CN102271693B - 保护动物对抗由属于诺卡氏菌型放线菌组的细菌感染引起的疾病的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种保护动物对抗由属于具有在动物巨噬细胞内存活能力的诺卡氏菌型放线菌组的细菌感染引起的疾病的药物组合物，其包含诺卡氏菌型放线菌种的活细菌和用于这些活细菌的药物学上可接受的载体，该活细菌通过灭活编码甲基六氢茚满二酮丙酸酯降解中所涉及的蛋白的基因来减毒。

Description

保护动物对抗由属于诺卡氏菌型放线菌组的细菌感染引起的疾病的药物组合物

本发明涉及一种保护动物对抗由属于诺卡氏菌型放线菌组的细菌感染引起的疾病的药物组合物。本发明还涉及该组的活减毒细菌用于制造所述组合物的用途和用该组合物治疗动物的方法。 

在放线菌纲的细菌中，存在称为放线菌目的细菌目，通常称为放线菌类。属于该目的细菌是具有高G+C含量的丝状革兰氏阳性细菌(然而，几个种具有复杂的细胞壁结构，这使得经典的革兰氏染色不太合适或甚至不合适，例如，属于放线菌目分枝杆菌科的许多种通常就是这样)。它们最为人所知的是作为土壤居住生物体，尽管各种菌株存在于植物和动物，包括人中。它们产生抗性孢子，其通常粘附于气生菌丝体或菌丝。放线菌目在有机材料的分解中起着重要作用。由于它们的典型特性，将几个种用于工业和制药研究中。 

大部分放线菌对于动物是非致病性的(结合本发明使用的术语动物包括人)。然而，在许多放线菌的亚目(例如，链孢囊菌亚目、微球菌亚目、链霉菌亚目和弗兰克氏菌亚目)中，存在一个亚目，即，棒杆菌亚目，其仅次于大量的非致病细菌，包含相当大数量的动物病原体。显示出这些病原体存在于称为诺卡氏菌型放线菌的系统发生组中，其包括分枝杆菌科、诺卡氏菌科和棒杆菌科(参见，例如，第11章，标题为：Rhodococus equi：Pathogenesis and Replication in Macrophages(马红球菌：巨噬细胞中的发病机理和复制)，见“Opportunistic Intracellular Bacteria and Immunity”(机会性胞内细菌和免疫)，Lois J.Paradise等(编辑)，纽约，1999)。显然，对抗较大部分的与这些病原体感染相关的疾病，几乎不存在任何合适的预防性处理(即，暴露于引起疾病的病原体之前或几乎同时的处理，这可能能够预防感染的疾病，或至少减轻疾病的影响)。在近些年中， 已经证实了诺卡氏菌型放线菌的系统发生组的分枝杆菌科、诺卡氏菌科和棒杆菌科是棒杆菌亚目内非常相关的科(请参阅，University of California，San Diego，Outline of Senior Project，Marelle L.Yehuda，2005年6月2日)。还变得清楚的是特别是该组中的致病细菌，至少对于其没有合适的预防性处理可用的致病细菌(如，例如，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、黄尾脾脏诺卡氏菌(Nocardia seriolae)和马红球菌(Rhodococcus equi))，具有重要的共有特性：感染通常通过皮肤或粘膜发生，接着该细菌在巨噬细胞内传播并且在这些巨噬细胞内复制(参见，例如，Microbes and Infection 7，2005，1352-1363；Proceedings of the National Academy of Sciences，2005年6月7日，Vol.102，no 23，pp 8327-8332；Nature Medicine 13，282-284，2007；Transplantation Proceedings，Vol.36，Issue 5，2004年6月，pp1415-1418)。实际上，巨噬细胞是在对抗微生物感染的宿主免疫防御的前线，但与依赖于避免噬菌作用以在宿主中存活的细菌不同，目前设想的该组内的致病细菌靶向巨噬细胞以存活，甚至在宿主中复制。本发明与这些具有在动物的巨噬细胞内存活能力的细菌有关，并且结合本发明将被称为巨噬细胞存活诺卡氏菌型放线菌。 

显然，巨噬细胞存活诺卡氏菌型放线菌已经进化以逃避动物对抗微生物的防御的关键功能。特别地，肺结核分枝杆菌，即肺结核的成因微生物，是已经成功地利用巨噬细胞作为其体内的主要小生境的种，但属于诺卡氏菌型放线菌组的其他细菌种，包括分枝杆菌科、诺卡氏菌科和棒杆菌科，已经采用了相同策略。这些是例如引起布路里溃疡的溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)，引起牛约内氏病的鸟副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium paratuberculosis)并且这与人的节段性回肠炎相关，引起牛肺结核的牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)，与免疫受损患者(如，AIDS病人)的机会感染相关的鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)，引起鱼诺卡氏病的黄尾脾脏诺卡氏菌和皮诺卡氏菌(Nocardia farcinia)，引起肾移植接受者感染的星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)，引起马驹肺炎的马红球菌(之前称 为棒杆菌)并且其也与免疫受损患者的机会感染相关，引起绵羊、山羊、马和偶尔还有人等中的例如肺部脓肿的假结核棒杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)。所有这些细菌种都具有共有的在巨噬细胞内存活，感染它们并在该类型的宿主细胞内复制的能力。 

这种典型的特性严重地妨碍了由属于巨噬细胞存活诺卡氏菌型放线菌组的细菌感染引起的疾病的治疗(在本说明书，术语“病症(disorder)”用作“疾病(disease)”的等价体)。在许多病例中，当临床体征实际存在时，治疗是使用抗生素。然而，这是麻烦的，因为相当大量的细菌存在于巨噬细胞内，并且抗生素难以到达。因此，使用抗生素的治疗常常花费很长的治疗时间，并且成效不一。对于诸如人的肺结核、鱼诺卡氏病和马驹肺炎这样的疾病，预防性处理将是优选的。这样的预防性处理通常依赖于使用包含源自野生型细菌的杀灭的或活的减毒细菌的疫苗。关于巨噬细胞存活诺卡氏菌型放线菌，已经证明了杀灭的疫苗(即，包含杀灭的细菌或其一个或多个亚基作为治疗剂的疫苗)是不成功的。目前，通常认为对于成功的对抗巨噬细胞存活诺卡氏菌型放线菌的预防性处理需要活细菌，因为只有这些才能具有到达巨噬细胞并模拟野生型细菌足以引发合适的免疫应答的能力。实际上，为了治疗肺结核，基于牛分枝杆菌种的活疫苗(BCG，卡介苗)是可用的，该种与肺结核分枝杆菌密切相关。然而，保护作用并不令人印象深刻。对于诸如马红球菌和黄尾脾脏诺卡氏菌这样的诺卡氏菌科种，目前没有可购得的疫苗。对于假结核棒杆菌，已经尝试了使用自体疫苗的控制，然而，成效不一(RUMA Guidelines，National Office of Animal health，Hertfordshire，英国，2006)。 

显然，对保护动物对抗由巨噬细胞存活诺卡氏菌型放线菌感染引起的疾病的合适的预防性处理存在着需求。该意义上的处理意思是刺激靶动物的免疫系统，足以至少降低野生型微生物攻击的负面影响。目标是这导致对抗疾病的保护，即，预防疾病，或至少减轻动物中感染的水平或疾病的临床体征，并且因此也减轻了疾病的严重性。巨噬细胞存活诺卡氏菌型放线菌为了在宿主中存活已经采用了相同的策略 这一事实产生了用于对抗这些细菌感染的预防性处理的共有策略的想法。 

在这点上，注意到已经在文献中描述了胆固醇代谢在诺卡氏菌型放线菌在巨噬细胞内的存活中起着关键作用，并且可能是重要的毒力因子(Proceedings of the National Academy of Science，2007年2月6日，2007，vol.104，no.6，pp1947-1952)。还表明了该代谢提供了用于对抗引起疾病的菌株的新治疗剂的逻辑上的靶，即，发生感染后用于治疗的药物。实际上，事后使用时，对于以下确定的事实存在其他支持的证据：对于所有巨噬细胞存活诺卡氏菌型放线菌，胆固醇代谢在细菌在宿主巨噬细胞内的存活和持久性中起着作用。例如，从第11章(题目为：Rhodococus equi：Pathogenesis and Replication in Macrophages(马红球菌：巨噬细胞中的发病机理和复制)，见“Opportunistic Intracellular Bacteria and Immunity”(机会性胞内细菌和免疫)，Lois J.Paradise等(编辑)，纽约，1999)，已知在由几种诺卡氏菌型放线菌引起的感染之间存在很大的临床症候学的相似性，并且确定了胆固醇氧化酶是毒力因子的酶成分。在Veterinairy Microbiology(兽医微生物学)，Volume 56，Issue 3-4，1997年6月，269-276中，显示了假结核棒杆菌与马红球菌一起参与胆固醇氧化酶过程。 

