CN109395071B - 一种美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu - Google Patents

一种美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有免疫保护作用的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF‑Tu，在制备美人鱼发光杆菌亚单位疫苗中的应用，其中美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF‑Tu的制备方法包括pMD18‑T‑EF‑Tu重组载体的构建、质粒pET32a‑EF‑Tu的构建、美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF‑Tu的诱导表达和美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF‑Tu的验证。本发明提供了一种具有免疫保护作用的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF‑Tu，利用原核表达系统对其表达和纯化，通过动物实验评估该美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF‑Tu的免疫保护力，为进一步研制美人鱼发光杆菌亚单位疫苗和核酸疫苗选择奠定基础。

Description

一种美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu。
背景技术
美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)是嗜盐病原菌中的重要成员，患病鱼临床以出血性败血症为典型特征，发病迅速，死亡率高，能够造成海洋经济鱼类养殖业的重大经济损失。同时，美人鱼发光杆菌能够感染人和哺乳动物，具有一定的公共卫生学意义。前期研究发现美人鱼发光杆菌能够向菌体外分泌大量胞外产物，且具有良好的免疫保护作用，而转录起始因子Tu(elongation factor Tu，EF-Tu)是胞外产物的重要成分，那美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu是否具有良好的免疫保护作用则有待验证。
疫苗是控制传染病流行的重要手段,目前针对美人鱼发光杆菌感染疫苗研究仍处于初步阶段，此外该菌疫苗的开发存在难以克服的问题，一方面灭活疫苗免疫效率低下，免疫效果差强人意；另一方面，基因工程减毒疫苗虽免疫效果优良，但安全问题不容忽视。
因此，对美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu进行制备，并对美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu的免疫保护作用进行验证，为进一步研制美人鱼发光杆菌亚单位疫苗和核酸疫苗选择奠定基础是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种具有免疫保护作用的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu，利用原核表达系统对其表达和纯化，通过动物实验评估该美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu的免疫保护力，为进一步研制美人鱼发光杆菌亚单位疫苗和核酸疫苗选择奠定基础。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种具有免疫保护作用的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu，在制备美人鱼发光杆菌亚单位疫苗中的应用。
一种美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu的制备方法包括以下步骤：
1)pMD18-T-EF-Tu重组载体的构建
根据EF-Tu的基因序列设计引物如下：
EF-Tu-F：5'-GCGGATCCATGTCTAAAGAAAAATTTGAACG-3'，BamHⅠ；SEQ ID NO：1；
EF-Tu-R：5'-GCGTCGACTTAAGCGATGATTGTAGCAAC-3'，SalI，SEQ ID NO：2；
以美人鱼发光杆菌EF-Tu的基因序列为模板，EF-Tu-F和EF-Tu-F为引物，PCR扩增EF-Tu目的基因，将目的基因与pMD18-T载体连接构建pMD18-T-EF-Tu，并对所述pMD18-T-EF-Tu进行测序比对；
2)质粒pET32a-EF-Tu的构建
利用限制性内切酶BamHⅠ和SalI分别对pMD18-T-EF-Tu载体和pET-32a载体进行双酶切，构建重组表达载体pET32a-EF-Tu；
3)美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu的诱导表达
将重组载体pET32a-EF-Tu转入表达菌株中，挑取单克隆进行诱导表达美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu；
4)美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu的验证
将所述美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu进行Western blot检测验证。
