2의 발현, 기능 또는 활성을 조정하는 상기 제제를 확인하는 방법.
34. 구체예 33에 있어서, 퍼포린-2 발현, 기능 또는 활성과 관련된 하나 이상의 표적 분자는 src, 유비퀴틴 콘쥬게이팅 효소 E2M(Ubc12), GAPDH, P21RAS/gap1m(RASA2), 갈렉틴 3, 유비퀴틴 C(UCHL1), 프로테아솜, vps34, ATG5, ATG7, ATG9L1, ATG14L, ATG16L, LC3, Rab5, 또는 이들의 단편을 포함하는 방법.
35. 구체예 33-34 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 제제는 퍼포린-2 발현, 기능 또는 활성과 관련된 상기 하나 이상의 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성을 상향조정하는 방법.
36. 구체예 35에 있어서, 하나 이상의 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성의 상향조정은 퍼포린-2의 발현, 기능 또는 활성을 상향조정하는 방법.
37. 구체예 33-34 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 제제는 퍼포린-2 발현, 기능 또는 활성과 관련된 상기 하나 이상의 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성을 하향조정하는 방법.
38. 구체예 37에 있어서, 하나 이상의 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성의 하향조정은 퍼포린-2의 발현, 기능 또는 활성을 하향조정하는 방법.
39. 구체예 33-34 중 어느 하나에 있어서, 퍼포린-2 발현, 기능 또는 활성은 퍼포린-2 발현, 기능 또는 활성과 관련된 적어도 두 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성을 독립적으로 상향조정 또는 하향조정하는 적어도 하나의 제제에 의해서 상향조정되는 방법.
40. 구체예 33-34 중 어느 하나에 있어서, 퍼포린-2 발현, 기능 또는 활성은 퍼포린-2 발현, 기능 또는 활성과 관련된 적어도 두 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성을 독립적으로 상향조정 또는 하향조정하는 적어도 하나의 제제에 의해서 하향조정되는 방법.
41. 구체예 33-34 중 어느 하나에 있어서, 퍼포린-2 발현, 기능 또는 활성은 퍼포린-2 발현, 기능 또는 활성과 관련된 적어도 두 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성을 독립적으로 상향조정 또는 하향조정하는 적어도 두 제제의 조합에 의해서 상향조정되는 방법.
42. 구체예 33-34 중 어느 하나에 있어서, 퍼포린-2 발현, 기능 또는 활성은 퍼포린-2 발현, 기능 또는 활성과 관련된 적어도 두 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성을 독립적으로 상향조정 또는 하향조정하는 적어도 두 제제의 조합에 의해서 하향조정되는 방법.
43. 구체예 33-42 중 어느 하나에 있어서, 제제는 소 분자, 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 변형된 펩티드, 변형된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 합성 분자, 천연 분자, 유기 또는 무기 분자, 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
44. 구체예 33에 있어서, 퍼포린-2 발현, 기능 또는 활성과 관련된 하나 이상의 표적 분자는 감염성 유기체로부터 유래되는 방법.
45. 구체예 44에 있어서, 상기 감염성 유기체는 박테리아인 방법.
46. 구체예 44-45 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 제제는 하나 이상의 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성을 하향조정하는 방법.
47. 구체예 44-45 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 제제는 하나 이상의 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성을 상향조정하는 방법.
48. 구체예 46에 있어서, 하나 이상의 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성의 하향조정은 퍼포린-2의 발현, 기능 또는 활성을 상향조정하는 방법.
49. 구체예 47에 있어서, 하나 이상의 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성의 상향조정은 퍼포린-2의 발현, 기능 또는 활성을 하향조정하는 방법.
50. 구체예 44-45 중 어느 하나에 있어서, 퍼포린-2 발현, 기능 또는 활성은 퍼포린-2 발현, 기능 또는 활성과 관련된 적어도 두 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성을 독립적으로 상향조정 또는 하향조정하는 적어도 하나의 제제에 의해서 상향조정되는 방법.
50. 구체예 44-45 중 어느 하나에 있어서, 퍼포린-2 발현, 기능 또는 활성은 퍼포린-2 발현, 기능 또는 활성과 관련된 적어도 두 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성을 독립적으로 상향조정 또는 하향조정하는 적어도 하나의 제제에 의해서 하향조정되는 방법.
52. 구체예 44에 있어서, 박테리아는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 에스체리키아 콜리(Escherichia coli)인 방법.
53. 구체예 44-45 중 어느 하나에 있어서, 퍼포린-2 발현, 기능 또는 활성과 관련된 하나 이상의 표적 분자는 PhoP 또는 데아미다아제를 포함하는 방법.
54. 퍼포린-2의 발현, 기능 또는 활성을 조정하는 후보 제제를 확인하는 방법으로서,
(a) src, 유비퀴틴 콘쥬게이팅 효소 E2M, GAPDH, P21RAS/gap1m, 갈렉틴 3, 유비퀴틴 C(UCHL1), 프로테아솜, vps34, ATG5, ATG7, ATG9L1, ATG14L, ATG16L, LC3, Rab5, PhoP, 데아미다아제, 이들의 단편 또는 관련된 분자를 포함하는 하나 이상의 표적를 분석 표면과 접촉시키는 단계;
(b) 표적 분자를 하나 이상의 후보 제제와 접촉시키고, 하나 이상의 표적 분자 또는 그것의 관련된 분자와 결합하거나 혼성화하는 제제를 확인하는 단계; 및
(c) 상기 하나 이상의 후보 제제를 퍼포린-2의 발현, 기능 또는 활성의 조정에 대해 상기 분석하고, 이로써 상기 후보 제제를 확인하는 단계를 포함하는 방법.
55. 구체예 54에 있어서, 확인된 후보 제제는 퍼포린-2의 발현, 기능 또는 활성을 상향조정하는 방법.
56. 구체예 54에 있어서, 확인된 후보 제제는 퍼포린-2의 발현, 기능 또는 활성을 하향조정하는 방법.
57. 구체예 54에 있어서, P2 분자의 발현, 기능 또는 활성을 분석하기 위한 분석은 세포 분석, 면역 분석, 효모 혼성체 시스템 분석, 혼성화 분석, 핵산 기반 분석, 고-처리량 스크리닝 분석 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
58. 구체예 54에 있어서, 확인된 후보 제제는 감염성 유기체의 복제의 억제, 성장의 억제, 또는 사멸에 대해 분석되는 방법.
59. 구체예 58에 있어서, 감염성 유기체는 세포내 또는 세포외 박테리아인 방법.
60. 환자의 샘플을 얻는 단계; src, 유비퀴틴 콘쥬게이팅 효소 E2M, GAPDH, P21RAS/gap1m, 갈렉틴 3, 유비퀴틴 C(UCHL1), 프로테아솜, 퍼포린-2, vps34, ATG5, ATG7, ATG9L1, ATG14L, ATG16L, LC3, Rab5, 이들의 단편 또는 관련된 분자를 포함하는 하나 이상의 분자를 분석하는 단계; 및 발현, 기능 또는 활성을 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 병원성 감염의 위험에 처한 개체를 확인하는 방법.
61. 구체예 60에 있어서, 대조군과 비교하여 하향조정된 발현 수준, 감소된 활성 또는 기능을 갖는 것으로 확인된 개체는 감염의 위험에 대한 예후가 있을 수 있는 방법.
62. 퍼포린-2 단백질을 암호화하는 유전자의 파괴를 포함하는 트랜스제닉 마우스.
63. 구체예 62에 있어서, 상기 파괴는 퍼포린-2 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 이형접합성 또는 동형접합성 파괴를 포함하는 것인 트랜스제닉 마우스.
64. 구체예 63에 있어서, 상기 파괴는 동형접합성 파괴를 포함하며, 상기 동형접합성 파괴는 상기 유전자를 비활성화하고, 상기 트랜스제닉 마우스에서 퍼포린-2 단백질의 발현을 억제하는 것인 트랜스제닉 마우스.
65. 구체예 62-64 중 어느 하나에 있어서, 상기 트랜스제닉 마우스는 야생형 마우스와 비교하여 세포내 병원체에 의한 감염에 대해 증가된 민감성을 나타내는 트랜스제닉 마우스.
66. 구체예 62-64 중 어느 하나의 트랜스제닉 마우스로부터 유래된 기관, 조직, 세포, 또는 세포주.
실시예
실시예 1: 대식세포 및 소교세포에서 기공-형성 단백질은 병원성 세포내 박테리아를 사멸한다.
이 실시예는 Mpeg1이 중합반응에 의해 경막 기공을 형성하는, 퍼포린-2(P-2)로 표시되는 신규한 기공 형성 단백질을 코드화하는 것을 보여준다. 대식세포에서 P-2는 메티실린 내성 황색 포도구균(MRSA), 미코박테리움 아비움(Ma), 미코박테리움 스메그마티스(Msm), 살모넬라 타이피유리움(St) 및 대장균을 포함한 병원균에 대한 잠재적인 세포내 사멸 활성을 가진다. 더욱이 P-2는 반응성 산소 종(ROS)과 일산화질소(NO)의 살균 활성을 가능하게 하였다.
재료 및 방법
플라스미드 구성물: 쥐의 Mpeg-1 cDNA의 완전한 코딩 영역을 여러 개의 EST 클론으로부터 구성하고, pEGFP-N3 플라스미드(Clontech)에 삽입하였다. 단량체 RFP는 일부 실험에서 사용하기 위해 GFP 대신 클론하였다.
세포주 및 일차 세포: HEK-293(ATCC), RAW264.7(ATCC) 및 세포주을 10% FBS가 첨가된 IMDM에서 유지하였다. 일차 대식세포를 복막 또는 골수로부터 얻었다. 싸이오글리콜레이트-유도된 복막 대식세포: 1.5ml의 3% 싸이오글리콜레이트 용액을 C57/B6 마우스에 i.p. 주사하였다. 4일 후에 복막 세포를 수득하고 대식세포에 대한 점착에 의해 정제하였다. 골수 유도된 대식세포: 골수를 C57BL/6 마우스의 길 뼈로부터 플러싱하였다. 적혈구를 ACK 완충액을 사용하여 용해하고, 세포 펠릿을 20ng/ml의 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)(Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA)를 함유하고 있는 완전 배지에 재현탁하였다(106 세포/ml). 4일 째에, 비-점착 세포를 수득하고 새로운 완전 배지에 재플레이팅하였다. 새로운 배지는 매 3일마다 세포가 실험에 준비될 때까지(보통 7일에서 10일 사이) 첨가하였다.
네거티브 염색 전자 현미경 검사: 막을 P2GFP-형질전환된 293 세포로부터 N2-캐비테이션 및 차등 원심분리에 의해 분리하였다. 막을 적은 부피의 천연 트리스-완충된 식염수에 재현탁하고, 100㎍/ml의 트립신으로 1시간 동안 37℃에서 처리한 후, 세척하고, 5% 천연 Na-포스포텅스텐산으로 30초 동안 네거티브 염색하였다. 영상을 Phillips CM10 투과 전자 현미경 상에서 52,000배의 초기 배율에서 얻었다.
젠타마이신 보호 분석: S. 타이피뮤리움 균주 LT2Z, 미코박테리움 아비움, 미코박테리움 스메그마티스(ATCC), 메티실린 내성 황색 포도구균 및 K12 대장균을 글리세롤 스톡으로부터 37℃에서 16 내지 18시간 동안 흔들어주면서 루리아 육즙(LB)에서(S. 타이피뮤리움, S. 아우레우스 및 대장균) 또는 Middlebrook 7H9 육즙(미코박테리아)에서 성장시킨 후 감염시켰다. 살모넬라에 대해서는, 배양물을 LB로 1:33으로 희석하고, 다시 3시간 동안 성장시켜서 침습성 표현형을 유도하였다. 대식세포 또는 소교세포를 플레이팅하고(12 웰 플레이트의 웰당 5×105 세포) 밤새 LPS(1ng/ml) 및 IFN-γ(100U/ml)로 자극하였다. 세포를 다음 날 표시된 MOI로 30분 동안(S. 타이피뮤리움) 또는 1시간(나머지 모든 박테리아) 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 감염시켰다. 세포를 PBS로 2회 세척하고, 50㎍/ml의 젠타마이신을 함유하고 있는 새로운 배지를 첨가하였다. 2시간 후에 젠타마이신의 농도를 5㎍/ml로 낮추었다. 젠타마이신을 첨가한 후 표시된 시간 지점에서 세포를 PBS로 세척하고, 물 중의 1%의 트리톤-X를 사용하여 용해한 후, 희석하고 아가 플레이트 상에 3중으로 플레이팅하고 CFU를 측정하였다.
RT-PCR: RNA를 RNeasy(Qiagen) 지시를 따라 세포로부터 추출하였다. 1㎍의 RNA를 QuantiTect 역전사 키트(Qiagen)를 사용하여 cDNA로 전환시키고, RT-PCR을 항존 제어 유전자로서 쥐과 Mpeg-1 및 GAPDH에 대하여 TAQMAN® 유전자 발현 분석(Applied Biosystems)을 사용하여 수행하였다. 모든 분석을 Applied Biosystems 7300 PCR 플랫폼 상에서 수행하였다.
항체: 토끼 항-Mpeg1 및 항-GFP 다클론성 항체를 Abcam으로부터 얻었고, 웨스턴 블롯 분석을 위해 사용하였다. 토끼 항-P2(세포질 도메인) 항혈청을 21st Century에 의해 생성시키고 얻었다.
RNA 간섭: 3개의 P2-특이적 화학 합성된 19-뉴클레오티드 siRNA 듀플렉스를 Sigma로부터 얻었다. 두 개의 siRNA는 P2의 3' UTR에 상보하였고, 세 번째는 코딩 영역에 상보하였다. 그 서열은 다음과 같았다: CCACCUCACUUUCUAUCAA(SEQ ID NO:l), GAGUAUUCUAGGAAACUUU(SEQ ID NO:2) 및 CAAUCAAGCUCUUGUGCAC(SEQ ID NO:3). siRNA의 대식세포 및 소교세포 안으로의 형질전환은 Amaxa Nucleofector System(Lonza)을 사용하여 제조업체의 지시에 따라 수행하였다. 모든 형질전환을 4×106 세포 및 1μM의 siRNA를 사용하여 수행하였다(P2-특이적 siRNA를 수집하였다). 그 직후에 형질전환 세포를 10%의 FBS를 함유하고 있고 항생물질이 없는 IMDM에 플레이팅하였다.
공초점 현미경 검사: 살아있는 세포 영상화를 위하여, RAW 세포를 P2GFP로 뉴클레오펙트하고, No. 1.5 커버 글라스(MatTek Corp.)가 있는 유리 바닥 접시에서 LPS(1ng/ml) 및 IFN-γ(100U/ml)로 자극하였다. 세포를 PBS로 1회 세척하고, 소기관들을 표지하였다. 소포체(ER) 표지화를 위하여, ER-TRACKERTM 블루-화이트 DPX(Invitrogen)를 1μM의 작업 농도로 30분 동안 37℃에서 사용하였다. 다른 모든 얼룩에 대하여, 형질전환된 세포를 3%의 파라폼알데하이드(PFA)로 15분 동안 실온에서 고정시키고, 0.5%의 사포닌을 투과시킨 다음, 10%의 정상 염소 혈청으로 차단시킨 후 일차 및 이차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 항-CD107a(LAMP-1)(BD Pharmingen), 항-CD11b(BD Pharmingen), 항-golgin97(Invitrogen), 항-EEA1(Calbiochem), 항-GM130(BD biosciences) 및 Hoechst 33258(Invitrogen)을 사용하여 세포 소기관들을 확인하였다. 이차 항체는 모두 염소에서 생성시켰다. 영상은 모터가 달린 스테이지가 부착되어 있는 Leica SP5 전환 공초점 현미경 상에서 얻었고, Leica application suite advanced 형광 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
결과 및 논의
대식세포는 본질적으로 세포용해성 기공-형성 단백질에서 전형적으로 발견되는 MACPF 도메인을 가지는 단백질을 예측하는 Mpeg1 mRNA를 전사한다. MACPF 도메인의 기본적인 구성원은 세포외재성 박테리아를 사멸하는 막 공격 복합체의 기공-형성 보완 성분 C9 및 바이러스-감염된 세포 및 종양 세포를 사멸하는 T 및 NK 림프구의 기공-형성 분자인 퍼포린-1이다. 기공 형성은 형태 변화를 중재하여 4개의 양친매성 β-가닥의 막 삽입을 초래하여 천공 및 표적 세포 사멸을 유도하는 MACPF 도메인의 중합에 의해 이루어진다. 이 실시예에서는, Mpeg1이 퍼포린-2(P-2)로 표시된, 중합에 의해 경막 기공을 조립하는 신규한 기공-형성 단백질을 코드화하는 것을 보여준다. 대식세포에서 P-2는 미코박테리움 아비움(M. 아비움), M. 스메가티스, 살모넬라 타이피뮤리움(S. 타이피뮤리움), 대장균(E. 콜리) 및 메티실린 내성 황색 포도구균(MRSA)의 임상적 분리물을 포함하여 세포내 병원균에 대한 잠재적인 사멸 활성을 가진다. 중요한 것은 P-2는 또한 ROS 및 NO의 항미생물 활성에도 기여한다는 것이다.
