KR20240054373A - 종양의 비독성 콜로니화를 위해 조작된 살모넬라 - Google Patents

종양의 비독성 콜로니화를 위해 조작된 살모넬라 Download PDF

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다니엘 앨런 살츠만
자넷 루이즈 쇼텔
랜스 비숍 아우구스틴
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리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미네소타
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Abstract

본원에서는 패혈증 부작용 없이 박테리아를 정맥내 전달하고, 어떠한 전신 독성도 없이 종양 미세환경에 직접 전달되도록 전신 독성인 면역 조정 단백질을 전달하기 위한 능력을 제공한다.

Description

종양의 비독성 콜로니화를 위해 조작된 살모넬라
우선권 출원(들)
본 출원은 2021년 9월 10일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 63/242,975에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 상기 출원의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
개발 중인 박테리아 항암 요법의 대부분은 종양을 특이적으로 콜로니화할 수 있는 박테리아의 능력에 의존한다. 살모넬라 엔테리카 티피무리움(Salmonella enterica Typhimurium) (에스. 티피무리움(S. Typhimurium)) 임상전 결과를 임상 환경으로 전환시키고자 하는 초기 시도는 주로 종양 콜로니화의 결여 및 전신 투여된 그람-음성 박테리아의 상당한 독성으로 인해 실패하였다.
본원에서는 박테리아 표면 분자와 포유동물 세포 상의 수용체의 상호작용으로 인한 독성의 감소를 제공한다. 이는 포유동물 세포 상의 톨-유사 수용체에 결합하는 플라젤린, 핌브리아에, O-항원 및 리포폴리사카라이드 단백질을 제거하기 위해 박테리아 게놈을 편집함으로써 달성된다. 또한, 보체 활성화를 억제하는 외막 프로테아제의 발현이 증가되었다. 추가로, 독성은 면역조정제 단백질의 전신 투여로 인해 감소/제거된다. 이는 종양 미세환경으로의 단백질의 발현 및 분비를 위한 유전자 카세트가 있는 플라스미드를 함유하는 박테리아 균주에 의해 달성되며, 그 결과로 전신 독성이 감소된 항암 면역 반응이 발생한다. 따라서, 본원에서는 패혈증 부작용 없이 박테리아를 정맥내 전달하고 어떠한 전신 독성도 없이 종양 미세환경에 직접 전달되도록 전신 독성인 면역 조정 단백질을 전달하기 위한 능력을 제공한다.
한 측면은 약독화된 살모넬라 세포로서, a) IL-6 분비를 유도하는 세포 표면 단백질을 코딩하는 살모넬라 유전자 중 하나 이상의 것에서의 돌연변이 또는 결실로서, 상기 하나 이상의 단백질의 감소된 발현 또는 발현 부재를 초래하는 돌연변이 또는 결실; 및 임의적으로 b) 대조군 세포와 비교하여, 보체 활성화를 억제하는 하나 이상의 외막 프로테아제의 발현에서의 증가, 및/또는 세포 표면 리포폴리사카라이드 단백질 (LPS)의 발현에서의 감소를 포함하는 약독화된 살모넬라 세포를 제공한다. 한 측면에서, 세포는 에스. 티피무리움 세포이다. 한 측면에서, 하나 이상의 살모넬라 유전자는 플라젤린, 핌브리아에, O-항원 및/또는 리포폴리사카라이드 단백질 (LPS)을 코딩한다. 또 다른 측면에서, 하나 이상의 살모넬라 유전자는 fliC, fljB, fimH 및/또는 rfaL이다. 한 측면에서, 하나 이상의 외막 프로테아제는 PgtE이다.
한 측면은 엔테로박테리아 공통 항원 로커스 (eca)의 결실을 추가로 포함한다. 또 다른 측면은 rpoS 유전자의 결실 및/또는 viaB 로커스의 부가를 추가로 포함한다. 또 다른 측면은 fljA, rflP, flgKL 및/또는 motAB 유전자 중 하나 이상의 것의 결실을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 살모넬라의 내인성 flhDP 프로모터는 종양-특이적 발현 프로모터로 대체된다. 하나의 실시양태에서, 종양-특이적 발현 프로모터는 FF+20* 프로모터이다.
한 측면에서, 세포는 외인성 면역조정제 단백질을 발현하는 하나 이상의 외인성 면역조정제 유전자를 포함한다. 일부 측면에서, 면역조정제 유전자는 IL-12, IL-18, IL-15, CXCL9-10, αCTLA-4 단일쇄 가변 단편 (scFv), αPD-L1 scFv, αCTLA-4 단일-도메인 항체 (sdAb), αPD-L1 sdAb 및/또는 αCD47 sdAb 단백질을 코딩/발현한다. 한 측면에서, 면역조정제 단백질은 세포로부터 분비된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 외인성 면역조정제 유전자는 종양-특이적 발현 프로모터의 제어 하에 있다. 한 측면에서, 종양-특이적 발현 프로모터는 FF + 20*이다.
한 측면은 본원에 기재된 세포의 집단 또는 그의 조합 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
한 측면은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 세포의 집단, 그의 조합 또는 본원에 기재된 조성물을 투여하여 상기 암을 치료하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다.
한 측면은 종양 성장/증식 억제 또는 종양 부피/크기 감소를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 세포의 집단, 그의 조합 또는 본원에 기재된 조성물을 투여하여 종양 성장을 억제하거나 또는 종양 부피를 감소시키는 것을 포함하는, 종양 성장/증식을 억제하거나 또는 종양 부피/크기를 감소시키는 방법을 제공한다.
또 다른 측면은 전이의 치료, 전이 형성/수의 감소 또는 전이 확산의 억제를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 세포의 집단, 그의 조합 또는 본원에 기재된 조성물을 투여하여 전이를 치료하거나, 전이 형성/수를 감소시키거나 또는 전이 확산을 억제하는 것을 포함하는, 전이를 치료하거나, 전이 형성/수를 감소시키거나 또는 전이 확산을 억제하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 종양, 암, 또는 전이는 폐, 간, 신장, 유방, 전립선, 췌장, 결장, 두경부, 난소 및/또는 소화기 종양, 암 또는 전이이다.
또 다른 측면에서, 세포 또는 조성물은 전신 투여된다. 한 측면에서, 세포는 1회 초과로 투여된다. 또 다른 측면은 혈관 파괴제 (VDA) 및/또는 칸나비디올 (CBD)을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 한 측면에서, VDA 및/또는 CBD는 치료 이전 및/또는 동안 (세포의 적어도 1회 투여 후) 투여된다. 측면에서, VDA 및/또는 CBD는 1회 초과로 투여된다. 한 측면에서, VDA는 VDA 콤브레타스타틴 A4 포스페이트 및 또는 VDA CKD-516이다. 한 측면에서, 항-인터류킨-6 (IL-6)이 투여된다.
한 측면은 a) IL-6 분비를 유도하는 세포 표면 단백질을 코딩하는 살모넬라 유전자 중 하나 이상의 것을 결실시켜 상기 하나 이상의 세포 표면 단백질의 감소된 발현 또는 발현 부재를 초래하는 단계; 및 임의적으로 b) 대조군 세포와 비교하여, 보체 활성화를 억제하는 하나 이상의 외막 프로테아제의 발현을 증가시키고/거나, 세포 표면 리포폴리사카라이드 단백질 (LPS)의 발현을 감소시키는 단계를 포함하는, 살모넬라의 독성을 감소시키는 방법이다. 하나의 실시양태에서, 살모넬라는 에스. 티피무리움 세포이다. 한 측면에서, 하나 이상의 살모넬라 유전자는 플라젤린, 핌브리아에, O-항원 및/또는 리포폴리사카라이드 단백질 (LPS)을 코딩한다. 또 다른 측면에서, 하나 이상의 살모넬라 유전자는 fliC, fljB, fimH 및/또는 rfaL이다. 한 측면에서, 하나 이상의 외막 프로테아제는 PgtE이다. 한 측면은 엔테로박테리아 공통 항원 로커스 (eca)의 결실을 추가로 포함한다. 또 다른 측면은 rpoS 유전자의 결실 및/또는 viaB 로커스의 부가를 추가로 포함한다. 추가 측면은 fljA, rflP, flgKL 및/또는 motAB 유전자 중 하나 이상의 것의 결실을 포함한다. 한 측면에서, flhDP 프로모터는 종양-특이적 발현 프로모터로 대체된다. 또 다른 측면에서, 종양-특이적 발현 프로모터는 FF+20* 프로모터이다.
도 1. 항-IL-6 항체는 전신 에스. 티피무리움 플러스 VDA의 독성을 감소시킨다. 400 mm3 종양을 보유하는 BALB-neuT 암컷 마우스를 5x105 또는 1x106 cfu의 균주 BCT1(pNG)를 이용하여 IV로 처리하였다. 박테리아 cfu 수치는 0일차에 전달된 총 cfu를 나타내고, 박테리아의 50%를 3시간 간격으로 2회 주사로 제공하였다. 모든 마우스는 -2일차 및 -1일차에 3시간 간격으로 주사당 0.4 mg을 2회 주사하여 IV CA4P VDA를 투여받았다. 지시된 경우, 첫 번째 에스. 티피무리움 주사 직후 1 mg의 항-IL-6 mAb를 IP로 투여하였다. 처리 후 체중 감소 및 생존에 대하여 7일 동안 마우스를 모니터링하였다. 각 군에서 처리된 생존 마우스/총 마우스는 각 칼럼 아래에 분수로 표시되어 있다. y-축 값은 각 군에서 생존 마우스의 평균 퍼센트 체중 감소를 나타낸다. 오차 막대는 평균으로부터의 표준 편차를 나타낸다.
도 2. 균주 BCT2의 구축. CRS의 전신 도입을 방지하기 위해 표면 분자를 변형시키기 위하여 ΔfliC , ΔfljB , ΔfimH, pgtEp(NC_016863.1: g.2506794G>A), 및 ΔrfaL 돌연변이를 (지질 A 돌연변이 (23) 함유하는) 균주 χ11091 내로 도입함으로써 에스. 티피무리움 균주 BCT2를 구축하였다. 유전자는 마지막 칼럼에 열거되어 있고, 유전자가 코딩하는 분자는 중간 칼럼에 있고, 상응하는 면역 반응은 첫 번째 칼럼에 열거되어 있다.
도 3. 에스. 티피무리움 BCT2 독성. 1x107 cfu (클로즈형 기호) 또는 1x106 cfu (오픈형 기호)의 균주 VNP20009 또는 BCT2(pPflEPLux)의 비-종양 부하된 BALB/c 마우스에게로의 박테리아 투여 후 체중 변화를 박테리아 주사 후 7일 동안 추적하였다. (명확성을 위해 단일 방향으로 표시된) 오차 막대는 마우스 4마리의 측정값으로부터의 표준 편차를 나타낸다.
도 4. 에스. 티피무리움 BCT2 독성 및 종양 콜로니화. 균주 BCT2(pFF + 20*Lux) 및 VDA로 처리된 종양-부하된 BALB-neuT 마우스에서 체중 변화를 추적하였다. -4, -3, -2 및 -1일차에 CKD-516 VDA를 단일 0.1 mg IP 주사로서 투여한 후, 0일차에 3시간 간격으로 2회에 걸쳐 1.5x106 cfu BCT2(pFF + 20*Lux) 용량을 IV 투여한 후, 이어서 1시간 후에 CKD-516 0.05 mg을 IP 주사하였다. 오차 막대는 마우스 3마리의 측정값의 표준 편차를 나타낸다. 인서트: BCT2(pFF + 20*Lux) 및 VDA로 처리된 3마리의 BALB-neuT 마우스에서의 종양으로부터의 생물발광. 각 마우스의 4개 뷰가 제시되어 있다.
도 5. Balb-neuT 종양-부하된 마우스에서의 조작된 박테리아 균주의 효능. 본 데이터는 균주 BCT2, BCT5 및 BCT14의 항암 치료 유용성을 입증한다. 모든 마우스는 명시된 균주 100 마이크로리터 주사를 맞았다. 처리 (A)부터 (D)까지는 이전에 기재되었다 (11). 처리된 마우스 모두는 -2일차에 4 mg/kg VDA (혈관 파괴제) + 50 mg/kg CBD IP (칸나비디올)를 받았다. 처리 (E)에서, 마우스는 0일차 2x106 cfu BCT2(pFF+20*-Quad) - 2 hr - 2x106 cfu BCT2(pFF+20*-Quad), 이어서 14일차 5x106 cfu BCT5(pFF+20*-Quad) - 2 hr - 5x106 cfu BCT5(pFF+20*-Quad)를 IV 주사를 맞았다. 처리 (F)에서, 마우스는 0일차 2.5x106 cfu BCT14-PL-Lux(pFliC-P) - 2 hr - 2.5x106 cfu BCT14-PL-Lux(pFliC-P)를 받았다. 코호트 (E) 및 (F)의 마우스는 0일차 박테리아의 두 번째 IV 주사 후 2시간째에 2 mg/kg VDA + 50 mg/kg CBD를 IP로 받았다. 종양 부피 차이 (패널 A) 및 평균 생존 기간 차이 (패널 B)에 대한 통계는 오직 상기 비교를 위해서만 제공된 것이며, 여기서 p 값은 < 0.05이다.
도 6. 면역조정제 단백질을 발현하고 분비하는 플라스미드. pFF+20*IL15Hly 플라스미드 (A) 및 pFF+20*αCTLA4Hly로 표시되는 scFv 분비 플라스미드 (B) 둘 다는 이. 콜라이(E. coli) rrnB 로커스 전사 종결인자 서열, p15A 복제 기점, 및 에스. 티피무리움 아스파르테이트 세미-알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 cDNA를 포함하는 플라스미드 pYA292로부터의 서열을 포함한다. 이들은 또한 헤모리신 분비 신호 서열 (HlyA)의 C-말단 60개 아미노산에 융합된 면역조정제 단백질 cDNA 및 이. 콜라이 (HlyB) 및 (HlyD) 헤모리신 전이체 단백질을 코딩하는 cDNA로 이루어진 FF+20* 촉진된 오페론도 포함한다. IL15 면역조정제 cDNA는 마우스 IL-15 수용체 알파 서브유닛의 스시 도메인을 코딩하는 서열 (IL15Ra), 이어서 gly/ser 가요성 링커 (L1), 이어서 마우스 IL-15를 코딩하는 서열 (IL15), 이어서 제2 gly/ser 가요성 링커를 코딩하는 서열 (L2)로 이루어진다. scFv 면역조정제 cDNA는 가요성 gly/ser 링커 (L)에 의해 이격되어 있는 가변 경쇄 (Vl) 및 가변 중쇄 (Vh) 항체 서열을 코딩하는 서열, 이어서 6x히스티딘 및 헤마글루티닌 태그 (T)로 이루어진다. pFF+20*αPDL1 (제시되지 않음)을 구축하기 위한 전략법은 pFF+20*αCTLA4와 동일하였다.
도 7. 면역조정제 단백질 분비물의 웨스턴 분석. 배지 (M) 및 면역조정제 분비 플라스미드를 보유하는 균주 χ4550의 배양물로부터의 초음파처리된 박테리아 (B)로부터 샘플링된 가용성 단백질에 대해 겔 전기영동을 수행하고, PVDF 막으로 옮겼다. 비-분비된 단백질에 대한 대조군으로서 항-DnaK 항체를 이용하여 3개 막 모두 프로빙하였다. 패널 A에서는 적색 형광단에 융합된 2차 항체를 사용하여 DnaK를 확인한 반면, 패널 B 및 C에서 DnaK는 녹색 형광성 밴드로서 검출되었다. 패널 A에서 겔로부터의 단백질을 항-마우스 IL-15 항체로 프로빙하였고, 패널 B 및 C에서 겔로부터의 단백질은 항-CTLA-4 또는 항-PD-L1 scFv의 C-말단에 위치하는 6개의 연속 히스티딘 잔기를 확인하기 위한 항체로 프로빙하였다. 패널 A에서 겔에 포함된 단백질 래더 (Li-Cor 카탈로그 928-40000)의 분자량 (레인 M.W.)이 명시되어 있다.
도 8. 치료 효능. 가장 큰 종양이 < 50 mm3로 측정된 BALB-neuT 암컷 마우스를 비처리하거나, 또는 상기 마우스에 물질 및 방법에 기재된 바와 같이 VDA, CBD 및 박테리아를 투여하였다. 실험 기간 동안 각 마우스에 대해 종양 크기를 측정하고, 총 종양 질량을 실험 시작시의 종양 질량과 비교하여 변화 배수를 계산하였다. 명확성을 위해 단일 표준 편차를 나타내는 양의 오차 막대만이 제시되어 있다. 2-샘플, 양측, 이분산 스튜던츠 t-검정을 사용하여 28일차 평균 종양 부하를 비교함으로써 명시된 P 값을 얻었다. A vs B 및 B vs C는 그의 P 값이 0.05를 초과하였는 바, 유의적으로 상이한 것으로 간주되지 않았다 (nd).
도 9. 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 분석. 도 8에 기재된 효능 실험으로부터의 마우스의 생존을 처리 후 9주 동안 추적하였다. 마우스를 그의 종양 중 하나가 2 cm3를 초과하였을 때 안락사시켰다. SAS JMP 소프트웨어 버전 15.1.0을 이용하여 계산된 로그-순위 P 값과 함께 평균 생존 기간 차이가 기록되어 있다. A vs B 및 A vs C는 그의 P 값이 0.05를 초과하였는 바, 유의적으로 상이한 것으로 간주되지 않았다 (nd).
도 10. 치료 독성. 0일차로부터의 마우스 체중 변화를 플롯팅하여 마우스가 처리 결과 경험한 체중 기준 독성의 양을 보여준다. 종양-부하된 BALB-neuT 마우스에서 이전에 발표된 연구로부터 최대 허용 용량 독소루비신 데이터 (MTD 독소루비신)를 임포팅하였다 [27]. 체표면적 환산으로 인간에서의 최대 허용 용량과 유사한 5 mg/kg 독소루비신을 상기 마우스에게 주사하였다.
살모넬라는 고형 종양을 콜로니화하는 독특한 경향을 가지고 있다. 상당량의 살모넬라를 정맥내 투여하면 종양 콜로니화율이 유의적으로 더 높아지지만, 그람 음성 박테리아의 독성으로 인해 많은 수의 박테리아를 주입할 수 없다. 본원에서는 독성 부작용을 감소시키면서, 종양을 콜로니화하는 그의 효과를 유지하기 위해 추가로 약독화되도록 유전적으로 변경된 약독화된 살모넬라를 제공한다. 또한, 본원에서는 상당한 항-종양 효과가 있는 다양한 면역조정 단백질을 발현하고 분비하는 다수의 유전적으로 조작된 살모넬라 구축물을 제공한다. 치료 용량으로 제공될 때, 상기 면역조정 단백질은 독성을 띨 수 있으며, 본 전달 방법은 이러한 독성을 감소시키고, 심지어는 제거한다.
