CN105646718B

CN105646718B - 一种m1型巨噬细胞激活肽与il-2融合蛋白、融合基因、表达载体及其构建方法

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Publication number: CN105646718B
Application number: CN201610096553.0A
Authority: CN
Inventors: 万小平
Original assignee: Chengdu Hubiaoxing Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Chengdu Hubiaoxing Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2016-02-22
Filing date: 2016-02-22
Publication date: 2019-01-22
Anticipated expiration: 2036-02-22
Also published as: CN105646718A

Abstract

本发明提供了一种M1型巨噬细胞激活肽与IL‑2融合蛋白、融合基因、表达载体及其构建方法，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1。采用多重表达M1型巨噬细胞激活肽与IL‑2基因拼接共表达，组成激活免疫应答的关键因子。融合蛋白在肠道黏膜和肠系膜淋巴结两个位置可同时行使功能并发挥作用，对PRRSV以及PCV2具有显著治疗调节作用，通过刺激M1型巨噬细胞增殖活化，下调M2型巨噬细胞数量，有效恢复免疫抑制。

Description

一种M1型巨噬细胞激活肽与IL-2融合蛋白、融合基因、表达载体及其构建方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种M1型巨噬细胞激活肽与IL-2融合蛋白、融合基因、表达载体及其构建方法。

背景技术

动物耐药菌引起的腹泻，沙门、大肠杆菌、链球菌、蓝耳病(PRRSV)、圆环病毒(PCV2)、猪瘟(CSFV)，禽腹泻、球虫病等各种细菌、病毒性疾病，以及动物寄生虫，真菌感染等长期以来是畜牧、禽蛋养殖中瓶颈限制问题，严重阻碍畜牧业的发展。目前畜牧养殖中，主要以抗生素添加解决临床问题，随着药物的滥用，严重破坏了动物消化道的微生态平衡，长期使用后在动物体内残留、并富集，直接影响了畜产品的品质和间接损害人类的健康，亟待需要安全、新型抗生素替代品来控制疾病和促进动物健康生长。

目前，可用于饲料添加剂领域工业化生产的菌种很多，我国农业部(2008)公布的饲用微生物添加剂有15种。其中芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌是应用最多的微生物添加剂菌种。芽孢杆菌由于稳定性好、抗逆性强、复活率高，通过与病原菌竞争营养物质，抑制病原菌；提高机体的免疫机能，并提供营养物质等作用，调节消化道健康，增强动物体的免疫功能，达到促进目标动物的生长、提高饲料的转化率的目的。

白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)是一种重要的免疫调节因子，有以下作用：(1)活化T细胞，促进细胞因子产生；(2)刺激NK细胞增殖，增强NK杀伤活性及产生细胞因子，诱导LAK细胞产生；(3)促进B细胞增殖和分泌抗体；(4)激活巨噬细胞。

巨噬细胞的极化分型是按照其功能划分的。以分泌促炎因子为主，发挥促炎功能的巨噬细胞称为M1型巨噬细胞。常见的M1型巨噬细胞的表面标志有：HLA-DR、CD197等。M1型巨噬细胞在IFN-γ、LPS和TNF-α等因子作用下，发挥宿主防御功能，分泌ROS、RNS、TNF-α、IL-1、IL-12、IL-23和其他趋化因子，主要发挥针对微生物的炎症反应，发挥宿主免疫功能，也会导致机体正常组织的炎症损伤。常见的M2型巨噬细胞的表面标志有：CD209、CD206和CD301等。巨噬细胞在IL-4、IL-13、IL-10和TGF-β等作用下，向M2型极化，可分泌TGF-β、VEGF、EGF等因子，尤其在炎症反应后期发挥抗炎作用,促进创伤修复和纤维变性。因此，维持机体M1/M2平衡对于免疫应答和组织损伤修复有重要意义。

巨噬细胞激活肽调节M2型巨噬细胞向M1型转变，激活固有免疫，提高吞噬活性，加速抗原提呈，促进获得性免疫应答，对维持M1/M2功能性平衡有着重要意义。

文献“IL2-GMCSF融合蛋白高效表达条件的初步研究”(《解放军广州医高专利学报》，1996，19(2))和“白细胞介素-2和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的克隆与表达”(北京农学院硕士论文，2008)均公开了一种IL-2和巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF的融合基因，以大肠杆菌为宿主菌。

