CN113186319B - 检测鰤鱼诺卡氏菌的引物、试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测鰤鱼诺卡氏菌的引物、试剂盒及方法。检测鰤鱼诺卡氏菌的引物包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.2所示。本发明解决了现有的鰤鱼诺卡氏菌检测技术周期长、检测成本高、不能应用于现场快速检测等问题。本发明提供的引物特异性好、灵敏度高且适用范围广。

Description

检测鰤鱼诺卡氏菌的引物、试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及微生物检测领域，更具体地，涉及检测鰤鱼诺卡氏菌的引物、试剂盒及方法。
背景技术
鰤鱼诺卡氏菌在分类上属于厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌纲(Actinobacteria)、放线菌目(Actinobacterales)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、诺卡氏菌属(Nocardia)。是水产养殖业中一种主要的致病菌，感染后使得鱼体表及内脏形成大量结节，还会引起鱼类体表出血及溃疡，严重影响成鱼的品质。鰤鱼诺卡氏菌自然感染发病率可达到15～30％，严重时可达50～60％，平均死亡率约20％。据不完全统计，染病的鱼种有近20种，包括卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)、大黄鱼(Larimichthys crocea)、乌鳢(Channamaculata)、大口黑鲈(Micropterus salmoides)等经济鱼类，给水产养殖业造成了较大的经济损失。以往对鰤鱼诺卡氏菌的检测，多采用传统的细菌分离培养法，由于诺卡氏菌的生长周期长，耗时太久，准确性欠佳，养殖生产中亟需一种可以操作简便的鰤鱼诺卡氏菌快速有效的检测技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的引物、试剂盒及方法。
本发明提供了一种检测鰤鱼诺卡氏菌的引物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.2所示。
本发明还提供了一种检测鰤鱼诺卡氏菌的试剂盒，该试剂盒包括上述引物。
本发明还提供了一种检测鰤鱼诺卡氏菌的方法，包括：提取待检测样品基因组DNA；构建包括以下引物的反应体系：上游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.2所示；进行37℃恒温扩增反应；通过凝胶电泳来确定是否存在鰤鱼诺卡氏菌。
本发明具有以下优点：
(1)本发明针对鰤鱼诺卡氏菌设计特异性引物，建立了鰤鱼诺卡氏菌的检测方法，可对鰤鱼诺卡氏菌进行定性检测。
(2)本发明针对鰤鱼诺卡氏菌仅用一对引物即可完成扩增，省去了LAMP等其它恒温扩增方法需要的多对引物的复杂设计过程；本发明的引物扩增只需要37℃下恒温反应即可，不需要特殊的热循环设备；反应时间仅需30min，检测时间短；不像LAMP产物的弥散带，本申请的RAA扩增产物具有特定大小的条带，其结果易于判断。
(3)本发明的RAA扩增引物特异性好、灵敏度高且适用范围广。
(4)本发明建立的鰤鱼诺卡氏菌RAA检测方法，灵敏、准确、简便和快速，对基层单位和养殖场快速检测鰤鱼诺卡氏菌具有指导意义。
附图说明
图1是采用本发明的RAA引物对鰤鱼诺卡氏菌和其他对照菌株进行特异性检测的琼脂糖凝胶电泳图，共有10条泳道：其中M:marker DL2000；1:鰤鱼诺卡氏菌NSX1株的RAA扩增产物；2:杀鲑诺卡氏菌的RAA扩增产物；3:褐色诺卡氏菌的RAA扩增产物；4:星状诺卡氏菌的RAA扩增产物；5:黄粉色诺卡氏菌的RAA扩增产物；6:绛红色诺卡氏菌的RAA扩增产物；7:紫褐诺卡氏菌的RAA扩增产物；8:河流诺卡氏菌的RAA扩增产物；N为阴性对照。
图2是采用本发明的RAA引物对鰤鱼诺卡氏菌进行灵敏度检测的琼脂糖凝胶电泳图，共有七条泳道：其中M:marker DL2000，N：阴性对照；1-5分别为鰤鱼诺卡氏菌靶基因的不同浓度的克隆质粒的扩增产物(1:100ng/μL；2:10ng/μL；3:1ng/μL；4:100pg/μL；5:10pg/μL)。
具体实施方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
通过在37℃恒温下，利用重组酶与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNA binding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在0.5h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。相比于PCR、LAMP、qPCR等检测方法，方法更简单，对实验设备要求低，能够满足基层单位对鰤鱼诺卡氏菌快速检测的需求。
本申请提供了一种鰤鱼诺卡氏菌快速检测引物，是由上游引物和下游引物组成，上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.1：5’-GGTTACGCCTCGCCCTACCCGTCCATCA-3’；
SEQ ID NO.2：5’-CCCGGTGTCCCAGTTGACCATGATCTCCC-3’。