대식세포의 살균 반응에 대한 현재의 이해는 그것이 산화성 메커니즘, 예컨대 파고솜 내에서 ROS와 NO에 의해, 그리고 파고솜-리소좀 융해에 의해 중재된다는 것이다. 박테리아의 세포내 사멸에서 ROS와 NO를 비교할 때 P-2의 역할을 평가하기 위하여, 각각의 살균 이펙터를 개별적으로 또는 P-2와 조합하여 차단시켰고, 복막 대식세포(PEM)에서의 세포내 박테리아 생존율을 젠타마이신 보호 분석을 활용하여 감염 후 1시간과 5시간 사이에 측정하였다(도 1a 내지 1c). 젠타마이신은 막을 통과할 수 없고, 오직 세포외재성 배지에만 존재한다. ROS, NO 또는 P-2의 억제는 개별적으로 상이한 박테리아에 대해 상이한 효과를 나타냈다. S. 타이피뮤리움을 사용하면 1시간째에 PEM에서 세포내에 존재하던 박테리아의 대략 90%가 억제제가 없을 때 5시간째에 사멸하였다(약 10%의 생존율, 도 1a). 항산화제 및 ROS 스캐빈저 N-아세틸시스테인(NAC)을 사용한 ROS의 차단은 1시간 수준과 비교하여 5시간째에 대략 80%의 살모넬라 생존을 가능하게 하였고, 이것은 ROS가 없으면 단지 20%만이 사멸된다는 것을 가리킨다. 산화 질소 합성효소 억제제 NG-니트로-L-아르기닌-메틸 에스터 염산염(L-NAME)을 사용한 NO의 차단은 NAC와 유사한 효과를 나타낸다. 다른 한편으로 P-2-특이적 siRNA를 사용한 형질전환에 의한 P-2 녹다운(도 5a, 5b에서 녹다운의 효과에 대한 데이터)은 모든 사멸을 제거하였고, ROS와 NO가 차단되지 않았음에도 살모넬라의 세포내 복제를 허용하였다(도 1a). 중요한 것은 NAC 또는 L-NAME과 P-2 녹다운과의 조합이 추가로 P-2 차단만에 의해 제공되는 것 이상으로 세포내 복제를 증가시키지는 않았다는 것이고, 그것은 P-2가 ROS 및 NO 항미생물 경로 둘 다에 대한 공통 중재자임을 시사한다.
약 30%의 M. 스메그마티스가 억제제가 없을 때 감염 후 5시간 째에도 생존하는데, 그것은 PEM에 의한 사멸에 대한 상대적인 내성을 가리킨다(도 1b). ROS 또는 NO의 차단은 그것들의 생존율을 약 60%까지 증가시키는데, 이것은 사멸에 대한 30%의 기여도를 증명한다. 다른 한편으로 P-2의 녹다운은 M. 스메그마티스에 대한 거의 모든 살균 활성을 억제하고, 이것은 다시 한 번 P-2가 ROS 및 NO의 독성을 또한 중재한다는 것을 시사한다(도 1b). 비-병원성 대장균 K12는 억제제가 없을 때 PEM에 의한 사멸에 가장 민감하다(100% 사멸, 도 1c). ROS 및 NO 억제 또는 P-2 녹다운은 각각 약 30, 40 및 60%의 생존율을 가능하게 하는데, 이것은 비-병원성 대장균이 ROS 및 NO 저항 메커니즘, 예컨대 카탈라제 및 항산화제의 생성 외에도 더 단단한 세포벽을 갖추고 있는 병원성 박테리아보다 P-2가 없을 때 ROS와 NO에 더 민감하다는 것을 가리킨다. PEM이 없을 때 억제제는 박테리아 성장에 아무런 효과를 나타내지 않았다(도 6). 데이터는 P-2에 의한 박테리아의 외부 세포벽 손상이 ROS 및 NO에 대한 접근을 촉진하여 근본적인 박테리아 구조에 되돌릴 수 없는 손상을 유발함으로써 감염의 처음 5시간 동안 박테리아 사멸을 초래하는 것을 증명한다. 이런 상황은 그랜자임-중재된 세포 사멸에 필요한 퍼포린-1 및 박테리아의 프로테오글리칸층에의 라이소자임에 대한 접근을 제공하여 구고적 붕괴를 초래하는 보충물의 MAC에 유사하다.
P-2는 해면동물로부터 사람에 이르기까지 고도로 보존되는데(도 7), 이것은 기본적인 기능적 중요성을 증명한다. MACPF 도메인에 대한 C-말단은 새롭게 보존된 도메인으로, 본원에서 P-2 도메인으로 표시되며(도 2a), 모든 퍼포린-2 상동분자에서 보존되지만 어떠한 다른 단백질 도메인에 대해 상동성을 나타내지는 않는다. 가용성인 면역체계의 다른 기공 형성자와는 달리, P-2는 전형적인 경막 서열 및 세포질 도메인을 함유하는 유형 1 막단백질이다. 이펙터-MACPF 도메인은 ER의 루멘이나 출아하는(budding) 수송소낭을 향하는 것을 목표로 한다. 짧은 세포질 도메인은 세포의 세포질 안으로 확장되고, 현재 P-2 중합의 메커니즘을 규정하기 위해 연구 중인 고전적인 조정 요소들을 나타낸다.
P-2가 막 결합 기공을 생성하는지를 측정하기 위하여, 완전히 개방된 오픈 리딩 프레임을 조립하고, 녹색 형광 단백질(GFP)을 세포질 도메인에서 C-말단에 융합하고, 그것을 HEK-293 세포에 형질전환하였다. P-2-GFP를 P-2의 세포질 도메인에 대해 발생한 내부의 다클론성 항혈청 또는 항-GFP 항체인, P-2에 대한 상업적 다클론성 항-펩티드 항혈청을 사용하여 면역블롯팅함으로써 검출하였다(도 8). P-2-GFP-형광 막을 세포 용해 및 차등 원심분리에 의해 얻고, 막 단백질을 제거하지만 퍼포린-1 및 MAC 기공은 제거하지 않는 트립신으로 처리하였다. 트립신은 P-2의 세포질 도메인을 절단하지만 P-2 기공은 절단하지 않아서, 대략 200,000배의 배율로 네거티브 염색 전자 현미경에 의해 도 2B에 도시된 것과 같이 막과 결합한 상태를 유지한다. 이 도면은 P-2가 실제로 세포 용해 활성을 가지는 기공-형성 단백질임을 가리키는 첫 번째 물리적 증거 및 영상을 나타낸다. 형질전환되지 않은 293 세포로부터 얻고 동일한 방식으로 트립신 처리된 대조 막은 기공 복합체가 전혀 없었다(도시되지 않음). 중공 원주형 폴리-P-2 복합체는 직경이 16nm인 폴리-퍼포린-1(도 2g) 및 10nm인 폴리-C9과 비교하여 9.2nm의 평균 내부 직경을 가진다. 미세한 구조는 12 내지 14개의 프로토머의 중합체 조성을 제시한다. 불완전하게 조립된 기공은 중합 과정을 증명한다(도 2c, 화살표). 측면도에서, 복합체는 바깥쪽으로 12 또는 25nm 돌출되어 있다(도 2e 및 2f; 평행 화살표).
PEM 외에, 골수-유도된 대식세포/수지상 세포(BMDM/BMDC) 및 대식세포(RAW1264.7) 및 소교세포(BV2) 세포주은 젠타마이신 보호 분석에 의해 측정되는 바, 포식된 MRSA, 미코박테리아, S. 타이피뮤리움 및 대장균에 대해 잠재적인 세포내 사멸 메커니즘을 가지고 있다(도 3a 내지 3i). 대식세포, BMDM/DC 및 소교세포는 P-2를 본질적으로 발현하고, 리포다당(LPS) 및 인터페론-감마(IFN-γ) 처리시에 P-2 mRNA 및 단백질 발현을 상향조정한다(도 9a 내지 9d). P-2를 RAW, BV2, BMDM/DC 또는 PEM에서 P-2-특이적 siRNA로의 형질전환에 의해 녹다운시켰고, 세포내 살균 활성을 스크램블된 siRNA로 형질전환된 세포에 비교하였다. P-2 mRNA의 녹다운 효율은 80 내지 95%였고(도 5a, 5b) 단백질의 녹다운 효율은 >90%였다(도 3e). P-2 녹다운은 RAW, BV2, BMDM/BMDC 및 PEM 세포에서 박테리아의 세포내 사멸을 강력하게 억제하였다(도 3a 내지 3d 및 도 10a 내지 10e). P-2 녹다운은 고도로 병원성인 M. 아비움, MRSA 및 S. 타이피뮤리움뿐 아니라 비병원성인 대장균 및 M. 스메그마티스의 세포내 사멸을 억제하였다(도 3a 내지 3d). 세포 생존력은 형질전환 후 또는 감염 기간 동안에 녹다운 및 대조 세포에서 차등적으로 영향을 받지 않았다(제시되지 않음). RAW의 형질전환에 의한 P-2-RFP의 과잉발현은 P-2의 세포내 살균 기능과 일치하게 M. 아비윰의 세포내 사멸을 증가시켰다(도 3f, 3g 및 도 11a 내지 11f). 세포 생존력은 형질전환 후 및 감염 기간 동안 P-2-RFP 발현 및 대조 세포에서 동등하였다(도시되지 않음). 감소된 세포내 사멸 활성의 원인이 될 수 있는 다른 세포 성분에 미치는 P-2 녹다운의 의도하지 않은 잠재적 효과를 배제하기 위하여, 내인성 P-2를 P-2 3'UTR에 상보하는 P-2-siRNA로 녹다운시키고, P-2 3'UTR이 없는 P-2-RFP cDNA로의 형질전환에 의해 P-2 활성을 재구성하였다(도 3h 및 도 12a, 12b). 웨스턴 블롯에 의해 증명된(도 3i) 내인성 P-2의 녹다운 및 P-2-RFP로의 보완은 세포내 살균 활성을 완전하게 회복시켰고, 그것은 세포내 박테리아 파괴에 P-2가 기여하는 것을 가리킨다.
P-2의 세포내 정위의 측정은 P-2-GFP로의 대식세포의 형질전환을 필요로 한다. P-2에 대한 상업적으로 활용가능한 다클론성 항-펩티드 항체는 천연 P-2를 인지하지 못한다(데이터는 제시하지 않음); 천연 P-2에 대한 단클론성 항체의 제조는 지금까지는, 아마도 고도의 보존성 때문에 성공적이지 못하였다(도 5a, 5b). P-2-GFP의 인공물을 피하기 위하여, RAW 세포의 과잉발현을 P2-GFP의 발현이 여전히 낮을 때 일시적인 형질전환 후 초기 시점에서 분석하였다. GFP 단독과는 달리, P-2-GFP는 주로 ER, 골지체 및 트랜스-골지 네트워크 막에 위치하였고, 원형질 막, 리소좀 및 초기 엔도솜으로부터 배제되었다(도 4a 내지 4d 및 도 13a 내지 13c). ER 막과 파고솜 막과의 기록된 융합은 파고솜 막으로의 P-2 접근을 가능하게 하는데, 그것은 J774 쥐과 세포주의 라텍스 입자를 함유하고 있는 정제된 파고솜에서 질량 분석에 의해 검출되었다. 그러므로 P-2는 세포내 박테리아의 파고솜내 사멸에 필요한 위치에 존재한다.
본 연구는 대식세포가 막-결합되어 있고 광범위한 병원성 박테리아 종에 대한 잠재적 세포내 살균 기능을 가지는 신규한 기공-형성 단백질, 퍼포린-2을 함유하고 있음을 수립한다. ROS 및 NO의 살균 활성은 P-2의 존재에 의해 강력하게 증강되며, 그것의 세포벽 손상 활성은 박테리아의 펩티도글리칸 층 또는 내막 및 DNA를 공격하기 위하여 라이소자임을 포함하여 작은 분자에 대한 접근을 제공할 수 있다. P-2-중합의 활성화의 분자 메커니즘은 알려져 있지 않지만 P-2의 세포질 도메인의 기능에 초점이 맞추어진 활발한 연구조사가 진행중이다. P-2와 세포내 박테리아의 긴 진화상의 길항작용이 제공된다면, P-2-공격을 피하기 위한 세포내 병원균의 회피 전략을 연구하기에 대단한 관심의 대상이 될 것이다.
P-2는 원시적인 해면동물 및 다른 무척추 해양생물에 이미 존재하는 선천적 면역 방어의 원래이 기공-형성 단백질인 것으로 여겨진다. P-2는 실제로 모든 체세포에서 유도가능하며 체세포를 세포내 박테리아 성장으로부터 보호한다. 고대의 P-2는 계속해서 선천적 면역 방어의 중요한 항균 성분이다.
실시예 2: P2의 조정
src 키나제가 P2 활성화 및 박테리아 사멸에 관련된 자가포식작용에 책임이 있을 것으로 가정하였다. 또한 7개의 단백질을 확인하였는데, 그 중 효모의 두 개의 하이브리드 시스템은 P2의 세포질 도메인과 상호작용하고, 따라서 그것들이 P2 활성화에 포함된다는 증거가 된다. 이들 단백질을 아래의 표 1에 열거한다.
P2는 사멸을 위한 P2 활성화에 포함된 경막 도메인을 가진다. P2는 고도로 보존된 Y 및 S 및 보존된 RKYKKK(SEQ ID NO:4) 도메인을 가진다(GTRKYKKKEYQEIEE; SEQ ID NO:6).
src, 유비퀴틴 포합 효소 E2M(Ubc12), GAPDH, P21 RAS/gap 1m(RASA2), 갈렉틴 3 및 UCHL 1의 녹다운은 소교세포 및 섬유아세포에 의한 박테리아의 사멸을 간섭하였다. 그러므로 이들 분자는 박테리아의 P2 의존성 사멸을 활성화시키는데 기여한다. ATG14 녹다운은 또한 P21 RAS 및 자가포식작용에의 연결을 제공하는 P2 중재된 사멸을 간섭한다. 이들 P2 활성화제 단백질을 작은 약물 또는 생물학으로 조정(차단 또는 증강)함으로써 P2 활성의 증가 또는 감소가 초래될 것이다. P2가 전체가 아니라도 많은 조직에서 발현되기 때문에 항-미생물 제어에 매우 중요한 것은 분명하다. 동시에 조정장애는 자기 공격 및 자가면역 질병(상향 조정된 활성) 또는 면역 결핍(하향 조정)을 유도할 수 있다. 병원성 박테리아는 활성화 캐스케이드를 차단하는 것을 통해서 P2 활성화를 간섭하는 것 같다. 그런 간섭에 반대작용을 하는 것은 약물 내성 박테리아로 감염된 환자의 치료 및 돌봄을 제공할 수 있다.
요약하면, P2 활성화의 분자 메커니즘은 광범위한 질병에 유용할, 약을 쓸 수 있는 많은 표적을 제공할 수 있다.
클론 클론의 수 상동성
1 유비퀴틴-함유 효소 E2M (Ubc12) 18 100%
2 GAPDH 17 100%
3 P21 RAS 활성화제2/gap 1m (sfpi1) (RASA2) 13 100%
4 갈락토스 결합 렉틴(갈렉틴-3) 6 100%
5 유비퀴틴 C (UCHL1) 1 100%
6 염색체 #6 1 100%
7 Mus 무스큘러스 프로테아좀 1 100%
실시예 3: 체세포는 기공 형성 단백질 퍼포린-2를 통해 살균 기능을 중재한다
대식세포, 수지상 세포 및 소교세포는 본질적으로 병원성 세포내 박테리아를 사멸하기 위하여 퍼포린-2(P-2)로 표시되는 기공-형성 단백질을 발현한다. P-2는 반응성 산소종(ROS) 및 산화질소(N0)의 살균 효과를 또한 증강시키는 막 손상에 의해 박테리아를 사멸하고, 그것은 물리적 손상이 박테리아의 민감한 층에의 접근을 제공한다는 것을 증명한다. 상피 세포, 섬유아세포 및 다른 비-조혈성-유도된 세포는 박테리아에 의해 침습되고 자가포식작용-관련 메커니즘 및 항미생물 화합물의 도움을 받아 세포내 박테리아 감염을 제거한다. 이들 실험 전에는, P-2가 박테리아 제거를 위해 비-조혈성 세포에 의해 발현되고 사용될 수 있는지에 대해 알려져 있지 않았다. 이것은 일차 사람 케라티노사이트가 P-2-mRNA를 본질적으로 발현하고 지금까지 분석된 모든 체세포가 유형 1 및 유형 2 인터페론에 의해 P-2-mRNA를 발현하기 위해 유도될 수 있다는 것을 보여주는 첫 번째 보고이다. 더욱이 내인성 P-2의 P-2-특이적 siRNA로의 녹다운은 RFP에 의해서가 아닌 P-2-RFP로의 보완에 의해 회복되는 살균 활성을 억제한다.
