KR20160061423A - 감염성 질환 및 소화관 염증에 대한 약물 표적으로서 퍼포린-2 활성화제 및 억제제 - Google Patents

Abstract

퍼포린-2의 활성을 조절하는 방법 및 조성물이 제공된다. 퍼포린-2 활성화 경로의 다양한 성분이 본원에 제공된다. 구체적인 구현예에서, 퍼포린-2 활성화 경로의 다양한 성분의 억제제가 제공되며, 이는 소화관(gut) 염증과 관련된 질환의 진단 및 치료를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 방법에서 사용될 수 있다. 퍼포린-2 억제제의 스크리닝 방법이 또한 제공된다. 퍼포린-2의 유비퀴틴화를 증가시켜서 퍼포린-2 활성을 증가시키는 화합물이 또한 제공된다. 퍼포린-2 활성을 증가시키고 감염성 질환, 특히 세균 및 항생제-내성 세균의 치료를 위한 다양한 방법이 또한 제공된다.

Description

감염성 질환 및 소화관 염증에 대한 약물 표적으로서 퍼포린-2 활성화제 및 억제제{PERFORIN-2 ACTIVATORS AND INHIBITORS AS DRUG TARGETS FOR INFECTIOUS DISEASE AND GUT INFLAMMATION}

EFS-WEB을 통한 텍스트 파일로서 제출된 서열 목록에 대한 참고

서열 목록의 공식적인 카피는 현재 본 명세서와 함께 EFS-Web을 통해 정보 상호교환용 미국 표준 코드(ASCII)에 부합되는 텍스트 파일로서, 452788seqlist.txt의 파일명, 2014년 10월 7일자의 생성일 및 2KB의 크기로 현재 제출되어 있다. EFS-Web을 통해 출원된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며 이의 전문은 본원에 의해 본원에서 참고로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 감염성 질환 및 소화관 염증의 분야에 관한 것이다.

퍼포린은 CD8 T-세포 및 NK 세포의 과립에서 발견된 세포용해 단백질이다. 탈과립화(degranulation)시, 퍼포린 자체는 표적 세포의 혈장막내로 삽입하여, 공극(pore)을 형성한다. 본 발명자들의 실험실(참고: Lichtenheld, M. G., et al., 1988. Nature 335:448-451; Lowrey, D. M., et al., 1989. Proc Natl Acad Sci USA 86:247-25 1) 및 쉰카이(Shinkai) 등(참고: Nature (1988) 334:525-527)에 의한 퍼포린의 클로닝(cloning)은 상보성 성분 C9 및 퍼포린의 추정된 상동성을 확립하였다(참고: DiScipio, R. G., et al., 1984. Proc Natl Acad Sci USA 81 :7298-7302).

퍼포린-1 및 퍼포린-2(P2) 둘 다는 친수성의, 수용성 전구체로서 합성되는 공극 형성인자이다. 이들 둘 다는 지질 이층내로 삽입하여 중합됨으로써 막을 스패닝(spanning)하는 거대한 물이 충전된 공극을 형성한다. 물이 충전된 공극은 원통형 단백질-중합체에 의해 제조된다.

원통의 내부는 물로 충전된 공극을 형성하기 때문에 친수성 표면을 지녀야 하지만 원통의 외부는 지질 코어내에 고정되어야 하므로 소수성이어야 할 필요가 있다. 이러한 공극 구조는 양친매성 나선(나선 회전 나선(helix turn helix))에 의해 형성되는 것으로 고려된다. 이는 단백질 도메인(domain), 소위 MAC-Pf(막 공격 복합체/퍼포린) 도메인의 일부분이며, 이는 퍼포린 및 C9과 상보체의 막 공격 복합체(MAC)를 형성하는 다른 상보성 단백질 사이에서 대부분 보존된다.

MAC/Pf 도메인을 갖는 단백질은 예측하는 사람 및 쥐의 대식세포에서 발현된 mRNA(Mpg 1 또는 Mpeg 1-대식세포 발현된 유전자로 명명됨)은 스필스버리(Spilsbury)에 의해 최초로 기술되었다(참고: Blood (1995) 85:1620- 1629). 이어서, 동일한 mRNA(MPS-1로 명명됨)이 실험적 프리온 질환에서 상향조절되는 것으로 밝혀졌다. 데스자딘(Desjardin)의 그룹은, 라텍스 비드(latex bead)가 공급된 대식세포로부터 분리된 파고솜(phagosome) 막의 단백질 조성물을 2D-겔 전기영동 및 질량 분광법으로 분석하였다(참고: J Cell Biol 152:165-180, 2001). 저자들은 MPS-1 단백질에 상응하는 단백질 스폿(protein spot)을 발견하였다. 마흐(Mah) 등은 전복 연체동물(abalone mollusks)을 분석하여 mpeg1 유전자 계열에 대해 동종인 혈액 속에서 mRNA를 발견하고(참고: Biochem Biophys Res Commun 316:468-475, 2004) 예측된 단백질이 CTL 퍼포린과 유사한 기능을 가지지만 이는 연체동물의 선천적인 면역계의 일부임을 제안하였다.

다중약물 내성은 이러한 세포의 박멸에 도움을 주도록 설계된 화학물질을 견디기 위한 병원성 세포의 능력이다. 병원성 세포는 진균성, 세균성, 바이러스성 감염된 세포 및 신생물(종양) 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 스타필로코쿠스(staphylococci), 엔테로코쿠스(enterococci), 고노코쿠스(gonococci), 스트렙토코쿠스(streptococci), 살모넬라(salmonella) 및 다른 것들을 포함하는 많은 상이한 세균이 현재 다중약물 내성을 나타내고 있다. 또한, 일부 내성 세균은 다른 세균에 대한 내성 기전을 암호화하는 DNA의 카피를 전달함으로써, 이들의 이웃에게 내성을 부여할 수 있으며, 이러한 이웃은 이후에 또한 내성 유전자를 이동시킬 수 있다.

세균은 예를 들면, 당단백질 세포벽에 더 이상 의존하지 않거나; 항생제의 효소적 탈활성화; 항생제에 대한 감소된 세포벽 투과성; 또는 항생제를 제거하기 위한 항생제 유출 기전의 변경된 표적 부위에 의해 항생제에 대해 적응할 수 있어왔다. 따라서, 병리학적 세포를 공격하는 새로운 약물의 방식으로 다중-약물 내성을 새로운 방식으로 극복하는 것에 대한 필요성이 증가하고 있다.

발명의 요약

퍼포린-2의 활성을 조절하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 퍼포린-2 활성화 경로의 다양한 성분이 본원에 제공된다. 구체적인 구현예에서, 퍼포린-2 활성화 경로의 다양한 성분의 억제제가 제공되며 이는 소화관 염증과 관련된 질환의 진단 및 치료를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 방법에서 사용될 수 있다. 퍼포린-2 억제제를 스크리닝(screening)하는 방법이 또한 제공된다. 또한, 퍼포린-2의 유비퀴틴화(ubiquitination)를 증가시킴으로써 퍼포린-2 활성을 증가시키는 화합물이 추가로 제공된다. 퍼포린-2 활성을 증가시키기 위한 다양한 방법 및 특히 세균 및 항생제-내성 세균에서 감염성 질환을 치료하기 위한 다양한 방법이 또한 제공된다.

도 1은 (a) 진핵 세포, (b) 엠. 스메그마티스(M. smegmatis), (c) 에스. 아우레우스(S. aureus)(MRSA)의 막 단편에서 전자 현미경에 의해 관찰된 집단화된 폴리-퍼포린-2 공극/구멍(100Å)을 나타낸다. 백색 화살표는 단독 퍼포린-2 중합체를 가르키고, 검정 화살표는 퍼포린-2 중합체의 집단을 가리킨다.
도 2는 세포질성 소낭에서 퍼포린-2(P-2)의 구조 및 배향을 나타낸다. 또한, 퍼포린-2 도메인 구조 및 세포질성 도메인의 보존을 나타낸다.
도 3은, P-2-GFP가 SCV에 전좌됨을 나타낸다. 소교세포 BV2는 P-2-GFP로 형질감염되며, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)으로 감염되고 감염 후 5분째에 고정시켜 영상화하였다. 감염되지 않은 세포내 세포질로부터 SCV로의 P-2-GFP의 전좌 및 P-2에 의한 사멸을 제안하는, 막대형 살모넬라(화살표, 세포 외부의 살모넬라)로부터 DNA의 방출에 주목한다.
도 4는 전좌 및 중합을 위한 퍼포린-2 상호작용 단백질을 나타낸다. 명확하게 하기 위해, 하나의 퍼포린-2 분자만을 나타내며-많은 분자가 중합하여 재폴딩되어 β-헤어핀(hairpin)에 삽입된다.
도 5는 퍼포린-2 유비퀴틴화, 중합 및 세균성 사멸을 조절하는 네딜화(neddylation) 및 데네딜화(deneddylation)의 경로를 나타낸다. NAE=NEDD8 활성화 효소.
도 6은, 유전적으로 P-2 결핍성이거나 P-2 siRNA 고갈된 복강 대식세포가 세포내 살모넬라 복제를 예방할 수 없음을 나타낸다.
도 7은, P-2 녹-다운(knock-down)이 PMN(상부 패널) 및 직장 상피 세포내에서 세포내 세균 복제를 가능하도록 함을 나타낸다. P-2-GFP 과발현은 살세균 활성(하부 패널)을 증가시킨다.
도 8은, ROS 및 NO가 NAC 및 NAME 억제에 의해 나타난 바와 같이 P-2 녹-다운(knock-down)에서가 아니라 P-2의 존재하에서만 세균 활성에 기여함을 입증한다. 채워진 기호: P-2 siRNA 녹 다운. 채워지지 않은 기호: 스크램블(scramble) siRNA 대조군(P-2 존재함).
도 9는, P-2 결핍 마우스가 에피큐테니우스(epicutaneous) MRSA 유발에 굴복함을 나타낸다. P-2-/-, P-2+/- 및 P-2+/+ 한배 새끼(그룹당 7 마리)를 7회 테이프로 면도(2x2cm)시키고, 10⁷ MRSA, 임상 분리물 속에 침지시킨 1cm²의 필터 디스크(filter disk)로 감염시켰다. 6일째에 체중(좌측 패널) 및 다양한 기관 및 혈액내 cfu.
도 10은, P-2-/- 마우스가 P-2+/+ 및 +/- 한배 새끼에서 정화된 10⁵ 또는 10² 개의 에스. 티피무리움에 의한 오로가스틱(orogastric) 감염으로 죽음을 입증한다. 그룹당 n=8 또는 15.
도 11은, P-2-/- 마우스가 오로가스트릭 에스. 티피무리움 감염 후 혈액 및 기타 기관내에 고 수준의 cfu를 가짐을 나타낸다.
도 12는 고 cfu에도 불구하고 에스. 티피무리움으로 유발된(challenged) P-2-/- 마우스에서 최소의 염증을 나타낸다.
도 13은, P-2-/- 마우스가 DSS 대장염에 대해 내성임을 나타낸다. 물 속에서 3% DSS는 5일 동안 제공된 후 정상의 물로 대체되었다.
도 14a 및 14b는, 마우스의 보다 큰 그룹에서, 이들이 퍼포린-2 결핍성인 경우 DSS 대장염에 대해 내성임을 나타낸다. (C) 대식세포성 세포 BV2에 의한 MRSA의 퍼포린-2 매개된 사멸은 화학 약물 MLN4294에 의해 차단되며, 이는 퍼포린-2 활성화에 있어서 NEDD8의 관여를 나타낸다.
도 15는 (a) IFN-α,β,γ에 의한 쥐 배아 섬유아세포에서 퍼포린-2 mRNA의 유도; (b) 복강 대식세포내 구성적 퍼포린-2 단백질 발현을 나타낸다.
도 16은 IFN-γ, 비-병원성 이. 콜라이(E. coli) K12 및 열로 사멸된 살모넬라에 의한 MEF에 있어서의 퍼포린-2 mRNA 유도를 나타낸다. 생 살모넬라 및 다른 병원체에 의한 퍼포린-2의 유도의 억제가 나열되어 있다.
도 17은 퍼포린-2 발현 및 사멸을 나타낸다. 상단: 비-병원성 이. 콜라이 K12 및 엠. 스메그마티스(M. smegmatis)에 의한 세포내 감염 후 MEF내 퍼포린-2 mRNA 유도의 역학. Mol 50:1에서 1시간 감염에 이어 세척 및 막 투과성 젠타마이신 속에 플레이팅. 하단: 유도되지 않은 MEF(채워지지 않은 사각형) 또는 IFN-γ로 14시간 동안 유도된(채워진 원)에서 엠. 스메그마티스의 세포내 사멸의 역학. 유도되지 않은 세포내에서 퍼포린-2 mRNA 발현으로 12시간에 의한 사멸의 상관관계에 주목한다.
도 18은, 퍼포린-2 녹-다운(knock-down)이 엠. 스메그마티스가 세포적으로 복제하여 숙주 세포(원주 상피(columnar epithelium))를 사멸시킬 수 있도록 함을 나타낸다. 대조군 스크램블 siRNA는 퍼포린-2 수준에 영향을 미치지 않으며 세포는 엠. 스메그마티스를 거부한다.
도 19는, 퍼포린-2 결핍성 대식세포 및 PMN이 세포내 Mtb를 사멸할 수 없음을 나타낸다. (a) Mtb(mCherry-Mtb, CDC 1551, 리포터 세균)는 +/+ 또는 +/- 골수 기원한 대식세포보다 IFN-γ 및 LPS 활성화된, 퍼포린-/-에서 유의적으로 보다 신속하게 복제하고; (b) 엠. 아비움(M. avium)은 +/+ 또는 +/- PMN보다 퍼포린-2-/-에서 유의적으로 보다 신속하게 복제한다. (c) 퍼포린-2는 엠. 스메그마티스, MRS A 및 살모넬라를 사멸시키기 위해 PMN에 의해 요구되며, (d) 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) CDC 1551은 세균 생존/성장의 상관관계로서 mCherry를 구성적으로 발현하도록 가공되었다.
도 20은 P-2 세균 봉입체내에서 소낭 전좌, 막 융합 및 공극 형성의 모델을 나타낸다. BCV/SCV=액포를 함유하는 세균/살모넬라. 중심이 검은색인 적색 원은 중합된 퍼포린-2이다.
도 21은 퍼포린-1의 결정 구조 및 퍼포린-1 및 -2의 모델을 나타낸다. (a) 단량체성 퍼포린-1. 도메인은 하기 사각형안에 표지되어 있다. 중합된 퍼포린-1에서 β-헤어핀에 리폴딩(refolding)되고 막내로 삽입된 MACPF-도메인의 CH1 및 CH2 부분에 주목한다. (b) 지질 이층내로 삽입된 β-헤어핀과 중합된 퍼포린-1내의 단량체. (c) 파고솜 내부에서 세포를 공격하는 MACPF 도메인을 갖는 파고솜 막에 묶여진(tethered) 퍼포린-2의 모델.
도 22는, 퍼포린-2-GFP 및 RASA2/GAP1M이 살모넬라 함유 액포와 동시국재화함을 입증한다(좌측 패널). 우측 채널: 퍼포린-2-RFP는 GFP-이. 콜라이 함유 액포와 동시국재화한다.
도 23은 공면역침전에 의한 퍼포린-2 상호작용 단백질을 나타낸다. RAW 세포는 GFP 또는 퍼포린-2-GFP로 형질감염되었고 항-GFP(천연의 퍼포린-2를 검출하여 침전시키기 위한 항체는 이용가능하지 않다)를 사용하여 형질감염되었으며, 면역침전물은 나타낸 항체로 블랏팅(blotting)되었다.
도 24는, Cif 결핍성 예르시니아 슈도튜베로쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis)가 내인성 퍼포린-2에 의해서 또는 보충된 퍼포린-2-GFP에 의해서 퍼포린-2 사멸에 대해 민감성임을 나타낸다. (a) 예르시니아 슈도튜베르쿨로시스(Y.pt)는 퍼포린-2로부터 염색체 Cif에 의해 보호된다; (b) Cif의 결실은, Y.pt가 퍼포린-2에 대해 민감성이 되도록 한다. 퍼포린-2의 녹-다운은 퍼포린-2-GFP에 의해 보충된다; (c) Cif 플라스미드는 Y.pt를 내인성 퍼포린-2 및 보충된 퍼포린-2-GFP에 대해 보호한다.
도 25는, Cif가 존재하고 세균이 생존하는 경우 항-퍼포린-2으로 블랏팅된 사멸된 예르시니아의 분해물이 신규의 퍼포린-2 단편 밴드를 나타냄을 입증한다. 퍼포린-2-GFP 면역침전물(항 GFP 사용)은, 사멸이 Cif에 의해 차단되는 경우 유비퀴틴-음성이며 Cif가 부재하고 세균이 사멸되는 경우 유비퀴틴-양성이다. 예르시니아 슈도투베르쿨로시스는 내인성 염색체 Cif를 함유하거나 Cif 결실되어 있고 재구성되며 퍼포린-2-GFP 형질감염된 CMT93 세포와 함께 항온처리되었다. 4시간 시점에서 항-퍼포린-펩타이드 혈청(Abcam)을 사용하여 분해물의 웨스턴 블랏팅(western blotting)으로 분석하였으며; 항-GFP 면역침전은 항-유비퀴틴으로 면역블랏팅하였다.
도 26은 10⁵ 및 10²개의 에스. 티피무리움 RL144을 사용한 퍼포린-2+/+ (녹색), +/- (청색) 및 -/- (적색) 마우스의 오가노가스트릭 유발를 나타낸다; 체중 감소 - 상부 패널; 생존 - 하부 패널.
도 27은 (A) 본원에 제공된 E1 유비퀴틴-활성화 효소, E2 유비퀴틴-접합 효소 및 E3 유비퀴틴 리가아제의 다양한 억제제의 화학 구조; (B) NEDD8 활성화 효소 (NAE) 억제제의 화학 구조를 나타낸다.
도 28은 본원에 제공된 다양한 이소펩티다제 억제제의 화학 구조를 나타낸다.
도 29는 본원에 제공된 다양한 데유비퀴티나제 억제제의 화학 구조를 나타낸다.
도 30은 본원에 제공된 다양한 프로테오좀 억제제의 화학 구조를 나타낸다.

본 발명은 첨부되는 도면을 참고로 이후에 보다 충분히 설명될 것이며, 여기서, 본 발명의 모든 구현예는 아니지만, 일부가 나타나 있다. 실제로, 이들 발명은 많은 상이한 형태에서 구현될 수 있으며 본원에 설정된 구현예에 한정되는 것으로 해석되지 않아야 하며; 오히려 이들 구현예는, 당해 개재내용이 적용가능한 법률적 요건을 충족하도록 제공된다. 유사한 도면 부호는 전체에서 유사한 성분을 말한다.

본원에 설정된 본 발명의 많은 변형 및 다른 구현예는, 본 발명이 속한 분야의 기술자가 앞서의 설명 및 관련 도면에 나타낸 교시 내용의 이점을 가짐을 기억할 것이다. 따라서, 본 발명은 개재된 구체적인 구현예에 한정되는 것이 아니며 변형 및 다른 구현예가 첨부된 특허청구범위의 영역내에 포함되는 것으로 의도됨이 이해되어야 한다. 특정 용어가 본원에 사용되어 있지만, 이들은 일반적이고 설명적인 개념으로 사용된 것이며, 제한의 목적이 아니다.

I. 개관

퍼포린-2의 활성을 조절하기 위한 방법 및 조성물이 본원에 제공된다. 퍼포린-2 활성화 경로의 다양한 성분 중 어느 것의 변형도 본원에 제공된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 구체적인 구현예에서, 소화관의 염증과 관련된 질환의 치료를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 방법에서 사용될 수 있는, 퍼포린-2 활성을 억제하는 화합물이 제공된다. 퍼포린-2 활성을 활성화시키는 화합물이 또한 본원에 제공되며 감염성 질환 유기체에 의해 유발된 질환을 치료함을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 방법에서의 용도가 발견되어 있다.

퍼포린-2는 모든 식균 세포에서 구성적으로 발현되며 마우스 및 사람 둘 다에서 시험된 모든 비-식균세포에서 유도성이고 병원성의 세포내 세균의 사멸에 있어서 중요한 역할을 한다. 퍼포린-2 녹다운 또는 결핍능은 세포를 무방비상태가 되도록 하고 세포를 사멸시키는 세포내 세균 복제를 생성하는 세포내 세균을 사멸시킬 수 없도록 한다.

중합시, 퍼포린-2는 장벽 기능을 손상시켜 반응성 산소 및 질소 종 및 하이드롤라제의 도입을 허용하여 세균 파괴를 완료시키는 세균의 세포 벽 봉입체(envelope)내 커다란 구멍 및 공극의 집단을 형성한다. 따라서, 퍼포린-2는 침입성 세균, 특히 항생제-내성 세균을 파괴하는 유일하게 중요한 유의적인 고유의 효과기 분자이다.

본원에 사용된 것으로서, "퍼포린-2 활성화 경로"는 퍼포린-2 활성의 조절에 관여하는 특정 하나 이상의 분자를 의미한다. 특수한 기전에 한정되기는 원하지는 않는다고 해도, 퍼포린-2의 활성화는 적어도 3개의 단계: (1) 포스포릴화/키나제 활성화; (2) 세균 함유 막으로의 퍼포린-2의 전좌; 및 (3) 세균 표면에 공극의 형성을 유발하는 퍼포린-2의 중합화를 포함한다. 본원에서는 유비퀴틴화가 퍼포린-2의 중합 및 활성화를 위한 중요한 단계라는 발견을 제공한다.

퍼포린-2 활성화 경로의 다양한 성분의 비-제한적 예는 예를 들면, 유비퀴틴화 경로의 특정 성분, 유비퀴틴, E1 유비퀴틴-활성화 효소, E2 유비퀴틴-접합 효소, E3 유비퀴틴 리가아제, 쿨린 환(쿨린 ring) 유비퀴틴 리가아제(CRL), 네딜화 경로(neddylation pathway)의 특정 성분, NEDD8, NEDD8 활성화 효소(NAE), 데네딜라제, 데아미다제, Ubc12, βTrcP1/2, Skp1, 쿨린1, Vps34, RASA2, Ubc4, Rbx1, 프로테오좀, 이소펩티다제, 데유비퀴티나제, TEC, NEK9, Mapk12, 또는 퍼포린-2를 포함한다.

II. 퍼포린 -2 활성의 조절인자

퍼포린-2의 활성을 조절하는데 관여하는 분자 경로의 다양한 성분들의 활성 및/또는 발현을 조절하는 일련의 화합물이 본원에 제공된다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "조절하는"은 "유도하는", "억제하는", "강화시키는", "상승시키는", "증가시키는", "감소시키는", "하향조절하는", "상향조절하는" 등을 포함한다. 이들 용어들 각각은 2개의 기술 사이의 정량적 차이를 나타내며, 특히 2개의 기술 사이의 적어도 통계적으로 유의적인 차이를 말한다.

A. 퍼포린 -2 활성을 억제하는 화합물

소화관 염증을 치료하고 소화관 염증과 관련된 질환을 치료하기 위한 퍼포린-2 활성의 억제제를 사용하는 방법 및 조성물이 제공된다.

본원에 사용된 것으로서, "소화관의 염증" 또는 "소화관 염증"은 위장관의 염증을 말한다. 일부 경우에, 소화관 염증은 상태 또는 질환과 관련될 수 있다. 소화관 염증과 관련된 질환의 비-제한적 예는 예를 들면, 결장염, 궤양성 결장염, 크론병(Crohn's disease) 또는 염증성 창자병을 포함한다. 이러한 경우에, 퍼포린-2 활성을 억제하는 것은 소화관의 염증을 치료하거나 예방하는데 유리할 수 있다.

퍼포린-2의 활성을 억제함으로써 퍼포린-2 활성을 감소시키는 작용을 하는 다양한 화합물(즉, 퍼포린-2 활성화 경로의 다양한 성분 중 특정 하나 이상을 조절하는 화합물)이 본원에 제공된다.

용어 "억제제"는 표적의 생물학적 활성 및/또는 발현 중 하나 이상을 "저하시키거나", "억제하거나", "감소시키거나" 달리는 "소멸시키는" 제제를 말한다(예, 표적 폴리펩타이드 또는 표적 신호전달 경로). 억제제를 사용한 억제는 표적화된 활성의 전체적인 제거를 필수적으로 나타내지 않는다. 대신에, 활성은 예를 들면, 적절한 대조군과 비교하여 표적의 활성의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95% 또는 100%의 감소를 포함하는 통계적으로 유의적인 양에 의해 감소될 수 있다.

퍼포린-2 활성의 감소는 웨스턴 블랏, 면역침전, 면역조직화학, 면역형광성과 같은 단백질 발현 분석에 의한 퍼포린-2 단백질의 수준에 있어서의 감소, 또는 노던 블랏(Northern blot) 또는 RT-PCR과 같은 분석에 의한 퍼포린-2 mRNA 발현에 있어서의 감소를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 방법에서 검정될 수 있다. 또한, 퍼포린-2의 활성에 있어서의 감소는 세균으로 감염된 세포의 세균 활성에 있어서의 감소를 검정함으로써 측정할 수 있다. 검정 방법은 세균 복제에 있어서의 증가, 또는 감염된 세균의 세포 사멸에 있어서의 증가를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 퍼포린-2 활성에 있어서의 감소는 또한 적절한 대조군과 비교하여 세균으로 감염된 후 다양한 기관 및 혈액 속에서 세균 콜로니 형성 단위에 있어서의 증가를 측정함으로써 또는 소화관 조직의 염증에 있어서의 감소를 통해 생체내에서 측정할 수 있다. 퍼포린-2 활성을 측정하기 위한 다양한 검정이 본원의 어느 곳에도 기술되어 있다.

