KR20150097432A

KR20150097432A - 다중 돌연변이된 살모넬라 티피뮤리움 균주 및 이를 포함하는 식중독 예방 백신 조성물

Info

Publication number: KR20150097432A
Application number: KR1020150024160A
Authority: KR
Inventors: 한태욱; 방일수
Original assignee: 강원대학교산학협력단; 조선대학교산학협력단
Priority date: 2014-02-18
Filing date: 2015-02-17
Publication date: 2015-08-26
Also published as: KR101797276B1

Abstract

본 발명은 살모넬라 티피뮤리움 균주에 포함된 다수의 유전자를 돌연변이화하여 다양한 동물의 살모넬라 감염을 예방하기 위한 것으로, 더 상세하게는 ssrA 및 ssrB 조절 유전자, rpoS 유전자, hmpA 유전자를 다중다중변이화 함으로써, 살모넬라 티피뮤리움의 숙주 내 지속 감염능을 감소 또는 저해시킴으로써 백신으로 활용하기 위한 것이다. 본 발명을 통하여 종래 백신에 비하여 부작용이 적고 안전성 및 가격 경쟁력 있는 신규 백신을 제공함으로써 축산업 및 제약업 발전에 기여할 수 있을 것이다.

Description

다중 돌연변이된 살모넬라 티피뮤리움 균주 및 이를 포함하는 식중독 예방 백신 조성물{Multiple mutated Salmonella Typhimurium and vaccine composition for prevention of food poisoning}

발명은 살모넬라 티피뮤리움 균주에 포함된 다수의 유전자를 돌연변이화하고, 이를 이용하여 식중독을 예방하기 위한 백신 조성물에 관한 것이다.

살모넬라는 형태학적 또는 생리학적으로 대장균과 유사하지만 의학상의 편의를 위해 K. Kauffmann 등의 제창에 의해 독립된 속 (genus)으로 분류되었다. 살모넬라는 1885년 Salmon과 Smith가 돈콜레라로 죽은 돼지에서 살모넬라 콜레라에수이스(Salmonella choleraesuis)를 최초로 분리 보고한 이래, 장염과 위장염 환자 및 각종 질병을 가진 동물로부터 분리되었다. 또한 닭을 비롯한 소, 돼지, 염소, 개, 고양이 등의 건강한 동물과 환경물에서도 분리되었다. 살모넬라 속 균은 현재까지 2,500여종 이상의 혈청형이 보고된 실정이며 동물에 따른 숙주 특이성이 있는 균종(예를 들면 사람에서의 S. Typhi, 소에서 S. Dublin, 돼지에서의 S. Choleraesuis, 닭에서의 S. Pullorum, S. Gallinarum)과 숙주 특이성이 없는 균종(S. Typhimurim, S. Enteriditis, S. Newprot 등)으로 크게 구분 지을 수 있는데, 이 중 축산물을 통해 사람의 식중독을 일으키는 혈청형은 후자에 해당한다.

살모넬라는 국내에서는 이질을 일으키는 쉬겔라(Shigella)와 함께 가장 많은 환자가 보고되고 있는 병원균으로, 살모넬라에 오염된 양식 동물의 유통을 통해 인체에 전염될 수 있는 매우 위험한 세균이다. 살모넬라는 그람음성 간균으로 포자는 형성하지 않으며, 다양한 동물에서 기생균으로 발견되고 있다.

살모넬라 감염증은 몇 가지 형태로 발생하지만 식중독의 주요 원인균이고, 장염 형태가 가장 일반적인 증상이다. 과거 국내의 식중독 원인은 쉬겔라(Shigella)에 의한 것이 주를 이루었으나, 최근에는 살모넬라에 의한 식중독 발생율이 점차 증가하고 있는 추세이며, 단체 급식의 증가로 그 심각성이 계속 커지고 있다. 2000년도 식중독 환자의 원인균을 조사한 보고에 의하면, 2,500여 건 이상이 살모넬라에 의한 식중독으로 조사되었는데, 이는 포도상 구균(약 1,000여건), 비브리오(약 200여건) 등 다른 식중독 원인균에 비교하여서도 월등히 높은 비율을 차지하고 있는 것이다.

한편, 살모넬라 식중독의 원인 혈청형에 따른 분포를 보면 1996년부터 2005년까지의 서울지역 사람에게서 분리된 살모넬라 혈청형 중 S. Enteritidis가 차지하는 비율이 42%로서 살모넬라에 의한 식중독의 거의 절반을 차지하고 있으며, S. Typhimurium이 그 다음 순위를 차지하고 있다(표 1 참조).

<1996년부터 2005년까지의 서울 지역에서 발생한 식중독 환자에서 분리한 살모넬라 혈청형 분포>

Serotype	No, of Isolates										Total (%)
Serotype	1996	1997	1998	1999	2000	2001	2002	2003	2004	2005
S. Enteritidis	12	10	51	135	58	32	60	10	7	41	416 (42.0)
S. Typhimurium	7	7	18	42	10	3	8	12	1	7	115 (11.6)
S. Typhi	10	15	73	51	19	50	10	4	14	10	256 (25.9)
Other Salmonella	6	8	18	57	18	9	58	7	7	14	202 (20.4)
Total	35	40	160	285	105	94	136	33	29	72	989

또한, 질병관리본부에서 조사한 사람에서 발견된 살모넬라 혈청형의 전국적 분포를 보면 S. Enteritidis가 가장 높고 그 다음으로는 S. Typhimurium이 차지하는 것으로 나타나 서울지역과 동일한 분포양상을 보이고 있다.

한편, 축산물에서의 살모넬라 혈청형 검출율은 축종에 따라 차이가 있는데, 국내의 경우 축종에 대한 살모넬라 혈청형의 체계적인 분포율은 아직 보고된 바 없다. 네덜란드의 경우 사람에서는 예전에는 장티푸스의 원인체인 S. Typhi가 가장 많이 분리되었으나 1980년대부터는 S. Typhimurium 또는 S. Enteritidis가 가장 많이 분리되고 있다(표 2). 또한, 돼지에서는 S. Typhimurium이 가장 많이 분리되고 있고, 소에서도 숙주특이성이 높은 S. Typhimurium과 S. Dublin이 가장 많이 분리되며 S. Enteritidis는 검출율이 비교적 낮다. 닭의 경우는 S. Enteritidis가 가장 많이 분리되고 S. Typhimurium의 경우 분리율이 6번째를 차지하고 있다고 한다. 흥미로운 것은 사람에서는 S. Enteritidis의 검출율이 살모넬라 혈청형 중 수위를 차지하나 닭에서 가장 높은 검출율을 보이고, 소와 돼지에서는 S. Typhimurium이 수위를 차지하고 있다는 것이고, 이러한 결과는 나라별로 유사한 양상을 보이는 듯 하다.

<1984년부터 2001년까지 네덜란드에서 가장 많이 분리된 살모넬라 혈청형>

Source	Serotype	Data for isolates from indicated period
		1996-2001		1990-1995		1984-1989
		% (no.)	Rank	% (no.)	Rank	% (no.)	Rank
Human	Typhimurium	32.0 (4,470)	2	33.1 (5,666)	2	57.2 (16,049)	1
Human	Enteritidis	43.6 (6,097)	1	33.8 (6,642)	1	5.4 (1,526)	2
Pig	Typhimurium	66.4 (2,384)	1	75.7 (2,378)	1	66.0 (2,197)	1
	Enteritis	-	>10	-	>10	-	>10
Chicken	Typhimurium	5.3 (336)	6	14.3 (2,669)	3	26.1 (5,170)	1
	Enteritidis	20.3 (1,290)	1	15.0 (2,802)	2	5.5 (1,088)	6
Cattle	Typhimurium	32.9 (702)	2	31.9 (1,670)	2	53.1 (1,706)	1
	Enteritidis	-	>10	-	>10	-	>10

세계보건기구(WHO)에서는 1988년부터 축산물 유래 살모넬라에 대한 식중독 발생을 억제시키기 위해서는 효과적인 생균백신을 대상 동물에 접종할 것을 권장하고 있다. 특히 S. Typhimurum은 축종에 관계없이 분리율이 수위를 차지하고 있어, S. Enteritidis와 더불어 축산물에 전파되어 사람에게 식중독을 일으키는 가장 빈번하고 중요한 살모넬라 혈청형이므로, 이에 대한 효과적인 생균 백신을 개발할 필요성이 있다.

