CN112746050B - 一种鰤鱼诺卡氏菌减毒株及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明适用于基因工程技术领域，提供了一种鰤鱼诺卡氏菌减毒株及其制备方法和应用，该鰤鱼诺卡氏菌减毒株为含有丙氨酸脱氢酶基因缺失的鰤鱼诺卡氏菌菌株，其制备方法包括以下步骤：将丙氨酸脱氢酶基因的上游片段和下游片段连接至载体中，得到重组载体；取鰤鱼诺卡氏菌野生株，制备鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞；利用重组载体对鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞进行电转化，得到电转化菌液；对电转化菌液进行培养和筛选，得到鰤鱼诺卡氏菌减毒株。本发明提供鰤鱼诺卡氏菌减毒株，可用于预防诺卡氏菌病感染，其通过基因敲除的方法缺失丙氨酸脱氢酶基因后，能有效降低细菌的致病性，但仍保留了较好的免疫原性。

Description

一种鰤鱼诺卡氏菌减毒株及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种鰤鱼诺卡氏菌减毒株及其制 备方法和应用。
背景技术
鰤鱼诺卡氏菌是鱼类诺卡氏菌病的主要病原菌，其在分类上属于细菌域(Bacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌纲(Actinobacteria)、放线菌 目(Actinobacterales)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、诺卡氏菌属(Nocardi a)。鱼类诺卡氏菌病对水产养殖业危害极大，在亚洲地区养殖鱼类中诺卡氏菌 病频发，发病鱼种包括鰤、鲳、大黄鱼、招财鱼、罗非鱼、乌鳢、大口黑鲈、 石斑鱼、四指马鲅、紫红笛鲷、红笛鲷、六带鲹等。随着养殖业集约化程度的 提高，养殖过程中的疾病也日趋严重，鱼类诺卡氏菌病自然发病率可达到15％～ 30％，严重的达到60％，人工感染的病死率可高达90％～100％。
近年来鱼类诺卡氏菌病引起越来越多学者的广泛关注，抗生素治疗细菌感 染性疾病难以根治，由于用药疗程长，长期使用抗生素容易产生耐药性，抗生 素残留也会导致人体蓄积性中毒。目前关于鰤鱼诺卡氏菌防治手段，仍然是以 预防为主。细菌的减毒株在保持原有免疫原性的基础上，又不会对宿主造成危 害，因此减毒株备受关注。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种鰤鱼诺卡氏菌减毒株，旨在解决背景技 术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种鰤鱼诺卡氏菌减毒株，其为含有丙氨酸 脱氢酶基因缺失的鰤鱼诺卡氏菌菌株；所述丙氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列如 序列表SEQ IDNO:1所示，和/或所述丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:12所示。
本发明实施例的另一目的在于提供上述的鰤鱼诺卡氏菌减毒株的制备方 法，其包括以下步骤：
将所述丙氨酸脱氢酶基因的上游片段和下游片段连接至载体中，得到重组 载体；
取鰤鱼诺卡氏菌野生株，制备鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞；
利用重组载体对鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞进行电转化，得到电转化菌液；
对电转化菌液进行培养和筛选，得到所述鰤鱼诺卡氏菌减毒株。
作为本发明实施例的一种优选方案，所述将所述丙氨酸脱氢酶基因的上游 片段和下游片段连接至载体中，得到重组载体的步骤，具体包括：
将所述丙氨酸脱氢酶基因的上游片段作为上游同源臂，将所述丙氨酸脱氢 酶基因的下游片段作为下游同源臂，以mLuI和XbaI为酶切位点，经过酶切、 酶连至载体中，构建用于同源重组的重组载体。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述丙氨酸脱氢酶基因的上游片段 的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述丙氨酸脱氢酶基因的下游片段 的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述载体为pRE112质粒。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述步骤中，电转化的电压为180～ 220V，脉冲间隔时间为800～1200ms。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述对电转化菌液进行培养和筛选， 得到所述鰤鱼诺卡氏菌减毒株的步骤，具体包括：
将电转化菌液涂布于含有氯霉素抗性的脑心浸液琼脂平板上进行培养，得 到菌落；
