CN104195075A - 一种屎肠球菌ef08及包含它的饲料添加物和饲料 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种屎肠球菌EF08及包含它的饲料添加物和饲料。屎肠球菌EF08，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号是：CGMCC No.5549。本申请之饲料添加物凭借平衡肠道环境之菌相平衡，可降低肠道内之有害菌过度消耗饲料，进而提升经济动物之饲料转换率，使经济动物所摄取之饲料可以有效转换为具有经济价值之初级畜产品，进而能够达到提升经济动物之经济价值的功效。

Description

一种屎肠球菌EF08及包含它的饲料添加物和饲料

技术领域

本申请涉及一种屎肠球菌EF08及包含它的饲料添加物和饲料。 

背景技术

陆生经济动物系包含家畜及家禽，如猪、牛、羊、鹿、鸡、鸭、鹅等，该陆生经济动物系可以生产肉、乳、蛋、皮毛等初级畜产品，并且经由烹饪加工，而成为食品或商品，衍生不同之经济价值。 

现有技术中，在上述陆生经济动物之饲育过程中，常会于饲料中同时混参低剂量抗生素，因为低剂量抗生素可以杀死消化道部分微生物，降低消化道内微生物数量，从而减少微生物对饲料的利用损耗，进而可以使陆生经济动物可以产出较多初级畜产品，提升陆生经济动物的经济价值。 

但抗生素之大量及不当使用，可能会导致抗生素残留于陆生经济动物体内，而影响消费者之健康，还可能会造成环境或陆生经济动物消化道中出现抗药性菌株，因此，欧盟已于2006年全面禁止此类低剂量抗生素之应用。 

因此，确实有需要提供一种饲料添加物，以取代少量抗生素之混参，进而改善混参少量抗生素所导致的各种问题。 

发明内容

本申请要解决的技术问题在于提供一种屎肠球菌EF08及包含它的饲料添加物和饲料。 

为解决上述技术问题，本申请的技术方案是： 

一种屎肠球菌EF08，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号是：CGMCC No.5549。 

屎肠球菌EF08的保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期是2011年12月8日。 

申请人经验经发现：上述屎肠球菌EF08可以改善陆生经济动物消化道菌相，以提升陆生经济动物之免疫系统状态。屎肠球菌EF08的分类命名为Enterococcus faecium。 

上述屎肠球菌EF08，的16S rDNA序列为： 

一种饲料添加物，包含上述屎肠球菌EF08。 

上述饲料添加物可以提升经济动物获取营养的能力，动物使体内营养有效转化为初级畜产品产出所需，进而提升陆生经济动物之经济价值者。 

每克饲料添加物优选包含10⁸～10¹²CFU之上述屎肠球菌EF08。这样可进一步提升经济动物的免疫及抗病能力。进一步优选，每克饲料添加物包含10¹⁰CFU的屎肠球菌EF08。 

上述饲料添加物，还包含由植物乳杆菌LP28与嗜酸乳杆菌LASW所组成之群 组，植物乳杆菌LP28寄存于中国普通微生物保藏管理中心，其寄存编号为CGMCC No.3346；嗜酸乳杆菌LASW寄存于中国典型型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M204083。这样可进一步提高饲料转换率。 

上述饲料添加物，优选，每克饲料添加物系包含10⁸～10¹²CFU的植物乳杆菌LP28和10⁸～10¹¹CFU的嗜酸乳杆菌LASW,其中，植物乳杆菌与嗜酸乳杆菌LASW的用量比为(1:1)-(10:1)。这样可更进一步提高饲料转换率。进一步优选，每克饲料添加物系包含10¹⁰CFU的植物乳杆菌LP28和10⁹CFU的嗜酸乳杆菌LASW。 

一种包含上述饲料添加物的饲料，优选，每克饲料包含10⁴～10⁸CFU的屎肠球菌EF08。这样可更进一步提升动物免疫及抗病能力。进一步优选每克饲料包含10⁶CFU的屎肠球菌EF08。 

上述屎肠球菌EF08的用途，系用以促进IL-10、TNF-α、IL-12p40和IFN-γ细胞激素的分泌，抑制IL-4之分泌。 

上述屎肠球菌EF08的用途，系用以抑制有害菌之生长，优选抑制大肠杆菌和肠道沙门氏菌之生长。 

上述饲料优选为陆生经济动物所用饲料。 

申请人经研究发现：本申请之屎肠球菌EF08系能够耐受胃酸及胆盐，完整通过胃部，长时间存活于肠道之中，并可以吸附于肠道上皮细胞，同时分泌并释放乳酸盐，降低肠道环境pH值，并藉由其良好抑菌效力，以抑制肠道之有害菌之生长，以促使肠道环境达到菌相平衡，且能促进IL-10、TNF-α、IL-12p40及IFN-γ等细胞激素的分泌，进而达到提升经济动物免疫及抗病能力之功效，因此，该屎肠球菌EF08系可以单独或混合其他成份，以形成一饲料添加物，混参于陆生经济动物之饲料中，以供给陆生经济动物，从而有效提升该陆生经济动物之免疫及抗病能力。 

