CN105924525A

CN105924525A - 猪tlr4多克隆抗体的制备方法和应用

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Publication number: CN105924525A
Application number: CN201610310992.7A
Authority: CN
Inventors: 罗廷荣; 赵倩楠; 李晓宁; 李晓泉; 应雪; 陶倩; 姜炳星
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2016-05-11
Filing date: 2016-05-11
Publication date: 2016-09-07
Anticipated expiration: 2036-05-11
Also published as: CN105924525B

Abstract

本发明公开了一种猪TLR4多克隆抗体的制备方法，将重组TLR4蛋白(抗原)与弗氏佐剂乳化后免疫动物获得多克隆抗体血清；其中，重组TLR4蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1氨基酸序列。试验表明，本发明制备的抗体反应性和特异性良好，由于TLR4基因是针对固有免疫应答的重要模式识别受体Toll样受体家族的成员，其在抗细菌性和病毒性感染疾病中发挥重要的作用，因此本发明可应用于猪TLR4蛋白的检测及相关研究，为研究猪细菌性和病毒性感染疾病与TLR4的相互作用机理以及病毒免疫逃避机制的打下良好基础，为新型疫苗和药物的研制提供新的靶标。同时，本发明构建的原核表达载体表达重组蛋白效率高，分离纯化方法简单易操作。

Description

猪TLR4多克隆抗体的制备方法和应用

技术领域

本发明属于多克隆抗体制备技术领域，尤其涉及一种猪TLR4多克隆抗体的制备方法和应用。

背景技术

TLR4属于I型跨膜蛋白，是TLR家族中极为重要的成员，是固有免疫系统识别病原微生物的主要受体。TLR4可识别革兰氏阴性菌的脂多糖而在细菌感染性疾病的发生中起重要作用。近年来越来越多的研究发现，TLR4还广泛参与病毒感染性疾病的发生和病毒的免疫逃逸。TLR4是TLR家族中唯一一个能利用四种接头分子(MyD88、MAL/TIRAP、TRIF和TRAM)传递级联信号的受体，通过下游IRAK以及TAF3和TRAF6，活化转录调节因子，如NF-κB、AP-1和一系列的干扰素调节因子，引起炎性因子和I型干扰素的产生，启动固有免疫和获得性免疫应答。

近年来，抗病毒固有免疫研究已经取得了重要进展，针对固有免疫应答的重要模式识别受体——Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)所研制的新型疫苗和治疗药物已经在临床上用于HIV、HBV和HCV的防治。在研究猪细菌性以及病毒性疾病与TLR4(猪Toll样受体4，Toll-like receptors 4)相互作用过程中，需要运用到Western-blot、IFA、Co-IP以及FCM等多种实验方法，而这些研究方法无一不需要抗猪TLR4多克隆抗体作为支撑，生物市场上猪源抗体的缺乏严重制约着猪TLR4的相关研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种猪TLR4多克隆抗体的制备方法，用于研究猪细菌性和病毒性疾病的感染机制，并通过揭示该蛋白抗细菌及病毒的机制，为开发新型疫苗或药物提供依据。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：猪TLR4多克隆抗体的制备方法，将重组TLR4蛋白(抗原)与弗氏佐剂乳化后免疫动物获得多克隆抗体血清；重组TLR4蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1氨基酸序列。

免疫动物按以下操作进行：采用第1、7、21、35天背部皮下多点注射的方式免疫8只4周龄昆明小白鼠；首免时，重组蛋白与等量的弗氏完全佐剂混合乳化，每只小鼠蛋白免疫量约500μg；后续免疫则采用等量的弗氏不完全佐剂与重组蛋白进行乳化每只小鼠蛋白免疫量约300-500μg。

重组TLR4蛋白是由IPTG诱导基因工程菌表达目的蛋白，并通过低浓度尿素溶液多次洗涤包涵体获得(纯度较高的重组TLR4蛋白)。

基因工程菌由TLR4原核表达载体转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)获得；TLR4原核表达载体是由RT-PCR获得并构建含有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的重组载体，通过PCR获得序列表SEQ.ID.No.2碱基序列连接至原核表达质粒pET-32a(+)构建而成。

