CN111700161A - 一种重组猪表皮生长因子的制备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组猪表皮生长因子的制备及应用，涉及基因工程领域，通过原核表达系统表达制备重组猪表皮生长因子。本发明采用基因工程制备的EGF为菌体破碎上清表达，易于纯化，生产周期短，下游的高密度发酵可实现量产，节约成本，蛋白的纯度和活性高，无毒副作用。重组猪表皮生长因子采用直接饲喂的方式能够简化操作过程、减少因注射过失或刺激造成的额外伤害，提高经济效益。以重组猪表皮生长因子蛋白代替传统可抗生素减轻断奶应激，不仅能够减少腹泻率、促进肠道上皮细胞增殖、修复损伤肠道，还避免了抗生素长期使用而产生耐药性以及环境污染。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种重组猪表皮生长因子的制备及应用。
背景技术
在中国饲料添加剂行业发展历程当中，血浆蛋白粉也是一种高蛋白、高能量和高矿物质的优良饲料原料。但是，由于饲用血液制品各生产企业工艺水平和产品质量良莠不齐，并不能确保病原微生物被彻底灭活，因此其带毒风险极高。
药物饲料添加剂将在2020年全部退出，显然，畜牧业减抗/替抗是大势所趋。随着饲料添加剂向绿色、高效、安全、多功能方向发展，采用现代生物技术研制的具有特定生物学活性和功能的新型安全添加剂已成为当前饲料添加剂技术发展的主要趋势。这种技术主流发展趋势由一系列以基因工程、蛋白质工程和代谢工程为核心的现代生物技术新产品所组成。基因工程蛋白制剂以其成本低、周期短、经济效益高的优势，成为当今国际上新型饲料添加剂的研究热点之一。
猪表皮生长因子(pEGF)是猪乳中含量较高的一种生长因子，是新生仔猪获取EGF的主要来源。断奶后，造成了仔猪断奶应激，仔猪肠绒毛萎缩，肠道完整性受损，EGF的中断对尚未发育完善的仔猪胃肠道来说无疑是灾难性的损伤。
有研究表明，断奶仔猪饲料中添加外源EGF，仔猪的肠道发育明显好于未添加EGF的仔猪。研究发现在小肠中EGF受体含量是EGF本身的10倍，这就进一步表明外源性补充EGF能有效地被早期断奶动物胃肠道吸收，从而改善断奶应激对仔猪肠道的损伤修复。EGF特殊的结构使其对热和酸具有较强耐受性，能抵抗胰蛋白酶和胃蛋白酶的消化，幼龄仔猪口服EGF后，在肠道仍保留其生物活性，使其能够作为饲料添加剂应用在断奶仔猪饲料中。但EGF高昂的价格限制了其在饲料工业中的应用。目前国内EGF的外源表达能够真正实现高效高产的实为少数，将其应用于饲料行业的更是罕见。本发明通过大肠杆菌外源重组表达猪EGF，检测到了可溶性表达的rpEGF，蛋白纯度高，表达量稳定，活性可达到7.74×105IU/mg。通过下游的高密度发酵工艺，明显缩短了工艺周期、降低了生产成本。在饲料应用中可实现产业化生产，推动仔猪养殖的健康发展。
传统工艺提取饲料添加剂原料费时费力，利用基因工程制备的新型活性蛋白作为添加剂周期短、成本低、经济效益高；早期仔猪断奶或生长过程中环境变化应激等需要通过大剂量添加抗生素的手段以减少病原菌的入侵，新型活性蛋白作为一种优质、无毒的新型功能性饲料添加剂可替代传统抗生素，生态环保；长期使用抗生素会使病原菌产生耐药性，而新型活性蛋白的长期使用能从根本上解决仔猪肠道损伤问题，且不会产生耐药性；在早期的断奶等应激中，大剂量抗生素的使用具有明显的局限性，新型活性蛋白有望能够有效调节肠道上皮细胞增殖和促进肠道损伤修复的功能性饲料添加剂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题：解决现有仔猪饲料添加剂中存在的诸多问题。
为解决上述技术问题，本发明提供以下的技术方案：
一种重组猪表皮生长因子，重组猪表皮生长因子基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，所述重组猪表皮生长因子由原核表达系统诱导表达。
优选地，所述原核表达系统包括PET-28a质粒载体和BL21/DE3宿主菌。