축산물 안전성을 담보하기 위하여 항생제 치료보다는 산업동물에 대한 살모넬라의 예방으로 백신 사용이 필수 불가결한 요소라 할 것이다. 일반적으로 백신은 불활화 백신과 생균백신으로 나눌 수 있지만 살모넬라가 일반적으로 세포매개성 면역에 의해 방어되기 때문에 전 세계적으로 생균백신의 연구가 활발히 이루어지고 있는 실정이고, 불활화 백신의 경우는 야외 병원성 살모넬라가 실질장기에 침투되는 것을 방어할 수는 있어 생독백신 후 고면역유도를 위한 보강접종으로 사용하고 있다. 따라서, S. Typhimurium은 사람의 식중독을 저감화 시키는 방안으로 축산식품으로 이용하는 돼지, 닭, 소에 있어 반드시 개발해야 하는 예방백신이며 축종에 관계없이 사용할 수 있는 시장성이 큰 백신 품목이므로, 식중독 예방을 최소화하고 국민보건 증진을 위해 개발 필요성이 절실히 요구되는 실정이다.

1. Datsenko, K. A., and Wanner, B. L. (2000). One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A97,6640-6645.

따라서 본 발명의 목적은, 살모넬라 티피뮤리움의 유전자를 다수 돌연변이화 한 신규의 살모넬라 티피뮤리움 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 살모넬라 티피뮤리움의 유전자를 다수 돌연변이화 한 신규의 살모넬라 티피뮤리움 균주 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 식중독 예방 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기한 살모넬라 티피뮤리움 균주 및 식중독 예방 백신 조성물을 제공하여 소비자에게 안전한 축산물 공급을 유도하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 ssrA 유전자인 서열번호 1, ssrB 유전자인 서열번호 2, rpoS 유전자인 서열번호 3, hmpA 유전자인 서열번호 4 중 어느 하나 이상이 돌연변이된 살모넬라 티피뮤리움 균주를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 서열번호 1의 돌연변이는 서열번호 5인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 서열번호 2의 돌연변이는 서열번호 6인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균주는 숙주의 식세포 내에서 생존 능력이 결핍 또는 감소된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 서열변호 3의 돌연변이는 서열번호 7인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균주는 숙주의 식세포 내에서 분비되는 활성산소 저항력이 결핍 또는 감소된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 서열번호 4의 돌연변이는 서열번호 8인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균주는 상기 서열번호 1의 돌연변이는 서열번호 5이고, 상기 서열번호 2의 돌연변이는 서열번호 6이고, 상기 서열번호 3의 돌연변이는 서열번호 7이고, 상기 서열번호 4의 돌연변이는 서열번호 8인 것을 특징으로 한다(기탁번호: KCTC 12325BP).

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균주는 숙주에서의 지속감염능이 결핍 또는 감소된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균주가 약독화 된 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 살모넬라 티피뮤리움 균주 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 식중독 예방 백신 조성물을 제공한다.

본 발명은 양계산업을 포함하는 축산사업에서 막대한 경제적 피해를 일으키는 살모넬라 티피뮤리움의 다수 개의 특정 유전자를 돌연변이화 한 다중 돌연변이형 균주를 제공함으로써, 부작용이 적고 안전성이 뛰어나며 방어능이 뛰어난 백신으로 활용가능하게 하고, 그 결과 종래 수입 백신에 의존하던 국내 방역업계에서 수입 백신을 대체하고, 해외 수출시장을 개척하는 효과를 기대할 수 있다.

도 1은 ssrA 및 ssrB 유전자를 돌연변이화 하여 SPI-2에 속하는 sseJ, ssaB, sseA의 mRNA 발현 변화를 real-time RT PCR로 측정한 그래프이다.
도 2는 rpoS 유전자를 돌연변이화 한 경우 H₂O₂에 의해 유도되는 활성산소종 감수성을 보여주는 그래프이다.
도3은 hmpA 유전자를 돌연변이화 한 경우 GSNO에 의해 유도되는 산화질소 감수성을 보여주는 그래프이다.
도 4는 ssrA 및 ssrB 유전자, rpoS 유전자, hmpA 유전자를 돌연변이화 한 살모넬라 티피뮤리움 균주와 야생형 균주를 마우스에 복강 접종시 간 및 비장에서 균주의 집락수를 비교한 그래프이다.
도 5는 ssrA 및 ssrB 유전자, rpoS 유전자, hmpA 유전자를 돌연변이화 한 살모넬라 티피뮤리움 균주와 야생형 균주를 마우스에 경구 투여시 간 및 비장에서 균주의 집락수를 비교한 그래프이다.
도 6은 마우스에서 생균백신 후보주에 대한 방어율 시험 결과 그래프이다.
도 7은 마우스에서 생균백신 후보주에 대한 생존율 시험 결과 그래프이다.
도 8은 방어율 시험 마우스에서의 생균백신 후보주에 대한 항체가 조사 결과 그래프이다.

본 발명은 살모넬라 티피뮤리움 균주에 ssrA 유전자, ssrB 유전자, rpoS 유전자, hmpA 유전자를 돌연변이화 하고, 이를 이용하여 식중독을 예방하기 위한 백신 조성물에 관한 것이다.

본 발명자들은 동물 백신균주 개발을 위한 살모넬라 병원성 연구에서 병원성 관련 유전자들의 조절과정을 응용하여 새로운 숙주동물의 급성 감염과정을 제어할 수 있는 시스템이 도입될 필요성에 따라 살모넬라 티피뮤리움을 이용한 백신용 균주에 대해 연구를 시작하였다. 주로 동물백신용 살모넬라 연구는 병독성 개별 유전자를 돌연변이화 한 백신이었으나, 본 발명자들은 현재까지 연구가 미미한 지속감염에 필요한 유전자들을 발굴하여 돌연변이를 제조하고 이들의 통합적인 조절과정을 이용한 숙주동물 내 감염 및 면역과정에 대한 연구를 통하여 새로운 백신 균주를 제공하고자 하였다. 즉, 살모넬라가 숙주 동물의 단계적 면역체계에서 적응하고 생존하여 침투하는 메커니즘 중 숙주 세포내에서 생존하여 증식하고 전신감염을 일으키게 하는 핵심적 요소로 식세포내 생존능력, 보균상태의 지속능력을 제거하여 안전한 백신 균주를 제조하고자 ssrA 유전자, ssrB 유전자, rpoS 유전자, hmpA 유전자를 돌연변이화 한 것이다.

우선, 본 발명자들은 살모넬라 티피뮤리움이 숙주에 감염되었을 때 항원성을 제시할 수 있는 능력을 유지하도록 하기 위하여 spi1의 발현은 정상적으로 이루어지되, 숙주의 식세포 내에서 생존에 필수적인 spi2의 발현은 저해하는 유전자 돌연변이형을 구축하고자 하였다.

spi2는 살모넬라가 독성을 나타내는 데 필수적인 유전자로, ssaV, ssaJ, ssaL, ssaM, ssaO. ssaP, ssaQ, ssaR, ssaS, ssaT, ssaU, ssaH 유전자들이 포함된다. 본 발명자들은 spi2의 돌연변이를 위하여 상기 개별 유전자들의 돌연변이보다 상기 돌연변이를 조절하는 조절영역 내의 돌연변이를 유도하여 상기 유전자들의 발현을 저해시키고자 하였다. 따라서 본 발명자들은 상기 유전자들의 조절영역에 존재하는 ssrA 및 ssrB 유전자 일부가 결손된 돌연변이를 제조하였다.

또한, 본 발명자들은 숙주 세포에 감염되었을 때 숙주의 식세포 내에서 분비되는 활성산소 저항성에 필수적인 RpoS 시그마 인자의 기능을 상실시키고자 하였다. 살모넬라는 생활주기 동안 가용할 수 있는 에너지 자원의 종류 및 다양한 종류의 스트레스에 빈번히 노출되며, 이러한 변화무쌍한 생활 환경에서 살아남기 위하여 스트레스 내성을 갖고 영양섭취 경쟁수요의 균형을 유지하여야 한다. 이는 RpoS 시그마인자 의존 스트레스 반응의 조절변화에 의하여 이루어지는데, 세포 내의 RpoS 농도가 감소하면, 영양 경쟁, 스트레스에 대항할 수 있는 능력도 현저히 감소하게 된다. 따라서, 본 발명자들은 숙주 세포에 감염되어 유발되는 스트레스에 저항하여 생존할 수 있는 능력을 상실시키고자 rpoS 유전자 돌연변이를 제조하였다.