本申请饲料添加物可以为药剂或其它等各种形式。 

本申请未特别说明的技术均可参照现有技术。 

本申请之饲料添加物凭借平衡肠道环境之菌相平衡，可降低肠道内之有害菌过度消耗饲料，进而提升经济动物之饲料转换率，使经济动物所摄取之饲料可以有效转换为具有经济价值之初级畜产品，进而能够达到提升经济动物之经济价值的功效，同时有效提升经济动物之免疫及抗病能力。 

附图说明

图1系本申请屎肠球菌EF08之耐酸性试验测试结果。 

图2系本申请屎肠球菌EF08之耐胆盐试验测试结果。 

图3系本申请屎肠球菌EF08之抑菌效力测试结果。 

图4a系本申请屎肠球菌EF08之促进IL-10分泌活性。 

图4b系本申请屎肠球菌EF08之促进TNF-α分泌活性。 

图4c系本申请屎肠球菌EF08之促进IL-12p40分泌活性。 

图4d系本申请屎肠球菌EF08之促进IFN-γ分泌活性。 

图5系以混参本申请饲料添加物之市售饲料喂饲离乳仔猪，对离乳仔猪粪便中之氨含量影响结果。 

图6系以混参本申请饲料添加物之市售饲料喂饲离乳仔猪，对离乳仔猪粪便中之pH值影响结果。 

图7a系以混参本申请饲料添加物之市售饲料喂饲离乳仔猪，对离乳仔猪粪便中之乳酸菌菌群影响结果。 

图7b系以混参本申请饲料添加物之市售饲料喂饲离乳仔猪，对离乳仔猪粪便中之大肠杆菌菌群影响结果。 

图7c系以混参本申请饲料添加物之市售饲料喂饲离乳仔猪，对离乳仔猪粪便中之菌相比例影响结果。 

图8系以混参本申请饲料添加物之市售饲料喂饲离乳仔猪，对离乳仔猪体内免疫球蛋白A影响结果。 

图9a系以混参本申请饲料添加物之市售饲料喂饲怀孕及哺乳母猪，对产出之仔猪粪便中的乳酸菌菌群影响结果。 

图9b系以混参本申请饲料添加物之市售饲料喂饲怀孕及哺乳母猪，对产出之仔猪粪便中的大肠杆菌菌群影响结果。 

图9c系以混参本申请饲料添加物之市售饲料喂饲怀孕及哺乳母猪，对产出之仔猪粪便中的菌相比例影响结果。 

图10系以混参本申请饲料添加物之市售饲料喂饲怀孕及哺乳母猪，对产出之仔猪体内免疫球蛋白A影响结果。 

图11a系以混参本申请饲料添加物之市售饲料喂饲蛋鸡，对产蛋前期蛋鸡之产蛋率影响结果。 

图11b系以混参本申请饲料添加物之市售饲料喂饲蛋鸡，对产蛋前期蛋鸡之平均日产蛋量影响结果。 

图12a系以混参本申请饲料添加物之市售饲料喂饲蛋鸡，对产蛋高峰期蛋鸡之产蛋率影响结果。 

图12b系以混参本申请饲料添加物之市售饲料喂饲蛋鸡，对产蛋高峰期蛋鸡之平均日产蛋量影响结果。 

图13a系以混参本申请饲料添加物之市售饲料喂饲蛋鸡，对产蛋下降期蛋鸡之产蛋率影响结果。 

图13b系以混参本申请饲料添加物之市售饲料喂饲蛋鸡，对产蛋下降期蛋鸡之平均日产蛋量影响结果。 

图14系以混参本申请饲料添加物之市售饲料喂饲蛋鸡，对蛋鸡之ND抗体衰退程度影响结果。 

具体实施方式

为让本申请之上述及其他目的、特征及优点能更明显易懂，下文特举本申请之较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下： 

本申请之屎肠球菌EF08(Enterococcus faecium)，系自健康成人粪便中选殖获得；该屎肠球菌EF08系具有降低肠道pH值、改善肠道菌相及促进周边血液细胞分泌多种细胞激素之能力。 

本申请之屎肠球菌EF08系经由顺序相接的以下各步骤处理而获得，A、培养步骤；B、鉴定步骤；C、保存步骤，各步骤具体如下： 

A、培养步骤：该培养步骤系分离健康成人粪便所含有之乳酸菌进行培养； 

具体为取样自一健康成人粪便，将所取样置于一培养液进行增殖培养(enrichment culture)，待适当培养时间后将该培养液进行序列稀释，另接种至一培养基以挑选可生长之菌株； 

上述增殖培养具体系将所取样以1:50之体积比例接种于一MRS液态培养基(配方系如表1所记载)，以37℃培养20小时而获得一增殖培养菌液，再以序列稀释该增殖培养菌液，将稀释后之增殖培养菌液以涂抹法接种于MRS固态培养基(系于上述MRS液态培养基中另添加质量用量为MRS液态培养基质量的1.5％的琼脂)，挑选可生长之菌株；上述1:5指取样体积：MRS液态培养基体积＝1:50； 