재료 및 방법
사람 세포: 다음의 세포들을 사용하였다. 제대 정맥 혈관내피 세포, MIA PaCa-2 췌장암(ATCC CRL-1420), UM-UC-3 방광암(ATCC CRL-1749), UM-UC-9 방광암 23, HeLa(ATCC CCL-2), HEK293T(ATCC CRL-1573) 및 일차 케라티노사이트. HUVEC를 Lonza EGM-2 불릿 키트에서 성장시켰다; 일차 사람 케라티노사이트를 앞에서 설명한 것과 같이 성장시켰다(Wiens, M. et al. J Biol Chem 280, 27949-27959, doi:10.1074/jbc.M504049200 (2005)). 다른 모든 세포를 ATCC 권고를 따라 성장시켰다. 모든 세포를 37℃에서 5% CO2를 함유하고 있는 축축한 대기 중에서 배양하였다.
마우스 세포: CT26 결장 암종(ATCC CRL-2638), CMT-93 직장 암종(ATCC CCL-223), B16-F10 흑색종(ATCC CRL-6475), Neuro-2a 신경교종 CATH.a neuroblastoma. 난소 암종 MOVCAR 5009 및 MOVCAR 5047을 Fox Chase 암센터로부터 구입하였다. NIH/3T3 섬유아세포(ATC CRL-1658), C2C12 근아세포(ATCC CRL-1772), 일차 뇌막 섬유아세포 및 일차 성상세포를 앞에서 설명한 것과 같이 분리하였다(Sabichi, A. et al. The Journal of Urology 175, 1133-1137, doi:10.1016/S0022-5347(05)00323-X (2006); Tomic-Canic, M. et al. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society 15, 71-79, doi:10.1111/j.1524-475X.2006.00187.x (2007)). 모든 세포주을 ATCC 권고를 따라 성장시켰고, 37℃에서 5% CO2를 함유하고 있는 축축한 대기 중에서 배양하였다.
화학물질: MG-132, 계란 흰자의 라이소자임 및 리포다당(LPS)을 Sigma로부터 구매하였다. 재조합 쥐과 IL-1α, IL-1β, TNFα, IFN-γ, IFN-α, IFN-β 재조합 사람 IFN-γ, IFN-β를 preprotech로부터 구입하였다. 재조합 사람 IFN-α를 R&D systems로부터 구입하였다. 쥐과 IL-1β를 표시되었을 때 10U/mL로 보충하였다. 쥐과 IL-1β를 1ng/ml로 보충하였다. 쥐과 TNFα를 20ng/ml로 보충하였다. 쥐과 IFN-α, INF-β 및 IFN-γ를 100U/ml로 보충하였다. 사람 IFN-α를 표시된 경우 150U/ml의 농도로 표시된 경우에 보충하였다. 사람 IFN-β 및 IFN-γ를 100U/ml의 농도로 보충하였다. LPS를 1ng/ml의 농도로 첨가하였다.
플라스미드 구성물: 쥐과 Mpeg-1 cDNA의 완전한 코딩 영역을 여러 개의 EST 클론으로부터 구성하여 pEGFP-N3 플라스미드(Clontech) 안에 삽입하였다. 단량체 RFP를 감염 실험에 사용하기 위하여 GFP 대신에 클론하였다.
네거티브 염색 투과 전자 현미경 검사: mEF를 14시간 동안 IFN-γ(100U/ml)로 자극하고, 표시된 박테리아 균주로 5시간 동안 30의 감염 다중도로 감염시켰다. mEF를 ddH2O 중의 1%의 Igepal로 용해시킴으로써 원핵생물의 막을 수득하였다. 용해물을 200g에서 10분 동안 원심분리하여 무상 박테리아를 펠릿화하였다. 그 결과의 펠릿을 최소 ddH2O에 재현탁하고 세척한 후 3% 우라닐 포메이트(UF)로 30초 동안 네거티브 염색하였다. 영상을 Phillips CM10 투과 전자 현미경 상에서 52,000-배 초기 배율로 얻었다.
항체: 토끼 항-Mpeg1 다클론성 항체를 Abcan으로부터 얻어서 웨스턴 블롯 분석에 사용하였다.
qRT-PCR: RNA를 RNeasy(Qiagen) 지시를 따라 세포로부터 추출하였다. 1㎍의 RNA를 QuantiTect 역전사 키트(Qiagen)를 사용하여 공급자의 프로토콜을 따라 cDNA로 전환시켰다. qRT-PCR을 쥐과 Mpeg1 및 GADPH에 대해 TAQMAN® 유전자 발현 분석(Applied Biosystems)을 사용하여 수행하였고, 이때 GAPDH는 내부 제어 유전자로서 작용한다. 사람 조직에 대해서는 사람 Mpeg1 및 GapDH 프로브를 활용하였다. 모든 분석을 Applied Biosystems 7300 PCR 플랫폼 상에서 수행하였다.
RNA 간섭: 쥐과 세포에 대해, 세 개의 mpeg1-특이적 화학 합성된 19-뉴클레오티드 siRNA 듀플렉스를 Sigma로부터 얻었다. 두 개의 siRNA는 P-2의 3'UTR에 상보하였고, 세 번째 siRNA는 코딩 영역에 상보하였다. 서열은 다음과 같았다: CCACCUCACUUUCUAUCAA(SEQ ID NO:1), GAGUAUUCUAGGAAACUUU(SEQ ID NO:2) 및 CA AUCAAGCUCUUGUGCAC (SEQ ID NO:3). 스크램블 siRNA를 또한 반응에 대한 대조표준으로서 사용하기 위해 제조하였다. 사람 세포에 대해서는, 세 개의 사람 mpeg1-특이적 사일런서 선택 siRNA를 Ambion(Invitrogen) Silencer Select #s61053, s47810, s61054로부터 구입하였다. Ambion(Invitrogen)으로부터의 사일런서 선택 네거티브 대조표준 #2를 또한 사용하였다.
형질전환: 일시적인 형질전환을 각 세포주에 대해 Amaxa Nucleofector System(Lonza)을 활용하여 제조업체의 최적화된 프로토콜을 따라 수행하였다.
젠타마이신 보호 분석: S. 타이피뮤리움 균주 LT2Z, 미코박테리움 스메그마티스, 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 및 대장균 균주 K12를 글리세롤 스톡으로부터 37℃에서 24시간 동안 흔들어주면서 루리아 육즙(S. 타이피뮤리움, S. 아우레우스 및 대장균) 또는 Middlebrook 7H9 육즙(M. 스메그마티스)에서 성장시켰다. S. 타이피뮤리움, S. 아우레우스 및 대장균에 대해서는, 이들 배양물을 LB에 1:33으로 희석시키고, 다시 3시간 동안 성장시켜서 감염 전에 로그 단계에 도달하도록 하였다. 진핵 세포를 각각의 세포에 대한 Lonza의 최적화된 프로토콜에 따라 형질전환하고, 형질전환 후에 12 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 그런 다음 세포를 14시간 동안 IFN-γ(100U/ml)로 자극하였다. 세포를 30분 동안(S. 타이피뮤리움) 또는 1시간 동안(S. 아우레우스, 대장균 및 M. 스메그마티스) 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 10과 60 사이의 감염 다중도(MOI)로 감염시켰다. 감염 후 세포를 빙-냉 PBS로 2회 세척하고, 50㎍/ml의 젠타마이신을 함유하고 있는 새로운 배지를 첨가하였다. 2시간 후에 배지를 교체하여 젠타마이신의 농도를 5㎍/ml로 감소시켰다. 표시된 시간 지점에 세포를 PBS로 세척하고, ddH2O 중의 1% Igepal을 사용하여 용해한 후, 희석하고 LB 아가 플레이트 상에(S. 타이피뮤리움, S. 아우레우스 및 대장균) 또는 Middlebrook 7H11 플레이트 상에(M. 스메그마티스) 기술상 3중으로 플레이팅하고, 충분한 콜로니 성장 후에 CFU를 측정하였다.
라이소자임 사멸 활성: 상기의 젠타마이신 보호 분석에 이어서, 용해 후 용해물을 6개의 동등한 분획으로 나누어 절반은 최종 농도가 40㎍/ml 라이소자임이 되도록 처리하고 나머지 절반은 동등한 부피의 완충액으로 처리하였다. 모든 분획을 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한 후에 CFU 분석을 위해 기술상 2중으로 플레이팅하였다.
통계학적 분석: 데이터를 먼저 Kolmogorov-Smirnov 시험(K-S 시험)에 따라 가우스 분포가 존재하는 지를 측정하기 위해 분석하였다. 결과적으로 생성된 통계학을 사용하여, 데이터를 각 실험에서 무관한 변수의 수를 따라 분석하였다. 만약 두 그룹 사이에 비교하고, 데이터가 K-S 시험에 따른 가우스 분포에 맞는다면, 독립 척도 t 시험을 사용하였고; 만약 가우스 분포가 존재하지 않으면 Mann-Whiteny 시험을 수행하여 통계학적 유의미성을 평가하였다. 두 그룹 이상의 그룹을 분석하는 경우에는, 가우스 분포가 존재하는 경우 1-방향의 독립 척도 ANOVA를 Bonferroni 포스트 hoc 시험에 적용하였다. 만약 가우스 분포가 존재하지 않으면, Kruskal-Wallis 시험을 Bonferroni 포스트 hoc 시험을 활용하여 사용하였다.
결과 및 논의
지금까지 분석된 모든 사람 및 마우스 일차 세포 및 세포주은 인터페론 유도 시에 신속하게 P-2 mRNA를 발현한다(도 14a 내지 14j 및 표 2 및 도 18a 내지 18i). 자극되지 않은 일차 쥐과 배 섬유아세포(mEF)는 39 주기 후에 TAQMANTM PCR에 의해 P-2 mRNA을 검출가능한 수준으로 검출하지 못한다(도 14a). 첨가된 인터페론(IFN-α, β 또는 γ)은 단독으로 각각 P-2 mRNA를 상향-조정하였고, 함께 첨가될 때에는 고수준의 P-2 mRNA를 유도하였다. 대조적으로 LPS, IL-1α 및 TNFα는 mEF에서 P-2 mRNA를 유도하지 못한다. 비록 개별적인 차이는 있지만, 이 P-2 유도 패턴은 모든 일차 세포 및 마우스 및 사람으로부터 시험된 수립된 세포주에서 발견되었다(도 14a 내지 14f, 도 18a 내지 18i 및 표 2에 완전하게 열거함). IFN에 의한 P-2 mRNA의 강력한 상향조정에도 불구하고, P-2 단백질은 프로테아좀 억제제 MG132가 첨가되지 않는 한 인터페론-활성화된 mEF의 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출되지 않는데(도 14g), 그것은 신속한 P-2 단백질 전환이 프로테아좀성 분해를 통해 발생하는 것을 증명한다. 이런 발견의 예외는 본질적으로 P-2 mRNA 및 단백질을 발현하는 일차 사람 케라티노사이트에서 발생한다(도 14h).
LPS는 mEF에서 P-2 mRNA를 유도할 수 없지만; mEF를 대장균 K12 또는 미코박테리움(M.) 스메그마티스와 함께 인큐베이션하면 24시간 이내에 P-2 mRNA의 발현이 매우 증가하는 결과를 초래하는데, 이때 10시간 째에 이미 검출된 P-2 mRNA 수준이 상당히 상향조정되어 있다(도 14i). P-2와 유형 2 IFN의 사전 인큐베이션은 mEF가 젠타마이신 보호 분석에서 1 내지 5시간 이내에 세포내 M. 스메그마티스를 빠르게 사멸하는 것을 가능하게 한다(도 14j); 젠타마이신은 이 기간 중에 무상 세포에서는 막을 통과할 수 없다. 대조적으로, 유도되지 않은 mEF가 M. 스메그마티스와 함께 인큐베이션될 때, 미코박테리아의 세포내 사멸은 약 16시간 정도 지연되고 덜 효과적이다(도 14j). 세포내 살균 활성과 P-2 mRNA 수준의 관련성은 타당한 관계임을 시사한다.
P-2 중재된 박테리아 사멸은 (1) mEF에 의한 박테리아의 세포벽 상의 전자 현미경 병변 및 (2) P-2 mRNA가 P2-siRNA로 녹다운될 때 세포내 사멸의 억제를 예측하게 한다. 세포내 M. 스메그마티스 또는 메티실린-내성 황색 포도구균(MRSA)을 타입 2-IFN-유도된 mEF로부터 감염 후 5시간 후에 숙주 세포의 계면활성제 용해에 의해 분리하였다. 이 시간 지점에 대부분의 세포내 미코박테리아는 콜로니 형성의 부족에 의해 나타나는 것과 같이 죽는다(도 14j). 박테리아를 원심분리에 의해 세포 용해물로부터 분리한다. 막-결합된 P-2-중합체가 폴리 퍼포린-1 및 폴리 C9과 유사하게 트립신 절단에 의해 내성을 보이기 때문에, 박테리아 펠릿을 트립신과 라이소자임으로 처리한 후 네거티브 염색 전자 현미경에 의해 250,000×배율로 검사하였다. 미코박테리아와 스타필로코쿠스 막의 영상은 HEK293 막 상에서의 P-2 안정한 과잉발현의 포지티브 대조표준(도 15c) 및 대장균 상에서의 보완 병변의 막 공격 복합체(MAC)(도 15f)에 유사한 폴리 P-2의 예상된 형태학을 확인해주는 병변을 나타낸다(도 15a, 15b, 15d, 15e). 원형 또는 불규칙적으로 융합된 네거티브 염색-충전 병변의 클러스터가 그렇지 않은 경우 도 15b에서 더 높은 배율에서 도시된 매끄러운 MRSA 세포벽의 바탕위에 나타난다(도 15a, 화살표). 유사한 막 병변은 2 배율로 도시된 M. 스메그마티스 막 상에서 찾아볼 수 있다(도 15d 및 15e의 화살표). P-2 병변의 클러스터는 박테리아 막 상에서 군데군데 나타나는데, 이것은 박테리아가 P-2 내포막과 국소적으로 접촉하고, 그 결과 P-2 중합 및 외부 박테리아 세포벽 안으로의 폴리-P2 삽입을 초래하여 전자 현미경에서 볼 수 있는 병변을 생성하는 것을 나타낸다. 직장의 상피 암종 세포 CMT93은 젠타마이신 보호 분석에서 M. 스메그마티스, MRSA의 임상적 분리물, S. 타이피뮤리움 및 대장균 K12를 사멸한다(도 16a 내지 16d). 사멸은 CMT-93을 RFP 단독이 아닌 RFP-태그된 P-2-RFP로 형질전환할 때 증강된다. 대조적으로, 스크램블된 siRNA 형질전환은 살균 활성을 제거하지 못하지만, P-2 siRNA는 대장균을 제외한 모든 시험된 박테리아가 세포내에서 복제하도록 유발한다. MRSA와 M. 스메그마티스는 수시간 후에 이 복제로 인해 숙주 세포를 사멸하고, 그것들이 항생물질에 의해 사멸되는 곳인, 젠타마이신을 함유하고 있는 배지 안으로 방출된다. 분석은 대부분의 경우 대부분의 P-2-의존성 박테리아 사멸이 일어나는 때인 처음 5시간에 제한되었다. 내인성 P-2가 고갈된 세포에서 박테리아 사멸은 내인성 P-2의 3'UTR의 결핍으로 인해 녹다운에 내성인 P-2-RFP로의 형질전환에 의해 회복될 수 있었다(도 16e).
본질적인 또는 유도성 P-2 mRNA를 발현하는 모든 마우스 및 사람 세포는 4가지의 박테리아 균주를 모두 사멸할 수 있다. P-2 siRNA는 도 16f 내지 16l의 실례 및 보충적인 도 20a 내지 20b에서 알 수 있는 것과 같이, 세포내 사멸 활성을 억제하였는데, 그것은 P-2 중재된 세포내 박테리아 사멸이 세포내 박테리아 침습을 방지하는 자연 면역의 결정적 성분임을 증명한다.