将菌落接种至脑心浸液肉汤液体培养基中进行培养，并筛选出缺失丙氨酸 脱氢酶基因的鰤鱼诺卡氏菌菌株，得到所述鰤鱼诺卡氏菌减毒株。
本发明实施例的另一目的在于提供上述制备方法制得的鰤鱼诺卡氏菌减毒 株。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述鰤鱼诺卡氏菌减毒株在制备诺 卡氏菌病疫苗中的应用。
本发明实施例提供的一种鰤鱼诺卡氏菌减毒株，可用于预防诺卡氏菌感染， 其通过基因敲除的方法缺失丙氨酸脱氢酶基因后，能有效降低细菌的致病性， 但仍保留了较好的免疫原性；本发明实施例提供的鰤鱼诺卡氏菌减毒株的制备 方法简单，构建成功后可大规模培养，成本低，周期短；另外，由于是在鰤鱼 诺卡氏菌基因组上直接进行敲除，菌内不含抗性质粒，符合生物安全，并且不 会以为质粒的丢失而影响鰤鱼诺卡氏菌的生长。
附图说明
图1为实施例1中鰤鱼诺卡氏菌丙氨酸脱氢酶基因的上、下游片段的电泳 图。图1中，M：DNA分子量标准；1：上游片段；2：下游片段。
图2为实施例1中鰤鱼诺卡氏菌丙氨酸脱氢酶基因缺失株筛选电泳图。图2 中，M：DNA分子量标准；1：缺失株；2：阳性对照。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实 施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅 仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
该实施例提供了一种鰤鱼诺卡氏菌减毒株，其为含有丙氨酸脱氢酶基因缺 失的鰤鱼诺卡氏菌菌株；所述丙氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，所述丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:12所示，其中， 丙氨酸脱氢酶基因的上游片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，丙氨 酸脱氢酶基因的下游片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示。
具体的，该鰤鱼诺卡氏菌减毒株的制备方法，包括以下步骤：
S1、构建同源重组载体：将保存的鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503菌株无菌操作划线 接种到脑心浸液(Brain Heart Infusion，BHI)固体培养基(购自广东环凯微 生物科技有限公司)，28℃倒置培养。待平板上长出单菌落，无菌操作挑取单 菌落至50mL BHI液体培养基中，28℃，120rpm培养至对数生长期；取一定 体积的菌液提取细菌基因组，以此作为模板，利用表1的引物分别克隆丙氨酸 脱氢酶基因上游片段和下游片段(其电泳图如附图1所示)，然后按照下述方 法连接到pRE112载体中：
从实验室-80℃冰箱中取出含有pRE112质粒的E.coli S17-1菌种，37℃ 水浴融化，划线于含有氯霉素抗性的LB平板中。挑取单菌落过夜扩大培养，随 后使用质粒提取试剂盒提取质粒。按照表2的体系对pRE112质粒和重叠PCR产 物分别进行双酶切实验(以mLuI和XbaI为酶切位点)，37℃反应30min。随 后按照表3，将重叠PCR产物与质粒pRE112连接，得到重组载体。
表1 引物序列
Figure BDA0002852751490000041
Figure BDA0002852751490000051
表1中，ACGCGT和TCTAGA分别为酶切位点，GCCGGTCCCCCGAGG和CCTCGGG GGACCGGCA分别为重叠PCR位点。
表2 双酶切反应体系
Figure BDA0002852751490000052
表3 重叠PCR产物与质粒pRE112连接体系
Figure BDA0002852751490000053
S2、鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞的制备：将保存的鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503菌株 无菌操作划线接种到脑心浸液(Brain Heart Infusion，BHI)固体培养基(购 自广东环凯微生物科技有限公司)，28℃倒置培养。待平板上长出单菌落，无 菌操作挑取单菌落至50mL BHI液体培养基中，28℃，120rpm培养至对数生 长期(OD＝0.7)。取对数生长期的1.5mL鰤鱼诺卡氏菌菌液于1.5mL离心管 中，3℃，8000rpm收集细菌菌体；用1.5mL 10％无菌甘油分别洗涤菌体三次， 再用0.15mL无菌甘油重悬菌体，得到鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞。