上述两篇文献的融合基因在表达后无法在肠道自动分割为单独的活性蛋白。肠道黏膜层富集有大量的粒细胞与巨噬细胞，而肠系膜淋巴结富集有大量的免疫淋巴细胞，如NKcell、Tcell、Bcell、树突细胞等。文献中的融合蛋白在肠道黏膜和肠系膜淋巴结两个位置无法同时行使功能并发挥作用，对疾病的治疗效果不好。

发明内容

M1型巨噬细胞激活肽不同于GMCSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)，M1型巨噬细胞激活肽来源于中性粒细胞分泌的cathelicidin家族蛋白的片段14个氨基酸，能激活巨噬细胞的吞噬能力，调节M1型巨噬细胞增殖，核心作用是抗菌肽的功能与免疫细胞活性调节。

本发明提供了一种M1型巨噬细胞激活肽与IL-2融合蛋白、融合基因、表达载体及其构建方法。采用多重表达M1型巨噬细胞激活肽(macrophage activate peptide，MAP):KSRIVPAIPVSLL-NH2，与IL-2基因拼接共表达，组成激活免疫应答的关键因子。

为了实现上述发明目的，采用如下技术方案：

一种M1型巨噬细胞激活肽与IL-2融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1。

本发明的融合蛋白通过GSGDDDDK氨基酸序列链接M1型巨噬细胞激活肽与IL-2，GSGDDDDK在肠道里被胰蛋白酶激酶切割成独立的活性结构域，利用GSG氨基酸柔性序列保护了M1型巨噬细胞激活肽和IL-2的独立折叠，DDDDK氨基酸序列保障该融合蛋白能够有效的被小肠胰蛋白酶激酶切割识别。有效地保障了M1型巨噬细胞激活肽在肠黏膜层激活粒细胞与巨噬细胞，同时，IL-2能够通过M细胞调节肠系膜淋巴结(P氏小结)内部的淋巴细胞。

本发明的融合蛋白对PRRSV(感染巨噬细胞)以及PCV2(感染DC细胞)具有显著治疗调节作用。复合物通过刺激M1型巨噬细胞增殖活化，下调M2型巨噬细胞数量，有效恢复免疫抑制。M1型巨噬细胞上调IL-1(协同刺激APC和T细胞活化，促进B细胞增殖和分泌抗体)、IL-12(促进DC细胞活性，辅助抗原提呈)、IL-23(促进免疫记忆细胞活性)的表达，能够显著增强巨噬细胞吞噬能力，增强其胞内溶酶体活性，促进抗原提呈，进一步促进获得性免疫应答，产生中合性抗体。

本发明融合蛋白中的M1型巨噬细胞激活肽来源于中性粒细胞分泌的cathelicidin家族蛋白的片段Innate defense regulator peptide-1(KSRIVPAIPVSLL)，通过对其进行设计改造后为14个氨基酸：KSRIVPAIPPVSLL。改造后的氨基酸片断增加了碱性氨基酸(P、脯氨酸)含量，提高短肽的正电位，有利于短肽与微生物细胞膜的结合，促进短肽对细菌和寄生虫细胞膜的穿孔效应，同时保障维持α-螺旋的稳定三嵌段(亲水-疏水-亲水)结构，从而达到提高抗病原微生物的活性和细胞调节活性的目的。

一种编码所述M1型巨噬细胞激活肽与IL-2融合蛋白的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2。

本发明的IL-2基因参照NCBI-genebank数据库的基因序列(GenBank:JN851821.1)。该融合基因能实现融合基因的高效表达，带有自动分割位点GGATCCGGAGATGACGATGACAAG，通过自动分割位点的碱基片断连接M1型巨噬细胞和IL-2的基因序列，表达后的融合蛋白在肠道里被胰蛋白酶激酶切割成独立的活性结构域。