表1、MRS液态培养基配方(1L) 

配方成分	含量(g)
		蛋白胨(Peptone)	10
牛肉抽出物(Beef Extract)	10
		酵母菌萃取物(Yeast Extract)	5
葡萄糖(Dextrose)	20
		柠檬酸铵(Ammonium Citrate)	5
硫酸镁(MgSO4)	0.1
		硫酸锰(MnSO4)	0.05
磷酸氢二钾(K2HPO4)	2
		醋酸钠(Sodium Acetate)	5
吐温80(Tween80)	1
			以水将体积补至1L

B、鉴定步骤：该鉴定步骤系依照步骤A所得乳酸菌之物理型态、生理特性或分子特征等判断其菌种分类； 

本实施例将该乳酸菌进行革兰氏染色、触酶反应及16S rDNA之分子鉴定，由该乳酸菌之染色图(结果为革兰氏阳性菌)、16S rDNA部分序列(如SEQ ID No:1所示)与美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology；简称NCBI)之序列比对数据库(BLAST)所得相似度达100％，确定本申请之乳酸菌系为一屎肠球菌(Enterococcus faecium)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号是：CGMCC No.5549，命名为屎肠球菌EF08； 

C、保存步骤：该保存步骤系使该乳酸菌可以稳定于低温环境下长久存放，以便后续使用； 

将步骤A所得之乳酸菌接种至固态MRS培养基(同步骤A中的固态MRS培养基)，以37℃培养48小时后挑选单一菌落转殖至MRS液态培养基(同步骤A中的液态MRS培养基)，以进行冷冻保存；该MRS液态培养基中较佳系包含质量用量为MRS液态培养基质量的30％之抗冻剂(如，甘油)，暂存于-80℃之恒温保存室，以待后续使用。 

为证实本申请饲料添加物确实具有提升陆生经济动物之健康状况及经济效益，遂进行以下试验： 

(A)屎肠球菌EF08之耐酸测试 

屎肠球菌EF08属于乳酸菌之一种，系可以分泌乳酸，使其生长环境之pH呈3.2～4.5；而胃部环境pH值仅介于2～3之间，其强酸环境系会影响大部份乳酸菌之存活率。 

为证实本申请屎肠球菌EF08系可以存活于强酸环境中，本试验系将屎肠球菌EF08以MRS液态培养基活化两次后，5000rpm离心10分钟，取得菌体，续取10⁹CFU/mL之菌体稀释于如表2所示之无菌PBS后(10倍稀释)，于37℃、10rpm之条件下进行震荡培养，并且分别于0、1、2小时后，以连续稀释法，取得适当稀释倍数后(适当稀释倍数指固态培养基中可以显现出30-300个菌落)，涂抹于MRS固态培养基中，于37℃培养48～72小时(大部分乳酸菌在培养48小时之后都已长出来，可开始计数)，计数菌数，试验结果系如图1所示。 

表2、本试验各组之处理条件 

组别	环境酸碱值条件
		第A1组	pH值为2
第A2组	pH值为3

如图1所示，虽然随着培养于强酸环境之时间延长，屎肠球菌EF08之总菌量系呈逐渐下降趋势，但在pH为2之环境下(第A1组)，经过2小时后，仍有约10⁵CFU/mL之屎肠球菌EF08存活，而于pH为3之环境下(第A1组)，经过2小时后，则仍有10⁷CFU/mL之屎肠球菌EF08存活；综合本试验结果，屎肠球菌EF08系可以存活于强酸环境中，是以可以通过胃液，进入肠道以发挥其作用。 

(B)屎肠球菌EF08之耐胆盐测试 

胆盐系由肝脏所分泌，为一种存在于肠道环境中之界面活性剂，可以破坏细菌之细胞膜通透性，而造成菌体之死亡。 

为证实本申请屎肠球菌EF08系可以存活于具有胆盐之环境中，本试验系将屎肠球菌EF08以MRS液态培养基活化两次后，以5000rpm离心10分钟，取得菌体，续取10⁹CFU/mL之菌体添加1％于如表3所示之MRS液态培养基后，于37℃下培养16小时后测量总菌数，试验3结果系如图2所示。 

表3、本试验各组之处理条件 

组别

0.3％胆盐

第B1组	不添加
		第B2组	添加

如图2所示，培养于0.3％胆盐中之第B2组虽然具有较低之存活菌数，但其存活菌数仍达10⁵CFU/mL以上；综合本试验结果，屎肠球菌EF08系可以存活于含有胆盐之环境中，是以可以长时间存活于肠道之中，以发挥其作用。 