一种猪饲料添加剂，由上述重组猪表皮生长因子、饲料添加剂、载体及饲料组成。
优选地，由如下重量份的组分制备而成：5.8～8份重组猪表皮生长因子、5～7份硫氧还原蛋白、18～25份甘氨酰谷氨酰胺、4～5.5份金属硫蛋白、20～25份包膜丁酸钠、4.5～5.5份BFGF、5～6份谷胱甘肽、25.7～33份脱脂米糠
本发明获得的有益效果：
1.传统饲料添加剂因工艺水平稂莠不齐带来的潜在微生物传播危险，而新型活性蛋白采用基因工程技术制备，产量高、安全、稳定。
2.与传统的饲料添加剂相比，本发明采用基因工程制备的EGF为菌体破碎上清表达，易于纯化，生产周期短，下游的高密度发酵可实现量产，节约成本。
3.新型活性蛋白的纯度和活性高，无毒副作用。
4.新型活性蛋白采用直接饲喂的方式能够简化操作过程、减少因注射过失或刺激造成的额外伤害，提高经济效益。
5.以新型活性蛋白代替传统可抗生素减轻断奶应激，不仅能够减少腹泻率、促进肠道上皮细胞增殖、修复损伤肠道，还避免了抗生素长期使用而产生耐药性以及环境污染。
附图说明
图1重组猪pET28a-rpEGF表达情况SDS-PAGE检测
泳道M：蛋白Marker(Thermo26610)；泳道1：诱导前；
泳道2～5：分别为挑取的不同菌落诱导表达情况。
图2重组猪pET28a-SUMO-rpEGF诱导表达SDS-PAGE检测
泳道M：蛋白Marker；泳道1：诱导前；
泳道2、3、4：分别为挑取的不同菌落诱导表达情况。
图3重组猪工程菌pET32a-rpEGF诱导表达SDS-PAGE检测
泳道M：蛋白Marker；泳道1：诱导前；
泳道2～7：分别为挑取的不同菌落诱导表达情况。
图4重组猪pET28a-SUMO-rpEGF和pET32a-rpEGF诱导表达SDS-PAGE检测
泳道M：蛋白Marker26610；
泳道1～2：重组猪pET32a-pEGF诱导表达全菌；
泳道3～4：重组猪pET28a-SUMO-rpEGF诱导表达全菌。
图5重组猪pET32a-rpEGF诱导表达SDS-PAGE检测
泳道M：蛋白Marker；泳道1：诱导表达全菌；
泳道2：诱导表达破碎沉淀；泳道3：诱导表达破碎上清。
图6BL21/pET-32a-rpEGFF工程菌原始菌种表达蛋白的WB检测结果
泳道M：蛋白Marker；泳道1：阴性对照；
泳道2、3：BL21/pET-32a-rpEGF工程菌原始菌种表达的蛋白。
具体实施方式
下面通过对实施例的描述，对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，以帮助本领域的技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
实施例1：按如下方法制备新型活性蛋白的制备：
1.1重组猪EGF表达质粒的构建
通过GenBank查询获得重组猪表皮生长因子的相关基因和核苷酸序列SEQ IDNO.1，以大肠杆菌为原核表达系统，构建工程菌，最终分别获得pET32a-rpEGF(C端带终止子)、pET-28a-rpEGF和pET-28a-SUMO-rpEGF表达质粒。
1.2重组猪EGF工程菌的诱导表达
将构建的表达质粒pET28a-rpEGF、pET32a-rpEGF和pET28a-SUMO-rpEGF分别转入BL21/DE3.0制备的感受态细胞中，转化后的菌种分别扩大培养，菌液按1:50～1:100(例如2ml菌种接种到100ml培养基中)接种于含抗性的LB液体培养基中，于37℃220r/min振荡培养至OD600为0.5～0.6时，加入IPTG(使其终浓度为0.5mmol/L)诱导表达约5小时，将诱导表达的菌液取1ml 4℃12000r/min离心2min，用PBS重悬菌体，进行超声破碎，取上清和沉淀利用SDS-PAGE鉴定是否表达以及表达量。BL21/pET28a-rpEGF在8kDa左右位置未出现优势表达条带，构建菌株未表达。BL21/pET32a-rpEGF和BL21/pET28a-SUMO-rpEGF分别在26kDa和20kDa左右出现优势条带，说明构建的工程菌表达目的蛋白结果见下图1，2，3。