本发明还提供了包含所述编码融合基因的表达载体，优选地为分泌性表达载体。分泌性表达载体在MCS位点前面有分泌信号肽序列；分泌信号肽能高效的将重组蛋白分泌到胞外。其他载体不具备分泌等功能。

进一步优选地，所述的分泌性表达载体为枯草芽孢杆菌表达载体PHT43或者pNZ8148。pHT43允许在细胞质中高水平表达重组蛋白，pHT43载体引导重组蛋白到培养基。这个载体基于强σA-依赖性启动子的枯草杆菌groE操纵子通过添加lac操纵子改造成为一种高效可控的(IPTG诱导的)启动子。

本发明还提供了包含所述表达载体的融合基因工程菌，优选为枯草芽孢杆菌或者乳酸菌。将融合表达基因与可分泌载体共同构建的工程菌具有更好的免疫调节潜能。

进一步优选地，所述枯草芽孢杆菌的菌株为BS.168。

本发明的融合基因对家畜的细菌性腹泻具有高效治疗效用，对慢性病毒性感染疾病有快速缓解作用，促进肠道健康，提高料肉比10％；对家禽的产气荚膜梭菌有抑制作用，治疗腹泻，抑制球虫病，促进产蛋光滑，促进肠道健康，提高料肉比和产蛋率。

本发明M1型巨噬细胞激活肽与IL-2融合基因表达载体的构建方法，具体步骤如下：

1)PCR扩增融合基因，得到融合基因扩增片段；

2)采用双酶切法，双酶切载体与扩增后的片段，采用T4连接酶将双酶切后的产物连接到质粒；

3)将连接产物转化大肠杆菌获得阳性克隆子，提取质粒，测序验证后，得到所述融合基因的表达载体。

优选地，所述的载体为pHT43，扩增引物如下：

上游引物：AAAACATCAGCCGTAGGA-AAGTCTGTATTGTCCCTG；

下游引物：TCCGGCTGCCCCGGG-AGTCAGTGTTGAGTAG。

上述引物与目的基因互补，提供限制性内切酶的保护信号；且与克隆载体具有15bp-18bp同源序列，可以更方便的与载体链接。

进一步优选地，采用SamI，BamHI双酶切载体pHT43。

由于pHT43载体上酶切位点稀少，SamI，BamHI是pHT43上多克隆位点相距最远的两个位点，双酶切的效率高，不受保护碱基的影响。选择其他位点会由于距离较近而达不到双酶切的效果。

附图说明

图1为PCR片段电泳图片。

通道1：阴性对照，通道2：目的片段，通道3：marker。

图2为重组质粒及酶切电泳验证图片。

通道1：空载质粒双酶切，通道2：重组质粒单酶切；通道3：重组质粒双酶切；通道4：重组质粒；通道5：1Kbmarker。

图3为猪淋巴细胞经刺激后的细胞增殖对比图。

a：淋巴细胞对照组图片，从0小时到72小时培养照片，放大200倍；

b：淋巴细胞经刺激后细胞显著增殖图片，0-72小时，放大200倍。

图4为猪淋巴细胞经刺激后的细胞增殖变化趋势图。

图5为母猪实验前后病毒数量的相对变化图。

图6为保育猪血液中病毒数量的相对变化图。

图7为仔猪血液中IL-2基因表达的相对变化图。

图8为仔猪血液中IL-4基因表达的相对变化图。

图9为仔猪血液中IL-10基因表达的相对变化图。

图10为仔猪血液中IL-6基因表达的相对变化图。

图11为仔猪血液中IFN-r基因表达的相对变化图。

图12为仔猪血液中CD4+淋巴细胞变化图。

图13为仔猪血液中CD8+淋巴细胞变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的实质性内容作进一步详细的描述。

实施例1

本实施例为M1型巨噬细胞激活肽与IL-2融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO:1，通过M1型巨噬细胞激活肽与IL-2融合基因的表达得到。