(C)屎肠球菌EF08之细胞吸附能力 

本试验系选用Caco-2细胞(colonic epithelial cell，第C1组)及嗉囊黏膜细胞(第C2组)作为肠道上皮细胞及禽类消化道上皮细胞之模型进行；其中，该Caco-2细胞系购自台湾食品工业发展研究所(BCRC60182)；该Caco-2细胞首先以液态培养基(含10％FBS(Fetal Bovine Serum的缩写，中文为胎牛血清)之DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Minimal Essential Medium))进行培养，待生长状态稳定后，分装至24孔盘，培养21天后备用；嗉囊黏膜细胞则系采取鸡只嗉囊后，剖开并以无菌PBS(pH7.2)冲洗内容物，续以玻片刮取黏膜上皮细胞，待沉淀后，以PBS稀释为浓度10⁴～10⁵cells/mL后备用。 

将活化之屎肠球菌EF08以5000rpm离心10分钟后取得菌体，以PBS回溶后，取100μL之菌体(10⁹CFU/mL)分别与Caco-2细胞(第C1组)及嗉囊黏膜细胞(第C2组)进行共培养2小时，经清洗及1％TritonX-100破解细胞后，以MRS固态培养基测定菌数，并计算每颗细胞上之屎肠球菌EF08总菌量，结果纪录于表4。 

表4、本试验各组之细胞模型及吸附菌数 

组别	模型	吸附菌数(CFU/cell)
			第C1组	Caco-2	335
第C2组	嗉囊黏膜细胞	422

如表4所示，屎肠球菌EF08对Caco-2细胞及嗉囊黏膜细胞均具有良好之吸附能力，是以可以附着于肠道上皮细胞及禽类之消化道上皮细胞，以发挥其作用(具体如下所述)。 

(D)屎肠球菌EF08之抑菌效力 

为证实本申请屎肠球菌EF08具有抑制有害菌生长之能力，本试验系选用肠道沙门氏菌(S.typhimurium，生合公司菌种库编号STCC510177)及大肠杆菌(E.coli，生合公司菌种库编号STCC510178)作为有害菌模型；将上述有害菌模型菌株隔夜培养于NB液态培养基中(浓度为10⁹CFU/mL，NB液态培养基配方请参照表 5)，将培养菌液与15mL灭菌之营养琼脂(nutrient agar)于培养皿中混合均匀，待培养基凝固后，于培养基上形成孔洞()。 

表5、NB液态培养基配方(1L) 

将活化之屎肠球菌EF08接种于MRS液态培养基中培养24小时，以5000rpm离心10分钟，将100μL的上清液体注入孔中，置于4℃两小时使菌液扩散后，以37℃培养14～15小时后测量抑菌圈直径；本试验另以2％乳酸作为正对比组，各组处理条件系如表6所示。 

表6、本试验各组之处理条件 

组别	处理条件
		第D1组	2％乳酸
第D2组	EF08

如图3所示，屎肠球菌EF08(第D2组)对大肠杆菌及肠道沙门氏菌之抑菌圈直径均达到约16mm，效果都较2％乳酸(第D1组)更好；因此，屎肠球菌EF08具有良好之抑菌效果，可以有效杀死肠道之有害菌。 

(E)屎肠球菌EF08之促进细胞激素分泌活性 

为证实本申请屎肠球菌EF08具有促进细胞激素分泌之能力，本试验系自鸡只静脉抽取全血，以1：1之体积比添加至葡聚糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)溶剂中(即全血与溶剂体积比为1:1)，续以2250rpm之转速离心30分钟后，即可以获得周边血液细胞(PBMC)。以PBS清洗获得之周边血液细胞二次，并将细胞分装至24孔盘中(浓度为1×10⁷cells/well)，于37℃、5％CO₂之环境下静置4小时，续加入1×10⁸CFU/well之屎肠球菌EF08，共同培养24小时(表7为对此处所得的处理条件)，以分析该屎肠球菌EF08促进周边血液细胞分泌细胞激素之活性。 

如表7所示，本试验系以ELISA方式侦测IL-10、TNF-α、IL-12p40及IFN- γ等细胞激素之分泌量，其中，第E1组系未进行处理之空白组、第E2组为磷酸盐缓冲生理盐水(Phosphate Buffer Saline，简称PBS)之对比组、第E3组则为屎肠球菌EF08之实验组、第E4组为刀豆球蛋白A(concanavalin A，简称Con A)之对比组，其结果系如图4a～4d所示。 

表7、本试验各组之处理条件 

组别	处理条件(施用剂量)
		第E1组	无
第E2组	PBS
		第E3组	EF08(1×108CFU/well)
第E4组	ConA(5μg/well)

如图4a所示，屎肠球菌EF08系可以有效促进IL-10之分泌，IL-10系可以抑制活化态巨噬细胞或调节型T细胞分泌IFN-γ、IL-2、IL-3、TNF及GM-CSF等细胞激素，且促进Th2细胞及肥大细胞之作用，亦可以促进B细胞之成熟作用及抗体生成作用；因此，屎肠球菌EF08系可以有效提升与IL-10相关之免疫反应。 