S3、电转化：吸取一定体积上述得到的重组载体(记为敲除质粒pRE112- ΔNsADH)加入到上述鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞中，使得重组载体总量为1.2 μg，冰浴混匀30min。随后将混合液加入到96孔酶标板中，每孔100μL。 设置电转仪参数：电压200V、频率30、间隔时间1000ms、持续时间60ms。 电转后，加入100μL 28℃预热的BHI液体培养基。置于28℃培养箱中静置 复苏4h，得到电转化菌液。
S4、阳性克隆筛选：取上述电转化菌液100μL涂布于含有氯霉素(25mg /mL)抗性的BHI平板上，另以没电转化过的鰤鱼诺卡氏菌菌液作为阴性对照， 等量涂布于含有氯霉素抗性的BHI平板上，放在生化培养箱中，28℃倒置培养 至平板长出菌落。挑取单菌落到不含有10％蔗糖的BHI液体培养基中培养，用表 4引物对112-F1/R1检测细菌内是否含有重组敲除质粒。将菌液接种到含有10％ 蔗糖的BHI液体培养基中继续培养，用表4的引物对112-F1/R1检测细菌内是 否消除重组敲除质粒，用表5的缺失株验证引物NsADH-F1/R1进行PCR检测， 筛选缺失株，其电泳结果如图2所示。将构建成功的缺失株命名为鰤鱼诺卡氏 菌丙氨酸脱氢酶缺失株，即为鰤鱼诺卡氏菌减毒株。该鰤鱼诺卡氏菌减毒株命 名为鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia sp.)ZJ0503-761，于2020年10月29日保藏于 广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61257，保藏地址为广州市先 烈中路100号大院59号楼5楼。
表4 pRE112验证引物
Figure BDA0002852751490000071
表5 筛选缺失株引物
Figure BDA0002852751490000072
实施例2
该实施例提供了一种鰤鱼诺卡氏菌减毒株，其为含有丙氨酸脱氢酶基因缺 失的鰤鱼诺卡氏菌菌株；所述丙氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，其中，丙氨酸脱氢酶基因的上游片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，丙氨酸脱氢酶基因的下游片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3 所示。
具体的，该鰤鱼诺卡氏菌减毒株的制备方法，包括以下步骤：
S1、构建同源重组载体：将保存的鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503菌株无菌操作划线 接种到脑心浸液(Brain Heart Infusion，BHI)固体培养基(购自广东环凯微 生物科技有限公司)，26℃倒置培养。待平板上长出单菌落，无菌操作挑取单 菌落至40mL BHI液体培养基中，26℃，100rpm培养至对数生长期；取一定 体积的菌液提取细菌基因组，以此作为模板，利用表1的引物分别克隆丙氨酸 脱氢酶基因上游片段和下游片段，然后按照下述方法连接到pRE112载体中：
从实验室-80℃冰箱中取出含有pRE112质粒的E.coli S17-1菌种，37℃ 水浴融化，划线于含有氯霉素抗性的LB平板中。挑取单菌落过夜扩大培养，随 后使用质粒提取试剂盒提取质粒。按照表2的体系对pRE112质粒和重叠PCR产 物分别进行双酶切实验(以mLuI和XbaI为酶切位点)，37℃反应30min。随 后按照表3，将重叠PCR产物与质粒pRE112连接，得到重组载体。
S2、鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞的制备：将保存的鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503菌株 无菌操作划线接种到脑心浸液(Brain Heart Infusion，BHI)固体培养基(购 自广东环凯微生物科技有限公司)，26℃倒置培养。待平板上长出单菌落，无 菌操作挑取单菌落至40mL BHI液体培养基中，26℃，100rpm培养至对数生 长期(OD＝0.5)。取对数生长期的1mL鰤鱼诺卡氏菌菌液于1.5mL离心管中， 2-4℃，6000rpm收集细菌菌体；用1mL 10％无菌甘油分别洗涤菌体三次，再 用0.1mL无菌甘油重悬菌体，得到鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞。
S3、电转化：吸取一定体积上述得到的重组载体(记为敲除质粒pRE112- ΔNsADH)加入到上述鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞中，使得重组载体总量为1μg， 冰浴混匀30min。随后将混合液加入到96孔酶标板中，每孔100μL。设置电 转仪参数：电压180V、频率30、间隔时间800ms、持续时间60ms。电转后， 加入100μL 28℃预热的BHI液体培养基。置于28℃培养箱中静置复苏2h， 得到电转化菌液。