因此，在最初考虑下，似乎试图利用胆固醇代谢在这些细菌在巨噬细胞内的存活中起着关键作用的认识研发药物组合物来保护动物对抗由巨噬细胞存活诺卡氏菌型放线菌感染引起的疾病(这样的组合物还可以称为疫苗)。然而，一旦实现以上提及的PNAS论文(2007论文)中提出的有关药物的建议，并因此针对通过干扰胆固醇代谢完全杀灭细菌，执行相同的策略似乎对于活疫苗是不合适的：如果尝试通过在复制的必需位点切断其存活来使细菌减毒，则该细菌将不会在宿主动物中复制和持久。实际上，对于使用药物的治疗，这是理想的情况。然而，对于活疫苗，如果完全阻断细菌的存活，预期可模拟包含杀灭的细菌的疫苗。 

已经证明了这样的疫苗对于处理巨噬细胞存活诺卡氏菌型放线菌是不成功的。尽管如此，已经进行了尝试以评价在用于保护动物对抗野生型的引起疾病的诺卡氏菌型放线菌攻击的药物组合物中胆固醇代谢削弱的活细菌的使用。这类尝试的实例是基于野生型马红球菌株103+的胆固醇氧化酶(ChoE)突变体的活疫苗(Prescott in Veterinary Microbiology 118，2006，pp240-246)。这种尝试是不成功的。然而，不是因为没有诱导保护作用，如人们基于以上提及的PNAS论文的技术教导(PNAS，2007年2月6日，vol.104，no.6，pp1947-1952)可以预期的，而是因为突变菌株仍然太毒。该突变体仍能以与野生型马红球菌相当的水平在巨噬细胞中存活和扩增。此外，该胆固醇削弱突变体的抗原负荷看来似乎与野生型生物体的相当。因此，该突变体仍然能够诱发疾病。实际上，同时还确定了活的突变体马红球菌根本不能吸收胆固醇(由Van der Geize等提出的固醇摄取透性酶突变体supAB，见4^th，Havemeyer Workshop on Rhodococcus equi，Edinburgh，2008年7月13-16日；和Van der Geize等：“A novel method to generate unmarked gene deletions in the intracellular pathogen Rhococcus equi using 5-fluorocytosine conditional lethality”(使用5-氟胞核嘧啶条件致死在胞内病原体马红球菌中产生未标记基因缺失的新方法)，见Nucleic Acids Research 2008；doi：10.1093/nar/gkn811，更多的还涉及“Van der Geize等，2008”)，这意味着阻断了全部的胆固醇代谢(至少当胆固醇被用作起始化合物时)，仍然能够在巨噬细胞中存活和持续存在(Van der Geize等，2008)，并因此仍然太毒。为了使活的马红球菌减毒，似乎需要具有胆固醇代谢以外的作用的额外突变(Prescott：Veterinary Microbiology 125，2007，100-110)。基于这些结果，推断出胆固醇代谢同样不是重要的毒力因子，并且可以被用于充分地使这些细菌减毒。具有胆固醇代谢突变的细菌明显具有与野生型生物体相同或至少相当的抗原负荷，因此，尽管能够提供适当的保护作用(即：如果受试动物幸免于突变细菌的攻击)，但毒性太强以致不能用于药物组合 物中。因此，认为针对用于预防性处理的药物组合物是一条死胡同，该组合物含有通过灭活胆固醇代谢中所涉及的基因来减毒的活细菌。 

然而，令人惊讶地，申请人发现了为了保护动物对抗由巨噬细胞存活诺卡氏菌型放线菌感染引起的疾病，可以使用包含诺卡氏菌型放线菌种活细菌(通常是与感染细菌相同的种，或可替换地，是非常密切相关的种，因此具有许多共有的T-细胞表位，结核分枝杆菌与牛分枝杆菌就是这种情况)和用于携带细菌的药物学上可接受载体的药物组合物，通过灭活编码甲基六氢茚满二酮丙酸酯降解中所涉及的蛋白的基因而使活细菌减毒。 

在该意义上“减毒的”意思是能够诱导与减毒细菌的有毒(通常是野生型)致病相对物相关的疾病的全套症状。 

在本发明意义上的“灭活”表示基因，例如同时是操纵子的一部分(即，实际上在功能水平上表达蛋白所必需的一组基因)，从基因组中完全除去或改变(通过任何已知的或甚至需要设计的技术；参见，例如，Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering(生物技术和遗传工程介绍)，A.J.Nair，INFINITY SCIENCE PRESS LLC，2008，第13章，“Genetic Techniques”(遗传技术)，pp476-496和第15章，“Recombinant DNA Technology”(重组DNA技术)，pp563-612)，使得其不再编码相应的野生型蛋白，或不再易于完全转录，或基因组中的任何其他变化，使得通过体内的减毒细菌将不会形成野生型蛋白，至少与其中基因(或操纵子，如果合适)是适于支持正常代谢的形式的情况相比是不适于支持正常甲基六氢茚满二酮丙酸酯分解代谢的水平。 

在本发明意义上的“编码蛋白”意思是基因(例如，同时是操纵子的一部分)直接编码蛋白或蛋白的亚基(多个亚基一起形成酶活性蛋白)，或编码一个或多个直接或通过多个步骤在蛋白或其亚基中转化的中间体(多个亚基一起形成酶活性蛋白)。 

“药物学上可接受的载体”可以是与靶动物在生理上相容和靶动物可接受的任何溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸 收延迟剂等，例如，通过无菌来制得。这些携带介质的一些实例是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、细菌培养流体、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其组合。它们可以提供液体、半固体和固体剂型，这将取决于所打算的给药模式。如通常所知的，携带介质的存在对于疫苗的功效不是必需的，但可以显著简化抗原的剂量和给药。除了该载体和抗原，药物组合物可以包含其他物质，诸如加入佐剂、稳定剂、粘度调节剂或其他成分，这取决于所打算的用途或所需的组合物特性。 

在本发明的药物组合物中，存在活的细菌，该细菌是突变的，使得编码甲基六氢茚满二酮丙酸酯降解中所涉及的蛋白的基因被灭活。如通常所知的，在胆固醇通过放线菌(包括巨噬细胞存活诺卡氏菌型放线菌)降解的过程中，形成了甲基六氢茚满二酮丙酸酯(也称为HIP或3aα-H-4α(3’-丙酸)-7αβ-甲基六氢-1，5-茚满二酮)和5-羟基-甲基六氢茚酮丙酸酯(也称为HIL或3aα-H-4α(3’-丙酸)-5α-羟基-7αβ-甲基六氢-1-茚酮-δ-内酯)。最近，已经在属于棒杆菌目的亚目的细菌种中鉴定出操纵子(称为ipdAB：茚满二酮丙酸酯降解α+β)，该操纵子编码HIP降解中所涉及的转移酶的α和β亚基(参见共同未决的国际专利申请PCT/EP2008/060844，2008年8月19日提交，基于2007年8月21日提交的US优先权申请)。已知的转移酶敲除突变体不再能够降解HIP和HIL(参见以上提及的专利申请的图3)，也不再在HIP、HIL或4-雄烯-3，17-二酮上生长。在任何情况中，“涉及HIP降解”意思是敲除突变体不再能够在作为唯一碳源和能源的HIP上生长，或至少不能够在通过非突变细菌可获得的水平下的HIP上生长。目前，不清楚转移酶是否使HIP降解自身异化，或是否催化HIP降解所依赖的反应。尽管如此，HIP降解在胆固醇代谢中相对后的阶段中发生，并且是胆固醇降解途径中非常特别的步骤。基于公众可获得的关于胆固醇代谢中的突变的知识(以上提及的Prescott参考文献)，将预期这种突变会导致活细菌极其毒，尽管其提供了保护作用。然而，令申请人惊讶的是，这样的突变体似乎得到了适当减毒，这是由于突变体在巨噬细胞内明显降低的存活能力引起的。为什么涉及HIP降解的基因 在巨噬细胞内的存活中起着这种重要作用的原因是不清楚的。甚至看来与现有技术的结果相抵触，现有技术的结果显示了连胆固醇代谢的完全阻断都具有差的减毒作用，这显然是因为对诺卡氏菌型放线菌的巨噬细胞存活能力没有作用。因此，非常令人惊讶地发现，本发明的突变，其影响胆固醇代谢途径中的次要步骤，严重地阻碍致病诺卡氏菌型放线菌在巨噬细胞中的存活能力。特别地，已经发现了突变的活细菌仍然能够进入巨噬细胞，并且在其中继续存活(因此保证了保护性免疫应答的刺激)，但在非常低的水平上，这看来似乎明显降低了它们的毒力，这随后使其适用于预防性处理。 