上述制备方法获得的猪TLR4多克隆抗体。

猪TLR4多克隆抗体在制备抗猪瘟病毒疫苗或药物方面的应用。

针对目前缺乏抗猪TLR4多克隆抗体用于研究猪细菌性以及病毒性疾病的现状，发明人建立了一种猪TLR4多克隆抗体的制备方法，将重组TLR4蛋白(抗原)与弗氏佐剂乳化后免疫动物获得多克隆抗体血清；其中，重组TLR4蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1氨基酸序列。试验表明，本发明制备的抗体反应性和特异性良好，由于TLR4基因是针对固有免疫应答的重要模式识别受体Toll样受体家族的成员，其在抗细菌性和病毒性感染疾病中发挥重要的作用，因此本发明可应用于猪TLR4蛋白的检测及相关研究，为研究猪细菌性和病毒性感染疾病与TLR4的相互作用机理以及病毒免疫逃避机制的打下良好基础，为新型疫苗和药物的研制提供新的靶标。同时，本发明构建的原核表达载体表达重组蛋白效率高，分离纯化方法简单易操作。

附图说明

图1是TLR4-KZ大片段DNA PCR电泳图，图中：M：DNA Marker DL2000，1：TLR4-KZ大片段DNA PCR产物。

图2是原核表达质粒PCR(左)和EcoR I/Not I双酶切电泳图(右)，图中：M：DNAMarker DL2000/5000，1：原核表达质粒PCR产物，2：原核表达质粒双酶切产物。

图3是SDS-PAGE分析重组菌pET-TLR4(170)表达的TLR4结果，图中：M：非预染蛋白Marker，1：未进行诱导的重组菌菌体2：0.05mM IPTG 30℃诱导重组菌6h后收集的菌体，3和4：分别为0.05mM IPTG 30℃诱导重组菌6h后裂解菌体得到的上清和沉淀。

图4是重组蛋白HIS标签的检测，图中：M：预染蛋白Marker。

图5是多克隆抗体与重组蛋白反应性的检测结果图，图中：M：预染蛋白Marker。

图6是多克隆抗体应用的检测结果图，图中：M：预染蛋白Marker，0-48h.p.i分别是PK-15细胞感染猪瘟病毒0、12、24、36和48h后收集的细胞总蛋白。

具体实施方式

实施例1构建TLR4原核表达载体和基因工程菌。

根据GenBank中Sus scrofa toll-like receptor 4(TLR4)mRNA(登录号：KF460453.1)氨基酸序列分析其亲疏水性及线性表位，确定原核表达基因序列为2043-2052共510bp，核苷酸序列和氨基酸序列分别如S序列表SEQ.ID.No.3和序列表SEQ.ID.No.1所示，并设计目的基因的克隆引物F1/R1和原核表达引物F2/R2。采集感染猪瘟病毒的PK-15细胞，抽提细胞总RNA并反转录，利用引物F1/R1扩增出TLR4-KZ大片段(621bp)(图1)，其核苷酸序列如序列表SEQ.ID.No.2所示。以TLR4-KZ质粒为模板，利用引物F2/R2PCR扩增得到原核表达序列TLR4(170)，其核苷酸序列如序列表SEQ.ID.No.3所示。反转录体系如下：RNA模板15μL，Oligo dT 1μL，M-MLV反转录酶1μL，5×first buffer 5μL，RNase inhibitor 1μL，dNTP 2μL。反转录程序为42℃1h，95℃5min。PCR反应体系如下：模板2μL，2×Taq PCRMastermix 12.5μL，上游引物和下游引物各0.5μL，ddH₂O 9.5μL。PCR程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；72℃终延伸10min。反应结束后进行DNA琼脂糖凝胶电泳分析，并回收目的基因片段，与pMD18-T载体连接，所获得质粒经华大基因公司测序确认与GenBank中目的基因序列一致。

设计的克隆引物：F1：5’-GCCGTCATTAGTGCGTCAGTT-3’(SEQ.ID.No.4)，R1：5’-GGCTGTTGTATCATGCTGGTTGCT-3’(SEQ.ID.No.5)。

原核表达引物：F2：5’-CGGAATTCTATGGCAGAGGTGAAAGC-3’(SEQ.ID.No.6)，R2：5’-CGGCGGCCGCATGATGATGATGATGATGTGTATCATGCTGGTTGCT-3’(SEQ.ID.No.7)。(下划线分别为核酸限制性内切酶EcoR I和Not I识别位点)

将所获得的目的基因质粒和原核表达质粒pET-32a(+)同时用核酸限制性内切酶EcoR I和Not I进行双酶切，纯化酶切产物后，通过T4DNA ligase将目的基因片段与用pET-32a(+)连接，构建TLR4原核表达载体，并将其转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)，利用氨苄青霉素鉴定筛选基因工程阳性菌(图2)。