S4、阳性克隆筛选：取上述电转化菌液100μL涂布于含有氯霉素(25mg /mL)抗性的BHI平板上，另以没电转化过的鰤鱼诺卡氏菌菌液作为阴性对照， 等量涂布于含有氯霉素抗性的BHI平板上，放在生化培养箱中，28℃倒置培养 至平板长出菌落。挑取单菌落到不含有10％蔗糖的BHI液体培养基中培养，用表 4引物对112-F1/R1检测细菌内是否含有重组敲除质粒。将菌液接种到含有10％ 蔗糖的BHI液体培养基中继续培养，用表4的引物对112-F1/R1检测细菌内是 否消除重组敲除质粒，用表5的缺失株验证引物NsADH-F1/R1进行PCR检测， 筛选缺失株。将构建成功的缺失株命名为鰤鱼诺卡氏菌丙氨酸脱氢酶缺失株， 即为鰤鱼诺卡氏菌减毒株。
实施例3
该实施例提供了一种鰤鱼诺卡氏菌减毒株，其为含有丙氨酸脱氢酶基因缺 失的鰤鱼诺卡氏菌菌株；所述丙氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，其中，丙氨酸脱氢酶基因的上游片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，丙氨酸脱氢酶基因的下游片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3 所示。
具体的，该鰤鱼诺卡氏菌减毒株的制备方法，包括以下步骤：
S1、构建同源重组载体：将保存的鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503菌株无菌操作划线 接种到脑心浸液(Brain Heart Infusion，BHI)固体培养基(购自广东环凯微 生物科技有限公司)，30℃倒置培养。待平板上长出单菌落，无菌操作挑取单 菌落至60mL BHI液体培养基中，30℃，150rpm培养至对数生长期；取一定 体积的菌液提取细菌基因组，以此作为模板，利用表1的引物分别克隆丙氨酸 脱氢酶基因上游片段和下游片段，然后按照下述方法连接到pRE112载体中：
从实验室-80℃冰箱中取出含有pRE112质粒的E.coli S17-1菌种，37℃ 水浴融化，划线于含有氯霉素抗性的LB平板中。挑取单菌落过夜扩大培养，随 后使用质粒提取试剂盒提取质粒。按照表2的体系对pRE112质粒和重叠PCR产 物分别进行双酶切实验(以mLuI和XbaI为酶切位点)，37℃反应30min。随 后按照表3，将重叠PCR产物与质粒pRE112连接，得到重组载体。
S2、鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞的制备：将保存的鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503菌株 无菌操作划线接种到脑心浸液(Brain Heart Infusion，BHI)固体培养基(购 自广东环凯微生物科技有限公司)，30℃倒置培养。待平板上长出单菌落，无 菌操作挑取单菌落至60mL BHI液体培养基中，30℃，100-150rpm培养至对 数生长期(OD＝0.8)。取对数生长期的2mL鰤鱼诺卡氏菌菌液于1.5mL离心 管中，4℃，10000rpm收集细菌菌体；用2mL 10％无菌甘油分别洗涤菌体三 次，再用0.2mL无菌甘油重悬菌体，得到鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞。
S3、电转化：吸取一定体积上述得到的重组载体(记为敲除质粒pRE112- ΔNsADH)加入到上述鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞中，使得重组载体总量为1.5 μg，冰浴混匀30min。随后将混合液加入到96孔酶标板中，每孔100μL。 设置电转仪参数：电压220V、频率30、间隔时间1200ms、持续时间60ms。 电转后，加入100μL 28℃预热的BHI液体培养基。置于28℃培养箱中静置 复苏6h，得到电转化菌液。
S4、阳性克隆筛选：取上述电转化菌液100μL涂布于含有氯霉素(25mg /mL)抗性的BHI平板上，另以没电转化过的鰤鱼诺卡氏菌菌液作为阴性对照， 等量涂布于含有氯霉素抗性的BHI平板上，放在生化培养箱中，28℃倒置培养 至平板长出菌落。挑取单菌落到不含有10％蔗糖的BHI液体培养基中培养，用表 4引物对112-F1/R1检测细菌内是否含有重组敲除质粒。将菌液接种到含有10％ 蔗糖的BHI液体培养基中继续培养，用表4的引物对112-F1/R1检测细菌内是 否消除重组敲除质粒，用表5的缺失株验证引物NsADH-F1/R1进行PCR检测， 筛选缺失株。将构建成功的缺失株命名为鰤鱼诺卡氏菌丙氨酸脱氢酶缺失株， 即为鰤鱼诺卡氏菌减毒株。
实施例4
为测定上述实施例1制得的鰤鱼诺卡氏菌减毒株的遗传稳定性，把鰤鱼诺 卡氏菌减毒株连续划线接种培养至30代，用缺失株引物验证相应菌株的遗传稳 定性。鰤鱼诺卡氏菌减毒株连续传至30代，无法检测出丙氨酸脱氢酶基因片段， 表明鰤鱼诺卡氏菌丙氨酸脱氢酶缺失株能稳定遗传。