在一个实施方案中，将一个操纵子中的多基因灭活。通过灭活多基因，细菌变成野生型(类似)表型的机会将降低。特别地，将基因ipdA和ipdB灭活。通过灭活这些基因，可以提供有效且安全的减毒。在优选的实施方案中，通过未标记基因缺失来缺失至少一个基因，以实现灭活。未标记突变的优点在于可以在相同菌株中重复引入突变。在引入突变的过程中除去外源DNA(载体DNA)。因此，用于引入第二个突变的新引入的载体DNA不能在之前的突变位点整合(通过载体DNA之间的同源重组)。如果载体DNA仍然存在于染色体中，将明确地发生整合，并将产生大量的假阳性整合体。系统能够使用唯一的抗生素基因，用于引入无数的突变。未标记突变还使得在工业中易于使用，因为不存在异源DNA，使发酵液易于处置。通过基因缺失的基因灭活能够构建稳定的、非回复变异的突变体。尤其是，与通过单重组整合的基因破坏相比，通过基因缺失更容易灭活小基因(＜500bp)。基因缺失诱变还可以用于灭活来自基因组的几个基因的簇。基因缺失诱变策略还可以用于基因-置换(例如，将野生型变成突变基因)。 

在一个实施方案中，细菌属于诺卡氏菌科或分枝杆菌科。优选，细菌属于红球菌属。诺卡氏菌或分枝杆菌，特别是属于马红球菌、黄尾脾脏诺卡氏菌、结核分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、牛分枝杆菌或鸟副结核分枝杆菌中的任一种。关于这些种，迄今为止没有可购得的合适 疫苗。本发明提供了可以用作疫苗的药物组合物以对抗这些细菌，并因此减轻它们在动物中引起的相应疾病。 

在一个实施方案中，药物组合物是适于口服给药的形式。除了这是非常方便的给药方式这一事实以外，特别变得清楚的是这种给药方式是安全的。非肠道给药可能产生脓肿。优选，活细菌以1x10⁴至1x10¹⁰CFU/剂的浓度存在。 

本发明还涉及源自以编号CNCM I-4108或编号CNCM I-4109保藏于法国巴黎的Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes of the Institut Pasteur的菌株的马红球菌，并且涉及属于该菌株的细菌。 

本发明还涉及具有在动物的巨噬细胞内存活能力的属于诺卡氏菌型放线菌组的活细菌的用途用于制造保护动物对抗由相应野生型细菌感染引起的疾病的药物组合物，通过灭活编码甲基六氢茚满二酮丙酸酯降解中所涉及的蛋白的基因将活细菌减毒。 

本发明还涉及治疗动物的方法，以保护其对抗由具有在动物的巨噬细胞内存活能力的属于诺卡氏菌型放线菌组的细菌感染引起的疾病，该方法包括将包含诺卡氏菌型放线菌种的活细菌的药物组合物给予动物，该活细菌通过灭活编码甲基六氢茚满二酮丙酸酯降解中所涉及的蛋白的基因来减毒。 

将使用以下描述本发明特定实施方案的实施例来进一步阐述本发明，这些实施方案覆盖三个部分： 

部分A：菌株的鉴定和构建 

部分B：作为体内减毒模型的巨噬细胞存活 

部分C：突变细菌在对抗野生型感染的保护中的功效 

部分A：菌株的鉴定和构建 

A1 培养基和生长条件

使马红球菌菌株在30℃(200rpm)下生长于由Bacto-胰蛋白胨(BD)、酵母提取物(BD)和1％NaCl(Merck)组成的Luria-Bertani (LB)培养基或矿物醋酸盐培养基中。使耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)mc²155(Snapper等，1990，Mol.Microbiol.4：1911-1919)在37℃(200rpm)下生长于补充了0.05％吐温80的BBL胰胨豆胨培养液(TSB；BD)中。矿物醋酸盐培养基(MM-Ac)含有K₂HPO₄(4.65g/l)、NaH₂PO₄·H₂O(1.5g/l)、醋酸钠(2g/l)、NH₄Cl(3g/l)、MgSO₄·7H₂O(1g/l)、硫胺素(40mg/l，无菌过滤；Sigma)和Vishniac储液(1ml/l)。如下制备储液(修改自Vishniac和Santer，1957，Rev.21：195-213)：将EDTA(10g/l)和ZnSO₄·7H₂O(4.4g/l)溶解于蒸馏水中(pH8，使用2M KOH)。然后，依次加入pH6的CaCl₂·2H₂O(1.47g/l)、MnCl₂·7H₂O(1g/l)、FeSO₄·7H₂O(1g/l)、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O(0.22g/l)，CuSO₄·5H₂O(0.315g/l)和CoCl₂·6H₂O(0.32g/l)，并且最终在pH4储存。 

对于在固体培养基上的生长，加入Bacto-琼脂(15g/l；BD)。在蒸馏水中制备5-氟胞嘧啶(Sigma-Aldrich)储液(10mg/ml)，通过加热至50℃来溶解，无菌过滤并加入高压灭菌的培养基中。 

使黄尾脾脏诺卡氏菌菌株INS436常规地在26℃(200rpm)下生长于补充了吐温80(0.05％)的Eugon肉汤(BD)中。对于在固体培养基上的生长，加入Bacto-琼脂(15g/l；BD)。将蔗糖(2％)加入琼脂培养基中，用于sacB依赖性蔗糖选择。 

A2 马红球菌菌株103+中的ipdA、ipdB和fadE30以及黄尾脾脏诺卡氏菌INS436中的ipdAB的鉴定

如以上所示，发现在甲基六氢茚满二酮丙酸酯(HIP；3aα-H-4α(3’-丙酸)-7αβ-甲基六氢-1，5-茚满二酮)和5-羟基-甲基六氢茚酮丙酸酯(HIL或3aα-H-4α(3’-丙酸)-5α-羟基-7αβ-甲基六氢-1-茚酮-δ-内酯)的降解中涉及红球菌的ipdA和ipdB基因。基因组数据库中红串红球菌(R.erythropolis)菌株SQ1的IpdA和IpdB的蛋白序列的生物信息分析揭示了编码IpdA和IpdB的基因及其表现操纵子组织在马红球菌103+(获自J.F.Prescott，Ontario，加拿大的野生型菌株；如 Veterinary Microbiology 118(2006)240-246中所提及的)的基因组中是保守的。已经通过Sanger Institute，Hinxton，Cambridge，UK的马红球菌测序组确定了马红球菌103+基因组序列(公开为“马红球菌103S”的基因组)。基因组分析进一步揭示了马红球菌103+带有ipdA和ipdB的其他平行进化同源基因，各自称为ipdA2和ipdB2。这些基因位于胆固醇分解代谢基因簇外。IpdA、IpdB、IpdA2和IpdB2的氨基酸序列各自描述于所附的SEQ ID NO.1、2、3和4中。马红球菌103+的IpdA和IpdB蛋白与这些平行进化同源物和几个其他的放线菌定向进化同源物的氨基酸序列识别号列于表6中。该表给出了诺卡氏菌型放线菌其他基因组中鉴定的基因的概览，编码马红球菌103+的IpdA和IpdB的定向进化同源物。结合本发明，将这些和其他定向进化同源物称为IpdA和IpdB。蛋白同一性表示与马红球菌103S的IpdA和IpdB的百分比全长氨基酸序列同一性。放线菌基因组序列获自国际生物技术信息中心(NCBI)的微生物基因组的基因组BLAST服务器。通过Sanger Institute的马红球菌测序组产生了马红球菌103+序列数据。将菌株103+的基因组(称为103S)用于这些鉴定目的。如此后举例说明的，使用马红球菌菌株RE1(分离自患有由马红球菌感染引起的肉芽肿型肺炎的马驹)进行了使用马红球菌的实践工作。 

在甲基六氢茚满二酮丙酸酯降解中所涉及的第二个基因是fadE30。ΔfadE30突变体在HIL和HIP上的生长严重受损，显示出在培养24小时后实际上没有生长。通过在Sanger Institute(http://www.sanger.ac.uk)获得的对马红球菌103+基因组进行的蛋白序列相似性搜寻鉴定出马红球菌103+的fadE30基因。将Rhodococcus jostii菌株RHA1的FadE30的注释蛋白序列(Ro4596，Genbank登录号ABG96382)用作蛋白序列模板(McLeod等，2006，见Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103：15582-15587；和Van der Geize等，2007，见Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104：1947-1952)。用Ro04596的数据库相似性搜寻揭示了马红球菌103S的基因，编码显示出与Ro04596为73％氨基酸序列同一性的蛋白。将该蛋白注释为马红球菌 103S的FadE30(SEQ ID No 43)，并将其相应的基因称为fadE30。可以以相似的方法鉴定编码其他放线菌中的FadE30的定向进化同源基因。这些的选择列于表8中。 

