CN105176997A - 一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法；所述引物组包括引物对V.pa、引物对N.se和引物对P.da，所述引物对的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1～6所示；所述检测试剂盒包括上述检测引物组；所述检测方法运用上述检测试剂盒进行检测，先对样品进行前处理，并提取基因组DNA作为样品组DNA，再采用PCR方法对样品进行检测。本发明建立了一套三重PCR检测方法，可用于对各时期的副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌进行跟踪检测，避免病原菌传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。

Description

一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法

技术领域

本发明属于水产养殖动物病原菌检测领域，具体涉及一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。

背景技术

副溶血弧菌(VibrioParahaemolyticus)、美人鱼发光杆菌(Photobacteriumdamsel)和鰤诺卡氏菌(Nocardiaseriolae)是三种常见的水产病原菌，其中副溶血弧菌和美人鱼发光杆菌属于革兰氏阴性菌，而鰤诺卡氏菌属于革兰氏阳性菌，这三种菌在海洋环境及水产养殖环境中广泛分布，可引起多种水产养殖动物大量死亡，造成严重的经济损失。

副溶血弧菌具有嗜盐性，可经粪-口途径传播。食用生鲜或未加工的海产食品，尤其是牡蛎，非常容易患由副溶血弧菌引起的急性肠胃炎。副溶血弧菌的爆发往往集中在沿海地区的夏季和初秋，因为这个时间段水温较高进而细菌含量更高。我们最常食用的海鲜包括乌贼、鲭鱼、金枪鱼、沙丁鱼、蟹、虾、牡蛎和蛤蚌等都容易携带副溶血弧菌。美人鱼发光杆菌具有嗜盐性，其重要致病因子是胞外蛋白酶类、胞外溶血素和细胞溶素等，现已从多种鱼类、爬行动物、软体动物和甲壳动物中分离到美人鱼发光杆菌，此菌严重威胁水产养殖重要经济品种。诺卡氏菌为属兼性细胞内病原，广泛分布在土壤、活性污泥、水、动植物和人的组织中，以腐生为主，可引发人、牛、猫、犬等哺乳动物及多种水产养殖动物疾病，已经成为一种引人注目的人-兽-鱼共患病病原。

凡纳滨对虾以其肉味鲜美，适应性强、生长迅速和抗病力强等优点，成为当今世界养殖产量最高的对虾养殖品种之一。2013年我国海水养殖虾类产量约为108万吨，其中南美白对虾产量约为81万吨，占总产量75％。然而随着养殖密度的增加及养殖环境的恶化，对虾病害日益严重。2014年对虾肝胰腺坏死症(AHPNS)席卷全球对虾产区，根据实验表明，每一尾病虾会吸引57尾健康虾的蚕食，疾病1传57，致死率可达100％。研究发现AHPNS并不是单一某种细菌造成的，而是由综合细菌引起的，并且与副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和诺卡氏菌有着密切的关联。目前养殖户采用混养模式来预防AHPNS病害，通过凡纳滨对虾与不同鱼类混养的方式，利用它们在食物链中的不同作用，及时清理病虾和死虾，降低病原传播、减少病害发生，提高养殖成功率及产量。然而这种方法并没有能从本质上去判断对虾是否患有AHPNS疾病，采用这种方法降低病原传播的概率并不高，仍可能遗漏一些患病的对虾在水域中而未被鱼类所清理，进而仍存在对其他健康对虾的传染性隐患，而且该方法存在对虾和鱼交叉感染的概率，因此存在着一些不足。

PCR技术是一种通过体外酶促反应放大扩增特定的基因的技术，该技术能将微量的DNA大幅增加，具有检测灵敏度高的特点，而多重PCR方法是PCR技术的重要分支，可检测多种特异性基因片段。三重PCR在普通PCR的基础上，在同一反应体系中加入三对引物，进而同时特异性扩增出三种目的基因片段，这样操作节省时间和成本。如何建立三重PCR方法用于快速检测副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌具有重要的实际意义和应用价值。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题是：如何提供一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测引物组，使其可用于三重PCR检测方法中，用以检测样品是否感染有副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌。

本发明所要解决的技术问题还有：如何提供一种检测试剂盒和检测方法，用以直接检测样品是否感染有副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌，且具有精确度高、检测方便的特点。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测引物组，包括引物对V.pa、引物对N.se和引物对P.da；其中，所述引物对V.pa包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的V.pa-F和核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的V.pa-R；所述引物对N.se包括核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的N.se-F和核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的N.se-R；所述引物对P.da包括核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的P.da-F和核苷酸序列如SEQIDNO.6所示的P.da-F。