为了测定和野生株N.seriolae ZJ0503的半致死浓度(LD50)。参考文献 方法(王文基,陈建林,侯素莹,等.鰤鱼诺卡氏菌感染乌斑杂交鳢的组织病 理学研究[J].基因组学与应用生物学,2019,38(10):4439–4446.)，用无 菌PBS溶液调整菌悬液浓度为104、105、106、107、108CFU/mL，实验组每尾杂 交乌鳢腹腔注射100μL菌液，对照组注射等量的无菌PBS溶液，每个浓度设 立三个平行组，每组20尾。连续观察14天，每天正常投喂商业饲料并记录死 鱼情况。参考文献方法(熊浩明,魏柏青,魏荣杰,等.用SPSS软件计算鼠疫 菌半数致死量(LD_(50))[J].中国人兽共患病学报,2013,29(11):1127–11 30.)，采用SPSS17.0进行统计学分析并计算LD50。将丙氨酸脱氢酶缺失株以 106CFU/mL免疫杂交鳢35天后，进行鰤鱼诺卡氏菌野生株活菌攻毒实验，并计 算免疫保护率。结果如表6所示，野生株的半致死浓度为3.64×105CFU/mL， 鰤鱼诺卡氏菌减毒株的半致死浓度为2.56×106CFU/mL，其半致死浓度相较野 生株降低了1个数量级，表明了该菌株毒力发生显著下降。另外，鰤鱼诺卡氏 菌减毒株的免疫保护率达92.36％(如表7所示)
表6 鰤鱼诺卡氏菌各菌株死亡数统计
Figure BDA0002852751490000111
表7 鰤鱼诺卡氏菌注射杂交鳢存活率鱼免疫保护率计算结果
Figure BDA0002852751490000121
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域 的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和 改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附 权利要求为准。
序列表
<110> 广东海洋大学深圳研究院
广东海洋大学
深圳义海生物科技有限公司
<120> 一种鰤鱼诺卡氏菌减毒株及其制备方法和应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2220
<212> DNA
<213> 鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)
<400> 1
cgagaaggtg gtgtccgcct tcgcggtggc ctggcgttcc ggcgacctga gcgcgctgct 60
gggcgtgctg gattccaatg tcaccttcac ctccgacggc ggcggcaagg tgcaggcctt 120
cctgcatccc atgcacggcg cggagaaggt ggcccagacc ctgctcggct tcctcgcggt 180
cgcctccgat atcggtggcg cgtggggtcg ttcggtgctg gtcaacggcc gcccgggcct 240
ggtggtgttc gacggcaaga acaccggcgt cttctcgttc accatcgacg agggccgcat 300
caccaagatc gacgtggtcc gcaatcccga caagatccat ctgcccgacg atgccgagcc 360
ggactggcca ctgggcgagc aggccgacac ccgccccgaa cccggcaccc gatcctgaac 420
cgaagcccac tgctcgagcc gtaagaccgc gggcccgcaa ccactttcgg tcgcgggccc 480
gcggcatgct caggacacga cgccggtctc agcagccatg ccggtctcag gaggcgatgc 540
gggtcaccgg ccggagcccg tgggcggtgg cgacctcggg cgagtacagc tgccccgcat 600
gcgccgtaag cccctgcgcc aggccctgat ccacggcgca ggcgtcgcgc cagccccggt 660
ccgcgatggc ccgggcgtag ggcagcgtcg cgttggtgag ggcgatggtg gaggtgtgcg 720
gcaccgcgcc cggcatgttc gccacgcagt agaacagcga atccgccacg tggaaggtcg 780
gttcggcgtg cgtggtgggc cgcgagctct ggaagcagcc gccctgatcg atggcgatat 840
ccaccagcac cgatccgggc cgcatgtgcg cgaccagggt gtcggacacc agtttcggcg 900
cccgcgcccc gggcaccagc accgacccga tcaccagatc cgctgccagc accgcctttt 960
cgacctcggc cgcattcgag ccgatggtgg cgacccgccc gccgaagcgc gcgtcgagtt 1020
cccgcagtcg cgcgatattg gtgtccagca cggtgactcg cgcccccatg ccgaccgcga 1080
ccaccgcggc attgctgccc gccaccccgc ctccgagcac caccacgtcc gcgggccgca 1140