使用放线菌ipdAB基因座的高保守核苷酸序列上产生的寡核苷酸引物，在三个部分中通过PCR扩增了黄尾脾脏诺卡氏菌的ipdAB基因组基因座。通过几个已知的ipdAB基因的放线菌序列的核苷酸序列比对鉴定了这些保守区域。将皮诺卡氏菌的ipdAB区的核苷酸基因组序列(nfa05080-nfa05090)(DDBJ登记号AP006618)用作初级模板来产生寡核苷酸PCR引物。所用的引物寡核苷酸序列列于表5中。将黄尾脾脏诺卡氏菌INS436的染色体组DNA用作PCR的模板。使用引物ipdA-actino-F和ipdB-actino-R(PCR22)扩增了黄尾脾脏诺卡氏菌的ipdAB基因，使用ipd-actino-F2和ipd-actino-R(PCR23)扩增了ipdAB的上游区域，并且使用ipdB-actino-F和ipd-actino-R(PCR21)扩增了下游区域。将PCR产物克隆至pGEM-T克隆载体中，并测定了插入片段的核苷酸序列。随后在所获得的DNA序列上产生了不同的引物对并用于再克隆和再测序ipd基因组。这形成了涵盖4,139bp的黄尾脾脏诺卡氏菌的ipdAB基因组的完整核苷酸序列。测序的DNA片段含有黄尾脾脏诺卡氏菌的ipdA和ipdB基因及其邻近的基因。推定的黄尾脾脏诺卡氏菌INS436的IpdA和IpdB的蛋白序列各自显示于SEQ ID NO 58和SEQ ID NO 59中。 

A3 克隆、PCR和基因组DNA分离

将大肠杆菌DH5α用作所有克隆程序的宿主。限制性酶获自Fermentas GmbH。根据制造商的说明，使用GenElute细菌基因组DNA试剂盒(Sigma-Aldrich)分离了细胞培养物的染色体组DNA。 

在反应混合物(25μl)中进行了PCR，反应混合物由Tris-HCl(10mM，pH8)、1×标准聚合酶缓冲液、dNTP(0.2mM)、DMSO(2％)、PCR引物(各自10ng/μl，表5)和高保真DNA聚合酶(Fermentas)或Pwo DNA聚合酶(Roche Applied Science)。对于 菌落PCR，将细胞材料与100μl的氯仿和100μl的10mM Tris-HCl pH8混合，彻底涡旋并离心(2分钟，14,000×g)。随后将上层水相样品(1μl)用作PCR的模板。标准PCR包括5分钟，95℃，DNA解链步骤，接着95℃45秒变性、60℃45秒退火和72℃1-3分钟延伸的30个循环。所用的延伸时间取决于预期的PCR扩增子的长度，按照一般规则取1.5分钟/1kb。 

A4 马红球菌、耻垢分枝杆菌和黄尾脾脏诺卡氏菌的电转化

基本上按照所述的(Van der Geize等，见以上提及的公认的NAR论文；Navas等，2001，J.Bacteriol.183：4796-4805)，通过电穿孔转化马红球菌菌株的细胞。简而言之，使细胞培养物在30℃下生长于50ml LB中，直至OD₆₀₀达到0.8-1.0。将细胞沉淀(4,500×g，20分钟)并用10％的冰冷甘油洗涤两次。将沉淀的细胞重悬浮于0.5-1ml冰冷的10％甘油中，并分成200μl等份。 

基本上按照所述的(Jacobs等，1991，Methods Enzymol.204：537-555)，通过电穿孔转化耻垢分枝杆菌mc²155的细胞。简而言之，使细胞培养物(250ml)在37℃下生长于TSB培养基+0.05％吐温80中，直至OD₆₀₀达到0.8，置于冰上一个半小时并离心(5,000×g，10分钟)以沉淀细胞。用蒸馏水将细胞沉淀洗涤两次并重悬浮于1ml 10％甘油的最终体积中，并分成200μl等份。 

将MilliQ-洗脱的质粒DNA(5-10μl；GenElute Plasmid Miniprep Kit，Sigma-Aldrich)加入2mm有裂口的比色皿中的200μl细胞中。使用12.5kV/cm，1000Ω和25μF的单脉冲进行了电穿孔。将电穿孔的细胞与1ml LB培养基(马红球菌)或1ml TSB+0.05％吐温80(耻垢分枝杆菌)温和地混合，并使其在37℃和200rpm下回收2小时(马红球菌)或5小时(耻垢分枝杆菌)。将等份(200μl)的回收细胞涂布于选择性琼脂培养基上。在含有阿泊拉霉素(50μg/ml)的LB琼脂上选择马红球菌转化体，并在30℃下培养2-3天后显示出来。在含有卡那霉素(10μg/ml)的TSB+0.05％吐温80琼脂上选择耻垢分枝杆 菌转化体，并在37℃下培养4-5天后显示出来 

对于黄尾脾脏诺卡氏菌，使菌株INS436的预培养物(20ml)在26℃下在Eugon肉汤+0.05％吐温80中生长5天(200rpm)(OD_600nm＝6)，并用于接种100ml的新鲜Eugon肉汤+0.05％吐温80培养基(1∶100)。将初级培养物在26℃下生长过夜，持续20小时，至OD_600nm＝1.3。 

将细胞在4℃沉淀(20分钟，4000g)并用50ml冰冷的10％甘油洗涤两次。将沉淀的细胞重悬浮于500μl 10％甘油中，分成200μl等份，并立即用于电转化。将Milli-Q洗脱的质粒DNA(5-10μl；GenElute Plasmid Miniprep试剂盒，Sigma-Aldrich)加入2mm有裂口的比色皿中的200μl细胞中，混合并在冰上静置1分钟。使用1.75kV/cm，200Ω和50μF的单脉冲进行了电穿孔(大约脉冲时间9.3ms)。将电穿孔的细胞与1ml补充0.05％吐温80的Eugon肉汤培养基温和地混合，并使其在26℃和220rpm下回收3.5小时。将50和100μl等份的回收细胞涂布于补充了0.05％吐温80和卡那霉素(20μg/ml)的选择性Eugon琼脂上。在26℃培养7天后显示出转化体。 

A5 使用5-氟胞嘧啶(5-FC)选择的在马红球菌菌株中的未标记基因缺失

基本上按照所述的(Van der Geize等，2008)，制得马红球菌的未标记基因缺失突变体。将从野生型或突变细胞的电穿孔获得的马红球菌转化体在补充了阿泊拉霉素的LB琼脂培养基上划线，以证实阿泊拉霉素抗性(Apra^R)。使每个转化的四个Apra^R转化体在30℃和200rpm下在25mL LB培养基中生长过夜(20-24小时)，并以10¹-10³倍稀释涂布于100μl等份中补充了5-FC(100μg/ml)的MM-Ac琼脂平板上的MM-Ac培养基中。将在30℃下培养3天后显示出的5-FC抗性克隆重复划线于LB琼脂和补充阿泊拉霉素(50μg/ml)的LB琼脂上，以选择阿泊拉霉素敏感性(Apra^s)和5-FC抗性(5-FC^R)克隆。使用扩增基因缺失的基因座的引物(表5)，通过克隆PCR，检 测了Apra^s/5-FC^R菌落中所需基因缺失的存在。从可能的基因缺失突变体分离出基因组DNA，并用于证实基因缺失，使用扩增ipdAB或ipdAB2基因座的引物，以及这些基因座的上游和下游区域和表5中所述的引物。 

A6 用于在马红球菌中的ipdAB和ipdAB2基因缺失的质粒的构建

如下构建了质粒pSelAct-ipd1，用于产生马红球菌RE1中ipdAB操纵子的未标记基因缺失。通过PCR(表5，PCR1和PCR2)扩增了ipdAB基因的上游(1,368bp；引物ipdABequiUP-F和ipdABequiUP-R)和下游(1,396bp；引物ipdABequiDOWN-F和ipdABequiDOWN-R)侧翼区域。将所获得的扩增子连接EcoRV消化的pBluescript(II)KS，分别产生用于上游和下游区域的质粒pEqui14和pEqui16。将pEqui14的1.4kb SpeI/EcoRV片段连接SpeI/EcoRV消化的pEqui16，产生了pEqui18。用Klenow片段处理带有ipdAB基因缺失及其侧翼序列的pEqui18的2.9kb EcoRI/HindIII片段并连接SmaI消化的pSeIAct自杀载体(Van der Geize等，2008)。将所得到的质粒称为pSeIAct-ipd1，用于构建ipdAB基因缺失突变马红球菌ΔipdAB(也称为RG1341)。将该突变体以编号CNCM I-4108保藏于法国巴黎的Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes of the Institut Pasteur。 