한편, HmpA는 살모넬라가 숙주동물에 지속적으로 감염되기 위하여 필수적으로 요구되는 산화질소 해독효소로, Flavohemoglobin이다. 본 발명자들은 지속감염능이 감소된 살모넬라 균주를 생산하고자 hmpA 유전자도 함께 돌연변이화 하였다.

ssrA 및 ssrB 조절 유전자의 돌연변이 확인은 spi-2 유전자에 속하는 sseJ, ssaB, sseA 유전자의 mRNA 발현변화를 real-time RT-PCR로 확인할 수 있었다. 도 1에서 볼 수 있듯이, ssrA 및 ssrB 조절 유전자가 단독으로 조절되거나, ssrA 및 ssrB 조절 유전자, rpoS 유전자, hmpA 유전자가 모두 돌연변이된 다중 돌연변이주에서는 야생형에 비해 spi-2에 속하는 유전자들의 mRNA 양이 현저히 감소됨을 확인할 수 있다.

이 후 rpoS 유전자 돌연변이 확인은 H₂O₂를 첨가한 배지에서 각 균주의 성장곡선을 비교하여 확인할 수 있었다. 야생형에 비하여, rpoS가 단독 돌연변이 되거나, ssrA 및 ssrB 조절 유전자, rpoS 유전자, hmpA 유전자가 삼중 돌연변이된 돌연변이 균주에서 특이적으로 H₂O₂ 첨가시 성장이 현격히 저해되는 것을 확인할 수 있었고, 이로써 rpoS 돌연변이종에서 활성산소종 감수성이 현저히 증가함을 알 수 있었다(도 2).

마지막으로, hmpA 유전자 돌연변이 확인은 GSNO 첨가 배지에서 각 균주의 성장곡선을 비교하여 확인할 수 있었다. 야생형에 비하여 hmpA 단독 돌연변이종 또는 ssrA 및 ssrB 조절 유전자, rpoS 유전자, hmpA 유전자가 다중 돌연변이종에서 GSNO 처리에 의한 성장이 완전히 억제되어, hmpA 돌연변이종에서 산화질소 감수성이 현저히 증가함을 알 수 있었다(도 3).

상기 다중 돌연변이에 의한 각 유전자의 기능 상실을 in vitro 실험을 통해 확인한 후, 본 발명자들은 상기 다중 돌연변이 균주의 유전자 기능 상실에 기인한 지속 감염능 저해 현상을 in vivo에서 확인해 보고자 하였다. 다중 돌연변이 균주의 지속 감염능이 감소 또는 저해된다면, 이는 살모넬라가 감염 가능한 숙주에 유용한 백신으로 활용 가능하기 때문이다.

따라서, 본 발명자들은 상기 돌연변이 균주와 야생형 균주를 각각 마우스에 복강접종 또는 구강투여 방식으로 투여하였다. 그 결과, 복강 접종시 간에서는 돌연변이 균주의 집락수가 현저히 감소함을 확인할 수 있었으나, 비장에서는 유의한 차이를 확인할 수 없었다(도 4). 그러나, 구강 투여시에는 간과 비장에서 모두 야생형에 비하여 다중 돌연변이형 균주의 집락수가 현저히 감소하였고, 특히 12일에는 돌연변이형 균주를 전혀 검출할 수 없었다(도 5).

본 발명자들은 ST 변이주에 대한 마우스에서 방어효과를 측정하기 위해 변이주를 경구, 복강내 및 근육내로 접종하였다. 그 결과, 모든 군들이 통계적으로 유의성이 있었으며, 특히 복강내 접종군이 간과 비장에서 가장 낮은 균수가 관찰되어 최고의 방어율을 확인하였다(도 6 참조).

본 발명자들은 ST 변이주에 대한 마우스에서 생존율을 측정하기 위해 백신접종 3주 후 고병원성 야생주 ST21을 마우스 구강으로 공격접종한 뒤, 15일간 마우스의 폐사 유무를 관찰하였다. 그 결과, 야생균주 ST21을 접종한 마우스는 폐사하였으나, 본 연구의 생균백신 후보주 ST△3는 복강내 접종시 100%의 생존율을 보이고, 경구접종 시에는 66.7%의 높은 생존율을 확인하였다(도 7 참조). 이후 생균백신 후보주의 항체가를 확인하기 위해 마우스로부터 혈청을 매주 안와채혈하여 항체가를 측정한 결과, 공격접종 후에도 높은 항체가를 보이며 높은 방어력을 보이는 것을 확인하였다(도 8 참조).

따라서, 본 발명자들은 다중 돌연변이된 살모넬라 티피뮤리움 균주는 지속감염능이 결손된 균주로써 백신으로 유용하게 활용 가능함을 입증하였다.

본 발명에서 상기 돌연변이 된 살모넬라 티피뮤리움 균주 및 약제학적으로 허용되는 담체는 식중독 예방 백신 조성물로 활용 가능하다.

본 발명의 백신 조성물이 면역 반응을 일으킬 수 있는 숙주 동물은 인간, 닭, 오리, 꿩, 칠면조 등의 가금류, 돼지,염소, 양, 소, 개, 고양이 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 백신은 약독화된 생독 백신 또는 사독 백신, 서브유닛 백신(subunit vaccine), 합성 백신(synthetic vaccine) 또는 유전공학 백신(genetic engineering vaccine)일 수 있으나, 효과적인 면역 반응을 유도하는 생독 백신이 바람직하다.

본 발명에서 사용된 용어 "생독 백신"이란 살아있는 균의 활성성분을 포함하는 백신을 의미한다. 또한 용어 "약독화된(attenuation)"이란 살아있는 병원체의 독성을 인공적으로 약하게 한 것으로, 병원체의 필수 대사에 관여하는 유전자를 변이시켜 체내에서 질병을 일으키지 못하고 면역 체계만을 자극해서 면역성을 유도하는 것을 의미한다. 균의 약독화는 자외선(UV) 조사, 약품처리 또는 시험관 내 고차 연속 계대배양에 의해 달성될 수 있다. 약독화는 또한 명확한 유전 변화를 만듦으로써, 예를 들어 독성을 제공하는 것으로 알려진 유전자 서열의 특정 결실 또는 균주의 게놈 내로의 서열의 삽입에 의해 달성될 수 있다.

용어 "사독 백신"이란 불활화 백신 또는 사균 백신이라고도 하며, 죽은 균을 포함한 백신이다..

용어 "서브유닛 백신"은 균의 구성성분 중 면역기능을 일으킬 수 있는 항원 성분만을 추출하여 제조한 백신으로, 균의 방어에 필요한 항원 부위에 대해서만 면역형성을 유도함으로써 부작용을 최소화할 수 있다.

"유전공학 백신"은 균의 병원성을 일으키는 특이 유전자를 변형하거나 제거한 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 백신은 숙주동물에 발생하는 살모넬라 균 이외의 균에 의해 발생하는 질병을 예방하기 위하여 사용되는 다른 백신의 제조에 사용되는 불활화된 균체들 또는 항원들과 혼합하여 식중독을 포함한 다른 질병들을 함께 예방할 수 있는 혼합 또는 복합 백신으로 사용될 수 있다. 용어 "혼합 백신"이란 서로 다른 바이러스 백신을 함께 사용한 백신을 말한다.

본 발명의 백신 조성물은 나출된(naked) 핵산 조성물들도 포함할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 핵산은 본 발명의 돌연변이형 RfaH 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 핵산 백신접종 방법들은 업계에 공지되어 있는 방법을 통해 실시할 수 있다. 예를 들어, 미국등록특허 제6,063,385호 및 제6,472,375호에 설명되어 있다. 상기 핵산은 플라스미드 또는 유전자 발현 카세트(expression cassette)의 형태일 수 있다. 일실시예에서, 상기 핵산은 동물에 투여되는 리포좀에 둘러싸여진 채로 제공된다.