cccccggcac cccgccgagc agcacgcccg ccccgccctg cggtgacatc aggtgatacg 1200
ccccgacctg ggcgccgagt ttgcccgcca cctcgctcat gggcgcgagc agcggcagcg 1260
acccgtccgc ggcgcgcacc gtctcgtagg cgatggcggt gatacccgac cgcaggatgg 1320
cgtcggtgca ttcgcgcgag gccgccagat gcaggaaggt gaacagcacc tgtccctccc 1380
gcatgcgcga atactcctcg gcgatgggct ctttcacctt cagcaccagc tcggcctcgc 1440
cccacacctg ttccgggccg ggcgcgatgc gggccccggc ggcgaggtag tccgcgtcgc 1500
cgaacccgga tccgatgccc gcgcccgcct cgatcagcac ctcgtgcccg tgccgcgtca 1560
gctccccggc accggccggg gtcagcgcga tccgatactc ctgctccttg acctcccgtg 1620
gaaccccgat tctcataccg ccatcgtgga cccgccgcgc cccgcccgcc atgaccgcca 1680
cgacccgatt tccgatgccg ctatcgaaca gcaaccccga ggccgttccg gcccgcctcc 1740
gaaatccacc gaaaccggtt ggcgggcggg cggtgcgaat cgcgccggtg gtggtggcgg 1800
tcaggatgcc gtcgcggcga ccgccagcac ctcgccgggg gtcgggaacc ggagcagatg 1860
gtcgcgcccg gcaatggtga agcggtgggt caggtagtcg aggtgctcgg agaagtgggc 1920
ccagccctcg gcgtggacgg gcacgatcac ggcgtcgccc agcgcggccg acgccttggc 1980
ggcggtgcgg ccgttgaggg tcaggtcgat atcgccgaag cggtcgacgt tcgcggcacc 2040
gacattgagg atggcgatat cgatgcgggg gaagcgttcc gcgatccgct ccacgtactc 2100
gaccgaggca ttgtcaccgg agacgtacac ggtcggcagc ccctcggccg ccaggacgaa 2160
tccggtgacc acgccggtct ggctctcgca gccctccggc ccgtgcagcg cgggcacgcc 2220
<210> 2
<211> 526
<212> DNA
<213> 鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)
<400> 2
cgagaaggtg gtgtccgcct tcgcggtggc ctggcgttcc ggcgacctga gcgcgctgct 60
gggcgtgctg gattccaatg tcaccttcac ctccgacggc ggcggcaagg tgcaggcctt 120
cctgcatccc atgcacggcg cggagaaggt ggcccagacc ctgctcggct tcctcgcggt 180
cgcctccgat atcggtggcg cgtggggtcg ttcggtgctg gtcaacggcc gcccgggcct 240
ggtggtgttc gacggcaaga acaccggcgt cttctcgttc accatcgacg agggccgcat 300
caccaagatc gacgtggtcc gcaatcccga caagatccat ctgcccgacg atgccgagcc 360
ggactggcca ctgggcgagc aggccgacac ccgccccgaa cccggcaccc gatcctgaac 420
cgaagcccac tgctcgagcc gtaagaccgc gggcccgcaa ccactttcgg tcgcgggccc 480
gcggcatgct caggacacga cgccggtctc agcagccatg ccggtc 526
<210> 3
<211> 506
<212> DNA
<213> 鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)
<400> 3
ccccgaggcc gttccggccc gcctccgaaa tccaccgaaa ccggttggcg ggcgggcggt 60
gcgaatcgcg ccggtggtgg tggcggtcag gatgccgtcg cggcgaccgc cagcacctcg 120