实施例2

本实施例为M1型巨噬细胞激活肽与IL-2融合基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2。

当将真核基因克隆在原核生物中表达时，需将真核生物偏爱的密码子改为原核生物(枯草芽孢杆菌、乳酸菌)偏爱的密码子，才能实现高效表达。本发明根据相应细胞的密码子偏好性对基因序列进行密码子优化，设计得到核苷酸序列SEQ ID NO:2，再根据该基因序列，人工合成基因。

本实施例的融合基因以脱氧核糖核苷酸为底物，在DNA合成仪(Dr.Oligo-192系列)上合成目标序列的核苷酸片段。

实施例3

1)PCR扩增融合基因，得融合基因扩增片段；

2)双酶切载体pHT43与扩增后的片段，采用T4连接酶(购自Fermentals)将双酶切后的产物连接到pHT43质粒(购自MoBi TEC)；

载体pHT43购自MoBi TEC中国四川代理商(传世科为生物科技有限公司)。

PCR扩增条件：

94℃1min

(94℃10s，52℃10s，68℃10s)5cycles

(94℃10s，68℃15s)30cycles

68℃1min

酶切体系：

SamI，BamHI双酶切Qbuffer(购自Fermentals)

1μL SamI，1μL BamHI，10μL 2X Q buffer，8μL ddH2O

16℃1小时。

实施例4

本发明融合基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：

1)PCR扩增融合基因，得融合基因扩增片段；

2)双酶切载体pHT43与扩增后的片段，采用T4连接酶将双酶切后的产物连接到pHT43质粒(购自MoBi TEC)；

3)将连接产物转化大肠杆菌获得阳性克隆子，提取质粒，测序验证后，电转枯草芽孢杆菌BS.168。

菌种BS.168购自四川省工业微生物菌种保藏管理中心西南菌种站(SouthwestCenter Of Industrial Culture Collection In China，SICC)即四川省工业微生物菌种保藏管理中心(Sichuan Center Of Industrial Culture Collection，SICC)。

实施例5

本发明融合基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：

1)PCR扩增融合基因，得融合基因扩增片段；

2)双酶切载体pNZ8148与扩增后的片段，采用T4连接酶将双酶切后的产物连接到质粒pNZ8148(购自MoBiTEC)；

3)将连接产物转化大肠杆菌获得阳性克隆子，提取质粒，测序验证后，电转乳酸菌(德氏保加利亚乳杆菌)。

实施例6

本实施例与实施例3基本相同，在此基础上：

所述步骤1)的扩增引物如下：

上游引物：AAAACATCAGCCGTAGGA-AAGTCTGTATTGTCCCTG；

下游引物：TCCGGCTGCCCCGGG-AGTCAGTGTTGAGTAG。

实施例7

本实施例与实施例3基本相同，在此基础上：

所述步骤1)的扩增引物如下：

上游引物：AAAACATCAGCCGTAGGA-AAGTCTGTATTGTCCCTG；

下游引物：TCCGGCTGCCCCGGG-AGTCAGTGTTGAGTAG。

所述的步骤2)，采用SamI，BamHI双酶切载体pHT43。

实施例8

本实施例采用双酶切法SamI，BamHI双酶切载体pHT43与片段，通过T4连接酶链接后转化大肠杆菌获得阳性克隆子，提取质粒测序验证后，电转枯草芽孢杆菌BS.168。

实验试剂：

GM:LB+0.5M山梨醇

ETM:0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％甘油

RM：LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇

电转仪：Bio-Rad的gene-pulser

具体方法如下：

1)新鲜平板挑单菌落(小一点为好)接种于5mlLB培养基中，过夜培养.。

2)测量摇管内OD，控制好接种量，使接种完毕后培养基的OD在0.19-0.2之间。培养基为50mlGM。37℃，200rpm培养至OD600＝1.0(大约3-4小时)左右。

3)取全部菌液冰水浴10min，然后5000rpm，8min，4℃离心收集菌体。

4)用40ml预冷的电转缓冲液ETM洗涤菌体，5000rpm，8min，4℃离心去上清，如此漂洗3次。

5)将洗涤后的菌体重悬于等500μL的ETM中，每管分装60μL。

6)将60μL感受态细胞中加入1-6μL质粒，冰浴孵育5min，加入预冷的电转杯(1mm)中，电击一次。电转仪设置：2.0kv,25μF200Ω，1mm,电击1次(持续时间4.5ms-5ms之间)。