또한, 본 발명의 백신 조성물을 추가적으로 용매, 면역증강제(adjuvant) 및 부형제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다. 상기 용매로는 생리식염수 또는 증류수가 있으며, 면역증강제로는 프레운즈(Freund's) 불완전체 또는 완전체 어쥬번트, 알루미늄 하이드록사이드 겔과 식물성 및 광물성 오일 등이 있으며, 부형제로는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포타슘 설페이트가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 기술자에게 잘 알려진 백신 제조에 사용되는 물질을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물을 경구형 또는 비경구형 제제로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 비경구형 제제인 주사액제로 제조하며, 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 비강 또는 경막외(eidural) 경로로 투여할 수 있다.

본 발명에서 용어 "예방"이란 조성물의 투여에 의해 살모넬라 감염을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 용어 "치료"란 조성물의 투여에 의해 살모넬라 감염에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체의 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명에 대하여 좀 더 상세히 설명하고자 한다.

<실시예 1>

Salmonella Typhimurium 다중 돌연변이주 제조

본 발명자들은 ssrA 및 ssrB 조절 유전자, rpoS 유전자, hmpA 유전자가 각각 결손된 돌연변이주를 제조하고, 그 후 이들 유전자들이 모두 결손된 다중 돌연변이주를 제조하고자 하였다. 본 발명자들은 야생형 균주에서 유전자 돌연변이를 제조하는 방법으로 lamda-Red recombinase를 이용한 재조합 기술을 변형하여 사용하였다(선행문헌 1 참조).

1-1. ssrA 및 ssrB 조절 유전자 , rpoS 유전자 , hmpA 유전자 단독 돌연변이주 제조

본 발명자들은 하기 표 3에 기재된 프라이머를 사용하여, pKD3 또는 pKD4를 주형으로 하여 PCR을 진행하였다. 주형 플라스미드 pKD3와 pKD4는 각각 항제제 Chloramphenicol과 Kanamycin 저항 cassette 유전자를 가지고 있고, 그 양쪽 바깥쪽에 Flp recombiase가 인지하는 FRT (Flp recombiase target) 유전자 서열을 포함하고 있다. 항생제 저항 cassette와 FRT 유전자 서열을 포함하는 PCR 산물을 얻기위해 두 유전자 서열 양쪽 바로 바깥에 위치하는 유전자를 인식하는 프라이머 P1과 P2를 사용하였다. P1과 P2 서열에 돌연변이 시키고자하는 target 유전자 일부 서열을 붙여서 프라이머를 제작하고, 각 유전자 이름에 P1과 P2를 사용하였다 (예, rpoS-P1, rpoS-P2). 이 프라이머들을 이용하여 pKD3 나 pKD4를 주형으로 PCR을 하면, 5＇-target 유전자 일부서열-P1-FRT-항생제 cassette-FRT-P2-target 유전자 일부서열(유전자의 다른 한쪽)-3＇을 갖는 DNA산물을 얻을 수 있었다. 이를 Lamda-Red recombinase가 과발현되어 있는 살모넬라 세포내로 형질전환하면, chromosome내 target 유전자와 상동성을 갖고 있는 PCR 산물의 유전자와 homologous recombination이 촉진되며 그 결과 target 유전자가 결손되고 그 자리에 P1-FRT-항생제 cassette-FRT-P2 가 삽입되어 돌연변이 가능하다. 이 후에 Flp recombiase를 생산하는 pCP20 플라스미드를 돌연변이체에 형질전환시켜 Flp recombiase가 FRT 유전자 서열 사이에 있는 항생제 cassette를 제거하였다.

ssrB 조절자의 돌연변이주는 ssrB-P1과 ssrA-P2 프라이머를 사용하였고, rpoS 유전자의 경우 rpoS-P1과 rpoS-P2 프라이머를 사용하였으며, hmpA 유전자의 경우 hmp-P1과 hmp-P2 프라이머를 사용하였다. PCR은 94℃에서 10분 predenaturation, 94℃에서 1분, 50℃ 0.5분, 72℃ 1분씩 35 cycle, 72℃에서 10분 post elongation 과정으로 진행하였다.

돌연변이주를 제조한 후에는 야생형과 돌연변이주 ST98 균주의 염색체에서 ssrA-Fw/ssrB-Rv, rpoS-Fw/rpoS-Rv, hmp-Fw/hmp-Rv 프라이머를 이용하여 PCR 산물을 얻어 이를 시퀀싱함으로써 돌연변이주가 제대로 만들어진 것인지 확인해 보았다.

1-2. ssrA 및 ssrB 조절 유전자 , rpoS 유전자 , hmpA 유전자 다중 돌연변이주 제조

ssrA 및 ssrB 조절 유전자 돌연변이주에 kanamycin cassette을 FLP recombinase(pCP20)를 이용하여 제거함으로써 ssrA 및 ssrB 조절 유전자 돌연변이주를 최종 완성하였다(FB324 균주). 상기 FB324 균주에 rpoS 돌연변이주(rpoS::cm)를 형질도입하여 FB 328을 제조하고, FLP recombinase를 이용하여 chloramphenicol cassette을 제거하여 ssrA 및 ssrB 조절유전자와 rpoS 유전자 이중 돌연변이주를 완성하였다(FB 329 균주). 상기 FB 329균주에 hmpA 유전자 돌연변이주(hmpA::Cm)를 형질도입하여 FB 330을 제조하고, FLP recombinase를 이용하여 chloramphenicol cassette을 제거함으로써 ssrA 및 ssrB 조절 유전자, rpoS 유전자, hmpA 유전자 다중 돌연변이주 FB331를 완성하였다.

<균주와 플라스미드 목록>

Strain	Genotype
FB280	ST98
FB289	ST98 rpoE::cm
FB324	ST98 ssrAB::km
FB327	ST98 ssrAB
FB328	ST98 ssrABrpoS::cm
FB329	ST98 ssrABrpoS
FB330	ST98 ssrABrpoShmpA::cm
FB331	ST98 ssrABrpoShmpA
IB1335	rpoS::cm
IB1337	ssrAB::km
IB1019	hmpA::cm
Plasmids
pKD3	cat cassette
pKD4	kan cassette
pKD46	Lamda Red recombinase
pCP20	FLP recombinase

<프라이머 목록>

Primer	Sequence (5＇-3＇)
rpoS-P1	tttcgcgcagacggcgcaggccttcaacctgaatctgacggtgtaggctggagctgcttc
rpoS-P2	tgatttaaatgaagacgcggaatttgatgagaacggagtacatatgaatatcctccttag
rpoS-Fw	cagtgtcagcattgtctgta
rpoS-Rev	cagctctacaagcttgcatt
ssrA-P2	atattgtactaagcaatcaacggtttgaagaagctgaacgcatatgaatatcctccttag
ssrB-P1	acctcattcttcgggcacagttaagtaactctgtcactttgtgtaggctggagctgcttc
ssrA-Fw	caggcgattctatcattcgg
ssrB-Rev	ggattttgtcgacgatgagca
hmp-P1	gcttgacgcacaaaccatcgctacagtaaaggccaccattgtgtaggctggagctgcttc
hmp-P2	tggggtgcatctggctgcgccggcaggtgacttctttatgcatatgaatatcctccttag
hmp-Fw	cataacgtaaagcagagaag
hmp-Rev	gctcgttagggcatgcttttat
rpoD-RT-Fw	gtgaaatgggcactgttgaactg
rpoD-RT-Rev	ttccagcagataggtaatggcttc
sseJ-RT-Fw	Ctttaccacccaccatgcag
sseJ-RT-Rev	tgggcttgggatgtgattta
ssaB-RT-Fw	ggatatcagggccgaaggta
ssaB-RT-Rev	aaatgcaagttaaagccaggtg
sseA-RT-Fw	gaggggaatgatgataaagaaa
sseA-RT-Rev	ggggcttgagcattaagtt

상기와 같은 방법으로 제조된 ssrA 및 ssrB 조절 유전자, rpoS 유전자, hmpA 유전자가 다중 돌연변이된 살모넬라 티피뮤리움 신균주를 2012년 11월 28일자로 국제공인기탁기관인 미생물자원센터(KCTC)에 기탁하였으며, 2012년 12월 5일자로 기탁번호 KCTC12325BP를 부여받았다.