ccgggggtcg ggaaccggag cagatggtcg cgcccggcaa tggtgaagcg gtgggtcagg 180
tagtcgaggt gctcggagaa gtgggcccag ccctcggcgt ggacgggcac gatcacggcg 240
tcgcccagcg cggccgacgc cttggcggcg gtgcggccgt tgagggtcag gtcgatatcg 300
ccgaagcggt cgacgttcgc ggcaccgaca ttgaggatgg cgatatcgat gcgggggaag 360
cgttccgcga tccgctccac gtactcgacc gaggcattgt caccggagac gtacacggtc 420
ggcagcccct cggccgccag gacgaatccg gtgaccacgc cggtctggct ctcgcagccc 480
tccggcccgt gcagcgcggg cacgcc 506
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgacgcgtc gagaaggtgg tgtccgcctt cg 32
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
catgccggtc ccccgaggcc gttccggccc g 31
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cctcggggga ccggcatggc tgctgag 27
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tagtctagag gcgtgcccgc gctgcac 27
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atcttgcgaa tatatgtgta ga 22
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
taaccagacc gttcagctg 19
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgagctctgg aagcagcc 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggcgacgcgg actacctc 18
<210> 12
<211> 395
<212> PRT
<213> 鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)
<400> 12
Leu Leu Phe Asp Ser Gly Ile Gly Asn Arg Val Val Ala Val Met Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ala Arg Arg Val His Asp Gly Gly Met Arg Ile Gly Val Pro
20 25 30
Arg Glu Val Lys Glu Gln Glu Tyr Arg Ile Ala Leu Thr Pro Ala Gly
35 40 45
Ala Gly Glu Leu Thr Arg His Gly His Glu Val Leu Ile Glu Ala Gly
50 55 60
Ala Gly Ile Gly Ser Gly Phe Gly Asp Ala Asp Tyr Leu Ala Ala Gly
65 70 75 80
Ala Arg Ile Ala Pro Gly Pro Glu Gln Val Trp Gly Glu Ala Glu Leu
85 90 95
Val Leu Lys Val Lys Glu Pro Ile Ala Glu Glu Tyr Ser Arg Met Arg
100 105 110
Glu Gly Gln Val Leu Phe Thr Phe Leu His Leu Ala Ala Ser Arg Glu
115 120 125
Cys Thr Asp Ala Ile Leu Arg Ser Gly Ile Thr Ala Ile Ala Tyr Glu
130 135 140
Thr Val Arg Ala Ala Asp Gly Ser Leu Pro Leu Leu Ala Pro Met Ser
145 150 155 160
Glu Val Ala Gly Lys Leu Gly Ala Gln Val Gly Ala Tyr His Leu Met
165 170 175
Ser Pro Gln Gly Gly Ala Gly Val Leu Leu Gly Gly Val Pro Gly Val
180 185 190
Arg Pro Ala Asp Val Val Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Gly Ser Asn
