一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法
技术领域
本发明属于水产养殖动物病原菌检测领域,具体涉及一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。
背景技术
副溶血弧菌(VibrioParahaemolyticus)、美人鱼发光杆菌(Photobacteriumdamsel)和鰤诺卡氏菌(Nocardiaseriolae)是三种常见的水产病原菌,其中副溶血弧菌和美人鱼发光杆菌属于革兰氏阴性菌,而鰤诺卡氏菌属于革兰氏阳性菌,这三种菌在海洋环境及水产养殖环境中广泛分布,可引起多种水产养殖动物大量死亡,造成严重的经济损失。
副溶血弧菌具有嗜盐性,可经粪-口途径传播。食用生鲜或未加工的海产食品,尤其是牡蛎,非常容易患由副溶血弧菌引起的急性肠胃炎。副溶血弧菌的爆发往往集中在沿海地区的夏季和初秋,因为这个时间段水温较高进而细菌含量更高。我们最常食用的海鲜包括乌贼、鲭鱼、金枪鱼、沙丁鱼、蟹、虾、牡蛎和蛤蚌等都容易携带副溶血弧菌。美人鱼发光杆菌具有嗜盐性,其重要致病因子是胞外蛋白酶类、胞外溶血素和细胞溶素等,现已从多种鱼类、爬行动物、软体动物和甲壳动物中分离到美人鱼发光杆菌,此菌严重威胁水产养殖重要经济品种。诺卡氏菌为属兼性细胞内病原,广泛分布在土壤、活性污泥、水、动植物和人的组织中,以腐生为主,可引发人、牛、猫、犬等哺乳动物及多种水产养殖动物疾病,已经成为一种引人注目的人-兽-鱼共患病病原。
凡纳滨对虾以其肉味鲜美,适应性强、生长迅速和抗病力强等优点,成为当今世界养殖产量最高的对虾养殖品种之一。2013年我国海水养殖虾类产量约为108万吨,其中南美白对虾产量约为81万吨,占总产量75%。然而随着养殖密度的增加及养殖环境的恶化,对虾病害日益严重。2014年对虾肝胰腺坏死症(AHPNS)席卷全球对虾产区,根据实验表明,每一尾病虾会吸引57尾健康虾的蚕食,疾病1传57,致死率可达100%。研究发现AHPNS并不是单一某种细菌造成的,而是由综合细菌引起的,并且与副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和诺卡氏菌有着密切的关联。目前养殖户采用混养模式来预防AHPNS病害,通过凡纳滨对虾与不同鱼类混养的方式,利用它们在食物链中的不同作用,及时清理病虾和死虾,降低病原传播、减少病害发生,提高养殖成功率及产量。然而这种方法并没有能从本质上去判断对虾是否患有AHPNS疾病,采用这种方法降低病原传播的概率并不高,仍可能遗漏一些患病的对虾在水域中而未被鱼类所清理,进而仍存在对其他健康对虾的传染性隐患,而且该方法存在对虾和鱼交叉感染的概率,因此存在着一些不足。
PCR技术是一种通过体外酶促反应放大扩增特定的基因的技术,该技术能将微量的DNA大幅增加,具有检测灵敏度高的特点,而多重PCR方法是PCR技术的重要分支,可检测多种特异性基因片段。三重PCR在普通PCR的基础上,在同一反应体系中加入三对引物,进而同时特异性扩增出三种目的基因片段,这样操作节省时间和成本。如何建立三重PCR方法用于快速检测副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌具有重要的实际意义和应用价值。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足,本发明所要解决的技术问题是:如何提供一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测引物组,使其可用于三重PCR检测方法中,用以检测样品是否感染有副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌。
本发明所要解决的技术问题还有:如何提供一种检测试剂盒和检测方法,用以直接检测样品是否感染有副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌,且具有精确度高、检测方便的特点。
为了解决上述技术问题,本发明采用如下技术方案:一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测引物组,包括引物对V.pa、引物对N.se和引物对P.da;其中,所述引物对V.pa包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的V.pa-F和核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的V.pa-R;所述引物对N.se包括核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的N.se-F和核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的N.se-R;所述引物对P.da包括核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的P.da-F和核苷酸序列如SEQIDNO.6所示的P.da-F。
