BRPI1006875B1

BRPI1006875B1 - composição farmacêutica, bactérias, e, uso de bactérias vivas

Info

Publication number: BRPI1006875B1
Application number: BRPI1006875-9A
Authority: BR
Inventors: Antonius Arnaldus Christiaan Jacobs; Robert Van Der Geize; Lubbert Dijkhuizen
Original assignee: Intervet International B.V.
Priority date: 2009-01-12
Filing date: 2010-01-11
Publication date: 2020-10-20
Also published as: CN102271693A; BRPI1006875A2; CA2749075C; ZA201104714B; BRPI1006875B8; RU2543663C2; NZ593588A; CA2749075A1; EP2385836B1; WO2010079224A1; AR075013A1; JP5540325B2; CN102271693B; US20110274660A1; MX2011007414A; RU2011133824A; AU2010204269A1; TW201036631A; US8574565B2; TWI458489B

Abstract

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, BACTÉRIAS, USO DE BACTÉRIAS, VIVAS, E, MÉTODOS PARA TRATAR UM ANIMAL. A invenção diz respeito a uma composição farmacêutica para proteger uma animal contra um distúrbio que surge de uma infecção com uma bactéria que pertence ao grupo de actinomicetos nocardioformes tendo a capacidade para sobriver dentro de macrófagos do animal, compreendendo bactérias vivas de uma espécie de actinomicetos nocardioformes, as bactérias vivas sendo atenuadas pela inativação de um gene que codifica uma proteína envolvida na degradação do propionato de metilhexabidroindanodiona, e um veículo farmaceuticamente aceitável para estas bactérias vivas.

Description

[0001] A presente invenção diz respeito a uma composição farmacêutica para proteger um animal contra um distúrbio que surge de uma infecção com uma bactéria que pertence ao grupo de actinomicetos nocardioformes. A invenção também diz respeito ao uso de bactérias atenuadas vivas deste grupo para fabricar a dita composição e um método de tratar um animal com esta composição.

[0002] Dentro das bactérias da classe Actinobacterium existe uma ordem de bactérias chamadas de Actinomycetales, habitualmente aludidas como actinomicetos. As bactérias que pertencem a esta ordem são bactérias filamentosas gram positivas (várias espécies, entretanto, têm estruturas de parede celular complexas que tornam o manchamento de gram clássico menos adequado ou mesmo inadequado, como é por exemplo o caso com muitas espécies que pertencem à família de Actinomycetales Mycobacteriaceae) com um alto teor de G+C. Elas são melhor conhecidas como organismos que residem no solo, embora várias cepas habitam em plantas e animais, incluindo seres humanos. Elas produzem esporos resistentes que são frequentemente ligados ao micélio aéreo ou hifa. Os actinomicetos desempenham um papel importante na decomposição de material orgânico. Várias espécies são usadas na indústria e pesquisa farmacêutica por causa das suas propriedades típicas.

[0003] A maioria dos actinomicetos são não patogênicos para os animais (o termo “animais” usado em conexão com a presente invenção inclui seres humanos). Entretanto, dentro das muitas subordens dos actinomicetos (entre outras, Streptosporangineae, Micrococcineae, Streptomycineae e Frankineae) existe uma subordem, a saber, as Corynebacterineae, que hospeda, junto a uma grande quantidade de bactérias não patogênicas, um número substancial de patógenos de animal. Parece que estes patógenos residem dentro do grupo filogênico conhecido como os Actinomicetos nocardioformes, que abrange as famílias Mycobacteriaceae, Nocardiaceae e Corynebacteriaceae (ver inter alia o capítulo 11, intitulado: Rhodococus equi: Pathogenesis and Replication in Macrophages, em “Opportunistic Intracellular Bacteria and Immunity”, por Lois J. Paradise et al (eds.), Nova Iorque, 1999). Extraordinariamente, contra a maior parte de doenças relacionadas com infecção com estes patógenos quase não existe nenhum tratamento profilático adequado (i.e., tratamento antes, ou essencialmente ao mesmo tempo da exposição ao patógeno causador da doença que possa ser capaz de prevenir a doença de ser contraída, ou pelo menos mitigar os efeitos da doença) disponível. Durante os anos recentes o reconhecimento de que as famílias Mycobacteriaceae, Nocardiaceae e Corynebacteriaceae do grupo filogênico de actinomicetos nocardioformes são famílias muito intimamente relacionadas dentro da subordem das Corynebacterineae, foi confirmado (ver também University of California, San Diego, Outline of Senior Project, Marelle L. Yehuda, 2 de junho de 2005). Tern se tornado claro também que em particular as bactérias patogênicas neste grupo, pelo menos aqueles para os quais nenhum tratamento profilático adequado é disponível (tal como por exemplo Mycobacterium tuberculosis, Nocardia seriolae e Rhodococcus equí), têm uma propriedade importante em comum: a infecção tipicamente ocorre por intermédio da pele ou membrana mucósica, seguido pela disseminação das bactérias dentro de macrófagos e a replicação dentro destes macrófagos (ver inter alia Microbes and Infection 7, 2005, 1352-1363; Proceedings of the National Academy of Sciences, 7 de junho de 2005, Vol. 102, no 23, pp 8327 - 8332; Nature Medicine 13, 282 - 284, 2007; Transplantation Proceedings, Volume 36, Edição 5, Junho de 2004, pp 1415 - 1418). De fato, os macrófagos estão na linha de frente da defesa imune do hospedeiro contra infecções microbianas, mas diferente das bactérias que dependem do evitação da fagocitose para sobreviver no hospedeiro, as bactérias patogênicas correntemente consideradas dentro deste grupo alvejam os macrófagos para sobreviver e ainda replicar no hospedeiro. A presente invenção diz respeito a estas bactérias que têm a capacidade para sobreviver dentro de macrófagos de um animal, e em conexão com a invenção corrente serão aludidos como actinomicetos nocardioformes que sobrevivem em macrófago.

[0004] Aparentemente, os actinomicetos nocardioformes que sobrevivem ao macrófago têm evoluído para evadir as funções críticas de uma defesa do animal contra micróbios. Em particular a Mycobacterium tuberculosis, o micróbio causative da tuberculose, é uma espécie que tem explorados os macrófagos com êxito como seu nicho primário in vivo, mas outras espécies bacterianas que pertencem ao grupo de actinomicetos nocardioformes, incluindo Mycobacteriaceae, Nocardiaceae e Corynebacteriaceae, têm adotado a mesma estratégia. Estas são por exemplo Mycobacterium ulcerans que causa a úlcera de Buruli, Mycobacterium avium paratuberculosis que causa a doença de Johne no gado e que é ligada à doença de Crohn nos seres humanos, Mycobacterium bovis que causa a tuberculose bovina, Mycobacterium avium que está relacionada com a infecção oportunística de pacientes imunocomprometidos tais como os paciente com AIDS, Nocardia seriolae e Nocardia farcinia que causam a nocardiose no peixe, Nocardia asteroides que causa infecção em receptores de transplante renal, Rhodococcus equi (antigamente conhecida como Corynebacterium) que causa pneumonia em crias de animais equinos e que também é conectada com infecções oportunísticas em indivíduos imunocomprometidos, Corynebacterium pseudotuberculosis que causa abscessos, inter alia nos pulmões, em ovelhas, cabras, cavalos e ocasionalmente também em seres humanos, etc. Todas estas espécies bacterianas têm em comum a capacidade para sobreviver dentro de macrófagos, infectá-los e replicar dentro deste tipo de célula hospedeira.

[0005] Esta propriedade típica seriamente dificulta o tratamento para os distúrbios (neste relatório descritivo o termo “distúrbio” é usado como um equivalente para “doença”) que surge de uma infecção com uma bactéria que pertence ao grupo de actinomicetos nocardioformes que sobrevivem ao macrófago. Em muitos casos, o tratamento é com antibióticos quando sinais clínicos estão de fato presentes. Isto é, entretanto, inconveniente visto que uma quantidade significante das bactérias estão presentes dentro dos macrófagos e difíceis de atingir pelos antibióticos. O tratamento com antibióticos, portanto, frequentemente leva um tempo de tratamento longo, e com sucesso ambíguo. Para doenças tais como a tuberculose em seres humanos, a nocardiose no peixe e a pneumonia em crias de animais equinos, o tratamento profilático seria preferido. Tal tratamento profilático tipicamente conta com o uso de uma vacina compreendendo bactérias mortas ou vivas atenuadas derivadas das bactérias do tipo selvagem. Com respeito aos actinomicetos nocardioformes que sobrevivem ao macrófago, as vacinas mortas (isto é, vacinas compreendendo bactérias mortas ou uma ou mais subunidades destas como o agente terapêutico) têm mostrado ser malsucedidas. No presente no geral acredita-se que se necessite de bactérias vivas para um tratamento profilático bem-sucedido contra actinomicetos nocardioformes que sobrevivem ao macrófago, visto que apenas estas podem ter a capacidade de atingir os macrófagos e imitar as bactérias do tipo selvagem suficientemente para deflagrar uma resposta imune adequada. De fato, para tratar a tuberculose, uma vacina viva (BCG, Bacilo de Calmette Guerin) está disponível com base na espécie Mycobacterium bovis espécie esta que é muito intimamente relacionada com a espécie Mycobacterium tuberculosis. Entretanto, o efeito protetor não é impressionante. Com respeito às espécies Nocardiaceae tais como Rhodococcus equi e Nocarida seriolae, nenhuma vacina está no momento comercialmente disponível. Com respeito às espécies Corynebacterium pseudotuberculosis controle tem sido tentado usando vacinas autógenas, entretanto com sucesso ambíguo (RUMA Guidelines, National Office of Animal health, Hertfordshire, Reino Unido, 2006).

[0006] Existe claramente uma necessidade quanto a tratamento profilático adequado para proteger um animal contra um distúrbio que surge de uma infecção com actinomicetos nocardioformes que sobrevivem ao macrófago. O tratamento neste sentido significa estimular o sistema imune do animal alvo suficientemente para pelo menos reduzir os efeitos negativos de uma inoculação com microorganismos do tipo selvagem. A meta é que isto leve a uma proteção contra o distúrbio, isto é, o distúrbio seja prevenido, ou pelo menos o nível de infecção ou os sinais clínicos de doença no animal sejam diminuídos, e consequentemente a severidade da doença também seja diminuída. O fato de que os actinomicetos nocardioformes que sobrevivem ao macrófago tenham adotado a mesma estratégia para sobreviver em um hospedeiro produz a idéia de uma estratégia comum para o tratamento profilático contra uma infecção com estas bactérias.