본원에 사용된 것으로서, "퍼포린-2 활성의 억제제" 또는 "퍼포린-2 활성을 억제하는 화합물"은 퍼포린-2 활성화 경로의 적어도 하나의 성분의 활성 및/또는 발현을 조절함으로써 퍼포린-2를 억제하거나, 퍼포린-2의 활성 및/또는 발현을 직접적으로 억제하는 화합물을 말한다. 일부 구현예에서, 퍼포린-2 활성의 억제제는 적어도 하나의 표적 분자의 활성을 억제함으로써, 퍼포린-2 활성을 억제한다. 다른 구현예에서, 퍼포린-2 활성의 억제제는 적어도 하나의 표적 분자의 활성을 증가시켜, 퍼포린-2 활성을 억제한다.

본원에 또한 상세히 설명된 바와 같이, 퍼포린-2의 유비퀴틴화는 퍼포린-2 활성화의 중요한 단계이다. 일 구현예에서, 퍼포린-2 활성을 억제하는 화합물은 퍼포린-2의 유비퀴틴화를 억제한다. 특정의 구현예에서, 화합물은 유비퀴틴화 경로의 적어도 하나의 성분의 억제제이다. 구체적인 구현예에서, 퍼포린-2 활성을 억제하는 화합물은 E1 유비퀴틴-활성화 효소 억제제, E2 유비퀴틴-접합 효소 억제제 또는 E3 유비퀴틴 리가아제 억제제이다. E1 유비퀴틴-활성화 효소, E2 유비퀴틴-접합 효소 또는 E3 유비퀴틴 리가아제의 억제제의 비-제한적 예는 예를 들면, PYR-41, BAY 11-7082, 뉴틀린-3, JNJ 26854165 (세르데메탄(Serdemetan)), 탈리도미드, TAME, NSC-207895, 또는 이의 활성 유도체를 포함한다. E1 유비퀴틴-활성화 효소, E2 유비퀴틴-접합 효소 또는 E3 유비퀴틴 리가아제의 다양한 억제제의 화학 구조는 도 27a에 나타나 있다.

본원의 어느 곳에 설명된 바와 같이, 네딜화는 퍼포린-2 활성화를 가져오는 경로 중 중요한 단계이다. 일부 구현예에서, 퍼포린-2 활성을 억제하는 화합물은 네딜화 경로의 억제제이다. 일부 경우에, 네딜화 경로의 성분을 활성화시키는 것은 네딜화의 억제를 초래할 것이다. 다른 경우에, 네딜화 경로의 성분을 억제하는 것은 네딜화의 억제를 초래할 것이다. 특정의 구현예에서, 화합물은 NEDD8-활성화 효소 (NAE) 억제제이다.

일부 구현예에서, 퍼포린-2 활성을 억제하는 화합물은 본원에 MLN-4924로 언급된 NAE 억제제 화합물을 포함하며 다음 화학식을 포함한다:

MLN-4924의 활성 유도체가 또한 제공되며, 여기서 활성 유도체는 퍼포린-2의 활성을 억제하는 능력을 갖는다.

다른 구현예에서, 퍼포린-2 활성을 억제하는 화합물은 본원에서 사이클로메탈화된 로듐(III) 복합체 [Rh(ppy)₂(dppz)]⁺(복합체 1)(여기서, ppy는 2-페닐피리딘이고 dppz는 디피리도[3,2-a:2',3'-c]페나진 디피리도페나진이다)로서 언급된 NAE 억제제 화합물을 포함한다(참고: Zhong H-J, et al. (2012) PLoS ONE 7(11): e49574; 이의 전문은 본원에 참고로 포함되어 있다). 또한 로듐(III) 복합체[Rh(ppy)₂(dppz)]⁺(복합체 1)(여기서, 활성 유도체는 퍼포린-2의 활성을 억제하는 능력을 보유한다)의 활성 유도체가 제공된다. 로듐(III) 복합체 [Rh(ppy)₂(dppz)]⁺의 다양한 유도체는 당해 분야에 공지되어 있으며 복합체 2, 3 및 4를 포함한다. 다양한 복합체의 경우 R은: 복합체 1: R1, R2, R3 = H; 복합체 2: R1, R2 = CH3, R3 = H; 복합체 3: R1, R2 = CH3, R3 = CHO; 및 복합체 4: R1 = H, R2 = N02, R3 + CHO로서 정의된다. 사이클로메탈화된 로듐(III) 복합체 [Rh(ppy)₂(dppz)]⁺의 화학 구조는 도 27b에 나타낸다.

용어 "활성 유도체"는 구조적 변형을 함유하고 퍼포린-2 조절 특성을 보유한 본원에 제공된 퍼포린-2 활성을 조절하는 다양한 화합물 중 어느 것의 변이체를 말한다. 퍼포린-2 활성을 억제하는 화합물의 경우에, 이러한 화합물의 활성 변이체는 퍼포린-2 활성을 억제하는 능력을 보유한다. 퍼포린-2 활성을 증가시키는 화합물의 경우에, 당해 화합물의 활성 변이체는 페로린-2 활성을 증가시키는 능력을 보유한다.

일부 경우에, 네딜화는 데아미다제에 의해 불활성화될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 퍼포린-2 활성을 억제하는 화합물은 데아미다제이다. 구체적인 구현예에서, 데아미다제는 Cif이다. 예를 들면, 문헌(참고: Taieb, F, et al. (2011) Toxins ( Basel ) 3(4):356-68)을 참고하며, 당해 문헌은, 이의 전문이 참고로 포함되어 있다.

다른 구현예에서, 퍼포린-2 활성은 쿨린 환(쿨린 Ring) 유비퀴틴 리가아제 (CRL) 억제제에 의해 억제된다. CRL 억제제의 비-제한적 예는 MLN-4924이다. 구체적인 구현예에서 쿨린 환 유비퀴틴 리가아제 억제제는 MLN-4924를 포함한다.

다른 구현예에서, 퍼포린-2 활성은 프로테오좀 억제제에 의해 억제된다. 프로테오좀 억제제의 비-제한적 예는, 예를 들면, 모르테조미브, 살리노스포라미드 A, 카르필조미브, MLN9708, 델라조미브(CEP- 18770) 또는 이의 활성 유도체를 포함한다. 프로테오좀 억제제의 비-제한적 예의 구조는 도 30에 나타나 있다. 구체적인 구현예에서, 프로테오좀 억제제는 보르테조미브, 살리노스포라미드 A, 카르필조미브, MLN9708, 델라조미브 또는 이의 활성화 유도체를 포함한다.

비-제한적인 구현예에서, 퍼포린-2 활성을 억제하는 화합물은 다음의 표적 경로 및/또는 분자 중의 하나 이상의 활성 및/또는 발현을 조절할 수 있다: 유비퀴틴화 경로의 특정 성분, 유비퀴틴, E1 유비퀴틴-활성화 효소, E2 유비퀴틴-접합 효소, E3 유비퀴틴 리가아제, 쿨린 환 유비퀴틴 리가아제(CRL), 네딜화 경로의 특정 성분, NEDD8, NEDD8 활성화 효소(NAE), 이소펩티다제, 데유비퀴티나제, 데아미다제, Cif, 데네딜라제, Ubc12, βTrcP, Skp1, 쿨린1, Vps34, RASA2, Ubc4, Rbx1, 프로테오좀, TEC, NEK9, Mapk12, 및/또는 퍼포린-2.

B. 퍼포린 -2 활성을 증가시키는 화합물

퍼포린-2 활성을 증가시키는 화합물을 사용하는 방법 및 조성물이 또한 제공된다. 이러한 화합물에는, 예를 들면, 감염성 질환 유기체로 부터 고생하는 대상체를 치료하는데 있어서의 용도가 발견되어 있다.

퍼포린-2의 활성화에 관여하는 분자 경로의 다양한 성분이 본원에 제공된다. 주요 발견은, 퍼포린-2의 유비퀴틴화가 퍼포린-2의 중합화 및 활성화에 있어서 중요한 단계라는 것이다(본원에 또한 제공된 실시예 1-3 참고). 따라서, 본원에 제공된 퍼포린-2 활성화 경로의 다양한 성분들 중의 어느 것도 조절될 수 있으며 퍼포린-2 활성에 있어서의 증가를 초래한다.

퍼포린-2의 활성을 증가시키는 다양한 화합물(즉, 퍼포린-2 활성화 경로의 다양한 성분들 중 어느 하나 이상의 조절을 초래하는 화합물)이 본원에 제공되어 있다. 일 구현예에서, 퍼포린-2의 활성을 증가시키는 화합물은 퍼포린-2의 유비퀴틴화를 증가시킨다.

본원에 사용된 것으로서, "증가시키다(increase, increases)" 또는 "증가시키는"은 적절한 대조군과 비교하여 표적(즉, 표적 폴리펩타이드 또는 표적 신호전달 경로)의 하나 이상의 생물학적 활성 및/또는 발현에 있어서의 특정 유의적인 활성을 말한다. 증가는 적절한 대조군과 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 400% 이상의 특정 통계적으로 유의적인 증가일 수 있다. 달리는, 증가는 적절한 대조군과 비교하여 적어도 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 12배, 14배, 16배, 20배 이상의 특정 배수(fold) 증가일 수 있다.

퍼포린-2 활성에 있어서의 증가는 웨스턴 블랏, 면역침전, 면역조직화학, 면역형광성과 같은 단백질 발현 분석에 의한 퍼포린-2 단백질의 수준에 있어서의 증가, 또는 노던 블랏 또는 RT-PCR과 같은 분석에 의한 퍼포린-2 mRNA 발현에 있어서의 증가를 포함하는 다양한 방법으로 검정될 수 있다. 또한, 퍼포린-2의 활성에 있어서의 증가는 적절한 대조군과 비교하여 세균으로 감염된 세포의 살세균 활성에 있어서의 증가에 대해 검정함으로써 측정할 수 있다. 검정 방법은 세균 복제에 있어서의 감소, 또는 감염된 세포의 세포 사멸에 있어서의 감소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 퍼포린-2 활성에 있어서의 증가는 또한 적절한 대조군과 비교하여 세균으로 감염된 후 다양한 기관 및 혈액 속에서 세균 콜로니 형성 단위에 있어서의 감소에 대해 측정함으로써 생체내에서 측정할 수 있다. 퍼포린-2 활성을 측정하기 위한 다양한 검정이 본원의 어느 곳에도 기술되어 있다.

본원에 사용된 것으로서, "퍼포린-2 활성을 증가시키는 화합물"은 퍼포린-2 활성화 경로의 적어도 하나의 성분의 활성을 조절하는 화합물을 말한다. 일부 구현예에서, 퍼포린-2 활성을 증가시키는 화합물은 퍼포린-2 활성화 경로의 하나 이상의 성분의 활성 및/또는 발현을 증가시킴으로써, 퍼포린-2 활성을 증가시킨다. 다른 구현예에서, 퍼포린-2 활성을 증가시키는 화합물은 퍼포린-2 활성화 경로의 하나 이상의 성분의 활성 및/또는 발현을 감소시킴으로써 퍼포린-2 활성을 증가시킨다.

일부 구현예에서, 퍼포린-2 활성을 증가시키는 화합물은 퍼포린-2의 유비퀴틴화를 증가시킨다. 구체적인 구현예에서, 화합물은 유비퀴틴화 경로의 적어도 하나의 성분의 활성 및/또는 발현을 증가시킨다. 본원에 사용된 것으로서, "유비퀴틴화 경로의 성분"은 표적 분자에서 유비퀴틴의 첨가 및/또는 제거시에 관여하는 특정 분자를 말한다. 유비퀴틴 경로의 고찰을 위해서는, 예를 들면, 본원에 이의 전문이 참고로 포함된 문헌(참고: Vlachostergios, PJ, et al. (2013) Growth Factors 31(3): 106-13)을 참고한다. 유비퀴틴화 경로의 성분은 예를 들면, 유비퀴틴, 특정 E1 유비퀴틴-활성화 효소, 특정 E2 유비퀴틴-접합 효소, 특정 E3 유비퀴틴 리가아제, 네딜화 경로의 특정 성분, NEDD8, NEDD8 활성화 효소(NAE), 데네딜라제, 데아미다제, 쿨린 환 유비퀴틴 리가아제(CRL), Ubc12, βTrcP, Skp1, 쿨린1, Ubc4, Rbx1, 프로테오좀, 이소펩티다제 또는 데유비퀴티나제를 포함할 수 있다.

추가의 구현예에서, 유비퀴틴화 경로의 적어도 하나의 성분은 E1 유비퀴틴-활성화 효소, E2 유비퀴틴-접합 효소 또는 E3 유비퀴틴 리가아제를 포함한다.

여전히 추가의 구현예에서, 적어도 하나의 화합물은 이소펩티다제 억제제를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 이소펩티다제 억제제는 유비퀴틴 이소펩티다제 억제제 II(F6)(3,5-비스((4-메틸페닐)메틸렌)-1,1-디옥사이드, 피페리딘-4-온) 또는 유비퀴틴 이소펩티다제 억제제 I(G5)(3,5-비스((4-니트로페닐)메틸렌)-1,1-디옥사이드, 테트라하이드로-4H-티오피란-4-온) 또는 이의 활성 유도체를 포함한다. 본원에 제공된 이소펩티다제 억제제의 화학 구조는 도 28에 나타나 있다.

다른 구현예에서, 퍼포린-2의 유비퀴틴화를 증가시키는 적어도 하나의 화합물은 데유비퀴티나제 억제제를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 데유비퀴티나제 억제제는 PR-619, IU1, NSC 632839, P5091, p22077, WP1130, LDN-57444, TCID, b-AP15 또는 이의 활성 유도체를 포함한다. 본원에 제공된 다양한 데유비퀴타나제 억제제에 대한 화학 구조는 도 29에 나타낸다.

또한 네딜화는 퍼포린-2 활성화를 가져오는 유비퀴틴화 경로에서 중요한 단계라는 발견이 본원에 제공된다(참고: 본원에 또한 제공된 실시예 1 내지 3). 본원에 사용된 것으로서, "네딜화"는 표적 분자에 대한 NEDD8의 접합을 말한다. 일 구현예에서, 퍼포린-2의 유비퀴틴화를 증가시키는 적어도 하나의 화합물은 네딜화 경로의 적어도 하나의 성분의 활성 및/또는 발현을 조절한다. 본원에 사용된 것으로서, "네딜화 경로의 성분"은 표적 분자의 네딜화 또는 데네딜화에 관여한 특정 분자도 말한다. "데네딜화"는 표적 분자에서 NEDD8의 제거 및/또는 탈활성화를 의미한다. 예를 들면, NEDD8은 데네딜라제에 의해 제거될 수 있거나 데아미다제에 의해 불활성화될 수 있다. 네딜화 경로의 성분의 비-제한적인 예는 예를 들면, NEDD8, NEDD8 활성화 효소(NAE), 데네딜라제 또는 데아미다제를 포함한다.

구체적인 구현예에서, 퍼포린-2 유비퀴틴화를 증가시키는 화합물은 데네딜화 억제제이다. 추가의 구현예에서, 데네딜화 억제제는 PR-619, 유비퀴틴 이소펩티다제 억제제 II(F6)(3,5-비스((4-메틸페닐)메틸렌)-1,1-디옥사이드, 피페리딘-4-온), 유비퀴틴 이소펩티다제 억제제 I(G5)(3,5-비스((4-니트로페닐)메틸렌)-1,1-디옥사이드, 테트라하이드로-4H-티오피란-4-온) 또는 이의 활성 유도체를 포함한다.

비-제한적인 구현예에서, 퍼포린-2 활성을 증가시키는 화합물은 다음의 표적 경로 및/또는 분자 중 하나 이상의 활성 및/또는 발현을 조절할 수 있다: 유비퀴틴화 경로의 특정 성분, 유비퀴틴, E1 유비퀴틴-활성화 효소, E2 유비퀴틴-접합 효소, E3 유비퀴틴 리가아제, 쿨린 환 유비퀴틴 리가아제(CRL), 네딜화 경로의 특정 성분, 이소펩티다제, 데유비퀴티나제, NEDD8, NEDD8 활성화 효소(NAE), 데아미다제, 데네딜라제, Ubc12, βTrcP, Skp1, 쿨린1, Vps34, RASA2, Ubc4, Rbx1, 프로테오좀, TEC, NEK9, Mapk12, 및/또는 퍼포린-2.

C. 퍼포린 -2 활성을 조절하는 다양한 유형의 화합물

퍼포린-2 활성화 경로를 조절하는 화합물은 다양한 상이한 유전자를 포함한다. 예를 들면, 화합물은 소 분자, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 항체, 및 RNA 간섭(interference)을 포함할 수 있다. 이러한 화합물의 비-제한적인 예는 하기에 기재되어 있다.

일부 구현예에서, 퍼포린-2 활성을 조절하는 화합물은 소 분자, 폴리펩타이드, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 조합물을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 퍼포린-2 활성을 억제하는 화합물은 MLN-4924 또는 이의 활성화 유도체를 포함한다.

용어 "폴리뉴클레오타이드"의 사용은 본 발명을 DNA를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로 한정하려는 것이 아니다. 당해 분야의 통상의 기술자들은, 폴리뉴클레오타이드가 리보뉴클레오타이드 및, 리보뉴클레오타이드와 데옥시리보뉴클레오타이드의 조합을 포함할 수 있음을 인지할 것이다. 이러한 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드는 천연적으로 존재하는 분자 및 합성 유사체 둘 다를 포함한다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 RNA, DNA, 또는 RNA/DNA 분자의 모든 형태를 포함함을 의미한다.

본원에 개시된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드는 아미노산 치환, 뉴클레오타이드 치환, 결실, 절단(truncation), 및 삽입을 포함하는 다양한 방법으로 변경될 수 있다. 이러한 조작 방법은 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 퍼포린-2 활성화 경로의 성분의 아미노산 서열 변이체 및 단편은 DNA내 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 돌연변이유발 및 폴리뉴클레오타이드 변경 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌(참고: Kunkel (1985) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol . 154:367-382; 미국 특허 제4,873,192호; Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York)) 및 이들 문헌에 인용된 문헌들을 참고한다.

i. 소 분자

소 분자 시험 화합물은 초기에 유기 또는 무기 화학 라이브러리(library)의 구성원일 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, "소 분자"는, 분자량이 약 3,000 달톤 이하인 소 유기 또는 무기 분자를 말한다. 소 분자는 천연 생성물 또는 조합 화학 라이브러리의 구성원일 수 있다. 다양한 분자의 세트를 사용하여 전하, 방향성, 수소 결합, 굴곡성, 크기, 측쇄의 길이, 소수성, 및 경직성과 같은 다양한 기능을 포함시킬 수 있다. 소 분자를 합성하는데 적합한 조합 기술은 예들 들면, 문헌(참고: Obrecht and Villalgordo, Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compound Libraries, Pergamon-Elsevier Science Limited (1998))에 예시된 바와 같이, 당해 분야에 공지되어 있으며, "스플리트(split) 및 혼주(pool)" 또는 "평행" 합성 기술, 고체-상 및 용액-상 기술, 및 암호화 기술과 같은 것들을 포함한다(예를 들면, 문헌, Czarnik, Curr . Opin . Chem. Bio., 1:60 (1997)을 참고한다). 또한, 다수의 소 분자 라이브러리가 시판되고 있다.

일부 구현예에서, 퍼포린-2 활성을 조절하는 화합물은 소 분자를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 소 분자는 MLN-4924 또는 이의 활성화 유도체를 포함한다.

ii. 항체

일 구현예에서, 퍼포린-2 활성의 조절인자는 항체를 포함할 수 있다. 따라서, 구체적인 구현예에서, 퍼포린-2 활성화 경로의 특정 다양한 성분에 대한 항체가 제공된다. 항체는 표준 프로토콜에 의해 제조될 수 있는 폴리클로날 및/또는 모노클로날 항체(mAb)를 포함할 수 있다. 예를 들면, 문헌(참고: Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1999)을 참고한다. 단백질 또는 펩타이드에 면역원성을 부여하기 위한 기술은 담체에 대한 접합을 포함하거나 다른 기술이 또한 당해 분야에 공지되어 있다. 바람직한 구현예에서, 본 항체는 유비퀴틴화 경로, 유비퀴틴, E1 유비퀴틴-활성화 효소, E2 유비퀴틴-접합 효소, E3 유비퀴틴 리가아제, 쿨린 환 유비퀴틴 리가아제 (CRL), 네딜화 경로의 특정 성분, 이소펩티다제, 데유비퀴티나제, NEDD8, NEDD8 활성화 효소(NAE), 데아미다제, 데네딜라제, Ubc12, βTrcP, Skp1, 쿨린1, Vps34, RASA2, Ubc4, Rbx1, 프로테오좀, TEC, NEK9, Mapk12, 및/또는 퍼포린-2의 특정 성분을 포함하나 이에 한정되지 않는 퍼포린-2 활성화 경로의 다양한 성분 중의 어느 것의 특정 폴리펩타이드의 유일한 항원성 결정인자에 대해 면역특이적이다.

본원에 논의된 것으로서, 이들 항체는 "항-퍼포린-2 활성화 경로 항체"로서 총괄적으로 언급되며 퍼포린-2 활성화 경로의 성분의 활성을 차단하는 길항 항체 또는 퍼포린-2 활성화 경로의 성분의 활성을 촉진하는 항체를 포함할 수 있다. 항체는 본 발명의 방법에서 단독으로 또는 함께 사용될 수 있다.

"특이적으로 결합하는 항체"는, 항체가 다른 폴리펩타이드와 실질적으로 교차 반응하지 않을 것으로 의도된다. "실질적으로 교차 반응하지 않는"은, 표적 단백질에 대한 결합 친화성이 10% 미만, 5% 미만, 또는 1% 미만인 비-동족성 단백질에 대해 결합 친화성을 가짐을 의도한다.

본원에 개시되고 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 다양한 조절 항체는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 특정 항체 생산 방법을 사용하여서도 생산할 수 있다. 따라서, 조절 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있다.

"모노클로날 항체"는 실질적으로 상동성인 항체, 즉 소량으로 존재할 수 있는 가능한한 천연적으로 존재하는 돌연변이를 제외하고는 동일한 집단을 포함하는 개개 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 의도한다.

"에피토프(epitope)"는, 항체가 생산되어 항체가 결합할 항원성 분자의 일부를 의도한다. 에피토프는 선형 아미노산 잔기(즉, 에피토프내 잔기가 선형 양식으로 서로 일렬로 정렬되어 있다), 비선형 아미노산 잔기(본원에서 "비선형 에피토프"로 언급됨-이들 에피토프는 순차적으로 정렬되어 있지 않다), 또는 선형 및 비선형 아미노산 잔기 둘 다를 포함할 수 있다.

또한, 본원에 사용된 것으로서, 용어 "항체"는 키메라 및 사람화된 항-퍼포린-2 활성화 경로 항체를 포함한다. "키메라" 항체는 가장 바람직하게는 재조합체 데옥시리보핵산 기술을 사용하여 유도된 항체를 의도하며 이는 사람(면역학적으로 "관련된" 종, 예를 들면, 침팬지) 및 비-사람 성분 둘다를 포함한다. 따라서, 키메라 항체의 불변 영역이 가장 바람직하게는 천연의 사람 항체의 불변 영역과 실질적으로 동일하며; 키메라 항체의 가변 영역은 비-사람 공급원으로부터 가장 바람직하게 유도되고 퍼포린-2 활성화 경로의 폴리펩타이드에 대해 바람직한 항원 특이성을 갖는다. 비-사람 공급원은 퍼포린-2 활성화 경로의 폴리펩타이드에 대한 항체를 생성하는데 사용될 수 있는 특정 척추동물 공급원 또는 퍼포린-2 활성화 경로의 폴리펩타이드를 포함하는 물질일 수 있다. 이러한 비-사람 공급원은 설치류(예를 들면, 토끼, 랫트, 마우스 등; 참고: 예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호) 및 비-사람 영장류(예를 들면, 구시대 원숭이, 유인원 등; 예를 들면, 미국 특허 제5,750,105호 및 제5,756,096호)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

"사람화된"은 비-사람 면역글로불린 서열로부터 유도된 최소의 서열을 함유하는 항-퍼포린-2 활성화 경로 항체의 의도된 형태이다. 따라서, 이러한 "사람화된" 항체는, 실질적으로 완전하지 않은 사람 가변 도메인이 비-사람 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된 항체를 포함할 수 있다.

iii. 사일런싱 성분(Silencing Element)

퍼포린-2 활성을 조절하는 화합물은 퍼포린-2 활성화 경로의 성분중 어느 하나의 서열을 표적화함으로써 퍼포린-2의 활성을 조절하는 사일런싱 성분을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 사일런싱 성분은 예를 들면, 유비퀴틴화 경로의 특정 성분, 유비퀴틴, E1 유비퀴틴-활성화 효소, E2 유비퀴틴-접합 효소, E3 유비퀴틴 리가아제, 쿨린 환 유비퀴틴 리가아제(CRL), 네딜화 경로의 특정 성분, 이소펩티다제, 데유비퀴티나제, NEDD8, NEDD8 활성화 효소(NAE), 데아미다제, 데네딜라제, Ubc12, βTrcP, Skp1, 쿨린1, Vps34, RASA2, Ubc4, Rbx1, 프로테오좀, TEC, NEK9, Mapk12, 및/또는 퍼포린-2의 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 퍼포린-2 활성화 경로내 폴리펩타이드를 암호화하는 특정 서열을 포함하는, 다양한 서열을 표적화하도록 설계될 수 있다.

