CN109207504B

CN109207504B - 一种有效免疫ib与nd的唾液乳酸杆菌的制备方法

Info

Publication number: CN109207504B
Application number: CN201811125423.0A
Authority: CN
Inventors: 王红宁; 杨鑫; 左磊; 吴暄; 袁齐武; 李豪
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2018-09-26
Filing date: 2018-09-26
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2038-09-26
Also published as: CN109207504A

Abstract

本发明属于基因工程和禽病疫苗制备技术领域，公开了一种有效免疫IB与ND的唾液乳酸杆菌的制备方法，包括如下步骤：分别扩增SpUsp45‑Tuftsin、EpiC、F‑DCpep和AcmA基因，连接SpUsp45‑Tuftsin和EpiC基因，连接F‑DCpep和AcmA基因，再连接四个基因，得到重组基因，将重组基因转入pMG36e载体，再将pMG36e载体转入TCMM17感受态，得到有效免疫IB与ND的唾液乳酸杆菌。本发明的优点在于，该制备方法简单易操作，便于规模化生产和应用，生产的唾液乳酸杆菌对IBV的攻毒保护率达到80％，对NDV的攻毒保护率达到90％，可在鸡群内可长期定植，为鸡群提供持续的免疫保护，具有广阔的应用前景和良好的社会经济效益。

Description

一种有效免疫IB与ND的唾液乳酸杆菌的制备方法

技术领域

本发明属于基因工程和禽病疫苗制备技术领域，具体涉及有效免疫IB与 ND的唾液乳酸杆菌的制备方法。

背景技术

禽传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB)是一种可侵染鸡的呼吸系统和生殖系统，引起鸡呼吸道症状、产蛋数量和品质下降以及肾脏病变等症状的急性传染病，病原为禽传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus,IBV)。新城疫(Newcastle Disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)引起的一种急性接触传染病，主要症状为呼吸困难、黏膜出血等，鸡高度敏感，具有很高的发病率和死亡率。IB和ND都是严重危害禽养殖业的重要传染病，给我国规模化养鸡业造成了巨大的经济损失。

疫苗免疫是目前控制IB和ND疫情的最有效手段，主要包括弱毒苗和灭活苗。弱毒苗是指通过鸡胚连续传代获得的一种具有原毒株免疫原性和侵袭性的非致病疫苗。灭活苗是指用加热或化学剂(如福尔马林)将病毒灭活得到的保持病毒免疫原性的非致病疫苗。弱毒苗免疫方式简单，但存在毒力返强和散毒的风险；灭活苗相对安全，但成本较高，只能注射免疫，费时费力，对鸡造成的应激大，影响鸡的生产性能。通过多价或联苗可以在预防IB和ND的同时减少免疫次数，提高免疫效率。而传统的新支二联苗，生产成本高、免疫时间短、生产质量不稳定。

目前，随着生物技术的逐渐更新，市面上有一些IBV或NDV的DNA疫苗、多肽苗、重组活载体苗等，这类疫苗制备过程中，影响其保护力度的因素较多，如抗原基因的选择、抗原表达的持续时间和表达位置、载体的选择等均对疫苗的保护力度有重要影响，虽然现有的疫苗对IBV或NDV疫苗的研究提供了新的思路，但在实际应用过程中，这些疫苗对鸡群的保护力度达不到传统疫苗的保护力度，无法大规模推广应用。利用基因工程构建同时表达多个抗原的疫苗，还需要考虑如何将这些抗原充分表达、合理表达，并互不影响其活性。如果能开发出一种可同时免疫IBV和ND且可提供持续的免疫保护的疫苗，对我国规模化养鸡业具有重要的意义。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种可同时有效免疫IB与ND的唾液乳酸杆菌的制备方法。

本发明所采用的技术方案为：

一种有效免疫IB与ND的唾液乳酸杆菌的制备方法，包括如下步骤：

(1)分别扩增SpUsp45-Tuftsin、EpiC、F-DCpep和AcmA基因，纯化，得到SpUsp45-Tuftsin、EpiC、F-DCpep和AcmA基因的纯化产物，将所述 SpUsp45-Tuftsin、EpiC、F-DCpep和AcmA基因的纯化产物分别进行分子克隆，提取质粒，得到SpUsp45-Tuftsin、EpiC、F-DCpep和AcmA的克隆载体；扩增所述SpUsp45-Tuftsin基因的引物P1-F和P1-R，所述P1-F和P1-R的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述P1-R中包含有Tuftsin序列；扩增所述EpiC基因的引物P2-F和P2-R，所述P2-F和P2-R的序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示；扩增所述F-DCpep基因的引物P3-F和P3-R，所述 P3-F和P3-R的序列分别如SEQID NO.5和SEQ ID NO.6所示，所述P3-R中包含有DCpep序列；扩增所述AcmA基因的引物P4-F和P4-R，所述P4-F和P4-R 的序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；

(2)分别对SpUsp45-Tuftsin和EpiC的克隆载体进行酶切，得到 SpUsp45-Tuftsin和EpiC的克隆载体的酶切产物，将SpUsp45-Tuftsin和EpiC的克隆载体的酶切产物纯化后连接，得到连接产物一，将所述连接产物一进行分子克隆，提取质粒，得到包含SpUsp45-Tuftsin-EpiC的克隆载体；