[0007] A este respeito é mencionado que foi descrito na literatura que o metabolismo de colesterol desempenha um papel crucial na sobrevivência de actinomicetos nocardioformes em macrófagos e seria um fator de virulência importante (Proceedings of the National Academy of Science, 6 de fevereiro de 2007, vol. 104, no. 6, pp 1947-1952). Foi também sugerido que este metabolismo fornece alvos lógicos para novos agentes terapêuticos para combater cepas que causam doença, isto é, medicamentos para o tratamento depois que infecção tenha ocorrido. De fato, quando da aplicação de visão retrospectiva existe outra evidência corroborantes quanto ao fato estabelecido de que para todos os actinomicetos nocardioformes que sobrevivem ao macrófago, o metabolismo de colesterol desempenha um papel na sobrevivência e persistência das bactérias em macrófagos hospedeiros. Por exemplo, a partir do capítulo 11 (intitulado: Rhodococus equi: Pathogenesis and Replication in Macrophages) em “Opportunistic Intracelular Bacteria and Immunity”, por Lois J. Paradise et al (eds.), Nova Iorque, 1999) é conhecido que existem enormes similaridades na sintomatologia clínica entre as infecções causadas pelos vários actinomicetos nocardioformes e a colesterol oxidase foi determinada ser um componente enzimático de fatores de virulência. Na Veterinairy Microbiology, Volume 56, Edição 3-4, junho de 1997, 269-276 é sabido que a Corynebacterium pseudotuberculosis está envolvida nos processos de colesterol oxidase junta com Rhodococcus equi.

[0008] Portanto, à primeira vista parece tentar desenvolver uma composição farmacêutica para proteger um animal contra um distúrbio que surge de uma infecção com actinomicetos nocardioformes que sobrevivem ao macrófago (uma tal composição também pode ser aludida como uma vacina), usando o reconhecimento de que o metabolismo de colesterol desempenha um papel crucial na sobrevivência destas bactérias nos macrófagos. Entretanto, uma vez constatado que as sugestões feitas no artigo da PNAS aludido acima (artigo de 2007) relacionadas com um medicamento, e assim dirigidas a matar completamente as bactérias pela interferência no seu metabolismo de colesterol, seguindo esta mesma estratégia parece ser inadequada para uma vacina viva: se é tentado atenuar uma bactéria pelo corte da sua sobrevivência no sítio essencial de replicação, a bactéria não replicará e persistirá no animal hospedeiro. De fato, para um tratamento com medicamentos esta é uma situação ideal. Entretanto, para uma vacina, bloqueia-se completamente a sobrevivência da bactéria, espera-se imitar uma vacina compreendendo bactérias mortas.

[0009] Tais vacinas têm se mostrado ser malsucedidas para tratar actinomicetos nocardioformes que sobrevivem ao macrófago. Entretanto, tentativas foram realizadas para avaliar o uso de bactérias vivas que são enfraquecidas em seu metabolismo de colesterol, em uma composição farmacêutica para proteger um animal contra uma inoculação com actinomicetos nocardioformes que causam doença do tipo selvagem. Um exemplo de tais tentativas é uma vacina viva com base em um mutante da colesterol oxidase (ChoE) da cepa 103+ de Rhodococcus equi do tipo selvagem (Prescott em Veterinary Microbiology 118, 2006, pp 240-246). Esta tentativa foi infrutífera. Entretanto, não porque a mesma não induziu nenhuma proteção, como esperar-se-ia com base nas divulgações técnicas do artigo da PNAS como aludido aqui acima (PNAS 6 de fevereiro de 2007, vol. 104, no. 6, pp 1947-1952), mas porque a cepa mutante foi ainda muito virulenta. O mutante pôde ainda sobreviver e multiplicar em macrófagos em um nível comparável à R. equi do tipo selvagem. Também, a carga antigênica deste mutante enfraquecido em colesterol pareceu ser comparável com aquele de um organismo do tipo selvagem. Portanto, o mutante foi ainda capaz de induzir doença. De fato, entrementes também foi estabelecido que uma Rhodococcus equi mutante vivo que é completamente incapaz de utilizar colesterol (mutante da utilização de esterol permease supAB como apresentado por Van der Geize et al. no 4o Havemeyer Workshop on Rhodococcus equi, Edinburgh, 13 a 16 Julho de 2008; e Van der Geize et al.: “A novel method to generate unmarked gene deletions in the intracelular pathogen Rhodococcus equi using 5-fluorocytosine conditional letality” em Nucleic Acids Research 2008; doi: 10.1093/nar/gkn811, mais adiante também aludido como “Van der Geize et al., 2008”), que significa que o metabolismo de colesterol completo é bloqueado (pelo menos quando colesterol é usado como o composto de partida), é ainda capaz de sobreviver e persistindo em macrófagos (Van der Geize et al., 2008) e assim é ainda muito virulente. De modo a atenuar uma Rhodococcus equi viva parece ser necessária uma mutação adicional tendo um efeito fora do metabolismo de colesterol (Prescott: Veterinary Microbiology 125, 2007, 100-110). Com base nestes resultados, foi concluído que o metabolismo de colesterol como tal não é um fator de virulência importante e não pode ser usado para atenuar suficientemente estas bactérias. As bactérias tendo mutações em seu metabolismo de colesterol aparentemente têm a mesma, ou pelo menos uma carga antigênica comparável como o organismo do tipo selvagem e assim, embora capaz de fornecer proteção adequada (isto é: se o animal objeto sobrevive a inoculação com as bactérias mutadas), são demasiadamente virulentas para serem usadas em uma composição farmacêutica. Assim, alvejar em uma composição farmacêutica para o tratamento profilático, cuja composição contém bactérias vivas que são atenuadas pela inativação de genes envolvidos no metabolismo de colesterol, é considerado ser uma rua sem saída.

[00010] Surpreendentemente entretanto os requerentes descobriram que de modo a proteger um animal contra um distúrbio que surge de uma infecção com um nocardioforme actinomiceto que sobrevive ao macrófago, pode-se usar uma composição farmacêutica compreendendo bactérias vivas de uma espécie de actinomicetos nocardioformes (tipicamente sendo da mesma espécie como a bactéria infectante ou alternativamente, sendo de uma espécie muito intimamente relacionada, tendo assim muitos epítopos de célula T em comum tal como é o caso com Mycobacterium tuberculosis vs Mycobacterium bovis), as bactérias vivas são atenuadas pela inativação de um gene que codifica uma proteína envolvida na degradação do propionato de metilhexahidro-indanodiona, e um veículo farmaceuticamente aceitável para carregar as bactérias.

[00011] “Atenuada” neste sentido significa ser incapaz de induzir uma gama completa de sintomas da doença que é normalmente associada com a contraparte patogênica virulenta (frequentemente do tipo selvagem) da bactéria atenuada.

[00012] “Inativação” no sentido da presente invenção significa que um gene, por exemplo enquanto é parte de um operon (isto é, o conjunto de genes necessários para expressar de fato a proteína em um nível funcional) é completamente removido do genoma ou trocado (por qualquer conhecido, ou ainda ser técnica desenvolvida; ver por exemplo, Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair, INFINITY SCIENCE PRESS LLC, 2008, capítulo 13 “Genetic Techniques”, pp 476-496 e capítulo 15 “Recombinant DNA Technology”, pp 563-612) tal que o mesmo não mais codifique a proteína do tipo selvagem correspondente, ou não esteja mais acessível para a transcrição completa, ou qualquer outra mudança no genoma tal que a proteína do tipo selvagem não será fabricada pela bactéria atenuada in vivo, pelo menos não ao nível adequado para sustentar o catabolismo de propionato de metilhexahidroindanodiona normal quando comparado a uma situação em que o gene (ou operon, se aplicável) está em uma forma adequada para sustentar o metabolismo normal.

[00013] “Que codifica uma proteína” no sentido da presente invenção significa que o gene (por exemplo enquanto sendo parte de um operon) diretamente codifica a proteína ou uma subunidade da proteína (subunidades múltiplas juntas formando a proteína enzimaticamente ativa), ou codifica um ou mais intermediários que são convertidos, diretamente ou por intermédio de etapas múltiplas, na proteína ou subunidade desta (subunidades múltiplas juntas formando a proteína enzimaticamente ativa).

[00014] Um “veículo farmaceuticamente aceitável” pode ser qualquer solvente, meio de dispersão, revestimento, agente antibacteriano e antifúngico, agente isotônico e retardador de absorção, e outros que são fisiologicamente compatível com e aceitável para o animal alvo, por exemplo, por ser feito inter alia estéril. Alguns exemplos de tais meios veículos são água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, fluido de cultura de bactéria, dextrose, glicerol, etanol e outros, assim como combinações destes. Eles podem fornecer uma forma de dosagem líquida, semi-sólida e sólida, dependendo do modo pretendido de administração. Como é habitualmente conhecido, a presença de um meio veículo não é essencial para a eficácia de uma vacina, mas pode simplificar significantemente a dosagem e administração do antígeno. Em seguida ao veículo e antígeno, a composição farmacêutica pode compreender outras substâncias tais como adjuvantes, estabilizantes, modificadoras de viscosidade ou outros componentes são adicionados dependendo do uso pretendido ou propriedades requeridas da composição.

[00015] Na composição farmacêutica da presente invenção, as bactérias vivas estão presentes, bactérias estas que são mutadas tal que um gene que codifica uma proteína envolvida na degradação do propionato de metilhexahidroindanodiona seja inativada. Como é habitualmente conhecido, o propionato de metilhexahidroindanodiona (também conhecido como HIP ou 3aa-H-4a(ácido 3’-propi0nico)-7αβ-metilhexahidro-l ,5-indanodiona) e propionato de 5-hidroximetilhexa-hidroindanona (também conhecido como HIL ou 3aa-H-4a(ácido 3’-propi0nico)-5α-hidr0xi-7αβ-metilhexahidro-l- indanona-O-lactona) são formados durante a degradação de colesterol pela Actinobacterium, incluindo os actinomicetos nocardioformes que sobrevivem ao macrófago. Recentemente, um operon (chamado ipdAB: degradação do proprionato de indanodiona Alfa + Beta) foi identificado em espécies bacterianas que pertencem à subordem de Corynebacterineae que codifica a subunidade α e β de uma transferase que está envolvida na degradação de HIP (ver pedido de Patente Internacional co-pendente PCT/EP2008/060844, depositado em 19 de agosto de 2008, com base em um pedido prioritário US depositado em 21 de agosto de 2007). O mutante silenciado em transferase conhecido não é mais capaz de degradar HIP e HIL (ver a figura 3 do pedido de patente aludido aqui acima) nem cresce em HIP, HIL ou 4-androsteno- 3,17-diona. Em qualquer caso, “envolvido na degradação de HIP” significa que um mutante silenciado não é mais capaz de crescer em HIP como uma única fonte de carbono e energia, ou pelo menos não capaz de crescer em HIP em um nível obtenível por uma bactéria não mutante. No presente não está claro se a transferase cataboliza a degradação do HIP por si só ou se uma reação é catalisada da qual a degradação de HIP depende. Ainda, a degradação de HIP ocorre em um estágio relativamente tarde no metabolismo de colesterol e é uma etapa muito específica no caminho da degradação do colesterol. Com base no conhecimento publicamente disponível a cerca de mutações no metabolismo de colesterol (referências de Prescott mencionadas aqui acima), esperar-se-ia que esta mutação levasse a uma bactéria viva que, embora fornecesse um efeito protetor, seria demasiadamente virulenta. Para a surpresa do requerente entretanto, um tal mutante parece ser adequadamente atenuado que é devido às capacidades de sobrevivência significantemente reduzidas do mutante dentro dos macrófagos. A razão do porque um gene que está envolvido na degradação de HIP desempenha um tal papel importante na sobrevivência dentro de macrófagos é incerta. Ele parece mesmo contradizer os resultados da técnica anterior que mostram que mesmo um bloqueio completo do metabolismo de colesterol tem um efeito atenuador fraco, aparentemente visto que não existe nenhum efeito sobre as capacidades de sobrevivência de macrófago dos actinomicetos nocardioformes. Portanto, foi muito surpreendente descobrir que a presente mutação, que afeta uma etapa menor ao longo do caminho do catabolismo do colesterol, severamente dificulta as capacidades de sobrevivência de actinomicetos nocardioformes patogênicos em macrófagos. Em particular, foi descoberto que as bactérias vivas mutantes são ainda capazes de entrar nos macrófagos e persistir neles (consequentemente assegurando o estímulo de uma resposta imune protetora), mas em um nível muito baixo, que parece reduzir significantemente a sua virulência, que por sua vez os tornam aceitáveis para o tratamento profilático.