"사일런싱 성분"은, 숙주 세포내로 발현되거나 도입되는 경우 표적 폴리뉴클레오타이드 또는 이에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 수준 또는 발현을 감소시키거나 제거할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 의도한다. 사용된 사일런싱 성분은 표적 RNA 전사체의 수준에 영향을 미치거나, 달리는 해독에 영향을 미침으로써 암호화된 폴리펩타이드의 수준에 영향을 미쳐서 표적 서열의 발현 수준을 감소시키거나 제거할 수 있다. 목적한 서열의 수준을 감소시키거나 제거할 수 있는 기능성 사일런싱 성분에 대한 검정 방법이 또한 본원에 개재되어 있다. 사일런싱 성분은 센스 억제 성분, 안티센스 억제 성분, siRNA, shRNA, 단백질 핵산(PNA) 분자, miRNA, 헤어핀억제 성분, 또는 이의 특정 전구체를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

따라서, 사일런싱 성분은 센스 억제 성분, 안티센스 억제 성분, siRNA, shRNA, miRNA, 또는 헤어핀 억제 성분의 전사체; 안티센스 RNA, siRNA, shRNA, miRNA, 또는 헤어핀 RNA의 RNA 전구체; 또는 활성 안티센스 RNA, siRNA, shRNA, miRNA, 또는 헤어핀 RNA의 전사를 위한 주형(template)을 포함할 수 있다. 사일런싱 성분을 세포내로 도입시키는 방법은 세포내로 도입되는 형태(DNA 주형, RNA 전구체, 또는 활성 RNA)에 따라 변할 수 있다. 사일런싱 성분이 안티센스 억제 성분, siRNA, shRNA, miRNA, 또는 헤어핀 억제 성분, 방해 RNA를 암호화하는 DNA 분자를 포함하는 경우, 당해 DNA는 세포내에 일시적으로 존재하거나 세포의 게놈내로 안정하게 도입되도록 설계될 수 있음을 인지한다. 이러한 방법은 본원의 다른 곳에 추가로 상세히 논의되어 있다.

사일런싱 성분은 표적 RNA 전사체의 수준에 영향을 미치거나, 해독에 영향을 미침으로써 암호화된 폴리펩타이드의 수준에 영향을 미치거나, 전-전사 수준에서 발현에 영향을 미침으로써(즉, 크로마틴 구조, 메틸화 양식 등의 조절을 통해 유전자 발현을 변경시킴) 표적 서열의 발현 수준을 감소시키거나 제거할 수 있다(예를 들면, Verdel et al. (2004) Science 303:672-676; Pal-Bhadra et al. (2004) Science 303:669-672; Allshire (2002) Science 297: 1818-1819; Volpe et al. (2002) Science 297: 1833-1837; Jenuwein (2002) Science 297:2215-2218; 및 Hall et al. (2002) Science 297:2232-2237를 참고한다). 목적한 서열의 수준을 감소시키거나 제거할 수 있는 작용성 방해 RNA에 대한 검정 방법은 본원의 다른 곳에 개시되어 있다.

본원에 사용된 것으로서, "표적 서열"은 발현의 수준을 감소시키고자 하는 특정 서열도 포함한다. "폴리뉴클레오타이드 또는 이에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 발현 수준을 감소시킴"은, 표적 서열의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 수준이 사일런싱 성분에 노출되지 않은 적절한 대조군내에서 동일한 표적 서열의 폴리뉴클레오타이드 수준 또는 폴리펩타이드 수준보다 통계학적으로 더 낮음을 의미함을 의도한다. 특수한 구현예에서, 현재 개시된 대상물에 따른 표적 서열의 폴리뉴클레오타이드 수준 및/또는 폴리펩타이드 수준을 감소시키는 것은 적절한 대조군에서 동일한 표적 서열의 폴리뉴클레오타이드 수준, 또는 이에 의해 암호화된 폴리펩타이드 수준의 95% 미만, 90% 미만, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만까지의 감소를 초래한다. RNA 전사체의 수준, 암호화된 폴리펩타이드의 수준, 또는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 활성의 수준에 대한 검정 방법이 본원에 또한 논의되어 있다.

표적 폴리뉴클레오타이드의 특정 영역 또는 다수의 영역을 사용하여 사일런싱 성분이 표적 폴리뉴클레오타이드의 수준을 감소시키도록 충분한 서열 동질성을 공유하는 사일런싱 성분의 도메인을 설계할 수 있다. 예를 들면, 사일런싱 성분은 표적 폴리뉴클레오타이드(들)의 5' 해독되지 않은 영역, 표적 폴리뉴클레오타이드(들)의 3' 해독되지 않은 영역, 표적 폴리뉴클레오타이드(들)의 엑손 영역, 표적 폴리뉴클레오타이드(들)의 인트론 영역, 및 이의 특정 조합도 공유하도록 설계될 수 있다.

표적 폴리뉴클레오타이드의 수준을 감소시키는 사일런싱 성분의 능력은 예를 들면, 노던 블랏, 뉴클레아제 보호 검정, 역 전사(RT)-PCR, 실시간 RT-PCR, 미세배열 검정 등을 사용하여 표적 전사체의 양을 측정함으로써 직접 평가할 수 있다. 달리는, 표적 폴리뉴클레오타이드의 수준을 감소시키기 위한 사일런싱 성분의 능력은 웨스턴 블랏, 면역검정, ELISA, 유동 세포분석법, 단백질 미세배열 등을 포함하는 다양한 친화성-계 시도(예를 들면, 표적 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 리간드 또는 항체를 사용)를 사용하여 직접 측정할 수 있다. 여전히 다른 방법에서, 표적 폴리뉴클레오타이드의 수준을 감소시키는 사일런싱 성분의 능력은 예를 들면, 전사체에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 작용적 활성을 측정하거나 전사체에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 의해 생산된 신호(signal)을 측정함으로써 간접적으로 평가할 수 있다.

D. 키트 (kit)

본원에 사용된 것으로서, "키트"는 생물학적 시료 속에서 퍼포린-2의 활성을 조절하는데 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 퍼포린-2의 조절인자를 포함한다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "키트" 및 "시스템"은 구체적인 구현예에서 하나 이상의 다른 유형의 성분 또는 요소들(예를 들면, 다른 유형의 생화학적 시약, 용기, 시판용으로 의도된 포장과 같은 포장재, 검출 시약이 부착된 기질, 전자 하드웨어 부품, 사용 지시사항 등)과 배합된 퍼포린-2 활성을 조절하는 적어도 하나 이상의 화합물을 말하는 것으로 의도된다.

일부 구현예에서, 키트는 화합물 MLN-4924 또는 이의 활성화 유도체를 포함한다.

III. 용도 및 방법

퍼포린-2 활성화 경로의 다양한 성분 및 본원에 개시된 퍼포린-2 활성을 조절하는 다양한 화합물을 스크리닝 검정, 진단 및 예후 검정, 퍼포린-2 활성을 조절하는 방법 및 치료 방법(예를 들면, 치료학적 및 예방학적)을 포함하는 다양한 방법에서 사용할 수 있다.

A. 퍼포린 -2 경로의 활성을 조절하는 방법

대상체에서 퍼포린-2의 활성을 조절하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 퍼포린-2 활성의 적어도 하나의 조절인자를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함한다. 본원에 개시된 퍼포린-2 활성화 경로의 특정 다양한 성분도 본원에 제공된 방법에 의해 조절될 수 있다.

퍼포린-2 활성을 억제하는 다양한 화합물은 소화관 염증과 관련된 특정 상태를 치료하는데 있어 용도가 발견되어 있다. 예를 들면, 퍼포린-2 억제제는 결장염, 궤양성 결장염, 크론병 또는 염증성 창자병을 치료하는데 있어서 용도가 발견되어 있다. 따라서, 일 구현예에서, 소화관의 염증을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 퍼포린-2 활성을 억제하는 적어도 하나의 화합물의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여함을 포함한다. 당해 화합물은 본원에 개시된 퍼포린-2 활성화 경로의 다양한 성분 중의 어느 것도 조절할 수 있다. 퍼포린-2 활성을 억제하는 다양한 화합물이 본원의 다른 곳에 논의되어 있다.

구체적인 구현예에서, 당해 방법은 소 분자 MLN-4924 또는 이의 활성화 유도체와 같은 소분자인 퍼포린-2 활성을 억제하는 화합물을 사용할 수 있다.

감염성 질환 유기체로 고생하는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 이러한 방법은 퍼포린-2 활성을 증가시키는 적어도 하나의 화합물의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여함을 포함한다. 퍼포린-2 활성을 증가시키는 화합물은 본원에 개시된 퍼포린-2 활성화 경로의 다양한 성분 중 어느 것도 조절할 수 있다. 퍼포린-2 활성을 증가시키는 다양한 화합물이 본원의 다른 곳에 논의되어 있다. 구체적인 구현예에서, 상기 화합물은 퍼포린-2의 유비퀴틴화를 증가시킨다.

퍼포린-2 활성을 증가시키는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 퍼포린-2의 유비퀴틴화를 증가시킴으로써 퍼포린-2의 활성을 증가시키는 적어도 하나의 화합물의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함한다. 본원에 개시된 유비퀴틴화 경로의 다양한 성분 중 어느 것도 본원에 제공된 퍼포린-2 활성을 조절하는 다양한 화합물 중 어느 것에 의해 조절될 수 있다. 일 구현예에서, 화합물은 유비퀴틴화 경로의 적어도 하나의 성분의 활성 및/또는 발현을 증가시킨다.

치료학적 유효량의 퍼포린-2 활성의 조절인자를 대상체에게 투여할 수 있다. "치료학적 유효량"은 질병 또는 상태의 치료, 예방 또는 진단에 유용한 양을 의도한다. 본원에 사용된 것으로서, 치료학적 유효량의 퍼포린-2 조절인자는, 대상체에게 투여되는 경우, 예를 들면, 억제제의 경우에, 이러한 조성물로 치료한 대상체에서 실질적인 세포독성 효과를 유발하지 않고 상기 대상체에서 퍼포린-2 활성을 감소시키는 것과 같은 바람직한 효과를 달성하기에 충분한 양이다. 소화관 염증을 치료하기 위한 치료학적 유효량은 소화관 염증에 있어서의 감소를 초래할 것이다. 소화관 염증에 있어서의 감소는 예를 들면, 소화관 염증의 증상 및/또는 징후에 있어서의 감소에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 소화관 염증에 있어서의 감소는 대변 속에서 염증성 마커를 측정하거나 생물학적 병변의 결장검 검사 및/또는 생검에 의해 측정할 수 있다. 퍼포린-2의 활성화제의 경우, 달성될 바람직한 효과는 예를 들면, 대상체에서 실질적인 세포독성 효과를 유발하지 않고 이러한 조성물로 치료되는 대상체에서 퍼포린-2 활성을 증가시킬 수 있다. 퍼포린-2 활성을 조절하는데 유용한 퍼포린-2 조절인자의 유효량은 치료되는 대상체, 고통의 중증도, 및 퍼포린-2 억제제의 투여 방식에 의존할 것이다.

"대상체"는 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양 등과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 포유동물, 예를 들면, 영장류, 사람, 농업 및 가축 동물을 의도한다. 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 제형으로 치료받는 대상체는 사람이다.

투여가 치료 목적인 경우, 투여는 예방학적 또는 치료학적 목적일 수 있다. 예방학적으로 제공되는 경우, 물질은 특정 증상보다 먼저 제공된다. 물질의 예방학적 치료는 특정 후속적인 증상도 예방하거나 약화시키기 위해 제공된다. 치료학적으로 제공되는 경우, 물질은 증상의 발생시(또는 발생 직후)에 제공된다. 물질의 치료학적 투여는 특정 실질적인 증상도 약화시키기 위해 제공된다.

당해 분야의 숙련가는, 특정 인자들이 질환 또는 장애의 중증도, 이전 치료, 대상체의 일반적인 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 기타 길환을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 대상체를 효과적으로 치료하는데 요구되는 용량에 영향을 미칠 수 있음을 인지할 것이다. 더욱이, 치료학적 유효량의 퍼포린-2 활성의 조절인자(MLN-4924와 같은 억제제 포함)를 사용한 대상체의 치료는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 치료에 사용된 유효 용량의 퍼포린-2 활성의 용량은 특수한 치료의 과정에 걸쳐 증가되거나 감소될 수 있음이 또한 인지될 것이다.

이러한 활성 화합물의 적절한 투여량은 통상의 숙련된 주치의, 수의사, 또는 연구자의 지식내의 다수의 인자에 의존함이 이해된다. 활성 화합물의 투여량(들)은 예를 들면, 치료되는 대상체 또는 시료의 실체, 크기, 및 상태에 의존하며, 또한 경우에 따라, 조성물이 투여될 경로, 및 숙련가가, 활성 화합물이 퍼포린-2 활성화 경로에 대해 가지길 바라는 효과에 따라 변할 것이다. 예시적인 투여량은 대상체 또는 시료 체중 당 소분자 밀리그램 또는 마이크로그램(예를 들면, 킬로그램 당 약 1 마이크로그램 내지 킬로그램 당 약 500 밀리그램, 킬로그램 당 약 100 마이크로그램 내지 킬로그램 당 약 5 밀리그램, 또는 킬로그램 당 약 1 마이크로그램 내지 킬로그램 당 약 50 마이크로그램)을 포함한다. 활성제의 적절한 투여량은 조절될 발현 또는 활성과 관련하여 활성제의 효능에 의존함이 또한 이해된다. 이러한 적절한 투여량은 본원에 기술된 검정을 사용하여 측정할 수 있다. 이들 소분자 중 하나 이상이 동물(예를 들면, 사람)에게 투여되어 퍼포린-2의 활성을 조절하는 경우, 주치의, 수의사, 또는 연구자는 예를 들면, 우선 비교적 저 투여량에 이어 후속적으로 적절한 반응이 달성될 때까지 투여량을 증가시켜 처방할 수 있다. 또한, 특수한 동물 대상체에 대한 특수한 투여량 수준은 사용된 특수 화합물의 활성, 대상체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 배출 속도, 특정 약물 배합, 및 조절될 발현 또는 활성의 정도에 의존할 것이다.

퍼포린-2 활성의 조절인자의 치료학적 유효량은 동물 연구에 의해 결정될 수 있다. 동물 검정을 사용하는 경우, 용량은 동물 검정에서 효과적인 것으로 밝혀진 것과 유사한 표적 조직 농도를 제공하도록 투여된다. 치료 방법은 치료학적 유효량의 퍼포린-2 활성의 조절인자의 단일 투여 또는 치료학적 유효량의 퍼포린-2 활성의 조절인자의 다중 투여를 포함할 수 있는 것으로 인식된다.

구체적인 구현예에서, 치료학적 유효량의 MLN-4924는 50μg/kg 내지 100 mg/kg이다. 예를 들면, 일일 용량은 예를 들면, 약 50, 약 100, 약 150, 약 200, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 약 500, 약 600, 약 700, 약 800, 또는 약 900μg/kg일 수 있다. 또한, 일일 용량은 예를 들면, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 또는 약 100mg/kg일 수 있다.

i. 감염성 유기체

본원에 사용된 것으로서, "감염성 유기체" 또는 "감염성 질환 유기체"는 예를 들면, 세균, 바이러스, 진균, 기생충 및 원생생물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

다양한 감염성 유기체가 본원에 제공된 방법 및 조성물에 포함된다. 일부 구현예에서, 퍼포린-2 활성을 조절하는 화합물은 감염성 질환 유기체의 복제를 억제하고, 성장을 억제하며, 사멸을 유도한다. 구체적인 구현예에서, 감염성 질환 유기체는 세포내 또는 세포외 세균이다.

본원에 제공된 방법 및 조성물에 포함된 다양한 감염성 질환 유기체의 비-제한적 예는 다음을 포함한다:

심각한 사람 질환을 유발하는 특히 바람직한 세균은 그람 양성 유기체: 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus ), 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스(MRSA), 스타필로쿠쿠스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis) , 엔테로코쿠스 파에칼리스( Enterococcus faecalis) 및 이. 파에키움(E. faecium) , 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 (Streptococcus pneumoniae ) 및 그람 음성 유기체: 슈도모나스 아에루기노사 ( Pseudomonas aeruginosa ), 부르콜리디아 세파키아 ( Burkholdia cepacia), 크산토모나스 말토필라 ( Xanthomonas maltophila ), 에슈케리키아 콜라이( Escherichia coli) , 병원성대장균 이. 콜라이(E. coil)( EPEC ), 엔테로박터 아종( Enterobacter spp) , 클렙시엘라 뉴모니아( Klebsiella pneumonia), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis )를 포함하는 클라미디아 아종( Chlamydia spp.), 및 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium )을 포함하는 살모넬라 아종(Salmonella spp.)이다.

다른 바람직한 구현예에서, 세균은 그람 음성 세균이다.

예는 다음을 포함한다: 슈도모나스 아에루기노사( Pseudomonas aeruginosa) ; 부르콜리디아 세파시아( Burkholdia cepacia) ; 크산토모나스 말토필라(Xanthomonas maltophila) ; 에스케리키아 콜라이( Escherichia coli) ; 엔테로박터 아종(Enterobacter spp .); 클렙시엘라 뉴모니아에 ( Klebsiella pneumoniae ); 살모넬라 아종(Salmonella spp ).

본 발명은 또한 마이코박테리움 아종(Mycobacterium spp .), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) , 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium) , 예르시니아 슈도투베르쿨로시스( Yersinia pseudotuberculosis), 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica) ; 뉴모시스티스 카리니이( Pneumocystis carinii) , 트리파노소마 크루지( Trypanosoma cruzi) , 트리파노소마 브루세이( Trypanosoma brucei), 레이슈마니아 멕시카나( Leishmania mexicana) , 리스테리아 모노사이토게네스( Listeria monocytogenes) , 시겔라 플렉스네리( Shigella flexneri) , 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum) , 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus ), 수족구병 바이러스(foot-and-mouth disease virus) 및 크리티디아 파스키쿨라타 ( Crithidia fasciculata )에 의한 감염; 및 또한 골다공증, 자가면역성, 주혈흡충병, 말라리아, 종양 전이, 이염색질 이영양증(metachromatic leukodystrophy), 근육위축병 및 근위축(amytrophy)을 포함한다.

다른 예는 필룸 아피콤플렉사(phylum Apicomplexa) 또는 사르코마스티고포라(Sarcomastigophora), 트리파노소마(Trypanosoma), 플라스모디아(Plasmodia), 레이슈마니아(Leishmania), 바베시아(Babesia) 및 테일레리아(Theileria), 크립토스포리디아(Cryptosporidia), 사크로키스티다(Sacrocystida), 아메바(Amoeba), 콜키디아(Coccidia) 및 트리코모나디아(Trichomonadia)의 가축 및 사람 병원성 원생생물, 세포내 활성 기생충을 포함한다. 이들 화합물은 또한 예를 들면, 플라스모디움 팔키파룸(Plasmodium falciparum )에 의해 유발된 말라리아 트로피카 (Malaria tropica), 플라스모디움 비박스 (Plasmodium vivax ) 또는 플라스모디움 오발 레 (Plasmodium ovale )에 의해 유발된 말라리아 테르티아나 (Malaria tertiana ) 및 플라스모디움 말라리아에(Plasmodium malariae)에 의해 유발된 말라리아 쿼타 나(Malaria quartana )의 치료에 적합하다. 이들은 또한 톡소플라스마 곤디 이(Toxoplasma gondii )에 의해 유발된 톡소플라스모시스(Toxoplasmosis), 예를 들면, 이소스포라 벨리(Isospora belli)에 의해 유발된 콕시디오시스(Coccidiosis), 사르코시스티스 수이호미니스 ( Sarcocystis suihominis )에 의해 유발된 장 사르코스포리디오시스(intestinal Sarcosporidiosis), 엔타모에바 히스톨리티카 ( Entamoeba histolytica)에 의해 유발된 이질, 크립토스포리디움 파르붐 ( Cryptosporidium parvum)에 의해 유발된 크립토스포리디아증(Cryptosporidiosis), 트리파노소마 그 루지(Trypanosoma cruzi )에 의해 유발된 사가스병(Chagas' disease), 트리파노소마 브루케이 로데시엔세 ( Trypanosoma brucei rhodesiense ) 또는 감비엔세(gambiense)에 의해 유발된 수면증(sleeping sickness), 피하 및 내장 및 또한 다른 형태의 레이슈마니아증의 치료에 적합하다. 이들은 또한 테일레리아 파르바(Theileria parva)와 같은 가축 병원성 원생생물, 소 이스트 코스트 열(bovine East coast fever)을 유발하는 병원체, 트리파노소마 콘골렌세 콘골렌세 ( Trypanosoma congolense congolense ) 또는 트리파노소마 비박스 비막스 ( Trypanosoma vivax vivax), 트리파노소마 브루케이 브루케이 ( Trypanosoma brucei brucei ), 아프리카에서 나가나 소병(Nagana cattle disease)을 유발하는 병원체, 수우러병(Surra)을 유발하는 트리파노소마 브루케이 에반시 ( Trypanosoma brucei evansi ), 바베시아 비게미나(Babesia bigemina), 소 및 버팔로에서 텍사스 열(Texas fever)을 유발하는 병원체, 유럽 소 바베시아증(European bovine Babesiosis) 및 개, 고양이 및 양에서 베바시아증을 유발하는 병원체, 양, 소 및 돼지에서 사르코시스티오시스(Sarcocystiosis)를 유발하는 사르코시스티스 오비카니스 ( Sarcocystis ovicanis ) 및 오비펠리스 병원체(ovifelis pathogen), 크립토스포리디아, 소 및 조류에서 크립토스포리디아를 유발하는 병원체, 에이메리아(Eimeria) 및 이소스포라(Isospora) 종, 토끼, 소, 양, 염소, 돼지 및 조류, 특히 닭 및 칠면조에서 콕시디아증을 유발하는 병원체에 의해 감염된 동물의 치료에 적합하다. 리케차(Rickettsia)는 리케챠 펠리스(Rickettsia felis) , 리케차 프로와첼키이(Rickettsia prowazekii) , 리케챠 리케치이(Rickettsia rickettsii) , 리케챠 파이피(Rickettsia typhi) , 리케챠 코노리이(Rickettsia conorii ), 리케챠 아프리카에(Rickettsia africae )와 같은 종을 포함하며 발진티푸스, 리케치아두창, 부톤네즈열, 아프리카 진드기 바이트 열(African Tick Bite Fever), 록키산 열참진드기열(Rocky Mountain spotted fever), 오스트랄리아 진드기 티푸스(Australian Tick Typhus), 플린데르 섬 열참진드기열(Flinders Island Spotted Fever) 및 퀸즈랜드 진드기 티푸스(Queensland Tick Typhus)를 유발한다. 이들 질병의 치료에 있어서, 본 발명의 화합물은 다른 제제와 조합될 수 있다.

본 발명에 따른 사람 질환을 유발하거나 이와 관련된 특히 바람직한 진균은 칸디다 알비칸스 ( Candida albicans ), 히스토플라스마 네오포르만스 ( Histoplasma neoformans), 콕시디오이데스 이미티스 ( Coccidioides immitis ) 및 페니실리움 마르 네페이(Penicillium marneffei)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

B. 약제학적 조성물

본원에 개시된 퍼포린-2 활성을 조절하는 화합물은 투여에 적합한 약제학적 조성물내로 포함될 수 있다. 이러한 조성물은 전형적으로 퍼포린-2 활성을 조절하는 하나 이상의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 약제학적 조성물은 MLN-4924 또는 이의 활성화 유도체를 포함한다.

본원에 사용된 것으로서, 언어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 약제학적 조성물과 혼화성인 특정 및 모든 용매, 분산 매질, 피복제, 항세균성 및 항진균성 제제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함하도록 의도된다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 용도는 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 특정 통상의 매질 또는 제제가 활성 화합물과 혼화성인 한, 조성물 중 이의 용도가 고려된다. 보충적인 활성 화합물을 조성물내로 또한 포함시킬 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 예를 들면, 상이한 표적 분자에서 서로 독립적으로 작용할 수 있는 하나 이상의 제제를 함유할 수 있다. 일부 예에서, 본 발명의 하나 이상의 화합물을 함유하는, 본 발명의 약제학적 조성물은 소염제, 면역자극제, 화학치료제, 항세균제 등과 같은 다른 유용한 조성물과 함께 투여된다. 또한, 본 발명의 조성물은 위에서 기술된 바와 같은, 세포독성제, 세포정지제, 또는 알킬화제, 항-대사체, 유사분열 억제제 또는 세포독성 항생제와 같은 화학치료제와 함게 투여될 수 있다. 일반적으로, 이러한 조합물에서 사용하기 위한 공지된 치료제의 현재 이용가능한 용량형이 적합할 것이다.

조합 치료요법(또는 "공-치료요법")은 치료학적 조성물 및 이들 치료제의 동시-작용으로부터 유리한 효과를 제공하도록 의도된 구체적인 치료 요법의 일부로서 적어도 제2의 제제의 투여를 포함한다. 조합물의 유리한 효과는 치료학적 제제의 조합으로부터 초래되는 약동학적 또는 약력학적 동시작용을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 전형적으로 조합된 이들 치료학적 제제의 투여는 규정된 기간(일반적으로 선택된 조합에 따라 분, 시간, 일 또는 주)에 걸쳐 수행된다.

조합 치료요법은 본 발명의 조합물을 부수적으로 및 우연히 초래하는 독립된 단독치료요법 요법의 일부로서 이들 치료학적 제제들 중 2개 이상의 투여를 포함하도록 의도될 수 있으나, 일반적으로는 그렇지 않다. 조합 치료요법은 이들 치료학적 제제를 연속적인 방식으로, 즉, 각각의 치료제를 상이한 시간에 투여하는 투여, 및 또한 이들 치료학적 제제, 또는 적어도 2개의 치료학적 제제의 실질적으로 동시 방식으로의 투여를 포함하는 것으로 의도된다. 실질적으로 동시 투여는 예를 들면, 고정된 비의 각각의 치료학적 제제를 갖는 단일의 캅셀제를 대상체에게 투여하거나, 치료학적 제제 각각에 대한 단일의 캅셀제를 다수 투여함으로써 달성될 수 있다. 각각의 치료학적 제제의 연속적인 또는 실질적으로 동시 투여는 국소 경로, 경구 경로, 정맥내 경로, 근육내 경로, 및 점막 조직을 통한 직접적인 흡수를 포함하는 특정 적절한 경로에 의해서도 달성될 수 있다. 치료학적 제제는 동일한 경로 또는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 선택된 조합물의 제1의 치료학적 제제는 주사에 의해 투여될 수 있는 반면 조합물의 다른 치료학적 제제는 국소 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 의도된 투여 경로와 상용성이도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들면, 정맥내, 피내, 피하, 경구(예를 들면, 흡입), 경피(국소), 및 경점막을 포함한다. 또한, 치료학적 유효량의 약제학적 조성물을 치료가 요구되는 부위에 국소 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 이는 예를 들면, 수술 동안 국소 또는 부위 주입 또는 관류, 주사, 카테터(catheter), 좌제, 또는 이식체(예를 들면, 다공성, 비-다공성, 또는 시알라스틱(sialastic) 막 또는 섬유와 같은 막을 포함하는 젤라틴성 물질) 등에 의해 달성될 수 있다. 일 구현예에서, 투여는 치료될 감염 부위(또는 형성 부위)에 직접 주사하여 달성할 수 있다. 다른 구현예에서, 치료학적 유효량의 약제학적 조성물은 리포좀과 같은 소낭으로 전달된다(참고: 예를 들면, Langer, Science 249: 1527-33, 1990 및 Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein and Fidler (eds.), Liss, N.Y., pp. 353-65, 1989).