상 대조 광현미경을 사용한 플레이트된 박테리아의 검사는 콜로니-형성 분석에서 콜로니의 초기 측정 및 계수를 가능하게 하여 특히 미코박테리아의 경우에 시간을 절약할 수 있는데, 육안으로 볼 수 있는 콜로니 형성에 2 내지 3일을 필요로 하지만, 현미경에 의하면 플레이팅 후 12시간 후에 이미 검출이 가능하다. 이 방법으로 M. 스메그마티스를 검사하면, 5시간 후에 숙주 세포로부터 분리된 대부분의 박테리아는 콜로니를 형성하지 못한 팽창되고 통통한 몸체를 가졌고, 그것은 그것들이 죽었음을 나타낸ㄷ(도 17a, 17b). 배양물로부터 새롭게 플레이팅된 살아있는 미코박테리아는 코르크 스크류 형태를 가졌고(도 17a) 콜로니를 형성할 수 있다(도시되지 않음). 5시간째에 얼음 상에서 30분 동안 분리된 미코박테리아에 라이소자임을 시험관 내 첨가하는 것(도 17c)은 대부분의 통통함 몸체의 소멸을 유발하고, 그것은 그것들의 용해가 일어났지만, 콜로니를 형성하기 시작하는 소수의 살아있는 박테리아의 코르크 스크류 형태에는 영향을 마치지 않았음을 시사한다(도 17c, 화살표). 그러므로 박테리아 세포 벽에서 폴리-P-2 병변은 모든 박테리아를 계수하고 라이소자임이 첨가되었거나 첨가되지 않은 통통한 몸체의 백분율을 기록함으로써 정량되는 라이소자임에 의한 용해에 대한 민감성을 중재한다(도 17e).
라이소자임의 효과에 미치는 세포벽에 대한 P-2 손상의 영향을 추가로 mEF에서 및 CMT93 세포에서 손상되지 않았을 때 모두 라이소자임-내성인 M. 스메그마티스, MRSA 및 대장균을 사용하여 P-2 녹다운 및 P-2 과잉발현에 의해 연구하였다(도 17e 내지 17j, 도 23a 내지 23c). 정상적인 P-2 수준을 함유하는 스크램블 siRNA 대조표준에서, 숙주 세포의 계면활성제 용해 후 상이한 시간에 얻어진 박테리아에 라이소자임을 첨가하는 것은 콜로니의 수를 상당히 감소시키고(도 17e 및 17h), 그것은 일부 박테리아가 손상된 세포벽을 가지고 있다는 증거이지만; 박테리아가 폴리-P-2에 의해 전체적인 세포벽 손상을 통해 접근할 수 있게 되는 라이소자임에 의해 용해되지 않는 한 세포벽 손상은 회복될 수 있다. 라이소자임의 살균 효과는 P-2가 P-2 SI굼DP 이해 녹다운될 때 검출되지 않으며(도 17f 및 17i), 그것은 폴리-P2-중재된 세포벽 손상이 없음을 가리키지만, P-2-RFP가 내인성 P-2와 함께 과잉발현될 때 라이소자임의 살균 효과는 보다 더 분명해지고, 더 많은 P-2-중재된 세포벽 손상을 유도한다(도 17g 및 17j).
상기 데이터는 분명하게 우리의 모든 세포가 킬러 세포가 되고 기공-형성 단백질 퍼포린-2의 도움을 받아 세포내 박테리아 침습을 제거하는 능력을 가지고 있음을 가리킨다. P-2는 매우 초기에 작용하는데, 지질층 안으로의 삽입 및, 보완에 의해 막을 공격하는 동안 C9 중합 및 바이러스-감염된 세포 및 신생 세포의 CTL 공격 동안 퍼포린-1 중합에 유사한 중합에 의해 박테리아 세포벽을 손상시킨다. 세 개의 모든 기공 형성자는 MACPF 도메인을 공유하는데, 그것은 퍼포린-1의 중합을 촉바시키는 것으로 밝혀졌고, 퍼포린-2에서 동일한 기능을 중재하는 것으로 여겨진다. MAC의 폴리-C9 기공은 박테리아 융해 및 구조적 붕괴를 유도하는 혈청 라이소자임에 대한 접근을 제공하고; 마찬가지로 폴리-퍼포린-1 기공은 다수의 아폽토시스성 및 비-아폽토시스성 경로를 통해 세포 사멸을 중재하는 그랜자임에 대한 접근을 제공한다. 유사하게, 폴리-퍼포린-2 기공은 라이소자임, ROS, NO 및 아마도 다른 항-미생물 화합물에 대한 접근을 제공함으로써 박테리아 사멸을 증강시킨다. 그로써 기공-형성 단백질에 의한 물리적인 막 손상은 면역 방어의 공통적인 방식이다. 퍼포린-2는 세포내 박테리아를 사멸하고, MAC는 세포외재 박테리아를 사멸하며 퍼포린-1은 물리적 공격을 통하여 바이러스 감염된 세포를 사멸한다. 모든 경우에 기공 형성자에 의해 유발된 세포벽/막 손상은 과업을 마무리하기 위한 추가의 세포독성 분자를 위한 유입부로서 작용한다. MAC/PF 도메인을 공유하는 세 개의 기공 형성자 중에서 퍼포린-2가 해면동물과 다른 무척추동물에 이미 존재하고 있는, 가장 오래된 것으로 여겨진다. 그것은 세포질 도메인으로부터의 경막 신호화에 의해 활성화되는 경막 단백질이라는 점에서 다른 두 개의 기공 형성자와 다르다. 신호화 메커니즘의 설명은 P-2 활성을 증강시키거나 감소시키기 위한, 그리고 박테리아 침습 메커니즘을 밝히기 위한 약물 표적을 제공하는 것 같다.
시험된 모든 세포주의 요약. N.D.는 P-2 의존성 사멸이 행해지지 않았을 때 표시된다.
세포 유형 P-2 mRNA IFN-유도성? P-2 의존성 사멸?
CT26 결장 암종 (M.m) 유도성 예
일차 CNS 섬유아세포 (M.m) 유도성 예
일차 케라티노사이트 (H.s) 구성성 N.D.
B16F10 흑색종 (M.m) 유도성 예
Neuro2.A 신경아세포종 (M.m) 유도성 N.D.
Ubc9 방광암 (H.s) 유도성 예
MiaPac 췌장암 (H.s) 유도성 예
Cath.A 신경아세포종 (M.m) 유도성 N.D.
Ubc3 방광암 (H.s) 유도성 예
쥐과 배 섬유아세포 (mEF) (M.m.) 유도성 예
NIH 3T3 (M.m.) 유도성 예
C2C12 근아세포 (M.m.) 유도성 예
CMT93 결장 암종 (M.m). 유도성 예
일차 성상세포 (M.m.) 유도성 예
HeLa 경부 암종 (H.s.) 유도성 예
293 태아 신장 (H.s.) 유도성 예
재대 내피 세포 (H.s.) 유도성 예
복막 대식세포 (M.m.) 구성성 예
골수 유도된 DC (M.m.) 구성성 예
소교세포 (M.m.) 구성성 예
다형-핵 호중구성 과립구 (H.s.) 구성성 N.D.
HL60 전골수 세포 PMN (H.s) 구성성 예
실시예 4: 퍼포린-2는 치명적인 박테리아 감염에 대하여 보호한다
반응성 산소와 질소 중간체 및 투과성 증가 단백질은 중요한 항균 이펙터이지만, 추가의 살균성 이펙터도 존재하는 것으로 여겨진다. 본 발명자들은 기공-형성 단백질 퍼포린-2가 세포내 박테리아 복제에 대항한 보호에 필수적임을 보이고자 한다. 신체 전체에 걸쳐 어디나 존재하는 퍼포린-2는 그람 포지티브, 네거티브 및 항산균을 사멸한다. 퍼포린-2 결핍 마우스는 퍼포린-2가 충분한 마우스에서는 제거되는 구위 살모넬라 감염으로 죽는다. 퍼포린-2는 그것의 MACPF-킬러-도메인을, 감염 시에 액포를 함유하는 박테리아로 전위되는 막-소포의 루멘 안으로 겨냥하는 경막 단백질이다. 퍼포린-2가 사멸시킨 박테리아는 그것의 세포벽에 박테리아를 반응성 산소 및 질소 중간체에 더 민감하게 만들 수 있는 군집된 90Å의 기공을 내포한다. 병원성 박테리아는 퍼포린-2 발현 또는 활성화를 전복시키고, 퍼포린-2 수준은 환자에서 비-치유성의 만성적으로 감염된 피부 궤양에서 억제된다. 퍼포린-2 작용의 경로를 연구하는 것은 생명을 위협하는 박테리아 감염에 대한 신규한 접근법에 대한 기회를 제공할 것이다.
마우스에서 퍼포린-2 녹아웃은 제어되지 않는 살모넬라 복제 및 치명성을 초래한다
생체 내에서 퍼포린-2의 생물학적 중요성을 측정하기 위하여, 본 발명자들은 상동 재조합에 의하여 퍼포린-2 녹아웃(P-2-/-) 마우스를 제조하였다. 마우스들은 C57B16과 129 바탕의 혼합으로서 중요하지 않은 MHC 항원에 차이를 제공하며, 그로써 한정된 다양성을 유발한다. P-2-/-마우스는 병원체가 없는 조건하에서 발생하고 정상적으로 잘 자란다. 동형접합성 P-2-/-, 이형접합성 P-2+/-및 야생형 P-2+/+한배 새끼들에게 설명된 것과 같이 살모넬라 타이피뮤리움을 구-위적으로 도전시켰다. 스트렙토마이신으로의 전처리 후 24시간 후에 P2+/+마우스의 105의 스트렙토마이신 내성 살모넬라로의 감염으로 감염 후 처음 5일 동안에 약간의(<10%) 체중 손실이 있었고, 계속해서 제 9일에는 완전히 회복되었다(도 25a). 대조적으로, 동형접합성 P-2-/-마우스는 5일 또는 6일이 될 때까지 점진적인 체중 손실과 함께 혈액이 섞인 설사를 하였고, 그때에 분석 및 추가 고통을 방지하기 위하여 안락사시켰다. 102의 살모넬라만으로의 도전으로도 P-2-/-마우스에서는 진행성 질병이 유발되었고 치명적이었다. P-2+/-한배 새끼는 P-2+/+한배 새끼보다 더 심각한 질병을 나타냈지만 회복되었다(도 25a).
S. 타이피뮤리움으로 감염된 P-2-/-마우스의 심각한 체중 손실은 혈액의 높은 박테리아 역가 및 다수의 기관으로의 전파와 관련되었다(도 25b). 조직병리학적 검사는 소장 및 대장의 상피 장벽의 완전한 용해 및 대규모의 세포 침윤을 나타냈지만, 박테리아를 제거할 수는 없었다(도시되지 않음).
P-2-/-마우스로부터의 IFN-γ 활성화된 복막 삼출물 대식세포(P-2-/-PEM)에 의한 살모넬라의 거부반응을 또한 시험관 내에서 분석하였다. PEM을 한 시간 동안 감염시키고, 세척한 후 표시된 시간 동안 인큐베이션하고, 용해시킨 후 CFU를 측정하였다. 살모네라는 P-2-/-PEM 내에서 큰 수로 복제하였다. 대조적으로 P-2+/+PEM에서 그것의 수는 4시간 내에 약 50%로 감소하였고, 그 후에는 일정하게 유지되었다. 이형접합성 P-2+/-PEM은 살모넬라 복제를 지연시키기만 하였다. 비교를 위해, 야생형 PEM에서 siRNA를 사용한 P-2 녹다운은 P-2-/-PEM을 닮았고, 그것은 녹다운 기술을 증명한다(도 25c).
인터페론은 모든 세포에서 퍼포린-2를 유도하고 살균 활성을 조장한다
P-2-/-마우스에서 살모넬라의 신속한 확산은 P-2-/-마우스에서 어떤 세포도 박테리아 전파를 중지시킬수 없음을 시사하였다. 그러므로 본 발명자들은 어떤 세포 유형이 P-2를 본질적으로 발현하는지 또는 P-2를 발현하도록 유도될 수 있는지 조사하였다. 표 2는 그 데이터를 요약한다. PMN, 대식세포, 수지상 세포 및 소교세포는 본질적으로 퍼포린-2 mRNA 및 단백질을 발현하고, 그것은 추가로 IFN-γ 및 LPS에 의해 상향조정된다(제시되지 않음). 사람 일차 케라티노사이트 및 만성 상처의 가장자리로부터 취한 조직 샘플로부터의 케라티노사이트(도 27)오 마찬가지로 P-2를 본질적으로 발현한다. 시험된 다FMS 모든 세포 및 세포주은 IFN-α,-β 또는-γ로 처리한 후에만 P-2 mRNA를 발현한다. P-2를 발현하는 모든 세포는 세포내 박테리아 감염을 제어할 수 있지만, 그러나 그것은 P-2가 siRNA로 녹다운될 때에는 제거된다. 사람 PMN 및 대식세포는 P-2 단백질을 본질적으로 발현한다(도 26a). PMN에서, HL60으로부터 레틴산에 의해 유도된 퍼포린-2의 녹다운은 살균 활성을 상당히 억제하고 MRSA, M. 스메그마티스 및 S. 타이피뮤리움의 세포내 복제를 가능하게 한다(도 26a). 마찬가지로 P-2 녹다운은 장의 상피 세포(직장 암종 CMT93)(도 26b), 사람 내피 세포(HUVEC)(도 26c) 및 사람 경부 암종 상피 세포 HeLa(도 26d)에서 세포내 박테리아의 사멸을 상당히 억제한다. P-2-GFP 형질전환에 의한 P-2의 상승된 발현은 미코박테리움 아비움의 제거에 중요한 살균 활성을 즈가시킨다(도 26e). P-2의 3'-미번역 영역에 특이적인 siRNA로의 내인성 P-2의 녹다운은 P-2-GFP eh는 P-2-RFP로의 형질전환에 의해 보완되고, MEF(도 26f) 또는 식세포(제시되지 않음)에서 살균 활성을 완전하게 재구성한다. 점증적으로, 본 발명자들의 데이터는 P-2가 어느 곳에서든지 발현되거나 유도될 수 있고, 조사된 적어도 세 가지 유형의 박테리아의 세포내 복제를 억제하거나 사멸시키는 데 필요한 것을 보여준다.
박테리아는 퍼포린-2 감염 및 활성화를 차단할 수 있다
P-2의 강력한 살균 활성은 세포내 박테리아가 퍼포린-2를 회피하기 위해 전략을 가져야 한다는 것을 시사한다. 원칙적으로, 박테리아는 비-식균작용 세포에서 퍼포린-2 전사를 차단할 수 있을 것이고, 본질적으로 퍼포린-2 발현 세포에서 하향 조정을 유발하거나 퍼포린-2 활성화 및 중합을 간섭한다. 천연 MEF의 실험실 균주 대장균 K12로의 감염은 P-2 mRNA의 신속한 유도 및 계속해서 세포내 박테리아의 사멸을 초래한다. 대장균과는 다르게, 살아있는 야생형 S. 타이피뮤리움은 MEF에서 P-2 mRNA 유도를 유발하지 못한다(또 27a). 대조적으로 열로 인해 죽었거나 PhoP 돌연변이 살모넬라는 MEF에서 대장균과 유사한 정도로까지 P-2 mRNA를 유도하였고, 그것은 S. 타이피뮤리움이 P-2 유도를 활발하게 억제하는 것을 시사한다. 유사하게, HeLA 세포의 편향성(obligate) 세포내 박테리아 클라미디아 트라코마티스로의 감염은 P-2 발현을 유도하지 못한다. 더욱이, 외인성 IFN에 의한 P-2 유도는 새로운 클라미디아 단백질 합성을 필요로 하는 메커니즘을 경유하여 활발하게 억제된다(도 27b). EPEC는 세포내 이물 흡수를 차단할 수 있지만, 식균작용 세포는 이런 억제를 극복할 수 있다(도 27c). 세포내 이물 흡수된 EPEC는 그것이 유비퀴틴-유사 분자인 NEDD8을 비활성화하는 탈아미드화효소를 코드화하는 Cif 플라스미드를 운반할 때에만 퍼포린-2로부터 보호된다(도 27d). NEDD8은 NFκB 활성화를 포함하여 기본적인 많은 세포 경로에 참여하는 쿨린-고리 유비퀴틴 E3-리가제(CRL)의 활성화에 필요하다. 네딜레이션(neddylation)은 NEDD8 특이적 E2-리가제 Ubc12에 의해 수행된다. P-2의 세포질 도메인은 효모 2 하이브리드 시스템에서 Ubc12와 상호작용하고, P-2와 공동-면역침전되는데(보충 도 27), 이것은 CRL의 Ubc12 중재된 네딜레이션이 퍼포린-2 중재된 사멸에 필요하고, CIF가 이 단계를 차단하는 것을 시사한다.