[00016] Em uma forma de realização, genes múltiplos em um operon são inativados. Pela inativação de genes múltiplos as chances de uma mudança da bactéria para um fenótipo do tipo selvagem (parecido) diminuirá. Em particular, os genes ipdA e ipdB são inativados. Pela inativação destes genes, uma atenuação eficaz e segura pode ser fornecida. Em uma forma de realização preferida a inativação é realizada deletando-se pelo menos um gene pela mutação de gene não marcada. Uma vantagem da mutação não marcada é que ela possibilita a introdução repetitiva de mutações na mesma cepa. O DNA estranho (DNA vetorial) é removido no processo de introduzir a mutação. O DNA vetorial recém introduzido, para a introdução de uma segunda mutação, portanto não pode integrar no sítio da mutação anterior (pela recombinação homóloga entre DNA’s vetoriais). A integração definitivamente acontecerá se o DNA vetorial ainda estiver presente no cromossoma e dará origem a um grande número de integrantes falso- positivos. O sistema possibilita o uso de um único gene antibiótico para a introdução de um número infinito de mutações. A mutação não marcada também possibilita o uso fácil na indústria por causa da ausência de DNA heterogêneo possibilitando o descarte fácil do caldo de fermentação. A inativação do gene pela deleção do gene possibilita a construção de mutantes estáveis, que não revertem. Especialmente genes pequenos (<500 pares de base) são inativados mais facilmente pela deleção de gene comparada com o rompimento de gene por uma única integração de recombinação. A mutagênese de deleção de gene também pode ser aplicada para inativar um grupo de vários genes do genoma. A estratégia da mutagênese de deleção de gene pode ser aplicada também para a reposição de gene (por exemplo, mudar o tipo selvagem em gene mutante).

[00017] Em uma forma de realização as bactérias pertencem à família de Nocardiaceae ou Mycobacteriaceae. Preferivelmente, as bactérias pertencem aos gêneros Rhodococcus, Nocardia ou Mycobacterium e em particular pertencem a qualquer uma das espécies de Rhodococcus equi, Nocardia seriolae, Mycobacterium tubercolosis, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium bovis ou Mycobacterium avium paratubercolosis. Com respeito a essas espécies, vacinas adequadas não estão até agora comercialmente disponíveis. A presente invenção permite o fornecimento de composições farmacêuticas que podem ser usadas como vacinas para combater estas bactérias e portanto mitigam as doenças correspondentes que elas causam em um animal.

[00018] Em uma forma de realização a composição farmacêutica está em uma forma adequada para a administração oral. Além do fato de que é um modo muito conveniente de administração, a mesma tem em particular tornar- se claro que este modo de administração é seguro. A administração parenteral pode dar origem a abscessos. Preferivelmente as bactérias vivas estão presentes em uma concentração entre 1 x 104 e 1 x IO10 CFU por dose.

[00019] A presente invenção também diz respeito a bactérias de Rhodococcus equi derivadas de uma cepa como depositada com a Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes do Institut Pasteur em Paris França sob o n- CNCM 1-4108 ou n- CNCM 1-4109 e às bactérias que pertencem a esta cepa.

[00020] A presente invenção também diz respeito ao uso de bactérias vivas que pertencem ao grupo de actinomicetos nocardioformes tendo a capacidade para sobreviver dentro de macrófagos de um animal, as bactérias vivas sendo atenuadas pela inativação de um gene que codifica uma proteína envolvida na degradação do propionato de metilhexahidroindanodiona, para fabricar uma composição farmacêutica para proteger um animal contra um distúrbio que surge de uma infecção com uma bactéria do tipo selvagem correspondente.

[00021] A invenção também diz respeito a um método de tratar um animal para protegê-lo contra um distúrbio que surge de uma infecção com uma bactéria que pertence ao grupo de actinomicetos nocardioformes tendo a capacidade para sobreviver dentro de macrófagos de um animal, que compreende administrar ao animal uma composição farmacêutica que compreende bactérias vivas de uma espécie de actinomicetos nocardioformes, bactérias vivas estas que são atenuadas pela inativação de um gene que codifica uma proteína envolvida na degradação do propionato de metilhexahidroindanodiona.

[00022] A invenção será explicada ainda usando os seguintes exemplos que descrevem formas de realização específicas da presente invenção, formas de realização estas que são distribuídas em três partes: Parte A: Identificação e construção de cepas Parte B: Sobrevivência em macrófago como um modelo para a atenuação in vivo Parte C: Eficácia de bactérias mutantes na proteção contra infecção com o tipo selvagem

PARTE A: IDENTIFCAÇÃO E CONSTRUÇÃO DE CEPAS Al Meio de cultura e condições de crescimento

[00023] As cepas de R. equi foram cultivadas a 30°C (200 rpm) em meio de Luria-Bertani (LB) que consiste de Bacto-Triptona (BD), Extrato de Levedura (BD) e 1 % de NaCl (Merck) ou meio de acetato mineral. M. smegmatis mc2155 (Snapper et al., 1990, Mol Microbiol. 4: 1911-1919) foi cultivado a 37°C (200 rpm) em BBL caldo de tripticase de soja (TSB; BD) suplementado com 0,05 % de Tween80. O meio de acetato mineral (MM-Ac) conteve K2HPO4 (4,65 g/1), NaFEPCkHzO (1,5 g/1), Na-acetato (2 g/1), NH4CI (3 g/1), MgSCkVHzO (1 g/1), tiamina (40 mg/1, filtro estéril; Sigma), e solução de estoque de Vishniac (1 ml/1). A solução de estoque de Vishniac foi preparada como segue (modificada de Vishniac e Santer, 1957, Rev. 21: 195- 213): EDTA (10 g/1) e ZnSO4.7H2O (4,4 g/1) foram dissolvidos em água destilada (pH 8 usando 2 M de KOH). Depois, CaCl2.2H2O (1,47 g/1), MnCl2.7H2O (1 g/1), FeSO47H2O (1 g/1), (NH4)6 Mo7O244H2O (0,22 g/1), CUSO45H2O (0,315 g/1) e COCI26H2O (0,32 g/1) foram adicionados nesta ordem no pH 6 e finalmente armazenado a pH 4.

[00024] Para crescer em meio sólido Bacto-ágar (15 g/1; BD) foi adicionado. Solução de estoque de 5-fluorocitosina (Sigma-Aldrich) (10 mg/ml) foi preparada em água destilada, dissolvida aquecendo-se a 50°C, esterilizada em filtro e adicionada ao meio autoclavado.

[00025] A cepa INS436 de Nocardia seriola foi rotineiramente cultivada a 26°C (200 rpm) em Caldo de Eugon (BD) suplementado com Tween80 (0,05 %). Para o cultivo em meio sólido Bacto-ágar (15 g/1; BD) foi adicionado. Sacarose (2 %) foi adicionada ao meio de ágar para a seleção em sacarose dependente de sacB.

A2 Identificação de ipdA, ipdB e fadE30 na cepa 103+ de R. equi, e ipdAB em INS436 de N. seriolae

[00026] Como indicado aqui acima, os genes ipdA e ipdB de Rhodococcus são descobertos estar envolvidos na degradação de propionato de metilhexahidroindanodiona (HIP; 3aa-H-4a(ácido 3’- propi0nico)-7αβ-metilhexahidro-l,5-indanodiona) e propionato de 5- hidroximetilhexahidroindanona (HIL; 3aa-H-4a(ácido 3’-propiônico)-5a- hidr0xi-7αβ-metilhexahidro-l-indanona-5-lactona). As análises de bioinformática das sequências de proteína de IpdA e IpdB da cepa SQ1 de R. erythropolis em bases de dados de genoma revelaram que os genes que codificam IpdA e IpdB e a sua organização operônica aparente foram conservadas no genoma de R. equi 103+ (cepa do tipo selvagem obtida de J. F. Prescott, Ontário, Canadá; como aludido em Veterinary Microbiology 118 (2006) 240-246). A sequência de genoma da R. equi 103+ foi determinada pelo grupo de sequenciamento de R. equi no Sanger Institute, Hinxton, Cambridge, UK (genoma publicado como “R. equi 103S”). A análise de genoma além disso revelou que R. equi 103+ abriga genes de parálogos adicionais de ipdA e ipdB, designados ipdA2 e ipdB2, respectivamente. Estes genes estão localizados fora do grupo de gene catabólico do colesterol. As sequências de aminoácido de IpdA, IpdB, IpdA2 e IpdB2 são representadas nas SEQ ID’s anexas sob os N— 1, 2, 3 e 4 respectivamente. As identidades de sequência de aminoácido das proteínas de IpdA e IpdB de R. equi 103+ com estes parálogos e vários outros ortólogos actinobacterianos são listados na Tabela 6. Esta tabela dá uma visão geral de genes identificados em outros genomas de actinomicetos nocardioformes, que codificam ortólogos de IpdA e IpdB de Rhodococcus equi 103+. Em conexão com a presente invenção, estes e outros ortólogos são chamados de IpdA e IpdB. A identidade de proteína indica a identidade de sequência de aminoácido de tamanho natural percentual com IpdA e IpdB de R. equi 103S. As sequências genômicas actinobacterianas foram obtidas do servidor de BLAST genômico para genomas microbianos do National Center for Biotechnology Information (NCBI). Os dados de sequência de R. equi 103+ foram produzidos pelo Grupo de Sequenciamento de R. equi no Sanger Institute. O genoma da cepa 103+ (conhecido como 103S) foi usado para estes propósitos de identificação. Trabalho prático com Rhodococcus equi, como a seguir exemplificado, foi realizado com a cepa REI de R. equi (isolada de um potro que sofre de pneumonia granulomatosa causada pela infecção de Rhodococcus equi).