7)电击完毕立即加入1ml复苏培养基RM，37℃，200rpm，复苏3h后，涂板。37℃，过夜培养。

体外细胞实验

猪全血淋巴细胞的制备

无菌条件下采取猪前腔静脉外周血5ml，EDTA-2K抗凝，按照淋巴细胞分离液说明书分离藏猪淋巴细胞(操作同前)。将分离到的外周血白细胞用完1640培养液稀释至细胞终浓度2×106/ml，分至直径为10cm的细胞培养皿中，每皿10ml,最后再加入终浓度为105的CoA(刀豆球蛋白)进行刺激，5％CO2、37℃细胞培养箱中培养24h。

淋巴细胞培养及处理：

1)24h时，将培养皿中的淋巴白细胞收集，2500rpm离心5min收集细胞。

2)用PBS或1640完全培养基清洗细胞2次，每次2500rpm离心5min。

3)用含20mg/mlα-MM的1640培养基洗细胞1次，1500rpm离心15min。

4)用含20mg/mlα-MM的1640培养基调整细胞至约6x106/ml。

按照排版向96孔板实验孔加入本发明的50μL乳酸菌培养上清液，空白对照，每个样品设3个重复孔，置于细胞培养箱培养5％CO2、37℃48h。

5)48h时，取出96孔板，每孔加入CCK810μL继续细胞培养箱培养5％CO2、37℃2h。

6)取出96孔板，用Bio-Reader3550检测每孔OD450(参照-OD630)。

体外细胞实验结果(图3和图4)说明：本发明的融合蛋白可调节巨噬细胞活性，刺激PMBC，猪外周血总白细胞刺激实验，提高活性与促分化作用显著，形成了显著的淋巴细胞集落。

动物实验

猪场实验：

实验组：口服本发明的枯草芽孢杆菌(0.2％)100天；

对照组：常规日粮与抗生素添加组100天。

1.生长繁殖情况

(1).母猪口服0.2％枯草芽孢杆菌100天PCV2圆环病毒带毒率及病毒载量检测结果显示带毒率下降38.3％(图5)：

(2).保育猪口服0.2％重组枯草芽孢杆菌40天圆环病毒带毒率及病毒载量检测结果显示保育猪体内圆环病毒病毒载量明显下降(图6)：

2.饲喂猪免疫水平变化

2.1细胞因子的变化

根据GenBank中报道的猪IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10基因的cDNA序列设计的引物,以提取的不同时期小鼠血液总RNA反转录合成的cDNA为模板,将免疫前基因表达量设为1进行定量分析。标准曲线的相关系数在0.99以上,PCR扩增效率均在95％-105％之间。结果表明样品之间有较好的线性关系。

总体显示各组免疫相关基因表达水平上升，IL-10下降显著，从下列图中免疫相关基因表达水平的定量分析结果可以看出,相对于0周，上述4种基因在免疫后2周-4周间，其表达量均明显上升(P<0.05)，说明重组枯草芽孢杆菌能有效激发此4种基因的表达。其中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6表达量均显著增高(P<0.05)，而IL-10在2周先升高后显著降低(P<0.05)。这些证明重组巨噬细胞激活肽与白细胞介素2融合基因的枯草芽孢杆菌能显著促进重要的先天免疫和获得性免疫调节基因的转录表达水平的升高，增强动物相应的免疫防御机能；这对动物的抗感染抗病力具有十分重要的提升作用。

2.2CD4/CD8淋巴细胞变化，流式细胞仪计数

图12和图13显示实验组的CD4+与CD8+值均上升，实验前普遍比例低下，饲喂2周后CD4+、CD8+数量和比值不断上升，显示小鼠向Th2型免疫发展，体液免疫得到加强。