<실시예 2>

ssrA 및 ssrB 조절 유전자 , rpoS 유전자 , hmpA 유전자 다중 돌연변이주에서 SPI-2 유전자 발현 저하

살모넬라에는 5가지 SPI(Salmonella pathogenicity island))가 존재하며 그 중 SPI-1과 SPI-2는 살모넬라의 병원성에 특히 중요하게 작용한다고 알려져 있다. SPI-1은 숙주의 상피세포로의 침입이나 염증 반응의 유발과 관계 있으며, SPI-2는 침입 후 생존과 증식에 기여하는 것으로 알려져 있다.

본 발명자들은 동물의 상피세포 침투에 필수적인 SPI-1의 발현은 정상적으로 이루어지나, 침입 후 숙주의 식세포 내에서 생존하여 전신감염을 일으키는 SPI-2의 발현이 결손된 돌연변이주를 만들기 위하여 SPI-2 유전자의 전사를 조절하는 ssrA 및 ssrB 조절 유전자가 결손된 돌연변이주를 실시예 1에서와 같이 제조하였다. 그 후, log-phase 상태의 세포에 SPI-2 유도 조건인 log-Mg 상태로 변화하여 SPI-2에 속하는 유전자인 sseJ, ssaB, sseA의 mRNA 발현양을 real-time RT-PCR로 측정하였다.

그 결과, 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이 sseJ, ssaB, sseA의 mRNA 발현이 야생형에 비하여 ssrA 및 ssrB 조절 유전자 단독 돌연변이주 및 ssrA 및 ssrB 조절 유전자, rpoS 유전자, hmpA 유전자 다중 돌연변이주 모두에서 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 3>

ssrA 및 ssrB 조절 유전자 , rpoS 유전자 , hmpA 유전자 다중 돌연변이주에서의 활성산소종 감수성 변화

시그마 인자란 박테리아에서 전사를 조절하는 단백질이다. 시그마 인자는 환경 조건의 변화에 따라 활성화되는데, rpoS가 인코딩하는 RpoS(Sigma-38) 단백질은 일반적인 스트레스 반응에서 중심적인 역할을 하는 조절자로 기능하는 것으로 알려져 있으며, 특히 살모넬라균에 있어서는 숙주의 식세포내에서 분비되는 활성산소의 저항성에 필수적인 요소로 알려져 있다.

본 발명자들은 살모넬라의 항산화 방어기전을 관장하는 시그마 인자인 RpoS를 인코딩하는 유전자 돌연변이주인 rpoS 단독 돌연변이주와 ssrA 및 ssrB 조절 유전자, rpoS 유전자, hmpA 유전자 다중 돌연변이주에서 활성산소종 H₂O₂에 대한 감수성을 알아보기 위하여, H₂O₂ 1mM을 첨가한 후 시간에 따른 살모넬라균의 성장곡선을 관찰하였다.

그 결과 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, rpoS 단독 돌연변이주 및 ssrA 및 ssrB 조절 유전자, rpoS 유전자, hmpA 유전자 다중 돌연변이주의 경우 H₂O₂을 첨가하였을 때 그 성장이 저해됨을 확인할 수 있었고, rpoS의 돌연변이로 인한 RpoS 단백질 기능이 상실됨을 실험적으로 확인할 수 있었다.

<실시예 4>

ssrA 및 ssrB 조절 유전자 , rpoS 유전자 , hmpA 유전자 다중 돌연변이주에서의 산화질소 감수성 변화

HmpA는 박테리아에서 발견되는 flavohemoglobin이다. HmpA는 RNS 방어 체계에서 중요한 기능을 담당하는데, hmpA가 결손되면 산화질소의 해독작용을 수행하지 못한다고 보고되고 있다.

따라서, 본 발명자들은 숙주의 식세포에서 분비되어 살모넬라의 지속적인 감염을 제어하는 산화질소를 해독하는 hmpA 유전자 결손 돌연변이를 상기 실시예 1에서와 같이 제조하였다. 그리고 hmpA 돌연변이주에서 실제로 산화질소에 대한 감수성이 변화하는지 산화질소 공여체인 GSNO를 2mM 첨가하여 시간에 따른 살모넬라 균주의 성장곡선을 관찰하였다.

그 결과, 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이 hmpA 단독 돌연변이 주 및 ssrA 및 ssrB 조절 유전자, rpoS 유전자, hmpA 유전자 다중 돌연변이주에서만 GSNO 첨가시 성장이 저해됨을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명자들은 상기 결과를 통하여 hmpA의 돌연변이에 의해 HmpA의 기능이 상실됨을 확인할 수 있었다.

<실시예 5>

마우스 접종을 위한 ssrA 및 ssrB 조절 유전자 , rpoS 유전자 , hmpA 유전자 다중 돌연변이주 및 야생형 균주 배양

본 발명자들은 상기 제조된 다중 돌연변이주의 살모넬라 예방 백신으로의 기능을 확인하기 위하여 마우스 실험을 준비하였다. 우선, 본 발명자들은 마우스 접종을 위한 다중 돌연변이주와 야생형 균주를 배양하였는데, ssrA 및 ssrB 조절 유전자, rpoS 유전자, hmpA 유전자 다중 돌연변이주는 LB 액상배지에 CM(chloramphnicol)을 첨가하여 배양하였고, 야생형 균주는 LB 액상배지에 접종하여 배양하였다. 37℃에서 18시간 배양한 후, 배양액 100ul를 다시 LB(CM 첨가) 액상배지 또는 LB 액상배지에 각각 접종하여 12시간 동안 추가 배양한 후, 13000rpm에서 20분간 원심분리하였다. 원심분리된 pellet은 PBS로 2번 세척하고, 10³/100ul로 분주하였다.

<실시예 6>

ssrA 및 ssrB 조절 유전자 , rpoS 유전자 , hmpA 유전자 다중 돌연변이주 및 야생형 균주의 마우스 접종

본 발명자들은 상기 준비된 다중 돌연변이주 및 야생형 균주를 마우스에 접종하여 지속감염능을 실험해 보기로 하였다. 따라서, 본 발명자들은 C57BL/6 마우스를 사용하였고 각 그룹당 5마리씩 케이지에 격리하였다. 각 케이지에 멸균된 사료와 물이 제공되었으며, 생장 조건은 22℃, 40~70% 습도, 12시간 주야주기로 하였다. 상기 실시예 5에서 준비한 균주는 7주령 암컷 마우스에 마우스 한 마리당 1.0×10³ CFU/g으로 복강접종 또는 2.6×10⁷ CFU/g으로 경구투여 하고, 접종 후 3, 6, 9, 12일에 경추탈골로 안락사시켰다.

그 후, 안락사한 마우스로부터 간과 비장을 적출하여 각각 비드가 있는 튜브에 넣고 무게를 측정한 후, 1ml의 BPW를 첨가하여 조직파쇄기(QUIAGEN, USA)를 이용하여 30Hz로 3분간 3번 반복하여 조직을 분쇄하였다. 분쇄된 조직유제 100ul를 XLT 한천배지 혹은 Salmonella Shigella 한천배지에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 세균의 집락수를 측정하였다. Salmonella Shigella 한천배지는 감별식 선택배지(differentially selective medium)로서 티피뮤리움 균주는 색깔로 다른 균들과 구분 가능하다.

그 결과, 복강접종시에는 간에서의 집락수가 각 부검일별로 돌연변이주와 야생형에서 유의적인 차이를 나타내었다. 즉, 돌연변이주에서는 야생형에 비하여 집락수가 99% 이상 감소된 것으로 확인되었다. 한편, 비장에서는 모든 부검일에서 돌연변이주가 야생형 균주보다 감소된 집락수를 나타냈으나, 통계적으로 유의적인 차이를 확인할 수는 없었다(도 4).

한편, 경구투여시 간에서의 집락수는 3일에서만 야생형과 돌연변이주에서 유의적인 차이를 나타내었으나, 비장에서는 3일, 9일 12일에서 통계적 유의성을 나타내었다(도 5).