一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测试剂盒,包括上述检测引物组。
采用上述检测试剂盒进行检测的方法,包括如下步骤:
1)取待检测样品50~100mg并加入500~550μL的TE缓冲液,用玻璃匀浆器充分匀浆后,于12000r/min离心10min;
2)步骤1)离心后去除沉淀,取上清备用;
3)向步骤2)上清溶液中加入30μL质量浓度为10%的SDS溶液和15μL20mg/mL的蛋白酶K,并于37℃温育1h;
4)向步骤3)温育后的溶液中加入100μL5mol/L的NaCl溶液,充分混匀后再加入80μLCTAB的NaCl溶液,65℃温育20min;
5)向步骤4)温育后的溶液中加入与温育后的溶液等体积的酚-氯仿-异戊醇混合溶液混匀,12000g/min离心4~5min;
6)将步骤5)离心后的上清转入一只新管中,加入上清液0.6~0.8倍体积的异丙醇,12000g/min离心4~5min;
7)步骤6)离心后去上清,沉淀用1mL的体积浓度为70%的乙醇洗涤后,12000g/min离心4~5min;
8)步骤7)离心后去上清,沉淀常温干燥5~10min,重溶于30~50μLTE缓冲液,即为样品DNA模板;
9)样品组三重PCR反应体系包括:12.5μL2×PCRDsMix、0.8μL引物V.pa-F、0.8μL引物V.pa-R、1.2μL引物N.se-F、1.2μL引物N.se-R、1.6μL引物P.da-F、1.6μL引物P.da-R、3μL步骤8)得到的样品DNA模板和2.3μL无菌水;
10)阳性对照组三重PCR反应体系包括:12.5μL2×PCRDsMix、0.8μL引物V.pa-F、0.8μL引物V.pa-R、1.2μL引物N.se-F、1.2μL引物N.se-R、1.6μL引物P.da-F、1.6μL引物P.da-R、3μL阳性对照品和2.3μL无菌水;
11)将步骤9)制得的样品组和步骤10)制得的阳性对照组分别混匀后12000g/min离心10s,置于PCR仪中,分别于94℃预变性5min,94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min,35个循环,72℃延伸10min,进行PCR反应;
12)对步骤11)PCR反应结果进行电泳检测,分别设置样品孔、阳性对照孔和参比孔;所述样品孔取步骤11)样品组PCR反应产物5μL与6×LoadingBuffer1μL混合,加入到1%琼脂糖凝胶点样孔中;所述阳性对照孔取步骤11)阳性对照组PCR反应产物5μL与6×LoadingBuffer1μL混合,加入到1%琼脂糖凝胶点样孔中;所述参比孔取5μLDL2000DNAMarker加入到1%琼脂糖凝胶点样孔中;以140V电压分别对所述样品孔、所述阳性对照孔和所述参比孔进行电泳20min后,于凝胶成像系统下观察结果;若样品孔电泳条带出现与阳性对照孔相同大小的条带,则说明待测样品中含有相对应的细菌。
相比现有技术,本发明具有如下有益效果:
1、本发明引物组具有高特异性,可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否,从而能够确定样品是否含有副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌或鰤诺卡氏菌,能够实现对副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌进行检测。
2、采用本发明检测试剂盒可以同时对三种病原菌进行检测,即进行一次实验就可以得到三种病原菌的检测结果,并且在5个小时左右完成检测。相比传统检测方法,不仅节约了成本和时间,也减少了劳动力的支出。
3、本发明的副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌三重PCR检测方法,不但使得南美白对虾养殖水体病原检测更加快速,而且可用于南美白对虾混养过程中各时期跟踪检测中,可以对病害的爆发进行及时预警,避免病原菌传播流行,减少对虾和鱼交叉感染的概率,降低对虾及其混养鱼类疾病爆发的风险,提高科学管理效率,具有很高的实用价值,有利于增加养殖效益。
4、本发明的检测操作简单,不需要使用复杂仪器,也不需要特殊试剂,只需常规PCR仪即可,对检测人员的技术素质要求较低,只需进行简单培训即可。
5、本发明应用范围广泛。本发明不仅可以检测南美白对虾养殖水体中的副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌,也可针对其他环境或患病动物进行快速检测。
6、本发明检测试剂盒制备成本低廉,制备工艺简单,容易实现工业化大生产,具有广阔的市场前景。
附图说明
图1为实施例2中三重PCR扩增产物及单一PCR扩增产物检测结果电泳图;
图2为实施例5中养殖水体样品检测结果电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和说明书附图对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施,现给出详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于以下的实施例。
