CN110305878B - 一种牛分枝杆菌卡介苗低黏附力及低侵袭力突变株b2909 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物传染病防制技术领域，涉及一种牛分枝杆菌卡介苗低黏附力及低侵袭力突变株B2909，该突变株含有牛分枝杆菌卡介苗FadD18的突变体基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，突变位点位于基因组3925305位点后，位于为FadD18基因序列的581位点后，是一种新结构基因和功能基因。本发明的突变株为低黏附力，低侵袭力，高生长速度，与野生菌株无形态学差异。突变株B2909保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018866。本发明的突变基因及其突变株可望在牛分枝杆菌致病机理研究、免疫机制研究和制备防制牛结核病疫苗或药物中应用。

Description

一种牛分枝杆菌卡介苗低黏附力及低侵袭力突变株B2909

技术领域

本发明属于动物传染病防制技术领域，具体涉及一种牛分枝杆菌卡介苗低黏附力及低侵袭力突变株B2909分离鉴定和制备方法。该突变株含有牛分枝杆菌卡介苗FadD18的突变体基因，相较于野生株，本发明的突变株为低黏附力和低侵袭能力，且后期生长速度显著高于野生株。

背景技术

结核病是一种重要的慢性消耗性人畜共患病，为单一病原所引起人类死亡的头号杀手，2017年该病已经导致了全球130万人的死亡[1]。在数千年的发展历史中，结核病的病原结核分枝杆菌以各种形式逃逸宿主的免疫应答，并与人类协同进化，为人类健康带来了巨大的威胁；多耐药及耐多药菌株的不断出现，更是对结核病的防治造成了巨大的障碍。自1921年法国官方将牛分枝杆菌卡介苗(Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guerin，M.bovis BCG)作为人结核病的官方许可疫苗后，全球范围内再无获许可的结核病疫苗问世[2]。

牛分枝杆菌卡介苗的本质为牛分枝杆菌传代致弱株。经实验室多次连续传代培养后自然丢失其编码毒力因子的RD1区后所形成。虽然卡介苗毋庸置疑的拯救了数以万计的生命，其保护效力却十分有限。除能够对儿童结核性脑膜炎有效控制外，对成人的保护力极差。不仅如此，对许多特殊群体尤其是免疫低下群体(如艾滋病人)而言，卡介苗不仅无法实现其免疫保护功能，反而加速了结核病的发生，具有极大的安全隐患。即便如此，在从未间断的结核病疫苗开发过程中，至今却仍没有优于卡介苗的疫苗问世。因此，从不同角度探讨开发出不影响卡介苗保护效力，且针对免疫低下群体更为安全的卡介苗具有十分重要的意义。

卡介苗的毒力决定着疫苗的安全性。黏附及侵袭能力是衡量细菌毒力的关键指标，黏附和侵袭更是细菌感染宿主细胞、激发免疫学反应的重要一步。在分枝杆菌感染过程中，细菌最先被吸入肺泡腔，并与肺泡巨噬细胞互作，随后通过一系列通路或方式实现对宿主细胞的黏附并侵袭[3]。黏附力和侵袭力也因此成为了细菌的毒力相关因子，直接影响着细菌的毒力强弱，并与细菌的扩散密切相关[4]。当细菌侵入细胞，或细胞吞噬细菌后，细菌的胞内存活能力则可用来影射细菌毒力的大小。

通过缺失毒力相关因子来降低卡介苗的毒力是制备安全疫苗的重要研究方向。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的缺陷，提供了一株重要的牛分枝杆菌低侵袭力突变体菌株(在本发明中简称为突变株)B2909，该突变株涉及的基因为FadD18，相对于野生型牛分枝杆菌呈现明显的低黏附能力和低侵袭能力，以及高生长速度，所示性状与所插入失活基因的毒力相关。

为了实现本发明的目的，申请人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原学分室从牛分枝杆菌卡介苗基因缺失突变体库中筛选得到一株侵袭能力显著降低的菌株B2909，该突变株含有FadD18基因，推测与脂质代谢及毒力相关。经验证，在感染A549细胞过程中，突变菌株黏附能力和侵袭能力显著降低。在7H9培养基中，该突变菌株生长速度在生长后期显著快于野生菌株。在7H11培养基中，该突变菌株单菌落形态与野生菌株相比无显著差别。本发明的突变菌株与突变基因的关系研究显示突变菌株所述表型与失活基因FadD18的毒力相关。黏附和侵袭是细菌实现感染的重要步骤，病原菌毒力能够直接影响着宿主的免疫反应水平。因此，牛分枝杆菌卡介苗B2909突变株的成功构建及其所涉及基因FadD18相关功能的研究将对阐明牛分枝杆菌属成员的相关致病机制及开发更为安全有效的疫苗具有重要的参考价值。