如图4b所示，屎肠球菌EF08系可以有效促进TNF-α之分泌，TNF-α系参与系统性发炎反应，同时分泌下游IL-1及IL-6，可以抑制肿瘤发生及病毒的复制；因此，屎肠球菌EF08系可以有效提升与TNF-α相关之免疫反应。 

如图4c所示，屎肠球菌EF08系可以有效促进IL-12p40之分泌，IL-12p40系为IL-12异构体之一员，可以促进Th1细胞发育、抑制Th2细胞发育，且提升及维持Th1细胞性免疫反应之免疫强度；因此，屎肠球菌EF08系可以有效提升与IL-12相关之免疫反应。 

如图4d所示，屎肠球菌EF08系可以有效促进IFN-γ之分泌，IFN-γ主要由自然杀手细胞及自然杀手T细胞所分泌，系为参与先天免疫(innate immunity)及后天免疫(adaptive immunity)之重要细胞激素，且可以活化巨噬细胞，提升与巨噬细胞相关之免疫机制；因此，屎肠球菌EF08系可以有效提升与IFN-γ相关之免疫反应。 

综合上述试验结果，屎肠球菌EF08系具有良好耐酸及耐胆盐能力，不易受到胃部之低pH值环境及肠道之胆盐作用而死亡，因此在完整通过胃部，进入肠道后，该屎肠球菌EF08可以发挥其良好上皮细胞吸附能力，持久吸附于上皮细胞，并藉由其良好抑菌效力，以抑制肠道之有害菌之生长，另外更由于该屎肠球菌EF08更 可以有效促进IL-10、TNF-α、IL-12p40及IFN-γ等细胞激素的分泌、提升与上述细胞激素相关之免疫反应；因此，该屎肠球菌EF08系可以单独或混合其他成份，以形成一饲料添加物，混参于陆生经济动物之饲料中，以供给陆生经济动物，从而有效提升该陆生经济动物之免疫及抗病能力。 

此外，本申请之饲料添加物除包含上述屎肠球菌EF08外，较佳另可以包含一乳杆菌，该乳杆菌系选自一植物乳杆菌LP28(Lactobacillus plantarum)及一嗜酸乳杆菌LASW(Lactobacillus acidophilus)所组成之群组，该植物乳杆菌LP28为如台湾公开第201106957号专利案所记载之植物乳杆菌，系寄存于中国普通微生物保藏管理中心，其寄存编号为CGMCCNo.3346，且该植物乳杆菌LP28具有如SEQ ID NO：2所示之16SrDNA序列，该嗜酸乳杆菌LASW为申请号为2005101054599中所记载的嗜酸乳杆菌LASW，寄存与中国典型型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M204083，且该嗜酸乳杆菌LASW具有如SEQ ID NO：3所示之16SrDNA序列。 

本申请之饲料添加物包含适量之屎肠球菌EF08、植物乳杆菌LP28及嗜酸乳杆菌LASW，例如，每克该饲料添加物系包含10⁸～10¹²CFU之该屎肠球菌EF08、10⁸～10¹²CFU之该植物乳杆菌LP28及10⁸～10¹¹之该嗜酸乳杆菌LASW；较佳地，每克之该饲料添加物系包含10¹⁰CFU之该屎肠球菌EF08、10¹⁰CFU之该植物乳杆菌LP28及10⁹CFU之该嗜酸乳杆菌LASW。此外，该饲料添加物更可以包含一赋形剂，该赋形剂系可以选自麦芽糊精、乳糖及发酵豆粕所组成之群组，此为本领域具有通常知识者之惯常手段，在此不加以设限，表8列出了各具体试验中饲料添加物的组成及用量。 

表8各具体试验中饲料添加物之组成 

本申请饲料添加物较佳系可以储存于干燥、常温之环境中，且避免光线直接照射，以防止该饲料添加物发生变质。 

为证实本申请包含屎肠球菌EF08之饲料添加物系可以提升陆生经济动物之免疫及抗病能力，将上述饲料分别喂饲离乳仔猪、生产前后之怀孕及哺乳母猪、蛋鸡及肉鸡等陆生经济动物，并观察各陆生经济动物之免疫状况及饲料转换率之变化情形，具体结果如下： 

(F)本申请饲料添加物于离乳仔猪之饲养效应 

本试验系将本申请饲料添加物混参于饲料中，连续喂饲离乳仔猪2周(即，自出生4周龄起连续喂饲2周)，并观察该离乳仔猪之生长表现及免疫状况。 

如表9所示，本试验系选用平均体重较重之离乳仔猪作为对比组(第F1组)，仅喂饲市售饲料，另选用平均体重较轻之离乳仔猪作为实验组(第F2组)，系喂饲混参本申请饲料添加物之市售饲料；本试验中，均系使各组离乳仔猪自由摄食，并依据自由摄食之喂饲饲料总重量及平均体重增加量计算各组之饲料转换率。 

表9、本试验各组离乳仔猪之生长表现 

¹：成长幅度＝(第2周平均体重－第0周平均体重)/第0周平均体重 

²：饲料转换率＝喂饲饲料总重量/(第2周平均体重－第0周平均体重) 

一般而言，体重较重之离乳仔猪系具有较大成长幅度之趋势；但如表9所示，在喂饲混参本申请饲料添加物之市售饲料后，原本平均体重较轻之第F2组离乳仔猪反而具有较大之成长幅度，且依据饲料转换率之计算结果，喂饲混参本申请饲料添加物之市售饲料的第F2组离乳仔猪在摄取等量饲料之状况下，可以增加较多之体重，因此证实本申请饲料添加物确实可以有效促进离乳仔猪之生长表现情形。 

继续观察第F1及F2组之离乳仔猪的粪便状况，如图5所示，第F2组离乳仔猪粪便中氨含量明显下降，使第F2组离乳仔猪之粪便臭味具有显著改善。 

如图6第F1组试验结果所示，离乳仔猪之肠道系统虽尚不健全，却可以受到哺乳母猪奶水之影响，使粪便pH略呈酸性，而随着离乳时间拉长(如约离乳1周后)，粪便pH值会渐渐呈中性，当离乳约2周后，则会由于肠道系统之发育渐为完善，粪便pH值会再度下降而呈略酸性，而喂饲混参本申请饲料添加物之市售饲料的第F2组则可以于第1周时仍使粪便pH值维持偏酸性，显示其肠道环境较为健康。 

如图7a及7b所示，系为第F1及F2组离乳仔猪粪便之益生菌(乳酸菌)及有害菌(大肠杆菌)之菌群数量，图7c则为益生菌及有害菌之菌群数量比例，用以表示肠道环境之健康与否，其结果显示，本申请饲料添加物确实可以提升离乳仔猪粪便之益生菌含量，降低离乳仔猪粪便之有害菌含量，调整离乳仔猪粪便之菌相比例，因而可以维持离乳仔猪之肠道环境健康。 

如图8第F1组试验结果所示，离乳仔猪之免疫系统虽不健全，却可以受到哺乳母猪奶水之影响，使体内免疫球蛋白A之含量上升，此时，粪便中之免疫球蛋白A含量达350ng/mg，而随着离乳时间拉长(如约离乳1周后)，免疫球蛋白A之含量则会降低至约200ng/mg，当离乳约2周后，则会由于免疫系统之发育渐为完善，体内免疫球蛋白A之含量会再次上升，使粪便中之免疫球蛋白A含量约为300ng/mg，而喂饲混参本申请饲料添加物之市售饲料的第F2组则可以于第2周时大为提升体内及粪便中免疫球蛋白A之含量，显示本申请申请饲料添加物系可以提升体内免疫球蛋白A之含量，从而提升离乳仔猪之免疫能力的。 

综合上述试验结果，喂饲混参本申请饲料添加物之饲料系可以提升离乳仔猪之免疫能力，排除肠道之有害菌，维持肠道环境健康，而可以提升离乳仔猪之免疫及抗病能力，并且可以防止肠道之有害菌过度消耗离乳仔猪摄取之饲料，因而可以提升离乳仔猪之饲料转换率。 

(G)本申请饲料添加物于怀孕及哺乳母猪之饲养效应 

本试验系将本申请饲料添加物混参于饲料中，连续喂饲预产期前2周之怀孕母猪，续于怀孕母猪产下仔猪后，再持续喂饲哺乳母猪2周，并观察仔猪之生长表现及免疫状况。 

如表10所示，本试验之对比组(第G1组)系仅喂饲市售饲料，而实验组(第G2组)则系喂饲混参本申请饲料添加物之市售饲料，且本试验各组母猪均为自由 摄取饲料。 

表10、本试验各组仔猪之生长表现 

¹：成长幅度＝(第2周平均体重－第0周平均体重)/第0周平均体重 

如表10所示，虽然第G2组仔猪于出生时平均体重较轻，在连续以混参本申请饲料添加物之饲料喂饲哺乳母猪，并且使哺乳母猪哺乳仔猪2周后，原本平均体重较轻之第G2组仔猪具有较大之成长幅度。一般来说，母猪怀孕期约110～120天，而同胎仔猪出生体重则是在第35天即有差异。本申请饲料添加物系自预产期前2周起连续喂饲怀孕母猪，此时仔猪出生体重差异早已产生，本申请饲料添加物并无法影响仔猪出生之体重，但从结果中可以证实本申请饲料添加物确实可以凭借喂饲母猪而有效促进仔猪之生长表现情形。 

另如第9a～9c图所示，系为第G1及G2组仔猪粪便之益生菌及有害菌之菌群数量，以及益生菌及有害菌之菌群数量比例，用以表示肠道环境之健康与否，其结果显示，本申请饲料添加物确实可以提升仔猪粪便之益生菌含量，降低仔猪粪便之有害菌含量，调整离乳仔猪粪便之菌相比例，因而可以维持仔猪之肠道环境健康。 