(3)分别对F-DCpep和AcmA的克隆载体进行酶切，得到F-DCpep和AcmA 的克隆载体的酶切产物，将F-DCpep和AcmA的克隆载体的酶切产物纯化后连接，得到连接产物二，将所述连接产物二进行分子克隆，提取质粒，得到包含 F-DCpep-AcmA的克隆载体；

(4)以包含SpUsp45-Tuftsin-EpiC的克隆载体为模板扩增UTEpiC，得到 UTEpiC的PCR产物，以包含F-DCpep-AcmA的克隆载体为模板扩增 FDCAcmA，得到FDCAcmA的PCR产物，分别纯化UTEpiC和FDCAcmA的 PCR产物，得到UTEpiC和FDCAcmA的纯化产物；

(5)混合UTEpiC和FDCAcmA的纯化产物，得到混合物，以所述混合物为模板进行扩增，得到UTEpiC-FDCAcmA的PCR产物，即UTEFDA，纯化，得到UTEFDA的纯化产物，对纯化产物进行分子克隆，得到UTEFDA的克隆载体；

(6)将所述UTEFDA的克隆载体和pMG36e载体分别双酶切，得到 UTEFDA的克隆载体和pMG36e载体的双酶切产物，将UTEFDA的克隆载体和 pMG36e载体的双酶切产物纯化后连接，得到pMG36e-UTEFDA重组表达质粒；

(7)制备TCMM17感受态；

(8)将所述pMG36e-UTEFDA重组表达质粒电转化入TCMM17感受态，涂布培养，挑取单克隆，放大培养，即得所述有效免疫IB与ND的唾液乳酸杆菌。

具体的，上述制备方法，所述P2-F、P2-R和P4-F的5’端添加有linker序列；所述步骤(2)中酶切SpUsp45-Tuftsin和EpiC所用的酶分别为BamHⅠ和 BglⅡ；所述步骤(3)中酶切F-DCpep和AcmA所用的酶分别为BamHⅠ和BglⅡ；所述步骤(6)中双酶切所用的酶为Xba I和HindⅢ。

具体的，上述制备方法，所述步骤(5)中扩增的条件为，将两种模板混合后，在不加引物的情况下循环反应5次，再加入引物P1-F和P4-R后，循环反应30次，退火温度为56℃，延伸时间为2min，得到UTEFDA的PCR产物。

具体的，上述制备方法，所述步骤(8)中电转化过程包括如下步骤：

S1：将步骤(6)中制备的pMG36e-UTEFDA重组表达质粒加入步骤(7) 中制备的TCMM17感受态中，混匀，得到混合物；S2：将所述混合物冰浴10min，得到冰浴后混合物；S3：将所述冰浴后混合物电转化，得到电转化后混合物，电转化程序为10kv/cm，25μF，200Ω；S4：向所述电转化后混合物中加入含3 mol/L蔗糖的MRS液体培养基，混匀后于37℃静置培养3h，涂布，倒置37℃ 培养24-36h；S5：挑取单克隆菌落，放大培养，即得所述有效免疫IB与ND的唾液乳酸杆菌。

具体的，上述制备方法，所述步骤(7)中制备TCMM17感受态包括如下步骤：S1：将TCMM17菌种接种于MRS液体培养基中，静置于37℃过夜培养，划线接种于MRS琼脂平板上，37℃培养24h，挑取单菌落接种MRS液体培养基中，于37℃静置过夜培养，得到菌液一；S2：按5％(v/v)接种量接种于MRS液体培养基，37℃静置培养3h，至菌体浓度为OD600＝0.3-0.4，加入适量氨苄青霉素，使其终浓度为10μg/mL，继续培养1.5h，得到菌液二；S3：将S2得到的菌液二冰浴静置20min，4℃1500g离心2min收集菌体；预冷的无菌ddH₂O清洗菌体2次，每次3min，4℃、1500g离心2min收集菌体；用预冷的50mmol/L EDTA清洗1次，预冷ddH₂O清洗2次，预冷0.3mol/L蔗糖溶液清洗1次，用500μL 0.3mol/L蔗糖溶液重悬菌体，冰浴静置30min，得到所述TCMM17感受态。

本发明的有益效果为：

本发明提供的有效免疫IB与ND的唾液乳酸杆菌的制备方法，通过在合理位置添加信号肽序列SpUsp45、免疫佐剂蛋白序列Tuftsin、树突状细胞诱导肽序列DCpep及锚定序列AcmA及linker序列，生产的唾液乳酸杆菌对IBV的攻毒保护率达到80％，对NDV的攻毒保护率达到90％，可在鸡群内可长期定植，为鸡群提供持续的免疫保护，制备方法简单易操作，便于规模化生产和应用，具有广阔的应用前景和良好的社会经济效益。

附图说明

图1是本发明提供的重组基因UTEFDA的构建策略示意图；

图2是本发明实施例1中分段基因SpUsp45-Tuftsin、EpiC、F-DCpep和AcmA 的PCR扩增结果图；

图3是本发明提供的重组表达质粒pMG36e-UTEFDA的PCR和双酶切鉴定结果图；

图4是从本发明提供的重组乳酸菌中提取质粒的PCR和双酶切鉴定结果图。

图5唾液乳杆菌TCMM17-UTEFDA各蛋白成分SDS-PAGE检测结果图；

图6唾液乳杆菌TCMM17-UTEFDA各蛋白成分Western-Blot检测结果图；

图7是本发明的实施例4中免疫程序示意图；

图8是IBV M41和NDV F48E9攻毒后各免疫组鸡攻毒保护率变化图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步阐释。