将BL21/pET32a-rpEGF和BL21/pET28a-SUMO-rpEGF菌株在同等条件下发酵诱导表达，SDS-PAGE结果显示，表达量前者明显优于后者，结果见图4。
BL21/pET32a-rpEGF选取的不同单菌落菌株进行表达形式的鉴定，结果显示表达的蛋白主要以菌体破碎上清表达为主，如图5所示，在25℃～30℃之间蛋白表达量稳定，生物学活性鉴定结果表明重组猪EGF蛋白的活性可达到7.74×105IU/mg。
1.3重组猪EGF蛋白的鉴定
选择BL21/pET-32a-rpEGF工程菌原始菌种表达的蛋白，与抗EGF单克隆抗体进行Western blot实验，以对其作出特异性鉴定。Western blot结果表明：BL21/pET-32a-rpEGF工程菌原始菌种表达的重组猪表皮生长因子可与抗EGF单克隆抗体发生特异性反应，在26kDa处出现特异性条带，证明工程菌原始菌种表达的蛋白无误(见图6)。
实施例2：新型活性蛋白在饲料添加剂中的应用：
EGF涉及大量离子通道及转运蛋白的调节作用，促进肠道对营养物质的吸收，如调节小肠磷吸收、维持细胞正常功能、促进上皮对谷氨酰胺的吸收。EGF特殊的结构使其对热和酸具有较强耐受性，能抵抗胰蛋白酶和胃蛋白酶的消化，决定了其可长期作用于胃肠道。幼龄仔猪口服EGF后，在肠道仍保留其生物活性，促进胃肠道的生长和出生后成熟。
相关文献表明，pEGF有利于猪早期胚胎发育、提高母猪的窝产仔数、提高仔猪成活率以及促进断奶仔猪生长。其在实际的养猪生产中能够对断奶仔猪的免疫功能、激素合成与分泌、仔猪生产性能均有显著的促进和提升作用，从根本上解决猪快速生长和器官发育滞后的矛盾。目前，利用EGF来减轻断奶应激对早期断奶仔猪肠道结构和功能的不利影响，促进肠道修复，已应用到了实际生产中。与皮下注射的方式相比较，直接饲喂的方式能够简化操作过程、减少因注射过失或刺激造成的额外伤害。
新型活性蛋白在饲料中的配比
脱脂米糠承载能力强，具有很好的稀释和吸附作用，且不影响饲料添加剂的稳定性，在后续饲料加工混匀，是一种常用饲料添加剂载体。以总量100份重量计算饲料添加剂，将新型活性蛋白、饲料添加剂以及载体分别按下表中的比例混合完成各配方。
表1不同配方饲料添加剂的混合比例
将上述各配方中的有效成分与载体脱脂米糠投入混合机中，使之充分混匀即为饲料添加剂成品。将获得的饲料添加剂按照0.1(wt)％的比例添加到饲料中，混合均匀后饲喂仔猪。1.于某猪场选取胎次相近、体重相当的断奶腹泻仔猪48头，公母各半，随机分成6个试验组，每组8个重复，每个重复1头猪(单栏饲喂)，对照组不添加EGF，试验组添加0.1(wt)％不同配比的饲料添加剂，试验周期14天。试验开始时少量多次饲喂，一周后自由采食。试验期间，受试猪的消毒、免疫等程序按照猪场的常规程序进行，其余按照猪场的常规饲养管理执行，每日记录受试猪体重、采食量以及腹泻情况。
本饲料添加剂对仔猪腹泻、肠道上皮细胞增殖和脱落凋亡的影响见表2。从表2的试验结果可以看出，与对照组相比，添加EGF和新型活性蛋白的试验组仔猪随着采食量的提高，仔猪日增重明显增加，说明合适的新型活性蛋白配比能够提高饲料转化率，降低饲养成本。添加EGF的试验组腹泻率均有所下降，说明在抗腹泻方面，EGF的添加剂可一定程度上替代抗生素的使用。试验组空肠上皮细胞的增殖指数得到了不同程度的提高，细胞脱落指数得到不同程度的下降，说明EGF可促进上皮细胞的增殖，保护仔猪肠道结构和功能，使仔猪在离开母乳后能尽快适应新环境，建立自身独立的消化吸收功能。
表2试验组受试猪各项指标检测结果
| 试验1 | 试验2 | 试验3 | 试验4 | 试验5 | 对照组 | |
| 日增重/g | 310.33 | 292.56 | 325.66 | 315.45 | 320.58 | 283.67 |
| 腹泻率/％ | 52.62 | 62.05 | 47.06 | 54.28 | 51.46 | 75.04 |