자생적 종양의 강건한 치료적 콜로니화에 필요한 개수로 박테리아를 투여할 수 있도록 허용하는 수준으로 독성을 감소시키는 것은 보고된 바 없다. 박테리아 균주에 도입된 플라젤린, 핌브리아에, O-항원, LPS 및 외막 프로테아제 돌연변이의 조합을 통해 자생적 종양의 포괄적이고, 강건한 콜로니화를 달성하는데 충분한 개수의 박테리아를 비독성으로 투여할 수 있게 허용된다. 추가로, 투여된 면역조정 단백질의 항암 효능을 제한하는 전신 독성은 현 암 면역요법의 효능 제한 전신 독성 없이 종양 미세환경으로 직접 다중의 면역조정제 단백질을 동시에 연속 분비하는 것을 허용함으로써 해결된다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나, 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 방법 및 물질에 관한 여러 실시양태가 본원에 기재되어 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 하기 용어들은 각각 본 섹션에서 그와 연관된 의미를 갖는다.
명확성 및 간결한 설명을 위해, 특색은 동일하거나, 또는 별도의 실시양태의 일부로 본원에 기재될 수 있지만; 본 발명의 범주는 기재된 특색 모두 또는 일부의 조합을 갖는 실시양태를 포함할 수 있다는 것을 인지될 것이다.
본 명세서에서 "하나의 실시양태", "한 실시양태" 등에 대한 언급은 기재된 실시양태가 특정한 측면, 특색, 구조, 모이어티, 또는 특징을 포함할 수 있지만, 모든 실시양태가 반드시 그러한 측면, 특색, 구조, 모이어티, 또는 특징을 포함할 필요는 없다는 것을 나타낸다. 추가로, 상기 어구는 반드시 그러할 필요는 없지만, 본 명세서의 다른 부분에서 언급된 동일한 실시양태를 지칭할 수 있다. 추가로, 특정한 측면, 특색, 구조, 모이어티, 또는 특징이 실시양태와 관련하여 기재된 경우, 명백하게 기재되었는지 여부와 상관없이, 상기 측면, 특색, 구조, 모이어티, 또는 특징은 다른 실시양태에 영향을 줄 수 있거나, 또는 그와 관련시키는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 지식 범위 내에 포함되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수형은 문맥상 달리 명시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, "및/또는"이라는 어구는 결합된 요소들 중 "둘 중 하나 또는 둘 다", 예를 들어, 일부 경우에서는 결합적으로 존재하고, 다른 경우에는 분리적으로 존재하는 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, "또는"은 상기 정의된 바와 같이 "및/또는"이라는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, "및/또는" 또는 "또는"이 항목의 목록을 분리한 경우, 이는 포괄적인 것으로, 예컨대 다수의 항목들 중 적어도 하나를 포함하는 것 뿐만 아니라 그들 중 하나 초과의 것, 및 임의적으로, 열거되지 않은 추가적인 항목을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. "중 단 하나" 또는 "중 정확하게 하나" 또는 청구범위에서 사용될 때, "로 이루어진"이라는 용어와 같이, 그에 반하는 것을 명백하게 명시하는 용어만이 다수의 요소들 또는 요소들의 목록에서 정확하게 1개의 요소만을 포함한다는 것을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본원에 사용된 바와 같이, "또는"이라는 용어는, "둘 중 어느 하나", "중 하나", "중 단 하나", 또는 "중 정확하게 하나"와 같은 배타적 용어가 앞에 있는 경우, 오직 배타적 대안을 명시하는 것으로만 (즉, "둘 다가 아닌, 하나 또는 나머지 다른 하나"인 것으로) 해석되어야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, "포괄하는", "포괄한다", "갖는", "갖는다", "수반하는" 또는 그의 변형은 "포함하는"이라는 용어와 유사하게 포괄적인 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이, "약"이라는 용어는 명시된 값의 플러스 또는 마이너스 10%를 의미한다. 예를 들어, 약 100은 90 내지 110을 의미한다. 본원에서 종점으로 언급된 수치 범위는 해당 범위 내에 포함된 모든 수치와 분수를 포함한다 (예를 들어, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.90, 4 및 5를 포함한다). 또한, 모든 수치와 그의 분수는 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 추정되는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "개체", "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 포유동물을 포함하여, 진단, 치료 또는 요법이 요구되는 임의의 대상체를 지칭한다. 포유동물은 인간, 농장 동물, 스포츠 동물 및 애완동물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "대상체"는 인간을 포함하는 포유동물과 같은 척추동물이다. 포유동물은 인간, 농장 동물, 스포츠 동물 및 반려 동물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "동물"이라는 용어에는 개, 고양이, 어류, 게르빌, 기니 피그, 햄스터, 말, 토끼, 돼지, 마우스, 원숭이 (예를 들어, 유인원, 고릴라, 침팬지, 오랑우탄), 래트, 양, 염소, 소 및 조류가 포함된다.
용어 "치료", "치료하는" 등은 일반적으로 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과, 예컨대 장애의 발병 또는 진행을 저지 또는 억제하거나, 또는 이를 저지 또는 억제하기 위해 시도하고/거나, 장애 및/또는 그의 증상을 감소, 억제, 퇴행 또는 완화시키거거나, 또는 이를 감소, 억제, 퇴행 또는 완화시키기 위해 시도하는 것을 의미하는 것으로 사용된다. 효과는 질환 또는 그의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 측면에서 예방적인 것일 수 있고/거나, 질환 및/또는 질환으로 인한 부작용에 대한 부분적 또는 완전한 치유 측면에서 치료적인 것일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 다양한 임상적 및 과학적 방법론 및 검정법을 사용하여 장애의 발병 또는 진행을 평가할 수 있으며, 유사하게, 다양한 임상적 및 과학적 방법론 및 검정법을 사용하여 장애 또는 그의 증상의 감소, 퇴행, 또는 완화를 평가할 수 있다. 추가적으로, 치료는 대상체 또는 세포 배양물 (생체내 또는 시험관내)에 적용될 수 있다.
"억제하다", "억제하는", 및 "억제"라는 용어는 질환, 감염, 병태, 세포군, 단백질 또는 그의 발현의 성장 또는 진행을 저속화시키거나, 정지시키거나, 역전시키는 것을 지칭한다. 억제는, 예를 들어, 치료 또는 접촉 부재 시 발생하는 성장 또는 진행과 비교하여 약 20%, 40%, 60%, 80%, 90%, 95% 또는 99%보다 클 수 있다.
"발현"은 DNA로부터 RNA의 생산 및/또는 유전 물질 (예를 들어, RNA (mRNA))에 의해 지시되는 단백질의 생산을 지칭한다. 구성적 발현 (항상 발현)과 달리, 유도성 발현은 특정 분자 (예를 들어, 아라비노스) 또는 환경 문제의 존재와 같은 특정 조건 하에서만 발생하는 발현이다.
핵산 (또는 단백질) 및 숙주와 관련하여 본원에 사용된 "외인성"이라는 용어는 자연에서 발견되는 특정한 유형의 세포에서 발생하지 않는 (및 그로부터 수득할 수 없는) 핵산, 또는 상기 핵산에 의해 코딩된 단백질을 지칭한다. 따라서, 비자연적으로 발생된 핵산은 일단 숙주에 있으면 숙주에 외인성인 것으로 간주된다. 비-자연적으로 발생된 핵산은 핵산 전체가 자연에 존재하지 않는 한, 자연에서 발견되는 핵산 서열의 핵산 서브서열 또는 단편을 함유할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요한다. 예를 들어, 발현 벡터 내에 게놈 DNA 서열을 포함하는 핵산 분자는 비-자연적으로 발생된 핵산인 바, 핵산 분자 전체 (게놈 DNA 플러스 벡터 DNA)는 자연에 존재하지 않기 때문에 일단 숙주에 도입되고 나면 숙주 세포에 외인성인 것이다. 따라서, 전체가 자연에 존재하지 않는, 임의의 벡터, 자율적으로 복제하는 플라스미드, 또는 바이러스 (예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 또는 헤르페스 바이러스)는 비-자연적으로 발생된 핵산인 것으로 간주된다. 따라서, cDNA 뿐만 아니라 PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 처리에 의해 생산된 게놈 DNA 단편은 자연에서 발견되지 않는 별도의 분자로 존재하는 바, 비-자연적으로 발생된 핵산으로 간주된다. 따라서, 외인성 서열이 숙주의 게놈에 통합될 수 있다. 또한, 자연에서 발견되지 않는 배열로 프로모터 서열 및 폴리펩티드 코딩 서열 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)을 함유하는 임의의 핵산은 비-자연적으로 발생된 핵산이라는 결론에 이르게 된다. 자연적으로 발생된 핵산은 특정한 숙주 미생물에 대해 외인성일 수 있다. 예를 들어, 효모 x 세포로부터 단리된 전체 염색체는 일단 염색체가 효모 y 세포에 도입되고 나면 효모 y 세포에 대해 외인성 핵산이다.
그에 반해, 핵산 (예를 들어, 유전자) (또는 단백질) 및 숙주와 관련하여 본원에 사용된 "내인성"이라는 용어는 자연에서 발견되는 것과 같이 특정한 숙주에서 발생하는 (및 그로부터 수득할 수 있는) 핵산 (또는 단백질)을 지칭한다. 추가로, 핵산 (또는 단백질)을 "내인적으로 발현하는" 세포는 자연에서 발견되는 것과 동일한 특정한 유형의 숙주가 발현하는 것과 같이 상기 핵산 (또는 단백질)을 발현한다. 추가로, 핵산, 단백질, 또는 다른 화합물을 "내인적으로 생산하는" 숙주는 자연에서 발견되는 것과 동일한 특정한 유형의 숙주가 생산하는 것과 같이 상기 핵산, 단백질, 또는 화합물을 생산한다.
"접촉시키는"이라는 용어는, 예를 들어, 예컨대, 용액 중, 반응 혼합물 중, 시험관내에서, 또는 생체내에서 세포 또는 분자 수준에서 터치하거나, 접촉하도록 하거나, 바로 옆에 또는 근접하게 위치시켜 생리학적 반응, 화학적 반응, 또는 물리적 변화를 일으키는 행위를 지칭한다.
"유효량"은 임상전 또는 임상 결과와 같은 유익하거나 또는 원하는 결과를 가져오기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본원에 기재된 화합물(들), 생물학적 제제 및 제약 조성물에 적용되는 "유효량"이라는 용어는 원하는 치료 결과를 제공하는데 필요한 양을 의미한다. 예를 들어, 유효량은 치료 화합물, 생물학적 제제 또는 조성물이 투여되는 장애 및/또는 질환의 증상을 치료, 치유 또는 완화시키는데 효과적인 수준이다. 추구하는 특정한 치료 목표에 효과적인 양은 치료되는 장애, 및 그의 중증도 및/또는 발생/진행 단계; 사용되는 특정 화합물, 생물학적 재재 또는 제약 조성물의 생체이용성 및 활성; 대상체에 대한 투여 경로 또는 방법 및 도입 부위; 특정 화합물 또는 생물학적 제제의 제거율 및 다른 약동학적 특성; 치료 지속 기간; 접종 요법; 특정 화합물, 생물학적 제제 또는 조성물과 함께 조합하여 또는 동시에 사용되는 약물; 치료받는 대상체의 연령, 체중, 성별, 식이요법, 생리 및 전반적인 건강 상태; 및 관련 과학 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 유사 인자를 비롯한 다양한 인자에 의존할 것이다. 투여량은 치료받는 대상체의 상태에 따라 일부 변경될 수 있고, 어느 경우에서든 치료를 실시하는 의사 또는 다른 개체는 개별 환자에 적절한 용량을 결정할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "장애"는 장애, 질환 또는 병태, 또는 건강하거나 정상적인 생물학적 활성에서 벗어나는 다른 것을 지칭하며, 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 용어는 정상적인 기능을 손상시키는 임의의 병태를 지칭한다. 병태는 산발성 또는 유전성 유전적 이상에 의해 유발될 수 있다. 병태는 또한 비-유전적 이상에 의해서도 유발될 수 있다. 병태는 또한, 제한하는 것은 아니지만, 대상체의 세포(들), 조직(들), 기관(들), 시스템(들) 등을 커팅, 크러싱, 버닝, 피어싱, 스트래칭, 쉬어링, 주사하거나, 또는 다르게는 변형시키는 것과 같이, 환경 인자로부터 대상체에게 손상을 가함으로써 유발될 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세포", "세포주", 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 용어들은 모두 임의의 모든 후속 세대인, 그의 자손도 포함한다. 모든 자손은 고의적 또는 비고의적 돌연변이에 기인하여 동일하지 않을 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
유전자의 "코딩 영역"은 유전자의 코딩 가닥의 뉴클레오티드 잔기 및 유전자의 전사에 의해 생산되는 mRNA 분자의 코딩 영역과 각각 상동성이거나, 또는 그와 상보적인, 유전자의 비-코딩 가닥의 뉴클레오티드로 이루어진다.
본원에 사용된 바와 같이, "상보적"이란, 두 핵산, 예를 들어, 두 DNA 분자 사이의 서브유닛 서열 상보성의 광범위한 개념을 지칭한다. 두 분자 모두의 뉴클레오티드 위치가 일반적으로 서로 염기쌍을 형성할 수 있는 뉴클레오티드가 점유하고 있다면 이때 핵산은 상기 위치에서 서로 상보적인 것으로 간주된더. 따라서, 각 분자의 상응하는 위치의 상당수 (적어도 50%)가 일반적으로 서로 염기쌍을 형성하는 뉴클레오티드 (예를 들어, A:T 및 G:C 뉴클레오티드 쌍)가 점유할 때, 두 핵산은 서로 상보적인 것이다. 따라서, 제1 핵산 영역의 아데닌 잔기는 잔기가 티민 또는 우라실인 경우 제1 영역과 역평행인 제2 핵산 영역의 잔기와 특이적인 수소 결합을 할 수 있는 것 ("염기쌍 형성")으로 공지되어 있다. 유사하게, 제1 핵산 가닥의 시토신 잔기는 잔기가 구아닌인 경우 제1 가닥과 역평행인 제2 핵산 가닥의 잔기와 염기쌍을 형성할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 두 영역이 역평행 방식으로 배열될 때 제1 영역의 적어도 하나의 뉴클레오티드 잔기가 제2 영역의 잔기와 염기쌍을 형성할 수 있는 경우, 핵산의 제1 영역은 동일하거나, 또는 상이한 핵산의 제2 영역에 상보적이다. 바람직하게는, 제1 영역은 제1 부분을 포함하고, 제2 영역은 제2 부분을 포함하며, 이로써, 제1 부분과 제2 부분이 역평행 방식으로 배열될 때, 제1 부분의 뉴클레오티드 잔기 중 적어도 약 50%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%는 제2 부분의 뉴클레오티드 잔기와 염기쌍을 형성할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 제1 부분의 모든 뉴클레오티드 잔기는 제2 부분의 뉴클레오티드 잔기와 염기쌍을 형성할 수 있다.
"코딩하는"이란, 생물학적 프로세스에서 뉴클레오티드 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 정의된 서열 또는 아미노산의 정의된 서열 중 하나를 갖는 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서의 역할을 하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 유전자, cDNA, 또는 mRNA 중의 뉴클레오티드의 특정 서열의 고유한 특성, 및 그로부터 생성된 생물학적 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역을 통해 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질이 생산된다면, 유전자는 단백질을 코딩하는 것이다. 그의 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 통상적으로 서열 목록에 제공되어 있는 코딩 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용되는 비-코딩 가닥 둘 다는 상기 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 생성물을 코딩하는 것으로서 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 특정한 단백질 또는 펩티드의 "본질적으로 순수한" 제제는 제제 중 적어도 약 95중량%, 바람직하게는 적어도 약 99중량%의 단백질 또는 펩티드가 특정한 단백질 또는 펩티드인 제제이다.
"단편" 또는 "절편"은 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열의 일부분, 또는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열의 일부분이다. 용어 "단편" 및 "절편"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, "기능적" 생물학적 분자는 특징으로 하는 특성을 보이는 형태의 생물학적 분자이다. 예를 들어, 기능적 효소는 효소가 특징으로 하는 특징적인 촉매 활성을 보이는 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "상동성"이란, 두 중합체 분자 사이의, 예를 들어, 두 핵산 분자 사이의, 예를 들어, 두 DNA 분자 또는 두 RNA 분자 사이의, 또는 두 폴리펩티드 분자 사이의 서브유닛 서열 유사성을 지칭한다. 두 분자 중 둘 다에서 서브유닛 위치가 동일한 단량체 서브유닛으로 점유되어 있을 때, 예를 들어, 각각의 두 DNA 분자 중의 위치가 아데닌으로 점유되어 있다면, 이때 그들은 상기 위치에서 상동성을 띠는 것이다. 두 서열 사이의 상동성은 매칭 또는 상동성 위치의 수의 직접적인 함수이며, 예를 들어, 두 화합물 서열 중 위치의 절반 (예를 들어, 길이가 10개의 서브유닛으로 이루어진 중합체 중의 5개의 위치)이 상동성을 띤다면, 이때 두 서열은 50% 상동성이고, 위치의 90%, 예를 들어, 10개 중 9개가 매칭되거나, 상동성을 띤다면, 두 서열은 90%의 상동성을 공유하는 것이다. 예로서, DNA 서열 3'ATTGCC5' 및 3'TATGGC5'는 50%의 상동성을 공유한다.
본원에 사용된 바와 같이, "상동성"은 "동일성"과 동의어로 사용된다.
두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 두 서열을 비교하는데 유용한 수학적 알고리즘은 문헌 [Karlin and Altschul (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877)]에서 변형된 것과 같은, 카를린(Karlin) 및 알트슐(Altschul)의 알고리즘 (1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268)이다. 상기 알고리즘은 문헌 [Altschul, et al. (1990, J. Mol. Biol. 215:403-410)]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램으로 도입되고, 예를 들어, 미국 국립 생물 공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information: NCBI) 웹사이트에서 BLAST 도구를 사용하여 범용 리소스 로케이터를 갖는 NCBI 월드 와이드 웹 사이트에서 액세스가 가능하다. 하기 파라미터: 갭 페널티 = 5; 갭 연장 페널티 = 2; 미스매치 페널티 = 3; 매치 보상 = 1; 기대 값 10.0; 및 워드 크기 = 11을 사용하여 (NCBI 웹 사이트에서 "blastn"으로 지정된) NBLAST 프로그램을 이용하여 BLAST 뉴클레오티드 검색을 수행함으로써 본원에 기재된 핵산에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. 하기 파라미터: 기대 값 10.0, BLOSUM62 스코어링 행렬을 사용하여 (NCBI 웹 사이트에서 "blastn"으로 지정된) XBLAST 프로그램 또는 NCBI "blastp" 프로그램을 이용하여 BLAST 단백질 검색을 수행함으로써 본원에 기재된 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적으로 갭이 있는 정렬을 수득하기 위해, 문헌 [Altschul et al. (1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)]에 기재된 바와 같이 갭드 BLAST(Gapped BLAST)를 사용할 수 있다. 대안적으로, PSI-Blast 또는 PHI-Blast는 분자 사이의 먼 관계 (상기 문헌 동일) 및 공통 패턴을 공유하는 분자 사이의 관계를 검출하는 반복 검색을 수행하는데 사용될 수 있다. BLAST, 갭드 BLAST, PSI-Blast, 및 PHI-Blast 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다.