实施例2获取和纯化重组TLR4蛋白

将阳性基因工程菌接种于含氨苄青霉素的灭菌LB培养基中，37℃200rpm培养至菌液光密度值(OD600)达0.6，加入IPTG至终浓度0.05mM，30℃诱导表达6h，4℃6000rpm离心20min收集菌体，裂解缓冲液重悬菌体，超声波裂解破碎菌体，4℃6000rpm离心30min，分别收集上清和沉淀。沉淀用PBS重悬后，与上清分别加入5×上样缓冲液沸水煮5min，SDS-PAGE检测目的蛋白的表达量以及表达形式(图3)。

本发明获得的重组蛋白以包涵体形式表达，与Ni-NTA亲和层析柱亲和力差，故菌体超声波破碎后收集的沉淀分别用含1M、2M、3M和4M尿素的包涵体洗涤液(NaCl 5.85g，Tris 6.06g，EDTA 0.585g，Trition X-1005mL，水1L，PH≈8)多次洗涤，将杂蛋白溶解去除。将洗涤后的沉淀置于包涵体溶解液(NaH₂PO₄·2H₂O 15.6g，Tris 0.121g，Urea 480.48g，水1L，PH≈8)中4℃变性溶解过夜，离心后，将上清置于透析袋中，采用梯度透析法，将透析袋分别依次置于添加6、4、2和0M尿素的复性液(Tris 12.1g，EDTA 3.722g，精氨酸20g，甘油100mL，GSH 0.3073g，GSSH 0.1225g，水2L)中透析12h，对变性的重组蛋白进行复性。Western-blot检测重组蛋白的His标签，确定复性过程中重组蛋白未丢失(图4)。复性后的重组蛋白若浓度较低则用PEG20000浓缩，测浓度后分装，-80℃保存备用。

实施例3多克隆抗体的制备和获得

采用第1、7、21、35天背部皮下多点注射的方式免疫8只4周龄昆明小白鼠。首免时，重组蛋白与等量的弗氏完全佐剂混合乳化，每只小鼠蛋白免疫量约500μg。后续免疫则采用等量的弗氏不完全佐剂与重组蛋白进行乳化，每只小鼠蛋白免疫量约300μg。三免后第7天，随机选一只小鼠断尾采血100-200μL至EP管中，室温静置2h，4℃12，000rpm离心10min，分装析出血清，Western-blot检测制备的多克隆抗体血清与重组蛋白的反应性，确定小鼠产生特异性抗体，且多克隆抗体稀释度可达1∶16000(图5)。四免后第7天采血，室温静置2h后4℃12，000rpm离心10min，分装析出血清，-80℃保存备用，即为所得小鼠抗猪TLR4多克隆抗体。

实施例4Western Blot检测多克隆抗体的应用

PK-15细胞感染猪瘟病毒后收集0、12、24、36、48h的蛋白样品，进行SDS-PAGE电泳，通过半干转膜仪将蛋白转移到PVDF膜，5％脱脂牛奶封闭，分别以抗CSFV E2单克隆抗体和制备的小鼠抗猪TLR4多克隆体作为一抗进行Western Blot检测，确定所制备的小鼠抗猪TLR4多克隆抗体特异性良好，效价为1∶1000，且能检测到感染猪瘟病毒后TLR4蛋白表达上升(图6)。

Claims

1.一种猪TLR4多克隆抗体的制备方法，其特征在于将重组TLR4蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫动物获得多克隆抗体血清；所述重组TLR4蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的猪TLR4多克隆抗体的制备方法，其特征在于所述免疫动物按以下操作进行：采用第1、7、21、35天背部皮下多点注射的方式免疫8只4周龄昆明小白鼠；首免时，重组蛋白与等量的弗氏完全佐剂混合乳化，每只小鼠蛋白免疫量约500μg；后续免疫则采用等量的弗氏不完全佐剂与重组蛋白进行乳化每只小鼠蛋白免疫量约300-500μg。

3.根据权利要求1所述的猪TLR4多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述重组TLR4蛋白是由IPTG诱导基因工程菌表达目的蛋白，并通过低浓度尿素溶液多次洗涤包涵体获得。

4.根据权利要求3所述的猪TLR4多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述基因工程菌由TLR4原核表达载体转化至大肠杆菌Rosetta DE3获得；所述TLR4原核表达载体是由RT-PCR获得并构建含有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的重组载体，通过PCR获得序列表SEQ.ID.No.3碱基序列连接至原核表达质粒pET-32a(+)构建而成。

5.权利要求1至4任一制备方法获得的猪TLR4多克隆抗体。

6.权利要求5所述猪TLR4多克隆抗体在制备抗猪瘟病毒疫苗或药物方面的应用。