| 细胞增殖指数 | 22.58 | 21.42 | 26.38 | 23.96 | 20.68 | 17.22 |
| 细胞脱落指数 | 0.26 | 0.25 | 0.22 | 0.24 | 0.24 | 0.37 |
综上所述，传统饲料添加剂因工艺水平稂莠不齐带来的潜在微生物传播危险，而新型活性蛋白采用基因工程技术制备，产量高、安全、稳定。与传统的饲料添加剂相比，本发明采用基因工程制备的EGF为菌体破碎上清表达，易于纯化，生产周期短，下游的高密度发酵可实现量产，节约成本。新型活性蛋白的纯度和活性高，无毒副作用。新型活性蛋白采用直接饲喂的方式能够简化操作过程、减少因注射过失或刺激造成的额外伤害，提高经济效益。以新型活性蛋白代替传统可抗生素减轻断奶应激，不仅能够减少腹泻率、促进肠道上皮细胞增殖、修复损伤肠道，还避免了抗生素长期使用而产生耐药性以及环境污染。
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。
SEQUENCE LISTING
<110> 芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司
安徽九川生物科技有限公司
<120> 一种重组猪表皮生长因子的制备及应用
<130> 123445
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggatccaaca gctatagcga gtgcccgccg agccatgacg gttattgcct gcacggtggc 60
gtgtgcatgt acatcgaagc ggttgatagc tatgcgtgca actgcgtgtt cggttacgtt 120
ggcgagcgtt gccagcaccg tgacctgaag tggtgggaac tgcgttaact cgag 174
<210> 2
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Asn Ser Tyr Ser Glu Cys Pro Pro Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Gly Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Val Asp Ser Tyr Ala Cys Asn
20 25 30
Cys Val Phe Gly Tyr Val Gly Glu Arg Cys Gln His Arg Asp Leu Lys
35 40 45
Trp Trp Glu Leu Arg
50
Claims (5)
1.一种重组猪表皮生长因子，其特征在于，重组猪表皮生长因子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1中所述的一种重组猪表皮生长因子，其特征在于：所述重组猪表皮生长因子由原核表达系统诱导表达。
3.根据权利要求2中所述的一种重组猪表皮生长因子，其特征在于：所述原核表达系统包括PET-32a质粒载体和BL21/DE3宿主菌。
4.一种猪饲料添加剂，其特征在于：由权利要求1中所述重组猪表皮生长因子、饲料添加剂、载体及饲料组成。
5.根据权利要求4中所述一种猪饲料添加剂，其特征在于：由如下重量份的组分制备而成：5.8～8份重组猪表皮生长因子、5～7份硫氧还原蛋白、18～25份甘氨酰谷氨酰胺、4～5.5份金属硫蛋白、20～25份包膜丁酸钠、4.5～5.5份BFGF、5～6份谷胱甘肽、25.7～33份脱脂米糠。
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2020
- 2020-06-30 CN CN202010611379.5A patent/CN111700161A/zh active Pending
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