[00027] Um segundo gene envolvido na degradação de propionato de metilhexahidroindanodiona é fadE30. O mutante AfadE30 é severamente prejudicado no crescimento em HIL e HIP, não mostrando virtualmente nenhum crescimento depois de 24 horas de incubação. O gene fadE30 de Rhodococcus equi foi identificado por uma pesquisa de similaridade de sequência realizada no genoma de R. equi 103+ disponível no Sanger Institute (http://wv.Afv.santer.acuk). A sequência de proteína anotada de FadE30 da cepa RHA1 de Rhodococcus jostii (Ro4596, Número de Acesso no Genbank ABG96382) foi usada como um padrão de sequência de proteína (McLeod et al., 2006, em Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 103: 15582-15587; e Van der Geize et al., 2007, em Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104: 1947-1952). Uma pesquisa de similaridade de base de dados com Ro04596 revelou um gene de R. equi 103S, que codifica uma proteína que demonstrou 73 % de identidade de sequência de aminoácido com Ro04596. Esta proteína foi anotada como FadE30 de R. equi 103S (SEQ ID NO: 43) e o seu gene correspondente foi chamado de fadE30. Os genes ortólogos, que codificam FadE30 em outra Actinobacterium, puderam ser identificados em um modo similar. Uma seleção destes é listada na Tabela 8.

[00028] O local genômico ipdAB de N. seriola foi amplificado pela PCR em três partes, usando iniciadores de oligonucleotídeo desenvolvidos em sequências de nucleotídeo altamente conservadas do local de ipdAB Actinobacteriano. Estas regiões conservadas foram identificadas pelo alinhamento de sequência de nucleotídeo de várias sequências Actinobacterianas conhecidas dos genes ipdAB. A sequência genômica de nucleotídeo da região ipdAB de Nocardia farcinica (nfa05080 - nfa05090) (Número de Acesso DDBJ AP006618) foi usada como um padrão primário para desenvolver os iniciadores da PCR de oligonucleotídeo. As sequências de oligonucleotídeo iniciadoras usadas são listadas na Tabela 5. O DNA cromossômico de N. seriola INS436 foi usado como padrão para a PCR. Os genes de ipdAB de N seriola foram amplificados usando iniciadores ipdA- actino-F e ipdB-actino-R (PCR 22), a região a montante de ipdAB foi amplificada usando ipd-actino-F2 e ipdA-actino-R (PCR 23), e a região a jusante foi amplificada usando ipdB-actino-F e ipd-actino-R (PCR 21). Os produtos de PCR foram clonados no vetor de clonagem pGEM-T e as sequências de nucleotídeo dos insertos foram determinadas. Os pares de iniciador diferentes foram subsequentemente desenvolvidas na sequência de DNA obtida e usados para re-clonar e re-sequenciar o local ipd. Isto resultou em uma sequência de nucleotídeo completa do local ipdAB de N. seriola que abrange 4.139 pares de base. O fragmento de DNA sequenciado conteve os genes de ipdA e ipdB de N seriola e o seus genes vizinhos. As sequências de proteína deduzidas de IpdA e IpdB de N. seriola INS436 são mostradas na SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 59 respectivamente.

A3 Clonagem, PCR e isolação de DNA genômico

[00029] DH5α de Escherichia coli foi usada como hospedeiro para todos os procedimentos de clonagem. As enzimas de restrição foram obtidas da Fermentas GmbH. O DNA cromossômico de culturas de célula foi isolados usando o Kit de DNA Genômico bacteriano GenElute (Sigma-Aldrich) de acordo com as instruções do fabricante.

[00030] A PCR foi realizada em uma mistura de reação (25 pl) que consiste de Tris-HCl (10 mM, pH 8), lx tampão de polimerase padrão, dNTPs (0,2 mM), DMSO (2 %), iniciadores da PCR (10 ng/pl cada, Tabela 5) e enzima da DNA polimerase High-Fidelity (Fermentas) ou DNA polimerase Pwo (Roche Applied Science). Para a PCR de colônia, o material celular foi misturado com 100 pl de clorofórmio e 100 pl de Tris-HCl a 10 mM pH 8, turbilhonado vigorosamente e centrifugado (2 min, 14.000 x g). Uma amostra da fase aquosa superior (1 pl) foi subsequente usada como padrão para a PCR. Uma PCR padrão incluiu uma etapa de fusão de DNA de 5 min 95°C, seguida por 30 ciclos de 45 s de desnaturização a 95°C, 45 s de recozimento a 60°C e 1 a 3 min de alongamento a 72°C. O tempo de alongamento usado dependeu do comprimento do amplicon de PCR esperado, levando 1,5 min/1 kb como uma regra geral.

A4 Eletrotransformação de R. equi, M. smegmatis e N, seriolae

[00031] A células de cepas de R. equi foram transformadas pela eletroporação essencialmente como descrito (Van der Geize et al., no do documento da NAR aceito aludido aqui acima; Navas et al., 2001, J. Bacteriol. 183: 4796-4805). Em resumo, as culturas de célula foram cultivadas em 50 ml de LB a 30°C até que a ODÓOO atingiu 0,8 a 1,0. As células foram pelotizadas (20 min a 4.500 x g) e lavadas duas vezes com 10 % de glicerol gelado. As células pelotizadas foram recolocadas em suspensão em 0,5 a 1 ml de glicerol a 10 % gelado e dividido em alíquotas de 200 pl.

[00032] As células de M. smegmatis mc2155 foram transformadas pela eletroporação essencialmente como descrito (Jacobs et al., 1991, Methods Enzymol. 204: 537-555). Em resumo, as culturas de célula (250 ml) foram cultivadas a 37°C em meio TSB + 0,05 % de Tween80 até que ODooo atingisse 0,8, colocadas em gelo por uma hora e meia e centrifugadas (10 min a 5.000 x g) para pelotizar as células, as pelotas de célula foram lavadas duas vezes com água destilada e recolocadas em suspensão em um volume final de 1 ml de glicerol a 10 % e dividido em alíquotas de 200 pl.

[00033] DNA plasmídeo MilliQ-eluted (5 a 10 pl; GenElute Plasmid Miniprep Kit, Sigma-Aldrich) foi adicionado a 200 pl de células em cubetas abertas de 2 mm. A eletroporação foi realizada com um único pulso de 12,5 kV/cm, 10000 e 25 pF. As células eletroporadas foram suavemente misturadas com 1 ml de meio LB (R. equi) ou 1 ml de TSB + 0,05 % de Tween80 (M. smegmatis) e deixadas recuperar por 2 h (R. equi) ou 5 h (M. smegmatis) a 37°C e 200 rpm. As alíquotas (200 pl) das células recuperadas foram plaqueadas em meio de ágar seletivo. Os transformantes de R. equi foram selecionados em LB ágar contendo apramicina (50 pg/ml) e apareceram depois de 2 a 3 dias de incubação a 30°C. os transformantes de M. smegmatis foram selecionadas em TSB + 0,05 % Tween80 ágar contendo canamicina (10 pg/ml) e apareceram depois de 4 a 5 dias de incubação a 37°C.

[00034] Para N. seriolae, uma pré-cultura (20 ml) da cepa INS436 foi cultivada por 5 dias a 26°C (200 rpm) em caldo de Eugon + 0,05 % de Tween80 (ODÔOO nm = 6) e usadas para inocular 100 ml de caldo de Eugon fresco + 0,05 % de meio de Tween80 (1:100). A cultura primária foi cultivada durante a noite a 26°C por 20 horas na OD6oo nm =1,3.

[00035] As células foram pelotizadas (20 min, 4000g) a 4°C e lavadas duas vezes com 50 ml de glicerol a 10 % gelado. As células pelotizadas foram recolocadas em suspensão em 500 pl de glicerol a 10 %, dividido em alíquotas de 200 pl e imediatamente usadas para a eletrotransformação. O DNA plasmídico eluído em MilliQ (5 a 10 pl; Kit GenElute Plasmid Miniprep, Sigma-Aldrich) foi adicionado a 200 pl de células em nm cubeta aberta de 2 mm, misturado e deixado por 1 min em gelo. A eletroporação foi realizada com um pulso único de 1,75 kV/cm, 200 Ω e 50 pF (tempo de pulso aprox. 9,3 ms). As células eletroporadas foram suavemente misturadas com 1 ml de meio de caldo de Eugon suplementado com 0,05 % de Tween80 e deixado recuperar por 3,5 h a 26°C e 220 rpm. As alíquotas de 50 e 100 pl das células recuperadas foram plaqueadas em ágar Eugon seletivo suplementado com 0,05 % de Tween80 e canamicina (20 pg/ml). Os transformantes apareceram depois de 7 dias de incubação a 26°C.

A5 Deleção de gene não marcado em cepas de R. equi usando seleção de 5-fluorocitosina (5-FC)

[00036] Os mutantes de deleção de gene não marcado de R. equi foram fabricados essencialmente como descrito (Van der Geize et al., 2008). Transformantes de R. equi obtidos da eletroporação de células do tipo selvagem ou mutantes foram riscadas em meio LB ágar suplementado com apramicina para confirmar a resistência à apramicina (ApraR). Quatro transformantes ApraR por transformação foram cultivados durante a noite (20 a 24 h) a 30°C e 200 rpm em 25 ml de meio LB, e plaqueados em diluições de lOMO3 vezes em meio MM-Ac em placas de MM-Ac ágar suplementadas com 5-FC (100 pg/ml) em alíquotas de 100 pl. As colônias resistentes em 5- FC, que aparecem depois de 3 dias de incubação a 30°C, foram riscadas em réplica sobre LB ágar e LB ágar suplementado com apramicina (50 pg/ml) para selecionar quanto as colônias sensíveis à apramicina (Apras) e resistentes a 5-FC (5-FCR). As colônias Apras/5-FCR foram checadas quanto a presença da deleção de gene desejada pela PCR de colônia usando iniciadores que amplificam o local da deleção do gene (Tabela 5). O DNA genômico foi isolado de mutantes de deleção de gene potencial e usado para confirmar a deleção de gene usando iniciadores que amplificam o local de gene ipdAB ou ipdAB2, assim como as regiões a montante e a jusante destes locais com iniciadores como descrito na Tabela 5.

A6 Construção de plasmídeos para a deleção dos genes ipdAB e ipdAB2 em R. equi

[00037] O plasmídeo pSelAct-ipdl, para a geração de uma deleção de gene não marcada do operon ipdAB em R. equi REI, foi construído como segue. As regiões flanqueadoras a montante (1.368 pares de base; iniciadores ipdABequiUP-F e ipdABequiUP-R) e a jusante (1.396 pares de base; iniciadores ipdABequiDOWN-F e ipdABequiDOWN-R) dos genes ipdAB foram amplificadas pela PCR (Tabela 5, PCR1 e PCR2). Os amplicons obtidos foram ligados no pBluescript(II)KS digerido no EcoRN, restituindo os plasmídeos pEquil4 e pEquiló para as regiões a montante e a jusante, respectivamente. Um fragmento de 1,4 kb SpeUEcoRV de pEquil4 foi ligado no pEquiló digerido com SpeUEcoRV, gerando pEquil8. Um fragmento de EcoRI/HindlR de 2,9 kb de pEquil8, que abriga a deleção do gene ipdAB e suas regiões flanqueadoras, foi tratado com fragmento de Klenow e ligado no vetor suicida pSelAct digerido com Smal (Van der Geize et al., 2008). O plasmídeo resultante foi designado pSelAct-ipdl para a construção do mutante de deleção do gene ipdAB, AipdAB de R. equi (também aludido como RG1341). Este mutante foi depositado na Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes do Institut Pasteur em Paris França sob o nr. CNCM 1-4108.