一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测试剂盒，包括上述检测引物组。

采用上述检测试剂盒进行检测的方法，包括如下步骤：

1)取待检测样品50～100mg并加入500～550μL的TE缓冲液，用玻璃匀浆器充分匀浆后，于12000r/min离心10min；

2)步骤1)离心后去除沉淀，取上清备用；

3)向步骤2)上清溶液中加入30μL质量浓度为10％的SDS溶液和15μL20mg/mL的蛋白酶K，并于37℃温育1h；

4)向步骤3)温育后的溶液中加入100μL5mol/L的NaCl溶液,充分混匀后再加入80μLCTAB的NaCl溶液，65℃温育20min；

5)向步骤4)温育后的溶液中加入与温育后的溶液等体积的酚-氯仿-异戊醇混合溶液混匀，12000g/min离心4～5min；

6)将步骤5)离心后的上清转入一只新管中，加入上清液0.6～0.8倍体积的异丙醇，12000g/min离心4～5min；

7)步骤6)离心后去上清，沉淀用1mL的体积浓度为70％的乙醇洗涤后，12000g/min离心4～5min；

8)步骤7)离心后去上清，沉淀常温干燥5～10min，重溶于30～50μLTE缓冲液，即为样品DNA模板；

9)样品组三重PCR反应体系包括：12.5μL2×PCRDsMix、0.8μL引物V.pa-F、0.8μL引物V.pa-R、1.2μL引物N.se-F、1.2μL引物N.se-R、1.6μL引物P.da-F、1.6μL引物P.da-R、3μL步骤8)得到的样品DNA模板和2.3μL无菌水；

10)阳性对照组三重PCR反应体系包括：12.5μL2×PCRDsMix、0.8μL引物V.pa-F、0.8μL引物V.pa-R、1.2μL引物N.se-F、1.2μL引物N.se-R、1.6μL引物P.da-F、1.6μL引物P.da-R、3μL阳性对照品和2.3μL无菌水；

11)将步骤9)制得的样品组和步骤10)制得的阳性对照组分别混匀后12000g/min离心10s，置于PCR仪中，分别于94℃预变性5min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min，进行PCR反应；

12)对步骤11)PCR反应结果进行电泳检测，分别设置样品孔、阳性对照孔和参比孔；所述样品孔取步骤11)样品组PCR反应产物5μL与6×LoadingBuffer1μL混合，加入到1％琼脂糖凝胶点样孔中；所述阳性对照孔取步骤11)阳性对照组PCR反应产物5μL与6×LoadingBuffer1μL混合，加入到1％琼脂糖凝胶点样孔中；所述参比孔取5μLDL2000DNAMarker加入到1％琼脂糖凝胶点样孔中；以140V电压分别对所述样品孔、所述阳性对照孔和所述参比孔进行电泳20min后，于凝胶成像系统下观察结果；若样品孔电泳条带出现与阳性对照孔相同大小的条带，则说明待测样品中含有相对应的细菌。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明引物组具有高特异性，可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否，从而能够确定样品是否含有副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌或鰤诺卡氏菌，能够实现对副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌进行检测。

2、采用本发明检测试剂盒可以同时对三种病原菌进行检测，即进行一次实验就可以得到三种病原菌的检测结果，并且在5个小时左右完成检测。相比传统检测方法，不仅节约了成本和时间，也减少了劳动力的支出。

3、本发明的副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌三重PCR检测方法，不但使得南美白对虾养殖水体病原检测更加快速，而且可用于南美白对虾混养过程中各时期跟踪检测中，可以对病害的爆发进行及时预警，避免病原菌传播流行，减少对虾和鱼交叉感染的概率，降低对虾及其混养鱼类疾病爆发的风险，提高科学管理效率，具有很高的实用价值，有利于增加养殖效益。

4、本发明的检测操作简单，不需要使用复杂仪器，也不需要特殊试剂，只需常规PCR仪即可，对检测人员的技术素质要求较低，只需进行简单培训即可。

5、本发明应用范围广泛。本发明不仅可以检测南美白对虾养殖水体中的副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌，也可针对其他环境或患病动物进行快速检测。

6、本发明检测试剂盒制备成本低廉，制备工艺简单，容易实现工业化大生产，具有广阔的市场前景。

附图说明

图1为实施例2中三重PCR扩增产物及单一PCR扩增产物检测结果电泳图；

图2为实施例5中养殖水体样品检测结果电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和说明书附图对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。

实施例1细菌基因组DNA的提取

分别取副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌(南海水产研究所渔业生物病害研究室自存)，采用如下步骤进行DNA提取：