<실시예 7>

ssrA 및 ssrB 조절 유전자 , rpoS 유전자 , hmpA 유전자 3중 돌연변이주의 방어능을 마우스에서 측정

본 발명자들은 상기 준비된 3중 돌연변이주를 마우스에 접종한 후 방어능을 실험해 보기로 하였다. 따라서, 본 발명자들은 C57BL/6 마우스를 사용하였고 각 그룹당 15마리씩 케이지에 격리하였다. 각 케이지에 멸균된 사료와 물이 제공되었으며, 생장 조건은 22℃, 40~70% 습도, 12시간 주야주기로 하였다. 상기 실시예 5에서 준비한 3중 돌연변이주는 7주령 암컷 마우스에 마우스 한 마리당 1.0×10³ CFU/g으로 복강접종 또는 2.6×10⁷ CFU/g으로 경구투여하였다 (백신접종군). 접종 후 21일 후에 야생형 균주를 마우스 한 마리당 1.0×10⁵ CFU/g으로 복강접종 또는 1.0×10⁷ CFU/g으로 공격접종하고 7일 후 혈액을 안와채혈하여 ELISA를 이용하여 항체가를 조사하였다.

그 후, 마우스를 경추탈골로 안락사시킨 후 간과 비장을 적출하여 각각 비드 가 있는 튜브에 넣고 무게를 측정한 후, 1ml의 BPW를 첨가하여 조직파쇄기(QUIAGEN, USA)를 이용하여 30Hz로 3분간 3번 반복하여 조직을 분쇄하였다. 분쇄된 조직유제 100ul를 XLT 한천배지 혹은 Salmonella-Shigella 한천배지에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 세균의 집락수를 측정하였다. Salmonella-Shigella 한천배지는 감별식 선택배지(differentially selective medium)로서 티피뮤리움 균주는 색깔로 다른 균들과 구분 가능하다. 또한, 상기 실시예 5에서 준비한 균주를 마우스에 접종 후 마우스가 안락사될 때까지 매주 fecal shading 샘플이 채취되어 위의 방식으로 세균의 집락수를 측정하였다.

그 결과, 복강접종시 및 경구투여시에 간에서의 공격접종균주의 집락수가 3중 돌연변이주 접종군과 야생형균주 접종군 사이에서 유의적인 차이를 나타내었다. 즉, 돌연변이주를 백신에서는 야생형에 비하여 집락수가 90% 이상 감소된 것으로 확인되었다. 또한, 비장에서도 삼중 돌연변이주가 야생형 균주보다 통계적으로 유의적인 감소된 집락수(90% 이상 감소)를 나타낸 것을 확인 할 수 있었다.

한편, 복강접종시 및 경구투여시에 변샘플에서의 집락수는 2 주 후부터 야생형과 삼중 돌연변이주에서 유의적인 차이(90% 이상 감소)를 나타내었고, 혈액샘플의 면역반응 역시 통계적 유의성(90% 이상 감소)을 나타내었다.

<실시예 8>

마우스에서 생균백신 후보주에 대한 방어율 시험

본 발명자들은 마우스에서 생균백신 후보주에 대한 방어율 시험을 위해, 실험동물로 7주령의 BALB/c 암컷마우스를 사용하였고, IVC Rack(MVCS; Threeshine, Korea)에서 사육하였다. 실험동물의 윤리적 사용을 위해 3R 원칙을 준수하였으며, 강원대학교의 동물실험윤리위원회 규정하에서 동물실험을 실시하였다(허가번호 KW-130924-1). 방어율 시험의 경우, 백신접종 3주 후 10⁸CFU/ml의 ST21을 마우스 구강으로 공격접종한 뒤, 12일차에 마우스의 장기무게 측정 및 간과 비장으로부터 검출된 공격균주의 균수 측정을 하였다. 분리된 간과 비장은 PBS에 희석하여 TissueLyser(QIAGEN, USA)로 조직을 파쇄한 후 Salmonella-Shigella(SS) agar(BD, USA)에서 집락수를 측정하였다. 상용백신(Salenvac T; MERCK, USA)가 양성대조군로 사용되었다. ST 변이주에 대한 마우스에서 방어효과를 측정하기 위해 변이주를 경구(oral), 복강내(IP) 및 근육내(IM)로 적정량을 접종하였으며, 음성대조군은 phosphate-buffered saline(PBS)만을 투여하였다(표 5 참조).

<마우스에서 생균백신 후보주에 대한 방어율 및 생존율 시험에 사용된 백신과 균주 목록>

Vaccine	Route	Dose (CFU)	Volume (μl)	Mouse numbers
Vaccine	Route	Dose (CFU)	Volume (μl)	Protection	Survival
ST△3	Oral	109	100	6	6
ST△3	IP	104	100	6	6
PBS	IP		100	6	6
Salenvac-T	IM	109	200	6	6

공격접종 2주 후에 모든 군의 마우스들을 폐사시킨 다음 간과 비장을 추출하여 공격균주의 집락수를 측정한 결과, 간에서는 대조군(1.3 X 10⁷CFU/g)과 비교 시 모든 군들이 통계적으로 유의성있게 낮은 값을 보였다. 이는 본 백신후보균주 백신의 방어능력이 뛰어남을 보여주는 것이다. 아울러, 본 백신후보균주가 상업용 백신보다 유의성있게 더 낮은 값을 보여 주었다. 비장에서도 대조군(1.5 × 10⁶CFU/g)과 비교 시에 백신군들이 낮은 집락수를 보였다. 특히 복강내접종군은 유의성있게 낮은 값이 보였다. 복강내접종군이 간(3.1 × 10⁴CFU/g)과 비장(1.7 × 10⁴CFU/g)에서 가장 낮은 균수가 관찰되어 최고의 방어율을 보여 주었다(도 6 참조).

<실시예 9>

마우스에서 생균백신 후보주에 대한 생존율 시험

본 발명자들은 마우스에서 생균백신 후보주에 대한 생존율 및 방어율 시험을 위해, 실험동물로 7주령의 BALB/c 암컷마우스를 사용하였고, IVC Rack(MVCS; Threeshine, Korea)에서 사육하였다. 실험동물의 윤리적 사용을 위해 3R 원칙을 준수하였으며, 강원대학교의 동물실험윤리위원회 규정하에서 동물실험을 실시하였다(허가번호 KW-130924-1). 생존율 시험의 경우, 백신접종 3주 후 10¹⁰CFU/ml의 고병원성 야생주 Salmonella Typhimurium (ST21: ATCC14028)을 마우스 구강으로 공격접종한 뒤, 15일간 마우스의 폐사 유무를 관찰하였다.

백신접종 3주 후에 야생균주 ST21 (방어율:10⁸CFU/ml,생존율: 10¹⁰CFU/ml)로 모든 군의 마우스에 공격접종한 결과, 대조군의 모든 마우스들이 공격접종 후부터 상태가 급격히 안 좋아졌으며, 5일 째부터 1마리씩 폐사하여, 11일째까지 모든 마우스가 폐사하였다. 근육내 접종군의 마우스들도 1마리를 제외하고 10일째까지 모두 폐사하였다. 이와는 반대로, 본 연구에 사용된 생균백신 후보주 ST△3는 공격접종 직후엔 털이 거칠어지고 활동성이 낮았지만, 곧 활동성이 회복되어 복강내 접종했을 시엔 100%의 생존율을 보였으며, 경구접종 시에는 66.7%의 높은 생존율을 보였다(도 7 참조).

<실시예 10>

방어율 시험마우스에서 생균백신 후보주에 대한 항체가 조사

백신접종 전(0주) 및 1, 2, 3, 5주 후에 모든 마우스에서 안와채혈 방식으로 혈액을 채취하였다. 혈액의 항체가 변화를 확인하기 위해 ELISA를 실시하였다. 50μl/well의 항원 (Salmonella Typhimurium 21 OMP, 10μg/ml)을 각각의 well에 코팅하고, plate (Nunc, Wiesbaden, Germany)를 -4℃에 16시간 동안 보관하였다. 그 후, PBST (0.5% Tween20 + PBS)로 plate를 세번 세척한 다음, 3% BSA (Merck, Darmsdadt, W. Germany)로 3시간 동안 37℃에서 blocking하였다. PBST로 다시 세척한 다음, 1차 항체로 0.5% BSA가 포함된 PBS에 200배로 희석된 혈청을 100μl 첨가하고, 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 2차 항체로 200배 및 2000배로 희석된 IgG, IgG1, IgG2a, IgA를 첨가하고 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 100μl의 TMB (SurModics, Eden Prairie, USA)를 첨가하고, 3분 동안 어두운 곳에서 반응시킨 후, 2N의 H₂SO₄로 반응을 중지시키고, ELISA reader로 흡광도를 측정하였다.

