CN110283765A - 具有修复肠道功能的环境友好型猪表皮生长因子重组乳酸乳球菌 - Google Patents
具有修复肠道功能的环境友好型猪表皮生长因子重组乳酸乳球菌 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110283765A CN110283765A CN201910357220.2A CN201910357220A CN110283765A CN 110283765 A CN110283765 A CN 110283765A CN 201910357220 A CN201910357220 A CN 201910357220A CN 110283765 A CN110283765 A CN 110283765A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pegf
- lactococcus lactis
- recombinant
- bacterium
- intestinal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 title claims abstract description 40
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 title claims abstract description 11
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 title claims abstract description 10
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 title claims abstract description 10
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 title claims abstract description 10
- 241000194035 Lactococcus lactis Species 0.000 title claims abstract 7
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 11
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 11
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 5
- 241001478240 Coccus Species 0.000 claims description 3
- 239000006071 cream Substances 0.000 claims description 3
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 claims 1
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 29
- 238000011049 filling Methods 0.000 abstract description 25
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 abstract description 22
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 16
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 abstract description 14
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 abstract description 11
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 abstract description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 abstract description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 abstract description 4
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000007413 intestinal health Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 104
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 62
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 47
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 35
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 33
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 19
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 12
- 108010053775 Nisin Proteins 0.000 description 11
- NVNLLIYOARQCIX-MSHCCFNRSA-N Nisin Chemical compound N1C(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@@H]([C@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)[C@H](N)[C@H](C)CC)CSC[C@@H]1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]2C(NCC(=O)N[C@H](C)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CS[C@@H]2C)C(=O)N[C@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]2C(N[C@H](C)C(=O)N[C@@H]3C(=O)N[C@@H](C(N[C@H](CC=4NC=NC=4)C(=O)N[C@H](CS[C@@H]3C)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H]([C@H](C)CC)C(=O)N[C@H](CC=3NC=NC=3)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(O)=O)=O)CS[C@@H]2C)=O)=O)CS[C@@H]1C NVNLLIYOARQCIX-MSHCCFNRSA-N 0.000 description 11
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 11
- 239000004309 nisin Substances 0.000 description 11
- 235000010297 nisin Nutrition 0.000 description 11
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 10
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 8
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 8
- 208000028104 epidemic louse-borne typhus Diseases 0.000 description 8
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 206010061393 typhus Diseases 0.000 description 8
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 7
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 7
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 7
- 239000002585 base Substances 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 6
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 239000005030 aluminium foil Substances 0.000 description 5
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 4