本发明的技术方案如下所述：

申请人所用的牛分枝杆菌卡介苗为巴斯德株BCG【美国模式培养物保藏所(ATCC)：35734】为美国俄勒冈州立大学Luiz Bermudez教授馈赠。本发明的前期工作包括对保藏的牛分枝杆菌卡介苗巴斯德株的复苏及培养。

本发明以牛分枝杆菌卡介苗巴斯德株(ATCC：35734)为野生菌株，利用具有温敏特性的噬菌体MycoMarT7，将Himar 1转座子转化到牛分枝杆菌卡介苗中，利用卡那霉素做抗性筛选标志，对突变菌株进行筛选，从而成功构建突变体库。本发明利用细胞侵袭模型从突变体库中筛选出侵袭能力降低的突变株，得到了侵袭能力显著降低的BCG突变菌株B2909(BCG::Tn FadD18)，申请人将该突变株命名为Mycobacterium bovis BCG PasterurB2909，于2018年12月6日送交中国·武汉·武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2018866。将本发明筛选的突变株B2909与牛分枝杆菌卡介苗野生株分别接种于7H9培养基中，进行生长曲线检测，结果显示突变株B2909在生长后期的生长速度显著高于野生菌株。将突变株B2909与牛分枝杆菌卡介苗野生株分别接种于7H11培养基中，菌落形态观察显示两者无明显差别。

本发明构建的突变菌株涉及基因为FadD18(核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示)，预测该基因与脂质代谢及毒力相关，目前尚未检索到相关文献报道该基因的功能。

本发明具有以下优点：

1、本发明的B2909菌株是发明人从牛分枝杆菌卡介苗突变体库中筛选获得的黏附及侵袭能力降低的突变株。

2、本发明的B2909菌株已被发明人证实相对于牛分枝杆菌野生菌株呈现显著的生长迅速的表现。

3、本发明的B2909菌株已被发明人证实与牛分枝杆菌野生菌株具有相似形态。

4、本发明所涉及的FadD18基因为一个新基因，该基因具有黏附及侵袭功能，并且细菌的降低生长速度。

更详细的技术方案请参见《具体实施方式》。

附图说明

图1：本发明的牛分枝杆菌卡介苗侵袭能力改变突变菌体高通量筛选部分结果。附图标记说明：图1中A图-F图分别是对突变体库中不同突变体进行筛选的结果，由于篇幅所限，仅对其中部分结果进行了展示。图1中的F图中的方框所示为低侵袭能力突变株B2909。整个实验中的“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01，“***”表示P<0.001。

图2：本发明牛分枝杆菌卡介苗突变株B2909感染A549细胞后侵袭能力定量检测分析图。“***”表示P<0.001。B2909相较野生株侵袭能力显著下调。

图3：本发明牛分枝杆菌卡介苗突变株B2909所涉及FadD18基因的核苷酸序列(如序列表SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列一致)。

图4：本发明牛分枝杆菌卡介苗突变株B2909所涉及基因FadD18的核苷酸序列(如序列表SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列一致)。其中在该基因的581位点、基因组3925305位点后发生转座子插入失活。

图5：是本发明牛分枝杆菌卡介苗突变株B2909感染A549细胞后黏附能力定量检测分析图。附图标记说明：“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01，“***”表示P<0.001。感染30min后B2909株黏附能力显著低于野生株。

图6：是本发明牛分枝杆菌卡介苗在7H9培养基中生长曲线分析图。附图标记说明：“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01，“***”表示P<0.001。感染21d和27d，突变株B2909生长速度显著高于野生株。