进一步的，步骤1)中所述PCR扩增方法配制50μL反应体系：Taq DNA聚合酶1.0μL，PCR Buffer 5μL，DNA模板1.0μL，dNTPs 4μL，引物EF-Tu-F和EF-Tu-F各1.0μL，ddH2O 37μL；
扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s；52℃退火30s；72℃延伸1min；72℃总延伸5min。
进一步的，步骤2)中所述质粒pET32a-EF-Tu构建的具体过程为：经所述限制性内切酶酶切后回收目的条带，将所述pET-32a载体与所述pMD18-T-EF-Tu载体3:1混合，22-25℃连接过夜，转化大肠杆菌感受态细胞中，涂布Amp平板，37℃培养过夜；挑取单克隆菌落进行PCR鉴定，并将阳性菌落扩大培养，提取质粒pET32a-EF-Tu。
进一步的，步骤3)所述表达菌株为BL21，挑取单克隆菌落利用液体LB培养基进行培养，直至OD600值达到0.6时，加入浓度为1mM的IPTG诱导表达4-6h，收集菌体。
进一步的，步骤3)所述液体LB培养基中含100μg/mL的Amp；其中，所述单克隆菌落的具体培养方法为：将所述单克隆菌落在所述液体LB培养基中培养过夜，次日吸取菌液与所述液体LB培养基按照1:100的体积比进行混合，200-300rpm摇菌培养，直至OD600值达到0.6。
本发明公开提供了一种具有免疫保护作用的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu，至少有以下优点：
(1)本发明公开的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu够被美人鱼发光杆菌阳性血清所识别，且在美人鱼发光杆菌自然感染过程中，该蛋白可诱导机体产生抗体，即美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu具有较好的免疫保护力。
(2)美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu能够使机体产生较高水平特异性抗体，效价能够达到38400，具有较好的抗原性。
(3)本发明公开的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu免疫小鼠后能够使80％的免疫小鼠得到保护，具有良好的免疫保护力，美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu在美人鱼发光杆菌疫苗研究中具有广阔的前景，为进一步研制美人鱼发光杆菌亚单位疫苗和核酸疫苗选择奠定基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明提供的EF-Tu基因扩增电泳图；
图2附图为本发明提供的诱导表达的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu电泳图；
其中，泳道M为Marker；泳道1为美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu；泳道2为空载体对照；
图3附图为本发明提供的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu的western blot验证；
其中，泳道1为美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu；泳道2为空载体对照；
图4附图为本发明提供的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu的表达形式分析图；
其中，M为预染蛋白Maker；泳道1为全菌；泳道2为包涵体；泳道3为上清；
图5附图为本发明提供的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu的纯化电泳图；
其中，泳道M为Marker；泳道1为纯化前美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu；泳道2为纯化后美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1pMD18-T-EF-Tu重组载体的构建
下载Photobacterium damselae ATCC3359(ACCESSION NUMBER：NZ_CP018297)全基因组，根据EF-Tu的基因序列，设计引物如下：
EF-Tu-F：5'-GCGGATCCATGTCTAAAGAAAAATTTGAACG-3'，BamH Ⅰ；SEQ ID NO：1；
EF-Tu-R：5'-GCGTCGACTTAAGCGATGATTGTAGCAAC-3'，SalI，SEQ ID NO：2；
提取Photobacterium damselae ATCC3359基因组DNA做模板，进行PCR扩增：配制50μL反应体系：Taq DNA聚合酶1.0μL，PCR Buffer 5μL，DNA模板1.0μL，dNTPs 4μL，引物EF-Tu-F和EF-Tu-F各1.0μL，ddH2O 37μL；扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s；52℃退火30s；72℃延伸1min；72℃总延伸5min。结果如图1所示，大小符合预期，凝胶回收PCR产物。将获得的产物与T载体连接，获得重组载体pMD18-T-EF-Tu，并将测序结果与GeneBank登录基基因进行序列比对。
实施例2质粒pET32a-EF-Tu的构建