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 4
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 description 4
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 101150115929 Usp45 gene Proteins 0.000 description 4
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- AVPCPPOOQICIRJ-UHFFFAOYSA-L sodium glycerol 2-phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OCC(CO)OP([O-])([O-])=O AVPCPPOOQICIRJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 4
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 4
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 108010009004 proteose-peptone Proteins 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- GDSOZVZXVXTJMI-SNAWJCMRSA-N (e)-1-methylbut-1-ene-1,2,4-tricarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C(/C)=C(C(O)=O)\CCC(O)=O GDSOZVZXVXTJMI-SNAWJCMRSA-N 0.000 description 2
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 II 30mL Substances 0.000 description 2
- 102100020881 Interleukin-1 alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010082786 Interleukin-1alpha Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 2
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 2
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 2
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- XJRPTMORGOIMMI-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-amino-4-(trifluoromethyl)-1,3-thiazole-5-carboxylate Chemical compound CCOC(=O)C=1SC(N)=NC=1C(F)(F)F XJRPTMORGOIMMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 210000001630 jejunum Anatomy 0.000 description 2
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000012549 training Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- CIWBSHSKHKDKBQ-SZSCBOSDSA-N 2-[(1s)-1,2-dihydroxyethyl]-3,4-dihydroxy-2h-furan-5-one Chemical compound OC[C@H](O)C1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-SZSCBOSDSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 238000009020 BCA Protein Assay Kit Methods 0.000 description 1
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100032367 C-C motif chemokine 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100031456 Centriolin Human genes 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 102100034221 Growth-regulated alpha protein Human genes 0.000 description 1
- 101150105849 H5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 101000797762 Homo sapiens C-C motif chemokine 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000941711 Homo sapiens Centriolin Proteins 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 101001069921 Homo sapiens Growth-regulated alpha protein Proteins 0.000 description 1
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 101710159752 Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase subunit PhaE Proteins 0.000 description 1
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 description 1
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 1
- 241001478878 Streptobacillus Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 229920002522 Wood fibre Polymers 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000002199 base oil Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000004913 chyme Anatomy 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000013039 cover film Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 1
- 230000003118 histopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000474 nursing effect Effects 0.000 description 1
- 229940100692 oral suspension Drugs 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 235000013406 prebiotics Nutrition 0.000 description 1
- 238000004080 punching Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
- A61K35/741—Probiotics
- A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Mycology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及具有修复肠道功能的环境友好型猪表皮生长因子重组乳酸乳球菌。本发明以乳酸乳球菌NZ3900为宿主菌，以LacF为筛选标记，利用表达载体pNZ8149为出发载体，构建了表达猪表皮生长因子(pEGF)的重组乳酸乳球菌pEGF‑NZ，实现了pEGF的无抗分泌表达，表达量为1.34μg/mL。通过细胞增殖试验及灌胃感染鼠伤寒沙门氏菌的小鼠试验，表明重组表达的pEGF蛋白具有显著促进细胞增殖的功能和良好的肠道修复功能，能够促进肠道发育，降低腹泻率，保护肠道健康。本发明的pEGF重组乳酸乳球菌可以作为在制备饲料添加剂中的应用和直接在养殖中的应用，对环境保护及养猪行业具有积极的推动作用。