使用质粒pSeIAct-ΔipdAB2，通过马红球菌ΔipdAB突变菌株中ipdAB2操纵子的未标记基因缺失形成了双基因缺失突变马红球菌ΔipdABΔipdAB2(也称为RG2837)。如下构建了质粒pSeIAct-ΔipdAb2。使用基因组DNA作为模板，通过PCR(表5，PCR6和PCR7)扩增了ipdAB2的上游(1,444bp；引物ipdAB2equiUP-F，ipdAB2equiUP-R)和下游(1,387bp；ipdAB2equiDOWN-F，ipdAB2equiDOWN-R)区域。将扩增子连接SmaI消化的pSeIAct，各自形成质粒pSeIAct-ipdAB2equiUP和 pSeIAct-ipdAB2equiDOWN。用BglII/SpeI消化两个质粒后，将pSeIAct-ipdAB2equiDOWN的1,381bp片段连接pSeIAct-ipdAB2equiUP，形成pSeIAct-ΔipdAB2，用于ΔipdAB2基因缺失的构建。将所得到的突变马红球菌ΔipdABΔipdAB2以编号CNCMI-4109保藏于法国巴黎的Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes of the Institut Pasteur。 

A7 用于在耻垢分枝杆菌mc ² 155中的ipdAB基因缺失的质粒的构建

如下构建了质粒pK18-ipdABsmeg，用于耻垢分枝杆菌mc²155中ipdAB基因的未标记基因缺失。 

使用耻垢分枝杆菌mc²155的基因组DNA作为模板，通过PCR(表5，PCR12和PCR13)扩增了ipdAB基因的上游(1,502bp；引物ipdABsmegUP-F和ipdABsmegUP-R)和下游(1,431bp；引物ipdABsmegDOWN-F和ipdABsmegDOWN-R)侧翼区域。将所获得的扩增子连接SmaI消化的pK18mobsacB( 

等，1994，Gene145：69-73)，分别产生pK18-ipdABsmegUP和pK18-ipdABsmegDOWN。随后将获自BamHI/SpeI消化的pK18-ipdABsmegUP的1,5kbDNA片段连接用BamHI/SpeI线性化的pK18-ipdABsmegUP，导致构建了用于ipdAB基因缺失的pK18-ipdABsmeg。 

A8 用于在马红球菌中的fadE30基因缺失的质粒的构建

如下构建了质粒pSeIAct-fadE30，用于产生马红球菌RE1中fadE30的未标记基因缺失。使用高保真DNA聚合酶(Fermentas GmbH)，通过标准PCR(表5；PCR15和PCR16)，扩增了fadE30的上游(1,511bp；引物fadE30equiUP-F和fadE30equiUP-R)和下游(1,449bp；引物fadE30equiDOWN-F和fadE30equiDOWN-R)侧翼基因组区域。将所获得的扩增子连接pGEM-T克隆载体(Promega  Benelux)，产生了pGEMT-fadE30UP和pGEMT-fadE30DOWN。从pGEMT-fadE30DOWN切出1.4kb BcuI/BglII DNA片段，并连接BcuI/BglII线性化pGEMT-fadE30UP，产生pGEMT-fadE30。为了构建pSeIAct-fadE30，用NcoI和BcuI消化pGEMT-afdE30，并用Klenow片段处理。将携带fadE30基因缺失的2.9kb平端DNA片段连接SmaI消化的pSeIAct(van der Geize等，2008)。将所得到的质粒称为pSeIAct-fadE30，并用于构建突变马红球菌ΔfadE30。 

A9 用于在黄尾脾脏诺卡氏菌INS436中的ipdAB基因缺失的质粒的构建

如下构建了质粒pK18ipdABNser，用于黄尾脾脏诺卡氏菌INS436中ipdAB基因的未标记基因缺失。使用黄尾诺卡氏菌INS436的基因组DNA作为DNA模板，通过PCR(图5)扩增了ipdAB基因的上游(1,487bp；引物ipdABNserUP-F和ipdABNserUP-R；PCR24)和下游(1,049bp；引物ipdABNserDOWN-F和ipdABNserDOWN-R；PCR25)侧翼区域。将所获得的扩增子连接SmaI消化的pK18mobsacB( 

等，1994，Gene 145：69-73)，分别产生pK18-ipdABNserUP和pK18-ipdABNserDOWN。随后将获自SmaI/PstI消化的pK18-ipdABNserDOWN的1.07kbDNA片段连接用SmaI/PstI线性化的pK18-ipdABNserUP，导致构建了用于ipdAB基因缺失的质粒pK18-ipdABNser。 

A10 突变株马红球菌ΔipdAB和马红球菌ΔipdABΔipdAB2的构建

使用对马红球菌产生的5-氟胞嘧啶反选择(Van der Geize等，2008)，使用两步同源重组策略，构建了ipdAB(RG1341)和ipdABipdAB2(RG2837)的马红球菌未标记基因缺失突变体。对于ΔipdAB突变马红球菌菌株RG1341的构建，通过电转化将非复制性质粒pSeIAct-ipd1调动至马红球菌菌株RE1。随后将从质粒 pSeIAct-ipd1和RE1基因组之间的同源重组得到的四个Apra^R转化体接受5-FC选择，以选择导致基因缺失的第二个罕见同源重组事件的出现。将十八个随机挑选的Apra^s/5FC^R克隆接受克隆PCR并且三个FC^R/Apra^s菌落产生了预期大小的扩增子(296bp，表5，PCR5)。从这三个ΔipdAB突变体分离出基因组DNA，并接受ipdAB基因座及其上游和下游侧翼区域的PCR分析(表5，PCR3和PCR4)。该分析证实了在三种情况的两种里面，存在真正的ipdAB基因缺失，并揭示了在ipdAB基因座没有异常的基因组重排。通过PCR(表5，PCR11)证实了作为毒性质粒标记的vapA的存在。选择了一个ipdAB突变株，称为马红球菌RG1341，并用于进一步的工作。 

基本上按照对ΔipdAB单突变体所述的，使用质粒pSeIAct-ΔipdAB2，从菌株RG1341构建了双基因缺失突变株RG2837。将获自用pSeIAct-ΔipdAB2电穿孔菌株RG1341细胞的四个Apra^R转化体接受5-FC选择，以选择Apra^s/5-FC^R菌落。随后十八个Apra^s/5-FC^R菌落的PCR分析证实了两个菌落带有ΔipdAB2基因缺失，如从所获得的123bp扩增子明显的，使用产生来扩增ipdAB2操纵子的寡核苷酸(表5，PCR10)。此外，通过PCR的ipdAB2基因座的上游和下游区域的分析证实了ipdAB2基因缺失的存在并且揭示了没有异常的基因组重排(表5，PCR8和PCR9)。此外，通过PCR证实了vapA毒性基因的存在(表5，PCR11)。选择了一个ΔipdABΔipdAB2双基因缺失突变株RG2837，用于进一步的工作。 

A11 突变株耻垢分枝杆菌ΔipdAB的构建

如下，使用sacB反选择系统(Pelicic等，1996，Mol.Microbiol.20：919-925；Van der Geize等，2001，FEMS Microbiol Lett.205：197-202)，构建了耻垢分枝杆菌mc²155的未标记ipdAB基因缺失突变体。对于耻垢分枝杆菌菌株mc²155的ΔipdAB突变体的构建，通过电转化将非复制性质粒pK18-ipdABsmeg调动至耻垢分枝杆菌。获得了几个转化体。将一个卡那霉素抗性转化体在37℃下在含有0.05％吐 温80的TSB培养基中非选择性地生长2天，并随后涂布于含有2％蔗糖的TSB琼脂平板上，以通过sacB反选择来选择卡那霉素敏感性(Km^s)和蔗糖抗性(Suc^R)双重组体。将培养3天后显示出的菌落在TSB琼脂和补充卡那霉素(10μg/ml)的TSB琼脂上重复划线，以选择Km^s/Suc^R菌落。通过克隆PCR进一步检查真实的Km^s/Suc^R菌落，以检测ipdAB基因缺失的存在(表5，PCR14)。从三个可能的ipdAB突变体分离出基因组DNA。PCR分析证实了ipdAB基因缺失的存在，并且选择了一个ipdAB突变株，用于进一步的工作，并称为耻垢分枝杆菌ΔipdAB。 