상기 설정된 활성 성분의 투여가 감염성 질환 유기체에 의한 감염 또는 소화관의 염증에 대한 효과적인 치료 요법인 대상체는 바람직하게는 사람이지만, 특정 동물도 가능하다. 따라서, 당해 분야의 통상의 기술자에게 용이하게 인식될 수 있는 바와 같이, 본원에 제공된 방법 및 약제학적 조성물은 특정 동물, 특히 포유동물, 및 고양이 또는 개과 대상체와 같은 애완 동물, 소과, 말과, 염소과, 양과, 및 돼지과 대상체와 같은 농장 동물, 야생 동물(야생 또는 동물원에 상관없이), 마우스, 랫트, 토끼, 염소, 양, 돼지, 개, 고양이 등과 같은 연구 동물, 즉 수의학용 연구 동물을 포함하나, 이에 한정되지 않는 동물에 대한 투여에 특히 적합하다.

여전히 다른 구현예에서, 약제학적 조성물의 치료학적 유효량은 조절된 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 하나의 예에서, 펌프를 사용할 수 있다(참고: 예를 들면, Langer, Science 249: 1527-33, 1990; Sefton, Crit. Rev. Biomed . Eng . 14:201-40, 1987; Buchwald et al., Surgery 88:507-16, 1980; Saudek et al., N. Engl. J. Med . 321 :574-79, 1989). 다른 예에서, 중합체 물질을 사용할 수 있다(참고: 예를 들면, Levy et al., Science 228: 190-92, 1985; During et al., Ann. Neurol. 25:351-56, 1989; Howard et al., J. Neurosurg. 71: 105-12, 1989). 랑거(Langer)(Science 249:1527-33, 1990)에 의해 논의된 것들과 같은 다른 조절된 방출 시스템을 또한 사용할 수 있다.

비경구, 경피, 또는 피하 적용을 위해 사용된 액제 또는 현탁제는 다음 성분들을 포함할 수 있다: 주사용수, 염수 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항세균제; 아스코르브산 또는 중황산나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이팅제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제 및 염화나트륨 또는 덱스트로즈와 같은 강직 조절제. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기로 조절할 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰플, 1회용 주사기, 또는 다중 투여 바이알 속에 봉입될 수 있다.

주사용으로 적합한 약제학적 조성물은 멸균 주사가능한 액제 또는 현탁제의 즉석 제조를 위한 멸균 수성 액제(수용성인 경우) 또는 분산제 및 멸균 산제를 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리학적 염수, 세균정지성 물, 크레모포르(Cremophor)

(제조원: BASF; 뉴저지주 파시패니 소재), 또는 인산염 완충된 염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균성이어야 하며 용이한 주사가능성이 존재하는 정도로 유동성이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에서 안정하여야만 하며 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야만 한다. 담체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들면, 레시틴과 같은 피복제의 사용, 분산제의 경우 필요한 크기의 유지, 및 표면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항세균 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장성 제제, 예를 들면, 당, 만니톨과 같은 폴리알코올, 염화나트륨을 조성물 속에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테라레이트 및 젤라틴을 조성물 속에 포함시킴으로써 달성할 수 있다.

멸균 주사가능한 액제는 요구되는 양의 활성 화합물을 필요한 경우, 상기 열거한 성분들 중 하나 또는 조합물과 함께 적절한 용매 속에 포함시킨 후, 여과된 멸균에 의해 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산제는 활성 화합물을 이염기성 분산 매질을 함유하는 멸균 비히클 및 상기 열거된 것들로부터의 요구되는 다른 성분들내로 포함시켜 제조한다. 멸균 주사가능한 액제의 제조용 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조이며, 이는 이의 앞서의 멸균-여과된 용액으로부터 특정 추가의 바람직한 성분 및 활성 성분의 분말을 생성한다.

경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 이들은 젤라틴 캅셀제내에 봉입되거나 정제내로 압착될 수 있다. 경구 치료학적 목적을 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 포함될 수 있으며 정제, 트로키제, 또는 캅셀제의 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강세척제로서 사용하기 위한 유체 담체를 사용하여 제조할 수 있으며, 여기서, 액체 담체 속의 화합물은 경구 적용되고 스위싱(swishing)되고 뱉거나 삼킬 수 있다. 약제학적으로 상용성인 결합제, 및/또는 보조 물질은 조성물의 일부로 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캅셀제, 트로키제 등은 다음 성분들 중 어느 하나, 또는 유사한 특성의 화합물; 미세결정성 셀룰로즈, 검 트라가칸트, 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분 또는 락토즈와 같은 부형제, 알긴산과 같은 붕해제, 프리모겔, 또는 옥수수 전분과 같은 붕해제; 스테아르산마그네슘 또는 스테로테스(sterotes)와 같은 윤활제; 콜로이드성 이산화규소와 같은 활주제; 슈크로즈 또는 사카린과 같은 감미제; 또는 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지 풍미와 같은 풍미제를 함유할 수 있다. 흡입에 의한 투여의 경우, 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 이산화탄소와 같은 가스를 포함하는 가압 용기 또는 디스펜서(dispenser), 또는 분무기로부터 에어로졸 분무의 형태로 전달된다.

전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단으로 달성할 수 있다. 경점막 또는 경피 투여의 경우, 투과될 담체에 적절한 침투제가 제형 속에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 경점막 투여, 세제, 담즙 염, 및 푸시딘산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌제의 사용을 통해 달성할 수 있다. 경피 투여의 경우, 활성 화합물은 당해 분야에 일반적으로 공지된 바와 같은 연고제, 고약, 겔제, 또는 크림제로 제형화된다. 화합물은 또한 좌제의 형태(예를 들면, 코코아 버터 및 다른 글리세라이드와 같은 통상의 좌제 기재) 또는 직장 전달을 위한 보유 관정제의 형태로 제조될 수 있다.

일 구현예에서, 활성 화합물은 이식물 및 미세봉입된 전달 시스템을 포함하는, 조절된 방출 제형과 같은, 신체로부터 신속한 제거에 대해 화합물을 보호할 담체와 함께 제조된다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산과 같은 생체 적합성 중합체를 사용할 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법은 당해 분야의 기술자에게 익숙할 것이다. 당해 물질은 또한 업자(Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc.)로부터 상업적으로 구입할 수 있다. 리포좀 현탁제(바이러스 항원에 대한 모노클로날 항체를 갖는 감염된 세포에 대해 표적화된 리포좀 포함)를 또한 약제학적으로 허용되는 담체로서 사용할 수 있다. 이들은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법, 예를 들면, 미국 특허 제4,522,811호에 기술된 방법에 따라 제조할 수 있다.

투여의 용이성 및 용량의 균일성을 위하여 용량 단위 형태로 경구 또는 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 바와 같은 용량 단위 형태는 필요한 약제학적 담체와 관련된 바람직한 치료학적 효과를 생산하기 위해 계산된 활성 화합물의 예정된 양을 함유하는 각각의 단위로 치료될 대상체에 대한 통합된 용량으로서 적합한 물리적으로 별개인 단위를 말한다. 본 발명의 용량 단위 형태에 대한 명세는 활성 화합물의 독특한 특성 및 달성될 특수한 치료학적 효과, 및 개인의 치료를 위한 이러한 활성 화합물을 화합하는 당해 분야의 고유한 제한에 의해 및 직접적으로 의존하여 허용된다.

일 구현예에서, 상기 방법은 본원에 제공된 퍼포린-2를 조절하기 위한 다양한 화합물 중 어느것 또는 본원에 제공된 퍼포린-2 활성화 경로의 다양한 성분들 중 어느 것을 투여하기 위한 바이러스의 사용을 포함한다. 투여는 재조합체 레트로바이러스, 재조합체 아데노-관련 바이러스, 재조합체 아데노바이러스, 및 재조합체 헤르페스 단성 바이러스(Herpes simplex viruse)과 같은, 본원에 제공된 표적 분자 또는 제제 중의 어느 것도 발현하는 바이러스의 사용에 의해 달성될 수 있다(참고: 예를 들면, Mulligan, Science 260:926 (1993), Rosenberg et al., Science 242:1575 (1988), LaSalle et al., Science 259:988 (1993), Wolff et al., Science 247:1465 (1990), Breakfield and Deluca, The New Biologist 3:203 (1991)).

본원에 제공된 다양한 표적 분자 또는 제제 중의 어느 것도 암호화하는 유전자는 예를 들면, 아데노 바이러스 벡터(예를 들면, Kass-Eisler et al., Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 90:11498 (1993), Kolls et al., Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 91:215 (1994), Li et al., Hum. Gene Ther . 4:403 (1993), Vincent et al., Nat. Genet. 5:130 (1993), 및 Zabner et al., Cell 75:207 (1993)), 아데노-관련 바이러스 벡터(Flotte et al., Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 90:10613 (1993)), 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki Forest Virus) 및 신드비스 바이러스(Sindbis Virus)와 같은 알파바이러스(Hertz and Huang, J. Vir . 66:857 (1992), Raju and Huang, J. Vir . 65:2501 (1991), 및 Xiong et al., Science 243: 1188 (1989)), 헤르페스 바이러스 벡터(예를 들면, 미국 특허 제4,769,331호, 제4,859,587호, 제5,288,641호 및 제5,328,688호), 파르보바이러스 벡터(Koering et al., Hum. Gene Therap. 5:457 (1994)), 폭스 바이러스 벡터(Ozaki et al., Biochem . Biophys . Res. Comm . 193:653 (1993), Panicali and Paoletti, Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 79:4927 (1982)), 카나리 폭스 바이러스(canary pox virus) 또는 박시니아 바이러스와 같은 폭스 바이러스(Fisher-Hoch et al., Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 86:317 (1989), 및 Flexner et al., Ann. N Y. Acad . Sci . 569:86 (1989)), 및 레트로바이러스(예를 들면, Baba et al., J. Neurosurg 79:729 (1993), Ram et al., Cancer Res. 53:83 (1993), Takamiya et al., J. Neurosci . Res 33:493 (1992), Vile and Hart, Cancer Res. 53:962 (1993), Vile and Hart, Cancer Res. 53:3860 (1993), 및 Anderson et al., 미국 특허 제5,399,346호)를 포함하는, 재조합체 바이러스 벡터를 사용하여 전달할 수 있다. 여러 구현예 내에서, 바이러스 벡터 자체, 또는 바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 입자를 아래에서 설명한 방법에 이용할 수 있다.

하나의 시스템의 예증으로서, 아데노바이러스, 이본쇄 DNA 바이러스는 이종 핵산 분자의 전달용의 잘-특성화된 유전자 전달 벡터이다(참고를 위해, 문헌, Becker et al., Meth . Cell Biol . 43:161 (1994); Douglas and Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)을 참고). 아데노바이러스 시스템은 (i) 비교적 거대한 DNA 삽입체를 수용하는 능력, (ii) 고-역가(high-titer)로 성장할 능력, (iii) 광범위한 포유동물 세포 유형을 감염시키는 능력, 및 (iv) 흔한, 조직 특이적이고, 조절가능한 프로모터를 포함하는 많은 상이한 프로모터와 함께 사용될 능력을 포함하는 수개의 장점을 제공한다. 또한, 아데노바이러스는 혈류내에서 안정하므로, 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다.

아데노바이러스 게놈의 부위가 결실된 아데노바이러스 벡터를 사용하여, 삽입체를 공-형질감염된 플라스미드와의 연결 또는 동종 재조합에 의해 바이러스 DNA내로 포함시킬 수 있다. 예시적인 시스템에서, 필수적인 E1 유전자는 바이러스 벡터로부터 결실되며, 당해 바이러스는, E1 유전자가 숙주 세포에 의해 제공되지 않는 한 복제하지 않을 것이다. 완전한 동물에게 정맥내 투여되는 경우, 아데노바이러스는 주로 간을 표적화한다. E1 유전자가 결실된 아데노바이러스 전달 시스템이 숙주 세포내에서 복제할 수 없다고 해도, 숙주의 조직은 암호화된 이종 단백질을 발현하고 가공할 것이다. 숙주 세포는 또한, 상응하는 유전자가 분비성 신호 서열을 포함하는 경우 이종 단백질을 분비할 것이다. 분비된 단백질은 이종 유전자를 발현하는 조직(예를 들면, 고도로 혈관화된 간)으로부터 순환기로 도입될 것이다.

더욱이, 바이러스 유전자의 다양한 결실을 함유하는 아데노바이러스 벡터는 벡터에 대한 면역 반응을 감소시키거나 제거하는데 사용될 수 있다. 이러한 아데노바이러스는 E1-결실되어 있으며, 또한, E2A 또는 E4의 결실을 함유한다(Lusky et al., J. Virol . 72:2022 (1998); Raper et al., Human Gene Therapy 9:671 (1998)). E2b의 결실은 또한 면역 반응을 감소시키는 것으로 보고되어 있다(Amalfitano et al., J. Virol . 72:926 (1998)). 전체 아데노바이러스 게놈을 결실시킴으로써, 이종 DNA의 매우 큰 삽입체를 수용할 수 있다. 모든 바이러스 게놈이 결실된, 소위 "거틀리스(gutless)" 아데노바이러스의 세대가 이종 DNA의 큰 삽입체를 삽입하는데 특히 유리하다(고찰을 위해, 참고: Yeh. and Perricaudet, FASEB J. 11:615 (1997)).

치료학적 유전자를 발현할 수 있는 재조합체 바이러스의 고 역가 스톡은 표준 방법을 사용하여 감염된 포유동물 세포로부터 수득할 수 있다. 예를 들면, 재조합체 헤르페스 단성 바이러스를 문헌(Brandt et al., J. Gen. Virol . 72:2043 (1991), Herold et al., J. Gen. Virol . 75:1211 (1994), Visalli and Brandt, Virology 185:419 (1991), Grau et al., Invest. Ophthalmol . Vis . Sci . 30:2474 (1989), Brandt et al., J. Virol . Meth . 36:209 (1992), 및 Brown and MacLean (eds.), HSV Virus Protocols (Humana Press 1997))에 기술된 바와 같이, 베로 세포(Vero cell) 속에서 제조할 수 있다.

재조합체 바이러스로 처리된 대상체가 사람인 경우, 치료요법은 바람직하게는 체세포 유전자 치료요법이다. 즉, 재조합체 바이러스를 사용한 사람의 바람직한 치료는 세포내로 사람 배아주의 일부를 형성할 수 있고 성공적인 세대로 이전시킬 수 있는 핵산 분자를 도입함(즉, 사람 배아주 유전자 치료요법)을 포함하지 않는다

약제학적 조성물은 투여용 지시사항과 함께 용기, 팩(pack), 또는 디스펜서(dispenser) 속에 포함될 수 있다.

C. 질병 상태의 확인, 분류 및/또는 진단 및/또는 예후 방법

일부 구현예에서, 생물학적 시료 속에서 퍼포린-2 활성의 조절은 질병 상태에 대한 생물학적 시료의 확인, 분류 및/또는 예후 및/또는 성향 또는 퍼포린-2의 조절인자에 대한 치료학적 반응의 경향성을 허용한다. 보다 특히, 퍼포린-2 활성에 있어서의 증가는 소화관 염증과 관련된 질환에 대한 생물학적 시료의 확인, 분류 및/또는 예후 및/또는 성향을 허용한다. 이러한 방법을 수행하기 위한 다양한 방법 및 조성물이 또한 본원의 어느 곳에 개시되어 있다.

일부 구현예에서, 퍼포린-2 활성에 있어서의 증가에 대해 대상체로부터의 생물학적 시료를 분석하는 방법이 제공된다. 당해 방법은 a) 대상체로부터의 생물학적 시료를 제공하는 단계; 및 b) 적절한 대조군과 비교하여 생물학적 시료가 퍼포린-2 활성에 있어서의 증가를 포함하는지를 결정하는 단계를 포함한다. 적절한 대조군과 비교하는 경우 퍼포린-2 활성에 있어서의 증가의 존재는 소화관 염증과 관련된 질환의 지표이다. 이러한 방법에서, 퍼포린-2 활성에 있어서의 증가의 존재는 소화관 염증, 보다 특히 퍼포린-2 활성을 억제하는 화합물에 대해 반응성인 소화관 염증과 관련된 질환의 지표이다. 일부 구현예에서, 소화관 염증과 관련된 질환은 결장염, 궤양성 결장염, 크론병 또는 염증성 창자병이다.

다른 구현예에서, 퍼포린-2 활성에 있어서의 증가는 퍼포린-2 활성화 경로의 성분의 활성화에 있어서의 조절을 포함한다. 퍼포린-2 활성화 경로의 성분은 유비퀴틴화 경로, 유비퀴틴, E1 유비퀴틴-활성화 효소, E2 유비퀴틴-접합 효소, E3 유비퀴틴 리가아제, 쿨린 환 유비퀴틴 리가아제(CRL), 네딜화 경로의 특정 성분, 이소펩티다제, 데유비퀴티나제, NEDD8, NEDD8 활성화 효소(NAE), 데아미다제, 데네딜라제, Ubc12, βTrcP, Skp1, 쿨린1, Vps34, RASA2, Ubc4, Rbx1, 프로테오좀, TEC, NEK9, Mapk12, 및/또는 퍼포린-2의 특정 성분도 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 생물학적 시료는 소화관, 위장관, 장, 림프절, 비장, 골수, 혈액, 또는 염증 부위로부터 기원한다.

일부 구현예에서, 퍼포린-2 활성의 억제제는 본원에 개시된 화합물들 중의 어느 것 또는 이의 활성 유도체일 수 있다. 구체적인 구현예에서, 퍼포린-2 활성을 억제하는 화합물은 MLN-4924 또는 이의 활성화 유도체를 포함한다.

D. 퍼포린 -2 경로 조절 화합물을 스크리닝하는 방법

퍼포린-2 활성화 경로의 조절 화합물을 확인하기 위한 방법(또한 본원에서 "스크리닝 검정"으로 언급됨)이 제공된다. 본원에 제공된 퍼포린-2 활성화 경로의 다양한 성분은 퍼포린-2 조절 화합물에 대해 스크리닝하기 위한 다양한 검정에서 사용될 수 있다.

일 구현예에서, 퍼포린-2 억제제를 스크리닝하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 퍼포린-2를 발현하는 세포를 후보물 화합물과 접촉시키고, 적절한 대조군 세포와 비교하며 후보물 화합물이 퍼포린-2의 활성을 감소시키는지를 측정함을 포함한다.

다른 구현예에서, 퍼포린-2를 활성화시키는 화합물에 대한 스크리닝 방법이 제공된다. 이러한 방법은 퍼포린-2를 발현하는 세포를 후보물 화합물과 접촉시키고, 후보물 화합물이 퍼포린-2의 활성을 증가시키는지를 측정함을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 상기 화합물은 퍼포린-2의 유비퀴틴화를 증가시킨다.

다양한 스크리닝 분석에서 사용된 후보물 화합물은 예를 들면, 폴리펩타이드, 펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 펩티도모사체, 소 분자, 항체, siRNA, miRNA, shRNA, 또는 다른 약물을 포함하는 특정 후보물 화합물도 포함할 수 있다. 이러한 후보물 화합물은 당해 분야에 공지된 조합 라이브러리 방법, 부분적으로 다룰 수 있는 평행 고체 상 또는 액체 상 라이브러리, 디콘볼루션(deconvolution)을 필요로 하는 합성 라이브러리 방법, "1개-비드 1개-화합물" 라이브러리 방법, 및 친화성 크로마토그래피 선택을 사용하는 합성 라이브러리 방법을 포함하는, 당해 분야에 공지된 조합 라이브러리 방법에서 다수의 시도중 어느 것을 사용하여 수득할 수 있다. 생물학적 라이브러리 시도는 펩타이드 라이브러리에 한정되지만, 다른 4개의 시도는 화합물의 펩타이드, 비펩타이드 올리고머, 또는 소분자 라이브러리에 적용가능하다(Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145).

분자 라이브러리의 합성을 위한 방법의 예는 당해 분야, 예를 들면, DeWitt et al. (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:6909; Erb et al. (1994) Proc . Natl. Acad . Sci . USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med . Chem . 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew . Chem. Int . Ed. Engl . 33:2059; Carell et al. (1994) Angew . Chem . Int . Ed. Engl. 33:2061; 및 Gallop et al. (1994) J. Med . Chem . 37:1233에서 찾을 수 있다.

화합물의 라이브러리는 용액(예를 들면, Houghten (1992) Bio/Techniques 13:412-421), 또는 비드(Lam (1991) Nature 354:82-84), 칩(Fodor (1993) Nature 364:555-556), 박테리아 (미국 특허 제5,223,409호), 포자 (미국 특허 제5,571,698호; 제5,403,484호; 및 제5,223,409호), 플라스미드(Cull et al. (1992) Proc . Natl. Acad . Sci . USA 89:1865-1869), 또는 파아지(Scott and Smith (1990) Science 249:386-390; Devlin (1990) Science 249:404-406; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl . Acad . Sci . USA 87:6378-6382; 및 Felici (1991) J. Mol . Biol . 222:301-310)으로 제공될 수 있다.

일부 구현예에서, 퍼포린-2 활성 조절 화합물에 대해 스크리닝하기 위한 검정은 퍼포린-2 활성화 경로의 성분의 폴리펩타이드 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 시험 화합물과 접촉하고 퍼포린-2 활성화 경로의 성분의 폴리펩타이드 또는 이의 생물학적 활성 변이체 또는 단편에 결합하는 시험 화합물이 능력을 측정함을 포함하는 세포-유리된 검정(cell-free assay)이다. 퍼포린-2 활성화 경로의 성분의 폴리펩타이드에 대한 시험 화합물의 결합은 직접 또는 간접적으로 측정할 수 있다. 추가의 구현예에서, 시험 또는 후보물 화합물은 퍼포린-2 활성화 경로의 성분의 폴리펩타이드에 구체적으로 결합하거나 선택적으로 결합한다.

다른 구현예에서, 분석은 퍼포린-2 활성화 경로의 성분의 폴리펩타이드를 포함하는 생물학적 시료를 후보물 화합물과 접촉시키고 퍼포린-2 활성화 경로의 성분의 폴리펩타이드의 활성을 조절하는 후보물 화합물의 능력을 측정함을 포함한다. 용어 "생물학적 시료"는 대상체, 및 대상체 내에 존재하는 조직, 세포, 및 유체로 부터 분리된 조직, 세포, 및 생물학적 유체를 포함하는 것으로 의도된다. 일부 구현예에서, 생물학적 시료는 림프절, 비장, 골수, 혈액, 또는 원시 종양으로부터 기원한다. 퍼포린-2 활성화 경로의 성분의 폴리펩타이드의 활성을 조절하는 후보물 화합물의 능력을 측정하는 것은 예를 들면, 퍼포린-2 활성을 측정하기 위해, 위에서 기술된 바와 같이 퍼포린-2를 활성화시키는 퍼포린-2 활성화 경로의 성분의 폴리펩타이드의 능력을 측정함으로써 달성할 수 있다.

또한, 본원에 기술된 바와 같은 치료를 위한 위에서 기술한 스크리닝 검정 및 이의 용도에 의해 확인된 신규 제제가 제공된다.

IV. 서열 동질성(Sequence Identity)

본원에 제공된 퍼포린-2 활성화 경로의 다양한 성분(즉, 유비퀴틴화 경로의 성분, 퍼포린-2, 또는 이의 특정 퍼포린-2-관련 분자)의 활성 변이체 및 단편을 본원에 제공된 방법에서 사용할 수 있다. 이러한 활성 변이체는 본원에 제공된 다양한 표적 분자 중 어느 것에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동질성을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 활성 변이체는 생물학적 활성을 보유함으로써 퍼포린-2 활성을 조절한다. 퍼포린-2 활성화 경로의 다양한 성분 중의 어느 것의 폴리펩타이드의 생물학적 활성 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 단편은 완전한 길이의 폴리펩타이드내에 존재하는 적어도 15, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450개의 연속된 아미노산, 또는 총 수 이하의 아미노산을 암호화할 것이다.

본원에 사용된 것으로서, 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열과 관련하여 "서열 동질성" 또는 "동질성"은 규정된 비교 윈도우(Comparison window)에 걸쳐 최대 상응성에 대해 정렬하는 경우 동일한 2개의 서열내 잔기를 참고하여 이룬다. 서열 동질성의 퍼센트가 단백질에 대한 참고로 사용되는 경우, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 흔히 상이한 것으로 인식되며, 여기서 아미노산 잔기는 유사한 화학적 특성(예를 들면, 전하 또는 소수성)을 지님으로써 분자의 작용적 특성을 변화시키지 않는 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 서열이 보존적 치환에 있어서 상이한 경우, 서열 동질성 퍼센트는 이러한 치환의 보존적 특성을 교정하기 위해 상향으로 조절될 수 있다. 이러한 보존적 치환에 의해 상이한 서열은 "서열 유사성" 또는 "유사성"으로 일컬어진다. 이러한 조절을 이루기 위한 수단은 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다. 전형적으로 이는 완전한 미스매치보다는 보존적인 치환을 점수매김으로서 서열 동질성의 퍼센트를 증가시킴을 포함한다. 따라서, 예를 들면, 동일한 아미노산이 1의 점수로 제공되고 비-보존적치환은 0의 점수로 제공되는 경우, 보존적 치환은 0과 1 사이의 점수로 제공된다. 보존적 치환의 점수매김은 예를 들면, 프로그램 PC/GENE(제조원: Intelligenetics, 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)에서 이행되는 바와 같이, 계산된다.