Description
技术领域
本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一株具有良好修复肠道功能的环境友好型猪表皮生长因子重组乳酸乳球菌及其应用。
背景技术
乳酸乳球菌是乳酸菌的典型菌种，是一种嗜温发酵菌，能够发酵糖类产生乳酸，是一种重要的商业化微生物，在食品发酵方面具有十分丰富和广泛的作用。乳酸乳球菌不是胃肠道内天然微生物，却能通过肠腔，并能在肠道内存活。乳酸乳球菌耐酸性强，活菌在消化道能正常代谢，大多数死菌被快速地裂解。最重要的是，乳酸乳球菌公认的安全级地位在生产和分泌治疗性、免疫性蛋白上具有明显的优势。这些优良的特性使乳酸乳球菌成为基因工程宿主菌的最佳候选者，可以用做传递胞质蛋白的活性载体，尤其是传递目的性消化酶如治疗胰腺缺陷的脂肪酶。到目前为止，以乳酸乳球菌为宿主菌，已成功表达出多种重组蛋白，如IL-10基因、禽流感H5基因、幽门螺旋杆菌Omp22-HpaA基因、丙型肝炎病毒ORF2抗原基因、木质纤维素基因、禽传染性支气管炎病毒Epic基因等，验证其具有良好的功能特性。
EGF是细胞因子的一种,具有促进细胞增殖与分化、代谢与凋亡、促进表皮修复的功能，在医药领域具有重大的研究及应用价值。
由于断奶仔猪肠道发育不完善，免疫力弱，日粮及环境的改变使其肠道表皮受损，腹泻发生率上升，进而造成养殖成本提高。因此，采用基因工程手段表达具有表皮修复功能的pEGF(猪表皮生长因子)，以LacF为筛选标记，构建食品级pEGF重组乳酸乳球菌，研发一种可保护断奶仔猪肠道健康的制剂。
通过口服食品级pEGF重组乳酸乳球菌，可降低养殖成本，在绿色养猪方面具有巨大的实用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服抗性筛选及低表达缺陷，以LacF为筛选标记，表达一种以低剂量(ng级别)就能发挥功能的猪表皮生长因子(pEGF)，研发一种可保护断奶仔猪肠道健康的环境友好型微生物制剂。
本发明通过电转化技术方法成功构建食品级pEGF重组乳酸乳球菌，实现了pEGF蛋白分泌型表达。通过细胞试验及感染鼠伤寒沙门氏菌CVCC542小鼠灌胃pEGF重组乳酸乳球菌试验对其功能进行了验证。
实现本发明目的的具体技术方案如下：
1、Usp45-pEGF基因的获得
将NCBI上登陆的pEGF基因的成熟肽序列(登陆号GenBank:M60178.1)按照乳酸乳球菌密码子偏爱性进行密码子优化，然后与Usp45基因的信号肽(登陆号GenBank:NM214020)融合在一起，将融合后基因片段命名为Usp45-pEGF，(由金斯瑞生物科技有限公司合成)，连接在pUC57载体上，将重组载体命名为pUC57-Usp45-pEGF。
2、Usp45-pEGF蛋白的分泌表达及纯化过程：
(1)根据Usp45-pEGF的5'和3'端序列设计2对引物，序列如下：
上游引物Usp45-F:5ˊ-CCCATGGCCATGAAAAAAA AGATTATCTCAGCTATTTTAATGTC-3ˊ下游引物Usp45-R:5ˊ-AGCGTAAACACCTGACAACGGGGCTGCAGCAGAAAGTATCACTGTA-3ˊ
pEGF-1:5ˊ-AGCCCCGTTGTCAGGTGTTTACGCTAACTCATACTCAGAATGTCCACCATC-3ˊpEGF-2:5ˊ-CGAGCTCTTAATGATGATGATGATGATGACGAAGTTCCCACCATTTAAGATCACG-3ˊ
Usp45上游引物5ˊ端加上了保护性碱基(C)、Nco I酶切位点(如下划线所示的序列)和防移码突变碱基(如黑体所示的序列)，pEGF下游引物3ˊ端加上了保护性碱基(C)、SacI酶切位点(如下划线所示的序列)、终止密码子(如黑体所示的序列)和6个his标签(如下划线所示的序列)。
以pUC57-Usp45-pEGF质粒为模板，使用上述引物对进行融合PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小正确后，将目标片段切下，用凝胶回收试剂盒(购自北京全式金生物技术有限公司)回收。
(2)pEGF重组乳酸乳球菌的构建：
将上述获得的Usp45-pEGF基因片段和表达载体pNZ8149(吉林农业大学胡桂学教授馈赠，质粒图谱见图13)分别进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，将目标片段切下，用凝胶回收试剂盒回收，于16℃条件下连接。
当乳酸乳球菌NZ3900(吉林农业大学胡桂学教授馈赠)OD600值约0.2-0.3时，制备感受态细胞。用连接产物电转化乳酸乳球菌NZ3900感受态细胞，将转化产物涂布Elliker筛选培养基(20g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、4g/L氯化钠、1.5g/L乙酸钠、0.5g/L L(+)抗坏血酸、15g/L琼脂糖、0.5％乳糖、0.004％溴甲酚紫)。30℃静置培养24h后挑取平板上的单个黄色菌落进行培养，12h后用菌液做PCR鉴定。菌液PCR鉴定正确后，提取pNZ8149-Usp45-pEGF重组质粒，经双酶切和测序鉴定正确后，申请人将所得的重组乳酸乳球菌命名为pEGF-NZ重组菌，即乳酸乳球菌pEGF-NZ，Lactococcus Lactis pEGF-NZ。
申请人将所得的乳酸乳球菌pEGF-NZ，Lactococcus Lactis pEGF-NZ，于2019年4月28日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:M2019311。
(3)pEGF-NZ重组菌pEGF的功能性表达及纯化：
将pEGF-NZ重组菌以1:25体积比接种于M17液体培养基(购自青岛高科园海博生物技术有限公司)中，当浓度OD600值为0.3-0.4时，加入nisin至终浓度为5ng/mL诱导目的基因pEGF的表达，30℃静置培养20h后离心收集上清，上清首先用His标签的鼠单抗(购自美国Abbkine公司)进行Western blot鉴定，鉴定正确后，用80％饱和度硫酸铵浓缩，4℃冰箱透析2天后，用0.45um滤膜进行过滤，最后用带有His标签的镍离子亲和层析柱对上清液过柱纯化，所得到的纯化蛋白进行Tricine-SDS-PAGE电泳分析鉴定，并置-80℃保存备用。
3、pEGF-NZ重组菌pEGF蛋白体外生物功能活性的鉴定：
具有生物功能活性的pEGF能够促进细胞增殖，把pEGF-NZ重组菌的过滤除菌上清与IPEC-J2细胞(由华中农业大学动物科技学院实验室保存，但完成本试验不限于所述的IPEC-J2细胞，该细胞可以从商业上或科研协作或科技交流上获得类似的细胞做试材)共孵育，12h后使用倒置显微镜拍照记录各处理组细胞生长状态，然后经cck8试剂给细胞数量定量，37℃孵育1h后，使用赛默飞Multiskan MK3型-酶标仪检测OD450，结果显示与空载组、空白组相比，pEGF-NZ重组菌的上清处理组的细胞较密，较饱满，OD450值显著升高。
4、pEGF-NZ重组菌pEGF对蛋白小鼠体内生物功能活性的鉴定：
具有生物功能活性的pEGF能够促进表皮修复与再生，提高肠绒毛高度，抑制促炎因子的表达。在5周龄雌性ICR小鼠感染鼠伤寒沙门氏菌CVCC542(华中农业大学动物科技学院栗绍文教授馈赠)前后分别灌胃经nisin诱导20h的pEGF-NZ重组菌及其培养上清，对各处理组小鼠腹泻率、腹泻时长、生长性能、肠道黏膜进行了比较，使用平板计数检测小鼠肠道菌群的变化，使用蛋白质芯片(美国RayBiotech公司)检测小鼠血清细胞因子的变化。表型结果显示pEGF-NZ重组菌及其培养上清预防组、治疗组小鼠被毛较模型光滑有序，精神状态较好、腹泻率降低、延缓了腹泻发生的时间；肠道组织切片结果表明pEGF-NZ重组菌及其培养上清预防组、治疗组小鼠肠黏膜较完整，肠绒毛高度较高，固有层损害较小，而模型组、空载组小鼠肠黏膜严重脱落，固有层坏死且有大量炎性细胞浸润，揭示了pEGF-NZ重组菌pEGF蛋白促进了肠道表皮的修复，保护了肠道的健康；肠道菌群检测结果表明pEGF-NZ重组菌及其培养上清预防组、治疗组结肠大肠杆菌数、肠球菌数、鼠伤寒沙门氏菌数显著降低，乳酸菌数上升，揭示了pEGF-NZ重组菌pEGF蛋白可调控肠道菌群结构。蛋白质芯片结果表明pEGF-NZ重组菌及其培养上清预防组、治疗组显著抑制促炎因子IL-1α的分泌，显著促进抑炎因子IL-13、IL-17的表达，揭示了pEGF-NZ重组菌pEGF蛋白促进表皮修复的同时，通过调控细胞因子的表达，维持机体免疫稳态。
本发明的积极效果如下：
(1)采用无抗筛选，在环境保护中起到重要作用。
(2)修复断奶仔猪表皮损伤，在养猪行业起到重要的作用。
(3)在益生制剂的生产中起到重要作用。
更详细的技术方案见《具体实施方案》中的内容。
附图说明
图1：pUC57-Usp45-pEGF Usp45-pEGF的融合PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测图。
附图标记说明：泳道M为：DL2000marker；泳道1为：pUC57-Usp45-pEGF Usp45-pEGF(259)融合PCR扩增片段。
图2：Usp45-pEGF与pNZ8149连接产物电转化乳酸乳球菌NZ3900感受态结果图。
附图标记说明：泳道M：DL2000marker；泳道1：pUC57-Usp45-pEGF Usp45-pEGF(259)融合PCR扩增片段。
图3：pEGF-NZ重组菌pEGF的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测图。