(1)用500-550μL的TE缓冲液重悬细菌；

(2)向步骤(1)重悬后的溶液中加入30μL质量浓度为10％的SDS溶液和15μL的蛋白酶K(20mg/mL)，混合均匀并于37℃温育1h；

(3)向步骤(2)温育后的溶液中加入100μL5mol/L的NaCl溶液，充分混匀后再加入80μLCTAB的NaCl溶液溶液(将CTAB溶于0.5mol/L的NaCl溶液中，CTAB和所述NaCl溶液的质量体积比为1:20)，于65℃温育20min；

(4)向步骤(3)温育后的溶液中加入与步骤(3)温育后的溶液等体积的酚-氯仿-异戊醇(酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1)的混合溶液混匀，12000g/min离心4-5min；

(5)将步骤(4)离心后的上清转入一只新管中，加入上清液0.6-0.8倍体积的异丙醇，12000g/min离心4-5min；

(6)步骤(5)离心后去上清，沉淀用1mL的体积浓度为70％乙醇洗涤后，12000g/min离心4-5min；

(7)步骤(6)离心后去上清，沉淀常温干燥5-10min，重溶于30-50μLTE缓冲液，备用。

实施例2副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌三重PCR检测引物组的设计和有效性检测

1、分别选取副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的特异性基因(GI:6714616、GI:2988378、GI:696553489)，采用PrimerPremier5.0软件分析设计出相应的引物对，各引物对能分别各自专一性鉴别上述细菌的特异性，引物序列如下所示：

2、有效性检测：

(1)合成上述设计的引物组，用引物组的引物分别对实施例1提取的副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的DNA进行单一PCR验证，其中单一PCR反应体系如下：

(2)同时对副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌进行三重PCR验证，采用如下三重PCR反应体系：

(3)采用如下PCR反应程序，对上述PCR反应体系进行PCR反应：

1)94℃预变性5min。

2)94℃变性30s。

55℃退火30s。

72℃延伸1min。

共计35个循环。

3)72℃延伸10min。

上述PCR反应结束后，分别取各组PCR反应产物5μL与6×LoadingBuffer1μL混合，分别加入到质量浓度为1％的琼脂糖凝胶点样孔中，同时在样品孔旁添加对照组，对照组琼脂糖凝胶点样孔中加入5μLDL2000DNAMarker作对照，以140V电压进行电泳，约20min后于凝胶成像系统下观察结果。

3、检测结果：

检测结果如图1所示，图1中泳道M为MarkerDL2000；泳道1为副溶血弧菌单一PCR的扩增结果，目的扩增片段长度为464bp；泳道2为副溶血弧菌单一PCR的阴性对照；泳道3为鰤诺卡氏菌单一PCR的扩增结果，目的扩增片段长度为690bp；泳道4为鰤诺卡氏菌单一PCR的阴性对照；泳道5为美人鱼发光杆菌单一PCR的扩增结果，目的扩增片段长度为954bp；泳道6为美人鱼发光杆菌单一PCR的阴性对照；泳道7为三种病原菌三重PCR的扩增结果，从下到上依次为副溶血弧菌、鰤诺卡氏菌和美人鱼发光杆菌；泳道8为三种病原菌三重PCR的的阴性对照；从图1可以看出单一PCR检测相应的单一条带及三重PCR检测相应的3条单一条带，分别与副溶血弧菌、鰤诺卡氏菌和美人鱼发光杆菌的扩增片段长度分别为464、690和954bp相吻合，即说明本发明的副溶血弧菌、鰤诺卡氏菌和美人鱼发光杆菌检测用引物组可以准确、特异性地检测出副溶血弧菌、鰤诺卡氏菌和美人鱼发光杆菌。

实施例4检测试剂盒

本实施例的检测试剂盒可用于三重PCR快速诊断样品中是否含有副溶血弧菌、鰤诺卡氏菌和美人鱼发光杆菌，该检测试剂盒由副溶血弧菌、鰤诺卡氏菌和美人鱼发光杆菌的检测用引物组、蛋白酶K、SDS溶液、酚-氯仿-异戊醇混合溶液、异丙醇、体积浓度为70％的乙醇、TE缓冲液、CTAB的NaCl溶液、阳性对照品和PCRDsMix组成，其中：

(1)副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌检测用引物组：1管内装副溶血弧菌引物V.pa-F及V.pa-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；2管内装美人鱼发光杆菌引物N.se-F及N.se-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；3管内装鰤诺卡氏菌引物P.da-F及P.da-R，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；以上引物浓度分别为10μM。