[00038] O mutante de deleção de gene duplo ΔipdABΔipdAB'l de R. equi (também aludido como RG2837) foi fabricado pela deleção de gene não marcado do operon ipdAB2 na cepa mutante ΔipdAB de R. equi usando o plasmídeo pSelAct-zhpdAB2. O plasmídeo pSelAct-JzpdAB2 foi construído como segue. As regiões a montante (1.444 pares de base; iniciadores ipdAB2equiUP-F e ipdAB2equiUP-R) e a jusante (1.387 pares de base; ipdAB2equiDOWN-F, ipdAB2equiDOWN-R) de ipdAB2 foram amplificadas pela PCR usando DNA genômico como padrão (Tabela 5, PCR6 e PCR7). Os amplicons foram ligados em pSelAct digerido com Smal, resultando nos plasmídeos pSelAct-ipdAB2equiUP e pSelAct-ipdAB2equiDOWN, respectivamente. A digestão a seguir com BgllUSpel de ambos os plasmídeos, um fragmento de 1.381 pares de base de pSelAct-ipdAB2equiDOWN foi ligado em pSelAct-ipdAB2equiUP, resultando em pSelAct-Zlz/xM/?2 usado para a construção de uma deleção de gene ΔipdABl. O mutante resultante ΔipdABΔipdABI de R. equi foi depositado na Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes do Institut Pasteur em Paris França sob nr. CNCM 1-4109

A7 Construção de plasmídeo para a deleção de gene ipdAB em M. smegmatis mc2155

[00039] O plasmídeo pK18-ipdABsmeg, usado para a deleção de gene não marcado dos genes ipdAB em M. smegmatis me2155 foi construído como segue.

[00040] As regiões flanqueadoras a montante (1.502 pares de base; iniciadores ipdABsmegUP-F e ipdABsmegUP-R) e a jusante (1.431 pares de base; iniciadores ipdABsmegDOWN-F e ipdABsmegDOWN-R) dos genes ipdAB foram amplificadas pela PCR usando DNA genômico de M. smegmatis mc2155 como padrão (Tabela 5, PCR12 e PCR13). Os amplicons obtidos foram ligados em pK18mobsacB digerido com Smal (Schafer et al., 1994, Gene 145: 69-73), resultando em pK18-ipdABsmegUP e pK18- ipdABsmegDOWN, respectivamente. Um fragmento de DNA de 1,5 kb obtido de pK18-ipdABsmegUP digerido com BamΔAUSpel foi subsequentemente ligado em pK18-ipdABsmegUP linearizado com BamAWJSpel, resultando na construção de pK18-ipdABsmeg usado para a deleção de gene de ipdAB.

A8 Construção de plasmídeo para a deleção de gene de fadE30 eml?, equi

[00041] O plasmídeo pSelAct-fadE30 para a geração de uma deleção de gene não marcado de fadE30 em RE1 de R. equi foi construída como segue. As regiões genômicas flanqueadoras a montante (1.511 pares de base; iniciadores fadE30equiUP-F e fadE30equiUP-R) e a jusante (1.449 pares de base; iniciadores fadE30equiDOWN-F e fadE30equiDOWN-R) de fadE30 foram amplificadas por uma PCR padrão usando High Fidelity DNA polimerase (Fermentas GmbH) (Tabela 5; PCR 15 e PCR 16). Os amplicons obtidos foram ligados no vetor de clonagem pGEM-T (Promega Benelux), restituindo pGEMT-fadE3OUP e pGEMTfadE3ODOWN. Um fragmento de DNA Bcul/Bglll de 1,4 kb foi cortado de pGEMT-fadE3ODOWN e ligado em pGEMT-fadE3OUP linearizado com Bcul/Bglll, resultando no pGEMT- fadE30. Para construir pSelAct-fadE30, pGEMT-fadE30 foi digerido com Ncol e Bcul e tratado com fragmento de Klenow. Um fragmento de DNA de extremidade abrupta de 2,9 kb, que carrega a deleção do gene fadE30, foi ligado no pSelAct digerido com Smal (van der Geize et al., 2008). O plasmídeo resultante foi designado pSelAct-fadE30 e usado para a construção da cepa mutante ΔfadE30 de R. equi.

A9 Construção de plasmídeo para a deleção do gene ipdAB em N. seriola INS436

[00042] Plasmídeo pK18ipdABNser, usado para a deleção de gene não marcado dos genes ipdAB em N. seriola INS436 foi construído como segue. As regiões flanqueadoras a montante (1.487 pares de base; iniciadores ipdABNserUP-F e ipdABNserUP-R; PCR 24) e a jusante (1.049 pares de base; iniciadores ipdABNserDOWN-F e ipdABNserDOWN-R; PCR 25) dos genes ipdAB foram amplificadas pela PCR usando DNA genômico de N. seriola INS436 como DNA padrão (Tabela 5). Os amplicons obtidos foram ligados em pK18mobsacB digerido com Smal (Schafer et al., 1994, em Gene 145: 69-73)), resultando em pK18-ipdABNserUP e pK18-ipdABNserDOWN, respectivamente. Um fragmento de DNA de 1,07 kb obtido de SmalIPstI digerido com pK18-ipdABNserDOWN foi subsequentemente ligado em pK18-ipdABNserUP que foi linearizado com Smal/PstI, resultando na construção de plasmídeo pK18-ipdABNser que foi usado para a deleção do gene ipdAB.

AIO Construção de cepas mutantes de R. equi AipdAB e R. equi AipdABAipdAB2

[00043] Os mutantes de deleção de gene não marcado de R. equi de ipdAB (RG1341) e ipdABipdAB2 (RG2837) foram construídos usando uma estratégia de recombinação de duas etapas homólogas com contra-seleção em 5-fluorocitosina desenvolvida para R. equi (Van der Geize et al., 2008). Para a construção da cepa RG1341 de R. equi mutante em AipdAB, o plasmídeo não replicativo pSelAct-ipdl foi mobilizado para a cepa REI de R. equi pela eletrotransformação. Quatro transformantes de ApraR, que resulta da recombinação homóloga entre plasmídeo pSelAct-ipdl e o genoma de REI, foram subsequentemente submetidas à seleção de 5-FC de modo a selecionar quanto a ocorrência do segundo evento de recombinação homóloga raro que resulta na deleção de gene. Dezoito colônias de Apras/5FCR aleatoriamente escolhidas foram submetidas à PCR de colônia e três colônias FCR/Apras deram um amplicon do tamanho esperado (296 pares de base, Tabela 5, PCR5). O DNA genômico foi isolado destes três mutantes de AipdAB e submetidas à análise de PCR do local ipdAB e suas regiões flanqueadoras a montante e a jusante (Tabela 5, PCR3 e PCR4). Esta análise confirmou a presença de uma deleção de gene de ipdAB genuína em dois dos três casos e não revelou nenhum rearranjo genômico aberrante no local ipdAB. A presença de vapA como um marcador do plasmídeo de virulência foi confirmado pela PCR (Tabela 5, PCR11). Uma cepa mutante de ipdAB foi escolhida, designada R. equi RG1341, e foi usada para outro trabalho.

[00044] A cepa mutante de deleção de gene duplo RG2837 foi construída a partir da cepa RG1341 usando o plasmídeo pS&Act-A ipdAB2 essencialmente como descrito para a isolação do mutante único AipdAB. Quatro transformantes de ApraR, obtidos da eletroporação de células da cepa RG1341 com pSelAct-JzpdAB2, foram submetidas à seleção 5-FC para selecionar quanto às colônias Apras/5-FOR. A análise de PCR subsequente de dezoito colônias Apras/5-FCR confirmou que duas colônias abrigaram uma deleção de gene AlpdAB2, como evidente a partir do amplicon de 123 pares de base obtido usando oligonucleotídeo desenvolvido para amplificar o operon ipdAB2 (Tabela 5, PCR10). Outra análise das regiões a montante e jusante do local ipdAB2 pela PCR confirmou a presença de uma deleção de gene ipdAB2 e não revelou nenhum arranjo genômico (Tabela 5, PCR8 e PCR9). Também, a presença do gene de virulência vapA foi confirmado pela PCR (Tabela 5, PCR11). Uma cepa RG2837 mutante de deleção dupla ΔipdABΔipdABl foi escolhida para outro trabalho.

All Construção de cepa mutante deM. smegmatis MOAB

[00045] Um mutante de deleção de gene ipdAB não marcado de M. smegmatis mc2155 foi construído usando o sistema de contra seleção sacB (Pelicic et al., 1996, Mol. Microbiol. 20: 919-925; Van der Geize et al., 2001, FEMS Microbiol Lett. 205: 197-202) como segue. Para a construção do mutante LipdAB de M. smegmatis cepa mc2155, o plasmídeo não replicativo pK18-ipdABsmeg foi mobilizado ao M. smegmatis pela eletrotransformação. Vários transformantes foram obtidos. Um transformante resistente à canamicina foi cultivado por 2 dias a 37°C de modo não seletivo em meio TSB contendo 0,05 % de Tween80 e subsequentemente plaqueado em placas de TSB ágar contendo 2 % de sacarose para selecionar quanto aos recombinantes duplos sensíveis à canamicina (Kníj e resistentes à sacarose (SucR) pela contra seleção de sacB. As colônias que aparecem depois de 3 dias de incubação foram riscados em réplica sobre TSB ágar e TSB ágar suplementado com canamicina (10 pg/ml) para selecionar quanto às colônias Kms/SucR. Colônias Kms/SucR genuínas foram checadas ainda pela PCR de colônia quanto a presença da deleção do gene ipdAB (Tabela 5, PCR14). O DNA genômico foi isolado de três mutantes ipdAB potenciais. A análise de PCR confirmou a presença da deleção do gene ipdAB, e uma cepa mutante em ipdAB foi escolhida para outro trabalho e designada LipdAB de M. smegmatis.

A12 Construção de cepa mutante AfadE30 de R. equi

[00046] Uma deleção de gene não marcado te fadE30 em R. equi REI foi gerada usando uma estratégia de recombinação homóloga de duas etapas com contra-seleção de 5-fluorocitosina desenvolvida para R. equi (Van der Geize et al., 2008). Para a construção da cepa mutante AtadE30, o plasmídeo não replicativo pSelAct-fadE30 foi mobilizado para a cepa R. equi REI pela eletrotransformação. Dois transformantes ApraR, que resulta da recombinação homóloga entre plasmídeo pSelAct-fadE30 e o genoma REI, foram subsequentemente submetidos à seleção de 5-FC de modo a selecionar quanto a ocorrência do segundo evento de recombinação homóloga raro que resulta na deleção do gene fadE30. Dezoito colônias Apras/5FCR aleatoriamente escolhidas foram submetidas à PCR de colônia usando iniciadores fadE30cont-F e fadE30cont-R (Tabela 5; PCR 19) e treze colônias FCR/ApraS deram um amplicon do tamanho esperado (428 pares de base). O DNA genômico foi isolado de dois mutantes de AtadE30 potencial e submetido à análise de PCR. A análise de PCR do local fadE30, usando iniciadores de oligonucleotídeo fadE30contr-F e fadE30contr-R (Tabela 5), confirmou a presença de uma deleção do gene fadE30 e a ausência do gene fadE30 do tipo selvagem. A análise das regiões flanqueadoras a montante e a jusante pela PCR resultou nos produtos de 1,86 kb e 1,76 kb esperados, respectivamente. A análise confirmou a presença de uma deleção do gene fadE30 genuína em ambos os casos e não revelou nenhum rearranjo genômico aberrante no local fadE30. A presença de vapA como um marcador para o plasmídeo de virulência foi confirmado pela PCR. Um mutante da cepa fadE30 foi designado AfadE30 de R. equi e foi usado para outro trabalho.