附图标记说明：泳道M：DL2000marker；泳道1：pEGF-NZ重组菌pEGF的PCR扩增片段。
图4：pEGF-NZ重组菌的pZN8149-Usp45-pEGF重组质粒双酶切产物琼脂糖凝胶电泳检测图。附图标记说明：泳道M为：DL5000marker；泳道1为：NcoⅠ和SacⅠ酶切pEGF-NZ重组菌的pZN8149-Usp45-pEGF产物。
图5：pEGF-NZ重组菌分泌表达pEGF的Western blot电泳鉴定图。
附图标记说明：泳道M为：蛋白Marker；泳道1为：pEGF-NZ重组菌培养上清。
图6：pEGF-NZ重组菌分泌表达pEGF的Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定图。
附图标记说明：泳道M为：蛋白Marker；泳道1为：His-tag-purified-pEGF-NZ。
图7：pEGF-NZ重组菌分泌表达pEGF促进细胞生长的生物功能活性检测图。
附图标记说明：图7中的A图：Ctrl高糖DMEM-100μL；图7中的B图：pNZ8149上清-10μL；图7中的C图：pEGF-NZ-10ng/mL；图7中的D图：pEGF-NZ-20ng/mL；图7中的E图：pEGF-NZ-25ng/mL；图7中的F图：pEGF-NZ-50ng/mL。
图8：pEGF-NZ重组菌分泌表达pEGF促进细胞增殖的生物功能活性检测图。
图9：pEGF-NZ重组菌各处理组小鼠的腹泻情况记录图。
附图标记说明：图9中的A图：空白组；图9中的B图：腹泻模型组；图9中的C图：V-NZ菌液预防组；图9中的D图：pEGF-NZ菌液预防组；图9中的E图：pEGF-NZ上清预防组；
图9中的F图：V-NZ菌液治疗组；图9中的G图：pEGF-NZ菌液治疗组；图9中的H图：pEGF-NZ上清治疗组。
图10：pEGF-NZ重组菌各处理组小鼠的肠道黏膜形态检测图。
附图标记说明：图10中的10-1图：十二指肠；其中A图：空白组；B图：腹泻模型组；C图：V-NZ菌液预防组；D图：V-NZ菌液治疗组；E图：pEGF-NZ菌液预防组；F图：pEGF-NZ上清预防组；G图：pEGF-NZ菌液治疗组；H图：pEGF-NZ上清治疗组。
图10中的10-2图：空肠；其中A图：空白组；B图：腹泻模型组；C图：V-NZ菌液预防组；D图：V-NZ菌液治疗组；E图：pEGF-NZ菌液预防组；F图：pEGF-NZ上清预防组；G图：pEGF-NZ菌液治疗组；H图：pEGF-NZ上清治疗组。
图10中的10-3图：回肠；其中A图：空白组；B图：腹泻模型组；C图：V-NZ菌液预防组；D图：V-NZ菌液治疗组；E图：pEGF-NZ菌液预防组；F图：pEGF-NZ上清预防组；G图：pEGF-NZ菌液治疗组；H图：pEGF-NZ上清治疗组。
图11：pEGF-NZ重组菌各处理组小鼠的结肠肠道菌群检测图。
附图标记说明：图11中的A图：大肠杆菌；图11中的B图：肠球菌；图11中的C图：沙门氏菌；图11中的D图：双歧杆菌；图11中的E图：乳酸菌。
图12：pEGF-NZ重组菌各处理组小鼠的血清型细胞因子检测图。
附图标记说明：图12中的A图：IL-1α；图12中的B图：IL-1β；图12中的C图：IL-3；图12中的D图：IL-4；图12中的E图：IL-6；图12中的F图：IL-13；图12中的G图：GM-CSF；图12中的H图：IFN-γ；图12中的I图：IL-10；图12中的J图：IL-17；图12中的K图：MCP-1；图12中的L图：TNF-α；图12中的M图：CCL5；图12中的N图：CXCL1。
图13：本发明应用实施例用到的pNZ8149空载体图谱(2548bp)。
图14：本发明制备的pEGF重组表达质粒(载体)pNZ8149-Usp45-pEGF的图谱(2829bp)。
具体实施方式
对相关序列表的说明：
序列表SEQ ID NO:1是pEGF基因的成熟肽序列。
序列表SEQ ID NO:2是密码子优化后的pEGF基因的成熟肽序列。
序列表SEQ ID NO:3是Usp45信号肽序列。
序列表SEQ ID NO:4是Usp45-pEGF的脱氧核苷酸序列。
实施例1：Usp45-pEGF基因的获得
把NCBI上的pEGF基因的成熟肽序列(GenBank:M60178.1)按照乳酸乳球菌密码子偏爱性通过Jcat软件进行密码子优化，然后与Usp45基因的信号肽(GenBank:NM214020)融合在一起(命名为Usp45-pEGF)，送南京金斯瑞生物科技有限公司合成，连接在pUC57载体上，命名为pUC57-Usp45-pEGF。
实施例2：pEGF-NZ重组菌的构建
根据Usp45-pEGF的5'和3'端序列设计2对引物，序列如下：
Usp45-F:5ˊ-CCCATGGCCATGAAAAAAA AGATTATCTCAGCTATTTTAATGTC-3ˊ；
Usp45-R:5ˊ-AGCGTAAACACCTGACAACGGGGCTGCAGCAGAAAGTATCACTGTA-3ˊ；
pEGF-1:
5ˊ-AGCCCCGTTGTCAGGTGTTTACGCTAACTCATACTCAGAATGTCCACCATC-3ˊ；
pEGF-2:
5ˊ-CGAGCTCTTAATGATGATGATGATGATGACGAAGTTCCCACCATTTAAGATCACG-3ˊ；
Usp45上游引物5ˊ端加上了保护性碱基(C)、Nco I酶切位点(如下划线所示的序列)和防移码突变碱基(如黑体所示的序列)，pEGF下游引物3ˊ端加上了保护性碱基(C)、SacI酶切位点(如下划线所示的序列)、终止密码子(如黑体所示的序列)和6个his标签(如下划线所示的序列)。
以pUC57-Usp45-pEGF质粒为模板，以Usp45-F、Usp45-R为引物扩增出Usp45基因，以pEGF-1、pEGF-2为引物扩增出pEGF基因，然后再以Usp45-下、pEGF-1为引物，以Usp45基因、pEGF基因为模板进行融合PCR扩增，扩增体系如表1所示，扩增条件设定为：98℃3min,98℃15sec,58℃15sec,72℃10s，30个循环后72℃延伸10min。
表1 Usp45-pEGF的融合PCR扩增体系
| 反应成分 | 用量(μL) |
| 2×PrimeSTAR Max PreMix(10mM) | 25 |
| Usp45-下(10uM) | 2.0 |
| pEGF-1(10uM) | 2.0 |
| Usp45基因 | 3 |
| pEGF基因 | 3 |
| ddH<sub>2</sub>O | up to 50 |
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小正确后，用PCR产物纯化试剂盒(购自北京全式金生物技术有限公司)回收。然后用Nco I和Sac I进行双酶切，37℃条件下酶切1小时，酶切体系如表2所示
表2 Usp45-pEGF的双酶切体系
| 反应成分 | 用量(μL) |
| Nco I | 2.0 |
| Sac I | 2.0 |
| 10×FastDigest Buffer | 4.0 |
| pEGF(644.4ng/μL) | 3.2 |
| ddH<sub>2</sub>O | up to 40 |
同时也对表达载体pNZ8149(质粒图谱见图13)用Nco I和Sac I双酶切，37℃条件下酶切1小时，酶切体系如表3所示：
表3表达载体pNZ8149的双酶切体系
| 反应成分 | 用量(μL) |
| Nco I | 2.0 |
| Sac I | 2.0 |
| 10×FastDigest Buffer | 4.0 |
| pNZ8149(314.3ng/μL) | 5.9 |
| ddH<sub>2</sub>O | up to 40 |
酶切后的Usp45-pEGF PCR产物和载体pNZ8149产物分别用胶回收试剂盒(购自北京全式金生物技术有限公司)纯化，然后于16℃条件下过夜连接，连接体系如表4所示：
表4连接体系
| 反应成分 | 用量(μL) |
| 酶切回收pEGF产物(105.8ng/μL) | 6.0 |
| 酶切回收pNZ8149载体(83.0ng/μL) | 1.5 |
| T4DNA ligase | 1.0 |
| 10×T4ligase Buffer | 2.0 |
| ddH<sub>2</sub>O | up to 20 |
乳酸乳球菌NZ3900感受态细胞的制备步骤如下：
(1)将保存的乳酸菌NZ3900(NZ3900菌株由吉林农业大学胡桂学教授馈赠)常规甘油菌无菌划线接种M17固体培养基，30℃培养24h。
(2)挑取M17固体培养基(5.0g/L大豆胨、2.5g/L蛋白胨、2.5g/L酪蛋白胨、2.5g/L酵母浸粉、5.0g/L牛肉浸粉、5.0g/L乳糖、0.5g/L抗坏血酸、19.0g/Lβ-甘油磷酸钠、0.25g/L硫酸镁、15.0g/L琼脂糖)的单个菌落接种于GM17液体培养基，30℃过夜培养24h。
(3)将500μL培养物接种于5mL GM17液体培养基(5.0g/L大豆胨、2.5g/L胰蛋白胨、2.5g/L酪蛋白胨、2.5g/L酵母浸粉、5.0g/L牛肉浸粉、5.0g/L乳糖、5.0g/L葡萄糖、0.5g/L抗坏血酸、19.0g/Lβ-甘油磷酸钠、0.25g/L硫酸镁)，继续在30℃静置培养24h。
(4)将5mL培养物接种于40mL G-SGM17液体培养基(5.0g/L大豆胨、2.5g/L蛋白胨、2.5g/L酪蛋白胨、2.5g/L酵母浸粉、5.0g/L牛肉浸粉、5.0g/L乳糖、5.0g/L葡萄糖、171.5g/L蔗糖、0.5g/L抗坏血酸、19.0g/Lβ-甘油磷酸钠、0.25g/L硫酸镁、25g/L甘氨酸)，继续培养大约3-4h至细菌进入对数生长期(OD600＝0.4)。