표 2에서 알 수 있는 것과 같이, 케라티노사이트는 감염에 대항하여 피부의 장벽 기능에 기여하는 것을 시사하는 퍼포린-2 mRNA 및 단백질을 발현한다. 본 발명자들은 고박테리아 버든이 포함된 비-치유성 만성 피부 궤양에 걸린 10명의 환자의 피부 및 표피에서 P-2 발현 수준을 조사하였다. 상처 및 상처 가장자리의 절제 수술로 인한 괴사조직 제거를 표준 돌봄의 일부로서 수행하였다. 계속해서, 절개된 피부를 상처-인접 절반과 정상 피부-인접 절반으로 나누고, 피부와 표피로 분리하고 TaqMan-PCR에 의해 P-2 mRNA 수준을 정량하였다. 퍼포린-2 mRNA 수준은 정상 피부-인접 세포에 비교하여 만성 궤양에 인접한 피부상의 표피 세포에서 대략 35배 더 낮았다. 대조적으로, 근간이 되는 피부에서 P-2 mRNA의 비율은 P-2 mRNA 수준과 반대 방향으로 상처 가까이에서 4배 더 높았다(도 27d). 데이터는 고 박테리아 버든을 포함한 만성 피부 궤양에서 P-2 수준은 영향을 받고 지연된 치유와 관련이 있을 수 있음을 보여준다.
퍼포린-2는 반응성 산소 및 질소 종의 살균 활성을 증강시킨다
현재의 패러다임은 세포내 박테리아가 반응성 산소 및 질소 종에 의해 및 리소좀과 식균작용된 박테리아의 융합에 의해 사멸되는 것을 시사한다. 여기서 본 발명자들은 각 이펙터 경로의 살균 효율과 그것들의 상조작용을 분석한다. 본 발명자들은 각각의 이펙터를 개별적으로 차단하고 세포내 S. 타이피뮤리움 및 M. 스메그마티스의 생존율 및 복제 또는 사멸을 측정하였다. 이들 실험을 장의 상피 세포(CMT93)(제시되지 않음)으로 및 IFN-γ 활성화된 PEM(도 27e)을 사용하여 수행하였고, 그 결과 실제로 동일한 결과를 얻었다. 먼저 본 발명자들은 IFN-γ 활성화되고 LPS 자극된 PEM이 ROS와 NO를 생성하고, 이런 생성이 P-2 siRNA 녹다운에 의해 영향을 받지 않는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 또한 사용된 ROS 및 NO 억제제들이 특이적이었고, ROS 또는 NO를 차단하는 데 활성이었음을 확인하였다(제시되지 않음). PEM은 세 개의 모든 이펙터가 스크램블 siRNA 형질전환된 세포에서 활성이었을 때 감염 후 처음 4시간 내에 세포내 살모넬라의 약 90%를 죽일 수 있다(도 27e, 실선). P-2의 녹다운은 살모넬라에 대항하는 살균 활성을 완전히 제거하였고, 그것들의 세포내 복제를 허용하였다(도 27e, 점선). NAC 및 NAME을 사용한 ROS와 NO의 추가의 억제는 더 이상의 효과를 나타내지 않았다. P-2가 없을 때(스크램블 siRNA, 청색 및 녹색 실선) ROS 또는 NO의 억제는 또한 살균 활성을 상당히 감소시켰지만, P-2가 없을 때 박테리아 복제는 여전히 차단되었다. M. 스메그마티스는 4시간 이내에 살균 이펙터에 의한 사멸에 대해 더 내성을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 퍼포린-2 녹다운은 M. 스메그마티스의 사멸을 상당히 억제하였고, ROS 또는 NO의 추가의 차단은 더 이상의 효과를 나타내지 않았다. P-2 녹다운이 없는 ROS 또는 NO의 차단은 미코박테리아에 대한 살균 활성에 대해서는 단지 제한적이고 유의미하지 않은 효과를 나타냈다. 대조적으로 비-병원성 실험실 대장균 K12는 P-2가 없을 때에도, P-2가 존재할 때보다는 상당히 덜 효과적이긴 하지만 ROS 및 NO에 의한 세포내 사멸에 민감하다. 데이터는 퍼포린-2가 앞에서 알 수 있는 것과 같이 반응성 산소 및 질소 종과 및 라이소자임과 상조작용을 하고, 박테리아는 개별적인 이펙터에 대해 차등적으로 민감한 것을 가리킨다.
퍼포린-2는 액포를 함유하는 박테리아로 전위된다
감염이 없을 때 퍼포린-2는 핵주위의 소포 구획의 막에 삽입된 채로 보관된다(도 28b). 그러므로, 사멸하기 위해서는 퍼포린-2는 박테리아 감염 부위로 수송되어야 한다. 퍼포힌-2는 P-2 전위 및 중합을 촉발하는 세포질 단백질과 상호작용할 수 있는 짧고, 고도로 보존된 세포질 도메인을 가진다(도 28a). Y에서 F로의 돌연변이(도 28a에서 붉은 색 화살표로 표시됨)는 P-2 활성화에 중요한 기능을 시사하는 P-2의 살균 활성을 차단한다(제시되지 않음).
본 발명자들은 공초점 현미경에 의해 액포를 함유하고 있는 박테리아로의 퍼포린-2 전위를 시험하였다. 이들 실험에서 BV2 세포의 내인성 퍼포린-2를 녹다운시키고, 일시적인 형질전환에 의해 P-2-GFP로 재구성하였다. BV2를 세포내 이물 흡수를 유도함으로써 활발하게 세포를 침습하는 살모넬라로 감염시켰다(도 28b). 이 실험에서 박테리아를 박테리아 DNA를 DAPI로 염색함으로써 영상화하고(더 좋은 가시성을 위해 백색으로 도시함) P-2-GFP과의 공전을 영상화한다. 감염 후 5분 후에 여러 살모넬라는 방출된 DNA 세포내 이물 흡수된 살모넬라의 DAPI DUATR의 '구름(cloud)'에 의해 시사되는 것과 같이 이미 세포내 이물로 흡수되고 외관상 용해된다. 세 개의 1.2μ 두께의 슬라이스는 DAPI 및 P-2-GFP에 의해 드러나는 용해된 살모넬라의 수(8) 및 세포내 이물 흡수성 소포를 함유하는 확산 DNA의 크기를 보여준다. DAPI에 의해 염색된 하나의 무상 살모넬라(화살표)는 여전히 세포 외부에서 바닥 부분(좌측 패널)에서 막대 모양의 구조로서 볼 수 있지만, 상부에서는 1.2μ 부분에서는 보이지 않는다. 본 발명자들은 또한 P-2 전위에 대해 GFP-마크된 대장균으로의 감염에 의해 일시적으로 P-2-RFP 형질전환된 BV2를 분석하였다. 감염 후 5분 이내에 P-2는 액포를 함유하고 있는 박테리아의 막상에서 및 박테리아 상에서 발견되었다(도 28b). 형광 세기는 퍼포린-2가 이 부위에서 고도로 풍부한 것을 시사하고, 그것은 특이한 표적화 메커니즘을 시사한다. 박테리아는 단편화되는 것으로 여겨지고 액포 내에서 확산된 형광으로서 검출가능한 GFP를 방출하였다. 데이터는 액포를 함유하고 있는 박테리아로의 퍼포린-2 전위가 감염의 수 분 이내에 완료되고 액포 내부의 박테리아의 단편화 및 박테리아 세포벽 상에서의 P-2-공격 및 기공 형성과 일치하는 그것들의 방출과 관련이 있음을 나타낸다.
퍼포린-2는 박테리아 세포벽에서 약 90Å의 기공을 형성한다
퍼포린-2가 감염의 수분 이내에 루멘을 향하는 것을 목표로 하는 이펙터 도메인을 가지는 박테리아를 둘러싸는 막 상에 축적된다는 발견은, 보충물 C9 및 퍼포린-1의 세포독성 메커니즘과 유사하게, 퍼포린-2가 그것의 세포벽에서의 중합 및 다른 살균 인자들의 침투를 증강시키는 물로 채워진 기공을 생성함으로써 박테리아에 치명적인 일격을 가할 수 있음을 시사한다. 본 발명자들은 퍼포린-2의 이전에는 보고되지 않았던 기공 형성 능력을 측정하였다. 본 발명자들은 C9 또는 퍼포린-1 단량체와 유사한 퍼포린-2 단량체가 세포독성을 나타내지 않으며, 기공 형성이 P-2의 세포질 도메인의 아직은 알려지지 않은 신호화 단백질과의 특이한 상호작용을 통해 P-2 중합을 필요로 한다고 판단하였다. 퍼포린-2의 세포질 도메인은 경막 도메인 가까이에 있는 보존된 RKYKKK(SEQ ID NO:4) 서열을 함유하는데(도 28a, 파란색 화살표), 그것은 막의 반대쪽에서 P-2 중합을 촉발시키기 위해 단백질 가수분해성 절단 부위로서 기능할 수 있다. 이것을 P-2-GFP 형질전환된 HEK293 세포로부터 차등 원심분리 및 간단하게 저수준의 트립신으로의 처리하여 세포질 도메인을 절단함으로써 퍼포린-2-GFP 내포 막을 정제함으로써 시험하였다(제시되지 않음). 트립신 처리된 퍼포린-2-GFP-막의 전자 현미경 조사는 평균 내부 직경이 85 내지 95Å인 전형적인 경막 기공을 보여준다(도 29a, 백색 화살표). 또한 중합되는 동안(검은색 화살표) 퍼포린-2의 융합에 의해 형성된 반-고리, 8자형 및 더 불규칙한 구조들은 고리 폐쇄에 의해 종결될 때까지 계속되는 중합 과정과 일치한다. C9 및 퍼포린-1과 같이, 고리-폐쇄는 막 단백질의 입체 방해에 의해 차단될 수 있다. 형질전환되지 않은 세포들은 그런 기공을 갖지 못한다(제시되지 않음). 이들 데이터는 직접 퍼포린-2가 실제로 액포 내부의 박테리아 세포벽 상에서 잠재적으로 기공을 형성할 수 있는 기공-형성 경막 단백질임을 보여준다. 퍼포린-2가 소포의 루멘 안으로 겨냥하는 MACPF 도메인을 가지는 막 단백질이기 때문에, 기공 형성은 소포 내부에서 MACPF 도메인을 접촉하는 막에서 일어날 것이다.
P-2 기공이 죽은 박테리아 상에서 조립되는 것을 시험하기 위하여, 본 발명자들은 저장성 비-이온성 계면활성제 용해에 의한 감염 후 3시간 후에 IFN 활성화되고, 퍼포린-2-충분한 MEF로부터 세포내 박테리아를 얻었다. 박테리아 세포벽은 인지질 이중층과 달리 약한 계면활성제에 의한 용해에 내성이고, 따라서 원심분리에 의해 얻고, 전자 현미경에 의해 영상화한다. M. 스메그마티스 세포 벽 상에서 약 90Å의 군집되고(도 29b, 백색 화살표), 빈번하게 불규칙적인 구조를 가지는(검은색 화살표) 많은 기공들을 볼 수 있다. 견고한 M. 스메그마티스 세포벽에 의한 입체 방해는 빈번하게 퍼포린-2-중합체의 고리 폐쇄를 감섭하는 것 같고, 그 결과 보다 불규칙적인 중합체가 생성된다. 기공 외부에 있는 M. 스메그마티스 세포 벽의 네거티브 염색에 의한 표면 염색은 최소한이고, 미코박테리아의 세포벽의 공지된 소수성과 일치한다. 대조적으로 S. 아우레우스의 세포벽은 미코박테리아 세포벽보다는 네거티브 염색이 점착되는 것을 허용함으로써 더 친수성인 것으로 나타난다. S. 아우레우스 세포벽은 불규칙성(검은색 화살표) 및 퍼포린-2 기공의 달라지는 크기(도 29c)에 의해 판단되는 바 인지질 막보다 더 견고하다.
재료 및 방법
플라스미드 구성물
쥐과 mpeg1 cDNA의 완전한 코딩 영역을 여러개의 EST 클론으로부터 구성하고 pEGFP-N3 플라스미드(Clontech)에 삽입하였다. 일부 실험에서 사용하기 위해 단량체 RFP(R. Flavell, Yale)를 GFP 대신 클론하였다.
세포주 및 일차 세포
RAW264.7, J774, HL-60 및 HEK-293 세포주을 ATCC로부터 얻었다. BV2 소교 세포주은 마이애미 주립대학교의 J. Bethea 박사의 선물이었다. 모든 세포를 ATCC 권고를 따라 37℃에서 5% CO2를 함유하는 가습된 분위기에서 배양하였다. HL-60은 앞에서 설명된 것과 같이 레틴산을 사용하여 PMN 표현형을 향해 분화하였다. 쥐과 일차 대식세포를 싸이오글리콜레이트-유도된 복막 또는 골수로부터 앞서 설명된 것과 같이 얻었다. 사람 대식세포 및 PMN을 새로운 건강한 공여자의 PBMC로부터 분리하였다. 사람 대식세포는 앞서 설명된 것과 같이 단핵세포로부터 분화하였고, 사람 PMN은 앞서 설명된 것과 같이 분리하였다. 쥐과 배 섬유아세포(MEF)를 앞서 설명된 것과 같이 분리하였다.
1. 박테리아 균주:
2. S. 타이피뮤리움 균주 LT2Z(마이애미 주립대학교 G. Plano 박사의 선물), K12 대장균 및 메티실린-내성 황색 포두구균(마이애미 주립대학교 L. Plano 박사의 선물)을 루리아 육즙(LB)에서 성장시켰다.
3. 세포내 M. 아비움(마이애미 주립대학교 T. Cleary 박사의 선물) 및 M. 스메그마티스(ATCC)를 Middlebrook 7H9 육즙에서 성장시켰다.
화학물질 및 사이토킨
리포다당(LPS)을 Sigma로부터 구입하여 1ng/ml의 최종 농도로서 사용하였다. 재조합 사람 및 쥐과 IFN-γ를 Peprotech로부터 구입하여 100U/ml의 최종 농도로 사용하였다. N-아세틸 시스테인 및 L-NAME을 둘 다 Sigma로부터 구입하였다.
항체
토끼 항-Mpeg1, 사람 항-Mpeg1 및 항-GFP 다클론성 항체를 Abcam으로부터 얻어서 웨스턴 블롯 분석에 사용하였다. 토끼 항-퍼포린-2(세포질 도메인) 항혈청을 21st Century에 의해 제조하고 얻었다.
qRT-PCR
RNA를 RNeasy(Qiagen) 지시를 따라 세포로부터 추출하였다. 1㎍의 RNA를 QuantiTect 역전사 키트(Qiagen)를 사용하여 공급자의 프로토콜을 따라 cDNA로 전환하였다. 쥐과 mpeg1, GAPDH 및 β-액틴에 대해 Taqman® 유전자 발현 분석(Applied Biosystems)을 사용하여 qRT-PCR을 수행하였다. 사람 조직에 대해서는, 사람 mpeg1, GAPDH 및 β-액틴 프로브를 활용하였다. 모든 분석을 Applied Biosystems 7300 PCR 플랫폼 상에서 수행하였다.
젠타마이신 보호 분석
세포내 살균 활성을 조정하였다. 간단히 설명하면, 박테리아를 37℃에서 흔들어주면서 16 내지 18시간 동안 루리아 육즙(LB)에서(S. 타이피뮤리움, S. 아우레우스 및 대장균) 또는 24시간 동안 Middlebrook 7H9 육즙에서(미코박테리아) 성장시킨 후 감염시켰다. S. 타이피뮤리움, 대장균 및 S. 아우레우스에 대해서는 배양물을 LB로 1:33으로 희석하고 다시 3시간 동안 성장시켜서 박테리아가 로그 단계에 들어가도록 하였고, 살모넬라에 대해서는 침습성 표현형을 유도하였다. 진핵 세포를 각각의 세포에 대해 Lonza의 최적화된 프로토콜을 따라 형질전환시키고, 형질전환 후 12-웰 플레이트에 플레이팅하였다. RA로 분화시킨 HL-60 세포는 자극하지 않았고; RAW264.7 세포를 14시간 동안 LPS(1ng/ml) 및 IFN-γ(100U/ml)로 자극하여 대식세포 계통으로 분화시켰으며; 다른 모든 세포는 종-특이적 IFN-γ(100U/ml)로 자극하였다. 세포를 10과 60 사이의 감염 다중도(MOI)로 30분 동안(S. 타이피뮤리움) 또는 1시간 동안(S. 아우레우스, 대장균 및 M. 스메그마티스) 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 감염시켰다. 감염 후에, 세포를 빙-냉 PBS로 2회 세척하고, 50㎍/ml의 젠타마이신을 함유하고 있는 새로운 배지를 첨가하였다. 2시간 후에 배지를 교환하여 젠타마이신의 농도를 5㎍/ml로 감소시켰다. 표시된 시간 지점에 세포를 PBS로 세척하고, ddH2O 중의 1% Igepal을 사용하여 용해시킨 후 희석하여 LB 아가 플레이트 상에(S. 타이피뮤리움, S. 아우레우스, 대장균) 또는 Middlebrook 7H11 플레이트 상에(미코박테리아) 3중으로 플레이팅하고 콜로니 성장 후에 CFU를 측정하였다.