(2)蛋白酶K(20mg/mL)，置于容器，1管；

(3)质量浓度为10％SDS，置于容器，1管；

(4)酚-氯仿-异戊醇混合溶液(体积比25:24:1)，置于容器，1管；

(5)异丙醇，置于容器，1管；

(6)制备体积浓度为70％乙醇，置于容器，1管；

(7)制备TE缓冲液(10mMTris-HCl,0.1mMEDTA，pH8.0)，置于容器，1管；

(8)制备CTAB的NaCl溶液(5gCTAB溶于100mL0.5MNaCl溶液中)，置于容器，1管；

(9)制备阳性对照品：提取副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的基因组DNA，等体积混合，置于容器，1管；

(10)2×PCRDsMix，置于容器，1管；

(11)一块泡沫板，将上述13个小管分别对应放置于泡沫板的孔内，装于盒中即制备得到本实施例的检测试剂盒。

本实施例中各试剂管制备后均经过抽样质检，对其质量进行监控。

实施例5利用实施例4制得的试剂盒进行检测的方法

1、本实施例采用实施例4制备所得试剂盒，采用三重PCR对凡纳滨对虾养殖水体样品是否含有副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌进行快速检测，其具体步骤如下：

(1)取待检测水体样品50ml于12000r/min离心10min；

(2)步骤1)离心后去上清，加入500-550μL的TE缓冲液重悬沉淀，备用；

(3)向步骤(2)重悬后的溶液中加入30μL质量浓度为10％的SDS溶液和15μL的蛋白酶K(20mg/mL)，并于37℃温育1h；

(4)向步骤(3)温育后的溶液中加入100μL5mol/LNaCl,充分混匀后再加入80μLCTAB的NaCl溶液，65℃温育20min；

(5)向步骤(4)温育后的溶液中加入与温育后的溶液等体积的酚-氯仿-异戊醇混合溶液混匀，12000g/min离心4min；

(6)将步骤(5)离心后的上清转入一只新管中，加入上清液0.6倍体积的异丙醇，12000g/min离心4min；

(7)步骤(6)离心后去上清，沉淀用1mL的体积浓度70％乙醇洗涤后，12000g/min离心4min；

(8)步骤(7)离心后去上清，沉淀常温干燥10min，重溶于30-50μLTE缓冲液，即为样品DNA模板；

(9)样品组三重PCR反应体系包括：12.5μL2×PCRDsMix、0.8μL引物V.pa-F(10μM)、0.8μL引物V.pa-R(10μM)、1.2μL引物N.se-F(10μM)、1.2μL引物N.se-R(10μM)、1.6μL引物P.da-F10μM)、1.6μL引物P.da-R(10μM)、3μL步骤(8)得到的样品DNA模板和2.3μL无菌水；

(10)阳性对照组三重PCR反应体系包括：12.5μL2×PCRDsMix、0.8μL引物V.pa-F(10μM)、0.8μL引物V.pa-R(10μM)、1.2μL引物N.se-F(10μM)、1.2μL引物N.se-R(10μM)、1.6μL引物P.da-F10μM)、1.6μL引物P.da-R(10μM)、3μL阳性对照品和2.3μL无菌水；

(11)将步骤9)制得的样品组和步骤10)制得的阳性对照组分别混匀后12000g/min离心10s，置于PCR仪中，分别94℃预变性5min，(94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min)35个循环，72℃延伸10min，进行PCR反应；

(12)对步骤11)PCR反应结果进行电泳检测，分别设置样品孔、阳性对照孔和参比孔；所述样品孔取步骤11)样品组PCR反应产物5μL与6×LoadingBuffer1μL混合，加入到1％琼脂糖凝胶点样孔中；所述阳性对照孔取步骤11)阳性对照组PCR反应产物5μL与6×LoadingBuffer1μL混合，加入到1％琼脂糖凝胶点样孔中；所述参比孔取5μLDL2000DNAMarker加入到1％琼脂糖凝胶点样孔中；以140V电压分别对所述样品孔、所述阳性对照孔和所述参比孔进行电泳约20min后，于凝胶成像系统下观察结果；若样品电泳条带出现与阳性对照相同大小的条带(副溶血弧菌464bp、鰤诺卡氏菌690bp、美人鱼发光杆菌954bp)，则说明待测样品含有相对应的细菌。

2、检测结果：

检测结果如图2所示，图2中泳道M为MarkerDL2000；泳道1为三种病原菌三重PCR阴性对照；泳道2为三种病原菌三重PCR阳性对照；泳道3为含有三种病原菌养殖水体样品的三重PCR扩增结果；泳道4为不含有三种病原菌养殖水体样品的三重PCR扩增结果；从图2可以看出含有三种病原菌养殖水体样品检测出相应的3条条带，并且与阳性对照条带大小相同，不含有三种病原菌养殖水体样品并未检测出条带，即说明本发明的副溶血弧菌、鰤诺卡氏菌和美人鱼发光杆菌检测用引物组可以准确、特异性地检测出养殖水体中是否含有副溶血弧菌、鰤诺卡氏菌和美人鱼发光杆菌。