实施例1细菌基因组DNA的提取
分别取副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌(南海水产研究所渔业生物病害研究室自存),采用如下步骤进行DNA提取:
(1)用500-550μL的TE缓冲液重悬细菌;
(2)向步骤(1)重悬后的溶液中加入30μL质量浓度为10%的SDS溶液和15μL的蛋白酶K(20mg/mL),混合均匀并于37℃温育1h;
(3)向步骤(2)温育后的溶液中加入100μL5mol/L的NaCl溶液,充分混匀后再加入80μLCTAB的NaCl溶液溶液(将CTAB溶于0.5mol/L的NaCl溶液中,CTAB和所述NaCl溶液的质量体积比为1:20),于65℃温育20min;
(4)向步骤(3)温育后的溶液中加入与步骤(3)温育后的溶液等体积的酚-氯仿-异戊醇(酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1)的混合溶液混匀,12000g/min离心4-5min;
(5)将步骤(4)离心后的上清转入一只新管中,加入上清液0.6-0.8倍体积的异丙醇,12000g/min离心4-5min;
(6)步骤(5)离心后去上清,沉淀用1mL的体积浓度为70%乙醇洗涤后,12000g/min离心4-5min;
(7)步骤(6)离心后去上清,沉淀常温干燥5-10min,重溶于30-50μLTE缓冲液,备用。
实施例2副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌三重PCR检测引物组的设计和有效性检测
1、分别选取副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的特异性基因(GI:6714616、GI:2988378、GI:696553489),采用PrimerPremier5.0软件分析设计出相应的引物对,各引物对能分别各自专一性鉴别上述细菌的特异性,引物序列如下所示:
2、有效性检测:
(1)合成上述设计的引物组,用引物组的引物分别对实施例1提取的副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的DNA进行单一PCR验证,其中单一PCR反应体系如下:
(2)同时对副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌进行三重PCR验证,采用如下三重PCR反应体系:
(3)采用如下PCR反应程序,对上述PCR反应体系进行PCR反应:
1)94℃预变性5min。
2)94℃变性30s。
55℃退火30s。
72℃延伸1min。
共计35个循环。
3)72℃延伸10min。
上述PCR反应结束后,分别取各组PCR反应产物5μL与6×LoadingBuffer1μL混合,分别加入到质量浓度为1%的琼脂糖凝胶点样孔中,同时在样品孔旁添加对照组,对照组琼脂糖凝胶点样孔中加入5μLDL2000DNAMarker作对照,以140V电压进行电泳,约20min后于凝胶成像系统下观察结果。
3、检测结果:
检测结果如图1所示,图1中泳道M为MarkerDL2000;泳道1为副溶血弧菌单一PCR的扩增结果,目的扩增片段长度为464bp;泳道2为副溶血弧菌单一PCR的阴性对照;泳道3为鰤诺卡氏菌单一PCR的扩增结果,目的扩增片段长度为690bp;泳道4为鰤诺卡氏菌单一PCR的阴性对照;泳道5为美人鱼发光杆菌单一PCR的扩增结果,目的扩增片段长度为954bp;泳道6为美人鱼发光杆菌单一PCR的阴性对照;泳道7为三种病原菌三重PCR的扩增结果,从下到上依次为副溶血弧菌、鰤诺卡氏菌和美人鱼发光杆菌;泳道8为三种病原菌三重PCR的的阴性对照;从图1可以看出单一PCR检测相应的单一条带及三重PCR检测相应的3条单一条带,分别与副溶血弧菌、鰤诺卡氏菌和美人鱼发光杆菌的扩增片段长度分别为464、690和954bp相吻合,即说明本发明的副溶血弧菌、鰤诺卡氏菌和美人鱼发光杆菌检测用引物组可以准确、特异性地检测出副溶血弧菌、鰤诺卡氏菌和美人鱼发光杆菌。
实施例4检测试剂盒
本实施例的检测试剂盒可用于三重PCR快速诊断样品中是否含有副溶血弧菌、鰤诺卡氏菌和美人鱼发光杆菌,该检测试剂盒由副溶血弧菌、鰤诺卡氏菌和美人鱼发光杆菌的检测用引物组、蛋白酶K、SDS溶液、酚-氯仿-异戊醇混合溶液、异丙醇、体积浓度为70%的乙醇、TE缓冲液、CTAB的NaCl溶液、阳性对照品和PCRDsMix组成,其中:
(1)副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌检测用引物组:1管内装副溶血弧菌引物V.pa-F及V.pa-R,其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示;2管内装美人鱼发光杆菌引物N.se-F及N.se-R,其核苷酸序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示;3管内装鰤诺卡氏菌引物P.da-F及P.da-R,其核苷酸序列分别如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示;以上引物浓度分别为10μM。