本申请还提供了一种用于鰤鱼诺卡氏菌快速检测的方法，包括如下步骤：
(1)提取待检样品DNA
(2)进行重组酶介导扩增(RAA扩增)
以鰤鱼诺卡氏菌的DNA为模板，采用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物进行RAA扩增，得到RAA扩增产物，RAA扩增反应条件：将上述RAA扩增体系充分混匀，置于39℃的金属浴上反应30min，得到RAA扩增产物；
所述的RAA扩增体系的配制方法如下：向含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp反应管中加入再水化缓冲液41.5μL、浓度均为10μmol/L的上、下游引物各2μL，DNA模板2μL，最后再加入280mmol/L的醋酸镁溶液2.5μL。
(3)RAA扩增产物的电泳检测
向上述RAA扩增产物中加入50μL由苯酚和氯仿按体积比1:1混合而成的溶液，充分混匀后12000rpm离心2min，取5μL上清液于1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果，若RAA扩增得到的扩增产物含有大小为250bp的片段，则进一步对RAA扩增产物进行测序验证。
具体地，本发明的恒温快速检测鰤鱼诺卡氏菌的方法包括以下步骤：
(1)提取DNA
利用湖南艾科瑞生物工程有限公司的核酸提取试剂盒(SteadyPure BacterialGenomic DNA Extraction Kit，AG21007)提取鰤鱼诺卡氏菌的基因组DNA。
(2)引物设计
通过分析鰤鱼诺卡氏菌的基因组序列，我们选择NOGM004001基因片段作为靶序列，设计鰤鱼诺卡氏菌的RAA检测的特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2所示。
(3)特异性检测实验
利用所提取的鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA为模板，其他菌株的DNA为对照，SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2为特异性引物，通过杭州众测生物科技有限公司购买的基础型核酸扩增试剂盒(S001ZC)构建RAA扩增体系：向含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp反应管中加入试剂盒中的再水化缓冲液41.5μL、浓度均为10μmol/L的上、下游引物各2μL，DNA模板2μL，最后再加入280mmol/L的醋酸镁溶液2.5μL,利用振荡器将反应液混合均匀。
将以上反应体系放至金属浴上，恒温37℃反应30min。
(4)产物分析
向扩增产物中加入50μL由苯酚和氯仿按体积比1:1混合而成的溶液，充分混匀后，12000rpm离心2min，取5μL上清液于1.5％琼脂糖凝胶电泳，观察产物中是否有大小为250bp的片段。结果如图1所示，表明本申请的引物对鰤鱼诺卡氏菌具有非常高的特异性。
表1示出了本发明中所使用的不同菌株及其来源。
表1
Figure BDA0003127335020000041
Figure BDA0003127335020000051
(5)灵敏度检测实验
利用特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2扩增鰤鱼诺卡氏菌的全基因组DNA，将PCR产物进行胶回收，连接T载体后，转化至DH5α感受态细胞，挑取单克隆送至上海生工测序，将测序正确的菌液扩大培养，利OMEGA质粒提取试剂盒提取相应的重组质粒。
利用Nanodrop 2000检测含有靶基因的重组质粒的浓度，然后用ddH2O将质粒进行梯度稀释后进行RAA恒温检测，反应的体系和条件如上文所述。
实验结果参见图2：其中M为marker DL2000，N：阴性对照；1-5分别为鰤鱼诺卡氏菌靶基因的不同浓度的克隆质粒的扩增产物(1:100ng/μL；2:10ng/μL；3:1ng/μL；4:100pg/μL；5:10pg/μL)。结果表明，本申请的引物的扩增产物具有非常高的灵敏度，可以达到100pg/μL级别。
本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本申请的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。
序列表
<110> 广东海洋大学;广东海洋大学深圳研究院;深圳义海生物科技有限公司
<120> 检测鰤鱼诺卡氏菌的引物、试剂盒及方法
<130> HP200230LZ
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
cgttacgcct cgccctaccc gtccatca 28
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
cccggtgtcc cagttgacca tgatctccc 29

Claims (2)

1.一种检测鰤鱼诺卡氏菌的重组酶介导扩增引物，其特征在于，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.2所示。
2.一种检测鰤鱼诺卡氏菌的试剂盒，其特征在于，包括根据权利要求1所述的重组酶介导扩增引物。
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