두 서열 사이의 퍼센트 동일성은 갭을 허용하면서 또는 허용하지 않으면서, 상기 기재된 것과 유사한 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 퍼센트 동일성을 산출할 때, 전형적으로는 정확한 매치가 계수된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "하이브리드화"는 상보적인 핵산의 쌍을 이루는 것과 관련하여 사용된다. 하이브리드화 및 하이브리드화 강도 (즉, 핵산 사이의 결합 강도)는 핵산 사이의 상보성 정도, 수반된 조건의 엄격성, 형성된 하이브리드의 길이 및 핵산내 G:C 비와 같은 인자의 영향을 받는다.
본원에 사용된 바와 같이, "설명서"는 본원에서 언급된 각종 질환 또는 장애를 완화시키기 위한 키트에서의 본 발명의 펩티드의 유용성을 전달하는데 사용될 수 있는 간행물, 기록물, 다이어그램, 또는 임의의 다른 표현 매체를 포함한다. 임의적으로, 또는 대안적으로, 설명서는 포유동물의 세포 또는 조직에서의 질환 또는 장애를 완화시키는 하나 이상의 방법을 기재할 수 있다. 본 발명의 키트의 설명서는, 예를 들어, 확인된 본 발명의 화합물을 함유하는 용기에 부착될 수 있거나, 또는 확인된 화합물을 함유하는 용기와 함께 수송될 수 있다. 대안적으로, 설명서는 설명서 및 화합물이 수용자에 의해 협조적으로 사용될 수 있게 하고자 하는 의도로 용기와 별도로 수송될 수 있다.
용어 "핵산"은 전형적으로 큰 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. "핵산"이란, 데옥시리보뉴클레오시드 또는 리보뉴클레오시드로 구성되었는지 여부와 상관없이, 및 포스포디에스테르 결합 또는 변형된 결합, 예컨대 포스포트리에스테르, 포스포라미데이트, 실록산, 카르보네이트, 카르복시메틸에스테르, 아세트아미데이트, 카르바메이트, 티오에테르, 가교된 포스포라미데이트, 가교된 메틸렌 포스포네이트, 가교된 포스포라미데이트, 가교된 포스포라미데이트, 가교된 메틸렌 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 가교된 포스포로티오에이트 또는 술폰 결합, 및 상기 결합의 조합으로 구성되었는지 여부와 상관없이 임의의 핵산을 의미한다. 용어 핵산은 또한 구체적으로 생물학적으로 발생된 5종의 염기 (아데닌, 구아닌, 티민, 시토신 및 우라실) 이외의 다른 염기로 구성된 핵산을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산"은 RNA 뿐만 아니라 단일 및 이중 가닥 DNA 및 cDNA를 포함한다. 게다가, "핵산", "DNA", "RNA"라는 용어 및 유사 용어는 또한 핵산 유사체, 즉, 포스포디에스테르 백본 이외의 것을 갖는 유사체를 포함한다. 예를 들어, 관련 기술분야에 공지되어 있고, 백본 중에 포스포디에스테르 결합 대신 펩티드 결합을 갖는, 소위 "펩티드 핵산"이라고 불리는 것은 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 간주된다. "핵산"이란, 데옥시리보뉴클레오시드 또는 리보뉴클레오시드로 구성되었는지 여부와 상관 없이, 및 포스포디에스테르 결합 또는 변형된 결합, 예컨대 포스포트리에스테르, 포스포라미데이트, 실록산, 카르보네이트, 카르복시메틸에스테르, 아세트아미데이트, 카르바메이트, 티오에테르, 가교된 포스포라미데이트, 가교된 메틸렌 포스포네이트, 가교된 포스포라미데이트, 가교된 포스포라미데이트, 가교된 메틸렌 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 가교된 포스포로티오에이트 또는 술폰 결합, 및 상기 결합의 조합으로 구성되었는지 여부와 상관 없이 임의의 핵산을 의미한다. 용어 핵산은 또한 구체적으로 생물학적으로 발생된 5종의 염기 (아데닌, 구아닌, 티민, 시토신, 및 우라실) 이외의 다른 염기로 구성된 핵산을 포함한다. 본원에서는 폴리뉴클레오티드 서열을 기재하는데 관용적 표기법이 사용되고: 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 단부가 5'-단부이고; 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 방향은 5'-방향으로 지칭된다. 5'에서 3'으로의, 초기 RNA 전사체에의 뉴클레오티드 부가 방향은 전사 방향으로 지칭된다. mRNA와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥은 "코딩 가닥"으로 지칭되고; DNA 상의 기준점에 대해 5'에 위치하는 DNA 가닥 상의 서열은 "상류 서열"로서 지칭되고; DNA 상의 기준점에 대해 3'에 위치하는 DNA 가닥 상의 서열은 "하류 서열"로서 지칭된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산 구축물"은, 게놈 또는 합성 방법에 의해 수득되는지 여부와 상관없이, 원하는 특정한 유전자 또는 유전자 단편을 코딩하는 DNA 및 RNA 서열을 포함한다.
달리 언급되지 않는 한, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축퇴성 버전이고 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 및 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함할 수 있다.
용어 "올리고뉴클레오티드"는 전형적으로 짧은 폴리뉴클레오티드, 일반적으로는 약 50개 이하의 뉴클레오티드를 지칭한다. 뉴클레오티드 서열이 DNA 서열 (즉, A, T, G, C)에 의해 표시되는 경우, 이는 "U"가 "T"를 대체하는 것인 RNA 서열 (즉, A, U, G, C)을 포함한다는 것을 이해할 것이다.
"실질적으로 상동성인 핵산 서열"이란, 상응하는 서열이 참조 핵산 서열에 의해 코딩된 펩티드와 실질적으로 동일한 구조 및 기능을 갖는 펩티드를 코딩하며, 예를 들어, 다만 상기 펩티드 기능에 유의적인 영향을 주지 않는 아미노산 변이만이 존재하는 것인, 참조 핵산 서열에 상응하는 핵산 서열을 의미한다. 바람직하게는, 실질적으로 동일한 핵산 서열은 참조 핵산 서열에 의해 코딩된 펩티드를 코딩한다. 실질적으로 유사한 핵산 서열과 참조 핵산 서열 사이의 동일성 백분율은 적어도 약 50%, 65%, 75%, 85%, 95%, 99% 또는 그 초과이다. 핵산 서열의 실질적인 동일성은, 예를 들어, 물리적/화학적 방법 (즉, 하이브리드화)에 의해, 또는 컴퓨터 알고리즘을 통한 서열 정렬에 의해 두 서열의 서열 동일성을 비교함으로써 결정될 수 있다. 뉴클레오티드 서열이 참조 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 유사한지 여부를 결정하는데 적합한 핵산 하이브리드화 조건은 하기와 같다: 50℃에서 7% 나트륨 도데실 술페이트 SDS, 0.5 M NaPO4, 1 mM EDTA, 50℃에서 2X 표준 염수 시트레이트 (SSC), 0.1% SDS 중에서 세척; 바람직하게는, 50℃에서 7% (SDS), 0.5 M NaPO4, 1 mM EDTA, 50℃에서 1X SSC, 0.1% SDS 중에서 세척; 바람직하게는, 50℃에서 7% SDS, 0.5 M NaPO4, 1 mM EDTA, 50℃에서 0.5X SSC, 0.1% SDS 중에서 세척; 및 더욱 바람직하게는, 50℃에서 7% SDS, 0.5 M NaPO4, 1 mM EDTA, 65℃에서 0.1X SSC, 0.1% SDS 중에서 세척. 두 핵산 서열 사이의 실질적인 유사성을 결정하는데 적합한 컴퓨터 알고리즘으로는 GCS 프로그램 패키지 (Devereux et al., 1984 Nucl. Acids Res. 12:387), 및 BLASTN 또는 FASTA 프로그램 (문헌 [Altschul et al., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990 87:14:5509-13]; [Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990 215:3:403-10]; [Altschul et al., 1997 Nucleic Acids Res. 25:3389-3402])을 포함한다. 상기 프로그램과 함께 제공된 디폴트 설정 환경은 본 발명의 목적을 위한 핵산 서열의 실질적인 유사성을 결정하는데 적합하다.
두 폴리뉴클레오티드가 "작동가능하게 연결된" 것으로서 기재되어 있는 것은 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산 모이어티가, 두 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 그가 특징으로 하는 생리학적 효과를 그 나머지 하나에 대해 발휘할 수 있도록 하는 방식으로 핵산 모이어티 내에 배열되어 있는 두 폴리뉴클레오티드를 포함한다는 것을 의미하는 것이다. 예로서, 유전자의 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 프로모터는 코딩 영역의 전사를 촉진시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "제약상 허용되는 담체"는 적절한 화합물 또는 유도체가 조합될 수 있고, 조합 후에 적절한 화합물을 대상체에게 투여하는데 사용될 수 있는 화학적 조성물을 의미한다. "제약상 허용되는"이란, 인간 또는 수의학적 적용에 대해 생리학적으로 허용될 수 있음을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, "제약 조성물"은 인간 및 수의학적 용도를 위한 제제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "정제된"이라는 용어 및 유사한 용어는 원래 환경에서 분자 또는 화합물과 일반적으로 연관된 다른 성분에 비해 분자 또는 화합물이 풍부해지는 것을 의미한다. "정제된"이라는 용어는 프로세스 동안 특정한 분자의 완전한 순도가 달성되었음을 반드시 의미하는 것은 아니다. 본원에 사용된 바와 같이, "고도로 정제된" 화합물은 90% 초과로 순수한 화합물을 지칭한다. 특히, 정제된 정자 세포 DNA는 정제된 정자 세포 DNA의 PCR 증폭 및 증폭된 DNA의 후속 분석 시 유의적인 검출가능한 수준의 비-정자 세포 DNA를 생산하지 않는 DNA를 지칭한다. "유의적인 검출가능한 수준"은 제시된 데이터에서 볼 수 있고, 법의학 증거를 분석하는 동안 해결/설명되어야 하는 오염 물질의 양이다.
"재조합 폴리뉴클레오티드"란, 천연적으로는 함께 연결되어 있지 않은 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 증폭된 또는 어셈블리된 재조합 폴리뉴클레오티드는 적합한 벡터에 포함될 수 있고, 상기 벡터는 적합한 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있다.
재조합 폴리뉴클레오티드는 또한 비-코딩 기능부 (예를 들어, 프로모터, 복제 기점, 리보솜-결합 부위 등)로서의 역할을 할 수 있다.
재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포는 "재조합 숙주 세포"로서 지칭된다. 유전자가 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 재조합 숙주 세포에서 발현되는 유전자는 "재조합 폴리펩티드"를 생산한다.
"재조합 폴리펩티드"는 재조합 폴리뉴클레오티드 발현 시 생산되는 것이다.
"재조합 세포"란, 트랜스진을 포함하는 세포이다. 상기 세포는 진핵 또는 원핵 세포일 수 있다. 또한, 트랜스제닉 세포는 트랜스진을 포함하는 배아 줄기 세포, 세포가 트랜스진을 포함하는 트랜스제닉 배아 줄기 세포로부터 유래된 키메라 포유동물로부터 수득된 세포, 트랜스제닉 포유동물, 또는 그의 태아 또는 태반 조직으로부터 수득된 세포, 및 트랜스진을 포함하는 원핵 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"조절한다"라는 용어는 관심 기능 또는 활성을 자극하거나 또는 억제하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표준"은 비교를 위해 사용되는 것을 지칭한다. 예를 들어, 시험 화합물을 투여할 때 결과를 비교하기 위해 투여되고 사용되는 공지된 표준 작용제 또는 화합물일 수도 있고, 작용제 또는 화합물이 파라미터 또는 기능에 미치는 효과를 측정할 때 대조군 값을 얻기 위해 측정되는 표준 파라미터 또는 기능일 수도 있다. 표준은 또한 샘플에 알려진 양으로 첨가되고, 관심 마커 측정 전에 샘플이 프로세싱되거나 또는 샘플에 대해 정제 또는 추출 절차가 수행될 때, 정제 또는 회수율과 같은 것을 측정하는데 유용한 작용제 또는 화합물과 같은 "내부 표준"을 지칭할 수도 있다. 내부 표준은 종종, 예컨대 방사성 동위원소 등으로 표지되어 내인성 마커와 구별될 수 있는 정제된 관심 마커이다.
종래의 분자생물학 기술을 수반하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 상기 기술은 관련 기술분야에 일반적으로 공지되어 있으며, 방법에 관한 논문, 예컨대 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]; 및 [Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992] (정기 간행물 최신판 포함)에 상세하게 기재되어 있다. 핵산의 화학적 합성 방법은, 예를 들어, 문헌 [Beaucage and Carruthers, Tetra. Letts. 22: 1859-1862, 1981] 및 [Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103:3185, 1981]에서 논의되고 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "포괄하는", "포괄한다", "갖는", "갖는다", "수반하는" 또는 그의 변형은 "포함하는"이라는 용어와 유사하게 포괄적인 것으로 의도된다.
"포함한다", "포함하는"이라는 용어 등은 미국 특허법에 그에 속한다는 의미를 가질 수 있으며, 이는 "포괄한다", "포괄하는" 등을 의미할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "포함하는" 또는 "포괄한다" 등은 제한 없이 포괄하는을 의미한다.
박테리아
본 발명에 유용한 박테리아는 살모넬라를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 사용될 수 있는 살모넬라 균주의 예로는 살모넬라 티피(Salmonella typhi) (ATCC No. 7251) 및 에스. 티피무리움 (ATCC No. 13311)을 포함한다. 약독화된 살모넬라 균주는 에스. 티피-aroC - aroD (Hone et al. Vacc. 9:810 (1991)), 에스. 티피무리움-aroA 돌연변이체 (Mastroeni et al. Micro. Pathol. 13:477 (1992)) 및 살모넬라 티피무리움 7207을 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 추가적인 약독화된 살모넬라 균주는 하나 이상의 다른 약독화 돌연변이, 예컨대 (i) 영양요구성 돌연변이, 예컨대 aro (Hoiseth et al. Nature, 291:238-239 (1981)), gua (McFarland et al. Microbiol. Path., 3:129-141 (1987)), nad (Park et al. J. Bact, 170:3725-3730 (1988), thy (Nnalue et al. Infect. Immun., 55:955-962 (1987)), 및 asd (Curtiss, 상기 문헌 동일) 돌연변이; (ii) 전체 조절 기능을 불활성화시키는 돌연변이, 예컨대 cya (Curtiss et al. Infect. Immun., 55:3035-3043 (1987)), crp (Curtiss et al. (1987), 상기 문헌 동일), phoP/phoQ ([Groisman et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:7077-7081 (1989)]; 및 [Miller et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:5054-5058 (1989)]), phop.sup.c (Miller et al. J. Bact, 172:2485-2490 (1990)) 또는 ompR (Dorman et al. Infect. Immun., 57:2136-2140 (1989)) 돌연변이; (iii) 스트레스 반응을 변형시키는 돌연변이, 예컨대 recA (Buchmeier et al. MoI. Micro., 7:933-936 (1993)), htrA (Johnson et al. MoI. Micro., 5:401-407 (1991)), htpR (Neidhardt et al. Biochem. Biophys. Res. Com., 100:894-900 (1981)), hsp (Neidhardt et al. Ann. Rev. Genet, 18:295-329 (1984)) 및 groEL (Buchmeier et al. Sci., 248:730-732 (1990)) 돌연변이; 특정 병독성 인자의 돌연변이, 예컨대 IsyA (Libby et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:489-493 (1994)), pag 또는 prg ([Miller et al. (1990), 상기 문헌 동일]; 및 [Miller et al. (1989), 상기 문헌 동일]), iscA 또는 virG (d'Hauteville et al. MoI. Micro., 6:833-841 (1992)), plcA ([Mengaud et al. Mol. Microbiol., 5:367-72 (1991)]; [Camilli et al. J. Exp. Med, 173:751-754 (1991)]), 및 act (Brundage et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:11890-11894 (1993)) 돌연변이; (v) DNA 토폴로지에 영향을 미치는 돌연변이, 예컨대 topA (Galan et al. Infect. Immun., 58: 1879-1885 (1990)); (vi) 세포 주기를 방해하거나 또는 변형시키는 돌연변이, 예컨대 min (de Boer et al. Cell, 56:641-649 (1989)); (vii) 자살 시스템을 코딩하는 유전자의 도입, 예컨대 sacB ([Recorbet et al. App. Environ. Micro., 59:1361-1366 (1993)]; [Quandt et al. Gene, 127:15-21 (1993)]), nuc (Ahrenholtz et al. App. Environ. Micro., 60:3746-3751 (1994)), hok, gef, kil, 또는 phlA (Molin et al. Ann. Rev. Microbiol., 47:139-166 (1993)); (viii) 리포폴리사카라이드 및/또는 지질 A의 생물발생을 변경시키는 돌연변이, 예컨대 rFb (Raetz in Esherishia coli and Salmonella typhimurium, Neidhardt et al., Ed., ASM Press, Washington D.C. pp 1035-1063 (1996)), galE (Hone et al. J. Infect. Dis., 156:164-167 (1987)) 및 htrB (Raetz, 상기 문헌 동일), msbB ([Reatz, 상기 문헌 동일]; 및 미국 특허 번호 7,514,089); 및 (ix) P22에 의해 코딩된 리소겐 (Rennell et al. Virol, 143:280-289 (1985)), 람다 무레인 트랜스글리코실라제 (Bienkowska-Szewczyk et al. Mol. Gen. Genet., 184:111-114 (1981)) 또는 S-유전자 (Reader et al. Virol, 43:623-628 (1971))와 같은 박테리오파지 용해 시스템의 도입을 포함한다.
약독화 돌연변이는 구성적으로 발현될 수 있거나, 또는 유도성 프로모터, 예컨대, 감온성 열 쇼크 계열의 프로모터 (Neidhardt et al. 상기 문헌 동일), 또는 혐기성 유도 nirB 프로모터 (Harbome et al. Mol. Micro., 6:2805-2813 (1992)), 또는 억제성 프로모터, 예컨대 uapA (Gorfinkiel et al. J. Biol. Chem., 268:23376-23381 (1993)) 또는 gcv (Stauffer et al. J. Bact, 176:6159-6164 (1994))의 제어 하에 있을 수 있다.
하나의 실시양태에서, 박테리아 균주는 살모넬라 티피무리움의 유도체 균주인 VNP20009이다. 그의 두 유전자 - msbB 및 purI -가 결실됨에 따라 (동물 숙주에서 독성 쇼크를 방해함으로써) 그는 완전히 약독화되었고, 생존을 위해 외부 퓨린 공급원에 의존하게 되었다. 이러한 의존성으로 인해 유기체는 간 또는 비장과 같은 정상 조직에서는 복제할 수 없지만, 퓨린이 이용가능한 종양에서는 여전히 성장할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 박테리아 균주는 SL3261 또는 χ11091이다.