A12 突变株马红球菌ΔfadE30的构建

使用对马红球菌产生的5-氟胞嘧啶反选择(Van der Geize等，2008)，使用两步同源重组策略，产生了马红球菌RE1中fadE30的未标记基因缺失。对于ΔfadE30突变株的构建，通过电转化将非复制性质粒pSeIAct-fadE30调动至马红球菌菌株RE1。随后将从质粒pSeIAct-fadE30和RE1基因组之间的同源重组得到的两个Apra^R转化体接受5-FC选择，以选择导致fadE30基因缺失的第二个罕见同源重组事件的出现。使用引物fadE30cont-F和fadE30cont-R(表5；PCR19)，将十八个随机挑选的Apra^s/5FC^R克隆接受克隆PCR，并且十三个FC^R/Apra^s菌落产生了预期大小的扩增子(428bp)。从两个可能的ΔfadE30突变体分离出基因组DNA，并接受PCR分析。使用寡核苷酸引物fadE30contr-F和fadE30contr-R(表5)，fadE30基因座的PCR分析证实了fadE30基因缺失的存在和野生型fadE30基因的不存在。通过PCR的上游和下游侧翼区域的分析各自形成了预期的1.86kb和1.76kb产物。分析证实了两种情况中真实的fadE30基因缺失的存在，并揭示了在fadE30基因座没有异常的基因组重排。通过PCR证实了作为毒性质粒标记的vapA的存在。将一个fadE30突变株称为马红球菌ΔfadE30，并用于进一步的工作。 

A13 突变株黄尾脾脏诺卡氏菌ΔipdAB的构建

如下，使用sacB反选择系统(Pelicic等，1996，见Mol.Microbiol.20：919-925；Van der Geize等，2001，见FEMS Microbiol Lett.205：197-202)，构建了黄尾脾脏分枝杆菌INS436的未标记ipdAB基因缺失突变体。通过电转化将非复制性质粒pK18-ipdABNser调动至黄尾脾脏分枝杆菌INS436。然后将几个卡那霉素抗性转化体在26℃下在含有0.05％吐温80的Eugon肉汤培养基中非选择性地生长7天。随后通过涂布于含有2％蔗糖的Eugon琼脂平板上，进行了通过sacB反选择的卡那霉素敏感性(Km^s)和蔗糖抗性(Suc^R)双重组体的选择。将在26℃下培养7天后显示出的菌落在Eugon琼脂平板和补充卡那霉素(20μg/ml)的Eugon琼脂平板上重复挑选，以选择Km^s/Suc^R菌落。使用引物ipdABNser-F和ipdABNser-R，通过克隆PCR进一步检查真实的Km^s/Suc^R菌落，以检测ipdAB基因缺失的存在(表5)。从三个可能的ipdAB突变体分离出基因组DNA。使用引物对ipdABNser-F和ipdABNser-R(PCR23)的PCR分析(PCR23)形成了222bp PCR产物和野生型1,634bp PCR产物的不存在，证实了ipdAB基因缺失的存在。使用引物对IpdABNser-F2和IpdABNserDOWN-Contr-R(PCR26)来进一步证实ipdAB基因缺失。对于ipdAB突变体，该引物对形成了预期的1,148bp的PCR产物，而对于野生型菌株，仅获得2,560bp PCR产物。将一个突变株称为黄尾脾脏诺卡氏菌ΔipdAB，并选择用于进一步的工作。 

部分B：作为体内减毒模型的巨噬细胞存活 

B1使用的菌株

有毒菌株 

菌株RE1：野生型亲本株。该菌株在胆固醇上生长。 

菌株RE1ΔsupAB：supAB基因的缺失。该菌株不能在胆固醇上生长。 

无毒菌株 

菌株103-：缺乏80-至90-kb有毒质粒，并且已知在马中是无病原性的(Takai等2000，Infect.Immun.68：6840-6847)。该菌株在胆固醇上生长。 

根据本发明的菌株 

菌株RE1ΔipdAB(RG1341)：缺失了胆固醇分解代谢簇中的ipdAB基因。该菌株没有在4-雄烯-3，17-二酮(AD)上生长。 

菌株RE1ΔipdAB-AD+：适应于在AD上生长的菌株RE1ΔipdAB的细菌(如果将菌株RE1ΔipdAB涂布于作为唯一碳源的高浓度(超过10⁶CFU/ml)AD下，则出现少数几个能在AD上生长的菌落)。 

菌株RE1ΔipdABipdAB2(RG2837)：还缺失了第二组ipdAB基因(不是胆固醇分解代谢簇的一部分)。该菌株没有在AD上生长。菌株马红球菌ΔfadE30。该菌株对于在HIP/HIL和AD上的生长严重受损。 

B2 用于巨噬细胞感染的马红球菌培养物

使在巨噬细胞存活试验中测试的不同马红球菌菌株在37℃和100rpm下在营养肉汤(Difco)中生长过夜(17小时)，目标在于1-2×10⁸CFU/ml的终浓度。只使用了新鲜制备的培养物。在巨噬细胞培养后，进行了活计数测定(平板计数)，以证实感染性滴度。 

B3 用于马驹攻击的红球菌培养物

将马红球菌菌株RE1、RE1ΔipdAB和RE1ΔipdAB-AD+涂布于血液琼脂上，并在37℃下培养24小时。收集细菌，4ml无菌等渗PBS/平板。用无菌等渗PBS稀释细菌悬浮液，目标在于4×10⁴CFU/ml的终浓度。在环境温度下转运；在制备后4小时内使用了稀释的培养物。攻击后，进行了活计数测定(平板计数)，以证实感染性滴度。活计数分别为RE1 4.35×10⁴CFU/ml，RE1ΔipdAB 7.1×10⁴CFU/ml， RE1ΔipdAB-AD+5.8×10⁴CFU/ml。 

B4 测试系统

巨噬细胞细胞系 

将细胞系U937(人单核细胞)用于测试马红球菌菌株的存活。使单核细胞生长于RPMI 1640+NaHCO₃+NAPYR+葡萄糖培养基(RPMI 1640培养基)，用10mM HEPES缓冲并补充了200IU/ml青霉素和链霉素以及10％胎牛血清(FBS)。将细胞在37℃和5％CO₂下在悬浮液中生长。 

马驹 

使用了八匹马驹：七匹3至5周大的马驹，一匹7周大(都伴随着母马)。将马驹分成3组，3，3和2匹马驹，估计年龄在组里的平均分布。在隔离的设备中圈养。在实验过程中，给马驹吮奶，并且根据标准程序来喂养母马。新鲜自来水可以随意饮用。 

在T＝0，使用有针的注射器，用100ml的菌株RE1、RE1ΔipdAB或RE1ΔipdAB-AD+的攻击培养物在气管内攻击所有马驹(参见以上“用于马驹攻击的红球菌培养物”下的内容)。 

B5 实验程序和参数

巨噬细胞存活测试 

对于巨噬细胞存活试验，按照之前所述的，使单核细胞生长数天。用新鲜培养基更换培养基，并用60ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-醋酸酯(PMA)将细胞激活过夜，以诱导它们分化成巨噬细胞。 

将分化的细胞沉淀(5分钟，200×g)，并将沉淀物重悬浮于新鲜的、无抗生素的、含有10％FBS的RPMI 1640培养基。对于每个待测试的菌株，用大约10细菌/巨噬细胞的感染复数(MOI)的马红球菌接种含有10ml大约10⁶细胞/ml的细胞悬浮液的试管。 

用巨噬细胞将细菌在37℃和5％CO₂下培养1小时。用10ml补充10％FBS和100μg/ml庆大霉素的RPMI 1640培养基更换培养基，并再次培养1小时，以杀灭任何胞外细菌。将巨噬细胞(含有内在化马红球菌)沉淀(5分钟，200×g)，并将沉淀重悬浮于40ml RPMI1640培养基中，该培养基用10mM HEPES缓冲并补充了10％FBS和10μg/ml庆大霉素。将悬浮液分在4个培养瓶中(10ml每个)，并在37℃和5％CO₂下培养。在4、28、52和76小时后，将巨噬细胞(每个菌株一个培养瓶)沉淀(5分钟，200×g)，并将沉淀在1ml无抗生素RPMI 1640培养基中洗涤两次。最后，用0.01M磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1％曲通X-100将沉淀裂解，接着活计数测定(平板计数)。 