图7：是本发明牛分枝杆菌卡介苗菌落形态图，附图标记说明：图7中的A图为野生菌株BCG，图7中的B图为突变子。

具体实施方式

对序列表的说明：

SEQ ID NO:1是本发明分离的牛分枝结核杆菌突变体基因FadD18的核苷酸序列。

实施例1：牛分枝杆菌卡介苗低侵袭力突变体的筛选和鉴定

1.1牛分枝杆菌低侵袭力突变体高通量筛选

将牛分枝杆菌卡介苗突变体库中克隆子逐一转移至7H9液体培养基(7H9液体培养基购自BD公司)中培养，利用A549细胞(美国俄勒冈州立大学Luiz Bermudez教授馈赠)感染模型对牛分枝杆菌卡介苗突变体库进行高通量筛选。将A549细胞在12孔细胞培养板中培养，待长成单层并达到2×10⁵个/孔后，按照感染比10:1加入细菌，于37℃、5％CO₂培养箱中作用1h后加入庆大霉素(终浓度100μg/ml)杀死胞外细菌，充分洗涤后用Triton X-100(Bio-Rad公司)进行裂解细胞，收集胞内菌涂布7H11固体(购自BD公司)平皿，于37℃、5％CO₂培养箱中培养约15天。通过细菌计数发现，64株突变子侵袭能力相较野生株BCG发生了显著变化，其中28株表现为侵袭能力降低，36株表现为侵袭能力增强(图1)。

1.2牛分枝杆菌卡介苗低侵袭力突变体定量检测分析

为了验证1.1步骤中的结果，对侵袭能力降低的28株突变子进一步进行了定量检测分析。将A549细胞按照2×10⁵个/孔铺至12孔细胞培养板，利用感染比为10:1将初筛的突变体逐一接种至A549细胞中，设置野生株卡介苗为对照。将突变体与A549细胞在37℃、5％CO₂培养箱中作用1h后加入庆大霉素(终浓度100μg/ml)杀死胞外细菌，充分洗涤后裂解细胞，利用常规菌落计数法定量测定突变体菌落数。结果显示，在28株突变子中，有10株突变子具有稳定的侵袭能力，在两次试验中均表现为侵袭能力降低。其中，本发明的突变株B2909与牛分枝杆菌野生株相比侵袭能力降低了3.9倍，差异达极显著(图2)，进一步对其功能进行验证。

同时，申请人将该突变菌株命名为Mycobacterium bovis BCG Pasterur B2909，于2018年12月6日送交中国·武汉·武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2018866。

1.3对B2909菌株突变基因的鉴定

利用常规的CTAB法抽提牛分枝杆菌卡介苗B2909突变体基因组DNA，对Himar1转座子与牛分枝杆菌卡介苗基因组连接处进行测序，将测序结果与牛分枝杆菌卡介苗全基因组序列进行比对，结果显示，B2909所涉及基因为FadD18(图3)其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO:1所示，转座子的插入位点位于基因组3925305位点后，以及位于FadD18基因581位点后(图4)。因此申请人将该突变子命名为BCG::Tn FadD18。

实施例2：牛分枝杆菌卡介苗低侵袭力突变体黏附能力的检测

为了验证突变体黏附能力，将A549细胞按照2×10⁵个/孔铺至12孔细胞培养板，利用感染比为10:1将突变体接种至A549细胞中，设置野生株卡介苗为对照。将突变体与A549细胞在4℃孵育30min。孵育结束后，用磷酸盐缓冲液(即PBS,0.01M,pH 7.4 PBS,Hyclone公司)洗涤3次，然后向每孔中加入1mL的0.025％Triton X-100，放置于室温裂解15min，用移液器反复吹打均匀后取100μL进行连续10倍稀释，取适当稀释倍数的裂解液均匀涂布于7H11平板，于37℃温箱培养约21d后进行菌落计数。结果显示，B2909突变株的黏附能力相较野生株显著降低2.2倍(P<0.01)。(图5)。

实施例3：牛分枝杆菌卡介苗生长曲线检测

取牛分枝杆菌卡介苗野生株和突变株B2909以1:100(体积比)的比例接种7H9液体培养基中，静置于37℃、5％CO₂培养箱中连续培养27天，每3天取适当菌液测量OD₆₃₀值，结果显示突变菌株在第21天和第27天的生长速度显著高于野生菌株(图6)，均上升1.2倍。统计学差异显著。暗示了突变株B2909所失活的基因具有降低细菌生长速度的功能。

实施例4：牛分枝杆菌卡介苗的形态学观察

将培养至对数末期的牛分枝杆菌卡介苗野生株和突变株B2909分别稀释适当倍数，涂布于7H11固体培养基上，于37℃、5％CO₂培养箱中培养14天后观察卡介苗菌落形态，结果显示B2909突变菌株菌落与野生菌株无显著差别(图7)。