마우스로부터 혈청을 매주 안와채혈하여 IgG, IgA, IgG1, IgG2a에 대한 항체가를 측정한 결과, IgG의 경우, 대조군과 비교 시 백신접종 2주 후부터 5주차까지 유의성을 보이며 현저히 높은 항체가를 보였다. 복강내접종군과 근육내접종군의 항체가가 가장 높았으며, 그 뒤를 경구내접종군이 뒤따랐다. IgA의 경우엔, 백신 후 항체가는 대체적으로 소폭 증가하거나 증가하지 않는 것처럼 보였으나, 공격접종 후에는 미백신그룹인 대조군보다 모든 백신군이 유의성있게 높은 항체형성을 보이는 것을 알 수 있었다. 특히 기대했던 것처럼 경구내접종군은 복강내접종군보다 IgA 형성률이 높은 것을 볼 수 있었다. IgG1에서는 상용백신군이 백신접종 2주 째부터 항체형성률이 굉장이 높음을 볼 수 있었다. 복강내접종군은 근육내접종군에 비해 백신접종 후 항체형성은 낮았으나, 공격접종 후 5주차엔 항체형성은 비슷한 수준을 보였다. IgG2a에서는 백신접종 후부터 복강내접종군의 항체형성률이 유의성있게 증가하였으며, 백신 접종 3주차에서는 positive control인 근육내접종군보다 항체가가 높았다. 공격접종 후에도 높은 항체가를 보이며 높은 방어력을 보이는 것을 확인하였다(도 8 참조).

상기와 같은 결과들을 통하여 본 발명자들은 본 발명에 의한 삼중 돌연변이주가 야생형 균주에 대한 백신으로 유용하게 활용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

통계분석

실험군간의 유의성 있는 차이를 보기 위한 통계적 분석은 one-way ANOVA를 이용하였다. p < 0.05인 경우 유의성이 있는 것으로 판정하였으며, Dunnett의 다중비교검정을 실시하여 군간의 차이를 비교하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC12325BP