젠타마이신-유리 세포내 박테리아 사멸 분석
젠타마이신 보호 분석을 변형하여 젠타마이신 유리 세포내 박테리아 사멸 분석을 만들었다. 상기에 대한 변형은 진핵 세포를 감염시 90 내지 100%의 집밀도 및 5와 15 사이의 감소된 감염 다중도(MOI)를 이루도록 플레이팅하는 것을 포함한다. 침습 시간은 S. 타이피뮤리움에 대해서는 30분, 그리고 S. 아우레우스, 대장균 및 M. 스메그마티스에 대해서는 1시간으로 변화시키지 않고 유지하였으며, 감염은 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 일어나도록 하였다. 세포외 박테리아의 최대 제거를 보장하기 위하여, 세척 단계를 세포를 빙-냉 PBS로 2회 세척하고, 트립신 처리하여 세포외재성 박테리아 부착물을 제거한 다음 추가로 빙-냉 PBS로 3회 세척하도록 변경하였다. 매 4시간마다 배지를 제거하고 세포를 PBS로 2회 세척한 후 새로운 배지를 다시 첨가하였다. 표시된 시간 지점에 세포를 PBS로 3회 세척하고, ddH2O중의 1% Igepal로 용해시키고, 희석하여 LB 아가 플레이트 상에(S. 타이피뮤리움, S. 아우레우스, 대장균) 또는 Middlebrook 7H11 플레이트 상에(미코박테리아) 3중으로 플레이팅하고 콜로니 성장 후에 CFU를 측정하였다.
RNA 간섭
쥐과 세포에 대해, 세 개의 퍼포린-2-특이적 화학 합성된 19-뉴클레오티드 siRNA 듀플렉스를 Sigma로부터 얻었다. 두 개의 siRNA는 퍼포린-2의 3'UTR에 상보하였고, 세 번째 siRNA는 코딩 영역에 상보하였다. 서열은 다음과 같았다: CCACCUCACUUUCUAUCAA(SEQ ID NO:1), GAGUAUUCUAGGAAACUUU(SEQ ID NO:2) 및 CA AUCAAGCUCUUGUGCAC (SEQ ID NO:3). 스크램블 siRNA를 또한 반응에 대한 대조표준으로서 사용하기 위해 제조하였다. 사람 세포에 대해서는, 세 개의 사람 퍼포린-2-특이적 사일런서 선택 siRNA를 Ambion(Invitrogen) Silencer Select #s61053, s47810, s61054로부터 구입하였다. Ambion(Invitrogen)으로부터의 사일런서 선택 네거티브 대조표준 #2를 또한 사용하였다. 모든 세포 안으로의 siRNA의 형질전환은 Amaxa Nucleofector 시스템(Lonza)을 사용하여 제조업체의 지시를 따라 수행하였다. 모든 형질전환을 1 내지 4×106 세포, 300nM의 최종 농도의 sIRNA(퍼포린-2-특이적 siRNA를 모았다) 및 표시된 경우 2㎍의 플라스미드 DNA를 사용하여 수행하였다. 형질전환 직후 세포를 항생물질-유리 완전 배지에 플레이팅하였다.
네거티브 염색 투과 전자 현미경 검사
진핵 세포 막: 막을 안정하게 형질전환된 퍼포린-2GFP HEK293 세포로부터 N2-캐비테이션 및 차등 원심분리에 의해 분리하였다. 막을 적은 부피의 중성 트리스-완충된 식염수에 재현탁하고, 100㎍/ml의 트립신으로 1시간 동안 37℃에서 처리한 후, 세척하고 5% 중성 Na-포스포텅스텐산염으로 30초 동안 네거티브 염색하였다. 영상을 Phillips CM10 투과 전자 현미경 상에서 52,000-배 초기 배율에서 얻었다.
박테리아 막: MEF를 14시간 동안 IFN-γ(100U/ml)로 자극하고, 표시된 박테리아 균주로 30의 감염 다중도에서 5시간 동안 감염시켰다. 원핵생물 막을 MEF를 ddH2O중의 1% Igepal로 용해시킴으로써 수득하였다. 용해물을 200g에서 10분 동안 원심분리하여 무상 박테리아를 펠릿화하고, 계속해서 무상 박테리아를 폴리트론으로 전단하여 부상 박테리아를 파괴하여 막을 분리해냈다. 그 결과의 펠릿을 100㎍/ml의 트립신으로 1시간 동안 37℃에서 처리하고, 침전시킨 후 최소한의 ddH2O에 재현탁하고, 3%의 우라닐 포메이트로 30초 동안 네거티브 염색하였다. 영상을 Phillips CM10 투과 전자 현미경 상에서 52,000 내지 168,000-배 초기 배율에서 얻었다.
공초점 현미경 검사
사퍼포린-2-GFP 정위를 위해, RAW264.7 세포를 퍼포린-2-GFP로 일시적으로 형질전환시키고, 밤새 LPS(1ng/ml) 및 IFN-γ(100U/ml)로 No. 1.5 커버글라스(MatTek Corp)가 부착된 유리 바닥 접시에서 자극하였다. 세포를 PBS로 1회 세척하고, 세포 소기관을 표지하였다. 소포체(ER) 표지화를 위해서 본 발명자들은 ER-TrackerTMBlue-White DPX(Invitrogen)을 1μM의 작업 농도로 30분 동안 37℃에서 사용하였다. 다른 모든 염색에 대해서는 형질전환된 세포를 3% 파라폼알데하이드(PFA)로 실온에서 15분 동안 고정시켰고, 0.5% 사포닌을 투과시킨 후 10% 정상 염소 혈청으로 차단한 후 일차 및 이차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 항-CD107a (LAMP-1)(BD Pharmingen), 항-CD11b(BD Pharmingen), 항-golgin97(Invitrogen), 항-EEA1(Calbiochem), 항-GM130(BD biosciences) 및 Hoechst 33258(Invitrogen)을 사용하여 세포 소기관을 확인하였다. 이차 항체는 모두 염소에서 생성하였다. 시편을 PBS 중에 유지하고 모터 부착 스테이지와 Leica DF495 카메라가 부착된 Leica SP5 역 공초점 현미경 상에서 실온에서 영상화하였다. 영상을 Leica application suite advanced 형광 소프트웨어를 사용하여 분석하고 디콘볼루션 처리를 적용하였다.
퍼포린-2-RFP 및 대장균 정위 영상화를 위해, BV2 세포를 퍼포린-2-RFP 및 내인성 퍼포린-2의3'UTR을 표적화하는 siRNA로 공동-형질전환시키고, 밤새 IFN-γ(100U/ml)로 자극한 후 커버슬립에 부착시켰다. 세포를 100의 MOI로 GFP-대장균으로 5분 동안 감염시키고, 그 지점에서 세포를 PBS로 2회 세척한 후 3% PFA로 15분 동안 실온에서 고정시켰다. 개별적인 커버슬립을 Vectashield 장착 배지를 활용하여 슬라이드에 장착하고, 실온에서 모터 부착 스테이지가 달린 Leica 역 공초점 현미경 및 Zeiss LSM710 역 공초점 현미경 상에서 영상화하였다. 영상을 Leica application suite advanced 형광 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
Leica SP5 공초점 현미경은 평평한-고차 색지움 렌즈 63x/1.4NA 대물렌즈, 405, 488, 561nm 레이저(만약 Cy5 또는 Alexa Fluor 647을 포함하고 있다면 633nm 레이저)를 사용하였다. 픽셀 크기는 60nm로 설정하여 2D Nyquist 샘플링을 얻었다(500nm 빛에 대해 회절 한계 214nm).
Zeiss LSM710 공초점 현미경은 평평한-고차 색지움 렌즈 63x/1.4NA 대물렌즈, 405, 488, 561nm 레이저(만약 Cy5 또는 Alexa Fluor 647을 포함하고 있다면 633nm 레이저)를 사용하였다. 픽셀 크기는 60nm로 설정하여 2D Nyquist 샘플링을 얻었다(500nm 빛에 대해 회절 한계 214nm).
실시예 5: 세포내 박테리아의 제거에서 RASA2/GAP1M P-2-상호작용의 기능 규정
대식세포, 소교세포, mEF, HeLa 및 다른 새롭게 이식된 세포 또는 세포주에서 P-2의 P-2 siRNA 녹다운은 젠타마이신 보호 분석 및 항생물질의 부재시에(제시되지 않음) 측정되는 바, 병원성 살모넬라 타이피뮤리움, 메티실린 내성 황색 포도구균(MRSA), 미코박테리움 스메그마티스(도 30a) 및 미코박테리움 아비움(도시되지 않음)을 포함하여 세포내 박테리아의 사멸 및 제거를 차단한다. 도 30에서, 직장 상피 세포(A) 또는 마우스 배 섬유아세포(mEF)(B)를 감염시키기 전 24시간 전에 P-2의 3'UTR에 특이적인 2개의 siRNA의 풀로 또는 P-2 RNA 및 단백질을 녹다운시키는 대조 스크램블된 siRNA로(도 31c) 일시적으로 형질전환시켰다; P-2 보충(B)에 대해서는 세포를 P-2 siRNA 및 녹-다운 내성 P-2-RFP(내인성 P-2의 3'UTR을 발현하지 않음)로 또는 대조 RFP로 공-형질전환시켰다. P-2-RFP는 P-2의 C-말단에 단량체 DsRed(RFP)가 태그된 융합 단백질이다. 형질전환된 P-2-RFP는 박테리아 사멸시 전체가 활성이다(도 30b, c). 16시간째에 IFN-γ를 첨가하여 P-2 mRNA(P-2 siRNA가존재할 때 억제된다)를 유도한다. 0 시간에 세포를 30 내지 60분 동안 병원성 MRSA, 살모넬라 타이피뮤리움 또는 미코박테리움 스메그마티스로 30 내지 50 박테리아/세포의 감염 다중도(MOI)로 감염시킨다. 세포내 감염 후, 세포외재성 박테리아를 PBS로 세척하고, 세포를 젠타마이신에 재플레이팅하여 세포외재성 박테리아 복제를 방지한다. 숙주 세포를 약한 계면활성제(NP40)로 감염 직후 용해하고, 그 후에 여러 시간 지점에서 생존한 박테리아를 복제 콜로니 형성 분석에 의해 열거하였다. 약한 계면활성제는 숙주 세포막은 용해하지만 박테리아 세포벽을 용해하지 못한다.
직장 상피 세포(도 30)에서, 대조-스크램블 siRNA 형질전환은 P-2에 영향을 미치지 못하고, 상피세포의 세포내 박테리아의 사멸 능력을 억제하지 못하는 한편, P-2 siRNA는 사멸을 차단하고 숙주 세포를 죽이는 세포내 복제를 허용한다. 내인성 P-2 외에 P-2-RFP 발현은 박테리아 사멸을 증가시켰다(도 30a). 내인성 P-2가 녹다운될 때, P-2-RFP로의 보충은 사멸을 회복시킨다(도 30b). 선천성 방어 메커니즘에 대해 예상했던 것과 같이, P-2는 그람-네거티브 살모넬라, 그람-포지티브 스타필로코쿠TM 및 항산성 미코박테리아와 같이 매우 다양한 외부 세포벽을 가지는 박테리아를 사멸할 수 있다.
ROS 및 NO는 파고솜 내 박테리아를 사멸하는 것으로 알려져 있는 이펙터이다. 그러므로 본 발명자들은 살모넬라 타이피뮤리움, 미코박테리아 및 MRSA에 대해 IFN-γ 활성화된 복막 대식세포의 살균 활성에 대해 직접 P-2 또는 ROD(NAC와 함께) 또는 NO(NAME과 함께)를 차단하는 효과를 비교하였다(도 31). P-2, ROS 및 NO가 억제되지 않을 때 우수한 세포내 사멸이 이루어진다(도 31에서 표지된 라인, P-2, ROD, NO). P-2가 없을 때 박테리아는 ROS와 NO에도 불구하고 복제한다. ROS의 NAC로의 억제 또는 NO의 NAME으로의 억제는 사멸 활성을 서서히 하락시키는데, 그것은 ROS와 NO가 둘 다 P-2 중재된 사멸을 증강시킨다는 것을 시사한다.
데이터는 P-2가 세포내 병원성 박테리아의 사멸에 결정적임을 보여주는데, 그 이유는 P-2가 없을 때 박테리아가 세포에서 복제하기 때문이다(도 30 및 도 31, 붉은색 ROS, NO 곡선). 이것은 결정적 차이이다. 박테리아의 계속되는 복제는 숙주 세포를 죽이고, 생체 내에서 다른 세포의 감염으로 확산될 것이다. 본 발명자들은 지금까지 시험된 모든 병원성 및 비-식균작용 사람 및 마우스 세포 및 세포주이 세포내 박테리아를 제거하기 위하여 퍼포린-2를 사용하는 것을 보여주는 데이터를 가지고 있다(표 2). 비-식균작용 세포는 세포내 박테리아를 제거하기 위하여 자가포식작용을 사용한다. 본 발명자들의 데이터는 P-2가 박테리아에 치명적인 일격을 가하기 위하여 자가포식작용과 협력할 수 있음을 나타낸다.
P-2-GFP는 휴지기의 BV2(도 32a, 두 개의 상부 패널) 및 핵주변의 막-소포 구획의 RAW 세포(도 33)에 위치한 경막 단백질이다. P-2-GFP(녹색)는 부분적으로는 오렌지색 RASA2(황색으로도 보임)과 공존한다(도 32a 및 33). LC3-RFP(붉은 색)는 RASA2 또는 P-2보다 더 균질하다. 핵은 DAPI 염색에 의해 파란 색으로 도시된다.
살모넬라는 유형 III 분비 시스템으로 세포내 이물 흡수를 촉발시킴으로써 5분 안에 세포를 활발하게 침습한다. 박테리아는 도 32a에서 모든 하부 패널에서 백색으로 보이는 DAPI(DNA) 염색에 의해 가시화될 수 있다. 무상의 세포외재성 살모넬라는 막대형 외관(흰색 화살표)을 가진다. IFN 활성화된 BV2(대식세포-유도된 소교세포)와 살모넬라 타이피뮤리움과의 5분 동안의 인큐베이션 후에, 여러 살모넬라가 세포에 의해 이물로 흡수되고 이미 그것의 DNA를 방출한 것으로 보이는데(DAPI 및 P-2-GFP 패널에서 별표, 화살표로 표시된 세포외재성 살모넬라와 형태를 비교함), 그것이 대부분은 P-2-GFP에 의해 사멸되었기 때문인 것으로 여겨진다. 내재화된 박테리아는 액포에 있게 되며 그것의 막은 P-2-GFP, RASA-2 및 LC3-GFP로 염색된다. 이 실험에서 내인성 P-2는 siRNA로 녹다운되었고, 형질전환된 P-2-GFP로 재구성되었다. 형질전환 혼합은 또한 LC3-RFP를 함유하였다. 유사한 데이터를 대장균에 대해 도시한다(도 32b). 이들 데이터는 P-2가 액포 내 박테리아의 사멸을 중재하고, 자가포식작용에 대한 마커로서 LC3가 P-2 중재된 세포내 박테리아의 사멸에서 자가포식작용에 연루되는 것을 직접적으로 지지한다.
이들 데이터를 식세포 작용을 하는 세포들을 사용하여 수집하였다; 본 발명자들은 이제 박테리아 제거를 위해 자가포식작용에 의존하는 비-식작용 세포에서의 이들 메커니즘을 측정하고자 한다. 연구는 P-2를 자가포식작용에 연결시켜서 자가포식작용에 결정적인 타격을 위한 분자 메커니즘을 제공한다.