主要功效：

(1).种猪：降低种猪蓝耳病圆环病毒病等病毒感染阳性率及带毒猪血清中病毒的载量，增加活产健仔数，减少母猪围产期发病，减少母猪便秘。

(2).乳仔猪：控制仔猪断奶腹泻，减少病弱仔猪，提高断奶仔猪猪增重。

(3).肥猪：提高生长猪采食量，提高日增重，降低料肉比，改善均匀度，无耐药，无残留。

禽(鸡)动物实验：

重组枯草芽孢杆菌在常德瑞丰鸡场应用试验

试验目的：观察饲喂产品对产蛋鸡肠道的影响

试验方法：针对同一鸡舍的产蛋鸡进行拌料饲喂，分为试验组和对照组，试验组为3000羽，对照组为2000羽，试验组添加本发明的重组枯草芽孢杆菌，添加量为每吨饲料添加重组枯草芽孢杆菌100克，按正常日粮和饲喂程序，对照组不添加重组枯草芽孢杆菌，按同一正常日粮和饲喂程序.每天观察二次，时间为早晚各一次，全程基础日粮和其它饲养管理、饲养环境、饲养员、免疫保健实验组与对照组相同。

试验材料：选择400日龄同一鸡舍的产蛋鸡，共计5000羽试验时间为30天

试验结果：

本次试验结果如下面表格

组别	粪便形状	产蛋率
			试验组	粪便成型	89％
对照组	稀便	85％

试验结果显示：在试验的开始时都存在一样的稀便，试验组在第六天粪便就开始好转，在试验结束时粪便基本上没有稀便，而对照组在试验结束时反而更严重了。试验组和对照组在试验前产蛋率都在86％，在试验第10天直到结束时采食量上也发生了变化，试验组在第10天时采食量就在下降，试验前的为123克每天，试验结束时为118克每天。对照组不但没有下降，反而有所上升，从试验前的123克每天，试验结束时为124克每天。

本次试验证实；重组枯草芽孢杆菌在鸡场应用能给鸡场带来极好的综合效益，重组枯草芽孢杆菌鸡场应用具有广阔发展前景，也为其它鸡场使用提供了强有力的依据。

主要功效：

显著提高禽免疫力，解除禽免疫抑制，靶向抑制沙门氏菌大肠杆菌等有害菌的增值数量,创造有益菌生长环境,使有益菌自行增多而后达到稳态。

(1)雏禽：能减少沙门氏杆菌、大肠杆菌及产气荚膜梭菌等病原性微生物在消化道内的定植，降低腹泻率，提高日增重及饲料消化率，降低料肉比。

(2)蛋禽：可提高产蛋率，延长产蛋高峰期，提高蛋壳质量及颜色，大幅度降低破蛋率，减少饲料便及粪便含水率。

(3)种禽：降低沙门氏杆菌感染率，提高蛋壳质量及孵化率，减少弱雏。

Claims

1.一种M1型巨噬细胞激活肽与IL-2融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种M1型巨噬细胞激活肽与IL-2融合基因，其特征在于：所述的融合基因为编码权利要求1中融合蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的一种M1型巨噬细胞激活肽与IL-2融合基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.一种融合基因表达载体，其特征在于：所述的表达载体包含权利要求2的基因。

5.根据权利要求4所述的融合基因表达载体，其特征在于：所述的表达载体为分泌性表达载体。

6.根据权利要求5所述的融合基因表达载体，其特征在于：所述的分泌性表达载体为PHT43或者pNZ8148。

7.一种融合基因工程菌，其特征在于：由权利要求4的融合基因表达载体转入宿主制备而得。

8.根据权利要求7所述的一种融合基因工程菌，其特征在于：所述的融合基因工程菌为枯草芽孢杆菌或者乳酸菌。

9.根据权利要求4所述融合基因表达载体的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：

1)PCR扩增融合基因，得到融合基因扩增片段；

2)采用双酶切法，双酶切载体与扩增后的片段，并用T4连接酶将双酶切后的产物连接到质粒；

10.根据权利要求9所述融合基因表达载体的构建方法，其特征在于：所述的载体为PHT43，扩增引物如下：

上游引物：AAAACATCAGCCGTAGGA-AAGTCTGTATTGTCCCTG；

下游引物：TCCGGCTGCCCCGGG-AGTCAGTGTTGAGTAG。