본원에 사용된 것으로서, "서열 동질성 퍼센트"는 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 측정된 값을 의미하며, 여기서 비교 윈도우내 폴리뉴클레오타이드 서열의 부위는 2개의 서열의 최적의 정렬을 위해 참조 서열(이는 첨가 또는 결실을 포함하지 않는다)에 비해 첨가 또는 결실(예, 간극)을 포함할 수 있다. 상기 퍼센트는, 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 서열 둘 다에 존재하는 위치의 수를 측정하여 매치된 위치의 수를 수득하고, 매치된 위치의 수를 비교 윈도우내 위치의 총 수로 나누며, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동질성의 퍼센트를 수득함으로써 계산한다.

달리 기술하지 않는 한, 본원에 제공된 서열 동질성/유사성 값은 다음의 매개변수를 사용하는 GAP 버젼 10을 사용하여 수득된 값을 말한다: 50의 GAP 중량 및 3의 길이 중량을 사용한 뉴클레오타이드 서열에 대한 동질성 % 및 유사성 %, 및 nwsgapdna.cmp 점수매김 매트릭스; 8의 GAP 중량 및 2의 길이 중량을 사용한 아미노산 서열에 대한 동질성 % 및 유사성 %, 및 BLOSUM62 점수매김 매트릭스; 또는 이의 특정 등가의 프로그램. "등가의 프로그램"은 문제의 2개 서열의 경우에도 GAP 버젼 10에 의해 생성된 상응하는 정렬과 비교하여 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 매치 및 동일한 서열 동질성 퍼센트를 갖는 정렬을 생성하는 의도된 특정 서열 비교 프로그램이다.

본원에 제공된 방법 및 조성물의 비-제한적인 예는 다음과 같다:

1. 퍼포린-2 활성을 억제하는 화합물의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하여, 소화관의 염증을 갖는 대상체를 치료하는 방법.

2. 상기 대상체가 결장염을 갖는, 구현예 1의 방법.

3. 상기 대상체가 크론병을 갖는, 구현예 1의 방법.

4. 상기 대상체가 염증성 창자병을 갖는, 구현예 1의 방법.

5. 상기 화합물이 소 분자, 폴리펩타이드, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 조합물을 포함하는, 구현예 1 내지 4 중의 어느 하나의 방법.

6. 퍼포린-2 활성을 억제하는 상기 화합물이 유비퀴틴화 경로의 적어도 하나의 성분의 억제제를 포함하는, 구현예 1 내지 5 중의 어느 하나의 방법.

7. 퍼포린-2 활성을 억제하는 상기 화합물이 E1 유비퀴틴-활성화 효소 억제제, E2 유비퀴틴-접합 효소 억제제, 또는 E3 유비퀴틴 리가아제 억제제를 포함하는, 구현예 6의 방법.

8. 퍼포린-2 활성을 억제하는 상기 화합물이 PYR-41, BAY 11-7082, 뉴틀린-3, JNJ 26854165, 탈리도미드, TAME, NSC- 207895, 또는 이의 활성화 유도체를 포함하는, 구현예 7의 방법.

9. 퍼포린-2 활성을 억제하는 상기 화합물이 쿨린 환 유비퀴틴 리가아제(CRL) 억제제를 포함하는, 구현예 6의 방법.

10. 퍼포린-2 활성을 억제하는 상기 화합물이 네딜화 경로의 억제제를 포함하는, 구현예 5의 방법.

11. 퍼포린-2 활성을 억제하는 상기 화합물이 NEDD8 -활성화 효소 (NAE) 억제제를 포함하는, 구현예 10의 방법.

12. 상기 NAE 억제제가 MLN-4924 또는 이의 활성화 유도체를 포함하는, 구현예 11의 방법.

13. 퍼포린-2 활성을 억제하는 상기 화합물이 데아미다제를 포함하는, 구현예 1 내지 5 중의 어느 하나의 방법.

14. 상기 데아미다제가 Cif를 포함하는, 구현예 13의 방법.

15. 퍼포린-2 활성을 억제하는 상기 화합물이 프로테오좀 억제제를 포함하는, 구현예 1 내지 4 중의 어느 하나의 방법.

16. 상기 프로테오좀 억제제가 보르테조미브, 살리노스포라미드 A, 카르필조미브, MLN9708, 델란조미브, 또는 이의 활성화 유도체를 포함하는, 구현예 15의 방법.

17. 퍼포린-2의 유비퀴틴화를 증가시키고, 이에 의해 퍼포린-2의 활성을 증가시키는 적어도 하나의 화합물의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 을 투여함을 포함하여, 퍼포린-2 활성을 증가시키는 방법.

18. 상기 적어도 하나의 화합물이 유비퀴틴화 경로의 적어도 하나의 성분의 활성 및/또는 발현을 증가시키는, 구현예 17의 방법.

19. 유비퀴틴화 경로의 적어도 하나의 성분이 E1 유비퀴틴-활성화 효소, E2 유비퀴틴-접합 효소 또는 E3 유비퀴틴 리가아제를 포함하는, 구현예 18의 방법.

20. 상기 적어도 하나의 화합물이 이소펩티다제 억제제를 포함하는, 구현예 17의 방법.

21. 상기 이소펩티다제 억제제가 유비퀴틴 이소펩티다제 억제제 II(F6) (3,5-비스((4-메틸페닐)메틸렌)-1,1-디옥사이드, 피페리딘-4-온), 유비퀴틴 이소펩티다제 억제제 I(G5) (3,5-비스((4-니트로페닐)메틸렌)-1,1-디옥사이드, 테트라하이드로-4H-티오피란-4-온) 또는 이의 활성화 유도체를 포함하는, 구현예 20의 방법.

22. 상기 적어도 하나의 화합물이 데유비퀴티나제 억제제를 포함하는, 구현예 17의 방법.

23. 상기 데유비퀴티나제 억제제가 PR-619, IU1, NSC 632839, P5091, p22077, WP1130, LDN-57444, TCID, b-AP15 또는 이의 활성화 유도체를 포함하는, 구현예 22의 방법.

24. 상기 적어도 하나의 화합물이 데네딜화 억제제를 포함하는, 구현예 17의 방법.

25. 상기 데네딜화 억제제가 PR-619, 유비퀴틴 이소펩티다제 억제제 II(F6) (3,5-비스((4-메틸페닐)메틸렌)-1,1-디옥사이드, 피페리딘-4-온), 유비퀴틴 이소펩티다제 억제제 I(G5) (3,5-비스((4-니트로페닐)메틸렌)-1,1-디옥사이드, 테트라하이드로-4H-티오피란-4-온) 또는 이의 활성화 유도체를 포함하는, 구현예 24의 방법.

26. 상기 적어도 하나의 화합물이 감염성 질환 유기체의 복제를 억제하거나,이의 성장을 억제하거나, 이의 사멸을 유도하는, 구현예 17 내지 구현예 25 중의 어느 하나의 방법.

27. 상기 감염성 질환 유기체가 세포내 세균인, 구현예 26의 방법.

28. 퍼포린-2의 활성을 증가시키는 적어도 하나의 화합물의 치료학적 유효량을 감염성 질환 유기체로 인하여 고통받는 대상체에게 투여함을 포함하며, 여기서 상기 화합물이 퍼포린-2의 유비퀴틴화를 증가시키는, 상기 대상체를 치료하는 방법.

29. 상기 적어도 하나의 화합물이 유비퀴틴화 경로의 적어도 하나의 성분의 활성 또는 발현을 증가시키는, 구현예 28의 방법.

본원에 사용된 것으로서, 단수 용어("a," "an" 및 "the")는, 내용이 달리 명확하게 나타내지 않는 한 다수의 지시대상을 포함한다. 유사하게, 단어 "또는"은, 내용이 달리 명확하게 나타내지 않는 한 "및"을 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 핵산 또는 폴리펩타이드에 대해 제공된 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자량 값은 근사치이며, 설명을 위해 제공된 것으로 이해되어야 한다.

본 기재내용의 주제는 다음의 비-제한적인 실시예에 의해 추가로 예증된다.

실시예

실시예 1:

퍼포린 -2: 세포내 세균을 제거하기 위한 신규의 중요한 효과기

퍼포린-2(P-2)는 물리적 공격에 의해 침입성 세균을 파괴하는 매우 중요한 고유의 효과기 분자이다. 중합시 P-2는 장벽 기능을 손상시키며 반응성 산소 및 질소 종 및 하이드롤라제의 도입을 허용하는 세균의 세포 벽/봉입체내에 거대한 구멍 및 공극의 집단을 형성하여 세균 파괴를 완료한다. P-2의 부재하에서, ROS, NO 및 라이소자임은 최소의 살세균 활성을 갖는다.

퍼포린-2는 시험되어 세포내 세균을 제거하기 위해 필요한 모든 대식세포 및 비-대식세포 사람 및 마우스 세포 및 세포주에서 보편적으로 발현되거나 유도된다.

퍼포린-2는 사람(호모)에 대한 해면동물(sponge, Porofera)로부터의 진화를 통해 고도로 보존된다.

마우스에서 퍼포린-2의 결핍성은 이들이 살모넬라 티피무리움에 의한 입위관(orogastric) 감염 또는 스타필로코쿠스 아우레우스에 의한 에피피하(epicutaneous) 감염 또는 질 클라미디아 감염에 대해 무방비하게 되도록 한다. P2-/- 마우스는 P-2+/+ 한배새끼에 의해 청소된 감염으로 죽는다.

마우스 및 사람에서 모든 비-식세포 및 식세포성 세포는 유도시 P-2를 발현한다.

P-2 녹-다운(knock-down) 또는 결핍성은 대식세포 및 PMN을 포함하는 세포를 무방비되도록 하며 세포를 사멸시키는 세포내 세균 복제를 초래하는 세포내 세균을 사멸시킬 수 없다.

사람 P-2가 마우스에서 생체내 및 시험관내에서 확립된 바와 같이 세균을 사멸시키는데 있어서 동일하게 중요한 것을 측정하는 것이 중요하다.

시험관내, 세포주내에서 사람 P-2는 마우스 세포주에서와 같은 동일한 중요한 중요성을 갖는다.

세균 감염을 위한 도입의 주요 포트(port)는 점막 표면 및 피부이다. 본 발명자들은 상처 치유 결손을 갖는 환자 및 염증성 창자병을 갖는 환자에서, 각질세포 및 정상 세포의 장 상피 세포내에서 P-2의 역할을 연구할 것이다.

세균은 P-2를 억제하거나, 차단하거나 회피하는 방법에 관여한다. 예를 들어, 클라미디아는 시험관내에서 점막 상피 세포(HeLa) 및 생체내 마우스에서 질 세포에서 P-2 mRNA 유도를 억제할 수 있다. 창자병원성 이. 콜라이내에서 Cif 플라스미드는 P-2-중합을 차단함으로써 P-2 사멸을 차단할 수 있다. 세균이 P-2를 차단하는 것을 중지시키기 위해, P-2가 사람 세포내에서 활성화되는 경로를 이해하여 세균 인자를 역작용시키는 약물을 개발하는 것이 필요하다.

퍼포린-2는, 비록 mRNA 수준에서의 이의 발현이 대식세포 발현된 유전자 1으로서 공지되어 있다고 해도 사람에서 연구되어 있지 않았다.

항-세균 방어에서 P-2의 독특한 기능의 발견은 완전한 면역성에 있어서 새로운 파라다임을 창조한다. 새로운 약물 및 방법이 어려운 세균 감염을 무산시키기 위한 P-2의 작용을 기준으로 개발될 것이다.

비록 단지 일시적이라고 해도, 사람 세포내에서 체류하기 시작하는 세균은 P-2를 피하거나 파괴하여야만 하는 경향이 있다. 이는, 항생제 내성 세균 감염을 포함하며 - 사람 세포내에서의 잔류로 인해 세균이 P-2의 능력을 중화시켜 이들을 사멸할 수 있어야 함을 포함한다. 감염을 유발하는 세균의 역작용 P-2-내성 인자는, P-2가 질병 유발 세균을 사멸하도록 하는 것으로 예측된다.

P-2를 견디는 세균 인자는 항생제-즉, 화학적 공격- 및 물리적 공격으로 공격하여 세균 봉입체내에 거대한 결손을 생성하는, P-2의 매우 상이한 특성으로 인하여 항생제 내성을 제공하는 인자로부터 구별될 것이다. 봉입체내에서 이러한 결손은 제2의 대사인자, 라이소자임, ROS 및 NO가 침투하여 세균 분해를 유발하도록 허용한다.

피부 및 점막에서 세균 감염시 퍼포린-2(P-2)의 역할

피부 및 점막은 세균 감염의 주요한 도입 부위이다. P-2의 구조 및 작용에 대한 본 연구자들의 새로운 데이타는, P-2가 대식세포 및 비-대식세포성 세포의 세포내 세균을 사멸시키고 제거하는 최초의 고유한 항-세균 효과기임을 나타낸다. 더욱이, P-2는 또한 병원체를 청소하는데 필수적인 것으로 여겨지는 염증 반응을 개시하는데 필수적이다. P-2 결핍성은 병원성 세균에 의한 피부 또는 점막의 감염 시 치사 결과와 관련되어 있다. 다른 한편, 부적절한 P-2 활성화 및 세균 사멸은 일부 자가-공격성 증상에 대해 관여할 수 있는 염증 및 사망율을 유발할 수 있다.

본 발명자들은 피부 및 장 점막에서의 특별한 강조와 함께 이러한 신규 효과기 경로 및 관련 질환을 최초로 연구할 것이다. 또한, 신규 정보는 세균 감염을 무산시키기 위한 새로운 약물 개발로의 시도에 사용될 것이다.

도입:

본 발명자들의 그룹은 세균 봉입체에서 거대 구멍(100Å 직경) 또는 "공극"의 집단을 생성하는 이의 '관통' 작용으로 인하여 퍼포린-2(P-2)로 지정된, 마우스 및 사람내 신규한 항-세균 효과기 단백질을 연구하여 왔다. 당해 관통 작용은 마이코박테리아를 포함하는 세포내 세균, 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 시겔라 플렉스네리(Shigella Flexneri) 및 오블리게이트(obligate intracellular Chlamydia trachomatis) 세포내 클라미디아 트라코마티스(데이타는 나타내지 않음)를 또한 포함하는 그람-양성 및 그람-음성 세균을 사멸하는데 필수적이다. 라이소자임을 포함하는 전통적인 살세균 효과기 ROS, NO 및 가수분해성 효소는 P-2의 살세균 활성을 강하게 향상시키지만 P-2의 부재하에서 세균의 세포내 복제를 차단할 수 없다.

복제하기 위하여, 세균은 조직 상피 세포 및 다른 비-대식세포성 세포를 흔히 침투한다. 중요하게도, 본 발명자들은, 모든 세포가 P-2를 발현할 수 있고 P-2-녹-다운이 세포내 세균 복제를 차단할 수 있는 세포의 능력을 폐지시킴을 발견하였다. 따라서, 퍼포린-2는 건강에 중요한 모든 비-대식세포 및 대식세포성 세포에서 마우스 및 사람내 우성 항-세균 효과기인 것으로 여겨진다.

피부 및 점막 표면은 병원성 세균에 대해 노출되어 이에 의해 흔히 침입되는 부위이다. 본 발명자의 그룹에 의해 생성된 P-2-결핍성 마우스에서의 연구는, 점막 및 피부 감염 모델에서 생체내 항세균 방어에 있어 P-2의 중요한 역할을 확인하였다. P-2 결핍성 마우스는, P-2가 충분한 한배새끼에 의해 청소되는 감염으로 죽었다.

진화 연구는, 퍼포린-2가 사람을 포함하는 포유동물에 대해 해면조직(Porifera)으로부터 고도로 보존된, mpeg1로 공지된, 오래된 항-세균 기전이다. 마우스 및 사람에서 본 발명자들의 데이타는, P-2가 사람 질병에서 상세한 연구를 필요로 하는 중요한 항-세균성 효과기 기전을 구성함을 나타낸다. 세균 병원체가 P-2를 방해하거나 침입하는 분자 메카이즘의 이해는 새로운 치료를 개발하여 항생제 내성 세균 감염을 박멸하는 방법을 가리킬 것이다.

1. 퍼포린-2의 구조 및 활성화 기전

퍼포린-2는 세포질내 막 소낭에 저장된 필수불가결한 전이막(transmembrane) 단백질이다. 퍼포린-2는 폴리-C9를 포함하는 보충물의 공극-형성 단백질에서 및 퍼포린-1에서 발견되는 막 공격 복합체 퍼포린 도메인(MACPF)을 함유한다. C9 및 퍼포린-1의 MACPF 도메인은 2개의 α-나선형 서열을 양쪽성 β-시트(sheet)를 재폴딩(refolding)하지만 세균 세포 벽내로 삽입되어 세균 봉입체의 구조를 파괴하는 집단화된 양쪽성 β배럴(barrel)을 형성함으로써 공극-형성에 관여한다. 본 발명자들은 전자 현미경에 의해 진핵 이층 막에서 사람 폴리-P-2 집단 및 세균 세포벽(MRSA 및 마이코박테리움 스메그마티스)에서 마우스 폴리-P-2를 영상화하고 폴리-P-2 공극의 내부 직경이 90 내지 100Å이며(도 1), 이는 상보체의 MAC-폴리 C9 복합체와 크기에 있어 유사하지만 폴리-P-1(160Å)보다 더 작음을 발견하였다.

P-2의 활성화: 위에서 언급한 바와 같이, P-2는 전이막 단백질이며; P-2의 N-말단 MACPF 도메인은 막 소낭의 관강내에 위치하고, C-말단은 짧은, 36개 아미노산 세포질성 도메인으로 종결한다(도 2).

세포의 감염 후 세균은 세균 함유 액포(BCV)로 공지된 엔도좀 또는 포식소체 막 소낭 속에 함유된다. P-2의 N-말단에서 MACPF의 위치 및 세포질성 막 소낭의 관강내로 지적하는 이의 배향은 MACPF 도메인의 중합 및 이의 세균성 봉입체내로의 삽입에 의해 세균 내부 소낭을 사멸시키는데 이상적이다. 이는 세포질 내에 저장된 P-2를 갖는 소낭의 BCV내로의 전좌 및 이와의 융합을 필요로 한다. 이는 실제로 도 3에 나타낸 바와 같은 경우이며, 여기서 GFP 표시된 P-2(P-2-GFP)는 감염 5분 내에 살모넬라 함유 소낭(SCV)에서 발견된다. 더욱이, P-2-GFP의 SCV로의 전좌는 P-2에 의한 사멸을 제안하는 DAPI 염색(백색으로 나타냄)에 의해 검출되는 바와 같이 살모넬라로부터의 DNA 방출과 관련된다(도 3).

P-2의 보존된 세포질성 도메인(도 2)은, 이것이 P-2-소낭 전좌 및 P-2 중합을 조절하는 단백질과 상호작용할 수 있음을 제안한다. P-2 2개의 하이브리드 스크린, P-2-공면역침전, P-2-GFP와의 SCV에 대한 공-전좌, 살세균 활성을 억제하기 위한 siRNA에 의한 녹 다운 및 화학적 억제제의 용도를 사용하여, 본 발명자들은 세포내 세균을 사멸시키는데 있어서 P-2 활성에 필수적인 단백질 중의 일부를 확인하였다(표 1).

2. P-2 활성화의 분자 기전:

a. 인산화: 도 2에 나타낸 P-2-사이토에서 Y 및 S의 병원성 보존을 기본으로 하여, 세린 및 타이로신의 인산화는 세균 세포내이입에 의해 개시된 제1의 활성화 신호 중의 하나인 것으로 여겨진다. 키나제 후보물은 TEC, NEK9 및 Mapk12이다.

b. 전좌: P-2-소낭(도 3 참고)의 세균 함유 소낭으로의 다음의 전좌는 P2의 세포질성 도메인과 상호작용하는 PI3-키나제 vps34 및 RASA2/GAP1M을 필요로 하는 경향이 있다.

c. P-2-유비퀴틴화, 중합 및 사멸: P-2-소낭 전좌 및 세균 함유 소낭과의 융합에 이어서, P-2는 소낭 내로 세균 엔벨로브를 중합시키고 공격하기 위해 활성화될 필요가 있다. 본 발명자들은, P-2가 프로테오좀을 공격하여 세포질성 도메인을 분해하는 라이신 집단(도 2)에서 유비퀴틸화하여 P-2가 중합하여 봉입체의 통합성을 파괴하는 양쪽성 β배럴을 형성하는 MACPF-서열의 삽입에 의해 세균을 공격할 수 있는 방식으로 정렬되도록 함을 제안한다(참고; 도 1). P-2 유비퀴틸화는 어댑터(adapter) Skp1-쿨린1-Rbx1-Ubc(4)(CRL1^βTrCP)(P-2 신호전달 복합체, 도 4)에 결합된 기질 인식 단위 βTrCP로 구성된 쿨린-환-유비퀴틴-리가아제(CRL)에 의해 수행된다. βTrCP 및 쿨린1은 P-2와 동시 면역침전된다(표 1).

모든 CRL은 NEDD8의 쿨린으로의 연결에 의한 활성화를 필요로 한다. NEDD8은 E1-리가아제, NEDD8 활성화 효소-1(NAE1)에 의해 활성화되어, NEDD8을 최종적으로 RBX1을 통해 유비퀴틴 리가아제(ubc4)를 활성화시켜 P-2를 유비퀴틸화하는 쿨린1을 네딜화하는 E2 리가아제 Ubc12로 형질감염시킨다. 본 발명자들은, 효모 2개의 하이브리드 분석에 의해 Ubc12가 P-2와 상호작용하여 P-2를 공면역침전시킴을 나타내었다. NEDD8은 NEDD8의 Gln40을 Glu40으로 탈아미드화하는 Cif-플라스미드에 의해 불활성화된다. NEDD 불활성화는 P-2에 의한 사멸로부터 세균을 보호한다. 도 5는 CRL 활성 및 P-2 활성화를 조절하는 네딜화 및 데네딜화의 경로를 나타낸다.

3. P-2 고갈 및 살세균 활성에서 ROS , NO 및 라이소자임의 역할.

유전적으로 P-2 결핍성 또는 siRNA P-2 고갈된 복강 대식세포는 에스. 티피무리움(S. typhimurium)을 사멸시킬 수 없으며 이들의 세포내 복제를 방지할 수 없다(도 6). 또한, 이들은 또한 MRSA 및 엠. 스메그마티스(M. smegmatis)를 조절할 수 없다(나타나 있지 않음). P-2 siRNA 녹 다운은 동일한 결과로 다른 세포에서 사용되었다: P-2가 녹다운되는 경우 세포는 HL60 또는 CMT93 직장 상피 세포(암종)에서 레티노산 유도에 의해 생성된, PMN에 대해 도 7에 나타낸 바와 같은 살모넬라, MRSA 또는 엠. 스메그마티스에 의한 세포내 감염을 조절할 수 없다. 내인성 P-2 이외의 P-2-GFP 형질감염에 의한 P-2 과발현은 항-세균 활성을 증가시킨다. 당해 데이타는, P-2가 세포내 세균성 감염을 조절하는데 절대적으로 필요하며 ROS, NO 및 라이소자임이 P-2 없이는 그렇게 할 수 없음을 제안하였다.

IFN-γ 활성화된, 티오글리콜레이트 유발된, 복강 대식세포내에서 세포내 살모넬라를 사멸시키는 이들의 능력에 있어서 ROS, NO 및 P-2의 분석(도 8)은, P-2의 부재하에서 ROS 및 NO가 함께 세포내 세균 복제를 유의적으로 지연시킬 수 없음을 나타낸다. P-2의 존재하에서, ROS는 감염의 처음 4시간 동안 살세균 활성에 기여한다. 4시간 후, P-2 살세균 활성에 기여하는 NO의 효과는 명백하게 된다(도 8). 당해 데이타는, ROS 및 NO가 이들의 완전한 살세균 활성에 대한 세균 봉입체에 대한 P-2 매개된 손상의 존재를 필요로 함을 명확하게 나타낸다. 본 발명자들은, ROS 및 NO의 민감성 부위로의 침투가 P-2 중합 및 집단화된 구멍 및 공극의 형성에 의해 세균 봉입체의 통합성에 대한 물리적 손상 후 가능하게 됨을 나타낸다고 해석하였다(도 1 참고). 본 발명자들은, 라이소자임이 또한 쥐 배아 섬유모세포(MEF)에서 P-2에 의한 봉입체의 사전 손상 후에만 살세균성임을 발견하였다. 당해 기전은 바이러스 감염된 또는 암 세포를 공격하여 그랜자임(granzyme)이 이들의 세포독성 활성을 매개하는 도입부를 제공하는 페포린-1과 유사하다.

본 발명자들의 데이타는, P-2-중합에 의해 맡겨진 세균 봉입체에 대한 손상이 다른 항세균 효과기의 살세균 효과를 매개하는데 필수적임을 나타낸다. 퍼포린-2의 부재하에서 3개의 주요 소그룹(그람-양성, -음성 및 산 패스트(acid fast))의 세포내 세균은 다른 살세균 매개인자의 존재에도 불구하고 더 이상 사멸되고 복제되지 않는다. 이들 데이타는, 항-세균 효과기 기전의 현재의 패러다임을 변경시킨다.

본 발명자들은 또한, 사람 세포가 P-2를 발현시키며 세균의 세포내 복제를 방지하는데 필요함을 확립하였다(도 7 상부 패널). 그러나, 사람 P-2의 활성화의 분자적 세부사항은 알려져 있지 않다.

4. 퍼포린-2의 발현 및 유도

P-2는 모든 계통의 내배엽, 외배엽, 중배엽 및 신경외배엽으로부터 시험한 모든 사람 및 마우스 세포내에서 편재하여 발현된다(표 2 및 3). P-2 발현 세포는 다형핵 호중성 과립세포(PMN), 대식세포, 수지 세포, 소교 세포 및 림프세포를 포함하는 식세포성 세포외에도, 근원세포, 신경원세포, 성상세포, 멜라닌세포, 췌장 췌선암 세포, 유로상피(uroepthelial) 세포, 장 원주 상피 세포, 경부 상피 세포, 각질세포, 내피 세포, 신장 상피 세포, 섬유모세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 비-식세포에 의한 P-2의 발현은 6 내지 8시간 내에 IFN α, β 또는 γ에 의해, 또는 세포내 세균 감염에 의해 신속하게 유도된다. PMN을 포함하는 식세포성 세포 및 각질세포내에서 P-2는 구성적으로 발현되어 IFN 및 LPS에 의해 추가로 상향-조절된다.