Al3 Construção da cepa mutante AipdAB de N. seriola

[00047] Um mutante de deleção de gene ipdAB não marcado de N. seriola INS436 foi construído usando o sistema de contra seleção de sacB (Pelicic et al., 1996, em Mol. Microbiol. 20: 919-925; Van der Geize et al., 2001, em FEMS Microbiol Lett. 205: 197-202) como segue. O plasmídeo não replicativo pK18-ipdABNser foi mobilizado para INS436 de N. seriola pela eletrotransformação. Vários transformantes resistentes à canamicina foram depois cultivados não seletivamente por 7 dias a 26°C em meio de caldo de Eugon contendo 0,05 % de Tween80. A seleção quanto a recombinantes duplos sensível à canamicina (Kms) e resistente à sacarose (SucR) pela contra seleção de sacB foi subsequentemente realizada plaqueando-se sobre placas de Eugon ágar contendo 2 % de sacarose. As colônias que aparecem depois de 7 dias de incubação a 26°C foram escolhidas em réplica sobre placas de Eugon ágar e placas de Eugon ágar suplementadas com canamicina (20 pg/ml), para selecionar quanto às colônias de Kms/SucR. As colônias Km7SucR genuínas foram checadas ainda pela PCR de colônia quanto a presença da deleção de gene de ipdAB usando iniciadores ipdABNser-F e ipdABNser-R (Tabela 5). O DNA genômico foi isolado de três mutantes de ipdAB potenciais. A análise de PCR usando par de iniciadores ipdABNser-F e ipdABNser-R (PCR 23) resultou em um produto de PCR de 222 pares de base e a ausência de um produto de PCR de 1.634 pares de base do tipo selvagem confirmando a presença da deleção do gene ipdAB. O par de iniciadores IpdABNser-F2 e IpdABNserDOWN-Contr-R (PCR 26) foi usado para confirmar ainda mais a deleção do gene ipdAB. Este par de iniciadores resultou em um produto de PCR esperado de 1.148 pares de base para o mutante ipdAB, ao passo que um produto de PCR de 2.560 pares de base foi obtido apenas para a cepa do tipo selvagem. Uma cepa mutante foi designada AipdAB de N. seriola e escolhida para outro trabalho.

[00048] PARTE B: SOBREVIVÊNCIA EM MACRÓFAGO COMO UM MODELO PARA A ATENUAÇÃO IN VIVO

B1 Cepas usadas Cepas virulentas

[00049] Cepa REI: cepa precursora do tipo selvagem. Esta cepa cresce sobre colesterol.

[00050] Cepa RElAsupAB: deleção do gene supAB. Esta cepa é incapaz de crescer em colesterol.

Cepa não virulenta

[00051] Cepa 103-: carece do plasmídeo de virulência de 80 a 90 kb e é conhecido ser apatogênicos em cavalos (Takai et al. 2000, Infect. Immun. 68: 6840-6847). Esta cepa cresce em colesterol.

Cepas de acordo com a invenção

[00052] Cepa REAΔipdAB (RG1341): o gene ipdAB no grupo do catabólico do colesterol é deletado. Esta cepa não cresce em 4-androsteno- 3,17-diona (AD).

[00053] Cepa RElJz/%ZÁB-AD+: bactérias da cepa REAΔipdAB adaptadas para crescer no AD (se a cepa REiΔipdAB é plaqueada em alta concentração (mais do que 106 CFU/ml) com AD como a única fonte de carbono, depois umas poucas colônias podem surgir que crescem em AD).

[00054] Cepa RElAipdABipdAB2 (RG2837): segundo conjunto de genes ipdAB (não parte do grupo catabólico do colesterol) também é deletado. Esta cepa não cresce em AD.

[00055] Cepa AfadE30 de R. equi. Esta cepa é severamente prejudicada quanto ao crescimento em HIP/HIL e AD.

B2 Culturas de Rhodococcus equi para a infecção de macrófago

[00056] As cepas de Rhodococcus equi diferentes a serem testadas no ensaio de sobrevivência em macrófago foram cultivadas durante a noite (17 h) a 37°C e 100 rpm em Caldo Nutriente (Difco) visando em uma concentração final de 1 a 2 x 108 CFU/ml. Apenas culturas recém preparadas foram usadas. Depois da inoculação dos macrófagos, uma determinação de contagem viva foi feita (contagem de placa) de modo a confirmar o título de infectividade.

B3 Culturas de Rhodococcus para a inoculação em potro

[00057] As cepas REI, REldipdAB e REUzpJAB-AD+ de Rhodococcus equi foram plaqueados em sangue ágar e incubadas por 24 horas a 37°C. As bactérias foram colhidas com 4 ml de PBS isotônico estéril por placa. A suspensão bacteriana foi diluída com PBS isotônico estéril visando em uma concentração final de 4 x 104 CFU/ml. O transporte foi na temperatura ambiente; as culturas diluídas foram usadas dentro de 4 horas depois da preparação. Depois da inoculação, uma determinação de contagem viva foi feita (contagem de placa) de modo a confirmar o título de infectividade. As contagens vivas foram de 4,35 x 104 CFU/ml para REI, 7,1 x 104 CFU/ml para REAΔipdAB e 5,8 x 104 CFU/ml para RElJzpdAB-AD+, respectivamente.

B4 Sistemas de Teste Linhagem de célula de macrófago

[00058] A linhagem de célula U937 (monócito humano) foi usado para testar quanto a sobrevivência de cepas de Rhodococcus equi. Os monócitos foram cultivados em RPMI 1640 + NaHCOs + NAPYR + meio de glicose (meio RPMI 1640), tamponado com 10 rnM de HEPES e suplementadas com 200 IU/ml penicilina e estreptomicina e 10 % de soro bovino fetal (FBS). As células foram cultivadas em suspensão a 37°C e 5 % de CO2.

Crias de animais equinos

[00059] Oito crias de animais equinos foram usadas: sete crias de animais equinos de 3 a 5 semanas de idade e uma de 7 semanas de idade (todas com a égua). As crias de animais equinos foram distribuídos em três grupos de 3, 3 e 2 crias de animais equinos, estimando uma distribuição uniforme de idade nos grupos. O alojamento foi em instalações de isolamento. Durante o experimento as crias de animais equinos mamaram e as éguas foram alimentadas de acordo com os procedimentos padrão. Agua de torneira fresca foi disponível ad libidum

[00060] Em T = 0 todas as crias de animais equinos foram inoculadas intratraquealmente com 100 ml de cultura de inoculação da cepa REI, REIAipdAB ou RElAipdAB-AD+ (ver aqui acima sob “Culturas de Rhodococcus para inoculação de potro”) usando uma seringa com agulha, chamada de injeção transtraqueal.

B5 Procedimentos e parâmetros experimentais Teste de sobrevivência em macrófago

[00061] Para o ensaio de sobrevivência em macrófago, os monócitos foram cultivados por vários dias como aqui descrito antes. O meio de cultura foi substituído com meio de cultura fresco e as células foram ativadas durante a noite com 60 ng/ml de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) para induzir a sua diferenciação para macrófagos.

[00062] As células diferenciadas foram giradas (5 min. a 200xg) e a pelota foi recolocada em suspensão em meio RPMI 1640 fresco, isento de antibiótico com 10 % de FBS. Para cada cepa a ser testada, um tubo contendo 10 ml de uma suspensão de célula com aproximadamente 106 células/ml foram inoculados com Rhodococcus equi em uma multiplicidade de infecção (MOÍ) de aproximadamente 10 bactérias por macrófago.

[00063] As bactérias foram incubadas com os macrófagos por 1 hora a 37°C e 5 % de CO2. O meio foi substituído com 10 ml de meio RPMI 1640 suplementado com 10 % de FBS e 100 pg/ml de gentamicina e incubados mais uma vez por 1 hora para matar quaisquer bactérias extracelulares. Os macrófagos (com R. equi internalizado) foram girados (5 min. a 200xg) e a pelota foi recolocada em suspensão em 40 ml de meio RPMI 1640, tamponado com 10 mM de HEPES e suplementadas com 10% de FB Se 10 pg/ml de gentamicina. Esta suspensão foi dividida em 4 frascos de cultura (10 ml cada) e incubada a 37°C e 5 % de CO2. Depois de 4, 28, 52 e 76 horas os macrófagos (um frasco de cultura por cepa) foram girados (5 min. a 200xg) e a pelota lavada duas vezes em 1 ml de meio RPMI 1640 isento de antibiótico. Finalmente a pelota foi lisada com 1 % de Triton X-100 em 0,01 M de solução salina tamponada com fosfato (PBS), seguido pela determinação da contagem viva (contagem de placa). Inoculação em Potro 1 - Temperatura retal: medida 1 dia antes da inoculação, dia da inoculação (exatamente antes da inoculação) e depois uma vez ao dia depois da inoculação até a necropsia. 2 - Exame Clínico: durante 3 semanas após a inoculação os cavalos foram diariamente examinados quanto aos sinais clínicos. 3 - Exame após a morte e bacteriologia: no dia 21 após a inoculação as crias de animais equinos foram pesadas e depois mortas por anestesia com xilazina (100 mg/100 kg) e cetamina (500 mg/100 kg) e subsequente sangria até a morte. Os pulmões foram pesados de modo a calcular a razão em peso de pulmão para corpo. Um exame após a morte completo foi realizado com atenção especial para os pulmões e linfonodos associados. No caso de anormalidades, as amostras para histologia foram tiradas como julgado necessário pelo patologista.

[00064] As amostras de tecido (1 cm3) foram excisadas de sete locais padrão representativos dos lóbulos de cada metade dos pulmões (3 locais por metade + lóbulo adicional); o tecido doente foi preferencialmente selecionado para cada local, se o mesmo foi presente. As amostras de exemplo (as duas amostras do lóbulo equivalente em cada metade) foram reunidos para dar 3 amostras por potro + uma amostra do lóbulo adicional. Cada amostras (reunida) foi homogeneizada, diluída em série e inoculada em placas de sangue ágar e depois incubadas a 37°C por 16 a 24 horas. As colônias de Rhodococcus foram enumeradas e expressadas como CFU/ml de homogenado. Hastes com algodão na ponta adicionais foram tiradas de todas as outras anormalidades. As hastes com algodão na ponta foram riscadas em placas de sangue ágar e depois incubadas a 37°C por 16 a 24 horas. Rhodococcus equi foi inicialmente identificado pela sua morfologia de colônia mucóide não hemolítica típica. Identificação adicional foi feita pela cepa Gram, API/ Phoenix, e/ou PCR.

B6 Resultados Sobrevivência em macrófagos

[00065] Os resultados de dois experimentos separados são mostrados na Tabela 1 (em conjunção com a figura 1) e 2 (em conjunção com a figura 2). Os resultados mostram que o mutante RElAsupAB é capaz de sobreviver em macrófagos em uma maneira similar como a cepa REI precursora do tipo selvagem, indicando que o metabolismo de colesterol não é essencial para a sobrevivência em macrófago. Isto está em linha com o reconhecimento de que o metabolismo de colesterol como tal não é importante para a virulência. Ao contrário, a sobrevivência em macrófagos da cepa RElAipdAB, cepa RElAipdABlpdAB2, cepa RElAipdAB-AD+ e cepa 103-, foi claramente reduzido. Note entretanto que as bactérias são ainda capaz de sobreviver nos macrófagos mas em um nível significantemente reduzido (tipicamente em uma concentração de 100 a 1000 vezes abaixo do nível do tipo selvagem). A cepa 103- carece do plasmídeo de virulência de 80 a 90 kb e é conhecido ser avirulento em cavalos (Takai et al.). Esta cepa 103- não é adequada como uma cepa de vacina visto que ela não induz uma resposta imune protetora, provavelmente porque ela carece do plasmídeo de virulência. Na Tabela 9 (em conjunção com a Figura 4) os resultados são mostrados para a cepa mutante ΔfadE30 de R. equi em comparação com a cepa do tipo selvagem de RE1 e cepa ΔipdAB de REI. Claramente o mutante fadE30 tern uma característica de sobrevivência comparável com a cepa ΔipdAB, e é também menos capaz de sobreviver nos macrófagos.

[00066] Os resultados com cepas que têm uma mutação no operon que codifica uma proteína envolvida na atividade de degradação de propionato de metilhexahidroindanodiona (i.e., cepas RElΔipdAB, RElΔipdABipdAB2, RElΔipdAB-AD+ e ΔfadE30 de R. equi) mostram que estas cepas são menos capazes de sobreviver em macrófagos, em particular, as suas capacidades de sobrevivência são comparáveis às capacidades de sobrevivência da cepa apatogênica 103-. Isto já é uma boa indicação de atenuação adequada. A cepa RElΔipdAB-AD+ demonstrou o mesmo fenótipo de macrófago como a cepa REI ΔipdAB indicando que a mesma é um operon de ipdAB intacto ao invés de um metabolismo de colesterol intacto que é essencial para a sobrevivência em macrófago ao nível do tipo selvagem. As deleções de gene ipdAB único (no grupo de gene catabólico de colesterol) resultou em uma sobrevivência dificultada em macrófago. Uma deleção adicional em um cópia destes genes (ipdA e ipdB fora do grupo catabólico do colesterol, chamado de ipdA2 e ipdB2) não teve nenhum efeito atenuador adicional no teste de macrófago.

[00067] Dados estes resultados, as cepas RElΔipdAB e RElΔipdAB- AD+ (= cepa RElΔipdAB adaptada para crescimento em AD) foram administradas intratraquealmente às crias de animais equinos (procedimento de inoculação normal) e comparadas com a cepa precursora do tipo selvagem REI para testar quanto a atenuação in vivo.

Temperatura retal

[00068] Na Tabela 3 (em conjunção com a figura 3) os resultados da temperatura retal são apresentados. O Grupo 1 é o Grupo que recebeu a cepa do tipo selvagem de REI. Os Grupos 2 e 3 receberam a RElΔipdAB e RElΔipdAB-AD+ respectivamente. As temperaturas dos dias 3 a 10 não são mostradas visto que elas não revelam nenhuma mudança significante da temperatura retal normal. As temperaturas anormais são indicadas em negrito. Duas das três crias de animais equinos (n- 18 e 19) inoculadas com a cepa precursora do tipo selvagem de REI apresentaram claramente temperaturas retais aumentadas a partir de 14 dias após a inoculação em diante. O aumento na temperatura retal depois de 14 dias coincidiu com o desenvolvimento de sinais clínicos (ver abaixo). O potro n- 21 (inoculado com a cepa RElΔipdAB) apresentou uma temperatura levemente aumentada (39,1 °C) no dia 1 após a inoculação que mais provavelmente não está relacionada com a infecção pelo Rhodococcus (o tempo de incubação neste modelo de inoculação normalmente é > 7 dias). Além disso, nenhuma temperatura aumentada foi observada nas crias de animais equinos inoculadas com RElΔipdAB ou RElΔlpdAB-AD+.

Sinais clínicos após a inoculação

[00069] As contagens clínicas do dia 7 ao 21 de fato mostraram que os potros n- 18 e 19, inoculados com a cepa precursora do tipo selvagem de REI desenvolveram sinais de doença respiratória a partir de 13 dias após a inoculação em diante. O potro n- 17 (também do grupo da inoculação de REI) apresentou apenas sinais clínicos brandos após a inoculação. As crias de animais equinos que foram inoculadas com a cepa mutante RElΔipdAB e RElΔipdAB-AD+ não apresentaram nenhum sinal claro de doença respiratória. Os efeitos clínicos dos últimos dois grupos foram principalmente com base em um batimento cardíaco levemente aumentado, que também (em parte) poderia ser devido ao estresse pelo manuseio, visto que o mesmo estava presente também antes da inoculação.

Exame após a morte

[00070] As descobertas após a morte com respeito aos pulmões são mostradas na Tabela 4. Depois da inoculação com a cepa precursora do tipo selvagem de REI as crias de animais equinos desenvolveram sinais de doença respiratória (em particular o potro n- 18 e 19). As crias de animais equinos inoculados com cepas mutantes permaneceram saudáveis. Em 21 dias após a inoculação as crias de animais equinos foram mortas e necropsiadas. No exame após a morte todas as crias de animais equinos inoculados com a cepa do tipo selvagem pareceram ter pneumonia piogranulomatosa típica a partir das quais R. equi foi re-isolado como uma cultura pura e a identidade da cepa do tipo selvagem foi confirmada pela PCR. Do potro n2 18 R. equi do tipo selvagem também foi isolado de um linfonodo mediastinal ampliado.

[00071] Os pulmões das crias de animais equinos inoculados com as cepas mutantes não apresentaram áreas pneumônicas e Rhodococcus não foi isolado, exceto de um linfonodo brônquico levemente ampliado do potro n2 20, e de tecido pulmonar saudável do potro n2 24. A identidade destes isolados foi confirmada como RElAipdAB e RElAipdAB-AD+ pela PCR e crescimento em AD ágar, respectivamente.

B7 Conclusão para a PARTE B dos experimentos

[00072] As cepas RElAipdAB e RElAipdAB-AD+ são claramente prejudicadas na sobrevivência em macrófago e são atenuadas em crias de animais equinos. O silenciamento da segunda cópia do gene ipdAB (que resulta na RElAipdABipdAB2) não parece ter um efeito adicional no teste de sobrevivência em macrófago e provavelmente também não em crias de animais equinos. Os resultados combinados in vivo e in vitro com cepas REI, RElsupAB, 103-, RElAipdAB e RElAipdAB-AD+ indicam uma boa correlação entre o nível de sobrevivência em macrófago e a virulência in vivo para uma bactéria pertencente aos actinomicetos nocardioformes. Em particular, parece que quando uma cepa mutante tem as capacidades de sobrevivência significantemente reduzida em macrófago, tipicamente cerca de 2 a 3 logs com respeito à cepa precursora virulenta, então a cepa mutante é significantemente atenuada com respeito à cepa precursora.

[00073] Com base no fato habitualmente conhecido de que o caminho dos fatores de infecção e virulência é compartilhada entre Actinomicetos nocardioformes - consequentemente o fato de que Rhodococcus equi é habitualmente usado como um modelo para estudar Mycobacteriaceae, em particular com respeito aos fatores de virulência relacionados com a sobrevivência e persistência em macrófago (ver inter alia PNAS, 6 de fevereiro de 2007, vol. 104, n- 6, pp 1947-1952) - é entendido que a taxa de sobrevivência reduzida para as bactérias pela inativação de um gene que codifica uma proteína envolvida na degradação do propionato de metilhexahidroindanodiona, é genérica para a atenuação de actinomicetos nocardioformes.

PARTE C: EFICÁCIA DA BACTÉRIA MUTANTE NA PROTEÇÃO CONTRA INFECÇÃO COM O TIPO SELVAGEM Cl Introdução

[00074] Acredita-se que a eficácia com respeito a uma composição farmacêutica contendo bactérias mutantes vivas de acordo com a presente invenção seja inerente. Isto pode ser entendido pelo reconhecimento de que o conhecimento publicamente disponível a cerca das mutações no metabolismo de colesterol claramente indica que as bactérias tendo mutações no metabolismo de colesterol ainda têm uma carga antigênica comparável com aquela de organismos do tipo selvagem. Em combinação com o conhecimento corrente, feito disponível pela presente invenção, de que as bactérias mutantes vivas são ainda capazes de entrar nos macrófagos e persistir dentro deles, não deixa dúvidas de que o estímulo de uma resposta imune é garantido. Além disso, o requerente conduziu experimentos para confirmar esta crença. Para isto, uma vacina contendo Rhodococcus equi vivo foi usada. Por si só, não existe ainda nenhuma vacina disponível contra esta bactéria o que torna os experimentos inerentemente relevantes. Mas de maneira mais importante, esta bactéria foi habitualmente reconhecida como um bom modelo para outros actinomicetos nocardioformes, em particular Mycobaterium tuberculosis. Outros experimentos confirmatórios (para obter resultados confirmatórios abranger a faixa completa de actinomicetos nocardioformes), por exemplo seriam feitos com Nocardia seriolae (ver parágrafo C6). Este é um patógeno de peixe típico contra o qual nenhuma vacina adequada está disponível pelas mesmas razões como porque não existe nenhuma vacina adequada disponível contra outros actinomicetos nocardioformes que sobrevivem ao macrófago.

C2 Planejamento Experimental

[00075] Dezesseis crias de animais equinos de 2 a 4 semanas de idade foram usadas para o estudo. As crias de animais equinos foram divididas em quatro grupos de 4 crias de animais equinos e vacinadas oralmente com 1 ml de vacina contendo doses diferentes de RElΔipdAB (constituído em solução salina tamponada com fosfato estéril isotônica). O grupo 1 foi vacinado com 5 x 109 CFU, o grupo 2 foi vacinado com 5 x 108 CFU; o grupo 3 foi vacinado com 5 x 107 CFU e o grupo 4 foi deixado como controles não vacinados. As vacinações foram feitas em T = 0 e em T = 2 semanas. Em T = 4 semanas todas as crias de animais equinos foram inoculadas intratraquealmente com 100 ml de cultura de cepa 85F virulenta de Rhodococcus equi (contendo 5 x 106 CFU por dose de 100 ml).

[00076] Durante um período de 3 semanas depois da inoculação os cavalos foram clinicamente avaliados. As crias de animais equinos foram pesadas no dia da primeira vacinação, no dia da inoculação e no dia da necropsia. Em 3 semanas depois da inoculação (ou mais cedo no caso de sinais clínicos graves) as crias de animais equinos foram pesadas e eutanizadas e um exame após a morte completo foi realizado com atenção especial aos pulmões e linfonodos respiratórios. Os pulmões foram pesados de modo a calcular a razão em peso de pulmão para corpo. As amostras de tecido de todos os lóbulos pulmonares foram amostrados para a examinação.

C3 Materiais e Métodos Artigos de teste

[00077] A vacina conteve Rhodococcus vivo da cepa RElAipdAB, constituída em solução salina tamponada com fosfato estéril isotônica (PBS). A cultura de inoculação foi feita como segue: A cepa 85F de Rhodococcus equi foi plaqueada em sangue ágar e incubada por 24 horas a 37°C. As bactérias foram colhidas com 4 ml de PBS isotônico estéril por placa. A suspensão bacteriana foi diluída com PBS isotônico estéril visando em uma concentração final de 4 x 104 bactérias/ml. O transporte foi na temperatura ambiente; a cultura diluída foi usada dentro de 4 horas depois da preparação. Depois da inoculação, uma determinação de contagem viva foi feita de modo a confirmar o título de infectividade. O título foi de 5,3 x 104 CFU/ml.

Procedimentos e parâmetros experimentais

[00078] A reisolação bacteriana foi realizada pela amostragem com hastes com algodão na ponta retais exatamente antes de cada vacinação e nos dias 0, 1,2, 3, 6, 10, 14, 15, 16, 17, 20 e 24 (depois da vacinação). Hastes com algodão na ponta nasais foram amostrados das crias de animais equinos em T = 0 (exatamente antes da primeira vacinação). As amostras de hastes com algodão na ponta foram diluídas em série em solução salina fisiológica e plaqueada em sangue ágar e incubadas a 37°C por 16 a 24 horas. As colônias de Rhodococcus foram inicialmente identificadas pela morfologia de colônia mucóide não hemolítica típica, enumeradas e expressadas como CFU/ml. Em cada dia de isolação três re-isolados foram selecionados aleatoriamente (de três cavalos diferentes se presentes) foram usados para confirmar a identidade: Cepa Gram, API/Phoenix e PCR nos genes ipdAB.

[00079] Durante o estudo, os cavalos foram observados diariamente quanto a quaisquer anormalidades de saúde e/ou comportamento gerais por um bioespecialista. Começando um dia antes da inoculação os cavalos foram diariamente examinados (até a necropsia) quanto aos sinais clínicos. A pesagem ocorreu exatamente antes da primeira vacinação, exatamente antes da inoculação e exatamente antes da necropsia. Deste modo, o ganho de peso e a razão em peso de pulmão para corpo puderam ser calculados.

[00080] Nos dias 14 a 20 após a inoculação (ou mais cedo no caso de sinais clínicos graves) as crias de animais equinos foram mortas pela anestesia com xilazina (100 mg/100 kg) e cetamina (500 mg/100 kg) e sangria subsequente até a morte. Os pulmões foram pesados de modo a calcular a razão em peso de pulmão para corpo. Um exame após a morte completo foi realizado. As amostras de tecido (1 cm3) foram excisadas de sete locais padrão representativos dos lóbulos de cada metade do pulmão (3 sítios por metade + lóbulo adicional); o tecido doente foi preferencialmente selecionado para cada local, se o mesmo foi presente. As amostras de exemplo (as duas amostras do lóbulo equivalente em cada metade) foram reunidas para dar 3 amostras por potro + uma amostra do lóbulo adicional. Cada amostra (reunida) foi homogeneizada, diluída em série e inoculada em placas de sangue ágar e depois incubadas a 37°C por 16 a 24 horas. As colônias de Rhodococcus foram enumeradas e expressadas como CFU/ml de homogenado. A contagem pulmonar de pneumonia para cada animal foi obtida pelo estabelecimento quanto aos nodos pulmonares apical (esquerdo + direito), caudal (esquerdo + direito) e adicionais da porcentagem de consolidação. Para cada animal, estas porcentagens foram adicionadas para se obter uma figura de contagem do pulmão. Deste modo, uma contagem pulmonar entre 0 e 500 é obtida.

C4 Resultados

[00081] Os resultados após a inoculação estão resumidos na Tabela 7. A partir dos resultados resumidos está claro que todos os quatro controles desenvolveram sinais graves de pneumonia piogranulomatosa causada pelo R. equi como o único patógeno. Dois vacinados n- 4 e 5 tiveram sinais comparáveis aos controles, mas todos os outros vacinados tiveram sinais muito mais brandos ou virtualmente nenhum sinal. A % em peso do pulmão (uma medida objetiva para a quantidade de pneumonia) confirma a proteção parcial na maioria dos vacinados.

[00082] O potro vacinado n2 2 teve pneumonia causada pelas bactérias não específicas. De fato este, potro pode ser considerado como protegido visto que a Rhodococcus não foi isolada a despeito da inoculação maciça. Além disso, das três crias de animais equinos vacinadas com pneumonia, infecções mistas foram isoladas. Estas infecções mistas provavelmente têm influenciado negativamente ps parâmetros de proteção diferentes. Embora o efeito protetor da vacina é evidente, nenhum efeito de resposta de dose foi observado. De fato, a dose mais baixa pareceu fornecer os melhores resultados. Com base nisto, em conjunção com o fato de que as crias de animais equinos têm uma flora intestinal imatura, acredita-se que uma dose ideal reside entre 1 x 104 e 1 x IO10 CFU.

C5 Conclusão para a parte C dos experimentos

[00083] Todas as três doses orais da vacina pareceu ser segura para as crias de animais equinos jovens e induziram proteção substancial contra uma inoculação intratraqueal grave. Nos experimentos correntes os genes ipdA e ipdB do operon ipdAB foram ambos removidos do genoma das bactérias na vacina. Está claro, entretanto, que outras mutações que envolvem o mesmo operon podem ser igualmente eficazes. Uma mutação que por exemplo afeta apenas um dos genes ipdA ou ipdB pode ser igualmente eficaz por si. Em qualquer um dos cases posteriores, a transferase envolvida não pode ser feita e assim o mesmo fenótipo é atingido. De fato, isto também pode ser derivada de Rengarajan (PNAS, 7 de junho de 2005, Vol. 102, N2 23, pp 8327-8332). Nesta referência prova relevante é fornecida por um outro actinomiceto nocardioforme, a saber Mycobacterium tuberculosis', inativando cada um dos genes de ipd ortólogo (chamado RV3551 e RV3552 respectivamente em M. tuberculosis) resulta no mesmo fenótipo.

C6 Confirmação da eficácia da vacina de um mutante de Nocardia seriolae

[00084] Os experimentos acima para Rhodococcuse equi foram repetidos por um outro actinomiceto, o patógeno de peixe Nocardia seriolae, que causa nocardiose em peixes. Para este experimento a cepa INS436 do tipo selvagem e a cepa ΔipdAB como mencionadas aqui acima no parágrafo A13 foram usadas.

[00085] Grupos de 20 peixes olho de boi (Seriola quinqueradiaía) foram injetados IP com a cepa do tipo selvagem ou a cepa mutante (em várias concentrações), e um grupo de 20 peixes foi deixado como controle. Os peixes foram observados quanto a ocorrência de mortalidade e outras reações clínicas por 2 a 3 semanas para avaliar a atenuação da cepa mutante. No final deste período de observação os peixes sobreviventes foram inoculados com uma dose fixa da cepa do tipo selvagem para avaliar a eficácia da cepa mutante como uma vacina. Os peixes foram observados por mais 2 semanas.

[00086] Para a cepa do tipo selvagem um inoculo foi feito de 2,25 x 108 cfu/ml. Para a cepa mutante isto foi 7,85 x 108 cfu/ml (cerca de 3 vezes mais alta). Destes inóculos puros, diluições de 2 vezes, 20 vezes, 200 vezes e 2000 vezes foram feitas para o uso no estudo de atenuação. O material de - inoculação IP conteve 1,2 x 106 cfu/ml.

[00087] Os resultados para o experimento de atenuação são indicados na Tabela 10 (que mostra a mortalidade no final do período de observação). A partir disto torna-se claro que a cepa mutante é atenuada com respeito à cepa do tipo selvagem. Embora o inoculo puro para a cepa mutante fosse três vezes mais alta em cfu’s/ml, a mortalidade é significantemente mais baixa no grupo que recebeu a cepa mutante. Os resultados para o experimento de eficácia são indicados na Tabela 11. Embora nenhuma proteção completa pudesse ser obtida, está claro que o mutante fornece proteção significante (dado o fato de que no grupo de controle 60 por cento dos peixes morreram durante o período de observação). Mesmo no grupo dos peixes que receberam a diluição de 2000 vezes, muito menos peixes morreram por causa da inoculação com Nocardia seriolae do tipo selvagem.

[00088] Foi assim mostrado que a inativação de um gene que codifica uma proteína envolvida na degradação do propionato de metilhexahidroindanodiona, leva a uma cepa de vacina atenuada e protetora em um actinomiceto nocardioforme secundário. Isto é sustentado ainda pelo fato de que a invenção é aplicável na faixa inteira de actinomicetos nocardioformes.

Claims

1. Composição farmacêutica para proteger um animal contra um distúrbio que surge de uma infecção com uma bactéria que pertence ao grupo de actinomicetos nocardioformes tendo a capacidade para sobreviver dentro de macrófagos do animal, a composição caracterizada pelo fato de que compreende bactérias vivas de uma espécie de actinomicetos nocardioformes, as bactérias vivas sendo atenuadas pela inativação dos genes ipdA e ipdB, e um veículo farmaceuticamente aceitável para estas bactérias vivas.

2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que genes múltiplos em um operon são inativados.

3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a inativação é realizada pela deleção de pelo menos um gene pela deleção de gene não marcado.

4. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que as bactérias pertencem à família de Nocardiaceae ou Mycobacteriaceae.

5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que as bactérias pertencem aos gêneros Rhodococcus, Nocardia ou Mycobacterium.

6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que as bactérias pertencem às espécies Rhodococcus equi, Nocardia seriolae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium bovis ou Mycobacterium avium paratuberculosis.

7. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que as bactérias vivas estão presentes em uma concentração entre 1 X 104 e 1 x IO10 CFU por dose.

8. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a bactéria viva é uma Rhodococcus equi consistindo de uma cepa como depositada com a Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes do Institut Pasteur em Paris França sob o n- CNCM 1-4108 ou n- CNCM 1-4109.

9. Bactérias Rhodococcus equi, caracterizado pelo fato de ser de uma cepa como depositada com a Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes do Institut Pasteur em Paris França sob n- CNCM 1-4108 on n2 CNCM 1-4109.

10. Uso de uma bactéria viva como definida na reivindicação 1 ou 9, caracterizado pelo fato de ser para fabricar uma composição farmacêutica ou medicamento para proteger um animal contra um distúrbio que surge de uma infecção com uma bactéria do tipo selvagem correspondente.