세포내 이물로 흡수된 박테ㅣ아는 초기에 원형질막에 가까이 있는데, 거기에서 자가포식작용이 감염의 수 분 내에 시작된다. 액포를 함유하고 있는 박테리아 상의 Rab5는 자가포식작용 관련된 PI3-키나제인 vps34를 영입한다. PI3P 및 PI(3,4,5)P3의 생성은 각각 액포의 파고솜 및 자가파고솜으로의 성숙에 필요하다. 본 발명자들은 액포 상에서 핵주변이 막으로부터의 전위에 의해 RASA2가 PIP3에 결합하는 것을 제시한다. RASA2는 대다수의 신호화 경로에서 RasGTPase 기능에 전형적인 분자 스위치를 제공할 수 있다. RASA2는 이 스위치를 P-2-소포 수송 및 액포로의 전위를 위해 제공할 수 있다. 액포로 vps34를 영입하는 Rab5도 또한 P-2를 수송할 수 있지만, 다른 메커니즘 또한 가능하다.
mEF 및 BV2 소교세포에서 퍼포린-2 및 GAP1M/RASA2의 영상화 분석. 세포에서 RASA2가 효모 2 하이브리드 시스템의 P-2의 세포질 도메인과 상호작용하는 것을 증명하기 위하여, 본 발명자들은 RAW 대식세포에서 두 단백질의 정위를 측정하였다. 대식세포는 P-2를 본질적으로 발현한다. 공존을 측정하기 위하여, 본 발명자들은 P-2의 세포질 도메인의 C-말단에 링커를 통해 융합된 P-2-GFP 융합 단백질을 생성하였다. P-2-GFP는 보완성 분석에서 세포내 박테리아의 사멸에서 기능적이다(도 30b, 도 31). P-2-GFP는 RASA2(도 33, 중앙)와 유사하게 RAW 세포의 핵주변 막 소포에 위치한다(도 33, 상부). 영상을 함께 볼 때, P-2-GFP와 RASA2는 대다수의 핵주변 소포에 공존하고 있는 것으로 나타난다(도 33, 바닥). 본 발명자들은 RASA2가 vps34 인산화가 이루어질 때 액포를 함유하고 있는 박테리아로 전위된다고 제시한다.
본 발명자들은 박테리아 감염 시의 RASA2의 정위 및 전위를 측정할 것이다. RASA2는 대부분의 또는 모든 세포에서 본질적으로 (상이한 수준이긴 하지만) 발현되고, 그것의 정위는 특이한 항체에 의해 측정될 수 있다(도 33 참조). 감염 후의 RASA2 전위의 동역학을 측정한 후에, 본 발명자들은 도 32에서와 같이 P-2-GFP로 형질전환시키고 2 및 3가지 색(형광-표지된 박테리아를 사용하여) 영상 분석에 의해 P-2 전위 및 그것의 RASA2 전위와의 관계를 측정할 것이다.
Rab5는 그것의 세포질 및 핵주변 위티로부터 액포를 함유하고 있는 박테리아로 PI3-키나제 vps34를 영입한다. Vps34는 포스파티딜-이노시톨-인산화를 통해 RASA2 전위를 위한 이노시톨-포스페이트 코드를 제공할 수 있다. 본 발명자들은 vpe34 억제제 3-MA가 RASA2 및 P-2의 전위를 차단하는지의 여부를 측정할 것이다. 본 발명자들은 BV2, 단순한(naive) mEF 또는 IFN-전활성화된 mEF에서 RASA2의 세포내 위치에 미치는 박테리아 감염의 효과를 측정할 것이다. 세포내 박테리아는 소포 수송을 조정하여 그것의 세포내 생존을 증강시킨다. 살모넬라는 살모넬라 함유 액포(SCV)의 생성을 위해 PI3P 생성을 증가시켜서 생존을 허용하는 한편, 미코박테리아는 PI3P 생성을 감소시켜서 액포의 성숙 및 리소좀과의 융합을 방지한다. 그러므로 상이한 박테리아 종은 액포로의 P-2 영입을 지연시키거나 차단하는 잠재적 결과를 가져오는 RASA2 전위를 조정할 수 있다.
본 발명자들은 단순한(휴지기) mEF 및 IFN-전활성화된 mEF와 BV2 소교세포에서의 전위를 비교하여 박테리아의 세포내 이물 흡수가 유사한 반응을 촉발하고 IFN을 사용한 mEF의 사전-활성화가 RASA2 전위와 관련하여 반응의 동역학 또는 질을 변화시키는지의 여부를 측정할 것이다. IFN은 세포내 박테리아를 공격하는 데 있어 P-2의 기능에 필요한 단순한 비-식균작용 세포의 인자들을 포함할 수 있는 대다수의 유전자를 유도한다. 도 34a에 도시되어 있는 것과 같이(좌측 패널), IFN-전-활성화된 mEF는 감염 후 2시간 이내에 대부분의 M. 스메그마티스를 사멸한 한편, 단순한 mEF는 12시간째에서야 사멸을 시작하였다. 이런 RASA2 전위의 동역학은 이런 지연도 반영하는 것일 수 있다.
본 발명자들은 또한 Rab5와 vps34를 녹다운시키고, CFU 분석으로 RASA2 전위 및 세포내 박테리아 사멸에 미치는 효과를 측정할 것이다.
본 발명자들은 IFN-전-활성화된 mEF가 P-2 전위 및 사멸을 위한 활성화 메커니즘들에서 식균작용 BV2에 비교할만할 것으로 예상한다. 만약 RASA2 영입 및 전위가 필요하다면, 활성화된 mEF 및 BV2에서 유사할 것으로 예상된다. 단순한 mEF에서 RASA2 및 P-2의 영입은 상조적이지 않을 수 있는데, 왜냐하면 P-2는 먼저 유도되어야 하기 때문이다. 죽은 것이 아닌 살아있는 살모넬라는 mEF에서 P-2 mRNA의 유도를 차단하여(도 34b) 비-식균작용 세포에서 살모넬라의 보호 메커니즘을 제공한다. 별도의 연구에서 본 발명자들은 P-2 억제에 기여하는 S. 타이피뮤리움의 독성 유전자(실례로서 PhoP 참조, 도 34b)를 연구하고 있다. 본 발명자들은 또한 클라미디아가 P-2 유도를 억제하는 데이터를 가지고 있다(데이터는 제시되지 않음). 이들 발견은 박테리아가 그것들이 세포내 장소에서 고정되기를 원한다면 P-2를 억제해야 한다는 본 발명자들의 제안을 지지한다.
박테리아 감염 후 초기 사건에 대한 추가의 통찰을 얻기 위해, 본 발명자들은 또한 Rab5 및 vps34를 영상화하였고, 거기에서 본 발명자들은 박테리아 액포로의 전위를 예상하였다.
세포내 박테리아의 사멸에 미치는 RASA2 siRNA 녹다운의 효과에 대한 분석. P-2 유도, 영입, 전위, 활성화 또는 중합에 필요한 어떠한 분자의 차단이든 또한 세포내 박테리아의 사멸을 차단할 것으로 예상된다. 만약 RASA2가 P-2 전위, 활성화 및/또는 사멸에 필요하다면, 그것의 녹다운은 세포내 박테리아의 사멸을 억제해야 한다. 이것을 세포내 M. 스메그마티스를 사멸하는 BV2 소교세포에서 초기 실험으로 시험하였다(도 35a). RASA2 녹다운은 P-2 녹다운과 유사하게 세포내 사멸을 완전하게 차단하였고, 세포내 복제를 허용하였는데, 그것은 RASA2가 세포내 박테리아의 사멸에 중요한 것임을 시사한다.
또한 Rab1, Rab5, Rab7 및 Rab11, 및 vps34를 녹다운시켜서 박테리아 사멸에 미치는 그것들의 효과를 젠타마이신 보호 분석으로 측정할 것이다.
RASA2에 대한 필요조건은 추가로 IFN-전-활성화된 및 비-활성화된(단순한) mEF 및 직장 상피 세포 CMT93에서 qPCR에 의한 RASA2 메시지 수준의 측정에 의해 시험될 것이다. 본 발명자들은 또한 젠타마이신 보호-CFU-분석으로 siRNA 녹다운 후에 MRSA, M. 스메그마티스 및 S. 타이피뮤리움의 세포내 사멸 또는 생존을 분석할 것이다.
공동면역침전에 의한 P-2와 RASA2의 생화학적 상호작용. 본 발명자들은 BV2-및 mEF-용해물을 항 RASA2 단클론성 항체로 면역침전시키고, 별도로 SDS-PAGE 및 항 P-2 항체를 사용하여 면역블롯팅을 할 것이다. 연구는 또한 각각 P-2-GFP 형질전환 및 항 GFP로의 면역침전 후에, 및 항 GFP와 항 RASA2로의 면역블롯팅 후에 수행할 것이다(도 35b에서처럼). GFP 형질전환(P-2 융합은 없음)은 대조표준으로서 작용할 것이다(제시되지 않음). 실험은 IFN 전-유도가 있거나 없이, 또한 박테리아 감염이 있거나 없이 수행할 것이다. 본 발명자들은 또한 P-2-GFP 면역침전물의 단백질 염색에 의한 추가의 단백질 밴드를 찾을 것이고, 그것를 질량 분석에 의해 특성을 확인할 것이다. GFP 면역침전물은 대조표준으로서 작용할 것이다. 본 발명자들은 또한 P2의 세포질 도메인 및 RASA2의 돌연변이의 돌이연변이 분석을 수행할 것이다.
P-2-GFP와 RASA2 사이의 직접적인 생화학적 상호작용은 이제 P-2-GFP 형질전환된 RAW 세포에서의 공면역침전에 의해 증명되었고(도 35b), 그것은 본 발명자들이 돌연변이 실험을 수행하는 것을 가능하게 할 것이다(GFP 대조표준은 RASA2와 공동면역침전을 하지 않는다, 제시되지 않음). 이것은 본 발명자들이 Rab5 또는 vsp34 및 P-2/RASA2와의 복합체에 존재할 수 있는 자가포식작용 단백질(aim 2)의 존재에 대해 면역침전물을 프로브하는 것을 가능하게 한다. 본 발명자들은 또한 SDS PAGE와 이어서 겔의 단백질 염색에 의해 P-2-GFP 면역침전을 분석하여(GFP 침전을 대조표준으로서 사용함) 지금까지 언급된 성분들에 해당하지 않는 단백질 밴드의 존재를 측정하고자 한다. 만약 추가의 밴드가 존재한다면, 본 발명자들은 질량 분석에 의해 그것을 분석하고 그것의 정체성을 측정할 것이다.
박테리아 사멸에서 RASA2의 돌연변이 분석. RASA2는 N-말단 절편에 두 개의 C2 도메인(C2A 및 C2B)과, 이어서 C-말단 쪽으로 RadGap 도메인 및 PH/Btk 도메인을 가진다. C2 도메인은 세포막으로 단백질을 표적화하는데 포함된 단백질 주고적 도메인이지만, 그것의 RASA2에서의 기능은 밝혀지지 않았다. PH-Btk 도메인은 PIP 결합에 필요하다. RASA-2는 가용성 IP(3,4,5)P3, PI(1,3,4,5,6)P5, IP6에 결합하지만 IP(1,4,5)P3에는 결합하지 않으며; RASA2는 또한 PtdIns(3,4,)P3에 결합하는데, 이것은 이노시톨-3 인산화가 그것의 결합에 필요한 것을 가리킨다. RASA2가 내인성 막 상에서 vps34에 의해 본질적으로 합성된 PtdInsP(3)P에 결합하는지의 여부는 알려지지 않았다.
박테리아 사멸 및 액포 함유 박테리아로의 P-2 전위(도 32)에서 RASA2의 기능적 도메인의 역할을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 기능성 도메인을 결실시킬 것이다: △C2A, △C2B, △C2A, B, △RasGAP, △PH-Btk. 분석을 위해 내인성 RASA2를 3'UTR을 표적화하는 siRNA로 녹다운시키고 세포를 3'UTR이 없는 RASA2의 결실 구성물로 재구성하였다(P-2-RFP에 대해 도시된 도 30에서와 같이).
P-2 및 RASA2 전위에 미치는 박테리아 종의 효과. 도 35에서의 P-2 전위를 S. 타이피뮤리움 및 실험실 균주 대장균 K12를 사용한 감염에 의해 시행하였다. 본 발명자들은 또한 살모넬라 및 미코박테리아와 다른 박테리아를 사용하여 야생형 및 돌연변이된 P-2 및 야생형 및 돌연변이된 RASA2의 각각의 전위를 측정할 것이다. 미코박테리아는 PI3P 생성 및 액포 성숙을 간섭한다. 살모넬라 유형 3 분비 이펙터 SopB는 PI3P에 대해 다중 효과를 나타내는데, 액포 성숙을 간섭하고 살모넬라 함유 액포, SCV에서 세포내 생존을 증강시킨다. 살모넬라 함유 액포상에서 PI3P의 변화는 대장균과 비교하여 P-2 및 RASA2 전위 둘 다에 영향을 미칠 것이다.
본 발명자들은 RASA2의 PH-Btk 도메인과 RasGap 도메인이 둘 다 박테리아 사멸에 필수적인 것으로 예상한다. PI3P가 생성될 때 RASA2의 박테리아-함유 액포로의 전위가 예상된다. RasGap는 통상 스위치 조정자로서 작용하고 P-2의 박테리아 함유 액포로의 전위에서 기능할 것이다. RasGap 또는 C2 도메인은 P-2/RASA2 상호작용에 필요할 것이며, 그것은 공면역침전 및 효모 2 하이브리드 분석에 의해 평가될 것이다.
후속적인 연구에서 본 발명자들은 RASA2 및 그것의 결실 돌연변이를 효모 2 하이브리드 선별에서 미끼로 사용하여 RASA2 기능을 평가하기 위한 추가의 후보, 예컨대 Rab 및 액포 분류 넥신을 확인할 것이다.
P-2-RFP의 세포질 도메인의 돌연변이 분석. 마우스 P-2 세포질 서열의 보존된(강조된) 아미노산은 (RKYKKK-SEQ ID NO:4)이고, 이어서 보존된 Y가 있고, 다음에 산성 EIEEQE (SEQ ID NO:5)에 이어서 보존된 S가 있으며, 추가로 C-말단 가까이에 S가 있다(도 28a). 여러 키나제-패밀리를 잠재적인 인산화 부위에 대한 알고리즘을 사용하여 확인하였다. 본 발명자들은 P-2의 세포질 도메인이 박테리아 감염시에 신호를 수용하여 P-2의 박테리아 함유 액포로의 전위 및 P-2 중합을 제공함으로써 박테리아 세포벽에 치명적인 일격을 전달한다고 제시한다. 본 발명자들은 (a) KYKK(SEQ ID NO:7)를 QYQQ(SEQ ID NO:8)로; (b) 보존된 Y를 F로 및 (c) 두 개의 보존된 S를 A(차단) 또는 D(본질적으로 활성)로 돌연변이시킬 것이다(도 28a). 본 발명자들은 이미 P-2-RFP에서 Y의 F로의 돌연변이가 유동 세포분석에 의해 측정되는 바 안정ㅎ게 발현되지만, 내인성 P-2의 siRNA 녹다운을 보완하기 위해 사용될 때 박테리아 사멸 활성을 제거한다는 것을 수립한 바 있다.
본 발명자들은 박테리아 사멸 및 P-2의 박테리아 함유 액포로의 전위 시에 발현 및 안정성에 미치는 P-2-RFP 돌연변이의 효과를 측정할 것이다. 또한 본 발명자들은 공동면역침전에 의해 RASA2와의 상호작용에 미치는(도 35b) 및 박테리아 함유 액포로의 잠재적인 RASA2 전위에 미치는 P-2 돌연변이의 효과를 측정할 것이다.
P-2PRFP에서 KYKK의 QYQQ로의 또는 보존된 Y의 F로의 돌연변이(도 28a)는 P-2-RFP 사멸 활성의 손실을 초래하지만 유동 세포분석에 의하면 발현 수준은 정상적이다(데이터는 제시하지 않음). 이들 실험에서 내인성 P-2를 내인성 P-2의 3'UTR에 특이적인 siRNA로의 형질전환 및 천연 3'UTR이 없은 돌연변이된 P-2-RFP 플라스미드-cDNA로의 부수적인 형질전환에 의해 녹다운시켰다. 돌연변이된 P-2와 RASA2와의 상호작용은 공동면역침전에 의해 측정될 것이다(도 35b). 보존된 S의 D로의 돌연변이(인산화를 모방함)는 P-2 사멸 활성을 증가시켰다(데이터는 제시하지 않음). 다른 돌연변이들은 C-말단 서열의 증가하는 부분을 결실시키고, 사멸 및 RASA2 상호작용에서의 기능을 분석할 것이다. 본 발명자들은 RASA2와의 P-2 상호작용의 실패를 초래하는 돌연변이가 P-2 중재된 사멸을 차단할 것으로 예상한다. 그러나, RASA2 상호작용을 간섭하지 않지만 P-2 기능을 여전히 차단하는 돌연변이가 있을 수 있다. 후자의 효과는 P-2 중합을 촉발하지만 RASA2 상호작용 및 전위에는 영향을 미치지 않는 세포질 도메인의 기능에 기인할 것이다.