벡터/플라스미드
본 조성물 및/또는 방법에서, DNA, RNA 및/또는 단백질은 재조합 방법에 의해 생산될 수 있다. 핵산은 발현을 위해 복제가능한 벡터에 삽입된다. 상기와 같은 다수의 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열 및 코딩 서열 중 하나 이상의 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 살모넬라에서, 유전자 및/또는 프로모터 (관심 서열)는 숙주 세포 염색체에 통합될 수 있거나, 또는 예를 들어, 플라스미드/벡터에 제공될 수 있다.
발현 벡터는 통상적으로 선택가능한 마커로도 명명되는 선택 유전자를 함유한다. 상기 유전자는 선택 배양 배지에서 성장한 형질전환된 숙주 세포의 생존 또는 성장에 필요한 단백질을 코딩한다. 선택 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되지 않은 숙주 세포는 배양 배지에서 생존하지 못할 것이다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라시클린에 대한 저항성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양소를 공급하는 단백질을 코딩한다.
발현 벡터는 숙주 유기체에 의해 인식되고 오픈 리딩 프레임을 코딩하는 핵산 서열과 같은 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유할 수 있다. 프로모터는 작동가능하게 연결된 특정한 핵산 서열의 전사를 제어하는 (일반적으로 약 100 내지 1000 bp 이내의) 구조 유전자의 시작 코돈의 상류 (5')에 위치하는 비번역 서열이다. 박테리아 세포에서, 전반적인 조절을 제어하는 영역은 오퍼레이터로 지칭될 수 있다. 프로모터는 전형적으로 유도성 프로모터 및 구성적 프로모터인 2가지 부류로 분류된다. 유도성 프로모터는 배양 조건의 일부 변화, 예를 들어, 영양소의 존재 또는 부재, 또는 온도 변화에 반응하여 그의 제어 하에 있는 DNA로부터 전사를 증가된 수준으로 개시하는 프로모터이다. 다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터는 널리 공지되어 있다.
원핵 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터로는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 하이브리드 프로모터 예컨대 tac 프로모터, 및 기아 프로모터를 포함한다 (Matin, A. (1994) Recombinant DNA Technology II, Annals of New York Academy of Sciences, 722:277-291). 그러나, 다른 공지된 박테리아 프로모터 또한 적합하다. 상기 뉴클레오티드 서열은 공개되어 있으며, 이로써, 통상의 기술자는 이를 DNA 코딩 서열에 작동가능하게 라이게이션할 수 있다. 박테리아 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 또한 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (S.D.: Shine-Dalgarno) 서열을 함유할 수 있다.
상기 열거된 성분 중 하나 이상을 것을 포함하는 적합한 벡터의 구축은 표준 라이게이션 기술을 사용한다. 단리된 플라스미드 또는 DNA 단편은 필요한 플라스미드를 생성하는데 필요한 형태로 절단, 맞춤 및 재-라이게이션된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 살모넬라에 사용하기에 적합한 플라스미드 또는 박테리오파지 벡터이고, the DNA, RNA 및/또는 단백질은 환자에게 투여된 조작된 살모넬라 (한 측면에서 약독화된 살모넬라)에 의한 발현을 통해 대상체에게 제공된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "플라스미드"는 발현가능한 유전자를 코딩하는 임의의 핵산을 지칭하며, 선형 또는 고리형 핵산 및 이중 또는 단일 가닥 핵산을 포함한다. 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있고, 변형된 뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 메틸화 또는 보호기 또는 캡 또는 테일 구조의 포함과 같은 수단에 의해 화학적으로 변형될 수 있다.
암 치료
박테리아, 예컨대 살모넬라는 고형 종양과 같은 암에 대해 자연적인 친화성을 가지고 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 치료할 수 있는 암 유형으로는 고형 종양, 예컨대, 육종 및 암종 (예를 들어, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골형성 육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 윤활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선 암종, 수질 암종, 기관지성 암종, 신세포 암종, 간종, 담관 암종, 융모막암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름 종양, 자궁경부암, 자궁암, 고환암, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관아세포종, 청신경종, 희소돌기신경교종, 청신경초종, 수막종, 흑색종, 신경아세포종, 및 망막아세포종)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 측면에서, 대상체는 본원에 기재된 박테리아 세포의 투여 이전, 이후, 또는 동안 방사선, 수술 및/또는 화학요법으로 치료된다.
투여
본 발명은 본원에 기재된 약독화된 살모넬라 균주의 투여 및 제약 조성물을 제조하는 방법 및 그를 투여하는 방법도 포함한다. 상기 방법은 본원에 기재된 약독화된 살모넬라 균주 중 하나 이상과 것과 함께 제약상 허용되는 담체를 제제화하는 것을 포함한다.
본 발명의 제약 조성물은 의도된 투여 경로에 적합하도록 제제화된다. 비경구, 피내 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분들: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 염수 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 장성 조절제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스를 포함할 수 있다. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨으로 조정될 수 있다. 비경구 제제는 앰플, 일회용 시린지 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다회 용량 바이알에 봉입될 수 있다.
정맥내 투여를 위해 적합한 담체로는 생리 식염수, 정균수, 크레모포르 EL(Cremophor EL)™ (바스프(BASF); 미국 뉴저지주 파시파니) 또는 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS)를 포함한다. 이는 제조 및 보관 조건 하에서 안정적이어야 하고, 다른 (원치않는) 미생물의 오염 작용으로부터 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌글리콜 등) 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액인 경우, 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 조성물 중 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 주사가능한 조성물을 장기간 흡수할 수 있다.
주사용 액제는 상기 논의된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매 중에 필요한 양으로 활성 화합물을 혼입시킴으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산제은 기본 분산 매질 및 상기 논의된 다양한 다른 성분을 함유하는 비히클에 활성 화합물을 혼입시킴으로써 제조된다. 주사용 액제 제조를 위한 산제의 경우, 바람직한 제조 방법은 상기의 것으로부터 활성 성분 플러스 원하는 임의의 추가적인 원하는 성분으로 이루어진 산제를 생성하는 진공 건조 및 동결 건조이다.
경구용 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 예를 들어, 젤라틴 캡슐에 봉입될 수 있다. 경구 치료 투여의 목적으로, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입될 수 있으며, 정제, 트로키 또는 캡슐 형태로 사용될 수 있다.
제약상 적합한 결합제 및/또는 애주번트 물질이 조성물의 일부로 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캡슐, 트로키 등은 하기 성분 또는 유사한 성질의 화합물 중 임의의 것을 함유할 수 있다: 결합제, 예컨대 미세결정질 셀룰로스, 트라가칸트 검 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 전분 또는 락토스, 붕해제, 예컨대 알긴산, 프리모겔, 또는 옥수수 전분; 활택제, 예컨대 스테아르산마그네슘, 스테로테스; 유동화제, 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예컨대 수크로스 또는 사카린; 또는 향미제, 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향료.
흡입에 의한 투여를 위해, 박테리아는 적합한 추진제, 예를 들어, 이산화탄소와 같은 가스 또는 분무기를 함유하는 가압 용기 또는 디스펜서로부터 에어로졸 스프레이 형태로 전달된다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의해 이루어질 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 투과되는 장벽에 적합한 침투제가 제제에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 경점막 투여의 경우, 계면활성제, 담즙염 및 푸시드산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌제를을 사용하여 수행할 수 있다. 경피 투여의 경우, 박테리아는 관련 기술분야에 일반적으로 공지된 바와 같이 연고, 고약, 겔 또는 크림으로 제제화된다.
투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 조성물을 투여량 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유익하다. 본원에 사용된 바와 같이, 투여량 단위 형태란, 치료하고자 하는 대상체를 위한 단위 투여량으로서 적합화된 물리적으로 분리된 단위로서; 각각의 단위는 필요한 제약 담체와 함께 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리결정된 양의 활성 화합물을 함유하는 것인 단위를 지칭한다. 본 발명의 투여량 단위 형태에 대한 상세한 사항은 활성 화합물의 고유한 특징 및 달성하고자 하는 특정한 치료 효과, 및 개체의 치료를 위해 상기 활성 화합물을 배합하는 기술에 있어서의 고유의 한계점에 의해 좌우되고, 여기에 직접적으로 의존한다.
환자에게 투여될 때, 약독화된 살모넬라는 단독으로 사용될 수 있거나 또는 임의의 생리학적 담체와 함께 조합될 수 있다. 일반적으로, 투여량은 약 1.0 c.f.u./kg 내지 약 1x1012 c.f.u./kg; 임의적으로 약 1.0 c.f.u./kg 내지 약 1x1010 c.f.u./kg; 임의적으로 약 1.0 c.f.u./kg 내지 약 1x108 c.f.u./kg; 임의적으로 약 1x102 c.f.u./kg 내지 약 1x108 c.f.u./kg; 임의적으로 약 1x104 c.f.u./kg 내지 약 1x108 c.f.u./kg; 임의적으로 약 1x105 c.f.u./kg 내지 약 1x1012 c.f.u./kg; 임의적으로 약 1x105 c.f.u./kg 내지 약 1x1010 c.f.u./kg; 임의적으로 약 1x105 c.f.u./kg 내지 약 1x108 c.f.u./kg 범위이다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 특정 실시양태 및 측면을 입증하고 추가로 설명하기 위해 제공되며, 그의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 I
자생적 종양의 비독성 전신 콜로니화를 위해 조작된 살모넬라 엔테리카 티피무리움
도입
임상전 연구에서, 수많은 항암 기전을 발현하도록 유전적으로 조작된, 병독성이 약독화된 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피무리움 (에스. 티피무리움) 균주는 효능을 입증하였다 (1). 임상전 연구는 미리 형성된 암 조직의 이식 또는 암 세포주 주사로 종양이 발생하는 마우스 모델에 주로 의존해 왔다. 이 종양은 설치류에서 빠르게 발생하는 바, 종양 발생 후 몇 주 이내에 안락사가 요구된다. 이러한 종양의 콜로니화는 강건하며, 종종 종양 조직 1 g당 박테리아 콜로니 형성 단위 (cfu)가 1x109 초과에 이른다 (2).
불행하게도, 정맥내 에스. 티피무리움 암 요법의 초기 임상 시험은 부분적으로 자생적 (자발적) 인간 종양의 박테리아 콜로니화가 불량하였기 때문에 실망스러웠다 (3-5). 임상전 이식 종양 모델과 대조적으로, 자발적 종양은 보다 성숙한 혈관구조와 제한된 괴사 공간으로 수개월에서 수년에 걸쳐 발생하며 (6,7), 이는 임상 시험에서 볼 수 있는 박테리아의 콜로니화가 상대적으로 불량한 이유일 수 있다. 많은 약독화된 살모넬라 균주가 임상전 박테리아 암 요법 연구에 사용되었지만, 이들 중 어느 것도 전신 전달에 의한 자생적 종양의 콜로니화에 최적화되지 않았다. 살모넬라 암 요법에 대해 공개된 거의 모든 연구는 이식된 암 조직 또는 암 세포 볼루스에서 발생한 종양을 수반하는 동물 모델에서 이루어졌다. 최근 예로는 VNP20009 (8,9), A1-R (10,11), SL3261 (12,13) 및 v4550 (14,15)을 포함한다. 또한, 이러한 연구 중 상당수는 반드시 면역결핍 동물에서 수행된다. 예를 들어, 환자 유래 동소 이종 이식 마우스 모델에서 살모넬라 티피무리움 균주 A1-R을 사용한 실험 (16)은 자생적 종양의 콜로니화를 모방하지 않으며, 무손상 면역계를 갖는 환자의 면역 반응을 정확하게 평가하지 못할 수도 있다.
이전 연구에서는 유전적으로 조작된 마우스 모델 (GEMM)에서 자생적 종양의 강건한 박테리아 콜로니화가 혈관구조 파괴제 (VDA)로 종양을 전처리하여 괴사 공간 증가를 확립함으로써 개선될 수 있다는 것이 밝혀졌다 (17). 그러나, 박테리아의 투여량을 증가시켜 VDA 조절 자생적 종양의 일관되고, 포괄적인 콜로니화를 달성하려는 시도는 독성으로 인해 제한되었다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 본원에서는 면역원성이 더 낮는 조작된 에스. 티피무리움 균주를 제공한다. 본원에서는 전신 독성이 감소되고, VDA로 조절된 자생적 종양의 강건한 콜로니화를 가능하게 하는 에스. 티피무리움 균주의 개발에 대한 보고가 기재되어 있다.
물질 및 방법
플라스미드의 특징은 표 1에 열거되어 있다. 플라스미드 pNG는 플라스미드 pYA292 (18)의 EcoRI/HindIII 분해 및 LacZ-알파 펩티드의 발현을 제거하기 위해 필링된(filled-in) 단부를 라이게이션시켜 재고리화함으로써 구축되었다. 플라스미드 pLux는 프라이머 LacFwd 및 LacRev를 사용하여 LacUV5 프로모터 서열을 함유하는 pYA292로부터의 PCR 생성 단편을 프라이머 LuxFwd 및 LuxRev를 사용하여 플라스미드 pAKlux2 (19)로부터 PCR에 의해 증폭된 luxCDABE 오페론에 라이게이션시켜 구축되었다. 플라스미드 pPflEPLux 및 pFF + 20*Lux는 플라스미드 pLux 중의 LacUV5 프로모터를 종양 특이적 프로모터 PflEP (20) 및 FF + 20*(21)로 대체하여 구축되었다. PflEP 및 FF + 20*서열을 갖는 gBlock을 DraIII 및 BlpI로 분해하였다. 생성된 단편을 DraIII 및 BlpI로 분해되고, 알칼리성 포스파타제로 처리된 pLux에 라이게이션시켰다. 제한 효소 분해, 라이게이션 및 알칼리성 포스파타제 처리는 제조업체의 가이드라인 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs: 미국 매사추세츠주 입스위치))을 따라 진행하였다. 프라이머 및 gBlock은 인터그레이티드 DNA 테크놀러지즈(Integrated DNA Technologies: 미국 아이오와주 코랄빌)로부터 입수하였다. 플라스미드 구축에 사용되는 모든 합성 분자의 DNA 서열에 대해서는 표 2를 참조한다.
박테리아 균주
관련 유전자형 및 공급원을 비롯한 박테리아 균주가 표 1에 열거되어 있다. 에스. 티피무리움 균주 VNP20009는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American 타입 Culture Collection) (ATCC #202165)으로부터 입수하였다. 균주 SL3261은 살모넬라 제네틱 스톡 센터(Salmonella Genetic Stock Centre) (SGSC #439)로부터 입수하였다. 파지 k Red 재조합 효소 방법 (22)과 두 개의 PCR 프라이머 DSfwd 및 DSrev (표 2)를 사용하여 SL3261의 염색체로부터 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제 (asd) 유전자를 결실시켜 균주 BCT1을 구축하였다. 종양 콜로니화를 측정할 때, 박테리아를 생물발광을 위한 lux 오페론 (23)을 포함하는 플라스미드로 형질전환시켰다. 에스. 티피무리움 균주 BCT2는 χ11091로부터 fliC, fljB, fimH, 및 rfaL 유전자를 결실시키고 (24), χ11091 염색체 중 pgtE 프로모터에 단일 뉴클레오티드 변이를 도입하여 구축하였다. DIRex 방법 (25)에 의해 χ11091에 상기 돌연변이를 도입하는데 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머가 표 2에 열거되어 있다.
박테리아 성장 조건
BCT1을 수반하는 실험의 경우, 균주를 플라스미드 pNG로 형질전환시키고, 신선한 중간 로그 단계 용원성 브로쓰-밀러 (LB) 배양물로부터 박테리아 주사액을 제조하였다. 배양물을 4℃에서 5 min 동안 3,500xg로 원심분리하여 수확하였다. 세포 펠릿을 냉각된 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS) 중에 재현탁시키고, 펠릿화한 후, 필요한 농도로 다시 재현탁시켰다. 균주 BCT2 또는 VNP20009를 수반하는 실험의 경우, 균주 BCT1(pNG)에 대해 명시된 바와 같이 배양물을 성장시켜 박테리아 주사액을 제조하였지만, 최종 세포 재현탁액을 냉각된 20% 글리세롤/PBS (부피/부피) 중에 있었고, 세포 샘플을 -80℃에서 보관하였다. 냉동된 글리세롤 스톡을 해동시키고, 사용 전에 원하는 농도로 PBS에 희석하였다. 동물 주사 후, 주사된 박테리아 1 ml당 콜로니 형성 단위 (cfu)는 37℃에서 LB 아가에 희석 플레이팅하여 확인하였다.
동물 실험
BALB-neuT 콜로니 유지 및 사육은 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (26). 각 데이터 점에 사용된 마우스 마리수는 도면 캡션에 제공되어 있다. 외부 캘리퍼를 이용하여 종양을 측정하고, 0.5(길이x너비2)로 종양 부피를 계산하였다. 모든 작용제는 개별 실험에 명시된 농도 및 투여 스케줄에 따라 PBS 중 100 마이크로리터 주사에 의해 마우스에게 비경구적으로 투여하였다. 박테리아를 꼬리 정맥 (IV)에 주사하였다. 명시된 바와 같이 혈관 파괴제 (VDA)를 IV 또는 복강내로 (IP) 주사하였다. VDA 콤브레타스타틴 A4 포스페이트 (CA4P; SF204, 셀렉(Selleck))를 IV 투여하고, VDA CKD-516 (A07.020.548, 오로라 파인 케미칼즈(Aurora Fine Chemicals))은 IP 투여하였다. 항-인터류킨-6 (IL-6) 단일클론 항체 (MP5-20F3, 바이오X셀(BioXCell))는 IP 주사하였다. 발광 박테리아로 처리된 마우스에서 종양의 휘도를 측정하기 위해, 마우스를 산소 중 3%의 이소플루란 흡입으로 마취시키고, 리빙 이미지(Living Image) 소프트웨어 (퍼킨엘머(PerkinElmer))와 함께 IVIS 스펙트럼 생체내 이미징 시스템을 사용하여 이미지화하였다. 60 s 동안 총 플럭스 (발광)를 획득하고, 관심 종양에 대한 휘도 (광자/sec/㎠/sr)로 기록하였다.
약어
에스. 티피무리움: 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피무리움; GEMM: 유전적으로 조작된 마우스 모델; VDA: 혈관 파괴제; LB: 용원성 브로쓰-밀러; PBS: 포스페이트-완충처리된 염수; cfu: 콜로니 형성 단위; IV: 정맥내; IP: 복강내; CA4P: 콤브레타스타틴 A-4 포스페이트; IL-6: 인터류킨-6; CRS: 시토카인 방출 증후군; PAMP: 병원체-연관 분자 패턴.