(2)蛋白酶K(20mg/mL),置于容器,1管;
(3)质量浓度为10%SDS,置于容器,1管;
(4)酚-氯仿-异戊醇混合溶液(体积比25:24:1),置于容器,1管;
(5)异丙醇,置于容器,1管;
(6)制备体积浓度为70%乙醇,置于容器,1管;
(7)制备TE缓冲液(10mMTris-HCl,0.1mMEDTA,pH8.0),置于容器,1管;
(8)制备CTAB的NaCl溶液(5gCTAB溶于100mL0.5MNaCl溶液中),置于容器,1管;
(9)制备阳性对照品:提取副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的基因组DNA,等体积混合,置于容器,1管;
(10)2×PCRDsMix,置于容器,1管;
(11)一块泡沫板,将上述13个小管分别对应放置于泡沫板的孔内,装于盒中即制备得到本实施例的检测试剂盒。
本实施例中各试剂管制备后均经过抽样质检,对其质量进行监控。
实施例5利用实施例4制得的试剂盒进行检测的方法
1、本实施例采用实施例4制备所得试剂盒,采用三重PCR对凡纳滨对虾养殖水体样品是否含有副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌进行快速检测,其具体步骤如下:
(1)取待检测水体样品50ml于12000r/min离心10min;
(2)步骤1)离心后去上清,加入500-550μL的TE缓冲液重悬沉淀,备用;
(3)向步骤(2)重悬后的溶液中加入30μL质量浓度为10%的SDS溶液和15μL的蛋白酶K(20mg/mL),并于37℃温育1h;
(4)向步骤(3)温育后的溶液中加入100μL5mol/LNaCl,充分混匀后再加入80μLCTAB的NaCl溶液,65℃温育20min;
(5)向步骤(4)温育后的溶液中加入与温育后的溶液等体积的酚-氯仿-异戊醇混合溶液混匀,12000g/min离心4min;
(6)将步骤(5)离心后的上清转入一只新管中,加入上清液0.6倍体积的异丙醇,12000g/min离心4min;
(7)步骤(6)离心后去上清,沉淀用1mL的体积浓度70%乙醇洗涤后,12000g/min离心4min;
(8)步骤(7)离心后去上清,沉淀常温干燥10min,重溶于30-50μLTE缓冲液,即为样品DNA模板;
(9)样品组三重PCR反应体系包括:12.5μL2×PCRDsMix、0.8μL引物V.pa-F(10μM)、0.8μL引物V.pa-R(10μM)、1.2μL引物N.se-F(10μM)、1.2μL引物N.se-R(10μM)、1.6μL引物P.da-F10μM)、1.6μL引物P.da-R(10μM)、3μL步骤(8)得到的样品DNA模板和2.3μL无菌水;
(10)阳性对照组三重PCR反应体系包括:12.5μL2×PCRDsMix、0.8μL引物V.pa-F(10μM)、0.8μL引物V.pa-R(10μM)、1.2μL引物N.se-F(10μM)、1.2μL引物N.se-R(10μM)、1.6μL引物P.da-F10μM)、1.6μL引物P.da-R(10μM)、3μL阳性对照品和2.3μL无菌水;
(11)将步骤9)制得的样品组和步骤10)制得的阳性对照组分别混匀后12000g/min离心10s,置于PCR仪中,分别94℃预变性5min,(94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min)35个循环,72℃延伸10min,进行PCR反应;
(12)对步骤11)PCR反应结果进行电泳检测,分别设置样品孔、阳性对照孔和参比孔;所述样品孔取步骤11)样品组PCR反应产物5μL与6×LoadingBuffer1μL混合,加入到1%琼脂糖凝胶点样孔中;所述阳性对照孔取步骤11)阳性对照组PCR反应产物5μL与6×LoadingBuffer1μL混合,加入到1%琼脂糖凝胶点样孔中;所述参比孔取5μLDL2000DNAMarker加入到1%琼脂糖凝胶点样孔中;以140V电压分别对所述样品孔、所述阳性对照孔和所述参比孔进行电泳约20min后,于凝胶成像系统下观察结果;若样品电泳条带出现与阳性对照相同大小的条带(副溶血弧菌464bp、鰤诺卡氏菌690bp、美人鱼发光杆菌954bp),则说明待测样品含有相对应的细菌。
2、检测结果:
检测结果如图2所示,图2中泳道M为MarkerDL2000;泳道1为三种病原菌三重PCR阴性对照;泳道2为三种病原菌三重PCR阳性对照;泳道3为含有三种病原菌养殖水体样品的三重PCR扩增结果;泳道4为不含有三种病原菌养殖水体样品的三重PCR扩增结果;从图2可以看出含有三种病原菌养殖水体样品检测出相应的3条条带,并且与阳性对照条带大小相同,不含有三种病原菌养殖水体样品并未检测出条带,即说明本发明的副溶血弧菌、鰤诺卡氏菌和美人鱼发光杆菌检测用引物组可以准确、特异性地检测出养殖水体中是否含有副溶血弧菌、鰤诺卡氏菌和美人鱼发光杆菌。
上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。