部分材料来源：大肠杆菌DH5α感受态细胞和pMD19T载体购自大连宝生物(TaKaRa)；大肠杆菌TOP10感受态细胞购自全式金；限制性内切酶BamHⅠ、 BglⅡ、Xba I、HindⅢ、T4 DNA连接酶均购自大连宝生物(TaKaRa)；

Plus DNA marker购自全式金；氨苄青霉素(Amp)和红霉素(Emr)购自Sigma；胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒均购自Omega；Q5高保真酶购自NEB；引物由成都Tsingke公司合成。

实施例1

本实施例的目的在于提供一种重组基因UTEFDA。

以Genebank中发布的乳酸乳球菌MG1363(收录号：AM406671)获得信号肽序列SpUsp45和细胞壁锚定结构域序列AcmA，选用免疫佐剂蛋白序列 Tuftsin和树突状细胞诱导肽序列DCpep增强机体对抗原的免疫应答，以IBV SAIBK株的多表位基因EpiC(以下简称EpiC)和禽新城疫病毒F48E9株的F 基因为基础材料，构建能展示宿主表面、增强抗原免疫原性的融合基因 SpUsp45-Tuftsin-linker-EpiC-linker-F-DCpep-linker-AcmA(后续简写为 UTEFDA)，构建策略如图1所示。

具体步骤：

(1)引物设计：SpUsp45基因的扩增引物如P1-F/P1-R所示，P1-F的5’ 端添加有XbaⅠ酶切位点，P1-R的5’端添加Tuftsin序列(ACAAAGCCACGT， 12bp)，Tuftsin序列序列前添加有BamHⅠ酶切位点；细胞壁锚定结构域序列 AcmA基因的扩增引物如P4-F/P4-R所示，P4-F的5’端添加有linker序列(氨基酸序列为GSGGS，碱基序列如SEQ ID NO.11所述，具体为GGTTCTGGTGGTTCT，共15bp)，linker序列前添加有BglⅡ酶切位点，P4-R 的5’端添加有HindⅢ酶切位点；多表位EpiC基因的扩增引物如P2-F/P2-R所示， P2-F/P2-R的5’端均添加有linker序列，P2-F的linker序列前添加有BglⅡ酶切位点；F基因的扩增引物如P3-F/P3-R所示，P3-R的5’端添加DCpep序列 (TTCTACCCATCATACCATTCAACTCCACAACGTCCA，36bp)，DCpep序列前添加有BamHⅠ酶切位点；

将设计的引物送至成都Tsingke公司合成，上述各基因的引物具体如表1 所示，画实线的碱基为酶切位点，所述酶切位点前方的碱基为保护碱基，画虚线的碱基为linker序列，画双波浪线的碱基为Tuftsin序列，画单波浪线的碱基为DCpep序列。

表1

(2)SpUsp45-Tuftsin、EpiC、AcmA和F-DCpep基因的PCR扩增

利用普通PCR技术分别扩增上述基因，扩增体系如下表所示，R为P1-R、 P2-R、P3-R或P4-R，F为相对应的P1-F、P2-F、P3-F或P4-F。扩增条件为： 94℃4min；94℃30sec，62℃30sec，72℃30sec，共30个循环；72℃10min， 12℃保存，最终获得各基因的PCR产物。

表2

组分	体积
		Q52×PCR Mix	25μL
F	1μL(20μM)
		R	1μL(20μM)
模板	2μL
		ddH<sub>2</sub>O	21μL
总体系	50μL

扩增结果如图2所示，泳道1-4分别表示SpUsp45-Tuftsin、EpiC、F-DCpep 和AcmA的PCR产物的电泳结果，泳道1-4所示条带与SpUsp45-Tuftsin(93bp)、 EpiC(555bp)、F-DCpep(1695bp)和AcmA(252bp)的目的片段大小相同，将SpUsp45-Tuftsin、EpiC、F-DCpep和AcmA的PCR产物分别用胶回收试剂盒纯化，得到各自的DNA纯化产物。

分子克隆：分别将SpUsp45-Tuftsin、EpiC、F-DCpep和AcmA的纯化产物与克隆载体pMD19T连接，转化进大肠杆菌DH5α感受态细胞。连接反应体系如表3所示，反应条件为：20℃反应30 min，反应完成后，得到各自的连接产物。将上述连接产物加入冰浴解冻后的大肠杆菌DH5α感受态细胞，轻轻混匀后冰上静置30 min；42℃水浴热激45 s，快速取出于冰浴静置5 min；再将其加入37℃预热的1mL SOC液体培养基(不含抗生素)，混匀后于37℃，200 rpm 条件下培养1 h；取150μL培养物，均匀涂布于含100μg/mL Amp的LB琼脂平板中(含X-Gal)；37℃倒置培养过夜，挑取白色单菌落于含100μg/mL Amp 的LB肉汤中，37℃、200 rpm过夜培养，即得到包含各基因的克隆载体的菌液。

将上述菌液离心收集菌体沉淀，参照质粒提取试剂盒说明书提取质粒；对提取得到的质粒分别进行PCR扩增验证和测序验证，将验证正确的重组质粒命名为pMD19T-SpUsp45-Tuftsin、pMD19T-EpiC、pMD19T-AcmA和pMD19T-F。

表3

组分	体积
		DNA纯化产物	2.5μL
pMD19T载体	0.5μL
		T<sub>4</sub> DNA ligase	1μL
T<sub>4</sub> DNA ligase Buffer(10×)	1μL
		ddH<sub>2</sub>O	5.5μL
总体系	10μL

(3)SpUsp45-Tuftsin与EpiC的连接及鉴定、F-DCpep与AcmA的连接及鉴定

分别将含有重组质粒pMD19T-SpUsp45-Tuftsin和pMD19T-EpiC的大肠杆菌DH5α于37℃、200 rpm过夜培养，参照质粒提取试剂盒说明书提取重组质粒pMD19T-SpUsp45-Tuftsin和pMD19T-EpiC。将pMD19T-SpUsp45-Tuftsin进行BamHⅠ单酶切，pMD19T-EpiC进行BglⅡ单酶切，单酶切体系如下，30℃ 酶切3 h，得到各自的酶切产物

表4

将酶切彻底的产物直接加入3倍体积的溶胶液混匀，过柱纯化回收线性质粒pMD19T-SpUsp45-Tuftsin和pMD19T-EpiC。单酶切后， pMD19T-SpUsp45-Tuftsin3′端的粘性末端与pMD19T-EpiC 5’端互补，使用T4 ligase连接单酶切纯化产物。连接体系如下，16℃连接过夜，60℃灭活30min，得到连接产物。

表5

组分	体积
		线性质粒pMD19T-SpUsp45-Tuftsin	4μL
线性质粒pMD19T-EpiC	4μL
		T<sub>4</sub> DNA ligase	1μL
10×T<sub>4</sub> DNA ligase Buffer	1μL
		总体系	10μL

将该连接产物用引物P1-F和P2-R进行PCR扩增，参考上述方法，将PCR 产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测正确后进行胶回收，获得目的基因 SpUsp45-Tuftsin-EpiC。将纯化后的SpUsp45-Tuftsin-EpiC与pMD19T连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取重组菌质粒，并以质粒作为模板进行PCR 扩增验证，验证正确的即为重组质粒pMD19T-UTEpiC。

参照pMD19T-UTEpiC的制备方法，分别将质粒pMD19T-F-DCpep和 pMD19T-AcmA进行BamHⅠ和BglⅡ的单酶切，回收线性质粒后进行T4连接，以连接产物为模板，用引物P3-F和P4-R进行PCR扩增，获得目的基因 F-DCpep-AcmA。将纯化后的F-DCpep-AcmA与pMD19T连接，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选构建正确的重组质粒即为pMD19T-FDCAcmA。

(4)UTEpiC与FDCAcmA的连接及鉴定

分别将含有重组质粒pMD19T-UTEpiC和pMD19T-FDCAcmA的大肠杆菌DH5α于37℃、200rpm过夜培养，参照质粒提取试剂盒说明书分别提取重组质粒pMD19T-UTEpiC和pMD19T-FDCAcmA。以pMD19T-UTEpiC为模板，用 P1-F/P5-R引物PCR扩增UTEpiC基因，以pMD19T-FDCAcmA为模板，用 P6-F/P4-R引物PCR扩增FDCAcmA基因，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测正确后进行胶回收，得到UTEpiC基因和FDCAcmA基因的纯化产物。

将两种纯化产物混合均匀作为模板，采用两步法PCR扩增融合基因 UTEpiC-FDCAcmA。第一步：将两种模板混合后，在不加引物的情况下循环反应5次；第二步：加上引物P1-F和P4-R后，循环反应30次。PCR体系及反应条件如下：

表6

组分	体积
		Q5 2×PCR Mix	25μL
P1-F(20μM)	1μL
		P4-R(20μM)	1μL
混合DNA模板	2μL
		ddH<sub>2</sub>O	21μL
总体系	50μL

反应条件为：94℃4min；94℃30sec，56℃30sec，72℃2min，共35 个循环；72℃10min，12℃保存，得到PCR产物，将该PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测正确后进行胶回收，得到纯化后的UTEpiC-FDCAcmA，即为即为本实施例所获得的可表达EpiC、NDV F的重组基因UTEFDA。将纯化后的 UTEpiC-FDCAcmA参照前述方法进行分子克隆后提取质粒，并以该质粒作为模板进行PCR扩增，进行电泳和测序鉴定，将鉴定正确的重组质粒命名为pMD19T-UTEFDA，将含有该重组质粒的大肠杆菌加甘油保存。

实施例2

本实施例的目的在于提供UTEFDA的pMG36e重组表达质粒。

分别将含有pMG36e空质粒和克隆载体pMD19T-UTEFDA的大肠杆菌过夜培养，按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒pMG36e和pMD19T-UTEFDA，对提取质粒进行Xba I和HindⅢ双酶切。用胶回收试剂盒纯化酶切后的UTEFDA 基因和pMG36e载体，并用T4连接酶连接UTEFDA和pMG36e载体，混匀后置16℃连接过夜，得到连接产物。连接体系如下：