(5)将细菌转移至无菌的冰预冷的50mL离心管中，冰上放置20min，使培养物冷却至0℃。
(6)4℃、6 000rpm离心15min，弃上清，回收细菌沉淀，加入40mL预冷的溶液Ⅰ重悬沉淀，冰上静止15min。
(7)4℃、6 000rpm离心15min，弃上清，回收细菌沉淀，加入20mL预冷的溶液Ⅱ重悬沉淀，冰上静止15min。
(8)4℃、6 000rpm离心15min，弃上清，回收细菌沉淀，加入10mL预冷的溶液Ⅰ重悬沉淀，冰上静止15min。
(9)4℃、6 000rpm离心15min，弃上清，回收细菌沉淀，加入400μL预冷的溶液Ⅰ重悬沉淀，每管分装40μL，储存于-80℃备用。
将所得20μL连接产物与100μL乳酸乳球菌混匀后转入2mm的预冷电转化杯中，以Transformation Apparatus 617BR1 03149电击。电击参数为：电压2KV、电阻200Ω、时间4.5ms，然后迅速加入1mL预冷的M17恢复培养基(5.0g/L大豆胨、2.5g/L胰蛋白胨、2.5g/L酪蛋白胨、2.5g/L酵母浸粉、5.0g/L牛肉浸粉、5.0g/L乳糖、5.0g/L葡萄糖、0.5g/L抗坏血酸、19.0g/Lβ-甘油磷酸钠、0.25g/L硫酸镁、20mmol/L MgCL2、2mmol/L CaCL2)，冰上静置5min，将菌液转移至1.5mL灭菌离心管中，30℃静止培养1.5-2h后涂布于Elliker固体筛选培养基(20g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、4g/L氯化钠、1.5g/L乙酸钠、0.5g/L L(+)抗坏血酸、15g/L琼脂糖、0.5％乳糖、0.004％溴甲酚紫)，30℃静置培养24h，挑取黄色单菌落培养12后进行菌液PCR鉴定，引物设计如下所示，扩增体系如表5所示，扩增条件设定为：95℃10min,95℃30sec,56℃30sec,72℃30s，35个循环后72℃延伸5min。
pEGF-NZ重组乳酸菌菌液PCR引物序列：
pNZ8149-3:5ˊ-CAATGATTTCGTTCGAAGGAACTAC-3ˊ
pEGF-4:5ˊ-ACGAAGTTCCCACCATTTAAGATCACG-3ˊ
表5菌液PCR扩增体系。
| 反应成分 | 用量(μL) |
| 2×MasterMix | 12.5 |
| pNZ8149-3(10uM) | 1.0 |
| pEGF-4(10uM) | 1.0 |
| 菌液 | 0.8 |
| ddH<sub>2</sub>O | up to 25 |
取阳性菌进行扩大培养，用质粒小提试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司提取
质粒进行双酶切鉴定，双酶切体系如表6所示：
表6双酶切体系
经双酶切鉴定条带大小正确后，交武汉擎科生物公司进行测序，测序结果表明Usp45-pEGF目的基因片段正确插入到载体pNZ8149中，且无突变发生，将获得的表达质粒命名为pNZ8149-Usp45-pEGF(质粒图谱见图14)。
实施例2：pEGF-NZ重组菌pEGF基因的表达及纯化
1、重组乳酸乳球菌pEGF-NZ的pEGF基因的诱导表达及浓缩
无菌条件下将活化后的10mL阳性重组菌接种于250mL M17液体培养基，继续培养约3-4h至细菌进入对数生长期(OD600＝0.4)。用5ng/mL的乳链杆菌肽(Nisin)诱导20h后终止培养，4℃12 000rpm离心5min，收集上清，取100μL上清进行Western blot检测，其余上清在4℃条件下置磁力搅拌器上搅拌，边搅拌边添加硫酸铵粉末，至硫酸铵饱和度达到80％。2h后，分装于50mL离心管，4℃8 000r/min离心20min，弃上清。用1/10培养基体积的PBS(0.01mol/L pH 7.4)重悬沉淀，装入透析袋4℃透析。
2、HisTrapTMHP crude亲和层析柱进行pEGF-pNZ8149重组乳酸乳球菌蛋白的纯化：
4℃透析上清经0.45um的滤膜过滤处理后，使用AKTApurifier全自动层析仪进行纯化。纯化方法为：
(1)打开电脑主机和电脑电源，待仪器自检完毕(例如：仪器型号为CU950上面的3个指示灯完全点亮不闪烁)，双击桌面上UNICORN图标，进入操作界面。首先将A1管道放入平衡液或banding buffering中，将B1管道放入高盐溶液中或elution buffering中，在systemcontrol窗口点击manual→pump→pump wash basic，选中A1，BI管道为ON，execute。泵清洗程序会自动运行结束。选择manual→pump→flow rate,输入流速1ml/ml，insert；选择manual→Alarm﹠mon→alarm pressure，设置high alarm，insert，execut。将进样阀的1号为管道接入柱子的柱头，稍微拧紧后将柱下端的堵头卸掉，直接拧入紫外流动池或连接管道。
(2)柱子平衡好了(观察电导COND，pH的数值正确曲线走稳了)。此时将紫外调零，选择manual→Alarm﹠mon→autozero，exectue，准备上样。用系统泵上样：点击pause，将A1放入样品中，点击countine；待样品上完后，再将放入到平衡液中继续清洗柱子。用缓冲液尽量将穿透峰洗回基线。选择manual→pump→gradient，按照自己的条件选择target％B和length，execute。固定体积收集：选择manual→Frac→fractionation-900，输入每管收集体积，exectue。结束固定体积收集选择manual→Frac→fractionation-stop-900，exectue。峰收集：选择manual→Frac→Peak-FracParametersUV，输入峰收集参数，insert,点击Peak-Fraction-900,输入每管最大收集体积，insert，exectue。结束峰收集，选择Peak-FracStop-900，execute。
(3)编程及自动运行。点击mothed editor窗口里工具栏的mothed wizard快捷图标，打开对话框。按照对话框的要求选择条件，编好后按finish出现编程结果，在变量框中可以更改变量。保存点击工具栏里的保存快捷图标，输入文件名，点击ok。在systemcontrol窗口点击工具栏中的RUN打开编好的方法，点击next直到start开始运行。
(4)清洗系统及拆柱。运行结束后，将A1和B1入口放入纯水中，启动pump washpurifier功能冲洗A泵和B泵及整个管路。然后在将A1和B1入口放入20％乙醇中，同样操作将乙醇冲满整个管路保存。系统给柱子一个慢流速，设置系统保护压力，然后先拆柱子的下端，拧上堵头，在拆柱子的上端，拧上堵头。收集纯化的蛋白，用超滤管在4℃4 000r/min的条件下离心浓缩至1ml左右，置-80℃保存备用。
3、利用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白含量：
使用Thermo PierceTM BCA Protein Assay Kit蛋白测定试剂盒对pEGF蛋白浓度进行测量，步骤如下：
配制工作液(该试剂盒自带)，该试剂盒由3部分构成，分别为Reagent A，ReagentB，Albumin Standard Ampules。工作液体积配比为A:B＝50:1，样品与工作液体积配比为1:8。
吸取25μL各标准品和待测样品加入微孔板(浓度范围为20-2000μg/mL)，每孔加入工作液200μL，震荡混匀30s。37℃条件下孵育30min。
使用分光光度计测定562nm处吸光值。除去空白样品吸光值后，制作标准曲线，计算PLE蛋白浓度。
实施例3：pEGF-NZ重组菌pEGF蛋白生物功能活性的验证
根据文献报道，pEGF蛋白具有促进表皮细胞增殖、修复与再生，提高肠绒毛高度、改善肠道发育，调控肠道菌群，参与机体炎症水平调控的作用。申请人设计细胞增殖试验验证pEGF蛋白促进表皮细胞增殖的功能，小鼠感染鼠伤寒沙门氏菌前后灌胃pEGF-NZ重组菌或其培养上清试验验证pEGF-NZ重组菌pEGF蛋白具有促进表皮修复与再生，提高肠绒毛高度、改善肠道发育，调控肠道菌群，参与机体炎症水平调控的作用。
1、细胞增殖试验
平板划线培养NZ3900/pNZ8149(V-NZ)和NZ3900/pNZ8149-SPUsp45-pEGF(pEGF-NZ重组菌)重组菌，挑取单菌落接种至10mL M17培养液中，30℃静置过夜培养。取过夜培养物按1:25倍分别接种到M17培养液中30℃静置培养，待OD600≈0.3(约1.5-2h)向V-NZ和pEGF-NZ中加入终浓度5ng/mLNisin诱导静置培养20h。分别取10mLV-NZ和pEGF-NZ经诱导的重组菌培养物，于4℃8 000r/min离心10min，收集上清液，并用0.22μm无菌滤器过滤，收集过滤产物-80℃保存备用。
调整传代培养IPEC-J2细胞浓度接种到96孔细胞培养板，至细胞达到60％汇合时，吸去培养液，用1×PBS清洗细胞3次，加入无血清DMEM饥饿培养24h，用1×PBS清洗细胞1次再更换新鲜的无血清DMEM培养液，按照表7进行试验处理，12h后观察细胞生长状况，并用倒置显微镜拍下细胞图片。该试验共9个处理，每个处理6个重复，每个重复1个孔细胞，共进行3次试验。结果见表7.