사람 P-2는 염색체 1 상에서 mpeg1(대식세포 발현된 유전자 l)에 의해 암호화된다. 전체 ORF 및 5' 내지 3' 해독되지 않은 서열의 일부는 ~4.5kb의 단일의 엑손, 5' 개시부를 암호화하는 제2의 짧은 엑손에 함유된다. 염색체 유전자자리(locus)는 ENCODE 계획에서 DNAse 과민감성 검정에 의해 분석된 125개 이상의 세포주에서 광범위하게 개방되어 있다. 전사체 개시부의 약 4kb 상부는 염색질 면역침전(CHIP) 검정에 의해 확인된 29개의 전사 인자와 관련된 al DNAse I 과민감성 집단이다. 칩 검정에서 가장 강한 신호는 Pu.1, BATF, NFκB, Oct-2, POU2F2, PAX5, RXRA, BCL11, IRF4, TCF12, BCL3 및 p300으로부터 온다. 이들 데이타는, 상기 유전자자리가 실제로 분석된 모든 세포에서 관찰되는 바와 같이 개방되어 신속하게 전사될 준비가 되어 있음을 제안한다.

5. P-2 결핍성 마우스의 세균 유발 에 의한 P-2의 생체내 분석

본 발명자들은 동종 유전자 대체에 의해 마우스에서 유전적 P-2 결핍성을 생성하였다. P-2 결핍성 세포, 예를 들어, 복강 대식세포 또는 배아 섬유모세포(MEF)를 유도한 P-2 결핍성은 세포내 세균 복제를 방지할 수 없다(참고: 도 6). 본 발명자들은 이들 질병 모델에서 P-2-/-를 유발하였다.

5.1 스타필로코쿠스 아우레우스(MRSA): P-2-/- 마우스는 정상적으로 발달하여 자란다. 이들의 세포 면역 레퍼토리의 조성물은 혈액 및 비장에서 모든 골수 및 림프 세포 집단을 포함하여 정상이며(데이타는 나타내지 않음), 이는 정상의 적응성 및 완전한 면역계를 나타내지만 P-2 효과기 단백질을 결여함을 나타낸다.

피내(epicutaneous) 마우스 피부 감염 모델에서 면도된 피부의 장벽은 대부분의 보호성 각막 층을 제거하는 테이프 스트리핑(tape stripping)에 의해 파괴된다. 이후에, 1cm²의 피부를 MRSA에 노출시키고 다음 24시간 동안 밴드처리하여 IL-6, TNF-α 및 IFN-γ 생산 및 마우스 β-방어 mBD3 및 mBD4의 생산에 의해 특성화된 국소 감염 및 염증을 유발한다.

P-2-/- 마우스를 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스(MRSA), 임상 분리체 CLP148로 피내 유발하였다. P-2-/- 마우스는 체중을 신속하게 감량하여 안락사(IACUC 요건)를 필요로 하며, 이는 이들이 죽을 수 있음을 제안한다. 대조적으로 P-2+/+ 및 P-2+/- 마우스는 체중을 손실하지 않으며 국소 피부 감염의 신호를 제외하고는 건강해보인다. 콜로니 형성 단위(cfu)를 분석하면, P-2 -/- 마우스는 감염 부위에서 피부에서만 높은 수를 갖는 P-2+/+ 마우스와는 대조적으로, 혈액, 신장, 비장 및 피부에서 높은 수를 갖는다. P-2+/- 마우스는 중간의 cfu 수를 갖는다. 당해 데이타는, 표피에서 각질세포에 의해 구성적으로 발현된 P-2가 스타필로코쿠스 및 아마도 다른 세균에 의한 감염 및 침입으로부터 보호에 중요할 수 있음을 제안한다.

5.1 살모넬라 티피무리움: 살모넬라 피피무리움은 사람 병원균이다. 본 발명자들은 P-2-/- 마우스 및 한배 새끼를 에스. 티피무리움(RL144, 예일대 갈란(Galan) 박사의 선물)로 확립된 프로토콜에 따른 입위관 경로에 의해 유발하였다. P-2-/- 마우스는 P-2+/+ 또는 P-2+/- 한배 새끼에 의해 청소되는 10⁵ 또는 10²개의 에스. 티피무리움에 의한 입위관 유발 후 죽는다(도 10). P-2+/+ 마우스가 아닌 P-2-/- 마우스는 세균 보급을 나타내는 고 수준의 세균혈증을 갖는다(도 11). 그러나, 놀랍게도 조직병리학에 의해, P-2-/-는 막창자/결장에서 염증의 특정 신호도 겨우 나타내는 반면 P-2+/+ 마우스는 PMN 및 단핵 침윤, 괴사, 고블릿 세포(goblet cell)의 손실, 점막하 부종 및 고-증식과 관련된 거대한 염증을 나타낸다(도 12). 당해 데이타는, P-2 매개된 살모넬라의 사멸이 청소에 기여하는 염증을 유발하는 다량의 병원체 관련 패턴(PAMPS)을 방출함을 나타낸다.

덱스트란 황산나트륨(DSS) 결장염: 염증성 창자병 모델에서 3% 덱스트란 황산나트륨(DSS)을 사용한 P-2+/+ 및 P-2-/-의 유발 시, 본 발명자들은, P-2-/- 마우스가 체중을 손실하지 않고 설사하지 않는 반면 P-2+/+ 한배새끼는 심각한 설사, 혈변 및 심각한 체중 감소를 갖는다(도 13 및 14)는 것을 발견하였다. 그러나, 혈액은 P-2+/+ 및 P-2-/- 마우스 둘 다에서 멸균성으로 남으며, 이는, 공생 세균이 염증을 유발하지만 침입성이 아님을 나타낸다. 조직병리학에서, P-2+/+ 마우스는 예측한 바와 같은 거대한 염증 및 괴사를 나타낸다. P-2-/-는 염증을 갖지 않는다(데이타는 나타내지 않음). 데이타는, DSS가 점막 층 및 상피 세포를 손상시켜 공생 세균과 세포막의 친밀한 접촉을 초래함을 제안한다. 세포 접촉은 세균의 세포내이입, P-2-활성화 및 염증 반응을 개시하는 공생 세균으로부터 PAMP의 방출에 의한 세균 사멸을 유발한다. P-2의 부재하에서, 공생자는 사멸하지 않으며, PAMP는 방출되지 않고 무 염증이 뒤따른다. 당해 데이타는, 맹장 및 결장내 정상의 점막 층 또는 상피 세포가 손상된 경우 염증성 창자병이 P-2에 의해 개시될 수 있음을 제안한다.

실시예 2

A. 퍼포린-2 발현의 증가:

사람 P-2는 염색체 1에서 mpeg1(대식세포 발현된 유전자 1)에 의해 암호화된다. 5' 내지 3' 해독되지 않은 서열의 전체 ORF 및 일부는 ~4.5kb의 단일의 엑손, 5' 개시부를 암호화하는 제2의 짧은 엑손에 함유된다. 염색체 유전자자리는 ENCODE 계획에서 DNAse 과민감성 검정에 의해 분석된 125개 이상의 세포주에서 광범위하게 개방되어 있다. 전사체 개시부의 약 4kb 상부는 염색체 면역침전(CHIP) 검정에 의해 확인된 29개의 전사 인자와 관련된 DNAse I 과민감성 집단이다. 칩 검정에서 가장 긴 신호는 Pu.1, BATF, NFκB, Oct-2, POU2F2, PAX5, RXRA, BCL11, IRF4, TCF12, BCL3 및 p300으로부터 온다. 이들 데이타는, 상기 유전자자리가 실제로 분석된 모든 세포에서 관찰되는 바와 같이 개방되어 신속하게 전사될 준비가 되어 있음을 제안한다.

P-2 전사를 증가시키는 특정 약물도 P-2 발현을 증가시키고 세균 청소를 향상시킬 것이다. P-2 유전자자리는 광범위하게 개방되어 있으므로 이는 상향으로 신장되어 P-2 전사를 측정하거나 P-2 리포터 검정 및 활성을 위한 스크린 약물을 설정한다.

B. P-2 활성의 증가

P-2 활성화는 소낭 함유 세균으로의 전좌 및 P-2-중합을 위한 활성화 및 P-2 인식 성분 βTrcP1/2을 사용한 쿨린-환-유비퀴틴-리가아제(CRL)에 의한 항-세균 공격을 필요로 한다.

전좌는 RASA2 및 vps34에 의해 매개된다. 중합 및 사멸을 위한 활성화는 P-2 유비퀴틸화에 필요한 쿨린-환-유비퀴틴-리가아제(CRL)의 복합체 및 P-2 세포질성 도메인의 프로테오좀 매개된 분해를 형성하기 위해 Ubc12, NEDD8, 쿨린-1, Rbx1, Skp1 및 βTrcP1/2를 포함하는 수개의 단백질을 필요로 한다.

CRL 성분의 발현 수준을 향상시키거나 이들의 복합체 형성을 향상시키거나 CRL 반감기를 증가시키는 특정 약물도 P-2 활성화를 증가시키는 것으로 예측된다.

CRL은 Cop-9 신호로솜(signalosome)에 의해 데네딜화되며; Csn5는 데네딜화에 관여하는 Cop-9의 활성 이소펩티다제 성분이다. 이소펩티다제 억제제를 사용한 Csn5의 억제는 P-2 유비퀴틸화 및 항-세균 활성에 요구되는 CRL의 반감기를 증가시키는 것으로 예측된다.

C. P-2 활성의 억제

P-2-/- 마우스에서 덱스트란-황산나트륨(DSS)-결장염 모델에서 본 발명자의 데이타는, P-2가 DSS 투여시 결장에서 염증의 유도에 필요함을 나타타낸다. 세균의 P-2 매개된 사멸은 쿨린1에 대한 NEDD8 연결의 억제제에 의해 억제될 수 있다. 본 발명자들은 MLN 4924를 사용한 NEDD8 활성화 효소 NAE1의 억제제를 시험하였고, 이것이 시험관내에서 P-2 매개된 세균 사멸을 차단함을 발견하였다(도 14c). 이는, P-2 억제제가 크론 결장염(Crohn's colitis), 궤양성 결장염 및 염증성 창자병의 치료에 유용할 것임을 나타낸다. 더욱이, P-2 억제는 P-2의 하향조절된 또는 과도한 활성에 의해 개시된 장애에 유리할 수 있다.

실시예 3

본 발명자들은, 지금까지 시험된 모든 대식세포에서 구성적으로 및 모든 비-대식세포 세포에서 유도적으로 발현된 퍼포린-2로 명명된 신규 효과기 경로를 확인하였다. 퍼포린-2는 병원성, 세포내 세균의 사멸에 필수적이다(3). 퍼포린-2-/- 마우스 배아 섬유모세포, 대식세포 및 다형백혈구 호중구(PMN)를 포함하는 유전적으로 퍼포린-2 결핍성 세포는 그람-양성(MRSA), 그람-음성(살모넬라, 장병원성 이. 콜라이 [EPEC]) 세균, 또는 마이코박테리아(엠. 스메그마티스, 엠. 투베르쿨로시스[Mtb] 및 엠. 아비움)에 의한 세포내 세균 감염을 청소할 수 없으며 세포내 클라미디아에를 인도한다(4). 유사하게, 퍼포린-2의 siRNA 녹 다운은 대식세포, PMN 및 비-대식세포내에서 세균의 사멸을 차단하고 세포내 복제를 가능하도록 한다(3). 세포내 세균의 생존 및 세포내 복제는, 세균이 퍼포린-2를 사일런싱시키고 피하는 것을 필요로 한다.

마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mtb)는 유의적인 과학적 유발를 나타내는 다수의 임상 중요성의 세포내 사람 병원체이다. 본 발명자들은, 퍼포린-2가 Mtb를 포함하는 세포내 마이코박테리아를 사멸할 수 있다는 명백한 논리를 가지고 있다. 그러나, 본 발명자들은 또한, 마이코박테리아가 강력한 퍼포린-2 내성 기전을 가지고 있다는 증거를 가지고 있다. 본 발명자들은 세포내 세균의 사멸을 위한 퍼포린-2 활성화에 있어서의 기본 단계를 정의하고 세균을 잠재적으로 차단하여 퍼포린-2 매개된 사멸을 피할 수 있은 단계를 확인하였다. 이들 단계는 (1) 퍼포린-2 유도 및 발현; (2) 액포를 함유하는 세균에 대한 퍼포린-2-전좌 및 (3) 퍼포린-2-중합, 공극 형성 및 세균 사멸에 대한 개시의 차단이다. 본 발명자들은 Mtb(및 대상물로서 엠. 아비움 및 엠. 스메그마티스에 의한)에 의해 억제된 퍼포린-2 발현 및/또는 활성화의 단계를 확인하고 퍼포린-2 억제에 관여하는 Mtb 유전자를 확인하는 것을 개시할 것이다. 이들 연구는 결핵의 파괴적인 질병을 차단하는데 효과적인 방법을 개발하기 위한 새로운 과학적 통찰력을 수득하고 지적할 것이다.

퍼포린-2는, 본 발명자들이 마우스 및 사람에서 연구해온 전적으로 신규한 항-세균 경로이다. 퍼포린-2는 공통 MACPF-도메인 함유 단백질이며(5-7), 이것이 CTL의 폴리-퍼포린-1 및 폴리-C9 성분과 유사한 MACPF 도메인 (2)을 통해 공극-형성으로 사멸시킬 수 있음을 제안하며, 상기 성분 둘 다는 본 발명자들이 확인하여 수년 전에 공극-형성 단백질로 특성화하였다(8, 9). 본 발명자들은, 전자 현미경에 의해 퍼포린-2가 또한 공극 형성 단백질이며 이것이 사멸된 세포내 MRSA 및 마이코박테리움 스메그마티스의 표면적 중 6% 이상에서 연결된 공극의 거대 집단을 형성하고 이것이 활성화된 대식세포의 세포내 복제를 유의적으로 방해함을 밝혔다. 본 발명자들은 또한, PMN 대식세포 및 소교세포를 포함하는 시험한 모든 대식세포성 세포 및 각질세포가 퍼포린-2를 구성적으로 발현함을 입증하였다. 더욱이, 마우스 및 사람에서 시험한 모든 비-대식세포성 세포(표 2 및 3 참고)는 IFN-α, β 또는 γ에 의해 또는 미생물 생성물에 의해 유도되어 퍼포린-2를 발현할 수 있다. 퍼포린-2가 녹다운되거나 유전적으로 결실된 경우 세포내 세균은 신속하에 복제되어 침입한 세포를 사멸시킨다. 당해 기술은 IFN 치료 후에도 PMN 및 비-대식세포를 포함하는 대식세포에 대해 사실이다. 당해 기술은 또한 침입성 세균의 유형과 상관없이 사실이다. 본 발명자들은 그람 양성 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스(MRSA), 리스테리아 모노사이토게네스, 그람 음성 살모넬라 티피무리움, 장병원성 이. 콜라이, 예르시니아 슈도투베르쿨로시스, 시겔라 플렉스네리, Mtb, 엠. 스메그마티스 및 엠, 아비움의 사멸 및 불가피한 세포내 클라미디아에 대한 퍼포린-2에 있어서의 이러한 의존성을 입증하였다(4). 당해 데이타는, 퍼포린-2가 세포내 세균에 대해 활성인 우세한 살세균 효과기임을 나타낸다. 더욱이, 라이소자임을 포함하는 반응성 산소 및 질소 종 및 하이드롤라제는 이들의 완전한 살세균력에 대한 퍼포린-2의 활성을 손상시키는 막과 함께 상승적이나 이를 필요로 한다.

실험적 시도 :

하기 추가로 기술된 본 발명자들의 앞서의 데이타(3, 4) 및 예비 데이타는, 병원성 세포내 세균의 사멸 및 제거가 퍼포린-2의 작용을 필요로 함을 나타낸다. 또한, ROS, NO, 및 라이소자임의 살세균 작용은 세균 표면에서 퍼포린-2에 의해 생성된 집단화된 공극의 집단에 의존하거나 이에 의해 크게 향상된다. 따라서, 세포내에서 복제하는 병원성 세균은 퍼포린-2를 차단하거나, 억제하거나 피하는 발견을 발견하여야 한다. 퍼포린-2 매개된 사멸로부터의 회피는 세균 봉입체의 표면의 물리적 손상(천공)에 대한 이들의 작용에 크게 의존하는 ROS, NO 및 라이소자임으로부터의 보호를 동시에 제공한다(3).

마이코박테리움 투베르쿨로시스는 전세계적으로 매년 약 110만명의 사망을 유발하는 주요 병원체이다. 감염시 마이코박테리아는 대식세포에 의해 식균되지만 세포내적으로 복제하여 사망을 유발한다. 본 발명자들은, Mtb가 퍼포린-2을 억제하거나, 피하거나 차단함을 추정하고; 본 발명자들은, 퍼포린-2 회피에 대한 마이코박테리아 전략에 대응하는 것이 당해 세균의 청소를 허용할 것이라고 추가로 추정한다. 본 발명자들은, 세포내 마이코박테리아가 퍼포린-2를 방해하거나 피하는 방법을 측정할 것이다. 주요 초점은 주요 병원체인 Mtb이다. 그러나, 본 발명자들은 또한 대응물(실험의 용이성을 위해) 및 비교용(Mtb의 특수화를 관찰하기 위해)로서 엠. 아비움 및 엠. 스메그마티스를 연구할 것이다.

실험 전략: 세포내 세균의 퍼포린-2 매개된 사멸은 세균 발달에 있어서 퍼포린-2에 의한 표적화 및 전좌 및 궁극적으로 집단화된 공극 형성에 의한 사멸을 포함한다. 사망을 피하기 위해 세균은 활성화 캐스케이드(cascade)의 특정 단계에서도 퍼포린-2를 차단하는 선택사항이다. 본 발명자들은 역 전략을 창안하기 전에, 우선 어느 단계가 차단되는지를 측정하여야 한다. 이는 Mtb로 달성되어 엠. 스메그마티스 및 아비움과 비교될 것이다.

I. 마이코박테리아가 퍼포린-2 발현을 방해하는 분자 기전은 무엇인가?

많은 병원성 세균은 비-대식세포성 세포를 우선적으로 침범한다. 예를 들면, 클라미디아에는 상피 세포에서 생산적인 감염을 확립하지만 대식세포에서는 그럴 수 없다. 살모넬라, 장병원성 이. 콜라이(EPEC), 예르시니아 슈도투베르쿨로시스는 원주 상피 세포를 공격한다. 마이코박테리아는 대식세포 및 비-대식세포성 세포를 침범하여 복제한다. MRSA는 각질세포를 공격한다. 발표된 데이타는, 모든 세포가 잠재적으로 세포에 의해 침범될 수 있으며 세균 거부를 위한 기전을 가질 수 있음을 나타낸다. 본 발명자들의 데이타는, 퍼포린-2가 모든 세포에 의해 사용된 고유의 살세균 효과기 분자일 수 있음을 제안한다.

본 발명자들은 25개의 마우스 및 사람 세포주 및 생체외 세포를 시험하여 IFNα,β 또는 γ 또는 세포내 세균 감염에 의한 구성적 또는 유도성 퍼포린-2 발현을 측정하였다. 당해 결과는, 각질 세포 및 PMN, 대식세포 및 미세아교세포를 포함하는 대식세포성 세포가 퍼포린-2를 구성적으로 발현함을 나타낸다. 시험한 모든 비-대식세포성 세포는 IFN α,β 또는 γ 유도시 또는 세포내 감염에 의해 퍼포린-2를 발현함을 나타낸다(표 2 및 3 및 도 15)(3). 따라서 세포내 잔류를 확립하는 세균은 퍼포린-2를 중화시켜 사멸되는 것은 피한다. 본 발명자들은 클라미디아에가 상피 세포내에서 퍼포린-2 유도를 활성적으로 억제함을 이미 밝혔다. 본 발명자들은, 관여하는 클라미디아 유전자를 확인하는 공정 중에 있다(4). 도 16은, 살모넬라 티피무리움을 포함하는 많은 병원성 세균이 MEF에서 퍼포린-2 mRNA 유도를 억제함을 나타낸다. 다른 한편, 열 사멸된 살모넬라 및 비-병원성 이. 콜라이는 IFN-γ와 유사한 정도로 퍼포린-2를 유도하며 이는, 억제가 활성 공정임을 제안한다. EPEC 및 예르시니아 슈도투베르쿨로시스는 또한 Cif(사이클 억제성 인자, (19, 20))를 사용하여 퍼포린-2-사멸을 억제한다(도 5). 마이코박테리아가 퍼포린-2를 중화시키고/시키거나 이의 발현을 억제하는 방법은 알려져 있지 않으며 본 연구의 대단히 중요한 목표이다.

비-병원성 이. 콜라이에 의한 MEF의 세포내 감염은 고 수준의 퍼포린-2 RNA를 유도한다(도 16 및 도 17 상부 패널). 비교에 의해 세포내. 엠. 스메그마티스는 이. 콜라이와 비교하여 퍼포린-2의 불량한 유도인자이다(도 17). 엠. 스메그마티스는 충분한 mRNA 수준 이전에, 감염 후 처음 12시간 동안 세포내적으로 복제한다. 후속적으로, 스메그마티스가 사멸되며, 동시에 충분한 퍼포린-2 mRNA의 수준이 증가한다(도 17, 하부 패널, 빈 사각형). 대조적으로, 퍼포린-2가 MEF내에서 밤새 IFN-γ와 함께 유도되는 경우 MEF는 즉각적으로 엠. 스메그마티스를 처음 10시간 동안 사멸시킨다( 도 17, 하부 패널, 채워진 원). 퍼포린-2가 IFN-γ 유도된 상피 세포(CMT93)내에서 siRNA로 녹 다운되는 경우, 엠. 스메그마티스는 복제하여 6시간 후 숙주 세포를 사멸시킨다(도 18). 퍼포린-2의 부재하에서(스크램블(scramble) 대조군) CMT93은 엠. 스메그마티스를 완전히 사멸시키기 위하여 24시간을 필요로 한다.

퍼포린-2 상향조절 외에도, 인터페론은 NO 생산을 위한 살세균 유전자 iNOS(21, 22) 및 ROS 생산을 위한 NOX 계열의 유전자(23)를 포함하는, 감염에 대한 고유의 및 적응성 면역 반응에 중요한 수백개의 유전자를 유도시킨다. 그러나, 본 발명자들의 퍼포린-2-녹-다운 데이타는, 퍼포린-2가 완전한 살세균 활성에 요구됨을 결론적으로 밝히고 있다. 본 발명자들은 유전적으로 퍼포린-2 결핍성(P-2^-/-) 세포 및 생체내 퍼포린-2^-/- 마우스에서 시험관내에서 세포내 이러한 결론에 대한 추가의 지지를 나타낸다.

본 발명자들은 퍼포린-2 결핍성 마우스를 창조하여 살세균 활성 퍼포린-2+/+, +/- 및 -/- 대식세포 및 PMN을 마이코박테리아 및 다른 병원성 세균에 대해 비교하였다. 도 19에 나타낸 당해 데이타는 퍼포린-2-/- 세포의 극도로 강력한 표현형을 나타낸다. 엠. 투베르쿨로시스(CDC1551)는 mCherry 표지된 세균으로 측정된 것으로서 +/+ 골수 기원한 대식세포(p=0.0002, t-시험)와 비교하여 IFN-γ 활성화된, 퍼포린-2-/-를 유의적으로 보다 신속하게 복제한다(도 19a). 유사하게, 엠. 아비움은 +/+ PMN보다 퍼포린-2-/-에서 유의적으로 보다 신속하게 복제한다(p=0.046, t-시험)(도 19b). 이 데이타는, 퍼포린-2가 세포내 복제로 Mtb 또는 엠. 아비움을 강력하게 방해함을 나타낸다. 퍼포린-2가 RAW-대식세포의 형질감염으로 과발현되는 경우, 엠. 아비움 복제는 완전히 차단되며 세균은 사멸된다(데이타는 나타내지 않음). 퍼포린-2 결핍성에 대한 강력한 표현형이 또한 엠, 스메그마티스, MRSA USA300(CL148, 마이아미대 엘. 피아노(L. Piano) 박사의 기부물) 및 살모넬라 티피무리움(RL144, 예일대 갈란(Galan) 박사의 기부물)에 대해 도 19c에서 관찰된다. 본 발명자들의 데이타는, Mtb가 퍼포린-2 매개된 사멸을 약화시키는 강력한 기전을 가짐을 제안한다. 이는 퍼포린-2 발현, 국재화 또는 활성의 어느 단계가 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mtb)에 의해 억제되고 마이코박테리아 유전자 중 어느 것이 주요 퍼포린-2 내성 및 발병력 유전자인지를 측정하는 전체적인 목표이다.

A. 마이코박테리아에 의한 퍼포린 -2 유도의 억제

1. 비-대식세포 및 대식세포성 세포에서 P-2 발현의 Mtb - 매개된 억제와 관련된 숙주 경로의 설명

실험적 설계. 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mtb)는 대식세포 및 상피 세포, 섬유세포, 지방세포, 및 내피세포(24-26)를 포함하는 비-대식세포성 세포 둘 다에서 감염하여 폐내에서 발견되며; 간엽성 줄기 세포는 틈새(niche)를 제공한다(27). 본 발명자들은, 우선 마이코박테리아 감염이 MEF 및 상피 세포(CMT93)에서 퍼포린-2를 가져오는 인터페론- 또는 미생물-매개된 신호 변환 경로를 방해하는 방법을 확립한다. 본 발명자들은, 엠. 스메그마티스, 엠. 아비움 및 Mtb를 1 및 5의 MOI에서 비교할 것이다. smyc '::mCherry, smyc '::GFP 및 smyc '::ffluc로 표시된(tagged) Mtb CDC 1551 균주를 플레이트 판독기, FACS 캘리버(caliber) 및 공촛점 현미경에 의한 분석에 사용하였다. 본 발명자들은 24웰 플레이트 속에서 비-대식세포성 세포 또는 대식세포의 융합성 층을 사용하여 모든 세균이 식균작용화(phago-cytosed)되도록 할 것이며, 이는 플레이팅 및 cfu에 의한 감염 후 12 내지 16시간째에 상층액을 시험하여 입증할 것이다. mRNA 분석용 시료를 0, 24 및 72 시간째에 먼저 취할 것이다. 시간은 필요한 경우 변경할 것이다. 모든 이들 접근에 대한 본 발명자들의 판독은 전체배양물 RNA 시료 속에서 P-2 메시지 수준의 척도로서 cDNA의 퍼포린-2 qPCR일 것이다. 본 발명자들은 모의(mock) 또는 마이코박테리아 감염된 세포를 재조합체 IFNα, IFNβ, 또는 IFNγ, 이의 조합물로 처리하는 일련의 대조군 실험, 또는 열 처리된 대조군을 수행할 것이다. 대조군으로서, 본 발명자들은 마이코박테리아 감염에 반응하는 다른 숙주 세포 인자의 발현을 실험할 것이다. 예를 들면, 대식세포의 엠. 아비움 감염은 Irf-1 및 IFN-γRα를 포함하는 IFN-γ 유도성 유전자의 발현을 감소시키고 IFN-γ 유도된 STAT1, JAk 1 및 2 포스포릴화를 방해한다(28). 이들 실험은, Mtb가 광범위한 경로로 방해하는지 및 당해 효과가 일반적인지 또는 퍼포린-2에 특이적인지를 확립할 것이다. 본 발명자들은 이후에, 감염 시 이전 자극(예를 들면, IFN)으로 처리함으로써 관찰된 효과에 대한 일시적인 요건을 시험하고 퍼포린-2 발현이 여전히 억제되는지를 질문할 것이다. 본 발명자들은 또한 새로운(de novo) 마이코박테리아 단백질 합성의 항생제-유도된 합성을 포함시켜 감염 주기에서 퍼포린-2 발현이 억제되는지의 여부 및 시기를 확립할 것이다.

본 발명자들은, 마이코박테리아가 분리될 수 있지만, 각각의 경로(I 또는 II형-유도성 전사 인자의 상부)를 통해 퍼포린-2 유도성 발현을 억제할 수 있는 풍부한 인자일 수 있는 가능성을 배제할 수 없다. 본 발명자들은 관련된 전사 인자의 잠재적인 역할을 구체적으로 시험함으로써 시작할 것이다. 본 발명자들은 시판되는 항체 및 활성 시험을 사용하여 STAT, IRF1, 3, 4, 및 7과 같은 전사 인자가 P-2 억제와 매치되는 역학을 갖는 마이코박테리아 감염에 의해 억제되는지를 시험할 것이다.

상보성 시도로서, 본 발명자들은 마이코박테리아-반응성 퍼포린-2 리포터 플라스미드를 작제함으로써 비-대식세포성 세포에서 퍼포린-2 발현에 대한 요건을 평가할 것이다. 염색체 퍼포린-2 유전자자리는 ENCODE 계획에 의한 DNAse 과민감성 검정에 의해 분석된 것으로서 125개 이상의 세포 및 세포주에서 전사에 대해 개방되어 있다. 전사 개시부의 약 4kb 상부는 크로마틴 면역침전(CHIP) 검정에 의해 확인된 29개의 전사 인자와 관련된 al DNAse I 과민감성 집단이다. 칩 검정에서 가장 강력한 신호는 Pu.1, BATF, NFκB, Oct-2, POU2F2, PAX5, RXRA, BCL11, IRF4, TCF12, BCL3 및 p300으로부터 온다. 이들 데이타는, 유전자자리가 개방되어 있으며 적절한 신호 전달시 신속하게 전사될 준비가 되어 있음을 제안한다. 이러한 발견은, 실제로 모든 세포가 IFNs(및 세균 감염, 도 16)에 의해 신속하게 유도되어 퍼포린-2를 전사할 수 있음을 나타내는 표 2 및 3에서의 데이타와 일치한다. 프로모터 및 P-2 암호화 서열을 함유하는 146111bp BAC 작제물을 생성시키고 진핵 세포내에서 발현시켰다(데이타는 나타내지 않음). 본 발명자들은 4.5kb 영역(퍼포린-2 개시부의 약 450nt 하부로부터 4kb 상부까지의 범위(spanning))의 프로모터가 거의 없는 진핵세포 발현 벡터내로의 PCR을 이용한 이동으로 시작할 것이다. 수득되는 작제물은 통상의 PCR-매개된 클로닝 과정을 통해 용이하게 조작할 수 있다. 이후에, 본 발명자들은 퍼포린-2 암호화 서열을 루시퍼라제 리포터 작제물로 대체하여 프로모터 활성의 적량적인 평가가 가능하도록 할 것이다. 수득되는 작제물은 MEF 세포 및 대식세포내로 형질감염시킬 것이고 본 발명자들은, 클로닝된 영역이 인터페론-처리된 MEF 세포 및 대식세포에서 마이코박테리아-억제성 발현(Mycobacteria-repressible expression)에 적용시킴을 확인할 것이다. 이들 매개변수가 확립되면, 본 발명자들은, 어느 인자가 상피 세포 및 대식세포에서 퍼포린-2 발현에 기여하는지를 확립하기 위해 에측된 전사 인자 결합 부위의 전신성 결실을 개시할 것이다. 본 발명자들은 DNAse 고민감성 부위의 제거를 우선적으로 처리할 것이다. 이들이 포함되지 않는 경우, 본 발명자들은 일련의 거대 결실에 이어 보다 작은 결실을 만들어 관찰된 퍼포린-2 발현 패턴에 관여하는 성분을 협소화시킬 것이다. 각각의 DNA 성분과 전사체의 마이코박테리아-특이적인 억제사이의 직접적인 연결을 확인하기 위해, 본 발명자들은 열 사멸된 세균으로 감염시킬 것이다.

2. Mtb 및 아비움은 이미 유도된 퍼포린 -2를 억제하는가?

당해 실험은 2개의 버젼으로 수행할 것이다: (a) 본 발명자들은 RAW 세포 및 퍼포린-2 단백질을 구성적으로 발현하는 골수 기원한 대식세포를 사용하여 이들을 Mtb, 엠. 스메그마티스 또는 엠. 아비움(MOI 1, 5 및 10)으로 감염시키고 변성된 퍼포린-2를 검출하지만 천연의 것은 검출하지 않는 시판되는(Abcam) 항-펩타이드 항체를 사용하는 웨스턴 블랏에서 퍼포린-2 단백질 발현을 측정할 것이다. 시점은 0 내지 72시간이 될 것이다. (b) 실험의 제2의 버젼에서, 본 발명자들은 IFN-γ를 사용한 밤새 처리에 의해 MEF 및 대식세포내에서 퍼포린-2 mRNA를 예비-유도시킨 후 세포를 Mtb 또는 마이코박테리아로 감염시킬 것이다. 전령 RNA 수준은 다중 시점에서 72 시간 이하 동안 막 불침투성 항체를 사용한 세포내 생존/복제에 대한 검정과 동시에 측정할 것이다.

본 발명자들은 24 웰 플레이트 속에서 세포의 통합성 층을 사용할 것이다. 이러한 저 MOI에서 필수적으로 모든 세균은 포식되어 세포외 성장을 방해할 것이며, 이는 감염 후 12시간째에 상층액을 제거하고 플레이팅함으로써 입증될 것이다. 당해 연구로부터의 결과는, 마이코박테리아 감염이 프로모터에서 퍼포린-2 발현을 직접 차단하는지 또는 시험된 자극을 통해 신호전달을 일반적으로 방해하는지에 의존할 것이다. 작업 모델은, 마이코박테리아 감염이 신호 형질도입 경로에 있어서 하부 현상, 가능하게는 전사 인자 또는 바로 하부에서 퍼포린-2 발현을 차단하는 것으로 상정한다. 마이코박테리아 감염은 퍼포린-2 전사를 유도하는 IFN-γ 처리에 대해 민감성이다. 이러한 시나리오는, 마이코박테리아가 IFN 유도의 상부 경로를 억제할 수 있음을 제안한다. 생산성 감염이 열-사멸된 마이코박테리아로부터의 자극을 차단할 수 있는지의 여부는 흥미가 있을 것이며 생존하는 마이코박테리아가 병원체 관련 분자 양식(PAMP)의 감각을 방해할지의 여부에 대한 해결책이 될 것이다. 이들 실험의 말기에, 본 발명자들은, 마이코박테리아 감염이 퍼포린-2-활성화 경로에 있어서 영향을 발휘하는 수준의 정도를 알 것이다.

B. 퍼포린 -2의 억제에 관여된 마이코박테리아 -특이적인 인자의 완전한 설명.

실험 설계. 본 발명자들은 본 발명자들의 퍼포린-2 수용체 작제물에서 루시퍼라제 유전자를 eGFP 암호화 서열로 대체함으로써 시작하여 GFP가 퍼포린-2 프로모터 활성에 대한 지시인자이도록 할 것이다. 당해 리포터는 퍼포린-2 녹아웃 마우스(P-2-/- 마우스)로부터 기원한 MEF내로 안정하게 통합될 것이다. 이러한 방식으로, 본 발명자들은 퍼포린-2의 살세균 활성으로부터 방해없이 마이코박테리아 감염의 존재 및 부재시 퍼포린-2 발현을 직접 실험할 수 있다. 본 발명자들은, 리포터 작제물이 마이코박테리아 감염에 대해 반응성이며 자극이 억제되는 것으로 밝혀졌는지를 확인할 것이다. 이후에, 당해 리포터 시스템을 사용하여 퍼포린-2 발현을 방해하는 이들의 능력이 결핍된 Mtb 돌연변이체를 확인할 것이다.

C. Mtb의 퍼포린-2 매개된 사멸에 대한 내성에 관여된 경로의 결정

본 발명자들은 Mtb의 퍼포린-2-매개된 사멸에 대한 충격 민감성 및 내성에 관여된 세균 경로를 시험할 것이다. TraSH로서 공지된, 사세티(Sassetti) 및 루빈(Rubin)(29,30)에 의해 개발된 유전 스크리닝에 대한 트랜스포존 삽입-부위 맵핑 방법은 Mtb 돌연변이체의 인터로게이팅 복합체(interrogating complex) 집단에 대한 극도의 효과적인 시도임이 밝혀졌다. 당해 방법은 도입 및 배출 돌연변이체 혼주물의 정량적인 분석을 가능하도록 하여 선택 후 풍부하거나 고갈된 개개 돌연변이체를 검출할 수 있다. 본 발명자들은 둘 다 상이한 환경 조건 하에서 양성적으로 및 음성적으로 선택된 대사 경로를 확인하기 위한 유전적 시도로서 당해 방법을 이미 사용하여 왔다(1).

본 발명자들은 대략 200,000개의 독립된 삽입체를 함유하는 트랜스포존-돌연변이유발된 Mtb의 라이브러리를 생성하여 게놈 포화를 보증할 것이다. 퍼포린-2^+/+ 또는 ^-/- 마우스로부터 분리한 퍼포린-2^+/+ 및 ^-/- 쥐 골수-기원한 대식세포를 Mtb 돌연변이체의 혼주물로 1:1 또는 5:1의 MOI에서 감염시킬 것이다. 요약하면, 도입 라이브러리의 분취량으로부터 대략 2xl0⁶개의 cfu를 사용하여 야생형 및 퍼포린-2-결핍성 한배새끼를 감염시킬 것이다. 신속한 성장물의 과도한 선택을 제한하기 위하여, Mtb를 2회 시점에서, 임시적으로 24시간 및 72 시간째에 분리할 것이다. 대조군 혼주물 및 돌연변이체의 퍼포린-2-결핍성 혼주물을 분리하여 둘 다 2개의 생물학적 반복물에서 도입 혼주물 및 2개의 기술적 반복물에 대해 TraSH를 사용하여 비교할 것이다. 앞서 설명한 바와 같이(1), 각각의 혼주물로부터의 게놈성 DNA를 HinPI에 이어서 MspI으로 부분 분해할 것이다. 0.5-2kb 단편을 정제하고 비대칭적 어댑터에 연결시키고 트랜스포손 염색체 연결부를 PCR을 사용하여 증폭시킬 것이다. 본 발명자들은 통상의 설게된 고-밀도 미세배열을 이용하여 삽입 부위를 확인할 것이다. 업자(Agilent Technologies)에 의해 합성된 당해 배열은 Mtb 게놈의 매 350 bp마다 60'머의 올리고로 이루어져 있다. 본 발명자들은, 당해 올리고 밀도가 크기-선택적(200-500 bp)이고, 표지된 프로브(labeled probe)가 적어도 하나의 올리고에 하이브리드화하도록 함으로써 대부분의 삽입 부위를 확인하기에 충분한 수용력(coverage)을 제공함을 알고 있다(1). 배출 혼주물에서 유의적으로 과도하게 또는 낮게-나타난 돌연변이체를 다음의 범주를 사용하여 정의할 것이다: 채널들 중 하나에서 임의의 형광성 강도 >300, 형광성 비 >3 및 t 시험 p 값 <0.05(GeneSpring 12.5). 당해 시도의 강도는, 이것이 도입 혼주물로부터 풍부하거나 고갈된 상이한 돌연변이체의 상대적 풍부성을 통해 선택의 정량적인 척도를 제공한다는 것이다. 이는 부분적인 표현형을 나타내기 위해 엄중도(stringency)의 정도를 적절한 수준으로 "설정"하도록 한다. 유사한 데이타를 RNASeq 분석으로 생성시킬 수 있지만 본 발명자들은, 다중 시료의 분석을 위해서는 미세배열-계 시도가 보다 비용-효과적임을 발견한다.

당해 스크린으로부터, 본 발명자들은 배출 혼주물에서 저하되어 나타난(under-represented) 돌연변이체에 대해 주로 초점을 맞출 것이고 본 발명자들은 다음의 돌연변이체 세트를 확인하는 것으로 예측된다:

(1) 퍼포린-2+/+ BMDM에서 저하되어 나타남: 이들 세균은 퍼포린-2 의존성 및 독립성 기전 둘 다를 통해 세포내 생존에 손상을 입었다.

(2) 퍼포린-2+/+ BMDM에서 과도하게 나타남: 이들 세균은 퍼포린-2 의존성 및 독립성 기전 둘 다에 의해 대식세포-매개된 사멸에 대해 내성이다.

(3) 퍼포린-2-/- BMDM에서 저하되어 나타남: 이들 세균은 퍼포린-2-독립성 기전을 통한 세포내 생존에서 손상을 입었다.

(4) 퍼포린-2-/- BMDM에서 과도하게 나타남: 이들 세균은 퍼포린-2-독립성 기전을 통한 대식세포-매개된 사멸에 대해 내성이다.

본 발명자들은 퍼포린-2-/- 및 +/+ 한배새끼 대식세포 둘 다를 사용하여 세포내 생존에 필요한 대사 경로와 같은 관련되지 않은 경로에서의 돌연변이로 인해 세균 사멸로부터의 퍼포린-2-의존성 사멸 기전으로부터의 사멸을 구별하며, 이는 혼주물 1 및 3 둘 다에 대해 일반적일 수 있다. 제1 및 제3 부류에서 이들 돌연변이체는 본 발명자들에게 가장 큰 흥미 중 하나이다. 야생형 및 퍼포린-2^-/- BMDM에 대해 선택된 이들 돌연변이체의 비교는 전사 또는 작용적 수준에서, Mtb의 퍼포린-2-의존성 사멸을 손상시키는 이들 경로에 있어서 결손된 돌연변이체의 확인을 촉진한다. 표현형은 명확한 녹아웃의 생성 및 발표된 바와 같이(16) 목적한 유전자의 상보성을 통해 입증할 것이다.

많은 유전적 스크린은 단일 유전자/단일 작용에서 가장 잘 작업하며, 이는, 표현형이 단일의 분비된 효과기로 인한 경우일 수 있다. 이는, 본 발명자들이 다중 유전적 유전자자리에 있어서 음성 또는 양성 선택을 동시에 정량할 수 있으므로 TraSH 분석에 대해서는 거의 사실적이지 않다. 이는 추가의 분석을 필요로 하지만 본 발명자들은, TraSH 시도가 다중-유전자자리 표현형, 또는 경로의 확인을 허용할 수 있음을 주장할 수 있다. 예를 들면; 대식구 거동은 세균 세포 벽 지질(31, 32)에 의해 영향받은 것으로 알려져 있다. 이들 지질은 다중 유전자의 생산물이므로 이러한 매개인자의 합성이 결손된 돌연변이체가 이에 대해 선택되는 경우 본 발명자들은 합성 경로에 있어서 수개의 유전자를 확인할 수 있다.

하나의 추가의 관심 사항은 수송중(in trans)의 보완성이다. 변경된 대식세포 표현형이 세균 세포벽 지질에 의해 유도된 경우, 배양물 속의 모든 세포는 영향받을 것임이 가능하다. 이는 스크린을 무효화할 수 있다. 그러나, 이것이, 본 발명자들이 앞서 수행한 바와 같이(31-33), 마우스 또는 대식세포를 분리된 마이코박테 리아 지질로 처리하고 관련되지 않은 병원체, 예를 들면, 살모넬라 또는 클라미디아를 사멸하는 세포의 능력을 손상시키는지에 대해 검정할 수 있다.

Mtb는 기술된 바와 같이 TraSH 시도를 사용하여 대식세포내에서 퍼포린-2+/+ 및 -/- 선택에 의해 확인될 것이다. 퍼포린-2-매개된 사멸에 대해 내성을 부여하는 유전자는 명백한 녹아웃의 생성에 의해 및 발표된 바와 같이(16) 목적한 유전자의 상보성을 통해 유효하게 될 것이다. 본 발명자들은 확인된 것으로 억제되는 퍼포린-2 발현, 활성화 또는 사멸에 있어서의 단계를 확인할 것이다. 퍼포린-2 내성 유전자가 퍼포린-2에 직접적으로 영향을 미치지는 않지만 예를 들면, 세균 봉입체에 영향을 미치는 유전자에 있어서 이의 역할을 통해 퍼포린-2 내성을 매개하여 퍼포린-2 손상을 보수하는 것이 가능하다. 본 발명자들은, 라이소자임이 부재하지만 이의 존재에 있어서는 그렇지 않은 경우 엠. 스메그마티스가 이들의 일부 퍼포린-2 손상을 복구할 수 있었음을 발견하였다(3).

II. Mtb가 액포를 함유하는 세균에 대한 전좌를 억제하는가?

A. 퍼포린-2의 구조 및 활성화의 기전

MPEG-1 (5)에 의해 암호화된 퍼포린-2는 본 발명자들에 의해 P2로 지정된 신규 도메인을 통해 전이막 도메인 및 C-말단의 짧은(38AA) 세포질성 도메인에 연결된 N-말단 막 공격 복합체 퍼포린 도메인(MACPF)을 함유하는 통합성 전이막 단백질이다(도 2). MACPF 중합 및 사멸 도메인은 세포질내에서 내부 막 액포내에 위치한다(도2). 퍼포린-2는 MACPF 및 P2 도메인을 포함하는 해면조직에서 하부로 고도로 보존되어 있다(3, 34). 세포질성 도메인은 도 2에 나타낸 바와 같이 척추동물 중에서 및 포유동물에서 보존되어 있으며, 이는 보존된 신호전달 성분임을 제안한다. 퍼포린-2의 작용은 이의 살세균 활성을 입증한 본 발명자들의 공보(3, 4)까지는 알려져 있지 않았다. 본 발명자들은 세포내 세균의 퍼포린-2 매개된 사멸을 불활성화시키지만 발현은 불활성화시키지 않는 Y 돌연변이를 F 돌연변이(적색 화살표, 도 2)에 도입하였으며(데이타는 나타내지 않음), 이는 세포질성 도메인의 작용적 중요성을 제안한다. MACPF 도메인은 또한 공극-형성 폴리-C9를 포함하는 상보체의 공극-형성 단백질에서, 및 폴리-퍼포린-1에서 발견되어 있다(8, 9, 35, 36). 본 발명자들은, 이의 MACPF를 통해 퍼포린-2가 막/세포벽 공극을 형성할 수 있는지를 측정하였다. 공극-형성 MACPF 킬러 도메인은 액포 관강내에 위치하며(도 2), 이는, 이것이 막으로 둘러싸인 표적(세균)에서 공극을 형성할 수 있음을 제안한다. 도 1에서, 스메그마티스(중간) 및 MRSA(우측 패널)는 감염 후 5시간째에 IFN-γ 유도된 MEF로부터 분리되었으며, 당해 세균은 음성 염색 전자-현미경(도 1, 150,000배 배율)에 의해 시험된 폴리트론 및 세포 벽에 의해 파괴되었다. 좌측 패널은 진핵 세포 인지질 이층 막에서 폴리-퍼포린-2를 나타낸다. 세균 세포벽은 상보체의 폴리-C9 공극과 크기가 유사한, ~Å100 직경의 연결된 공극의 집단을 갖는다. 대조군 세포벽은 이러한 공극을 갖고 있지 않다(나타내지 않음). 공극은, 퍼포린-2가 siRNA으로 녹 다운되고 세균이 사멸되지 않는 경우 검출되지 않는다(나타내지 않음). 당해 도는, 퍼포린-2가 공극-형성 단백질이며 집단화된 공극이 퍼포린-2을 발현하는, 살세균성 MEF로부터 분리된 세균 세포벽에 존재함을 나타낸다. 도 1, 패널 b에서 퍼포린-2-중합체를 공격하여 이와 집단을 이룬 엠. 스메그마티스 단편의 표면적은 >0.16μm² 크기이며 전체 표면적의 6% 이상을 나타낸다. 유사한 손상이 또한 MRSA에서 관찰된다(도 1, 패널 c). 이러한 광범위한 세포 벽 손상은 세균 봉입체의 정상의 보호성 작용을 고려할만하게 손상시키는 경향이 있으며 라이소자임을 포함하는 ROS, NO 및 하이드롤라제에 의한 화학적 공격에 대한 접근을 제공한다.

중합, 막 삽입 및 공격 동안 MACPF 도메인의 CH1 및 CH2의 재폴딩은 최근에 동결-전자 현미경(2)과 함께 재결정화에 의해 설명되어 왔으며 본 발명자들의 원래의 모델을 입증하고 있다(37). 도 21에서 본 발명자들은 파고솜내 세균을 공격하는 파고솜 막에 부착된 퍼포린-2의 분자 기전을 모델화한다. 당해 모델에 따라서, 퍼포린-2의 MACPF 도메인은 파고솜내에 트랩핑된 세균의 봉입체(도 21c)의 외부 층을 손상시킨다.

세포질 전체에 저장된 막 액포내 막 단백질 퍼포린-2의 존재(도 22, 상단 좌측)은 세포내 감염시 세균 함유 액포에 대한 전좌를 필요로 하며, 이는 도 20에 모델화되어 있다. 엔도솜/액포 막과 융합되면, 퍼포린-2는 중합되어 엔도솜/액포내 세균을 공격하여 사멸시키는 것을 개시한다. 도 22에 나타낸 공초점 연구는 당해 모델을 뒷받침한다. 좌측 패널에서, 상부 좌측은 퍼포린-2-GFP(녹색)으로 형질감염된 감염되지 않은 미세아교세포 BV2 세포이며 보다 우수한 가시성을 위해 거짓 색상으로 나타낸, 백색의 DAPI로 염색되어 있다. 다른 패널은 살로넬라로 감염되고(MOI 30), 5분 후 고정되며 항 RASA2/GAP1M 항체(오렌지색)로 염색된 퍼포린-2-GFP 형질감염된 BV-2를 나타낸다. 내인성 퍼포린-2는 3'UTR 특이적인 siRNA로 녹-다운되어 있다. 화살표는 DAPI로 염색된 세포의 외부에서 완전한 살모넬라 로드(rod)를 나타낸다. 세포 내부의 녹색, 백색 및 오렌지색 달걀 형태의 구조물은 퍼포린 2 공격으로 인하여 이들의 DNA를 방출한 살모넬라를 함유하는 것으로 여겨지는 엔도솜이다. 합해진 영상은 동시국재화를 나타낸다. 우측 패널, 도 22: 감염 후 5분내에 고정된 퍼포린-2-RFP 형질감염된 BV2에서 GFP-표시된 이. 콜라이. 세균 함유 엔도솜이 중심 패널에서 확대되어 있으며 엔도솜 상내 세균을 나타낸다(하부 좌측). 녹색 GFP (상부 좌측)은 단편화되어 세균 외부로 부분적으로 유출된 세균을 나타낸다. 퍼포린-2-RFP(상부 우측)는 엔도솜 막 및 세균 표면에서 고도로 농축되어 있다. 합쳐진 영상은 동시국재화를 나타낸다.

전체적으로 신규한 경로에 대해 예측될 수 있는 바와 같이, 침입하는 세균에 대해 표적화하여 사멸시키는 퍼포린-2 활성화의 많은 상세한 사항은 여전히 알려져 있지 않다. 그러나, 본 발명자들은 몇몇 퍼포린-2 활성화 단백질을 확인하였으며(표 1) 퍼포린-2 활성화에 대한 모델의 작제를 허용하고 도 20 및 4에 나타낸 바와 같이 내포작용성 액포내 세균의 공격을 허용하는 증거를 수집하였다.

실험 설계: 퍼포린-2 작용 및 세균 인자에 의한 이의 작용의 잠재적인 차단은 퍼포린-2-동시면역침전 검정에서 모니터링될 것이다. 퍼포린-2는 IFN-γ 및 LPS 활성화된 RAW 세포내에서 vps34, RASA2/GAP1M, Ubc12, 쿨린-1 및 βTrcP와 상호작용한다(도 23, 4). 수송 신호(trafficking signal)로서 흔히 사용되는 퍼포린-2는 모노-유비퀴틸화되어 있다. 퍼포린-2와 이의 상호작용하는 단백질의 상호작용은 세균 함유 액포에 대한 퍼포린-2 전좌의 작용 및/또는 퍼포린-2 중합화 및 세포내 세균의 사멸의 개시에 필수적이다. 상호작용하는 단백질의 siRNA에 의한 녹 다운은 퍼포린-2의 사멸 활성을 차단하거나 크게 억제한다(데이타는 나타내지 않음). 유사하게, 세균 인자에 의한 방해는 사멸되는 것으로부터 세균을 보호할 수 있다. 상호작용의 방해는 조기 활성화 단계의 억제를 지시할 수 있거나 이는 억제에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들면, 퍼포린-2의 세포질성 도메인은 1개의 보존된 Y 및 2개의 보존된 S-포스포릴화 부위를 갖는다(도 2). 본 발명자들은, 세균 감염 및 내포작용이 Ca-유출 및 공지되지 않은 키나제를 개시하여 퍼포린-2의 전좌를 개시하는 조기 단계 중의 하나로서 퍼포린-2-사이토(cyto)를 인산화(또는 포스파타제를 개시하여 인산화)시킴을 제안한다. 전좌는 아마도 vps34 및 RASA2/GAP1M과의 상호작용을 필요로 한다. Vps34는 활성화를 필요로 하는 키나제인 vps15와의 복합체이다. 세균을 조기 활성화 단계로 방해하는 것은 이들 추정된 전좌 단백질과 퍼포린-2의 후속적인 상호작용을 방지할 수 있다. 마이코박테리아에 의한 감염시 퍼포린-2 작용은 또한 도 22에 나타낸 바와 같이, 공초점 현미경에 의해 모니터링될 것이다. 당해 검정은 전좌와 중합 사이를 구별할 수 있다. 세균이 전좌를 방해하지 않지만 퍼포린-2 중합을 억제하는 것은 가능하다. 이 경우에, 표지된 세균은 엔도솜 액포 내부에서 관찰되지만 이들은 사멸되지 않는데, 예를 들면, 이들의 DNA를 방출하지 않거나 도 22에 나타낸 바와 같이 단편화될 수 있다.

도 4는 작용을 조절하는 퍼포린-2-사이토 관련된 상호작용 단백질과 함께 Mtb 함유 액포의 막 내의 퍼포린-2의 본 발명자들의 모델을 나타낸다. 도 5는, 모두 퍼포린-2 작용에 필요한 쿨린-환-유비퀴티-리가아제를 조립할 필요가 있는 Ubc12, 쿨린-1 및 βTrcP와 퍼포린-2-사이토의 상호작용을 기본으로 하여, 퍼포린-2-중합에 대한 모델을 나타낸다(도 5). 본 발명자들은, 퍼포린-2-사이토의 라이신 집단의 유비퀴틸화(도 2)가 중합을 초래하는 세포질성 도메인의 프로테오좀 매개된 분해에 대한 신호임을 제안한다. 당해 단백질분해성 절단은, C5 내지 C5b의 단백질분해성 절단이, 막의 조립체가 C9의 복합체 및 중합을 공격하기 위한 개시인자(trigger)인 상보체와 거의 유사하다. C6, C7, C8 및 C9는 모두 100Å(38)의 공극/구멍을 형성하는 폴리 C9인 14-16개의 C9 분자와 공중합되는 MACPF 도메인을 갖는다.

B. 인산화 및 동시면역침전

골수 기원하고 IFN-γ 활성화된 대식세포 또는 RAW-세포는 퍼포린-2-GFP로 일시적으로 형질감염되어 mCherry-마이코박테리움으로 1 내지 10의 MOI에서 감염될 것이다. 시료를 2분으로부터 72시간까지 일시적으로 조기 시간에 취할 것이다. 시간은 수집한 실험에 따라 조절할 것이다. 분석은 도 23 및 표 1에 나타낸 단백질의 퍼포린-2 동시면역침전으로 수행할 것이다. 본 발명자들은 엠. 스메그마티스, 엠,아비움을 Mtb와 비교하여 확인하고; 이들 3개의 마이코박테리아 종들 중에서 엠. 스메그마티스가 퍼포린-2에 의해 비교적 효과적으로 사멸될 수 있으므로 양성 대조군으로서 제공될 것이다. 다른 양성 대조군은, 비-병원성이고 공지된 내성 유전자 또는 플라스미드를 가지지 않은 이. 콜라이 K12일 것이다. 본 발명자들은 또한 키나제 작용을 찾을 것이다. 퍼포린-2-사이토에서 추정적 키나제 인산화 Y 및 S는 알려져 있지 않으나, 후보물(Tec 및 Nek)은 알고리즘으로 예측된다. 본 발명자들은 상이한 감염 시점 전 및 후에 항-포스포-타이로신 및 항-포스포-세린을 사용한 퍼포린-2 면역침전을 블랏팅할 것이다.

본 발명자들의 현재의 데이타는, 퍼포린-2 매개된 사멸이 3개의 동시발생된 단계의 캐스케이드(cascade)로 진행함을 제안한다. (1) 키나제 ( 포스파타제 ) 활성화 : 퍼포린-2-사이토에서 보존된 인산화 부위는 세균 부착 및 내포작용/식세포 작용 후 제1 단계로서 가장 유사한 키나제 활성화를 제안한다. (2) 전좌 : 퍼포린-2 부하된 막 액포는 세포질로부터 세균 함유 엔도솜/파고솜 막에 전좌되어 이와 융합된다. (3) 중합 : 퍼포린-2-중합은 개시되어 엔도솜 내부의 세균이 엔도솜 막에 밀접하게 되어 퍼포린-2의 N-말단 MACPF-도메인에 닿을 경우의 정확한 순간에서 작동할 필요가 있다. 이때 중합이 개시되어 중합의 쇄 반응은 세균 막을 때려서 MACPF에 충분히 근접한 세균 표면의 면적에서 집단화된 공극을 형성한다. 막 손상은 ROS, NO 및 라이소자임의 살세균 작용을 촉진한다(3).

키나제(또는 포스파타제) 단계의 억제 또는 변경은 시간에 따라 항-포스포-항체 또는 P32 표지화를 수반하여 양성 대조군인 이. 콜라이 및 엠. 스마그마티스와는 상이한 Mtb 및 엠. 아비움의 효과를 나타낼 것이다. 이러한 조기 수준에서의 차단은 또한 전좌 및 중합화 및 사멸을 차단하는 것으로 예측된다. 마이코박테리아가 전좌 전에 중합을 조기에 개시하는 것은 가능하다. 폴리-퍼포린-2는 폴리-C9 및 폴리-퍼포린-1에서와 같이 사멸-불활성인 것으로 예측된다.

Vps34 및 RASA2/GAP1M(및 추가의 단백질은 아직 확인되어 있지 않다)은 전좌에 필요한 유사 후보물이다. 퍼포린-2와의 이들의 상호작용이 마이코박테리아 인자에 의해 방해되는 경우, 전좌는 억제될 것이며 이는 본 발명자들이 공초점 현미경으로 확인할 것이다. 세균 억제를 역작용시키기 위해, 본 발명자들은 vps34 및/또는 RASA2/GAP1M을 과발현시켜 사멸 활성을 재저장할 것이다. Mtb는 ManLam 및 Ca^{2 +} 이동을 통해 vps34를 방해하는 것으로 알려져 있다. SapM 포스파타제는 PI3P를 탈인산화할 수 있다(39-44). 퍼포린-2-사이토는 PI3-키나제 vps34 및 PI3P 결합 단백질 RASA2/GAP1M 둘 다와 상호작용하여 공침전시킨다. 이러한 수준에서 방해는 명백하게 퍼포린-2 작용에 있어서 강력한 음성 효과를 가질 수 있다.

C. 중합

세균 사멸은 퍼포린-2 중합 및 세균 표면에 대한 물리적 손상을 필요로 한다. 따라서, 세균 사멸은, 퍼포린-2 활성화에 대한 다른 조기 단계 모두를 포함한 중합이 일어난다는 간접적인 증거로서 취해질 수 있다. 본 발명자들의 데이타는, 중합이 쿨린-환-유비퀴틴-리가아제(CRL)에 의해 라이신 집단에서 퍼포린-2의 유비퀴틴화-사이토의 유비퀴틴화에 의해 개시됨을 제안한다. 퍼포린-2는 동시면역침전되며 퍼포린-2-사이토는 효모 내 2개의 하이브리드 시스템 속에서 CRL에 요구되는 주요 NEDD8 리가아제인, Ubc12와 상호작용한다(45, 46). 퍼포린-2는 또한 NEDD8-기질인 쿨린1 스캐폴딩 단백질 및 퍼포린-2-사이토를 인식하는 쿨린1 및 Skp1과 관련된 Fbox 단백질인 βTrcP와 동시면역침전한다(도 23). 최종적으로, 퍼포린-2 면역침전물은 유비퀴틴화된다.

CRL은, NEDD8를 불활성화시키는 것으로 알려진 Cif-플라스미드(도 5)(19, 20)가 Cif 함유 예르시니아 슈도투베르쿨로시스의 퍼포린-2 매개된 사멸을 차단한다는 본 발명자들의 발견으로부터 유도된다. 대조적으로 Cif 결핍성 예르시니아는 내인성 퍼포린-2에 의해 또는 보완된 퍼포린-2-GFP에 의한 퍼포린-2 사멸에 대해 민감성이다(도 24). 항-퍼포린-2로 블랏팅된 사멸된 예르시니아의 분해물은, 신규의 퍼포린-2-단편 밴드가, Cif가 존재하여 세균이 생존하는 경우 검출되지 않음을 나타낸다. 이러한 발견은 활성화의 결과로서 퍼포린-2 절단을 제안한다. 더욱이, 퍼포린-2-GFP 면역침전물(항 GFP를 지님)은, 사멸이 Cif에 의해 차단되는 경우 유비퀴틴-음성이며 Cif가 존재하고 세균이 사멸된 경우 유비퀴틴 양성이다(도 25). 당해 데이타는, 퍼포린-2-사이토-GFP의 유비퀴틴화 및 절단이 퍼포린-2 중합 및 세포내 세균의 사멸에 필수적일 수 있음을 제안한다. 따라서, 유비퀴틴화 및 퍼포린-2-절단 검정은 퍼포린-2-중합을 위한 (비-정량적) 대용 검정으로서 개발될 것이다.

퍼포린-2의 중합을 직접적으로 측정하는데 유용한 검정은 없으며, 이는 또한 퍼포린-1 및 폴리-C9에 대해서도 사실이다. 사멸은 중합을 내포하며 중합이 일어남을 나타내는데 사용될 수 있다. 위에서 논의한 바와 같이, 본 발명자들의 데이타는, 최종 단계가 세포질성 도메인의 유비퀴틸화에 의한 엔도솜내 퍼포린-2 중합 및 프로테오좀에 의한 절단/분해의 유도임을 나타낸다(도 4). 도 25 및 도 23의 증거는 이를 뒷받침한다. 또한, 이러한 뒷받침은 Y를 완전히 보호하는 Cif의 강력한 퍼포린-2 차단 활성(도 24)로부터 온다. CRL에 필요한 NEDD8을 차단함을 통한 퍼포린-2 사멸로부터의 가성결핵(pseudotuberculosis)은 퍼포린-2를 매개하였다. 살모넬라 티피무리움은 데유비퀴티나제, SseL을 암호화하며, 이는 자가소화작용과 연관되어 있다(47). SseL이 또한 퍼포린-2 내성 인자임은 가능하다. 본 발명자들은, 자기소모에 의한 세균 사멸이 또한 퍼포린-2를 필요로 한다는 증거를 가지고 있다. CYLD는 염증을 하향 조절하는 세포계 데유비퀴티아제이다. CYLD의 발현은 생리학적 조건하에서 비교적 낮지만 호흡계내에서 세균 감염시 유의적으로 상향조절되고(48-51); 세균에 의한 CYLD의 상향조절은 포스포디에스테라제 4B의 억제를 통해 달성된다(52). 증가된 CYLD 수준은 NFκB 활성화를 억제하며 또한 퍼포린-2를 데유비퀴틴화함으로써, 중합을 차단하고 사멸시킨다. 따라서, 본 발명자들은 데유비퀴티나제 억제제 및 siRNA를 사용하여 퍼포린-2 의존성 Mtb 및 엠. 아비움 사멸의 효능을 측정할 것이다.

III. 생체내에서 마이코박테리아를 조절하는데 있어서 퍼포린 -2의 중요성

본 발명자들은 동종 유전자 치환에 의해 퍼포린-2 결핍성 마우스를 생성시켰다. 도 19에 나타낸 바와 같이, Mtb 및 엠. 아비움은 퍼포린-+/+ 세포에서 보다 퍼포린-2 결핍성 PMN 및 BMDM을 유의적으로 보다 신속하게 복제한다. 이들 데이타는, 퍼포린-2가 적어도 시험관내에서 세포내 마이코박테리아 복제를 저지하는데 유용함을 강력하게 제안한다. 살모넬라 티피무리움 RL144에 의한 입위관 감염에 의한 및 MRSA CL1380의 피내 감염에 의한 퍼포린-2-/-, +/-, 및 +/+ 한배새끼의 생체내 유발는 강력한 표현형을 나타내었다. 퍼포린-2-/- 마우스는 +/+ 및 퍼포린-2+/- 한배 새끼에 의해 청소된 살모넬라 유발에 의하여 사망하였다(도 26). 퍼포린-/-, 그러나 +/- 또는 +/+ 마우스에서는 아닌 유사한 치사도(lethality)는 피내 MRSA 감염에 의해 관찰된다(데이타는 나타내지 않음). 당해 데이타는, 퍼포린-2가 생체내에서 항-세균 방어에 대한 중요한 효과기임을 나타낸다. 퍼포린-2의 부재하에서 병원성 세균은 전신성으로 신속하게 퍼져서 세균을 생성하고 퍼포린-2+/+ 마우스에서보다 비장 간 및 신장에서 10³ 내지 10⁴ 배 더 높은 수준으로 복제한다. 본 발명자들은, 도 19a, b의 시험관내 데이타를 기준으로 하여, 퍼포린-2가 또한 Mtb 및 엠. 아비움에 대한 중요한 효과기이며 퍼포린-2 -/- 마우스가 +/+ 또는 +/- 한배새끼의 보다 더 신속하게 및 보다 적은 감염 투여량에 예속될 것임을 예측한다.

실험 계획: 본 발명자들은 mCherry-Mtb의 비강내 경로 및 복강내 주사에 의해 퍼포린-2-/-, +/- 및 +/+ 한배새끼를 감염시킬 것이다. 등급화된 투여량을 감염에 사용하여 2개, 1개 또는 0개의 퍼포린-2의 대립형질의 존재하에서 방어 수준을 측정할 것이다. 본 발명자들은 확인된 퍼포린-2 내성 유전자에서 결손된 Mtb 돌연변이체를 생성시키고 이들을 사용하여 퍼포린-2-/- +/- 및 +/+ 한배새끼의 생체내 유발를 위해 사용할 것이다. 12 마리의 마우스 그룹을 사용하고 4개의 감염성 투여량 수준의 세균을 각각의 실험에서 사용할 것이다. 보증된 BSL3 동물 시설을 사용할 것이다. 마우스를 체중 및 거동 및 웰-빙(well-being)에 대해 관측할 것이다. 소염 약물 및 통증 의약을 수의학 연구 분과의 본 발명자들의 수의사와 상의 후 필요할 경우 투여할 것이다. 3마리 마우스의 그룹을 빈사 상태인 경우 4 내지 6주 간격으로 또는 조기에 희생시킬 것이다. 부검은 폐, 간, 비장 및 장관의 조직병리학적 분석을 포함할 것이다. 또한 이들 기관으로부터의 시료를 사용하여 CFU를 측정할 것이다. mCherry-Mtb 및 이의 결실 돌연변이체로 유발된 마우스로부터의 조직을 또한 유동 세포분석법 및 형광 현미경으로 분석할 것이다.

병원체 유리된 장벽 시설 속에 유지시킨 퍼포린-2 결핍성 마우스는 병원성 표현형을 갖지 않는다. 정상의 공생 소화관 및 피부 식물군은 퍼포린-2를 필요로 하지 않는다. 마이코박테리아를 포함하는 병원성 세균은 생체내에서 침입성이고 퍼포린-2에 의한 활성 방어를 필요로 한다. 본 발명자들은, 퍼포린-2-/-가 야생형 마우스보다 Mtb에 대해 유의적으로 보다 더 민감할 것임을 예측한다. 임상적으로 이는 신속한 체중 감소 및 다중 기관에 대한 Mtb의 신속한 전파로서 나타날 것이다. 임상 사진은 치료되지 않을 경우 급속히 치명적인, 환자 및 어린이에서 관찰된 파종된 초급성 결핵의 형태인, 속립성 결핵과 유사할 수 있다. 퍼포린-2 내성 유전자가 결실된 Mtb 돌연변이체의 사용은 퍼포린-2+/+ 및 +/- 마우스에서 거의 병원성이 아닌 것으로 예측되지만 퍼포린-2-/- 마우스에서는 동일하게 병원성으로 잔류할 수 있다. 이러한 생체내 시스템에서 Mtb의 다양한 결실 돌연변이체의 스크리닝은 본 발명자들에게 퍼포린-2-의존성 사멸에 저항하는 Mtb의 주요 성분으로의 중요한 통찰력을 제공하고 Mtb에게 독성을 제공할 것이다. 이들 통찰력은 또한, 퍼포린-2 활성화 경로의 어느 단계가 억제되는지를 측정하는데 도움을 줄 것이다. 그리고, 이는 본 발명자들에게 Mtb 내성 경로에 역작용하여 퍼포린-2가 세균을 사멸하도록 하는 생물학적 또는 소 분자 약물을 개발하도록 할 것이다.

서열 번호의 요약

서열 번호	설명
1	마우스 퍼포린-2 세포질성 도메인
2	개 퍼포린-2 세포질성 도메인
3	말 퍼포린-2 세포질성 도메인
4	사람 퍼포린-2 세포질성 도메인

본 명세서에 언급된 모든 공보 및 특허원은, 본 발명이 속한 당해 분야의 숙련가의 수준의 지표이다. 모든 공보 및 특허원은, 각각의 개개 공보 또는 특허원이 구체적으로 및 개별적으로 참고로서 포함되는 것으로 나타난 경우와 동일한 정도로 참고로 본원에 포함된다.

상기한 발명이 이해의 명확성을 위한 목적으로 예증 및 실시예의 방식으로 어느 정도 상세히 설명되어 있지만, 특정의 변화 및 변형이 첨부된 특허청구의 범위내에서 실시될 수 있음이 명백할 것이다.

<110> McCormack, Ryan Podack, Eckhard <120> Perforin-2 Activators and Inhibitors as Drug Targets For Infectious Disease and Gut Inflammation <130> 060569/452788 <150> US 61/927,591 <151> 2014-01-15 <150> US 61/888,919 <151> 2013-10-09 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 40 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Tyr Gly Thr Arg Lys Tyr Lys Lys Lys Glu Tyr Gln Glu Ile Glu Glu 1 5 10 15 Gln Glu Ser Leu Val Gly Ser Leu Ala Thr Asp Ala Thr Val Leu Asn 20 25 30 Gly Glu Glu Asp Pro Ser Pro Ala 35 40 <210> 2 <211> 41 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 2 Tyr Gly Thr Arg Lys Tyr Lys Lys Arg Gly Tyr Gln Ala Leu Glu Asp 1 5 10 15 Glu Arg Gln Ser Leu Ala Ala Gly Thr Ala Glu Ser Gly Asp Ala Pro 20 25 30 Gly Gln Glu Gln Glu Gln Ser Pro Ala 35 40 <210> 3 <211> 41 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 3 Tyr Gly Thr Arg Lys Tyr Lys Lys Arg Glu Tyr Gln Ala Leu Glu Glu 1 5 10 15 Glu Arg Gln Ser Leu Ala Pro Gly Thr Ala Glu Thr Arg Asp Met Pro 20 25 30 Asp Gln Glu Gln Glu Gln Ser Pro Ala 35 40 <210> 4 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Tyr Gly Thr Arg Lys Phe Lys Lys Lys Ala Tyr Gln Ala Ile Glu Glu 1 5 10 15 Arg Gln Ser Leu Val Pro Gly Thr Ala Ala Thr Gly Asp Thr Thr Tyr 20 25 30 Gln Glu Gln Gly Gln Ser Pro Ala 35 40

Claims (29)

1. 소화관(gut)의 염증을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서,
   퍼포린-2 활성을 억제하는 화합물의 치료학적 유효량을, 치료를 필요로 하는 상기 대상체에게 투여하는 단계을 포함하는, 방법.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 대상체가 결장염을 갖는, 방법.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 대상체가 크론병을 갖는, 방법.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 대상체가 염증성 창자병을 갖는, 방법.
5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 소 분자, 폴리펩타이드, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 조합물을 포함하는, 방법.
6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서, 퍼포린-2 활성을 억제하는 상기 화합물이 유비퀴틴화 경로의 적어도 하나의 성분의 억제제를 포함하는, 방법.
7. 청구항 6에 있어서, 퍼포린-2 활성을 억제하는 상기 화합물이 E1 유비퀴틴-활성화 효소 억제제, E2 유비퀴틴-접합 효소 억제제, 또는 E3 유비퀴틴 리가아제 억제제를 포함하는, 방법.
8. 청구항 7에 있어서, 퍼포린-2 활성을 억제하는 상기 화합물이 PYR-41, BAY 11-7082, 뉴틀린-3, JNJ 26854165, 탈리도미드, TAME, NSC-207895, 또는 이의 활성화 유도체를 포함하는, 방법.
9. 청구항 6에 있어서, 퍼포린-2 활성을 억제하는 상기 화합물이 쿨린 환(쿨린 Ring) 유비퀴틴 리가아제(CRL) 억제제를 포함하는, 방법.
10. 청구항 5에 있어서, 퍼포린-2 활성을 억제하는 상기 화합물이 네딜화(neddylation) 경로의 억제제를 포함하는, 방법.
11. 청구항 10에 있어서, 퍼포린-2 활성을 억제하는 상기 화합물이 NEDD8-활성화 효소 (NAE) 억제제를 포함하는, 방법.
12. 청구항 11에 있어서, 상기 NAE 억제제가 MLN-4924 또는 이의 활성화 유도체를 포함하는, 방법.
13. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서, 퍼포린-2 활성을 억제하는 상기 화합물이 데아미다제(deamidase)를 포함하는, 방법.
14. 청구항 13에 있어서, 상기 데아미다제가 Cif를 포함하는, 방법.
15. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서, 퍼포린-2 활성을 억제하는 상기 화합물이 프로테오좀 억제제를 포함하는, 방법.
16. 청구항 15에 있어서, 상기 프로테오좀 억제제가 보르테조미브, 살리노스포라미드 A, 카르필조미브, MLN9708, 델란조미브, 또는 이의 활성화 유도체를 포함하는, 방법.
17. 퍼포린-2 활성을 증가시키는 방법으로서,
    퍼포린-2의 유비퀴틴화를 증가시키고, 이에 의해 퍼포린-2의 활성을 증가시키는 적어도 하나의 화합물의 치료학적 유효량을, 퍼포린-2의 활성 증가를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
18. 청구항 17에 있어서, 상기 적어도 하나의 화합물이 상기 유비퀴틴화 경로의 적어도 하나의 성분의 활성 및/또는 발현을 증가시키는, 방법.
19. 청구항 18에 있어서, 상기 유비퀴틴화 경로의 적어도 하나의 성분이 E1 유비퀴틴-활성화 효소, E2 유비퀴틴-접합 효소 또는 E3 유비퀴틴 리가아제를 포함하는, 방법.
20. 청구항 17에 있어서, 상기 적어도 하나의 화합물이 이소펩티다제 억제제를 포함하는, 방법.
21. 청구항 20에 있어서, 상기 이소펩티다제 억제제가 유비퀴틴 이소펩티다제 억제제 II(F6) (3,5-비스((4-메틸페닐)메틸렌)-1,1-디옥사이드, 피페리딘-4-온), 유비퀴틴 이소펩티다제 억제제 I(G5) (3,5-비스((4-니트로페닐)메틸렌)-1,1-디옥사이드, 테트라하이드로-4H-티오피란-4-온) 또는 이의 활성화 유도체를 포함하는, 방법.
22. 청구항 17에 있어서, 상기 적어도 하나의 화합물이 데유비퀴티나제(deubiquitinase) 억제제를 포함하는, 방법.
23. 청구항 22에 있어서, 상기 데유비퀴티나제 억제제가 PR-619, IU1, NSC 632839, P5091, p22077, WP1130, LDN-57444, TCID, b-AP15 또는 이의 활성화 유도체를 포함하는, 방법.
24. 청구항 17에 있어서, 상기 적어도 하나의 화합물이 데네딜화(deneddylation) 억제제를 포함하는, 방법.
25. 청구항 24에 있어서, 상기 데네딜화 억제제가 PR-619, 유비퀴틴 이소펩티다제 억제제 II(F6) (3,5-비스((4-메틸페닐)메틸렌)-1,1-디옥사이드, 피페리딘-4-온), 유비퀴틴 이소펩티다제 억제제 I(G5) (3,5-비스((4-니트로페닐)메틸렌)-1,1-디옥사이드, 테트라하이드로-4H-티오피란-4-온) 또는 이의 활성화 유도체를 포함하는, 방법.
26. 청구항 17 내지 청구항 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 화합물이 감염성 질환 유기체의 복제를 억제하거나, 이의 성장을 억제하거나, 이의 사멸을 유도하는, 방법.
27. 청구항 26에 있어서, 상기 감염성 질환 유기체가 세포내 세균인, 방법.
28. 감염성 질환 유기체(infectious disease organism)로 인하여 고통받는 대상체의 치료 방법으로서,
    퍼포린-2의 활성을 증가시키는 적어도 하나의 화합물의 치료학적 유효량을, 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 화합물은 퍼포린-2의 유비퀴틴화를 증가시키는, 방법.
29. 청구항 28에 있어서, 상기 적어도 하나의 화합물이 상기 유비퀴틴화 경로의 적어도 하나의 성분의 활성 또는 발현을 증가시키는, 방법.

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