马驹攻击 

1-直肠温度：在攻击前1天，攻击那天(就在攻击前)和攻击后每日一次测量，直至验尸。 

2-临床检查：在攻击后3周过程中，每日检查马的临床体征。 

3-尸检检查和细菌学：在攻击后21天，将马驹称重，然后通过用甲苯噻嗪(100mg/100kg)和克他命(500mg/100kg)麻醉并随后放血至死来杀死马驹。将肺称重，以计算肺与体重的比例。进行了完整的 尸检检查，特别关注肺和相关的淋巴结。在异常的情况中，取出病理学家认为需要的样品，用于组织学。 

从代表每半个肺叶的七个标准部位切除组织样品(1cm³)(3个位点/半个肺叶+副叶)；如果存在，优先选择每个部位的患病组织。将镜像样品(每半个相等肺叶的两个样品)集合，以产生3个样品/马驹+副叶的样品。将每个(集合的)样品均质，连续稀释并接种于血液琼脂平板上，然后在37℃下培养16-24小时。将红球菌菌落计数，并表示为CFU/ml匀浆。从所有其他异常情况获取其他擦拭样品。将擦拭样品在血液琼脂平板上划线，然后在37℃下培养16-24小时。最初通过其典型的非溶血粘液型菌落形态学来鉴定马红球菌。通过革兰氏染色、API/Phoenix和/或PCR进行了更多鉴定。 

B6 结果

在巨噬细胞中的存活 

两个分开实验的结果显示于表1(结合图1)和表2(结合图2)中。结果显示了RE1ΔsupAB突变体能够以与野生型亲本株RE1相似的方式在巨噬细胞中存活，表明胆固醇代谢对于巨噬细胞存活不是必需的。这与胆固醇代谢本身对于毒力是不重要的认识相一致。相反，菌株RE1ΔipdAB、菌株RE1ΔipdABipdAB2、菌株RE1ΔipdAB-AD+菌株103-在巨噬细胞中的存活明显降低。然而，注意到细菌仍然能够在巨噬细胞中存活，但水平明显降低(通常浓度低于野生型水平100至1000倍)。菌株103-缺乏80-至90-kb有毒质粒并已知在马中是无毒力的(Takai等)。该菌株103-不适于作为疫苗菌株，因为它没有诱导保护性的免疫应答，可能是因为它缺乏有毒质粒。在表9中(结合图4)，显示了突变株马红球菌ΔfadE30与野生型菌株RE1和菌株RE1ΔipdAB相比较的结果。显然，fadE30突变体具有与ΔipdAB菌株相当的存活特征，并且也不太能够在巨噬细胞中存活。 

使用在编码甲基六氢茚满二酮丙酸酯降解中所涉及活性的蛋白的操纵子中具有突变的菌株(即，菌株RE1ΔipdAB、RE1ΔipdABipdAB2、 RE1ΔipdAB-AD+和马红球菌ΔfadE30)的结果表明了这些菌株不太能够在巨噬细胞中存活，特别地，它们的存活能力与无病原性的菌株103-的存活能力相当。这已经是合适减毒的良好表示。菌株RE1ΔipdAB-AD+证明了与菌株RE1ΔipdAB相同的巨噬细胞表型，这表明完整的ipdAB操纵子而不是完整的胆固醇代谢是以野生型水平的巨噬细胞存活必需的。单个ipdAB基因缺失(在胆固醇分解代谢基因簇中)导致了受阻的巨噬细胞存活。这些基因拷贝中的其他缺失(胆固醇分解代谢簇外的ipdA和ipdB，称为ipdA2和ipdB2)在巨噬细胞测试中不具有更多的减毒作用。 

已知这些结果，将菌株RE1ΔipdAB和RE1ΔipdAB-AD+(＝适于在AD上生长的菌株RE1ΔipdAB)气管内给予马驹(正常攻击程序)，并与野生型亲本菌株RE1相比，来测试体内减毒。 

直肠温度 

在表3中(结合图3)，呈现了直肠温度的结果。组1至接受了野生型RE1菌株的组。组2和3各自接受了RE1ΔipdAB和RE1ΔipdAB-AD+。第3天至第10天的温度没有显示，因为它们没有显示出与正常直肠温度的任何明显变化。以粗体表示异常温度。用野生型亲本菌株RE1攻击的三匹马驹中的两匹(第18和19号)从攻击后14天开始清楚地显示出提高的直肠温度。14天后直肠温度的升高与临床体征的发展相符(参见以下)。第21号马驹(用菌株RE1ΔipdAB攻击的)在攻击后1天时显示出温度略有提高(39.1℃)，这很可能与红球菌感染无关(该攻击模型中的培养时间通常为＞7天)。此外，在RE1ΔipdAB或RE1ΔipdAB-AD+攻击的马驹中没有观察到升高的温度。 

攻击后的临床体征 

从第7天至第21天的临床评分真正地显示出用野生型亲本菌株RE1攻击的第18和19号马驹从攻击后第13天开始产生了呼吸道疾 病的体征。第17号马驹(也是RE1攻击组)在攻击后只显示出轻微的临床体征。用突变株RE1ΔipdAB和RE1ΔipdAB-AD+攻击的马驹显示出没有明显的呼吸道疾病体征。后两组的临床表现主要是基于略有增加的心跳，这(部分)也可能是由于操作应力引起的，因为在攻击前也存在。 

尸检检查 

关于肺的尸检发现显示于表4中。用野生型菌株RE1攻击后，马驹产生了呼吸道疾病的体征(特别是第18和19号马驹)。用突变株攻击的马驹保持健康。攻击后21天时，将马驹杀死并验尸。在尸检时，用野生型菌株攻击的所有马驹显示出具有典型的肉芽肿性肺炎，从其中重新分离出马红球菌作为纯培养物并通过PCR证实了野生型菌株的鉴定。从第18号马驹，也从扩大的纵隔淋巴结分离出野生型马红球菌。 

用突变株攻击的马驹的肺没有显示出肺炎区域，并且没有分离红球菌，除了第20号马驹略有扩大的支气管淋巴结，和第24号马驹的健康肺组织。各自通过PCR和在AD上的生长，将这些分离物的鉴定证实为RE1ΔipdAB和RE1ΔipdAB-AD+。 

B7 部分B的实验的结论

菌株RE1ΔipdAB和RE1ΔipdAB-AD+在巨噬细胞存活中明显受损，并且在马驹中是减毒的。敲除ipdAB基因的第二个拷贝(形成RE1ΔipdABipdAB2)看来在巨噬细胞存活中不具有其他作用，可能在马驹中也不具有。结合使用菌株RE1、RE1supAB、103-、RE1ΔipdAB和RE1ΔipdAB-AD+的体内和体外结果，表明巨噬细胞存活水平和属于诺卡氏菌型放线菌的细菌的体内毒力之间的良好关联。特别地，显示出当突变株具有明显降低的巨噬细胞存活能力时，对于有毒亲本株通常为2至3logs，然后突变株相对亲本株明显减毒。 

基于诺卡氏菌型放线菌中的感染途径和毒力因子是共享的公知事 实-因此马红球菌通常用作分枝杆菌科研究模型的事实，特别是对于涉及巨噬细胞存活和持久性的毒力因子(参见，例如，PNAS，2007年2月6日，vol.104，no.6，pp1947-1952)-理解通过灭活编码甲基六氢茚满二酮丙酸酯降解中所涉及的蛋白的基因而降低的细菌存活率对于诺卡氏菌型放线菌的减毒是普通的。 

部分C：突变细菌在对抗野生型感染的保护中的功效 

C1 介绍

认为对于含有根据本发明的活突变细菌的药物组合物的功效是内在的。这可以通过公众可获得的关于胆固醇代谢中的突变清楚地表明胆固醇代谢中具有突变的细菌仍然具有与野生型生物体相当的抗原负荷知识的认识来理解。结合目前的知识，本发明得知突变的活细菌仍然能够进入巨噬细胞并在其中持续存在，毫无疑问的是免疫应答的刺激物是安全的。仍然，申请人已经进行了实验来证实这种看法。为此，使用了含有马红球菌的疫苗。对于其自身，仍然不存在可获得的对抗该细菌的疫苗，这使得实验本质上是相关的。但更重要地，通常将该细菌认为是用于其他诺卡氏菌型放线菌的良好模型，特别是结核分枝杆菌。其他证实实验(为了获得覆盖诺卡氏菌型放线菌完整范围的证实结果)例如可以使用黄尾脾脏诺卡氏菌进行(参见段落C6)。这是典型的鱼病原体，出于一些原因没有合适的对抗其的疫苗可获得，如同为什么不存在对抗其他巨噬细胞存活诺卡氏菌型放线菌的合适疫苗的原因一样。 