提取表达质粒pET32a和pMD18-T-EF-Tu，对表达质粒pET32a和pMD18-T-EF-Tu利用BamHⅠ和SalI分别进行双酶切，凝胶回收目的条带，对酶切后的表达质粒pET32a和pMD18-T-EF-Tu按比例3:1混合，25℃连接过夜，将连接产物加入到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min，后转入至42℃孵育90s，再次冰浴5min，加入600μL LB液体培养基37℃培养1h，将获得的菌体涂布Amp平板(50μg/mL)，37℃培养过夜；挑取单克隆菌落进行摇菌培养，使用载体通用引物：T7作为上游引物，Stag为下游引物进行PCR鉴定，扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s；54℃退火30s；72℃延伸1min；72℃总延伸5min；1％琼脂糖凝胶电泳，将阳性菌落扩大培养，保存菌种并提取质粒pET32a-EF-Tu。
实施例3美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu的诱导表达
将重组表达质粒pET32a-EF-Tu转化表达菌株BL21，挑取单克隆菌落液体LB(Amp100μg/mL、胰蛋白胨1％、氯化钠1％和酵母提取物0.5％)培养过夜，次日吸取1mL菌液接种100mL含Amp的液体LB培养基，200rpm摇菌，直至OD600值达到0.6，加入IPTG(浓度为1mM)诱导表达4h，离心收集菌体。
实施例4美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu的验证
将离心收集菌体进行PBS洗涤，每次15min，共洗涤三次，后将洗涤后的菌体利用PBS重悬，加入Loading Buffer煮沸裂解后进行SDS-PAGE：初始电压为80V,当样品到达浓缩胶与分离胶分界线时，调整电压至120V，电泳结束后，考马斯亮蓝染色和脱色，结果如图1所示，由图1可知，预期蛋白大小约为60kD，条带符合预期大小，而空载对照表达后约为15kD，与图中所示相符。同时利用His单克隆抗体进行Western blot分析：SDS-PAGE后，取凝胶转印至NC膜，使用鼠源His标签单克隆抗体作为一抗(稀释度1：5000)，羊抗鼠HRP-IgG多克隆抗体作为二抗(稀释度1：10000)，进行Western blot分析。经胶片曝光后，结果如图2所示。由图2可知EF-Tu在预期位置出现条带，空载对照(Empty vector)也符合预期。
实施例5美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu的可溶性分析及纯化
将实施例3得到的美人鱼发光杆菌膜外蛋白EF-Tu进行可溶性分析：其具体步骤为将实施例3中的菌液诱导表达后，超声破碎仪裂解菌液，功率300w，作用5s、停止5s，超声20min，4℃12000rpm离心10min，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，确定蛋白表达形式，结果如图3所示，由图3可知，美人鱼发光杆菌膜外蛋白EF-Tu的表达形式为包涵体表达。
使用His标签蛋白纯化试剂盒(康为世纪，CW0893)，根据说明书进行蛋白纯化，纯化后的蛋白进行SDS-PAGE验证，采用Nanodrop 2000测定蛋白浓度，结果如图4所示，美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu纯化效果良好，经测定，美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu的浓度可达到1.5mg/mL。
实施例6动物免疫试验
将免疫佐剂
Figure BDA0001869026860000062
adjuvant 2％(InvivoGen,Lot：AAG-33-429L)和EF-Tu抗原以体积比为1:1的比例混匀，使用PBS稀释至蛋白浓度为500μg/mL。取Blb/c小鼠分两组，每组10只。取皮下注射免疫Bab/c小鼠，其中实验组每次每只免疫50μg美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu，对照组仅注射等量的免疫佐剂；每隔10d加强免疫1次，共加强免疫2次。免疫结束后第14d尾静脉采血，分离血清。
ELISA检测抗体滴度：EF-Tu抗原包被剂量200ng每孔，4℃包被过夜；5％脱脂奶4℃封闭过夜；血清使用脱脂奶倍比稀释后，37℃孵育1h；羊抗鼠HRP-IgG，稀释度1:5000，37℃孵育1h；显色时间10min。经测定，10只小鼠血清测定结果取平均值，确定抗体滴度为38400。结果证明，美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu具有良好的免疫原性。
小鼠免疫14天后，腹腔接种PBS重悬后的美人鱼发光杆菌菌液，剂量为103LD50；攻毒后观察小鼠死亡情况。
结果：攻毒后1d，蛋白免疫组(试验组)死亡率为10％，而佐剂免疫组(对照组)高达80％；攻毒后3d和5d蛋白免疫组(试验组)死亡率为20％，而佐剂免疫组(对照组)死亡率为100％。结果表明美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu有良好的免疫保护力。
表1美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu的免疫保护效果
Figure BDA0001869026860000061
由表1可知道，美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu具有良好的免疫原性，具有一定的免疫保护力，具备作为亚单位疫苗的良好前景。