上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (7)

1.一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测引物组，其特征在于，包括引物对V.pa、引物对N.se和引物对P.da；其中，所述引物对V.pa包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的V.pa-F和核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的V.pa-R；所述引物对N.se包括核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的N.se-F和核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的N.se-R；所述引物对P.da包括核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的P.da-F和核苷酸序列如SEQIDNO.6所示的P.da-F。

2.一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述检测引物组。

3.根据权利要求2所述副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测试剂盒，其特征在于，还包括蛋白酶K、SDS溶液、酚-氯仿-异戊醇混合溶液、异丙醇、体积浓度为70％的乙醇、TE缓冲液、CTAB的NaCl溶液、阳性对照品和PCRDsMix；所述酚-氯仿-异戊醇混合溶液中酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1；所述CTAB的NaCl溶液为将CTAB溶于0.5mol/L的NaCl溶液中，CTAB和所述NaCl溶液的质量体积比为1:20；所述阳性对照品包括副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的DNA模板。

4.根据权利要求3所述副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测试剂盒，其特征在于，所述检测引物组中的引物浓度均为10μM。

5.根据权利要求3所述副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶K的浓度为20mg/mL，所述SDS溶液的质量浓度为10％。

6.根据权利要求3所述副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测试剂盒，其特征在于，所述PCRDsMix为2×PCRDsMix。

7.采用权利要求2～6任一所述检测试剂盒进行检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)取待检测样品50～100mg并加入500～550μL的TE缓冲液，用玻璃匀浆器充分匀浆后，于12000r/min离心10min；

2)步骤1)离心后去除沉淀，取上清备用；

3)向步骤2)上清溶液中加入30μL质量浓度为10％的SDS溶液和15μL20mg/mL的蛋白酶K，并于37℃温育1h；

4)向步骤3)温育后的溶液中加入100μL5mol/L的NaCl溶液,充分混匀后再加入80μLCTAB的NaCl溶液，65℃温育20min；

5)向步骤4)温育后的溶液中加入与温育后的溶液等体积的酚-氯仿-异戊醇混合溶液混匀，12000g/min离心4～5min；

6)将步骤5)离心后的上清转入一只新管中，加入上清液0.6～0.8倍体积的异丙醇，12000g/min离心4～5min；

7)步骤6)离心后去上清，沉淀用1mL的体积浓度为70％的乙醇洗涤后，12000g/min离心4～5min；

8)步骤7)离心后去上清，沉淀常温干燥5～10min，重溶于30～50μLTE缓冲液，即为样品DNA模板；

9)样品组三重PCR反应体系包括：12.5μL2×PCRDsMix、0.8μL引物V.pa-F、0.8μL引物V.pa-R、1.2μL引物N.se-F、1.2μL引物N.se-R、1.6μL引物P.da-F、1.6μL引物P.da-R、3μL步骤8)得到的样品DNA模板和2.3μL无菌水；

10)阳性对照组三重PCR反应体系包括：12.5μL2×PCRDsMix、0.8μL引物V.pa-F、0.8μL引物V.pa-R、1.2μL引物N.se-F、1.2μL引物N.se-R、1.6μL引物P.da-F、1.6μL引物P.da-R、3μL阳性对照品和2.3μL无菌水；

11)将步骤9)制得的样品组和步骤10)制得的阳性对照组分别混匀后12000g/min离心10s，置于PCR仪中，分别于94℃预变性5min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min，进行PCR反应；

12)对步骤11)PCR反应结果进行电泳检测，分别设置样品孔、阳性对照孔和参比孔；所述样品孔取步骤11)样品组PCR反应产物5μL与6×LoadingBuffer1μL混合，加入到1％琼脂糖凝胶点样孔中；所述阳性对照孔取步骤11)阳性对照组PCR反应产物5μL与6×LoadingBuffer1μL混合，加入到1％琼脂糖凝胶点样孔中；所述参比孔取5μLDL2000DNAMarker加入到1％琼脂糖凝胶点样孔中；以140V电压分别对所述样品孔、所述阳性对照孔和所述参比孔进行电泳20min后，于凝胶成像系统下观察结果；若样品孔电泳条带出现与阳性对照孔相同大小的条带，则说明待测样品中含有相对应的细菌。