表7重组pEGF菌株对IPEC-J2细胞增殖活性检测的试验处理
| 处理 | 材料(上清液) | 剂量(单位：μL) |
| 空白(control) | 高糖DMEM | 100.0μL |
| 空载(V-NZ-10μL) | Nisin诱导的上清液 | 10.0μL |
| pEGF-NZ-2ng/mL | Nisin诱导的pEGF-NZ上清液 | 1.5μL |
| pEGF-NZ-4ng/mL | Nisin诱导的pEGF-NZ上清液 | 3.0μL |
| pEGF-NZ-5ng/mL | Nisin诱导的pEGF-NZ上清液 | 4.0μL |
| pEGF-NZ-10ng/mL | Nisin诱导的pEGF-NZ上清液 | 10.0μL |
| pEGF-NZ-20ng/mL | Nisin诱导的pEGF-NZ上清液 | 15.0μL |
| pEGF-NZ-25ng/mL | Nisin诱导的pEGF-NZ上清液 | 20.0μL |
| pEGF-NZ-50ng/mL | Nisin诱导的pEGF-NZ上清液 | 40.0μL |
共孵育12h后倒置显微镜下观察细胞生长状态，拍照留图后，每个孔添加100μL10％cck8(10μLcck8+90μLDMEM)预混液，37℃作用1h，使用检测OD450值。与空载组、空白组相比，pEGF-NZ10ng/mL,20ng/mL,25ng/mL,50ng/mL上清处理组的细胞较密，较饱满，OD450值显著升高，与文献报道的结果相一致，表明申请人构建的pEGF-NZ重组菌表达的pEGF蛋白具有促进细胞增殖的功能。
2、小鼠感染鼠伤寒沙门氏菌CVVCC542前后10d灌胃pEGF-NZ重组菌或其培养上清试验96只体重相近的5周龄雌性ICR小鼠(购自湖北省动物实验中心)分8组(空白组、腹泻模型组、pEGF-NZ菌液预防组、pEGF-NZ上清预防组、pEGF-NZ菌液治疗组、pEGF-NZ上清治疗组、V-NZ菌液预防组、V-NZ上清治疗组)；保持饲养温度(23℃左右)，每天人工照明12h，标准小鼠饲料喂养、自由采食和自由饮水。对照组连续灌胃连续灌胃PBS 21d
(0.1mL/只)，每天1次，每次100μL；腹泻模型组1-10d灌胃PBS，第11d灌胃鼠伤寒沙门氏菌菌液，第12-21d灌胃PBS；pEGF-NZ菌液预防组1-10d灌胃pEGF重组菌液，第11d灌胃鼠伤寒沙门氏菌菌液，第12-21d灌胃PBS；pEGF-NZ上清预防组1-10d灌胃pEGF重组菌培养上清，第11d灌胃鼠伤寒沙门氏菌菌液，第12-21d灌胃PBS；pEGF-NZ菌液治疗组1-10d灌胃PBS，第11d灌胃鼠伤寒沙门氏菌菌液，第12-21d灌胃pEGF重组菌液；pEGF-NZ上清治疗组1-10d灌胃PBS，第11d灌胃鼠伤寒沙门氏菌菌液，第12-21d灌胃pEGF重组菌培养上清；V-NZ菌液预防组1-10d灌胃空载菌液，第11d灌胃鼠伤寒沙门氏菌菌液，第12-21d灌胃PBS；V-NZ上清治疗组1-10d灌胃PBS，第11d灌胃鼠伤寒沙门氏菌菌液，第12-21d灌胃空载菌液。各组小鼠均在第10d下午5:30断食，第11d腹腔注射氨苄青霉素200μL，口服氨苄青霉素300μL，每只小鼠12.5kg/mL，3h后灌胃鼠伤寒沙门氏菌菌液(109cfu，0.2mL每只)攻毒。各处理组具体饲喂与感染试验处理见表8。
表8试验动物分组及处理
| 组别 | 1-10d | 11d | 12-21d |
| 空白组 | PBS | PBS | PBS |
| 腹泻模型组 | PBS | 鼠伤寒CVCC542 | PBS |
| pEGF-NZ菌液预防组 | pEGF-NZ菌液 | 鼠伤寒CVCC542 | PBS |
| pEGF-NZ上清预防组 | pEGF-NZ上清 | 鼠伤寒CVCC542 | PBS |
| pEGF-NZ菌液治疗组 | PBS | 鼠伤寒CVCC542 | pEGF-NZ菌液 |
| pEGF-NZ上清治疗组 | PBS | 鼠伤寒CVCC542 | pEGF-NZ上清 |
| V-NZ菌液预防组 | V-NZ菌液 | 鼠伤寒CVCC542 | PBS |
| V-NZ菌液治疗组 | PBS | 鼠伤寒CVCC542 | V-NZ菌液 |
试验期为21d，试验开始后每隔3天上午8:30统计小鼠体重并计算日增重，结果表明pEGF-NZ重组菌对小鼠日增重无影响，具体见表9。
表9 pEGF-NZ重组菌各处理组的小鼠腹泻率记录表
在第11d攻毒鼠伤寒沙门氏菌后12h开始观察小鼠的腹泻与精神状况并进行拍照记录，粪便不成形、稀薄或底油脓液者判定为腹泻，统计小鼠腹泻率及腹泻时长，具体结果见表10。
表10 pEGF-NZ重组菌各处理组的小鼠腹泻率记录表
| 组别 | 小鼠数量(只) | 腹泻率 | 维持时间(h) |
| 空白组 | 10 | 0％ | 0 |
| 腹泻模型组 | 10 | 100％ | 7 |
| pEGF-NZ菌液预防组 | 12 | 75％ | 5 |
| pEGF-NZ上清预防组 | 10 | 70％ | 6 |
| pEGF-NZ菌液治疗组 | 12 | 91.6％ | 7 |
| pEGF-NZ上清治疗组 | 12 | 91.6％ | 7 |
| V-NZ菌液预防组 | 10 | 80％ | 6 |
| V-NZ菌液治疗组 | 10 | 100％ | 7 |
第21d晚上饥饿，第22d上午8:30小鼠称重后眼球采血处死小鼠。分别采取长约3cm的十二指肠、空肠、回肠置于4％通用型多聚甲醛组织固定液中，然后送佰仟度生物科技有限公司通过石蜡包埋法做病理组织切片对肠道黏膜形态进行检测。
收集每组小鼠结肠食糜进行肠道菌群分析，通过10倍梯度稀释法检测肠道菌群的变化，选择3个适宜的稀释度，每个平板滴注接种200μL，每个稀释度作3个重复，总细菌、大肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳酸菌、鼠伤寒沙门氏菌分别采用PCA、MAC、EC、BBL和MRS、HE培养基培养。
眼球采集的血液经37℃静置1h后，4℃放置过夜，3000rpm离心15min，吸取上层血清，使用小鼠细胞因子芯片(Quantibody Mouse Cytokine Array,美国RayBiotech,Inc)检测小鼠血清细胞因子的变化，具体步骤如下：
(1)从包装盒中取出蛋白质芯片，放在室温20～30min，使其恢复至室温。然后拆开塑料包装，剥去覆盖膜，室温干燥1～2min；
(2)细胞因子标准品的制备：先将标准品瞬离一下，然后向其中加入500μL样品稀释液，轻轻转动小瓶使标准品充分溶解混匀，标记为std1。取6个干净的1.5mL离心管，分别为std2～std7，每个离心管中加入200μL Sample Diluent。取100μL std1于std2中，轻轻混匀。然后从std2取100μL于std3，轻轻混匀，直至std7。另取一干净1.5mL离心管，加入100μLSampleDiluent，为CNTRL；
(3)上样孵育：首先向每孔中加入100μL的Sample Diluent，室温孵育30min，然后弃去孔中的Sample Diluent，向每孔中加入100μL标准品或待测样品，4℃孵育过夜。倒掉每孔中液体，然后用1×Wash BufferⅠ洗涤5遍，每孔中加150μL，每次5min。然后用1×WashBufferⅡ洗涤2遍，每孔中加150μL，每次5min；
(4)一抗孵育：向每孔中加入80μL多抗混合物，室温孵育1～2min，倒掉每孔中液体，然后用1×Wash BufferⅠ洗涤5遍，每孔中加150μL，每次5min；用1×Wash BufferⅡ洗涤2遍，每孔中加150μL，室温轻轻摇动，每次5min；
(5)荧光标记的二抗孵育：向每孔中加入80μL Cy3标记的二抗，用铝箔纸盖住并放在黑暗处，避免光照，室温孵育1h。然后倒掉每孔中的样品，用1×Wash BufferⅠ洗涤5遍，每孔中加150μL，每次5min；用1×Wash BufferⅡ洗涤2遍，每孔中加150μL，室温轻轻摇动，每次5min；
(6)小心推动夹子拆开装置，将玻片从衬垫上取下，然后将玻片放在Slidewasher/Dryer里，加入足够的1×Wash BufferⅠ约30mL，以充分覆盖整张玻片，然后经铝箔纸包裹后置于摇床室温清洗6min；重复操作一遍。加入1×Wash BufferⅡ30mL，铝箔纸包裹后置于摇床室温清洗3min。弃掉后，更换新的1×Wash BufferⅡ30mL，铝箔纸包裹后置于摇床室温清洗10min。弃掉后，轻轻甩干残留的1×Wash BufferⅡ，铝箔纸包裹好后存放于4℃；
(7)玻片晾干后，经扫描检测荧光，注意全程避光。绘制标准曲线，计算细胞因子的浓度后进行分析。
主要参考文献
1.Le Loir Y,Azevedo V,Oliveira S C,et al.Protein secretion inLactococcus lactis:an efficient way to increase the overall heterologousprotein production.Microb Cell Fact,2005,4:2:1-13；
2.Drouault S,Gerard C,Ehrlich S D,et al.Survival,physiology,and lysisof lactococcus lactis in the digestive tract.Appl Environ Microb,1999,65:4881-4886；