综上所述，本发明公开的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu够被美人鱼发光杆菌阳性血清所识别，且在美人鱼发光杆菌自然感染过程中，该蛋白可诱导机体产生抗体，效价能够达到38400，具有较好的抗原性。本发明公开的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu免疫小鼠后能够使80％的免疫小鼠得到保护，具有良好的免疫保护力，美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu在美人鱼发光杆菌疫苗研究中具有广阔的前景，为进一步研制美人鱼发光杆菌亚单位疫苗和核酸疫苗选择奠定基础。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 河北科技师范学院
<120> 一种美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcggatccat gtctaaagaa aaatttgaac g 31
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgtcgactt aagcgatgat tgtagcaac 29

Claims (5)

1.一种具有免疫保护作用的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu在制备美人鱼发光杆菌亚单位疫苗中的应用，其特征在于，包括下述步骤：
1）pMD18-T-EF-Tu重组载体的构建
根据EF-Tu的基因序列设计引物如下：
EF-Tu-F：5'- GCGGATCCATGTCTAAAGAAAAATTTGAACG -3'；
EF-Tu-R：5'- GCGTCGACTTAAGCGATGATTGTAGCAAC -3'；
以美人鱼发光杆菌EF-Tu的基因序列为模板，EF-Tu-F和EF-Tu-F为引物，PCR扩增EF-Tu目的基因，将目的基因与pMD18-T载体连接构建pMD18-T-EF-Tu，并对所述pMD18-T-EF-Tu进行测序比对；
2）质粒pET32a-EF-Tu的构建
利用限制性内切酶BamHⅠ和Sal I分别对pMD18-T-EF-Tu载体和pET-32a载体进行双酶切，构建重组表达载体pET32a-EF-Tu；
3）美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu的诱导表达
将重组载体pET32a-EF-Tu转入表达菌株中，挑取单克隆进行诱导，使其表达美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu；
4）美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu的验证
将所述美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu进行Western blot检测验证；
5）纯化
使用His标签蛋白纯化试剂盒，根据说明书进行蛋白纯化，纯化后的EF-Tu蛋白进行SDS-PAGE验证，并测定EF-Tu蛋白浓度；
6）制备亚单位疫苗
以2%免疫佐剂对EF-Tu蛋白进行乳化，并使用PBS稀释至EF-Tu蛋白浓度为500μg/mL，得到亚单位疫苗。
2.根据权利要求1所述的一种具有免疫保护作用的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu在制备美人鱼发光杆菌亚单位疫苗中的应用，其特征在于，步骤1）中所述PCR扩增方法为：
配制50μL反应体系：Taq DNA聚合酶 1.0μL，PCR Buffer 5μL，DNA模板 1.0μL，dNTPs 4μL，引物EF-Tu-F和EF-Tu-R各1.0μL，ddH2O 37μL；
扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s；52℃退火30s；72℃延伸1min；72℃总延伸5min。
3.根据权利要求1所述的一种具有免疫保护作用的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu在制备美人鱼发光杆菌亚单位疫苗中的应用，其特征在于，步骤2）中所述质粒pET32a-EF-Tu构建的具体过程为：经所述限制性内切酶酶切后回收目的条带，将所述pET-32a载体与目的基因EF-Tu按3:1混合，22-25℃连接过夜，转化到大肠杆菌感受态细胞中，涂布Amp平板，37℃培养过夜；挑取单克隆菌落进行PCR鉴定，并将阳性菌落扩大培养，提取质粒pET32a-EF- Tu。
4.根据权利要求1所述的一种具有免疫保护作用的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu在制备美人鱼发光杆菌亚单位疫苗中的应用，其特征在于，步骤3）所述表达菌株为BL21，挑取单克隆菌落利用液体LB培养基进行培养，直至菌液OD600值达到0.6，加入浓度为1mM的IPTG诱导表达4-6h，收集菌体。
5.根据权利要求4所述的一种具有免疫保护作用的美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu在制备美人鱼发光杆菌亚单位疫苗中的应用，其特征在于，步骤3）所述液体LB培养基中含100μg/mL的Amp；其中，所述单克隆菌落的具体培养方法为：将所述单克隆菌落在所述液体LB培养基中培养过夜，次日吸取培养的菌液与所述液体LB培养基按照1:100的体积比进行混合，200-300rpm摇菌培养，直至菌液OD600值达到0.6。
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