결과
고유한 에스. 티피무리움 독성의 제거
인간 임상 시험에서의 최대 허용 용량 추정을 위해, 독성학 문헌에서는 설치류에서의 단기 (7일) 제약 투여 연구에서 급성 체중 감소의 상한을 10%로 정의한다 (27). VDA와 함께 에스. 티피무리움 균주 BCT1 (pNG)를 IV 투여하였을 때 관찰되는 독성은 시토카인 방출 증후군 (CRS)으로 인한 것일 수 있다고 의심하면서, 인터류킨-6 (IL-6) 수용체 활성화에 대해 길항성인 항체를 투여하는 것을 수반하는, CRS로 인한 독성을 완화시키는 것으로 보고된 요법을 적용하였다 (28). 항-IL-6 항체로 처리된 마우스는 1x106 cfu 에스. 티피무리움 균주 BCT1 (pNG) 플러스 VDA의 IV 투여를 허용하였고, 여기서 항-IL-6 항체로 처리되지 않은 경우, 체중 감소가 허용불가능한 18%이고, 마우스 3마리 중 2마리가 사망한 것과 비교하여 양성 독성 (<10% 체중 감소)을 보였다 (도 1, 칼럼 4 및 5). 5x105 cfu 박테리아 투여는 독성은 더 적었지만, 항-IL-6 항체로 처리된 마우스 또는 처리되지 않은 마우스와 비교하였을 때, 퍼센트 체중 감소에서의 차이는 유사한 것으로 관찰되었다 (도 1, 칼럼 2 및 3).
IL-6 신호 전달 차단으로 인한 독성 감소가 관찰되었을 때, 면역 세포로부터 IL-6 분비를 유도하는 것으로 공지된 에스. 티피무리움 표면 분자를 코딩하는 유전자를 돌연변이화하여 양성 독성 하에 증가된 양으로 박테리아를 투여할 수 있고, CRS를 방지할 수 있었다. 폴레이트 영양요구성에 의해 병독성이 약독화되고, 톨-유사 수용체 4의 리포폴리사카라이드 활성화가 감소되도록 조작된 균주인 에스. 티피무리움 χ11091 (24)을 시작으로 IL-6 분비 유도를 담당하는 추가적인 표면 분자를 코딩하는 유전자를 결실시켰다. 핌브리아에의 말토스 수용체 결합 어드헤신 서브유닛을 코딩하는 fimH와 같이 (30), 플라젤린 유전자 fliC 및 fljB를 결실시켰다 (29). 또한, rfaL의 결실에 의해 O-항원을 제거하였다 (31,32). 최종으로, pgtE에 대한 전사 프로모터 서열을 변경하여 보체 활성화를 억제하는 PgtE 외막 프로테아제의 발현을 증가시켰다 (33). 생성된 균주를 BCT2로 명명하였다 (도 2).
균주 BCT2의 독성
비-종양 부하된 마우스를 사용하여 에스. 티피무리움 암 요법에 관한 다수의 임상전 연구 및 여러 임상 시험에서 사용되는 균주인 균주 VNP20009와 비교하여 균주 BCT2의 독성을 시험하였다 (1,3-5). 비-종양 부하된 마우스를 1x106 cfu의 이들 균주로 처리한 결과, BCT2(pPflEPLux)의 경우, 체중 감소가 5% 미만이고, VNP20009의 경우, 체중 감소가 10% 미만이었다 (도 3). 본 실험에서는 염색체 asd 돌연변이를 보완하기 위해 asd 유전자의 공급원으로서 pPflEPLux 플라스미드를 사용하였고, 그 결과로 비항생제 균형잡힌 치명적인 플라스미드 유지가 이루어졌다 (34). 1x107 cfu의 BCT2(pPflEPLux)로 처리하였을 때, 3일 후 체중이 약 12% 감소하였지만, 7일 후에는 약 10%의 체중 감소로 회복되었다. 1x107 cfu의 균주 VNP20009로 동일하게 투여하였을 때, 3일 후 체중이 15% 감소하였고, 7일 후에는 거의 25% 체중이 감소하였다 (도 3). 이러한 결과는 균주 BCT2가 균주 VNP20009보다 독성이 유의적으로 더 낮다는 것을 시사하는 것이다.
박테리아 콜로니화를 위한 종양 혈관구조 조절
에스. 티피무리움과 같은 통성 혐기성균의 콜로니화를 위하여 종양내 저산소 괴사 공간을 증가시키기 위해 종양-부하된 마우스를 VDA로 전처리하였을 때, 3x106 cfu의 균주 BCT2(pFF + 20*Lux) 투여 시 처리된 모든 마우스에서 적어도 하나의 종양의 콜로니화도 이루어지지 않았다 (데이터 제시되지 않음). pFF + 20*Lux 플라스미드는 염색체 asd 돌연변이를 보완하기 위해 asd 유전자 및 전신 생물발광에 의해 박테리아를 추적하기 위해 발현된 lux 오페론을 포함한다. 따라서, VDA 전처리 이외에도, 종양 중 박테리아를 '트래핑'하기 위해 박테리아 투여 후 VDA를 첨가하였다. -4, -3, -2 및 -1일차에 VDA를 제공한 후, 0일차에 투여된 3x106 cfu 균주 BCT2(pFF + 20*Lux)의 독성 및 콜로니화를 3x106 cfu 박테리아의 펄스 주사 1시간 후 VDA를 IP 투여한 것과 함께 시험하였다. 상기 프로토콜 결과, 모든 마우스에서 양성 독성 및 종양 콜로니화만이 이루어졌다 (도 4).
논의
박테리아는 다수의 의료 적용을 위해 사용되어 왔지만, 박테리아를 표적 조직에 전달하고, 항-박테리아 반응으로 인한 독성을 회피하는 것은 어려운 일이었다. 박테리아 요법의 한 가지 적용은 인간 및 다른 동물에서 살모넬라증 치료용 백신 균주로서 살모넬라 기반 균주를 개발하는 것이다 (35). 이러한 경우, 박테리아를 전신 투여할 때, 독성이 심각한 문제가 된다. 독성을 감소시키고자 하는 시도는 리포폴리사카라이드 내독소 또는 편모의 면역원성을 약화시키는데 중점을 두었다 (35-37). 균주 χ11091 (도 2)에서와 같이 지질 A 합성을 코딩하는 유전자를 돌연변이화시킴으로써 에스. 티피무리움의 독성이 실질적으로 감소되었다.
백신 균주 개발 외에도 박테리아의 또 다른 적용은 고형 종양 치료에 있다 (38). 암 요법에 특이적인, 미생물 기반 암 요법의 '성배'는 비-독성 방식으로 고형 종양의 강건한 콜로니화를 통한 전신 전달이다 (39). 본 실험에 사용된 박테리아로는 종양의 저산소 괴사 공간에서 성장할 수 있는, 에스. 티피무리움, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 및 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens)를 포함한다. 박테리아 항-암 잠재능에 대한 임상전 연구는 주로 마우스의 이식 종양 모델에서 에스. 티피무리움의 사용에 중점을 두었다 (38). 본 실험에서 종양 콜로니화는 강건한 바, 따라서, 치료를 위해 더 적은 수의 박테리아가 필요하고, 그 결과로 독성은 거의 없거나, 또는 전혀 없다. 이러한 임상전 연구에서는 여러 가지 상이한 유형의 고형 종양에 대해 효능과 관련하여 매우 유망한 결과가 보고되었다.
에스. 티피무리움 암 요법의 초기 임상 시험에서 아미노산 영양요구성에 의해 병독성이 약독화되고, 리포폴리사카라이드 독성이 감소된 균주인 VNP20009를 정맥내로 투여하였다 (4). 연구자들은 효능의 결여를 보고하였고, 종양의 콜로니화를 증가시키기 위해서는 박테리아 용량을 증가시켜야 하지만, 박테리아의 독성을 극복하여야 한다고 제안하였다. 상기 시험에서 관찰된 용량-제한 독성은 플라젤라 및 핌브리아에와 같이 유기체의 면역원성이 높은 병원체 연관 분자 패턴 (PAMP) 분자 대부분이 무손상 상태 그대로 남아 있기 때문에 유기체에 대한 전신 면역 반응의 과도한 자극으로 인한 것일 수 있다 (40). 이식된 종양을 이용한 임상전 시험에서 VNP20009 균주를 성공적으로 적용했음에도 불구하고, 종양 콜로니화 및 독성은 임상 시험에서 제한이 있었는데, 이는 임상전 결과를 인간 시험으로 전환시키는데 어려움이 있다는 것을 보여주는 것이다.
임상전 연구에 사용된 이식 종양 모델과 달리, 인간 종양은 시간, 혈관구조 및 괴사 공간과 관련하여 다르게 발생하며, 이는 임상전 마우스 연구에서 인간 시험으로의 전환의 결여를 설명할 수 있다. 면역적격 BALB-neuT 마우스와 같은 자생적 종양 모델을 임상전 연구에 사용하는 것은 인간에서 발생하는 종양과 더 유사하기 때문에 더욱 큰 관련성을 갖고 있다. 이는 바로 본 발명자들이 본 발명자들의 연구에서 자생적 모델을 사용한 이유이다. 그러나, 마우스의 이식 종양과 비교하기 위해 자생적 종양의 콜로니화를 사용했을 때, VDA를 사용하여 종양의 괴사 공간을 증가시키지 않는 한, 콜로니화가 몇 자릿수 더 적은 것으로 관찰되었다 (17). 따라서, 자생적 종양의 강건한 콜로니화를 달성하기 위해서는 치료에 사용되는 박테리아의 개수 및 종양 내 괴사 공간의 양을 최적화시켜야 하고, 그에 따라 생성된 독성도 해결하여야 한다.
에스. 티피무리움을 자생적 종양을 전신으로 표적화하는데 사용하려면, 독성이 과도하게 자극된 전신 항박테리아 면역 반응의 유도를 회피하여야 한다. 박테리아 표면 상의 PAMP 분자는 종양 미세환경에서 항종양 면역 반응을 효과적으로 자극할 뿐만 아니라 허용불가능한 독성을 초래하는 전신 면역 반응을 유도할 것이다. 면역 자극 PAMP를 코딩하는 유전자를 파괴하여 박테리아를 변형하면 최소한의 독성으로 종양 미세환경에 치료 분자를 분비하는 생물학적 공장으로 사용할 수 있을 것이다.
IV 투여된 에스. 티피무리움으로 인한 독성을 해결함으로써 PAMP 발현에 수반된 여러 유전자가 파괴되고 (29-31), 보체 활성화를 감소시키는 돌연변이 (33)를 포함하는 유전적으로 조작된 유기체인 BCT2를 구축하게 되었다. 혈관 파괴제와 함께 조합하였을 때, 상기 균주는 임상전 연구에서 자생적 종양의 강건한 비-독성 콜로니화를 촉진시킨다.
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실시예 II
면역조정제를 분비하도록 조작된 병독성이 약독화된 살모넬라가 유방암의 자생적 마우스 모델에서 종양 성장을 감소시키고, 생존을 증가시킨다.
도입
최근까지, 암을 치료하기 위한 주된 방법은 수술, 방사선, 화학요법을 포함하였다. 네 번째 치료 전략법인 면역요법이 빠르게 부상하고 있으며, 널리 채택되고 있다. 그러나, 암의 재발을 공격하고, 보호하도록 면역계를 자극하면 전신 면역 반응의 위험한 과도한 활성화로 인해 방해를 받아 건강한 조직이 허용불가능한 정도로 파괴되고, 심각한 전신 독성이 발생할 수 있다 [1]. 종양 미세환경에 대한 면역계를 조정하는 표적화 분자는 전신 독성을 방지하고, 항암 면역요법의 잠재능을 증가시킬 수 있다 [2]. 본원에서는 종양의 비독성 콜로니화 [18] 및 면역조정제 전달을 위한 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피무리움 (에스. 티피무리움)의 병독성이 약독화된 균주를 제공한다.
본 접근법의 치료 가능성을 입증하기 위해, 본원에서는 시토카인 및 2개의 면역 체크포인트 억제제의 조합 전달을 제공한다. 인터류킨-15 초효능제 IL-15Ra-IL-15 (RLI) [3]는 항-CTLA4 및 항-PD-L1 면역 체크포인트 억제제의 조합과 유사하게 [5], 강력한 항암 효능을 제공할 수 있는 그의 독성 제한 능력 때문에 선택되었다 [4]. 게다가, 본 요법은 성공적인 임상적 전환 가능성을 더욱 엄격하게 시험하기 위해 이식 암 모델보다는 자생적 유방암 모델에서 시험하였다. 자생적 종양 발생을 통해 혈관화는 더욱 성숙화될 수 있고, 그 결과로 괴사 공간은 감소된다. 따라서, 투여된 박테리아가 콜로니화할 수 있도록 괴사 공간을 증가시키기 위해 혈관구조 파괴제 (VDA)를 포함하였다 [6]. VDA로 유발된 괴사 공간을 확장 및 유지하고, 박테리아로 유발된 임의의 급성 전신 염증 반응을 감소시키기 위해, 칸나비디올 (CBD)을 그의 항-혈관신생 및 항-염증 특성을 위해 포함하였다 [7, 8].
본원에서는 면역조정제가 종양 미세환경으로 직접 표적화된 방식으로 분비되도록 조작된 비병독성 에스. 티피무리움의 항암 효능에 대한 보고를 개시한다. 이들 박테리아는 면역 자극 분자의 전신 투여로 인해 발생하는 암 면역요법에 내재된 독성 반응을 유발하지 않는다.
물질 및 방법
플라스미드
본 연구에 사용된 플라스미드는 항-암 요법을 위해 시험될 수 있는 다양한 면역조정제를 발현하고 분비하도록 디자인되었다 (표 1). 플라스미드 pYA292 중 Trc 프로모터 및 LacZ알파 서열 [9]을 FF+20* [10] 촉진된 오페론으로 대체하여 플라스미드를 구축하였다. 종양-특이적 유전자 발현을 위해 FF+20* 프로모터를 사용하였다. 오페론은 FF+20* 프로모터, 이. 콜라이 헤모리신 분비 단백질 HlyB 및 HlyD를 코딩하는 cDNA 서열로 이어지는 C-말단 60개 아미노산 이. 콜라이 HlyA 분비 신호를 프레임 내에 포함하는 면역조정제 cDNA 서열 [11]로 이루어졌다 (도 6). 플라스미드 pFF+20*IL15Hly, pFF+20*αCTLA4Hly 및 pFF+20*αPDL1Hly는 그의 완전한 DNA 서열을 포함하여 애드진(Addgene)에 기탁되었다. pFF+20*IL15Hly 중의 IL-15 서열은 RLI로부터 모델링된 것이다 [3]. 플라스미드 pORF9-mIL15RAa (인비보젠(InvivoGen) 카탈로그 porf-mil15raa)로부터 PCR에 의해 단리된 뮤린 IL-15Ra 스시 도메인을 20개 아미노산 RLI 가요성 링커를 통해 플라스미드 pORF9-mIL15 (인비보젠 카탈로그 porf-mil15)로부터 PCR에 의해 단리된, 뮤린 IL-15 유전자를 코딩하는 cDNA에 연결하였다. 제2의 18개 아미노산 글리신/세린이 풍부한 가요성 링커, GQSSRSSGGGGSSGGGGS [12]를 사용하여 IL-15의 C-말단 아미노산을 HlyA 신호 서열의 C-말단의 60개 아미노산에 연결하였다. C-말단 6x히스티딘 및 헤마글루티닌 태그를 포함하는 항-CTLA-4 및 항-PD-L1 scFv cDNA 서열을 이전에 기재된 바와 같이 [13], 면역화된 닭 항체 라이브러리로부터 단리시켰다. 이를 그의 C-말단 아미노산에서 C-말단 60 아미노산 HlyA 신호 서열에 직접 연결시켰다. 각각 역방향 및 정방향 프라이머 TTAGCCTATGGAAGTCAGGGTAATC 및 TTAACGCTCATGTAAACTTTCTGTTAC를 사용하여 플라스미드 pNirB-PAop-hlyAs [14]로부터 PCR에 의해 각 면역조정제 플라스미드 중의 이. 콜라이 헤모리신 오페론 서열을 단리시켰다. 면역조정제 발현 및 분비의 웨스턴 분석을 위해, FF+20* 프로모터 및 컨센서스 AGGAGG 샤인-달가노 서열로부터 바로 상류에 있는 서열을 pLacUV5IL15Hly 중의 LacUV5 프로모터 [15] AGATCTTCCGGAAGACCTTCCATTCTGAAATGAGCTGTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACAAT 뿐만 아니라 pTrcaCTLA4Hly 및 pTrcaPDL1Hly 중의 Trc 프로모터 [16] AGATCTTCCGGAAGACCTTCCATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACAAT를 함유하는 서열에 의해 대체하였다.
모든 플라스미드는 균주 χ4550 및 BCT2 중의 Dasd 돌연변이를 보완하기 위한 asd 유전자를 함유하였다.
표 1. 박테리아 균주 및 플라스미드
박테리아 균주
관련 유전자형 및 공급원을 비롯한 박테리아 균주가 표 1에 열거되어 있다. 균주 χ4550을 pLacUV5IL15Hly, pTrcαCTLA4Hly 또는 pTrcαPDL1Hly로 형질전환시켜 3개의 균주를 확립함으로써 3개의 면역조정제 단백질의 발현 및 분비를 연구하였다. 균주 BCT2를 플라스미드 pFF+20*Lux, pFF+20*IL15Hly, pFF+20*αCTLA4Hly 또는 pFF+20*αPDL1Hly로 형질전환시켜 효능 및 독성 실험을 위한 4개의 균주를 확립하였다. 단일 pFF+20*Lux 형질전환 균주 (BCT2pLux), 또는 조합된 4개의 모든 균주 (BCT2pQuad) (종양 콜로니화를 모니터링하기 위해 BCT2pLux를 포함)를 이용하여 실험을 수행하였다.
단백질 발현의 분석
면역조정제 플라스미드로 형질전환된 균주 χ4550의 단일 콜로니를 50 ml의 용원성 브로쓰-밀러 (LB)에 접종하였다. 배양물을 600 nm에서 ~ 6.0의 광학 밀도까지 37℃에서 ~ 17시간 동안 통기하면서 성장시켰다. 20 ml의 배양물을 4℃에서 20분 동안 4000xg로 수확하고, 배양 배지를 보관하였다. 박테리아 펠릿을 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS) 중에 재현탁시키고, 원심분리하고, PBS 2 ml 플러스 1x Halt 프로테아제 억제제 (써모 피셔(Thermo Fisher) 카탈로그 78430) 중에 재현탁시켰다. 배양 배지를 0.2 μm 필터를 통해 진공여과하고, 10 kDa 컷오프 밀리포어 아미콘(Millipore Amicon) 원심분리 필터 (밀리포어, UFC901024)를 통해 원심분리하여 약 400 μl로 농축시킨 후, PBS를 이용하여 최종 부피 2 ml로 희석하였다. 재현탁된 박테리아 세포 (원래 2 ml 중 0.5 ml)를 소닉 디스멤브레이터(Sonic Dismembrator) (다이나테크 라보라토리즈(Dynatech Laboratories), 모델 300)를 사용하여 얼음 위에서 15초 동안 40% 전력으로 6회에 걸쳐 초음파처리하고, 12분 동안 21,000xg로 원심분리하였다. 10 μl의 6X 로딩 완충제 (보스톤 바이오프로덕츠(Boston Bioproducts) 카탈로그 BP-111R)를 50 μl 분취량의 (가용성 세포 단백질을 나타내는) 초음파처리 상청액 및 농축된 배양 배지에 첨가하고, 샘플을 비등 수조에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 각각의 비등된 샘플 (25 μl)을 트리스-트리신(Tris-Tricine) 10% 내지 20% 구배 폴리아크릴아미드 겔에서 분석하였다. 단백질을 전기영동에 의해 PVDF 막으로 옮기고, 이에 대해 웨스턴 분석을 수행하였다. 본 실험에서 사용된 1차 항체는 마우스 항-DnaK (엔조 라이프 사이언시스(Enzo Life Sciences) 카탈로그 ADI-SPA-880), 래트 항-마우스-IL15 (R&D 시스템즈(R&D Systems) 카탈로그 MAB447) 또는 마우스 항-His 태그 (바이오레전드(BioLegend) 카탈로그 65201)였다. 2차 항체는 염소 항-마우스 (LI-COR IRDye 680RD 카탈로그 926-68070) 또는 염소 항-래트 (LI-COR IRDye 800CW 카탈로그 926-32219)였다.