실시예 6: 세포내 박테리아의 P-2 중재된 사멸에 결부된 것으로서 자가포식작용의 분석
자가포식작용(xenophagy라고도 함)은 감염에 의해 활성화된다. 자가포식작용의 세포내 개시 부위는 자가 파고솜으로 성장하는 파고포어(phagophore)의 핵화 부위를 결정하는 vps34 복합체에 의한 PI(3,4,5)P3 및 PI3P의 3-위치에서 이노시톨의 인산화에 의해 규정된다.
감염 후에 RAB5는 PI3-키나제 vs34를 박테리아 함유 액포로 영입하고, 그곳에서 이노시톨의 3-위치에서 인산화되어 PI(3,4,5)P3 및 PI(3)P가 생성된다. 자가포식작용 막-소포 수송에 대한 gef는 TRAPPIII 복합체이고, 본 발명자들은 그것의 성분과 Vps34, RASA2, P-2 및 Rab1과의 상호작용을 연구할 것이다. Vps34-인산화는 RASA2가 잠재적으로 상호작용하는 P-2와 함께 결합하는 것을 가능하게 하고(도 35b), 또한 비-식균작용 세포에서 초기 단계의 자가 파고솜에 대한 핵화 부위로서 작용한다. 식균작용 세포에서 동일한 서열은 RASA와 P-2를 박테리아 함유 액포로 가져가고 거기서 파고솜으로 성숙될 수 있다. 병원성 박테리아, 예컨대 살모넬라 엔테리카 세로바르 타이피뮤리움 및 미코박테리움 튜베르큘로시스는 자가포식 또는 파고솜 성숙에서 이들 초기 단계를 조정하는 독성 유전자를 가지고 있다.
LC3는 초기 및 후기 자가 파고솜과 관련된 포유류 세포에서 자가포식에 대한 우수한 마커이다. 포스파티딜-에탄올아민에 대한 LC3 결찰은 E3 유사 Atg16L-Atg17-Atg5 복합체에 의해 촉진된다. Atg16L-복합체는 또한 mEF에서 S. 타이피뮤리움의 세포내 복제를 방지하는 데 필요한 Atg9L1과 함께 자가포식 이중 막의 형성에 필요하다. 최종 단계는 산성화 및 리소좀과의 융합이다. 본 발명자들은 P-2가 자가 파고솜에 영입되고 LC3과 공존할 수 있다고 제시한다(도 32).
자가 파고솜 안으로의 P-2의 유입 지점의 규정. 자가포식작용은 자가포식 막의 단계식 조립과 후속되는 리소좀과의 융합에 의해 중재된다. 본 발명자들은 감염 중에 자가포식 P-2가 박테리아 함유 액포 및/또는 시작 단계의 자가 파고솜으로 영입되어, 그곳에서 박테리아에 치명적인 일격을 가하는 한편 경막 도메인을 통해 P-2-막에 묶여 있는 상태를 유지하는 것으로 제시한다(도 28a 참조). P-2에 의해 죽은 박테리를 내포하는 세포벽 기공은 퍼포린-2-중합에 의한 천공을 강력하게 시사한다(도 37). 감연 후 4시간에 계면활성제 용해에 의해 mEF로부터 얻어지고 전자 현미경에 의해 분석된 MRSA는 진핵생물 막 상에서 P-2-기공(도 36, 우측 패널)과 크기가 유사한 전형적인 90Å 세포벽 기공(도 36, 좌측 패널)을 나타낸다. 추정되는 P-2 기공은 또한 mEF-사멸된 미코박테리아의 세포벽 상에 존재한다(데이터는 제시하지 않음). P-2 기공은 ROS, NO 및 라이소자임이 박테리아 세포벽을 가로질러 침투하는 것을 촉진하여 사멸을 완성시킬 수 있다. 본 발명자들의 P-2/자가포식 연관의 제안에 따르면, P-2의 영입 전 단계에서의 자가포식작용의 차단은 박테리아 사멸을 차단할 것이다. P-2가 영입되고 중합된 후에 자가포식작용의 차단은 사멸에 손상을 주지 않을 것이다. Atg14L은 자가포식작용에서 vps34 PI3-키나제 복합체의 표적화 성분이다 P-2 녹다운과 유사하게, Atg14L의 siRNA 녹다운은 전체적으로 활성인 P-2의 존재에도 불구하고 BV2에서 미코박테리아의 사멸을 차단한다(도 37).
BV2는 식균작용 세포이다. 도 37의 데이터는 vps34/Atg14L이 자가포식작용에 의존하는 mEF에서의 필요조건과 유사하게 식균작용 세포에 의한 박테리아의 사멸에 필요하다는 것을 시사한다. 박테리아의 식균작용 및 자가포식작용의 초기 단계는 유사할 수 있고, 비-식균작용 및 식균작용 세포에서 P-2 영입에 대한 공통 메커니즘을 반영할 수 있다. 데이터는 P-2가 자가포식작용 및 식균작용 둘 다에 의해 박테리아의 사멸을 위한 이펙터라를 가설과 일치한다. P-2는 각각 자가포식작용의 개시와 함께 또는 파고솜으로의 액포 성숙의 개시와 함께 영입된다.
추가로 자가 파고솜으로의 P-2의 유입 지점을 규정하기 위하여, 본 발명자들은 자가포식-막 상에서 LC3의 포스파티딜-에탄올아민의 포합에 필요한 자가포식의 성분인 Atg5 및 Atg16L1을 녹다운시킬 것이다.
도 38의 데이터는 따라서 Atg14L(도 38b), Atg16L(도 38c) 및 Atg5(도 38d)가 살모넬라의 사멸 및 살모넬라 제균방지의 유지에 필요하다는 것을 시사한다. 그것들의 녹다운은 mEF에서 세포내 살모넬라 복제를 허용한다. Atg14L은 또한 mEF에서 살모넬라 복제를 방지하기 위해 필요하다(도 38). Atg14L은 자가포식작용을 개시하는 PI3-키나제-vps34 복합체의 한 성분이다. vps34-PI3-키나제 효소 활성의 소포함을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 둘 다 자가포식작용을 억제하는 것으로 알려져 있는 PI3-키나제 차단제인 Wortmannin 또는 보다 선택적인 vps34 억제제 3-메틸-아데닌(3-MA)를 사용할 것이다. P-2 녹다운에 유사한 3-MA는 살모넬라 복제를 허용하고, 그것은 vps34의 효소적 활성이 박테리아의 세포내 사멸에 필요한 것임을 시사한다. 대조적으로, 바필로마이신은 살균/제균 활성을 간섭하지 않는다. 바필로마이신은 산성화 및 리소좀 융합을 방지하는데 그것은 mEF에 의한 살모넬라의 사멸에는 필요하지 않다(도 39).
P-2 녹다운과 자가포식작용 차단은 둘 다 박테리아의 세포내 사멸을 방지하여 mEF에서의 복제를 허용한다. 이런 발견에 대한 가장 간단한 설명은 두 과정 모두 박테리아 제어에 필요하며 관련될 수 있다는 것이다. P-2는 자가포식작용과 함께 치명적인 일격을 박테리아에 전달할 수 잇다. 도 37 내지 39의 데이터는 P-2 작용을 Atg14L-vps34 뒤에, 그러나 파고솜-리소좀 융합 전에 위치시킨다. Atg5 또는 Atg16L의 녹다운은 공개된 보고와 일치하게 mEF에서의 살모넬라의 복제를 허용한다. Atg5는 LC3를 포스파티딜-에탄올아민에 결찰시키는 Atg16L 복합체의 부분으로서 필요하다. 그러므로, LC3 지질화는 살모넬라의 P-2 중재된 사멸에 필요할 것이다. Atg16L 복합체는 Atg9L1과 함께 또한 이중막의 형성에 필요하다. 녹아웃 mEF에서 Atg9L1의 부재는 세포내 살모넬라 복제를 촉진한다. Atg9L1은 LC3로 장식되는 자가포식 이중막의 형성을 위해 Atg16L 복합체와 함께 필요한 주요 지질-소포 공여체의 하나일 수 있다. Atg9는 효모에서 Atg23과 Atg27의 도움으로 골지 복합체로부터 유도되고 세포질에 존재하는 300 내지 600Å 직경의 막 소포에 상주하는 다중-회전 막 단백질이다. 효모 Atg23과 27의 상동체는 포유류에서는 설명되지 않았다. Atg9L1은 효모 Atg9의 포유류 상동체이다. 경막 단백질 P-2(도 28a)는 RASA-2에 의해 Atg9L1-소포와 함께 Atg16과 LC3를 필요로 하고 이중막의 형성을 개시하는 과정에서 박테리아 함유 액포에 영입된다. P-2-소포는 Atg9L1-소포와 융합할 수 있거나 또는 별도로 RASA2, Rab5 또는 Rab7 및/또는 다른 성분들을 포함할 수 있는 동일한 수송 경로에 의해 영입될 수 있다.
영상화에 의한 자가포식작용에서의 P-2 전위 및 LC3의 규정. 도 32는 감염 후 5분 이내에 박테리아를 함유하는 액포에 P-2가 전위되는 실례를 보여준다. 그 실험에서 내인성 P-2를 siRNA로 녹다운시켰고, 동시에 세포를 P-2-RFP로 형질전환시켰다. 16시간 후에 세포를 GFP-발현 대장균 K12로 감염시키고, 감염 후 5분 후에 파라폼알데하이드로 고정시킨 다음 공초점 현미경에 의해 영상화하였다. 도 32a는 P-2와 LC3가 감염 후 5분 내에 박테리아 함유 액포상에 공존하고 있음을 나타낸다.
파고솜 또는 자가 파고솜에의 LC3 결찰을 측정하기 위하여, 본 발명자들은 mEF, BV2 및 RAW를 LC3-GFP로 영구적으로 형질전환시켰다. 본 발명자들의 연구는 주로 단순한 및 IFN 유도된 mEF에 초점을 맞추고; BV2와 RAW 세포는 대조표준으로서 사용할 것이다. Atg 5, 7, 9L1, 14L 또는 16L을 녹다운시킬 것이고, 세포를 살모넬라, MRSA 또는 미코박테리아로 감염시키며 반응을 고정에 의해 중지시킨다.
IFN 유도된 mEF에서 박테리아 사멸에서 P-2와 ATG9L1과의 관계에 대한 녹다운 및 영상화에 의한 연구. ATG9L1은 IFN에 의해 P-2를 발현하도록 유도되지 않은 mEF에서 살모넬라의 세포내 복제를 둔화시키는 데 필요하다. 본 발명자들은 P-2가 존재하지 않을 때 박테리아가 mEF에서 복제할 것이고, 도 34b에서 살모넬라가 P-2 유도를 억제하는 것을 밝혔다. 그러므로 본 발명자들은 P-2 발현에 대해 유도되거나 유도되지 않은 야생형 및 ATGL1 녹다운 세포의 영상화에 의해 ATG9L1의 역할을 연구할 것이다. 본 발명자들은 또한 P-2-GFP 또는/및 RASA2와의 공동면역침전을 조사할 것이다. ATG9L1이 약 60 내지 90nm 지질 소포에 삽입된 6-막 회전 단백질이기 때문에, 그것은 P-2와 상호작용하고 유사한 전위 경로를 사용하는 잠재적 후보이다.
SEQUENCE LISTING <110> DeArmas, Lesley Lyapichev, Kirill McCormack, Ryan Podack, Eckhard R. <120> Perforin-2 Defense Against Invasive and Multidrug Resistant Pathogens <130> 60569-430333 <150> US 61/637455 <151> 2012-04-24 <160> 8 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized siRNA <400> 1 ccaccucacu uucuaucaa 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized siRNA <400> 2 gaguauucua ggaaacuuu 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized siRNA <400> 3 caaucaagcu cuugugcac 19 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Arg Lys Tyr Lys Lys Lys 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Glu Ile Glu Glu Gln Glu 1 5 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Gly Thr Arg Lys Tyr Lys Lys Lys Glu Tyr Gln Glu Ile Glu Glu 1 5 10 15 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Lys Tyr Lys Lys 1 <210> 8 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 8 Gln Tyr Gln Gln 1

Claims (17)

  1. 퍼포린-2(P2) 발현, 기능 또는 활성과 관련된 하나 이상의 분자의 기능, 활성 또는 발현을 조절하는 적어도 하나의 제제의 유효량을 환자에게 투여하는 단계; 및 P2의 기능 또는 발현을 조절하는 단계를 포함하는, P2의 기능, 활성 또는 발현을 조절하는 방법.
  2. 제1 항에 있어서, P2 기능, 활성 또는 발현과 관련된 하나 이상의 분자는 src, 유비퀴틴 콘쥬게이팅 효소 E2M(Ubc12), GAPDH, P21RAS/gap1m (RASA2), 갈렉틴 3, 유비퀴틴 C(UCHL1), 프로테아솜, vps34, ATG5, ATG7, ATG9L1, ATG14L, ATG16L, LC3, Rab5, 또는 이들의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1 항에 있어서, 분자는 P2의 전사 또는 번역을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1 항에 있어서, 제제는 소분자, 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 변형된 펩티드, 변형된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 합성 분자, 천연 분자, 유기 분자 또는 무기 분자, 또는 이것들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. src, 유비퀴틴 콘쥬게이팅 효소 E2M(Ubc12), GAPDH, P21RAS/gap1m (RASA2), 갈렉틴 3, 유비퀴틴 C(UCHL1), 프로테아솜, vps34, ATG5, ATG7, ATG9L1, ATG14L, ATG16L, LC3, Rab5, 또는 이들의 단편을 포함하는 하나 이상의 표적 분자를 발현하는 세포를 접촉시키는 단계; 분자의 발현, 기능 또는 활성을 측정하는 단계; 분자의 발현, 기능 또는 활성을 대조군과 비교하는 단계; 및 퍼포린-2의 발현, 기능 또는 활성을 조절하는 후보 치료제를 확인하는 단계를 포함하는, 후보 치료제를 확인하는 방법.
  6. 제5 항에 있어서, 하나 이상의 표적 분자의 발현, 기능 또는 활성의 조절은 퍼포린-2 (P2) 분자의 발현, 기능 또는 활성을 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5 항에 있어서, 표적 분자는 폴리뉴클레오티드 또는 이것들의 발현된 생성물인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. src, 유비퀴틴 콘쥬게이팅 효소 E2M(Ubc12), GAPDH, P21RAS/gap1m (RASA2), 갈렉틴 3, 유비퀴틴 C(UCHL1), 프로테아솜, vps34, ATG5, ATG7, ATG9L1, ATG14L, ATG16L, LC3, Rab5, 또는 이들의 단편 또는 관련된 분자를 포함하는 하나 이상의 표적 분자를 분석 표면과 접촉시키는 단계; 표적 분자를 하나 이상의 후보 치료제와 접촉시키는 단계 및 하나 이상의 표적 분자 또는 그것의 관련된 분자와 결합하거나 혼성화하는 제제를 확인하는 단계를 포함하는, 후보 치료제를 확인하는 방법.
  9. 제8 항에 있어서, 확인된 후보 치료제는 퍼포린-2 분자의 발현, 기능 또는 활성의 조절에 대하여 분석되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9 항에 있어서, 확인된 후보 제제는 감염성 유기체의 복제의 억제, 성장의 억제, 또는 사멸에 대하여 분석되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10 항에 있어서, 감염성 유기체는 세포 내 또는 세포 외 박테리아인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1 항 또는 제8 항의 방법에 의해 확인된 제제의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 감염성 질환 유기체로 고통받는 환자를 치료하는 방법.
  13. 퍼포린-2 단백질을 암호화하는 유전자의 파괴를 포함하는 트랜스제닉 마우스.
  14. 제13 항에 있어서, 상기 파괴는 퍼포린-2 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 이형접합성 또는 동형접합성 파괴를 포함하는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 마우스.
  15. 제14 항에 있어서, 상기 파괴는 동형접합성 파괴를 포함하며, 상기 동형접합성 파괴는 상기 유전자를 비활성화하고, 상기 트랜스제닉 마우스에서 기능적 퍼포린-2 단백질의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 마우스.
  16. 제13 항 내지 제15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스제닉 마우스는 야생형 마우스와 비교하여 세포내 병원체에 의한 감염에 대해 증가된 민감성을 나타내는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 마우스.
  17. 제13 항 내지 제15 항 중 어느 한 항의 트랜스제닉 마우스로부터 유래된 기관, 조직, 세포, 또는 세포주.
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