3.Bedford A,Chen T,Huynh E,et al.Epid-ermal growth factor containingculture supernatant enhances intestine development of early-weaned pigs invivo:Potential mechanisms involved.J Biotechnol,2015,196-197:9-19；
4.Calvert R,Beaulieu J F and Menard D.Epidermal growth factor(EGF)accelerates the maturation of feteal mouse intestinal mucosa inutero.Experientia,1982,38:1096-1097；
5.Cao H P,Wang H N,Zhang A Y,et al.Expression of Avian InfectiousBronchitis Virus Multi-Epitope Based Peptide EpiC in Lactococcus lactis forOral Immunization of Chickens.Biosci Biotech Bioch,2012,76:1871-1876；
6.Cera K R,Mahan D C,Cross R F,et al.Effect of age,weaning andpostweaning diet on small intestinal growth and jejunal morphology in youngswine.J Anim Sci,1988,66:574-584；
7.Chen S,Zhang R,Duan G,Shi J.Food-Grade Expression of Helicobacterpylori UreB Subunit in Lactococcus lactis and its Immunoreactivity.CurrMicrobiol,2011,62:1726-1731；
8.Cheung Q C,Yuan Z F,Paul W D,et al.Generation of epidermal growthfactor-expressing Lactococcus lactis and its enhancement on intestinaldevelopment and growth of early-weaned mice；
9.Drouault S,Gerard C,Ehrlich S D,et al.Survival,physiology,and lysisof lactococcus lactis in the digestive tract.Appl Environ Microb,1999,65:4881-4886；
10.Gao S,Li D,Liu Y,et al.Oral immunization with recombinanthepatitis E virus antigen displayed on the Lactococcus lactis surfaceenhances ORF2-specific mucosal and systemic immune responses in mice.IntImmunopharmacol,2015,24:140-145；
11.Hampson D J and Kidder D E.Influence of creep feeding and weaningon brush border enzyme activities in the piglet small intestine.Res Vet Sci,1986,40:24-31；
12.Hampson D J.Attempts to modify changes in the piglet smallintestine after weaning.Res Vet Sci,1986,40:313-317；
13.Havenith C E,Seegers J F,Pouwels P H.Gut-associated Lactobacillifor oral immunization.Food Res In,2002,2:151-163；
14.Kaneko Y,Imai Y,Matsuzaki F,et al.Epidermal growth factorstimulates proliferation of rat hepatoma cells producingα-fetoprotein.Experientia,1979,35:1660-1661；
15.Kang P,Toms D,Yin Y,et al.Epidermal Growth Factor-ExpressingLactococcus lactis Enhances Intestinal Development of Early-Weaned Pigs.JNutr,2009,806-811；
16.Leutz A and Schachner M.Epidermal growth factor stimulates DNA-synthesis of astrocyte in primary cerebellar cultures.Cell tissue Res,1981,220:393-404。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 具有修复肠道功能的环境友好型猪表皮生长因子重组乳酸乳球菌
<141> 2019-04-29
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 159
<212> DNA
<213> 乳酸乳球菌(Lactococcus Lactis)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(159)
<400> 1
aatagttact ctgaatgccc gccgtcccac gacgggtact gcctccacgg tggtgtgtgt 60
atgtatattg aagccgtcga cagctatgcc tgcaactgtg tttttggcta cgttggcgag 120
cgatgtcagc acagagactt gaaatggtgg gagctgcgc 159
<210> 2
<211> 159
<212> DNA
<213> 乳酸乳球菌(Lactococcus Lactis)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(159)
<400> 2
aactcatact cagaatgtcc accatcacac gatggttact gtcttcacgg tggtgtttgt 60
atgtacatcg aagctgttga ttcatacgct tgtaactgtg ttttcggtta cgttggtgaa 120
cgttgtcaac accgtgatct taaatggtgg gaacttcgt 159
<210> 3
<211> 81
<212> DNA
<213> 乳酸乳球菌(Lactococcus Lactis)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(81)
<400> 3
atgaaaaaaa agattatctc agctatttta atgtctacag tgatactttc tgctgcagcc 60
ccgttgtcag gtgtttacgc t 81
<210> 4
<211> 240
<212> DNA
<213> 乳酸乳球菌(Lactococcus Lactis)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(240)
<400> 4
atgaaaaaaa agattatctc agctatttta atgtctacag tgatactttc tgctgcagcc 60
ccgttgtcag gtgtttacgc taactcatac tcagaatgtc caccatcaca cgatggttac 120
tgtcttcacg gtggtgtttg tatgtacatc gaagctgttg attcatacgc ttgtaactgt 180
gttttcggtt acgttggtga acgttgtcaa caccgtgatc ttaaatggtg ggaacttcgt 240
Claims (2)
1.一种具有修复肠道功能的环境友好型猪表皮生长因子重组乳酸乳球菌(Lactococcus Lactis)pEGF-NZ，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019311。