동물 실험
동물 실험을 위해, 주사에 사용된 박테리아 배양물은 pFF+20*Lux, pFF+20*IL15Hly, pFF+20*αCTLA4Hly 또는 pFF+20*αPDL1Hly를 함유하는 균주 BCT2의 신선한 중간 로그 단계의 LB 배양물로부터 제조하였다. 배양물을 4℃에서 5 min 동안 3,500xg로 원심분리하여 수확하였다. 세포 펠릿을 냉각된 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS) 중에 재현탁시킨 후, 이어서 냉각된 20% 글리세롤/PBS (부피/부피) 중에 재현탁시켰다. 세포 샘플을 -80℃에서 보관하였다. 냉동된 글리세롤 스톡을 해동시키고, 사용 전에 원하는 농도로 PBS에 희석하였다. -80℃에서 보관하기 전, 및 동물 주사 후, 주사된 박테리아 1 ml당 콜로니 형성 단위 (cfu)는 37℃에서 LB 아가에 희석 플레이팅하여 확인하였다.
BALB-neuT 콜로니 유지 및 사육은 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 [20]. 독성을 측정하기 위해, 마우스의 체중을 측정하고, 이동성 감소 및 헝클어진 털에 대해 관찰하였다. 외부 캘리퍼를 이용하여 종양을 측정하고, 0.5(길이 x 너비2)로 종양 부피를 계산하였다. 종양이 2 cm3를 초과할 때마다 마우스를 안락사시켰다. 모든 작용제는 개별 실험에 명시된 농도 및 투여 스케줄에 따라 PBS 중 100 μl 주사에 의해 마우스에게 비경구적으로 투여하였다. -2일차에, 마우스에 4 mg/kg VDA (CKD-516, 오로라 파인 케미칼즈 카탈로그 A07.020.548) 및 50 mg/kg CBD (99% 순수 결정 CBD, 엔도카 USA(Endoca USA)))를 단일 복강내 주사로 투여하였다. 0일차에, 마우스의 측면 꼬리 정맥 (IV)에 1.5 x 106 cfu 박테리아를 주사하고, 3시간 후에 1.5 x 106 cfu 박테리아를 추가로 IV 주사하였다. 이 순서는 1시간 후에 2 mg/kg VDA + 50 mg/kg CBD의 IP 주사로 이어졌다. 마우스를 대조군으로 BCT2pLux 단독으로 또는 BCT2pQuad로 처리하였다. BCT2pQuad를 사용한 경우, 4가지 박테리아 균주를 각각 동일한 양으로 혼합하여 1.5 x 106 cfu 주사 농도를 달성하였다.
발광 박테리아로 처리된 마우스에서 종양의 휘도를 측정하기 위해, 마우스를 산소 중 3%의 이소플루란 흡입으로 마취시키고, 리빙 이미지 소프트웨어 (퍼킨엘머)와 함께 IVIS 스펙트럼 생체내 이미징 시스템을 사용하여 이미지화하였다. 60초 동안 총 플럭스 (발광)를 획득하고, 관심 종양에 대한 휘도 (광자/sec/㎠/sr)로 기록하였다.
약어
에스. 티피무리움: 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피무리움; VDA: 혈관 파괴제; LB: 용원성 브로쓰-밀러; PBS: 포스페이트-완충처리된 염수; cfu: 콜로니 형성 단위; IV: 정맥내; IP: 복강내; IL-15: 인터류킨-15; CBD: 칸나비디올; MTD: 최대 허용 용량.
결과
면역조정제 분비.
헤모리신 타입 I 분비 장치를 통한 면역조정제의 분비를 시험하였다. 플라스미드 pLacUV5IL15Hly 또는 pTrcαCTLA4Hly 또는 pTrcαPD-L1Hly로 형질전환된 에스. 티피무리움 균주 χ4550에서 발현된 면역조정제 단백질의 웨스턴 분석을 통해 3가지 면역조정제 모두 분비된 것으로 확인되었다 (도 7). 박테리아 초음파처리 (B)에는 세포내 DnaK 단백질이 존재하지만 배지 (M)에는 존재하지 않는 것은 배지 (M)에서 관찰된 면역조정제 단백질 밴드가 박테리아 용해보다는 분비에 기인하는 것임을 나타낸다. 게다가, 이들 분비된 면역조정제는 생물학적으로 활성인 것으로 확인되었다 (데이터는 제시되지 않음).
앞서, lux 오페론의 전사를 구성적으로 촉진시킨 LacUV5 프로모터를 종양-특이적 FF+20* 프로모터 [10]로 대체한 결과, lux 오페론의 종양-특이적 발현이 발생한 것으로 관찰되었다 [19]. 따라서, 시험관내에서 면역조정제 단백질의 분비를 확인한 후, 이들 플라스미드 중 LacUV5 및 Trc 프로모터를 FF+20* 프로모터로 대체하였다. 면역조정제의 발현을 종양 미세환경으로 국한시키는 것을 이용하여, 암 면역요법의 달성가능한 효능을 제한하는 시토카인 방출 증후군을 초래할 수 있는 전신 면역 세포의 염증성 자극에 기인하는 독성을 방지할 수 있었다 [21].
효능.
균주 BCT2를 pFF+20*Lux로, 또는 3개의 면역조정제 단백질 중 하나의 생산을 코딩하는 플라스미드 중 하나로 형질전환하여 4개의 개별 균주를 확립하였다. 종양-부하된 마우스를 박테리아 투여 2일 전에 VDA로 처리하여 박테리아 콜로니화를 위한 괴사 공간을 생성하였다. 또한 VDA를 상기 박테리아 1시간 후에 투여하였고, 그 결과, 이전 실험에서 제시된 바와 같이 종양 콜로니화가 증가하였다 (데이터는 제시되지 않음). -2일차에, 4 mg/kg VDA를 체표면적 환산을 통해 인간 임상 시험에서 결정된 최대 허용 용량 (MTD)과 동일한 용량으로 IP 주사하였다 [22]. 0일차에, 3시간 간격으로 2회 꼬리 정맥 주사를 통해 마우스에 박테리아를 투여하였다. 이러한 박테리아의 "펄스" 투여는 단일 볼루스 용량 주사와 비교하여 종양의 박테리아 콜로니화를 증가시키는 것으로 입증되었으며 [23], 이러한 전략법은 실험을 통해 확인되었다 (데이터는 제시되지 않음). 0일차에 주사된 VDA는 박테리아 이후에 MTD VDA를 투여하였을 때 관찰된 독성에 기인하여 50% MTD (2 mg/kg)로 감소되었다 (하기 참조). VDA 유발 괴사에 따른 급성 혈관신생을 일시적으로 억제하고 [24], 박테리아에 대한 초기 전신 염증성 반응을 억제하기 위해, CBD가 모든 VDA 주사에 포함되었다. 50 mg/kg으로 투여된 CBD 용량은 체표면적 환산에 의하면 인간 임상 시험에서 결정된 MTD와 동일하다 [25]. 4 또는 5일차 생물발광 이미징 결과, BCT2pLux 주사를 맞은 마우스 15마리 중 10마리 및 BCT2pQuad 주사를 맞은 마우스 14마리 중 9마리에서 적어도 한 종양이 박테리아에 의해 콜로니화된 것으로 나타났다 (데이터는 제시되지 않음). 박테리아 없이 VDA + CBD로 처리된 마우스의 종양 성장은 비록 성장이 더 느려지는 방향으로 진행되고 있지만, 비처리된 마우스에서 관찰된 종양 성장과 크게 다르지 않았다 (도 8, 28일차, A vs B, P = 0.1). 균주 BCT2pLux를 치료에 첨가하였을 때, 28일차까지의 종양 성장은 비처리된 마우스에서의 종양 성장 대비 40%만큼 유의적으로 크게 감소하였다 (도 8, 28일차, A vs C, P = 0.02). 이는 비록 BCT2pLux 존재 하의 VDA + CBD와 부재 하의 VDA + CBD 사이에 유의적인 차이가 관찰되지는 않았지만, 면역조정제 발현 부재 하의 BCT2도 상기 요법에 대하여 약간의 효능을 추가할 수 있다는 것을 시사한다 (도 8, 28일차, B vs C, P = 0.2). BCT2pQuad로 처리한 마우스에서는 비처리된 동물 대비 종양 성장이 64% 유의적으로 감소한 것으로 관찰되었다 (도 8, A vs D, P = 0.0004). 각각 BCT2pLux 존재 또는 부재 하에 VDA + CBD를 주사맞은 마우스에서 관찰된 것과 비교하여 BCT2pQuad를 주사맞은 마우스에서 종양 성장이 41% 및 51% 추가적으로 저속화된 것 (도 8, 28일차, C vs D, P = 0.004 또는 B vs D, P = 0.0006)은 면역조정제의 종양-특이적 발현이 박테리아 단독에 의해 제공되는 임의의 항종양 효능 외에도 항종양 면역 반응을 유도한다는 것을 시사하는 것이다.
박테리아 처리 후 9주 동안 마우스 생존을 추적하였다 (도 9). VDA + CBD 단독 처리는 비록 유의도가 95% 미만이기는 하지만, 비처리된 마우스 대비 생존 기간이 12% 감소하는 경향이 있었다 (도 9, A vs B, P = 0.09). 이는 CBD의 항-염증 특성에 기인하여 항암 면역이 억제될 수 있음을 시사한다 [8]. BCT2pLux 첨가는 비처리 대비 생존에 유의적인 영향을 미치지 않았지만 (도 9, A vs C, P = 0.6); VDA + CBD 단독 대비 생존은 15%만큼 증가하였다 (도 9, B vs C, P = 0.01). BCT2pQuad를 치료 전략법에 포함시켰을 때, 마우스는 비처리된 마우스보다 25% 더 오래 생존하였고 (도 9, A vs D, P = 0.0002), VDA + CBD로만 처리된 마우스보다 33% 더 오래 생존하였고 (도 9, B vs D, P = 0.00002), BCT2pLux가 치료 전략법에 포함된 유일한 균주일 때보다 21% 더 오래 생존하였다 (도 9, C vs D, P = 0.0001). 본 데이터는 박테리아 전달 면역조정제가 종양 미세환경에서 효과적인 항암 면역 반응을 일으킨다는 결론을 추가로 뒷받침한다.
독성.
VDA + CBD + BCT2pQuad를 이용한 치료의 부작용은 아주 적었다. 실험을 통해 체중 감소에 의해 결정된 독성은 BCT2pQuad 투여 2일 후 최대 -6.9% +/- 2.0%에 도달하였다 (도 10). 3일차 체중은 마우스가 비처리된 동물과 비교하여 정상적인 체중 증가를 재개했다는 것을 보여주었다. 이러한 결과는 설치류 시험 제약을 인간 임상 시험으로 전환시키기 위한 상한선으로 간주되는 7일 10% 체중 감소 내에 있다 [26]. 또한, 실험을 통해 결정된 상기 양성 독성은 최대 허용 용량 화학요법에서 관찰된 것 (도 10, MTD 독소루비신)보다 훨씬 더 적었다. MTD 독소루비신을 주사맞은 마우스는 14일차까지 계속해서 체중 감소가 25% 초과까지 지속되었고, 21일차까지 체중 증가가 재개되지 못했다 (이전에 발표된 데이터) [27]. 독성은 또한 하기와 같이 0 내지 3의 척도로 활동성 및 털 매끄러움을 관찰하여 주관적으로 결정하였다: 0) 활동성에 있어서 비처리된 동물과 차이가 없고, 매끄럽고 반짝이며, 헝클어지지 않은 털, 1) 약간 덜 움직임 및 약간 헝클어진 털, 2) 확실히 느려진 움직임 및 헝클어진 털, 및 3) 강압 없이는 움직임이 없고, 윤기가 없고, 극도로 헝클어진 털. 상기 이동성/털 척도에서 BCT2pQuad를 주사맞은 모든 마우스는 1일차부터 4일차까지 0/0, 1/0 또는 0/1인 것으로 관찰되었으며, 7일차에는 모두 0/0으로 스코어를 얻었다. 따라서, 이러한 치료 전략법에서는 어느 정도 수준의 독성이 분명하게 나타났지만, 이는 양성이며, 인간 임상적 전환에 적합한 한계 내에 있다.
논의
본원에서는 암 면역요법의 잠재적 효능을 제한하는 독성 없이 종양 미세환경에 다중 면역조정제 단백질을 표적 전달하는 방법을 제공한다. 이전에 보고된 박테리아의 정맥 투여를 사용한 연구에서는 아마도 그람 음성 박테리아에 의해 유발된 많은 염증성 캐스케이드의 과도한 활성화로 인해 상당한 독성이 나타났으며 (28, 29), 이는 이후 상기 치료 전략법의 채택을 제한하였다. 독성 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 이러한 박테리아의 비독성 정맥내 투여를 가능하게 하는 에스. 티피무리움 균주를 성공적으로 개발하였고 (18), 또한 스텔스 및 면역조정제의 종양-특이적 발현을 위해 박테리아를 조작하였다. 중요하게도, 이들 박테리아는 이식 종양을 사용한 모델보다 임상적으로 더 관련성이 큰 자생적 유방암 마우스 모델에서 비독성 항암 효능을 입증하였다 (30).
박테리아 투여 전 및 후에 VDA로 괴사 공간을 확립함으로써 종양 콜로니화를 증진시켰다. 소분자 VDA는 튜불린에 결합하여 미성숙 혈관 내피 세포의 세포골격을 방해하여 종양의 혈류를 방해한다. 이로 인해 저산소증 및 허혈 부위가 발생하여 주변 종양 세포가 사멸하고, 괴사 공간이 형성된다 (31). 본 발명자들은 이렇게 생성된 괴사 공간이 이러한 박테리아가 번성하고, 이후에 면역조정제를 방출할 수 있는 배양 환경을 제공한다고 믿는다. VDA 콤브레타스타틴을 사용하여 자생적 종양의 에스. 티피무리움 콜로니화 증진을 입증한 후 [6], 본 발명자들은 현 연구에서 용량을 최적화하기 위해 더욱 안정적인 VDA인 CKD-516을 사용하였다 (32). 본 발명자들은 박테리아 투여 2일 전에 MTD VDA로 단일 전처리를 한 경우 박테리아 투여 전 최대 4일 동안 하루에 한 번 VDA를 투여한 것과 마찬가지로 종양에 박테리아 콜로니화가 이루어진 것을 발견하였다. 이는 VDA의 단일 MTD가 이용가능한 조기 종양간 혈관구조의 대부분을 파괴할 수 있다는 것을 시사한다 (33). 게다가, -1일차 VDA 용량을 포함시킨 결과, 콜로니화 양은 감소되었으며 (미공개 결과), 이는 박테리아 처리 시간에 너무 가깝게 투여할 경우 VDA가 혈관에서 종양으로의 박테리아 이동을 방해할 수 있다는 것을 시사한다. 순환 CKD-516의 반감기는 약 5시간인 바 (34), VDA를 제거하는데 2일을 허용하면 초기 혈관구조의 성장을 위한 시간을 허용함으로써 박테리아 콜로니화를 촉진시킬 수 있다. 박테리아로 처리한 후, 종양 중 박테리아를 잠재적으로 트래핑하기 위해 혈관계를 다시 한 번 파괴하여 종양 콜로니화를 증가시키기 위해서는 본 연구에서 보고된 치료 전략법에서 사용된 1시간 간격보다는 VDA를 투여하기 전 2시간을 기다리는 것이 유익할 수 있다.
CBD의 항-혈관신생 및 항-염증 특성을 이용하여 일시적으로 혈관신생을 억제하고, 괴사 공간을 유지하고, 박테리아에 의해 자극을 받은 전신 염증으로 인한 급성 독성을 감소시켰다. VDA 처리는 혈관구조를 파괴하여 종양의 혈관신생 반응을 자극하는 것으로 공지되어 있는 바 (35), 그의 순환 반감기가 24시간이고 (36), 항-혈관신생 특성 (7)이 있는 CBD는 VDA 유발 괴사 시간을 연장시킴으로써 종양의 박테리아 콜로니화를 위한 괴사 공간을 증가시킬 수 있는 가능성이 있다.
종양 미세환경은 항암 면역을 억제하는 상호작용하는 세포와 분자의 복잡한 어레이이다 [38]. 단일 면역조정제를 사용하는 다수의 단일요법이 항암 효능을 입증한 반면, 단일 요법에 면역조정제들을 조합하는 것이 훨씬 더 효과적이다. 예를 들어, 항-PD-1 및 항-CTLA4 단일클론 항체의 조합을 투여한 결과, 환자의 생존은 어느 치료든 단독으로 투여하였을 때보다 2배 초과로 연장되었다 [39]. 더 많은 세포 기능에 영향을 미치기 위해 추가적인 면역조정제로 요법을 강화시킴으로써 종양 미세환경의 면역억제 성질을 추가로 극복할 수 있고, 점점 더 활성화되는 항종양 면역 반응을 유도할 수 있다 [40]. 그러나, 전신으로 전달되는 모든 면역조정제의 경우와 마찬가지로 면역 관련 유해 사례로 인한 독성은 특히 면역조정제가 조합되었을 때, 현 항암 면역요법의 달성가능한 효능을 제한한다 [41]. 전신으로 전달되는 항암 면역요법의 효능 제한 부작용을 극복하면 본 연구에서 조합된 IL-15 시토카인 및 항-PD-L1 및 항-CTLA4 면역 체크포인트 억제제를 넘어서는 면역조정제의 추가적인 조합을 전달할 수 있어야 한다. 면역원성 스텔스 에스. 티피무리움 (BCT2) 및 면역조정제의 종양-특이적 발현으로 이루어진 본 발명자들의 시스템은 자생적 유방암 마우스 모델에서 상당한 효능을 유지하면서 전신 독성을 방지하고, 인간의 암 치료를 위한 성공적인 임상적 전환 가능성을 증가시킨다.
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실시예 III
플라스미드 구축
헤모리신 분비 시스템
플라스미드 pYA292 중 Trc 프로모터 및 LacZ알파 서열 (1)을 종양-특이적 유전자 발현을 위해 사용된 FF+20* 프로모터 서열 (2)로 대체하여 플라스미드를 구축하였다. 오페론은 FF+20* 프로모터, 이. 콜라이 헤모리신 분비 단백질 HlyB 및 HlyD를 코딩하는 cDNA 서열로 이어지는 C-말단 60개 아미노산 이. 콜라이 HlyA 분비 신호를 프레임 내에 포함하는 면역조정제 cDNA 서열 (3)로 이루어졌다. 상기 구축물을 위해 사용된 면역조정 cDNA 서열은 IL-15, αCTLA-4 scFv, 및 αPD-L1 scFv를 포함한다. 상기 면역조정제 유전자를 함유하는 플라스미드의 구축은 이전에 기재되었다 (4).
유사한 접근법 (4)을 사용하여 하기 면역조정제에 대한 cDNA를 클로닝하였다:
*pFF+20*-CXCL9-10.
pFF+20*-CXCL9-10을 구축하기 위해, pFF+20*-IL15 및 CXCL9-10 gBlock을 BsrGI 및 Esp3I로 절단하였다. 분해된 플라스미드를 알칼리성 포스파타제로 처리하고, 분해된 gBlock에 라이게이션시켰다. 라이게이션을 이용하여 균주 χ6212를 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 단리시키고, 플라스미드를 시퀀싱하여 FF+20*-CXCL9-10 구축물을 확인하였다. 올바른 플라스미드를 사용하여 균주 χ3730A를 형질전환시키고; 플라스미드를 형질전환체로부터 단리시키고, 이를 사용하여 균주 BCT2를 형질전환시켰다.
CXCL9-10 gBlock 서열 (1126 bp):
Figure pct00004
*pFF+20*-αPD-L1N (N=나노바디)
pFF+20*-αPD-L1N을 구축하기 위해, pFF+20*-IL15 및 PDL1N gBlock을 BamHI 및 PacI로 절단하였다. 분해된 플라스미드를 알칼리성 포스파타제로 처리하고, 분해된 gBlock에 라이게이션시켰다. 라이게이션을 이용하여 균주 χ6212를 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 단리시키고, 플라스미드를 시퀀싱하여 FF+20*-αPD-L1N 구축물을 확인하였다. 올바른 플라스미드를 사용하여 균주 χ3730A를 형질전환시키고; 플라스미드를 형질전환체로부터 단리시키고, 이를 사용하여 균주 BCT2를 형질전환시켰다.
PDL1N gBlock 서열 (557 bp):
Figure pct00005
플라젤라 분비 시스템
플라젤라 분비 시스템 (5)을 이용하기 위해, FliC 프로모터 서열 및 면역조정 DNA 서열에 융합된 FliC 분비 신호를 함유하도록 플라스미드를 구축하였다. 플라스미드 FliC 프로모터의 활성은 면역조정제 발현 및 분비를 종양 미세환경으로 국한시키기 위해 종양-특이적 FF+20* 프로모터 (2)에 의해 구동되는 염색체 플라젤라 로커스에 의해 제어된다. BCT14 균주에 대한 설명을 참조한다.
상기 구축물을 위해 사용된 면역조정 cDNA 서열은 하기를 포함한다:
* pFliC -IL-15
pFliC-IL15를 제조하기 위해, FLIC-IL15 gBlock-2 및 플라스미드 pLacUV5-mIL15Ra-mIL15 (4)를 DraIII 및 SphI로 분해하였다. 분해된 플라스미드를 알칼리성 포스파타제로 처리하고, 분해된 gBlock에 라이게이션시켰다. 라이게이션을 이용하여 균주 χ6212를 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 단리시키고, 플라스미드를 시퀀싱하여 FliC-IL15 구축물을 확인하였다. 올바른 플라스미드를 사용하여 균주 χ3730A를 형질전환시키고; 플라스미드를 형질전환체로부터 단리시키고, 이를 사용하여 균주 BCT13을 형질전환시켰다.
FLIC -IL15 gBlock -2 서열 (380 bp):
Figure pct00006
하기 면역조정제 유전자를 포함하는 pFliC 플라스미드의 구축은 pFliC-IL15의 구축과 유사한 프로토콜을 따라 진행하였다.
*pFliC-αPD-L1 scFv
pFliC-αPD-L1 scFv를 제조하기 위해, pLacUV5-OmpA-αPD-L1 플라스미드 및 αPD-L1 gBlock을 BstEII 및 AvrII로 분해하였다. 분해된 플라스미드를 알칼리성 포스파타제로 처리하고, 분해된 gBlock에 라이게이션시켰다. 라이게이션을 이용하여 균주 χ6212를 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 단리시키고, 플라스미드를 시퀀싱하여 FliC-αPD-L1 구축물을 확인하였다. 올바른 플라스미드를 사용하여 균주 χ3730A를 형질전환시키고; 플라스미드를 형질전환체로부터 단리시키고, 이를 사용하여 균주 BCT13을 형질전환시켰다.
FLIC-αPDL1 gBlock (1053 bp):
Figure pct00007
*pFliC-αCTLA-4 scFv
pFliC-αCTLA-4 scFv를 제조하기 위해, pFliC-αPD-L1 scFv 플라스미드 및 αCTLA4 gBlock을 NsiI 및 SpeI로 분해하였다. 분해된 플라스미드를 알칼리성 포스파타제로 처리하고, 분해된 gBlock에 라이게이션시켰다. 라이게이션을 이용하여 균주 χ6212를 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 단리시키고, 플라스미드를 시퀀싱하여 FliC-αCTLA4 구축물을 확인하였다. 올바른 플라스미드를 사용하여 균주 χ3730A를 형질전환시키고; 플라스미드를 형질전환체로부터 단리시키고, 이를 사용하여 균주 BCT13을 형질전환시켰다.
FLIC-αCTLA4 gBlock (1070 bp):
Figure pct00008
*pFliC-CXCL9-10
pFliC-CXCL9-10을 제조하기 위해, pFliC-IL15 플라스미드 및 CXCL9-10 pFlic gBlock을 HindIII 및 DraIII으로 분해하였다. 분해된 플라스미드를 알칼리성 포스파타제로 처리하고, 분해된 gBlock에 라이게이션시켰다. 라이게이션을 이용하여 균주 χ6212를 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 단리시키고, 플라스미드를 시퀀싱하여 FliC-CXCL9-10 구축물을 확인하였다. 올바른 플라스미드를 사용하여 균주 χ3730A를 형질전환시키고; 플라스미드를 형질전환체로부터 단리시키고, 이를 사용하여 균주 BCT13을 형질전환시켰다.
CXCL9-10 pFlic gBlock (991 bp):
Figure pct00009
*pFliC-αCTLA-4N (N=나노바디)
pFliC-αCTLA-4N을 제조하기 위해, pFliC-IL15 플라스미드 및 αCTLA4N pFliC gBlock을 HindIII 및 DraIII으로 분해하였다. 분해된 플라스미드를 알칼리성 포스파타제로 처리하고, 분해된 gBlock에 라이게이션시켰다. 라이게이션을 이용하여 균주 χ6212를 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 단리시키고, 플라스미드를 시퀀싱하여 FliC-αCTLA-4N 구축물을 확인하였다. 올바른 플라스미드를 사용하여 균주 χ3730A를 형질전환시키고; 플라스미드를 형질전환체로부터 단리시키고, 이를 사용하여 균주 BCT13을 형질전환시켰다.
αCTLA4N pFliC gBlock (727 bp):
Figure pct00010
*pFliC-αPD-L1N (N=나노바디)
pFliC-αPD-L1N을 제조하기 위해, pFliC-IL15 플라스미드 및 αPDL1N pFlic gBlock을 HindIII 및 DraIII으로 분해하였다. 분해된 플라스미드를 알칼리성 포스파타제로 처리하고, 분해된 gBlock에 라이게이션시켰다. 라이게이션을 이용하여 균주 χ6212를 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 단리시키고, 플라스미드를 시퀀싱하여 FliC-αPDL1N 구축물을 확인하였다. 올바른 플라스미드를 사용하여 균주 χ3730A를 형질전환시키고; 플라스미드를 형질전환체로부터 단리시키고, 이를 사용하여 균주 BCT13을 형질전환시켰다.
αPDL1N pFlic gBlock (730 bp):
Figure pct00011
*pFliC-αCD47N (N=나노바디)
pFliC-αCD47N을 제조하기 위해, pFliC-IL15 플라스미드 및 αCD47 pFliC gBlock을 HindIII 및 DraIII으로 분해하였다. 분해된 플라스미드를 알칼리성 포스파타제로 처리하고, 분해된 gBlock에 라이게이션시켰다. 라이게이션을 이용하여 균주 χ6212를 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 단리시키고, 플라스미드를 시퀀싱하여 FliC-αCD47N 구축물을 확인하였다. 올바른 플라스미드를 사용하여 균주 χ3730A를 형질전환시키고; 플라스미드를 형질전환체로부터 단리시키고, 이를 사용하여 균주 BCT13을 형질전환시켰다.
αCD47 pFliC gBlock (751 bp):
Figure pct00012
면역조정 유전자 조합을 함유하는 플라스미드 구축
1. pFliC -IL15- αPDL1N (N= 나노바디 ) 비시스트로닉 오페론
비시스트로닉 플라스미드를 제조하기 위해, pFliC-IL15-αPDL1N, IL15-αPDL1N gBlock 및 pFliC-IL15 플라스미드 (상기 참조)를 DraIII 및 HindIII으로 분해하였다. 분해된 플라스미드를 알칼리성 포스파타제로 처리하고, 분해된 gBlock에 라이게이션시켰다. 라이게이션을 이용하여 균주 χ6212를 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 단리시키고, 플라스미드를 시퀀싱하여 FliC-IL15-αPDL1N 구축물을 확인하였다. 올바른 플라스미드를 사용하여 균주 χ3730A를 형질전환시키고; 플라스미드를 형질전환체로부터 단리시키고, 이를 사용하여 균주 BCT13을 형질전환시켰다.
IL15-αPDL1N gBlock (1555 bp):
Figure pct00013
2. pFliC -P는 IL12, IL18, IL15, αPDL1N , 및 αCTLA4N을 포함하는 펜타시스 트로닉 오페론을 함유한다 (N=나노바디)
펜타시스트로닉 오페론을 포함하는 pFliC-P 플라스미드를 제조하기 위해, 2 단계를 사용하였다. 제1 단계는 IL12 유전자의 클로닝을 수반하였다. 제2 단계는 남은 4개의 유전자 서열을 pFliC-IL12 플라스미드에 부가하였다.
단계 1: pFliC-IL12D gBlock 및 pFliC-IL15 플라스미드 (상기 참조)를 DraIII 및 HindIII으로 분해하였다. 분해된 플라스미드를 알칼리성 포스파타제로 처리하고, 분해된 gBlock에 라이게이션시켰다. 라이게이션을 이용하여 균주 χ6212를 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 단리시키고, 플라스미드를 시퀀싱하여 FliC-IL12D 구축물을 확인하였다.
pFliC-IL12D gBlock (1960 bp):
Figure pct00014
단계 2: "펜타 gBlock 2 M-H" gBlock 및 플라스미드 pFliC-IL12D를 MluI 및 HindIII으로 분해하였다. 분해된 플라스미드를 알칼리성 포스파타제로 처리하고, 분해된 gBlock에 라이게이션시켰다. 라이게이션을 이용하여 균주 χ6212를 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 단리시키고, 플라스미드를 시퀀싱하여 FliC-P 구축물을 확인하였다. 올바른 플라스미드를 사용하여 균주 χ3730A를 형질전환시키고; 플라스미드를 형질전환체로부터 단리시키고, 이를 사용하여 균주 BCT13을 형질전환시켰다.
"펜타 gBlock 2 M-H" gBlock (2663 bp):
Figure pct00015
3. pFliC -P- Lux는 IL12, IL18, IL15, αPDL1N , 및 αCTLA4N을 포함하는 펜타 시스트로닉 오페론 및 lux 오페론을 함유한다 (N=나노바디)
생물발광에 의해 종양 콜로니화를 추적하기 위해 lux 오페론을 pFliC-P 플라스미드 내로 삽입하였다.
pGRG36-LacUV5-Lux를 LacUV5-Lux 오페론의 공급원으로서 사용하였다.
LacUV5-Lux 오페론은 하기 프라이머를 이용하여 pLux (6)로부터 증폭시켰다:
Lux PacI Fwd 60.2:
5' ACT GTT AAT TAA GAA GAC CTT CCA TTC TG 3'
Lux XhoI Rev 60.4:
5'- AGG ATT CTC GAG TTA TCA ACT ATC AAA CGC TTC GGT TAA G -3'
PCR 생성물을 PacI 및 XhoI로 분해시키고, 동일한 효소로 절단된 pGRG36 (7)에 라이게이션시켰다. 플라스미드의 제한 분해 및 상기 플라스미드를 함유하는 박테리아의 생물발광에 의해 재조합 pGRG36-LacUV5-Lux 플라스미드를 확인하였다. pGRG36-LacUV5-Lux 플라스미드를 PacI 및 XhoI로 절단하고, 단부를 평활화시켰다. pFliC-P를 HindIII으로 절단하고, 단부를 평활화시키고, 알칼리성 포스파타제로 처리하였다. 상기 절단된 두 플라스미드를 라이게이션시키고, 이를 사용하여 균주 χ6212를 형질전환시켰다. 생성된 콜로니를 생물발광에 대해 스크리닝하고; 플라스미드를 양성 클론으로부터 단리시키고, PCR 및 시퀀싱에 의해 구축물을 확인하였다. 플라스미드를 사용하여 균주 χ3730A를 형질전환시키고, 플라스미드를 형질전환체로부터 단리시켰다. 플라스미드를 사용하여 균주 BCT14를 형질전환시키고, 콜로니 생물발광에 의해 Lux 발현을 다시 확인하였다.
참고문헌
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실시예 IV
균주 구축
BCT2 ( χ11091 플러스 fliC - fljB - fimH - rfaL - pgtE *)
균주 BCT2를 제조하기 위한 출발점으로서 살모넬라 엔테리카 티피무리움 균주 χ11091을 사용하였고, 독성 감소를 위해 하기와 같이 변이시켰다: fliC 유전자 결실; fljB 유전자 결실; fimH 유전자 결실; rfaL 유전자 결실; 및 발현을 증가시키기 위해 pgtE 프로모터 중 단일 뉴클레오티드 변이.
상기 변이는 모두 DIRex 프로토콜 (1)을 이용하여 진행하였다. 상기 실험에 관한 세부 사항은 이전에 기재되었다 (2).
BCT2E ( BCT2 플러스 eca -)
DIRex 프로토콜 (1) 및 하기 프라이머를 이용하여 BCT2 중에서 엔테로박테리아 공통 항원 (3) 로커스 (eca)를 결실시켜 독성을 감소시켰다:
Figure pct00016
표 1. 균주 BCT2 및 BCT2E의 독성. 각각 마우스 9마리로 이루어진 두 코호트로부터 얻은 데이터에 기초하면, 비-종양 부하된 Balb/C 마우스의 꼬리 정맥 내로 균주 BCT2E를 주사하였을 때, 그 결과로 독성은 균주 BCT2를 주사하였을 때 관찰된 것의 절반 미만인 것으로 나타났다. 모든 마우스는 이전에 기재된 바와 같고 (2,11), 하기와 같이 변형된 방식으로 100 마이크로리터 주사를 맞았다. 2일차: (4 mg/kg VDA + 50 mg/kg CBD) IP. 0일차: 4x106 cfu BCT2(pLux) 또는 BCT2E(pLux) - 3 hr - 4x106 cfu BCT2(pLux) 또는 BCT2E(pLux) - 2 hr - (1 mg/kg VDA + 50 mg/kg CBD). 0 - 3 = 정상 - 불량인 척도로 털/이동성을 관찰하였다. BCT2 코호트 중 극심한 체중 감소가 발생하고, 빈사 상태가 된 마우스 1마리와, BCT2E 코호트 중 1일차에 사망한 것으로 발견된 마우스 1마리는 이상치로 간주하고, 본 분석에 포함시키지 않았다.
BCT5 ( BCT2 플러스 rpoS - 플러스 viaB )
rpoS 유전자는 RNA 폴리머라제 시그마 인자 (4)를 코딩한다. DIRex 프로토콜 (1) 및 하기 프라이머를 이용하여 상기 유전자를 결실시켰다.
Figure pct00018
ViaB 캡슐을 코딩하는 로커스를 살모넬라 티피 Ty2로부터 PCR 증폭시키고 (5,6), 람다 red 재조합을 이용하여 attTn7 부위에서 BCT2 염색체 내로 삽입하였다 (7).
viaB PCR 정방향 프라이머: 5'-CGGGGTACCAGTATGACGTTCTGACGGTT-3'
viaB PCR 역방향 프라이머: 5'-CGGGGTACCATTTTCAGCTCTGAAGTACA-3'
BCT14 ( BCT2 플러스 fljA - rflP - flgKL - motAB -; flhDp → FF+20*; eca -)
박테리아로부터 발현된 면역조정제의 종양 미세환경으로의 분비를 위해 플라젤라 타입 III 분비 시스템 (8)을 이용하고, 독성을 추가로 감소시키기 위해 BCT2 균주에 대해 수개를 결실시켰다. 모든 변이는 DIRex 프로토콜 (1) 및 명시된 프라이머를 이용하여 수행하였다.
fljA 유전자를 결실시킴
Figure pct00019
rflP 유전자를 결실시킴
Figure pct00020
flgKL 유전자를 결실시킴
Figure pct00021
motAB 유전자를 결실시킴
Figure pct00022
플라젤라 유전자의 발현을 종양 미세환경으로 국한시키기 위해 상기 유전자의 발현을 위한 flhDp 프로모터 서열을 종양-특이적 FF+20* 프로모터로 대체하였다 (9).
프로모터 대체: flhDp → FF+20*
Figure pct00023
BCT2E 균주 경우와 같이 독성을 감소시키기 위해 eca 로커스 (3)를 결실시킴
Figure pct00024
BCT14-PL-Lux
PL-Lux 오페론을 람다 red 재조합을 이용하여 attTn7 부위에서 염색체 내로 삽입하였다 (7). 상기 구축물에서, lux 오페론은 람다 PL 프로모터 (10)에 의해 구동된다. PL 프로모터 서열 및 관련 제한 효소 부위를 함유하는 하기 프라이머를 이용하여 pLux로부터 lux 오페론을 증폭시켰다 (2):
Figure pct00025
PCR 생성물을 PacI 및 XhoI로 분해하고, 동일한 효소로 절단된 pGRG36에 라이게이션시켰다 (7). 플라스미드의 제한 분해, 및 상기 플라스미드를 함유하는 박테리아의 생물발광에 의해 재조합 pGRG36-PL-Lux 플라스미드를 확인하였다. 이어서, pGRG36-PL-Lux로부터의 PL-Lux 오페론을 람다 red 재조합을 이용하여 attTn7 부위에서 BCT13 염색체 내로 삽입한 후 (7), 이어서 BCT2E에 대해 기재된 바와 같이 eca 로커스 (3)를 결실시켰다.
참고문헌
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실시예 V
균주:
- BCT15 (BCT14 플러스 viaB 로커스)
ViaB 캡슐을 코딩하는 로커스를 살모넬라 티피 Ty2 (χ8073)로부터 PCR 증폭시키고 (1,2), 람다 red 재조합을 이용하여 attTn7 부위에서 BCT14 염색체 내로 삽입하였다 (3).
viaB PCR 정방향 프라이머: 5'-CGGGGTACCAGTATGACGTTCTGACGGTT-3'
viaB PCR 역방향 프라이머: 5'-CGGGGTACCATTTTCAGCTCTGAAGTACA-3'
- BCT16 (BCT14 플러스 glmS-)
asd 결실 외에 추가로 또 다른 균형 잡힌 치사 선택을 제공하기 위해 균주 χ6212, χ3730A, 및 BCT14에서 glmS 유전자 (4)를 결실시켰다. BCT14에서의 결실을 위해 하기 프라이머와 함께 DIRex 프로토콜 (5)을 이용하였다:
Figure pct00026
플라스미드:
pGlmS
pGlmS는 BCT16 중의 glmS 염색체 결실을 보완하기 위해 glmS 유전자를 함유한다. pGlmS를 구축하기 위해, pNG.1 플라스미드를 BspH1 및 BspE1로 분해하고, BspH1 및 EcoR1-HF로 절단된 pGlmS gBlock1, 및 EcoR1-HF 및 BspE1로 절단된 pGlmS gBlock2에 라이게이션시켰다. 라이게이션을 사용하여 균주 χ6212glmS -를 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 단리시키고, 플라스미드를 시퀀싱하여 pGlmS 구축물을 확인하였다. 올바른 플라스미드를 사용하여 균주 χ3730A glmS -를 형질전환시키고, 플라스미드를 형질전환체로부터 단리시켰다.
pGlmS gBlock1 (1058 bp)
Figure pct00027
pGlmS gBlock2 (2404 bp)
Figure pct00028
pGlmS-CXCL9-10
pGlmS-CXCL9-10을 제조하기 위해, pGlmS 플라스미드를 NheI로 분해하고, 평활화시키고, 알칼리성 포스파타제로 처리하였다. pFliC-CXCL9-10을 HindIII 및 DraIII로 분해하고, 평활화시키고, 분해된 pGlmS 플라스미드에 라이게이션시켰다. 라이게이션을 사용하여 균주 χ6212glmS-를 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 단리시키고, 시퀀싱에 의해 플라스미드 구축물을 확인하였다. 올바른 플라스미드를 사용하여 균주 χ3730AglmS를 형질전환시키고; 플라스미드를 형질전환체로부터 단리시키고, 이를 사용하여 균주 BCT16을 형질전환시켰다.
pGlmS-aCD47N (N=나노바디)
pGlmS-aCD47을 제조하기 위해, pGlmS 플라스미드를 NheI로 분해하고, 평활화시키고, 알칼리성 포스파타제로 처리하였다. pFliC-aCD47을 HindIII 및 DraIII로 분해하고, 평활화시키고, 분해된 pGlmS 플라스미드에 라이게이션시켰다. 라이게이션을 사용하여 균주 χ6212glmS-를 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 단리시키고, 시퀀싱에 의해 플라스미드 구축물을 확인하였다. 올바른 플라스미드를 균주 χ3730AglmS-를 형질전환시키고; 플라스미드를 형질전환체로부터 단리시키고, 이를 사용하여 균주 BCT16을 형질전환시켰다.
pGlmS-INF (인터페론 알파+람다 비스시스트로닉 오페론)
pGlmS-INF를 제조하기 위해, pGlmS 플라스미드 및 pGmsS-INF gBlock을 NheI 및 BsaI로 분해하였다. 분해된 pGlmS 플라스미드를 알칼리성 포스파타제로 처리하고, 분해된 gBlock에 라이게이션시켰다. 라이게이션을 사용하여 균주 χ6212glmS-를 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 단리시키고, 시퀀싱에 의해 플라스미드 구축물을 확인하였다. 올바른 플라스미드를 균주 χ3730AglmS -를 형질전환시키고; 플라스미드를 형질전환체로부터 단리시키고, 이를 사용하여 균주 BCT16을 형질전환시켰다.
pGlmS-INF gBlock (1710 bp)
Figure pct00029
참고문헌
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여러 실시양태
1. 하기를 포함하는 약독화된 살모넬라 세포:
a) IL-6 분비를 유도하는 세포 표면 단백질을 코딩하는 살모넬라 유전자 중 하나 이상의 것에서의 돌연변이 또는 결실로서, 상기 하나 이상의 단백질의 감소된 발현 또는 발현 부재를 초래하는 돌연변이 또는 결실; 및 임의적으로
b) 대조군 세포와 비교하여, 보체 활성화를 억제하는 하나 이상의 외막 프로테아제의 발현에서의 증가, 및/또는 세포 표면 리포폴리사카라이드 단백질 (LPS)의 발현에서의 감소.
2. 실시양태 1에 있어서, 세포가 에스. 티피무리움 세포인 세포.
3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 하나 이상의 살모넬라 유전자가 플라젤린, 핌브리아에, O-항원 및/또는 리포폴리사카라이드 단백질 (LPS)을 코딩하는 것인 세포.
4. 실시양태 1 내지 3 중 어느 한 실시양태에 있어서, 하나 이상의 살모넬라 유전자가 fliC, fljB, fimH 및/또는 rfaL인 세포.
5. 실시양태 1 내지 4 중 어느 한 실시양태에 있어서, 하나 이상의 외막 프로테아제가 PgtE인 세포.
6. 실시양태 1 내지 5 중 어느 한 실시양태에 있어서, 엔테로박테리아 공통 항원 로커스 (eca)의 결실을 추가로 포함하는 세포.
7. 실시양태 1 내지 6 중 어느 한 실시양태에 있어서, rpoS 유전자의 결실, gmlS의 결실 및/또는 viaB 로커스의 부가를 추가로 포함하는 세포.
8. 실시양태 1 내지 7 중 어느 한 실시양태에 있어서, fljA, rflP, flgKL 및/또는 motAB 유전자 중 하나 이상의 것의 결실을 추가로 포함하는 세포.
9. 실시양태 1 내지 8 중 어느 한 실시양태에 있어서, flhDP 프로모터가 종양-특이적 발현 프로모터로 대체되는 것인 세포.
10. 실시양태 9에 있어서, 종양-특이적 발현 프로모터가 FF+20* 프로모터인 세포.
11. 실시양태 1 내지 10 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포가 외인성 면역조정제 단백질을 발현하는 하나 이상의 외인성 면역조정제 유전자를 포함하는 것인 세포.
12. 실시양태 11에 있어서, 면역조정제 유전자가 IL-12, IL-18, IL-15, CXCL9-10, αCTLA-4 단일쇄 가변 단편 (scFv), αPD-L1 scFv, αCTLA-4 단일-도메인 항체 (sdAb), αPD-L1 sdAb 및/또는 αCD47 sdAb를 발현하는 것인 세포.
13. 실시양태 11 내지 12 중 어느 한 실시양태에 있어서, 면역조정제 단백질이 세포로부터 분비되는 것인 세포.
14. 실시양태 11 내지 13 중 어느 한 실시양태에 있어서, 하나 이상의 외인성 면역조정제 유전자가 종양-특이적 발현 프로모터의 제어 하에 있는 것인 세포.
15. 실시양태 14에 있어서, 종양-특이적 발현 프로모터가 FF + 20*인 세포.
16. 실시양태 1 내지 15 중 어느 한 실시양태의 세포의 집단 또는 그의 조합 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
17. 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 실시양태 1 내지 15 중 어느 한 실시양태의 세포의 집단, 그의 조합, 또는 실시양태 16의 조성물을 투여하여 암을 치료하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
18. 종양 성장/증식 억제 또는 종양 부피/크기 감소를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 실시양태 1 내지 15 중 어느 한 실시양태의 세포의 집단, 그의 조합, 또는 실시양태 16의 조성물을 투여하여 종양 성장을 억제하거나 또는 종양 부피를 감소시키는 것을 포함하는, 종양 성장/증식을 억제하거나 또는 종양 부피/크기를 감소시키는 방법.
19. 전이의 치료, 전이 형성/수의 감소 또는 전이 확산의 억제를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 실시양태 1 내지 15 중 어느 한 실시양태의 세포의 집단, 그의 조합, 또는 실시양태 16의 조성물을 투여하여 전이를 치료하거나, 전이 형성/수를 감소시키거나 또는 전이 확산을 억제하는 것을 포함하는, 전이를 치료하거나, 전이 형성/수를 감소시키거나 또는 전이 확산을 억제하는 방법.
20. 실시양태 17 내지 19 중 어느 한 실시양태에 있어서, 종양, 암, 또는 전이가 폐, 간, 신장, 유방, 전립선, 췌장, 결장, 두경부, 난소 및/또는 소화기 종양, 종양 연관 세포, 암 또는 전이인 방법.
21. 실시양태 17 내지 20 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포 또는 조성물이 전신으로, 예컨대 정맥내로 투여되는 것인 방법.
22. 실시양태 17 내지 21 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포가 1회 초과로 투여되는 것인 방법.
23. 실시양태 17 내지 22 중 어느 한 실시양태에 있어서, 혈관 파괴제 (VDA) 및/또는 칸나비디올 (CBD)을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
24. 실시양태 24에 있어서, VDA 및/또는 CBD가 치료 이전 및/또는 동안 (세포의 적어도 1회 투여 후) 투여되는 것인 방법.
25. 실시양태 23 또는 24에 있어서, VDA 및/또는 CBD가 1회 초과로 투여되는 것인 방법.
26. 실시양태 23 내지 25 중 어느 한 실시양태에 있어서, VDA가 VDA 콤브레타스타틴 A4 포스페이트 및 또는 VDA CKD-516인 방법.
27. 실시양태 17 내지 26 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항-인터류킨-6 (IL-6)이 투여되는 것인 방법.
28. 하기 단계를 포함하는, 살모넬라의 독성을 감소시키는 방법:
a) IL-6 분비를 유도하는 세포 표면 단백질을 코딩하는 살모넬라 유전자 중 하나 이상의 것을 결실시켜 상기 하나 이상의 세포 표면 단백질의 감소된 발현 또는 발현 부재를 초래하는 단계; 및 임의적으로
b) 대조군 세포와 비교하여, 보체 활성화를 억제하는 하나 이상의 외막 프로테아제의 발현을 증가시키고/거나, 세포 표면 리포폴리사카라이드 단백질 (LPS)의 발현을 감소시키는 단계.
29. 실시양태 28에 있어서, 살모넬라가 에스. 티피무리움 세포인 방법.
30. 실시양태 28 또는 29에 있어서, 하나 이상의 살모넬라 유전자가 플라젤린, 핌브리아에, O-항원 및/또는 리포폴리사카라이드 단백질 (LPS)을 코딩하는 것인 방법.
31. 실시양태 28 내지 30 중 어느 한 실시양태에 있어서, 하나 이상의 살모넬라 유전자가 fliC, fljB, fimH 및/또는 rfaL인 방법.
32. 실시양태 28 내지 31 중 어느 한 실시양태에 있어서, 하나 이상의 외막 프로테아제가 PgtE인 방법.
33. 실시양태 28 내지 32 중 어느 한 실시양태에 있어서, 엔테로박테리아 공통 항원 로커스 (eca)의 결실을 추가로 포함하는 방법.
34. 실시양태 28 내지 33 중 어느 한 실시양태에 있어서, rpoS 유전자의 결실 및/또는 viaB 로커스의 부가를 추가로 포함하는 방법.
35. 실시양태 28 내지 34 중 어느 한 실시양태에 있어서, fljA, rflP, flgKL 및/또는 motAB 유전자 중 하나 이상의 것의 결실을 추가로 포함하는 방법.
36. 실시양태 28 내지 35 중 어느 한 실시양태에 있어서, flhDP 프로모터가 종양-특이적 발현 프로모터로 대체되는 것인 방법.
37. 제36항에 있어서, 종양-특이적 발현 프로모터가 FF+20* 프로모터인 방법.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 마치 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조로 인용되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 명시된 것과 같은 정도로 본원에 참조로 포함된다. 참조로 포함된 용어의 정의가 본원에 정의된 용어와 상충하는 경우, 본 명세서가 우선 적용되어야 한다.

Claims (37)

  1. 하기를 포함하는 약독화된 살모넬라(Salmonella) 세포:
    a) IL-6 분비를 유도하는 세포 표면 단백질을 코딩하는 살모넬라 유전자 중 하나 이상의 것에서의 돌연변이 또는 결실로서, 상기 하나 이상의 단백질의 감소된 발현 또는 발현 부재를 초래하는 돌연변이 또는 결실; 및 임의적으로
    b) 대조군 세포와 비교하여, 보체 활성화를 억제하는 하나 이상의 외막 프로테아제의 발현에서의 증가, 및/또는 세포 표면 리포폴리사카라이드 단백질 (LPS)의 발현에서의 감소.
  2. 제1항에 있어서, 세포가 에스. 티피무리움(S. Typhimurium) 세포인 세포.
  3. 제1항에 있어서, 하나 이상의 살모넬라 유전자가 플라젤린, 핌브리아에, O-항원 및/또는 리포폴리사카라이드 단백질 (LPS)을 코딩하는 것인 세포.
  4. 제1항에 있어서, 하나 이상의 살모넬라 유전자가 fliC, fljB, fimH 및/또는 rfaL인 세포.
  5. 제1항에 있어서, 하나 이상의 외막 프로테아제가 PgtE인 세포.
  6. 제1항에 있어서, 엔테로박테리아 공통 항원 로커스 (eca)의 결실을 추가로 포함하는 세포.
  7. 제1항에 있어서, rpoS 유전자의 결실, glmS의 결실 및/또는 viaB 로커스의 부가를 추가로 포함하는 세포.
  8. 제1항에 있어서, fljA, rflP, flgKL 및/또는 motAB 유전자 중 하나 이상의 것의 결실을 추가로 포함하는 세포.
  9. 제1항에 있어서, flhDP 프로모터가 종양-특이적 발현 프로모터로 대체되는 것인 세포.
  10. 제9항에 있어서, 종양-특이적 발현 프로모터가 FF+20* 프로모터인 세포.
  11. 제1항에 있어서, 세포가 외인성 면역조정제 단백질을 발현하는 하나 이상의 외인성 면역조정제 유전자를 포함하는 것인 세포.
  12. 제11항에 있어서, 면역조정제 유전자가 IL-12, IL-18, IL-15, CXCL9-10, αCTLA-4 단일쇄 가변 단편 (scFv), αPD-L1 scFv, αCTLA-4 단일-도메인 항체 (sdAb), αPD-L1 sdAb 및/또는 αCD47 sdAb를 발현하는 것인 세포.
  13. 제11항에 있어서, 면역조정제 단백질이 세포로부터 분비되는 것인 세포.
  14. 제11항에 있어서, 하나 이상의 외인성 면역조정제 유전자가 종양-특이적 발현 프로모터의 제어 하에 있는 것인 세포.
  15. 제14항에 있어서, 종양-특이적 발현 프로모터가 FF + 20*인 세포.
  16. 제1항의 세포의 집단 또는 그의 조합 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  17. 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제1항의 세포의 집단을 투여하여 암을 치료하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  18. 종양 성장/증식 억제 또는 종양 부피/크기 감소를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제1항의 세포의 집단을 투여하여 종양 성장을 억제하거나 또는 종양 부피를 감소시키는 것을 포함하는, 종양 성장/증식을 억제하거나 또는 종양 부피/크기를 감소시키는 방법.
  19. 전이의 치료, 전이 형성/수의 감소 또는 전이 확산의 억제를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제1항의 세포의 집단을 투여하여 전이를 치료하거나, 전이 형성/수를 감소시키거나 또는 전이 확산을 억제하는 것을 포함하는, 전이를 치료하거나, 전이 형성/수를 감소시키거나 또는 전이 확산을 억제하는 방법.
  20. 제17항에 있어서, 종양, 암, 또는 전이가 폐, 간, 신장, 유방, 전립선, 췌장, 결장, 두경부, 난소 및/또는 소화기 종양, 종양 연관 세포, 암 또는 전이인 방법.
  21. 제17항에 있어서, 세포 또는 조성물이 전신으로, 예컨대 정맥내로 투여되는 것인 방법.
  22. 제17항에 있어서, 세포가 1회 초과로 투여되는 것인 방법.
  23. 제17항에 있어서, 혈관 파괴제 (VDA) 및/또는 칸나비디올 (CBD)을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  24. 제24항에 있어서, VDA 및/또는 CBD가 치료 이전 및/또는 동안 (세포의 적어도 1회 투여 후) 투여되는 것인 방법.
  25. 제23항에 있어서, VDA 및/또는 CBD가 1회 초과로 투여되는 것인 방법.
  26. 제23항에 있어서, VDA가 VDA 콤브레타스타틴 A4 포스페이트 및 또는 VDA CKD-516인 방법.
  27. 제17항에 있어서, 항-인터류킨-6 (IL-6)이 투여되는 것인 방법.
  28. 하기 단계를 포함하는, 살모넬라의 독성을 감소시키는 방법:
    a) IL-6 분비를 유도하는 세포 표면 단백질을 코딩하는 살모넬라 유전자 중 하나 이상의 것을 결실시켜 상기 하나 이상의 세포 표면 단백질의 감소된 발현 또는 발현 부재를 초래하는 단계; 및 임의적으로
    b) 대조군 세포와 비교하여, 보체 활성화를 억제하는 하나 이상의 외막 프로테아제의 발현을 증가시키고/거나, 세포 표면 리포폴리사카라이드 단백질 (LPS)의 발현을 감소시키는 단계.
  29. 제28항에 있어서, 살모넬라가 에스. 티피무리움 세포인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 하나 이상의 살모넬라 유전자가 플라젤린, 핌브리아에, O-항원 및/또는 리포폴리사카라이드 단백질 (LPS)을 코딩하는 것인 방법.
  31. 제28항에 있어서, 하나 이상의 살모넬라 유전자가 fliC, fljB, fimH 및/또는 rfaL인 방법.
  32. 제28항에 있어서, 하나 이상의 외막 프로테아제가 PgtE인 방법.
  33. 제28항에 있어서, 엔테로박테리아 공통 항원 로커스 (eca)의 결실을 추가로 포함하는 방법.
  34. 제28항에 있어서, rpoS 유전자의 결실 및/또는 viaB 로커스의 부가를 추가로 포함하는 방법.
  35. 제28항에 있어서, fljA, rflP, flgKL 및/또는 motAB 유전자 중 하나 이상의 것의 결실을 추가로 포함하는 방법.
  36. 제28항에 있어서, flhDP 프로모터가 종양-특이적 발현 프로모터로 대체되는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 종양-특이적 발현 프로모터가 FF+20* 프로모터인 방법.
KR1020247011817A 2021-09-10 2022-09-09 종양의 비독성 콜로니화를 위해 조작된 살모넬라 KR20240054373A (ko)

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