195 200 205
Ala Ala Val Val Ala Val Gly Met Gly Ala Arg Val Thr Val Leu Asp
210 215 220
Thr Asn Ile Ala Arg Leu Arg Glu Leu Asp Ala Arg Phe Gly Gly Arg
225 230 235 240
Val Ala Thr Ile Gly Ser Asn Ala Ala Glu Val Glu Lys Ala Val Leu
245 250 255
Ala Ala Asp Leu Val Ile Gly Ser Val Leu Val Pro Gly Ala Arg Ala
260 265 270
Pro Lys Leu Val Ser Asp Thr Leu Val Ala His Met Arg Pro Gly Ser
275 280 285
Val Leu Val Asp Ile Ala Ile Asp Gln Gly Gly Cys Phe Gln Ser Ser
290 295 300
Arg Pro Thr Thr His Ala Glu Pro Thr Phe His Val Ala Asp Ser Leu
305 310 315 320
Phe Tyr Cys Val Ala Asn Met Pro Gly Ala Val Pro His Thr Ser Thr
325 330 335
Ile Ala Leu Thr Asn Ala Thr Leu Pro Tyr Ala Arg Ala Ile Ala Asp
340 345 350
Arg Gly Trp Arg Asp Ala Cys Ala Val Asp Gln Gly Leu Ala Gln Gly
355 360 365
Leu Thr Ala His Ala Gly Gln Leu Tyr Ser Pro Glu Val Ala Thr Ala
370 375 380
His Gly Leu Arg Pro Val Thr Arg Ile Ala Ser
385 390 395

Claims (8)

1.一种鰤鱼诺卡氏菌减毒株ZJ0503-761，其特征在于，所述鰤鱼诺卡氏菌减毒株ZJ0503-761为含有丙氨酸脱氢酶基因缺失的鰤鱼诺卡氏菌菌株，其保藏号为GDMCC No：61257；所述丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:12所示。
2.一种如权利要求1所述的鰤鱼诺卡氏菌减毒株ZJ0503-761的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将所述丙氨酸脱氢酶基因的上游片段和下游片段连接至pRE112质粒中，得到重组载体；
取鰤鱼诺卡氏菌野生株ZJ0503菌株，制备鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞；
利用重组载体对鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞进行电转化，得到电转化菌液；
对电转化菌液进行培养和筛选，得到鰤鱼诺卡氏菌减毒株ZJ0503-761。
3.根据权利要求2所述的一种鰤鱼诺卡氏菌减毒株ZJ0503-761的制备方法，其特征在于，将所述丙氨酸脱氢酶基因的上游片段和下游片段连接至载体中，得到重组载体的步骤，具体包括：
将所述丙氨酸脱氢酶基因的上游片段作为上游同源臂，将所述丙氨酸脱氢酶基因的下游片段作为下游同源臂，以mLuI和Xba为酶切位点，经过酶切、酶连至载体中，构建用于同源重组的重组载体。
4.根据权利要求2或3所述的一种鰤鱼诺卡氏菌减毒株ZJ0503-761的制备方法，其特征在于，所述丙氨酸脱氢酶基因的上游片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。
5.根据权利要求2或3所述的一种鰤鱼诺卡氏菌减毒株ZJ0503-761的制备方法，其特征在于，所述丙氨酸脱氢酶基因的下游片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示。
6.根据权利要求2所述的一种鰤鱼诺卡氏菌减毒株ZJ0503-761的制备方法，其特征在于，所述步骤中，电转化的电压为180～220V，脉冲间隔时间为800～1200ms。
7.根据权利要求2所述的一种鰤鱼诺卡氏菌减毒株ZJ0503-761的制备方法，其特征在于，所述对电转化菌液进行培养和筛选，得到鰤鱼诺卡氏菌减毒株ZJ0503-761，具体包括：
将电转化菌液涂布于含有氯霉素抗性的脑心浸液琼脂平板上进行培养，得到菌落；
将菌落接种至脑心浸液肉汤液体培养基中进行培养，并筛选出缺失丙氨酸脱氢酶基因的鰤鱼诺卡氏菌菌株，得到鰤鱼诺卡氏菌减毒株ZJ0503-761。
8.一种如权利要求1所述鰤鱼诺卡氏菌减毒株ZJ0503-761在制备鰤鱼诺卡氏菌疫苗中的应用。
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