2.权利要求1所述的一种具有修复肠道功能的环境友好型猪表皮生长因子重组乳酸乳球菌在制备微生态制剂中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910357220.2A CN110283765A (zh) | 2019-04-30 | 2019-04-30 | 具有修复肠道功能的环境友好型猪表皮生长因子重组乳酸乳球菌 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910357220.2A CN110283765A (zh) | 2019-04-30 | 2019-04-30 | 具有修复肠道功能的环境友好型猪表皮生长因子重组乳酸乳球菌 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110283765A true CN110283765A (zh) | 2019-09-27 |
Family
ID=68001526
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910357220.2A Pending CN110283765A (zh) | 2019-04-30 | 2019-04-30 | 具有修复肠道功能的环境友好型猪表皮生长因子重组乳酸乳球菌 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110283765A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109207504A (zh) * | 2018-09-26 | 2019-01-15 | 四川大学 | 一种有效免疫ib与nd的唾液乳酸杆菌的制备方法 |
| CN111700161A (zh) * | 2020-06-30 | 2020-09-25 | 芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司 | 一种重组猪表皮生长因子的制备及应用 |
| CN112546210A (zh) * | 2020-12-15 | 2021-03-26 | 南京农业大学 | 一种沙门菌灭活疫苗的制备方法及应用 |
| CN116676246A (zh) * | 2023-06-16 | 2023-09-01 | 华中农业大学 | 重组乳酸乳球菌、益生菌制剂、构建方法、cECF表达方法及应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100178273A1 (en) * | 2007-06-20 | 2010-07-15 | Actogenix Nv Corporation | Methods and compositions for treating mucositis |
| CN107325998A (zh) * | 2017-06-20 | 2017-11-07 | 江西嘉博生物工程有限公司 | 一种表达猪表皮生长因子基因的重组乳酸乳球菌及构建方法 |
-
2019
- 2019-04-30 CN CN201910357220.2A patent/CN110283765A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100178273A1 (en) * | 2007-06-20 | 2010-07-15 | Actogenix Nv Corporation | Methods and compositions for treating mucositis |
| CN107325998A (zh) * | 2017-06-20 | 2017-11-07 | 江西嘉博生物工程有限公司 | 一种表达猪表皮生长因子基因的重组乳酸乳球菌及构建方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ANDREA BEDFORD等: "Epidermal growth factor containing culture supernatant enhances intestine development of early-weaned pigs in vivo: Potential mechanisms involved", 《JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》 * |
| 王定越: "重组猪EGF乳酸乳球菌的构建及其对早期断奶仔猪肠道健康的影响", 《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109207504A (zh) * | 2018-09-26 | 2019-01-15 | 四川大学 | 一种有效免疫ib与nd的唾液乳酸杆菌的制备方法 |
| CN109207504B (zh) * | 2018-09-26 | 2022-03-18 | 四川大学 | 一种有效免疫ib与nd的唾液乳酸杆菌的制备方法 |
| CN111700161A (zh) * | 2020-06-30 | 2020-09-25 | 芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司 | 一种重组猪表皮生长因子的制备及应用 |
| CN112546210A (zh) * | 2020-12-15 | 2021-03-26 | 南京农业大学 | 一种沙门菌灭活疫苗的制备方法及应用 |
| CN116676246A (zh) * | 2023-06-16 | 2023-09-01 | 华中农业大学 | 重组乳酸乳球菌、益生菌制剂、构建方法、cECF表达方法及应用 |
| CN117946953A (zh) * | 2023-06-16 | 2024-04-30 | 华中农业大学 | 重组乳酸乳球菌、益生菌制剂、构建方法、cECF表达方法及应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110283765A (zh) | 具有修复肠道功能的环境友好型猪表皮生长因子重组乳酸乳球菌 | |
| CN105219669B (zh) | 具有抗氧化能力、促进肉鸡生长发育的解淀粉芽胞杆菌tl | |
| CN104593397B (zh) | 一种优化的产肠毒素性大肠杆菌多价抗原基因序列及其在预防断奶仔猪腹泻中的应用 | |
| CN111304119B (zh) | 一种降解伏马毒素的饲用枯草芽孢杆菌及其应用 | |
| CN112300976B (zh) | 一株表达新城疫病毒抗原基因的重组植物乳杆菌及其发酵工艺和应用 | |
| CN102988971B (zh) | 一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服疫苗的制备方法 | |
| Chen et al. | Oral immunization with recombinant Lactobacillus casei displayed AHA1-CK6 and VP2 induces protection against infectious pancreatic necrosis in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) | |
| CN105602865A (zh) | 一株枯草芽孢杆菌、发酵方法、粉剂和应用 | |
| CN106591195A (zh) | 一种适用于水产动物的微生物免疫增强剂及其应用 | |
| CN109266593A (zh) | 基于Ngpiwi蛋白介导的禽多杀性巴氏杆菌基因敲除菌株及其构建方法和应用 | |
| CN104745521B (zh) | 一株鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株及其应用 | |
| CN104774782A (zh) | 鸡源粪肠球菌分离株及其应用 | |
| CN103060250A (zh) | 一种表达猪传染性胃肠炎病毒基因工程菌菌种 | |
| CN107012095A (zh) | 猪结肠微生物组体外模拟培养的发酵参数 | |
| CN111560341A (zh) | 一种泛性型惰性载体大肠杆菌及其潜在应用 | |
| CN103509838B (zh) | 仔猪大肠杆菌k88、k99、987p纤毛抗原的高表达生产工艺及其提取方法 | |
| CN109705223A (zh) | 一种羊口疮病毒重组亚单位疫苗及其生产方法 | |
| CN108251546A (zh) | 一种植物乳杆菌内源性信号肽的预测方法及其应用 | |
| CN111961121B (zh) | 产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白及其制备方法、应用和疫苗 | |
| CN109161501B (zh) | 一种饲用地衣芽孢杆菌及其应用 | |
| CN113584004A (zh) | 一种牛瘤胃微生物纤维素酶eg基因在乳酸菌表达中的应用 | |
| CN100435844C (zh) | 大肠杆菌热不稳定毒素作为鸟类和家禽的佐剂的用途 | |
| CN113151125A (zh) | 一种减毒铜绿假单胞菌的构建方法及应用 | |
| CN106754464B (zh) | 一株蜡样芽孢杆菌及其应用 | |
| CN110041426A (zh) | 一种鸭疫里默氏杆菌阳性血清及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |