CN104171429A - 一种植物乳杆菌lp28的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物乳杆菌LP28的用途，系用以制备饲料添加物，该植物乳杆菌LP28寄存于中国普通微生物保藏管理中心，其寄存编号为CGMCC No.3346。本申请之植物乳杆菌LP28系藉由平衡肠道环境之菌相平衡，降低肠道内有害菌过度消耗饲料，可以提升经济动物之饲料转换率，使经济动物所摄取之饲料可以有效转换为具有经济价值之初级畜产品，进而能够达到提升经济动物之经济价值的功效。

Description

一种植物乳杆菌LP28的用途

技术领域

本申请涉及一种植物乳杆菌LP28的用途。 

背景技术

陆生经济动物系包含家畜及家禽，如猪、牛、羊、鹿、鸡、鸭、鹅等，该陆生经济动物系可以生产肉、乳、蛋、皮毛等初级畜产品，并且经由烹饪加工，而成为食品或商品，衍生不同之经济价值。 

现有技术中，在上述陆生经济动物之饲育过程中，常会于饲料中同时混参低剂量抗生素，因为低剂量抗生素可以杀死消化道部分微生物，降低消化道内微生物数量，从而减少微生物对饲料的利用损耗，进而可以使陆生经济动物可以产出较多初级畜产品，提升陆生经济动物的经济价值。 

但抗生素之大量及不当使用，可能会导致抗生素残留于陆生经济动物体内，而影响消费者之健康，还可能会造成环境或陆生经济动物消化道中出现抗药性菌株，因此，欧盟已于2006年全面禁止此类低剂量抗生素之应用。 

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)系为乳酸菌之一种，如台湾公告第I404540号专利案，系揭示植物乳杆菌LP23具有抑制幽门螺旋杆菌活性，台湾公告第I371283号专利案则系揭示植物乳杆菌BB9具有排除体内胆固醇及三酸甘油酯之活性，台湾公开第201106957号专利案系揭示植物乳杆菌LP28系具有减缓过敏反应之活性。 

目前尚未有相关研究指出植物乳杆菌可以作为陆生经济动物饲育时混参之饲料添加物。 

发明内容

本申请要解决的技术问题在于提供一种植物乳杆菌LP28的用途。 

为解决上述技术问题，本申请的技术方案是： 

一种植物乳杆菌LP28的用途，其特征在于：系用以制备饲料添加物，该植物乳杆菌LP28寄存于中国普通微生物保藏管理中心，其寄存编号为CGMCC No.3346。 

上述植物乳杆菌LP28可改善陆生经济动物消化道菌相，以提升动物之免疫系统状态。本申请中动物优选陆生经济动物。 

上述植物乳杆菌LP28还可提升经济动物营养获取能力，使体内营养有效转化为初级畜产品产出所需，进而提升陆生经济动物之经济价值者。 

上述植物乳杆菌LP28的用量优选为每克饲料10⁴～10⁸CFU。这样可进一步提升动物的经济价值。进一步优选，植物乳杆菌LP28的用量为每克饲料10⁶CFU。 

上述植物乳杆菌LP28的用途，系用以促进IL-10、TNF-α、IL-12p40和IFN-γ细胞激素的分泌，抑制IL-4之分泌。 

上述植物乳杆菌LP28的用途，系用以抑制肠道之有害菌之生长。 

上述有害菌包括动物体内的任何有害菌，优选，大肠杆菌和肠道沙门氏菌。 

上述植物乳杆菌LP28的16SrDNA序列为： 

申请人经研究发现：本申请之植物乳杆菌LP28系能够耐受胃酸及胆盐，完整通过胃部，长时间存活于肠道之中，并可以吸附于肠道上皮细胞，同时产生并释放乳酸，降低肠道环境酸硷值，抑制有害菌之生长，以促使肠道环境达到菌相平衡，且促进IL-10、TNF-α、IL-12p40及IFN-γ等细胞激素的分泌、抑制IL-4之分泌，以调节与上述细胞激素相关之免疫反应，进而达到提升经济动物免疫及抗病能力之功效，因此，该屎肠球菌EF08系可以单独或混合其他成份，以形成一饲料添加物，混参于陆生经济动物之饲料中，以供给陆生经济动物，从而有效提升该陆生经济动物之免疫及抗病能力。 

本申请饲料添加物可以为药剂或其它等各种形式。 

本申请未特别说明的技术均可参照现有技术。 

本申请之植物乳杆菌LP28系藉由平衡肠道环境之菌相平衡，降低肠道内之有害菌过度消耗饲料，可以提升经济动物之饲料转换率，使经济动物所摄取之饲料可以有效转换为具有经济价值之初级畜产品，进而能够达到提升经济动物之经济价值的功效，同时有效提升经济动物之免疫及抗病能力。 

附图说明

图1系本申请植物乳杆菌LP28之耐酸性试验测试结果。 

图2系本申请植物乳杆菌LP28之耐胆盐试验测试结果。 

图3a系本申请植物乳杆菌LP28之促进人类周边血液细胞的IL-4分泌活性。 

图3b系本申请植物乳杆菌LP28之促进人类周边血液细胞的IL-10分泌活性。 

图3c系本申请植物乳杆菌LP28之促进人类周边血液细胞的IL-12p40分泌活性。 

图3d系本申请植物乳杆菌LP28之促进人类周边血液细胞的IFN-γ分泌活性。 

图3e系本申请植物乳杆菌LP28之促进人类周边血液细胞的TNF-α分泌活性。 

图4系本申请植物乳杆菌LP28之促进鸡只周边血液细胞的IFN-γ分泌活性。 

图5系本申请植物乳杆菌LP28之抑制肠道有害菌的测试结果。 

具体实施方式

为让本申请之上述及其他目的、特征及优点能更明显易懂，下文特举本申请之较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下： 

本申请之植物乳杆菌LP28(Lactobacillus plantarum)，系选殖获得自豆干中；该植物乳杆菌LP28系具有降低肠道pH值、改善肠道菌相及促进周边血液细胞分泌多种细胞激素之能力。 

本申请之植物乳杆菌LP28系为如台湾公开第201106957号专利案系揭示植物乳杆菌LP28，该植物乳杆菌LP28系经由顺序相接的以下各步骤处理而获得，A、筛选步骤；B、鉴定步骤；C、保存步骤，各步骤具体如下： 

A、筛选步骤：该筛选步骤系分离购自传统市场之豆干中所含有之乳酸杆菌进行培养，系将豆干接种于10％之脱脂奶粉液态培养基(配方系如第1表所载)，于37℃进行增殖培养(enrichment culture)16～20小时，并筛选产生凝乳现象之乳酸菌菌株； 

表1、10％之脱脂奶粉液态培养基配方(1L) 

配方成分	含量(g)
		脱脂奶粉(Skim Milk Powder)	10
酵母菌萃取物(Yeast Extract)	1
			以水将体积补至1L

续将上述产生凝乳现象之乳酸菌菌株进行序列稀释及平板划线培养，并于37℃厌氧条件下培养2～3天，以挑选出不同菌相之单一菌落； 

B、鉴定步骤：该鉴定步骤系将上述单一菌落分别进行革兰氏染色、触酶反应及16S rDNA之分子鉴定，该乳酸菌菌株系为革兰氏阳性菌，触酶反应系呈阴性，且其16S rDNA部分序列系如SEQ ID No:1所示，该16S rDNA部分序列系于美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology；简称NCBI)之序列比对数据库(BLAST)进行比对，并依照上述鉴定结果确定本申请之乳酸菌系为一植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，寄存编号为CGMCC No.3346，命名为植物乳杆菌LP28，保藏日期是2009年10月19日，保藏地址是北京市朝阳区大屯路； 

C、保存步骤：该保存步骤系使该植物乳杆菌LP28可以稳定于低温环境下长久存放，以便后续使用；将本申请之植物乳杆菌LP28接种至该固态MRS培养基(系为如表2所示之液态MRS培养基中另添加1.5％琼脂，上述百分比为琼脂相对应培养基质量的百分比)，以37℃培养48小时后挑选单一菌落转殖至上述MRS液态培养基(配方系如第2表所示)，以进行冷冻保存；前述MRS液态培养基中较佳系包含30％之抗冻剂(如，甘油)，暂存于-80℃之恒温保存室，以待后续使用； 

表2、MRS固态培养基配方(1L) 

配方成分	含量(g)
		蛋白胨(Peptone)	10
牛肉抽出物(Beef Extract)	10
		酵母菌萃取物(Yeast Extract)	5
葡萄糖(Dextrose)	20
		柠檬酸铵(Ammonium Citrate)	5
硫酸镁(MgSO4)	0.1
		硫酸锰(MnSO4)	0.05
磷酸氢二钾(K2HPO4)	2
		醋酸钠(Sodium Acetate)	5
吐温80(Tween80)	1

[0043] 

以水将体积补至1L

为证实本申请植物乳杆菌LP28确实具有提升陆生经济动物之健康状况及经济效益，遂进行以下试验： 

(A)植物乳杆菌LP28之耐酸测试 

植物乳杆菌LP28属于乳杆菌之一种，系可以分泌乳酸，使其生长环境之pH呈3.2～4.5；而胃部pH值仅介于2～3之间，其强酸环境系会影响大部份乳杆菌之存活率； 

为证实本申请植物乳杆菌LP28系可以存活于强酸环境中，本试验系将植物乳杆菌LP28以MRS液态培养基活化两次后，5000rpm离心10分钟，取得菌体，续取10⁹CFU/mL之菌体稀释于如表3所示之无菌PBS后(10倍稀释)，于37℃、10rpm之条件下进行震荡培养，并且分别于0、1、2小时后，以连续稀释法，取得适当稀释倍数后(适当稀释倍数指固态培养基中可以显现出30-300个菌落)，涂抹于MRS固态培养基中，于37℃培养48～72小时(大部分乳酸菌在培养48小时之后都已长出来，可开始计数)，计数菌数，试验结果系如图1所示。 

表3、本试验各组之处理条件 

组别	环境酸碱值条件
		第A1组	pH2
第A2组	pH3

如图1所示，随着培养于强酸环境之时间延长，植物乳杆菌LP28之总菌量系呈逐渐下降趋势，但于pH2之环境下(第A1组)，经过2小时后，仍有约10⁵CFU/mL之植物乳杆菌LP28存活，而于pH3之环境下(第A2组)，经过2小时后，则仍有高于10⁸CFU/mL之植物乳杆菌LP28存活；综合本试验结果，植物乳杆菌LP28系可以存活于强酸环境中，是以可以通过胃液，进入肠道以发挥其作用。 

(B)植物乳杆菌LP28之耐胆盐测试 

胆盐系由肝脏所产生，为一种存在于肠道环境中之界面活性剂，可以破坏细菌之细胞膜通透性，而造成菌体之死亡。 

为证实本申请植物乳杆菌LP28系可以存活于具有胆盐之环境中，本试验系将植物乳杆菌LP28以MRS液态培养基活化两次后，以5000rpm离心10分钟，取得菌体，续取10⁹CFU/mL之菌体添加1％于如表4所示之MRS液态培养基后，于37℃下培养16小时后测量总菌数，试验结果系如图2所示。 

表4、本试验各组之处理条件 

组别	0.3％胆盐
		第B1组	－
第B2组	+

如图2所示，培养于0.3％胆盐中之第B2组虽然具有较低之存活菌数，但其存活菌数仍达10⁸CFU/mL以上；综合本试验结果，植物乳杆菌LP28系可以存活于含有胆盐之环境中，因此是可以长时间存活于肠道之中，以发挥其作用的。 