再如图10第G1组试验结果所示，仔猪之免疫系统系受到哺乳母猪奶水之影响，使体内免疫球蛋白A之含量上升(粪便中免疫球蛋白A之含量达约270ng/mg)，而喂饲混参本申请饲料添加物之饲料的第G2组哺乳母猪奶水，则可以大为提升仔猪体内之免疫球蛋白A含量，使粪便中之免疫球蛋白含量约为660ng/mg，因此本申请饲料添加物系可以藉由哺乳母猪奶水，提升仔猪体内免疫球蛋白A之含量，提升仔猪之免疫能力。 

综合上述试验结果，本申请饲料添加物系可以混参于饲料，供喂饲怀孕母猪及哺乳母猪，进而提升仔猪之免疫能力，排除肠道之有害菌，维持肠道环境健康，而可以提升仔猪之免疫及抗病能力。 

(H)本申请饲料添加物于蛋鸡之饲养效应 

如表11所示，本试验系选用20周龄之蛋鸡，区分为第H1组及第H2组，第H1组系喂饲市售饲料，而第H2组则系喂饲混参本申请饲料添加物之市售饲料，其喂饲时间系自第20周起持续至第34周，并于第43周起持续至第80周。 

表11、本试验各组之蛋鸡喂饲条件 

组别	喂饲条件
		第H1组	市售饲料
第H2组	混参本申请饲料添加物之市售饲料

一般而言，蛋鸡之产蛋时程可以区分为产蛋前期(约为23周龄起)、产蛋高峰期(约为50周龄前后)及产蛋下降期(约为70周龄后)，于产蛋前期时，仅有少数蛋鸡会产蛋，且随着步入产蛋高峰期，蛋鸡之产蛋率及平均日产蛋量都会达到高峰，而当进入产蛋下降期，产蛋率及平均日产蛋量则都会呈下滑之趋势。本试验则系观察第H1及H2组蛋鸡，于上述产蛋时程之产蛋率及平均日产蛋量之差异。 

于产蛋前期，相较于第H1组，喂饲混参本申请饲料添加物之饲料的第H2组自第23周起即有较高产蛋率(如图11a所示)，且亦具有较高平均日产蛋量(如图11b所示)；进入产蛋高峰期，第H2组仍明显具有较高之产蛋率及平均日产蛋量(分别如图12a及12b所示)；而当产蛋时程进入产蛋下降期，第H2组不仅具有较高之产蛋率及平均日产蛋量，产蛋率及平均日产蛋量之下降趋势则较第H1组为缓和(分别如图13a及13b所示)；据此，本申请饲料添加物之混参系可以延长蛋鸡之产蛋时程，且亦可以增加蛋鸡于每天平均之产蛋数量。 

继续观察第H1及H2组蛋鸡对新城鸡瘟(Newcastle disease，简称ND)抗体力价之衰退程度，新城鸡瘟之防疫流程系依循台湾某牧场之制式流程，于第19、24、34、47、70及79周分别自各组蛋鸡鸡翼静脉抽取样本血液，待凝血后以10,000rpm转速离心5分钟，取得上清液后保存于-80℃冰箱备用，本试验系以IDEXX ELISA套组量测新城鸡瘟抗体力价之衰退程度。 

如图14所示，喂饲混参本申请饲料添加物之饲料的第H2组之ND抗体衰退程度较为缓和，藉此证实本申请饲料添加物系可以有效维持抗体力价，延长抗体之半衰期，可以减少于蛋鸡饲育过程中疫苗之施打次数及剂量。 

综合上述试验结果，本申请饲料添加物系可以混参于饲料中，供喂饲蛋鸡，藉由改善肠道菌相，抑制有害菌、帮助益生菌生长及活性，并且经由细胞型免疫或体液型免疫机制提升免疫能力，且亦可以帮助肠道中之营养消化及吸收能力，而使蛋 鸡获得充足之营养成分，进而提升蛋鸡之产蛋率及平均日产蛋量。 

(I)本申请饲料添加物于肉鸡之饲养效应 

如表12所示，本试验系针对1～35日龄之肉鸡进行测试，系将肉鸡区分为喂饲市售饲料之第I1组、喂饲混参本申请饲料添加物之市售饲料的第I2组及喂饲混参低剂量抗生素之市售饲料的第I3组。 

表12、本试验各组之肉鸡喂饲条件 

组别	喂饲条件
		第I1组	市售饲料
第I2组	混参本申请饲料添加物之市售饲料
		第I3组	混参低剂量抗生素之市售饲料

分别纪录1～21日龄、21～35日龄及1～35日龄之肉鸡的生长表现情形，比较于第1～21天、第21～35天内肉鸡所摄取之饲料总重量及所增加之体重，并换算饲料转换率(feed conversion rate，简称FCR)，纪录于表13。 

表13、本试验各组肉鸡之生长表现 

¹：饲料转换率＝采食量/体增重 

如表13所示，试验结果显示第I1组，第I2组及第I3组均具有较低之饲料转换率，喂饲等量饲料时，第I2及I3组肉鸡可以增加较多体重，证明本申请饲料添加物可以有效促进肉鸡之生长表现。 