综上，本发明的牛分枝杆菌突变株B2909相对于牛分枝杆菌野生菌株对宿主细胞的黏附能力显著降低，因此侵入能力也明显下降。在生长后期表现为一定的快速生长能力，但随后与野生株无显著差异。黏附及侵袭力的降低与细菌的毒力相关。本发明所筛选出的突变株黏附能力及侵袭能力均明显下降，其毒力相较野生株也有明显降低，因此有望在结核病疫苗(或药物)的制备方面具有广泛的应用价值。

名词术语说明：

牛分枝杆菌卡介苗B2909涉及基因以FadD18表示。

牛分枝杆菌卡介苗B2909基因突变株以突变株B2909或B2909突变株表示。

主要参考文献：

1.OIE:Global TB 2018.2018；

2.Ginsberg AM:Designing tuberculosis vaccine efficacy trials-lessonsfrom recent studies.Expert Rev Vaccines 2019:1-10；

3.Zhang Y,Li J,Li B,Wang J,Liu CH:Mycobacterium tuberculosis Mce3Cpromotes mycobacteria entry into macrophages through activation of beta2integrin-mediated signalling pathway.Cell Microbiol 2018,20；

4.Ashiru OT,Pillay M,Sturm AW:Adhesion to and invasion of pulmonaryepithelial cells by the F15/LAM4/KZN and Beijing strains of Mycobacteriumtuberculosis.J Med Microbiol 2010,59:528-533。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种牛分枝杆菌卡介苗低黏附力及低侵袭力突变株B2909

<141> 2019-04-13

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1299

<212> DNA

<213> 牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1299)

<400> 1

atgcaagtgg tcaacgtggc tacgctgccg gggattgtcc gggcctcgta tgcgatgccc 60

gatgtgcact ggggatatgg tttcccaatc ggcggcgtgg ccgcaaccga cgtcgacaat 120

gatggagtcg tttccccagg cggtgtcggc ttcgatattt cgtgcggcgt aagactcttg 180

gtcggcgaag ggctggaccg cgaggagctg caaccacggt tgccggcggt catggaccgg 240

cttgatcgcg cgataccgcg cggagtgggc acggcgggtg tgtggcgact acccgaccgg 300

aacacgctgc aggaggtgct caccggtggt gcccggtttg cggtggaaca ggggcatggc 360

gtcgcgctag acctcgagcg gtgcgaagac ggcggtgtga tgacaggagc ggacgcggcc 420

aaaatcagtg accgggccct ccaacgcggg cttgggcaga tcggcagcct tggctcgggc 480

aaccacttcc tggaagtcca ggccgtggac cgcgtctacg atccggttgc ggccgcgccg 540

atgggtctgg cggaagggac cgtctgcgtg atgatccaca ccggctcacg gggcctgggc 600

catcagatct gcacggatca cgtccgccag atggaacaag ccatgggccg atacggaatc 660

gcggtgcccg atcgccaatt ggcttgtgtg ccggtgcact cccccgatgg gcaggcctat 720

ctcgccgcga tggcggcggc ggccaactac ggacgcgcca accgccaact gctgaccgag 780

gcgacgcgtc gtgtgttcgc tgatgcaacc ggaacacctc tggacctgct ctacgacgtg 840

tcgcacaacc tggccaagat cgagacgcat ccgatcgacg gtcagctgcg ctcggtgtgc 900

gtgcaccgca agggcgccac ccgctcgctg ccgccgcacc atcacgagct gccggccgaa 960

ctggcagcgg tcggccaacc cgtgctgata cccgggacga tgggtacggc gtcatatgtg 1020

cttgccgggg tcaccggcaa cccggcgttc ttttccaccg cgcatggtgc tgggcgggta 1080

ctgagccgtc accaggccgc ccgccacacc agcggtgaag cgatacgcgc cagcctcgca 1140

aaacgtggca tcatcgtccg cggtacctct cgtaggggta tcgccgagga aaagccggag 1200

gcctacaaag acgtcgacga ggtcatcgaa gccagccatc agagtggcct cgcgcgcaaa 1260

gtggctcgcc ttgttccctt gggctgtgtc aaaggatga 1299

Claims (2)

1.一株从牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）卡介苗中筛选的突变株B2909，其特征在于，所述突变株B2909保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018866。

2.权利要求1所述的突变株B2909在制备防治牛结核病的疫苗或药物中的应用。

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