20121128

<110> KNU-Industry Cooperation Foundation Industry-Academic Cooperation Foundation, Chosun University <120> Multiple mutated Salmonella Typhimurium and vaccine composition for prevention of food poisoning <130> PN1209-467 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2763 <212> DNA <213> salmonella typhimurium <400> 1 ttaagtaatg gtgtagtttt tgaagatcat acgtattttc tggcgtaagt cggttagttc 60 ctccagcgcg atgattttcc ccatttttac gcgattctca atgtctatga catagcatac 120 caattcagtc tgccctattt gacctaaaca gccttttaat gtgtgaatta actgatcgat 180 tttttctcca gccgatacgg cattttcaat atcagccagc aagaggtcca gtgattggaa 240 aatcttgcta ttaatgacca tatcatctgt cgccagtagc gctgagcagc gactcggatc 300 ctgctcctgt agctctatat ttcgtaaaag ttggtattct gcggcaatac tgatgtagcg 360 agctaaggta gccaatgtca ctggttttgt aatgtaatga tgaatcccat tttttttaca 420 acgatgaata tcttctgtcg ctacgctagc ggatagtgcc acaaacatgc agtcaggatc 480 taaattattc ggctcatcat gccataatcg tacacattca ataccatcta tttctggcat 540 tctaatgtca atcagtacta aatcgaatcg ctgctgttgt gataaagtca gagcctcgtt 600 actactggcg gcaatagtga cgtgttggcc caggctgaca agcattttgc cgatgatatc 660 ccgattaata tcggcatcat caaccaaaag aatctgcaac tgccagggtg gtaacaaatt 720 atttattact ggcatatttg gtgtacacaa tattaactgt tgcgccaggt cgtagagttt 780 tccggagaaa tacaaaagct ctgcgttgag aagcgcattt tgctggtggg gtggttcacc 840 gcgtattccc cagcaagcca gttgccgatg caggcagaac ggcgctgaca gcgtcccttt 900 aattggttga ggcggctggt attcttgtaa gggtaatact agcgagacac aggttccaac 960 cccggggaca ctttttagtg tcagattacc gcccatcatt ttagccaggc ttgacgcaat 1020 agtcagtcca attcctgtac cttgcgaatt tgtgtctgct tgataaaaag cagtaaagat 1080 ttgagactgc tgctgtattt caatcccttt accgctatcg ctaaccagaa atattaattg 1140 ttcctcatga cgcttgaccg tcagacgtat ccctccggtt tcggtaaatt ttaccgcgtt 1200 cccgagtaaa ttaaccaaaa tttgccgtaa acggatactg tcggtatgaa aatagagagg 1260 gacatgttga ccgacaaaag tacgtaatga cagttttttg ctttgcgctg gcccctggat 1320 ggtttgcatt gcctggtcca gtaacggcag taacgctgtt tcttccatat gtaatgtgaa 1380 atgaccagac tcgatgcgtg aaaaatccag cagattatta ataatagcta acaaagacag 1440 tgtacaattt ctggcggtat cagctaatcc ttgttgctct atgtttaaag gggtggtttg 1500 taataattca attgcaccga gtacgccatt catcggagta cgtaactcat gacttattac 1560 cgtaagatga atgcttttac gtttgttagc tcgctcagcg cgtttttttg cttcatttag 1620 cgcctgggtg cgctctgcga ctttgttttc cagattgtcg tattggactt gtagagtatc 1680 aagcagttgg ttaaaagcac cggcaatact atctaattca tccagtcgtt gtgctggtaa 1740 acgtgtgctc agcggtgcag ttgcggtttt attaatgaca tcgacaaaac gccataacgg 1800 tttggccagt gagcgatgta gtaaccagca aaaagccgac gtcatcaaca ccaatgctgt 1860 taatgtaaag gggatttgtt gaaggataat ttttaagatg cgattatgta gattaccgta 1920 tgggtacagc gtaaccagac tccatccggg gccatgcaag gttgtgcgta atatcagaaa 1980 tccgggaatt tgctgccatc catcatgcag cgttacattt tctaactgtg tacgtatttt 2040 ttgcgggatg tatgaaaacg gcaataagtg gttgttttga tccagccata ctcgaatact 2100 atcatctaat ggcaggtggc tcttagtaat gagatcggga agtttaaccg tcacctcaaa 2160 aaatacgcct tgctgatcgg caaccgcaac ggaagcgtgc catcctttgc cgtttatgta 2220 ttctggttca ctccagtaaa acccggcatg ggttgggtat aaaggaaagc tttttcgcgt 2280 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cagaacttgc tgactactgc tttttaaaac atagccatta gcacctgcgg ctaaagtttt 360 aatggtcata tactcttgtt ggtatgctgt gtaaaccaga atattcattg ctggccaacg 420 ctgatgtaat tgaggaatga tatccaggcc attgatgcca ggtagactaa gatcaaggat 480 aagtatgtca ggctcgtatg cacaacaggc attataaacc tcaagaccat ttttaacatg 540 ctctacaatt ttaaaatgag gccagggtaa taaggcattc ataatgccgt taatgatgat 600 ttcatgatcg tctactaata agatcttata ttctttcat 639 <210> 3 <211> 993 <212> DNA <213> salmonella typhimurium <400> 3 ttactcgcgg aacagcgctt cgatattcag cccctgcgtc tgcagaattt cgcgcagacg 60 gcgcaggcct tcaacctgaa tctgacgaac acgttcacgc gtaagaccga tttcacggcc 120 tacatcttcc agtgtcgcag cttcatatcc cagcagaccg aaacggcgcg ccagcacttc 180 acgctgtttg gcgttcagtt cgaacaacca tttgacgatg ctctgtttca tatcgtcatc 240 ttgcgtggtg tcttccggac cgttctcttt ttcatcggcc aggatgtcca gcaacgcttt 300 ttcggaatca ccgcccagcg gggtgtctac cgaggtaatg cgctcgttga gacgaagcat 360 acggctgacg tcatcaaccg gtttatccag ttgctctgca atttcttccg cactcggttc 420 gtggtccagt ttatgcgaca actcacgtgc ggtgcgcagg tatacgttca gctctttaac 480 aatgtgaatc ggcaagcgaa tcgtacgggt ttggttcatg atcgcccgtt cgattgtctg 540 gcgaatccac caggttgcgt atgttgagaa gcggaacccg cgttccgggt caaacttctc 600 gactgcacgg ataagcccca ggttgccctc ttcaatcagg tccagcaacg ccagtccacg 660 attgccataa cggcgggcaa tttttaccac cagacgcagg ttactctcaa tcatgcgacg 720 gcgagaagcg acatctccac gcagtgcgcg acgcgcaaaa tagacttctt cttcggctgt 780 taacagtggt gaatacccaa tctcaccaag gtaaagctga gtcgcgtcca acacacgctg 840 tgtggcccct tgcgataaca gctcttcttc agccaggtcg ttatcactgg gttcctcttc 900 actcaaggct ttttcgtcaa aagcctctac tccgttctca tcaaattccg cgtcttcatt 960 taaatcatga actttcagcg tattctgact caa 993 <210> 4 <211> 1191 <212> DNA <213> salmonella typhimurium <400> 4 atgcttgacg cacaaaccat cgctacagta aaggccacca ttcccctgct ggttgaaaca 60 ggaccgaaac tgaccgccca cttctacgac cgtatgttta cgcataaccc ggagctcaaa 120 gaaatcttca atatgagcaa ccagcgtaac ggcgatcagc gtgaagccct gtttaatgct 180 atcgcggcct acgccagcaa tatcgaaaat ttaccggcgt tgctgccggc ggtagaaaaa 240 atcgcgcaga agcacaccag cttccagatt aagccggagc agtacaacat cgtcgggaca 300 catctgctgg cgacgctgga cgaaatgttc aacccgggcc aggaagtgct ggacgcgtgg 360 ggcaaagcct atggcgtact ggctaacgtc tttattcatc gggaagccga gatttatcac 420 gagaacgcca gcaaagacgg cggctgggaa ggcacgcgcc ccttccgcat cgttgcgaaa 480 accccgcgta gcgcactgat caccagcttt gagtttgaac cagtcgacgg cggtacggtg 540 gcggaatacc gtcccgggca gtatctgggc gtctggctga agccggaagg ttttgcgcat 600 caggagatcc gccaatattc actgacccgt aaacccgatg gcaaagggta ccgtattgcc 660 gtgaagcgtg aagacggcgg ccaggtatca aactggttac accatcacgc cagcgtaggc 720 gatggggtgc atctggctgc gccggcaggt gacttcttta tgaatgtcgc cgctgatacc 780 cccgtttcgc tgatttccgc tggcgtcggc cagacgccga tgttagcgat gctcgatacg 840 ctggcgaaag aacagcatac cgcgcaggtg aactggttcc acgcggcgga gaacggcgac 900 gtccatgcgt ttgccgacga agtgagcgag ctgggccgta cactgccgcg tttcactgcc 960 catacctggt accgcgagcc gactgagtcc gatcgcgccc aacgcctctt cgacagcgaa 1020 gggctgatgg atttaagcaa actggaagcc gcgatcagcg atccagcaat gcagttctat 1080 ctttgcggcc cggtaggctt tatgcagttt gccgcaaaac aactggtttc acttggcgtg 1140 aataacgaaa acattcatta cgaatgcttc ggcccgcata aagtgctgta a 1191 <210> 5 <211> 283 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated ssrA gene from salmonella typhimurium <400> 5 gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata ggaactaagg aggatattca 60 tatggcgttc agcttcttca aaccgttgat tgcttagtac aatattcatc tcggatagaa 120 cggataaatc ctctattata tgctgccgtt tctgaaccat tgatatataa gctgcggtaa 180 gcacagatag cagccaaata attattgttg ttaataaaaa taaaaaagtt agcctgatta 240 ctaaagatgt ttgcagcgta ttcttgagat tgagcaaatt cat 283 <210> 6 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated ssrB gene from salmonella typhimurium <400> 6 ttaatactct attaacctca ttcttcgggc acagttaagt aactctgtca ctttgtgtag 60 gctggagctg cttcgaagtt cctatacttt ctagagaata ggaacttcgg aataggaact 120 aaggaggata ttcatatgg 139 <210> 7 <211> 238 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated rpoS gene from salmonella typhimurium <400> 7 ttactcgcgg aacagcgctt cgatattcag cccctgcgtc tgcagaattt cgcgcagacg 60 gcgcaggcct tcaacctgaa tctgacggtg taggctggag ctgcttcgaa gttcctatac 120 tttctagaga ataggaactt cggaatagga actaaggagg atattcatat ggtactccgt 180 tctcatcaaa ttccgcgtct tcatttaaat catgaacttt cagcgtattc tgactcaa 238 <210> 8 <211> 596 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated hmpA gene from salmonella typhimurium <400> 8 atgcttgacg cacaaaccat cgctacagta aaggccacca ttgtgtaggc tggagctgct 60 tcgaagttcc tatactttct agagaatagg aacttcggaa taggaactaa ggaggatatt 120 catatggtgg ggtgcatctg gctgcgccgg caggtgactt ctttatgaat gtcgccgctg 180 atacccccgt ttcgctgatt tccgctggcg tcggccagac gccgatgtta gcgatgctcg 240 atacgctggc gaaagaacag cataccgcgc aggtgaactg gttccacgcg gcggagaacg 300 gcgacgtcca tgcgtttgcc gacgaagtga gcgagctggg ccgtacactg ccgcgtttca 360 ctgcccatac ctggtaccgc gagccgactg agtccgatcg cgcccaacgc ctcttcgaca 420 gcgaagggct gatggattta agcaaactgg aagccgcgat cagcgatcca gcaatgcagt 480 tctatctttg cggcccggta ggctttatgc agtttgccgc aaaacaactg gtttcacttg 540 gcgtgaataa cgaaaacatt cattacgaat gcttcggccc gcataaagtg ctgtaa 596

Claims

ssrA 유전자인 서열번호 1, ssrB 유전자인 서열번호 2, rpoS 유전자인 서열번호 3, hmpA 유전자인 서열번호 4 중 어느 하나 이상이 돌연변이된 살모넬라 티피뮤리움 균주.
제1항에 있어서,
상기 서열번호 1의 돌연변이는 서열번호 5인 것을 특징으로 하는 살모넬라 티피뮤리움 균주.
제1항에 있어서,
상기 서열번호 2의 돌연변이는 서열번호 6인 것을 특징으로 하는 살모넬라 티피뮤리움 균주.
제2항 또는 제3항에 있어서,
상기 균주는 숙주의 식세포 내에서 생존 능력이 결핍 또는 감소된 것을 특징으로 하는 살모넬라 티피뮤리움 균주.
제1항에 있어서,
상기 서열변호 3의 돌연변이는 서열번호 7인 것을 특징으로 하는 살모넬라 티피뮤리움 균주.
제5항에 있어서,
상기 균주는 숙주의 식세포 내에서 분비되는 활성산소 저항력이 결핍 또는 감소된 것을 특징으로 하는 살모넬라 티피뮤리움 균주.
제1항에 있어서,
상기 서열번호 4의 돌연변이는 서열번호 8인 것을 특징으로 하는 살모넬라 티피뮤리움 균주.
제7항에 있어서,
상기 균주는 숙주에서의 지속감염능이 결핍 또는 감소된 것을 특징으로 하는 살모넬라 티피뮤리움 균주.
제1항에 있어서,
상기 서열번호 1의 돌연변이는 서열번호 5이고, 상기 서열번호 2의 돌연변이는 서열번호 6이고, 상기 서열번호 3의 돌연변이는 서열번호 7이고, 상기 서열번호 4의 돌연변이는 서열번호 8인 것을 특징으로 하는 살모넬라 티피뮤리움 균주(기탁번호: KCTC 12325BP).
제1항에 있어서,
상기 균주는 약독화 된 것을 특징으로 하는 살모넬라 티피뮤리움 균주.
제1항에 따르는 살모넬라 티피뮤리움 균주 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 식중독 예방 백신 조성물.