C2 实验设计

将十六匹2至4周大的马驹用于该研究。将马驹分成四组，每组4匹马驹，并口服接种1ml含有不同剂量的RE1ΔipdAB(在无菌等渗磷酸盐缓冲盐水中构成)的疫苗，第1组接种5×10⁹CFU，第2组接种5×10⁸CFU；第3组接受了5×10⁷CFU，第4组留作未接种对照。在T＝0和T＝2周时给予接种。在T＝4周时，用100ml有毒马红球菌 85F培养物(含有5×10⁶CFU/100ml剂量)气管内攻击所有马驹。 

在攻击后3周的时间段中，在临床上评价马。在第一次接种那天，攻击那天和验尸那天，将马驹称重。攻击后3周(或在严重临床体征情况中较早的时间)，将马驹称重，并使其安乐死，进行了完整的尸检检查，特别关注肺和呼吸道淋巴结。将肺称重，以计算肺与体重的比例。将来自所有肺叶的组织样品取样，用于检查。 

C3 材料和方法

测试样品 

疫苗含有活的红球菌菌株RE1ΔipdAB，在无菌等渗磷酸盐缓冲盐水(PBS)构成。如下制得攻击培养物：将马红球菌菌株85F涂布于血液琼脂上，并在37℃下培养24小时。用4ml无菌等渗PBS/平板来收集细菌。用无菌等渗PBS稀释细菌悬浮液，目标为4×10⁴细菌/ml的终浓度。在环境温度下转运；在制备后4小时内使用稀释的培养物。攻击后，进行了活计数测定，以证实感染性滴度。滴定度为5.3×10⁴CFU/ml。 

实验程序和参数 

就在每次接种前和第0、1、2、3、6、10、14、15、16、17、20和24天(接种后)，通过取样直肠擦拭物，进行了细菌重新分离。在T＝0(就在第一次接种之前)，从马驹取样鼻擦拭物。将擦拭样品在生理盐水中连续稀释，并涂布于血液琼脂上，并在37℃下培养16-24小时。最初通过典型的非溶血粘液型菌落形态学来鉴定红球菌菌落，计数并表示为CFU/ml。在每次分离那天，随机选择三个重新分离物(来自三匹不同的马，如果存在)，并用于证实特性：革兰氏染色、API/Phoenix以及对ipdAB基因的PCR。 

在研究过程中，通过生物技术员每日观察马的一般健康和/或行为的任何异常。在攻击前一天开始，每日检查(直至验尸)马的临床体征。就在第一次接种前，就在攻击前和就在验尸前，进行称重。这样 可以计算体重增加和肺与体重的比例。 

在攻击后第14-20天(或在严重临床体征的情况中更早的时间)，通过用甲苯噻嗪(100mg/100kg)和克他命(500mg/100kg)麻醉并随后放血至死，来杀死马驹。将肺称重，以计算肺与体重的比例。进行了完整的尸检检查。从代表每半个肺叶的七个标准部位切除组织样品(1cm³)(3个位点/半个肺叶+副叶)；如果存在，优先选择每个部位的患病组织。将镜像样品(每半个相等肺叶的两个样品)集合，以产生3个样品/马驹+副叶的样品。将每个(集合的)样品均质，连续稀释并接种于血液琼脂平板上，然后在37℃下培养16-24小时。将红球菌菌落计数，并表示为CFU/ml匀浆。通过建立顶端(左+右)、尾部(左+右)和副肺结的硬化百分比，来获得每个动物的肺炎肺评分。对于每个动物，增加这些百分比，以获得一个肺评分图。这样，获得了0至500之间的肺评分。 

C4 结果

攻击后结果概括于表7中。从概括的结果看，清楚所有四个对照产生了严重的由作为唯一病原体的马红球菌引起的肉芽肿性肺炎的体征。两次疫苗接种第4和5号具有与对照相当的体征，但所有其他疫苗接种具有更温和的体征或实质上没有体征。％肺重(肺炎量的客观测量)证实了大部分疫苗接种中的部分保护。 

接种的第2号马驹具有由非特异性细菌引起的肺炎。事实上，可以认为该匹马驹受到了保护，因为没有分离出红球菌，尽管进行了大规模攻击。此外，从三匹患有肺炎的接种马驹中，分离出混合的感染。这些混合的感染可能负面地影响了不同的保护参数。尽管疫苗的保护作用是明显，没有观察到剂量应答作用。事实上，最低的剂量显示出提供了最佳的结果。基于此，结合马驹具有不成熟胃肠道菌群的事实，认为最佳剂量为1×10⁴和1×10¹⁰CFU。 

C5 部分C实验的结论

所有三个口服剂量的疫苗显示出对于小马驹是安全的，并且诱导了对抗严重气管内攻击的实质性保护。在本实验中，从疫苗中的细菌的基因组中除去ipdAB操纵子的基因ipdA和ipdB。然而，清楚涉及相同操纵子的其他突变可能是同样有效的。例如，只影响基因ipdA或ipdB之一的突变本身可能是同样有效的。在后一种情况中，没有形成所涉及的转移酶，并且因此获得相同表型。实际上，这也可能源自Rengarajan(PNAS，2005年6月7日，Vol.102，No.23，pp8327-8332)。在该参考文献中，给另一种诺卡氏菌型放线菌提供了相关证据，即，结核分枝杆菌：灭活任一个定向进化同源ipd基因(在结核分枝杆菌中，各自称为rv3551和rv3552)，导致相同的表型。 

C6 黄尾脾脏诺卡氏菌突变体的疫苗功效的证实

对于另一种放线菌鱼病原菌黄尾脾脏诺卡氏菌(其引起鱼的诺卡氏菌病)，重复了以上对马红球菌的实验。对于该实验，使用了以上段落A13中所提及的野生型菌株INS436和ΔipdAB菌株。 

给20条黄尾鱼(Seriola quinqueradiata)组IP注射野生型菌株或突变株(以不同的浓度)，并且一组20条鱼用作对照。观察鱼出现死亡和其他临床反应2-3周，以平价突变株的减毒。在该观察阶段结束时，用固定剂量的野生型菌株攻击存活的鱼，以评价突变株作为疫苗的功效。再观察鱼两周。 

对于野生型菌株，接种量为2.25×10⁸cfu/ml。对于突变株，这为7.85×10⁸cfu/ml(约高3倍)。这些纯接种物中，制得了2倍、20倍、200倍和2000倍稀释液，用于减毒研究中。IP-攻击材料含有1.2×10⁶cfu/ml。 

对于减毒实验的结果显示于表10中(其显示了观察阶段结束时的死亡率)。从这可以清楚突变株相对野生型菌株是减毒的：尽管突变株的纯接种物以cfu’s/ml计高出三倍，在接受突变株的组中，死亡率明显较低。功效实验的结果显示于表11中。尽管没有获得完全保护，但清楚突变体提供了显著的保护(已知在观察阶段中，对照组60％的 鱼死亡)。即使在接受了2000倍稀释的鱼组中，死于野生型黄尾脾脏诺卡氏菌攻击的鱼也少得多。 

因此，显示了编码甲基六氢茚满二酮丙酸酯降解中所涉及的蛋白的基因的灭活在第二种诺卡氏菌型放线菌中形成了减毒且保护性的疫苗株。这进一步支持了本发明适用于整个范围的诺卡氏菌型放线菌的事实。 

打印(原始为电子形式) 

(该页不是国际申请的一部分，并且不认为是国际申请的一页) 

仅供接收局使用 

仅供国际局使用 

Claims (5)

1.一种保护动物对抗由属于具有在动物的巨噬细胞内存活能力的马红球菌(Rhodococcus equi)或黄尾脾脏诺卡氏菌(Nocardia seriolae)的细菌感染引起的疾病的药物组合物，其包含马红球菌(Rhodococcusequi)或黄尾脾脏诺卡氏菌(Nocardia seriolae)的活细菌和用于这些活细菌的药物学上可接受的载体，该活细菌通过灭活基因ipdA和ipdB来减毒。

2.根据权利要求1的药物组合物，其特征在于它是适于口服给药的形式。

3.根据权利要求1的药物组合物，其特征在于活细菌以1×10⁴与1×10¹⁰CFU/剂之间的浓度存在。

4.源自以编号CNCM I-4108或编号CNCM I-4109保藏于法国巴黎的Collection Nationale de Culture de Micro-organismes of theInstitut Pasteur的菌株的马红球菌细菌。

5.属于具有在动物的巨噬细胞内存活能力的马红球菌或黄尾脾脏诺卡氏菌的活细菌用于制造保护动物对抗由相应野生型细菌感染引起的疾病的药物组合物的用途，该活细菌通过灭活ipdA和ipdB基因来减毒。

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