表7

组成	体积(μL)
		UTEFDA基因	7
pMG36e载体	1
		T4 DNA ligase	1
10×T4 DNA ligase buffer	1

从-80℃冰柜中取出大肠杆菌TOP10感受态细胞，冰浴解冻；缓慢加入上述全部连接产物，轻轻混匀后冰上静置30min，42℃热激30s，快速取出于冰浴中静置2min，然后将其加入37℃预热的1mL SOC液体培养基(不含抗生素)，混匀后置37℃、200rpm培养1h；取150μL培养物，均匀涂布于含200 μg/mL Emr的LB琼脂平板中；30℃倒置培养，24h后观察结果。挑取单个的白色单菌落于含200μg/mL Emr的LB肉汤中，37℃摇床震荡过夜培养，得到菌液；将部分菌液离心收集菌体沉淀，按照质粒提取试剂盒说明书提取重组表达质粒。以提取的重组表达质粒为模板，用UTEFDA基因的特异性引物P1-F和P4-R扩增UTEFDA基因。反应体系和条件如实施例1所述，得到PCR产物；以Xba I 和HindⅢ限制性内切酶对重组表达质粒进行双酶切鉴定，得到酶切产物。

分别取5μL PCR反应产物、酶切产物和重组表达质粒进行琼脂糖(0.8％) 凝胶电泳验证，结果如图3所示，泳道1-3分别代表PCR产物、重组表达质粒双酶切产物和重组表达质粒的电泳结果；取部分重组质粒交由成都Tsingke公司测序鉴定，测序结果表明pMG36e-UTEFDA中UTEFDA序列与SEQ ID NO.1 相同，将验证正确的重组表达质粒命名为pMG36e-UTEFDA。将鉴定正确、携带有重组质粒pMG36e-UTEFDA的菌液，加入终浓度为20％的无菌甘油，混匀后-80℃冻存。

实施例3

本实施例的目的在于制备有效免疫IB和ND的重组乳酸菌并对该重组乳酸菌的表达进行鉴定。

1有效免疫IB和ND的重组乳酸菌的制备：

TCMM17感受态的制备：

S1：取-80℃甘油保存的TCMM17菌种接种于5mL MRS液体培养基中，静置于37℃过夜培养，将培养液划线接种于MRS琼脂平板上，37℃培养24h；挑取单菌落接种于5mL MRS液体培养基中，于37℃静置过夜培养。S2：按 5％接种量接种于5mL MRS液体培养基，37℃静置培养3h，至菌体浓度为 OD600＝0.3-0.4；加入适量氨苄青霉素，使其终浓度为10μg/mL，继续培养1.5h。 S3：将S2培养液冰浴静置20min，4℃、1500g离心2min收集菌体；用适量 4℃预冷的无菌ddH₂O清洗菌体2次，每次3min，4℃、1500g离心2min收集菌体；用预冷的50mmol/LEDTA清洗1次，预冷ddH₂O清洗2次，预冷0.3 mol/L蔗糖溶液清洗1次，用500μL0.3mol/L蔗糖溶液重悬菌体，冰浴静置30 min，得到所述TCMM17感受态。

电转化：将2mm电转杯分别用超纯水(超声处理)和无水乙醇清洗，紫外灯照射2h以上。取20μL pMG36e-UTEFDA重组表达质粒轻缓加入100μL制备的TCMM17感受态细胞中，轻轻混匀，移入电转杯中，冰浴静置10min后进行电击。电转化程序为10kv/cm，25μF，200Ω。电转完成后，向电转杯中加入1mL含0.3mol/L蔗糖的MRS液体培养基(37℃预热)，吹打均匀后吸至 1.5mL离心管中，37℃静置培养3h。吸取150μL复苏菌液均匀涂布于含200 μg/mL Emr的MRS琼脂平板，倒置37℃培养24-36h。

放大培养：挑取乳白色单菌落，接种于含200μg/mL Emr的MRS液体培养基中，37℃静置培养过夜，离心收集菌体沉淀，按照革兰氏阳性细菌质粒提取试剂盒说明书提取重组菌中的重组表达质粒；以提取重组表达质粒为模板，用 P1-F和P4-R扩增UTEFDA基因作PCR鉴定，用Xba I和HindⅢ限制性内切酶作双酶切鉴定。反应体系和条件如前所述；分别取5μL PCR反应产物、双酶切产物和重组质粒进行琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图4所示，泳道1-3分别代表PCR产物、重组表达质粒双酶切产物和重组表达质粒的电泳结果；取部分质粒交由成都Tsingke公司测序鉴定，将验证正确的菌液命名为 TCMM17-UTEFDA，按1:1比例添加40％无菌甘油，混匀后-80℃冻存。

2融合蛋白TEFDA的表达及提取

2.1融合蛋白TEFDA的提取

提取TEFDA蛋白，步骤如下：

(1)将-80℃保存的TCMM17-UTEFDA接种于5mL含200μg/mL Emr的 MRS液体培养基，37℃静置培养过夜；取200μl菌液接于5mL含200μg/mL Emr 的MRS液体培养基，37℃静置培养至菌液OD600值为0.4～0.6；12000rpm离心5min，分离上清液一和菌体沉淀。