再如表14所示，于各组肉鸡达35日龄时，观察各组肉鸡肠道内容物之pH值及总挥发性脂肪酸含量，其结果显示，相较于第I3组，第I2组肉鸡肠道内容物之pH值明显较低，表示本申请饲料添加物可以有效改善肉鸡之肠道状况，使有害菌不容易于肠道中生存及繁殖。 

表14、本试验各组肉鸡肠道内容物之pH值及总挥发性脂肪酸含量 

组别

pH值

总挥发性脂肪酸(μmol/g)

	嗉囊	回肠	盲肠	回肠	盲肠
						第I1组	4.88	6.59	7.36	4.95	22.98
第I2组	5.02	6.86	7.24	4.72	22.39
						第I3组	5.14	8.10	6.89	5.15	22.92

另如表15所示，同样于各组肉鸡达35日龄时，观察各组肉鸡肠道内益生菌菌群(乳酸菌)及有害菌菌群(大肠杆菌及产气荚膜梭菌)分布状况，其结果显示，相较于第I1组，第I2组肉鸡肠道内有害菌菌群系有降低趋势，且益生菌菌群则有升高趋势，表示本申请饲料添加物可以有效调整肉鸡肠道内菌群分布状况，提升益生菌菌群含量，降低有害菌菌群含量。 

表15、本试验各组肉鸡肠道内菌群分布状况 

综合上述试验结果，本申请饲料添加物系可以混参于饲料中，供喂饲肉鸡，藉由降低肠道pH值、改善肠道菌相、抑制有害菌、帮助益生菌生长及活性，以提升肉鸡之免疫及抗病能力，并且可以提升肠道之营养消化及吸收能力，而提升肉鸡之饲料转换率。 

综合上述，本申请之屎肠球菌EF08系能够耐受胃酸及胆盐，完整通过胃部，长时间存活于肠道之中，并可以吸附于肠道上皮细胞，同时分泌并释放乳酸盐，降低肠道环境酸硷值，以促使肠道环境达到菌相平衡，且促进IL-10、TNF-α、IL-12p40及IFN-γ等细胞激素的分泌，进而达到提升经济动物免疫及抗病能力之功效。 

再者，本申请之饲料添加物系凭借平衡肠道环境之菌相平衡，降低肠道内之有害菌过度消耗饲料，可以提升经济动物之饲料转换率，使经济动物所摄取之饲料可以有效转换为具有经济价值之初级畜产品，进而能够达到提升经济动物之经济价值的功效。 

实施例中提到的液体培养基，无特别说明的均参照标1；固态培养基均系于上 述MRS液态培养基中另添加质量用量为MRS液态培养基质量的1.5％的琼脂。 

虽然本申请已利用上述较佳实施例揭示，然其并非用以限定本申请，本领域技术人员在不脱离本申请之精神和范围之内，相对上述实施例进行各种更动与修改仍属本申请所保护之技术范畴。 

Claims (10)

1.一种屎肠球菌EF08，其特征在于：保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号是：CGMCC No.5549。

2.如权利要求1所述的屎肠球菌EF08，其特征在于：其16S rDNA序列为：

3.一种饲料添加物，其特征在于：包含权利要求1或2所述的屎肠球菌EF08。

4.如权利要求3所述的饲料添加物，其特征在于：每克饲料添加物包含10⁸～10¹²CFU的权利要求1或2所述的屎肠球菌EF08。

5.如权利要求3-4任意一项所述的饲料添加物，其特征在于：还包含由植物乳杆菌LP28与嗜酸乳杆菌LASW所组成之群组，植物乳杆菌LP28寄存于中国普通微生物保藏管理中心，保藏号是为CGMCC No.3346；嗜酸乳杆菌LASW寄存于中国典型型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M204083。

6.如权利要求5所述的饲料添加物，其特征在于：每克饲料添加物还包含10⁸～10¹²CFU的植物乳杆菌LP28和10⁸～10¹¹CFU的嗜酸乳杆菌LASW,其中，植物乳杆菌LP28与嗜酸乳杆菌LASW的用量比为(1:1)-(10:1)。

7.如权利要求6所述的饲料添加物，其特征在于：每克饲料添加物系包含10¹⁰CFU的权利要求1或2所述的屎肠球菌EF08、10¹⁰CFU的植物乳杆菌LP28和10⁹CFU的嗜酸乳杆菌LASW。

8.一种包含权利要求3-7任意一项所述的饲料添加物的饲料，其特征在于：每克饲料包含10⁴～10⁸CFU的权利要求1或2所述的屎肠球菌EF08。

9.如权利要求1或2所述的屎肠球菌EF08的用途，其特征在于：系用以促进IL-10、TNF-α、IL-12p40和IFN-γ细胞激素的分泌，抑制IL-4之分泌。

10.如权利要求1或2所述的屎肠球菌EF08的用途，其特征在于：系用以抑制大肠杆菌和肠道沙门氏菌之生长。