(2)向上清液一中加入1/10体积预冷的100％TCA(W/V)溶液，振荡 15s，冰上静置20min，12000rpm离心10min。弃上清，得到沉淀一，沉淀一用100μL预冷的丙酮洗涤两次，除去TCA。开盖室温静置10min，待丙酮挥发完全后加入50μL 50mmol/L NaOH溶液溶解沉淀二，获得细胞外蛋白，即 TCMM17-UTEFDA外蛋白。

(3)用无菌PBS洗涤步骤(1)得到的菌体沉淀2次，加入1/10体积的表面蛋白提取缓冲液(2％SDS,1％巯基乙醇)，70℃静置10min，3500rpm离心 5min，分离上清液二和沉淀二，上清液二即细胞表面蛋白，即 TCMM17-UTEFDA表面蛋白。

(4)取(3)得到的沉淀二，加入5mg/mL的溶菌酶，37℃振荡1h，12000 rpm离心5min，取上清，获细胞内蛋白，即TCMM17-UTEFDA内蛋白。

(5)按(1)-(4)方法制备TCMM17菌株的细胞外蛋白(TCMM17外蛋白)、内蛋白(TCMM17内蛋白)及表面蛋白(TCMM17表面蛋白)，作为阴性对照。

2.2SDS-PAGE鉴定

参照《实验室SDS-PAGE操作规程》制备SDS-PAGE胶，其中分离胶浓度为8％，浓缩胶浓度为4.5％。电泳条件为：浓缩胶80V；分离胶120V。跑胶完成后将凝胶用考马斯亮蓝R250染色液过夜染色，然后用清水漂洗数次，最后用脱色液脱色，当出现清晰蛋白条带时照相保存。

2.3Western-blot检测

按照《实验室Western-Blot操作规程》，将SDS-PAGE后的蛋白电转移至 PVDF膜，转膜条件为：200mA，1h；用TBST洗膜3遍，蛋白面朝下移入封闭液中，4℃静置过夜；用TBS洗膜3次，加入5mL含鸡IBV高免阳性血清或抗新城疫F基因单抗的TBS中(1：100稀释)，37℃孵育2h；用TBST洗膜3次，加入5mL HRP标记二抗(1:1000倍稀释)，37℃孵育2h；用TBST 洗膜3次，用DAB试剂盒显色，观察结果并照相保存。

3结果

SDS-PAGE结果如图5所示，其中M表示Protein Marker，1表示 TCMM17-UTEFDA外蛋白，2表示TCMM17-UTEFDA表面蛋白，3表示 TCMM17-UTEFDA内蛋白，4表示TCMM17外蛋白，5表示TCMM17表面蛋白，6表示TCMM17内蛋白。其中泳道2、3在80-100Kda范围内有明显的目的条带，表明TCMM17-UTEFDA可成功表达UTEFDA蛋白，且UTEFDA位于TCMM17表面和TCMM17内部。

Western-blot结果如图6所示，其中A表示TEFDA蛋白与IBV高免阳性血清反应；B：TEFDA蛋白与抗NDV F基因单抗反应；A图和B图中M表示Protein Marker，1表示TCMM17-UTEFDA表面蛋白，2表示TCMM17-UTEFDA内蛋白，3表示TCMM17-UTEFDA外蛋白。A图和B图的泳道1和2在目标位置均为明显条带，表明TCMM17-UTEFDA表达的UTEFDA蛋白(包括TCMM17-UTEFDA表面蛋白和TCMM17-UTEFDA内蛋白)可与NDV F基因单抗和IBV高免阳性血清反应，即TCMM17-UTEFDA蛋白有效免疫IB和ND。

实施例4

本实施例的目的在于验证重组乳酸菌TCMM17-UTEFDA可有效免疫IB和 ND。

1.鸡免疫分组及免疫程序

将孵化器进行清洗后用百毒杀消毒，将种蛋放进孵化器，37.6℃，湿度为 55-60％，孵化22天后，将小鸡随机分组转移至SPF隔离器进行饲喂和免疫。设置鸡新城疫-传染性支气管炎二联活疫苗(ND LaSota+IBV H120)为疫苗对照组，本发明提供的表达IBV多表位EpiC和NDV F基因的唾液乳杆菌口服疫苗 TCMM17-UTEFDA为实验组，野生型唾液乳杆菌TCMM17为阴性对照组，PBS 为空白对照组。通过滴鼻点眼途径免疫小鸡，鸡分组及免疫方法如下。

表8

将小鸡在SPF隔离器中饲养至10日龄，颈静脉采血后按照表8中的免疫途径及剂量对小鸡进行首免，24日龄颈静脉采血后进行二免，17日龄、31日龄、 38日龄进行颈静脉采血，分离血清。具体免疫程序见图7。

2鸡血清中NDV抗体、血凝抑制(HI)抗体检测、气管和肠管冲洗液中 sIgA抗体水平

2.1检测方法

采用间接ELISA法检测前述鸡免疫分组及免疫程序中采集的鸡血液的血清样品中的NDV抗体。检测方法参照武汉科前新城疫病毒ELISA抗体检测试剂盒说明书进行。参照《GB/T 17999.2-2008SPF鸡红细胞凝集抑制试验》对鸡血清样品进行NDVHI抗体检测。分别于10、17、24、31、38d扑杀各免疫组小鸡3只，采集气管和肠管，用无菌PBS清洗干净，收集气管内冲洗液和肠管内冲洗液，作鸡分泌型免疫球蛋白A(sIgA)检测，操作方法参照鸡分泌型免疫球蛋白A(sIgA)ELISA抗体检测试剂盒说明书进行。用SPSS软件对检测数据进行分析。同列数据肩注不同字母表示差异显著(P<0.05)，肩注相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。

2.2检测结果

由表9可知，在17d-38d，TCMM17-UTEFDA组的鸡血清中的NDV抗体水平与LaSota/H120组的抗体水平基本相同，差异不显著，但二者显著高于 TCMM17组或PBS组的NDV抗体水平。

表9

由表10可知，在17d-38d，TCMM17-UTEFDA组的鸡血清中的HI抗体水平与LaSota/H120组的抗体水平，但二者显著高于TCMM17组或PBS组的 HI抗体水平。

表10

各免疫组气管冲洗液中sIgA抗体水平测定结果如表11所示，各免疫组肠管冲洗液中sIgA抗体水平测定结果如表12所示。表11和表12中，同列数据肩注不同字母表示差异显著(P<0.05)，肩注相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。由表11和表12可知，在17d-38d，TCMM17-UTEFDA组的气管和肠管冲洗液中sIgA抗体水平均显著高于LaSota/H120组的sIgA抗体水平， LaSota/H120组显著高于TCMM17组或PBS组的sIgA抗体水平。

表11

表12

3 IBV和NDV攻毒保护试验

38日龄，将实验鸡群分为A组(A1-A4)和B组(B1-B4)，每组10只，进行攻毒保护实验。

A组：攻毒毒株为IBVM41毒株，攻毒剂量为10³EID₅₀/0.2mL，攻毒方式为滴鼻点眼。攻毒后弃掉24h内死亡鸡只，统计2周内每天鸡只发病情况和死亡情况。2周后(52日龄)，将鸡全部进行安乐死，解剖后采鸡气管、心脏、肝脏、肺、肾脏，通过RT-PCR方法对IBV病毒进行检测，计算保护率。保护率＝IBV RT-PCR阴性数/总数。RT-PCR检测方法参照实施例1中方法进行。用 SPSS软件对数据进行分析。

B组：攻毒毒株为NDVF48E9毒株，攻毒剂量为10⁶EID₅₀/0.2mL。攻毒方式为滴鼻点眼。攻毒后弃掉24h内死亡鸡只，统计2周内每天鸡只发病情况和死亡情况。2周后(52日龄)，将鸡全部进行安乐死，解剖后采鸡气管、心脏、肝脏、肺、肾脏、脾脏，通过RT-PCR方法对NDV病毒进行检测，计算保护率。保护率＝NDV RT-PCR阴性数/总数。RT-PCR检测方法参照实施例1中方法进行。用SPSS软件对数据进行分析。

表13

攻毒后各免疫组鸡的发病和保护情况统计结果表13和图8所示。由表13 和图8可知，A组鸡群攻IBV M41毒株后，重组疫苗TCMM17-UTEFDA可为免疫鸡群提供90％的保护率，与LaSota/H120保护率相当(90％)；B组鸡群攻 NDV F48E9毒株后，TCMM17-UTEFDA可为免疫鸡群提供90％的保护率，略低于LaSota/H120组(100％)，PBS和TCMM17对IBV和NDV均不能提供免疫保护。表明重组乳酸杆菌TCMM17-UTEFDA能够为免疫鸡提供较高的对IBV 和NDV攻毒保护，均达到《中华人民共和国兽用生物制品质量标准(2001版)》关于IBV活疫苗和NDV活疫苗对鸡的攻毒保护的要求(IBV：80％；NDV：90％)。

本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。

序列表

<110> 四川大学

<120> 一种有效免疫IB与ND的唾液乳酸杆菌的制备方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggcgtctaga tatgaagaag aagattattt c 31

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcaggatcca cgtggctttg tagcgtaaac accagat 37

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggaagatctg gttctggtgg ttctgaaaac gttgctaact gtc 43

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agaaccacca gaacctaatt cgttttcacc taaag 35

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgggcccca aatcttctac caatgtcc 28

<210> 7

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcaggatcct ggacgttgtg gagttgaatg gtatgatggg tagaagattc ttgtagtggc 60

cctcat 66

<210> 7

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggaagatctg gttctggtgg ttctgatggt gcttcttctg ctggtaaca 49

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggcgaagctt ctaaccagag tttgtagaag aagcaga 37

<210> 9

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agaagatttg gggcccatag aaccaccaga acctaattcg ttttcaccta aag 53

<210> 10

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acgaattagg ttctggtggt tctatgggcc ccaaatcttc taccaat 47

Claims

1.一种有效免疫IB与ND的唾液乳酸杆菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）以Genbank中发布的乳酸乳球菌MG1363（收录号：AM406671）获得信号肽序列SpUsp45和细胞壁锚定结构域序列AcmA，选用免疫佐剂蛋白序列Tuftsin和树突状细胞诱导肽序列DCpep增强机体对抗原的免疫应答，以IBV SAIBK株的多表位基因EpiC和禽新城疫病毒F48E9株的F基因为基础材料，分别扩增SpUsp45-Tuftsin、EpiC、F-DCpep和AcmA基因，纯化，得到SpUsp45-Tuftsin、EpiC、F-DCpep和AcmA基因的纯化产物，将所述SpUsp45-Tuftsin、EpiC、F-DCpep和AcmA基因的纯化产物分别进行分子克隆，提取质粒，得到SpUsp45-Tuftsin、EpiC、F-DCpep和AcmA的克隆载体；扩增所述SpUsp45-Tuftsin基因的引物P1-F和P1-R，所述P1-F和P1-R的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述P1-R中包含有Tuftsin序列；扩增所述EpiC基因的引物P2-F和P2-R，所述P2-F和P2-R的序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；扩增所述F-DCpep基因的引物P3-F和P3-R，所述P3-F和P3-R的序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，所述P3-R中包含有DCpep序列；扩增所述AcmA基因的引物P4-F和P4-R，所述P4-F和P4-R的序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；

（2）分别对SpUsp45-Tuftsin和EpiC的克隆载体进行酶切，得到SpUsp45-Tuftsin和EpiC的克隆载体的酶切产物，将SpUsp45-Tuftsin和EpiC的克隆载体的酶切产物纯化后连接，得到连接产物一，将所述连接产物一进行分子克隆，提取质粒，得到包含SpUsp45-Tuftsin-EpiC的克隆载体；

（3）分别对F-DCpep和AcmA的克隆载体进行酶切，得到F-DCpep和AcmA的克隆载体的酶切产物，将F-DCpep和AcmA的克隆载体的酶切产物纯化后连接，得到连接产物二，将所述连接产物二进行分子克隆，提取质粒，得到包含F-DCpep-AcmA的克隆载体；

（4）以包含SpUsp45-Tuftsin-EpiC的克隆载体为模板扩增UTEpiC，得到UTEpiC的PCR产物，以包含F-DCpep-AcmA的克隆载体为模板扩增FDCAcmA，得到FDCAcmA的PCR产物，分别纯化UTEpiC和FDCAcmA的PCR产物，得到UTEpiC和FDCAcmA的纯化产物；

（5）混合UTEpiC和FDCAcmA的纯化产物，得到混合物，以所述混合物为模板进行扩增，得到UTEpiC-FDCAcmA的PCR产物，即UTEFDA，纯化，得到UTEFDA的纯化产物，对纯化产物进行分子克隆，得到UTEFDA的克隆载体；

（6）将所述UTEFDA的克隆载体和pMG36e载体分别双酶切，得到UTEFDA的克隆载体和pMG36e载体的双酶切产物，将UTEFDA的克隆载体和pMG36e载体的双酶切产物纯化后连接，得到pMG36e-UTEFDA重组表达质粒；

（7）制备TCMM17感受态；

（8）将所述pMG36e-UTEFDA重组表达质粒电转化入TCMM17感受态，涂布培养，挑取单克隆，放大培养，即得所述有效免疫IB与ND的唾液乳酸杆菌。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（5）中扩增的条件为，将两种模板混合后，在不加引物的情况下循环反应5次，再加入引物P1-F和P4-R后，循环反应30次，退火温度为56 ℃，延伸时间为2 min，得到UTEFDA的PCR产物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（8）中电转化过程包括如下步骤：

S1：将步骤（6）中制备的pMG36e-UTEFDA重组表达质粒加入步骤（7）中制备的TCMM17感受态中，混匀，得到混合物；

S2：将所述混合物冰浴10 min，得到冰浴后混合物；

S3：将所述冰浴后混合物电转化，得到电转化后混合物，电转化程序为10 kv/cm，25 μF，200 Ω；

S4：向所述电转化后混合物中加入含3 mol/L蔗糖的MRS液体培养基，混匀后于37 ℃静置培养3 h，涂布，倒置37 ℃培养24-36 h；

S5：挑取单克隆菌落，放大培养，即得所述有效免疫IB与ND的唾液乳酸杆菌。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（7）中制备TCMM17感受态包括如下步骤：

S1：将TCMM17菌种接种于MRS液体培养基中，静置于37 ℃过夜培养，划线接种于MRS琼脂平板上，37 ℃培养24 h，挑取单菌落接种MRS液体培养基中，于37 ℃静置过夜培养，得到菌液一；

S2：按体积百分数5 %接种量接种于MRS液体培养基，37 ℃静置培养3 h，至菌体浓度为OD600=0.3-0.4，加入氨苄青霉素，使其终浓度为10 μg/mL，继续培养1.5 h，得到菌液二；

S3：将S2得到的菌液二冰浴静置20 min，4 ℃ 1500 g离心2 min收集菌体；预冷的无菌ddH₂O清洗菌体2次，每次3min，4℃、1500g离心2min收集菌体；用预冷的50mmol/L EDTA清洗1次，预冷ddH₂O清洗2次，预冷0.3 mol/L蔗糖溶液清洗1次，用500 μL0.3 mol/L蔗糖溶液重悬菌体，冰浴静置30 min，得到所述TCMM17感受态。