(C)植物乳杆菌LP28之细胞吸附能力 

本试验系选用Caco-2细胞(colonic epithelial cell，第C1组)及嗉囊黏膜细胞(第C2组)作为肠道上皮细胞及禽类消化道上皮细胞之模型进行；其中，该Caco-2细胞系购自台湾食品工业发展研究所(BCRC60182)；该Caco-2细胞首先以液态培养基(含10％FBS(Fetal Bovine Serum的缩写，中文为胎牛血清)之DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’sMinimal Essential Medium))进行培养，待生长状态稳定后，分装至24孔盘，培养21天后备用；嗉囊黏膜细胞则系采取鸡只嗉囊后，剖开并以无菌PBS(pH7.2)冲洗内容物，续以玻片刮取黏膜上皮细胞，待沉淀后，以PBS稀释为浓度10⁴～10⁵cells/mL后备用。 

将活化之植物乳杆菌LP28以5000rpm离心10分钟后取得菌体，以PBS回溶后，取100μL菌体(10⁹CFU/mL)分别与Caco-2细胞(第C1组)及嗉囊黏膜细 胞(第C2组)进行共培养2小时，经清洗及1％TritonX-100破解细胞后，以MRS固态培养基测定菌数，并计算每颗细胞上之植物乳杆菌LP28总菌量，结果纪录于表5。 

表5、本试验各组之细胞模型及吸附菌数 

组别	模型	吸附菌数(CFU/cell)
			第C1组	Caco-2	830
第C2组	嗉囊黏膜细胞	153

如表5所示，植物乳杆菌LP28对Caco-2细胞及嗉囊黏膜细胞均具有良好之吸附能力，因此可以附着于肠道上皮细胞及禽类之消化道上皮细胞，以发挥其作用(具体如下所述)。 

(D)植物乳杆菌LP28之促进人类细胞激素分泌活性 

为证实本申请植物乳杆菌LP28具有促进细胞激素分泌之能力，本试验系采集人类血液，加至葡聚糖─泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)溶剂中，其中，人类血液按与至葡聚糖─泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)溶剂的体积比为1：1，续以2250rpm之转速离心30分钟后，即可以获得周边血液细胞；用PBS清洗获得的周边血液细胞二次，并将所得细胞分装至24孔盘中(浓度为1×10⁶cells/well)，于37℃、5％CO₂之环境下静置4小时，续加入1×10⁸CFU/well之植物乳杆菌LP28，共同培养24小时，以分析该植物乳杆菌LP28促进人类周边血液细胞分泌细胞激素之活性。 

如表6所示，本试验系以ELISA方式侦测IL-4、IL-10、IL-12p40、IFN-γ及TNF-α等细胞激素之分泌量，其中，第D1组系未进行处理之空白组、第D2组为处理磷酸盐缓冲生理盐水(Phosphate Buffer Saline，简称PBS)之对比组、第D3组则为处理植物乳杆菌LP28之实验组，其结果系如第3a～3e图所示。 

表6、本试验各组之处理条件 

组别	处理条件(施用剂量)

[0068] 

第D1组	无
		第D2组	PBS
第D3组	LP28(1×108CFU/well)

如图3a所示，植物乳杆菌LP28系可以有效降低IL-4之分泌，IL-4系由Th2细胞所分泌，可以刺激活化B细胞及T细胞之增殖反应，且为参与先天免疫(innate immunity)及后天免疫(adaptive immunity)之重要细胞激素，IL-4更可以抑制Th1细胞、巨噬细胞之生成，且减少IFN-γ之分泌；因此，植物乳杆菌LP28系可以有效抑制与IL-4相关之免疫反应。 

如图3b所示，植物乳杆菌LP28系可以有效促进IL-10之分泌，IL-10系可以抑制活化态巨噬细胞或调节型T细胞分泌IFN-γ、IL-2、IL-3、TNF及GM-CSF等细胞激素，且促进Th2细胞及肥大细胞之作用，亦可以促进B细胞之成熟作用及抗体生成作用；因此，植物乳杆菌LP28系可以有效提升与IL-10相关之免疫反应。 

如图3c所示，植物乳杆菌LP28系可以有效促进IL-12p40之分泌，IL-12p40系为IL-12异构体之一员，可以促进Th1细胞发育、抑制Th2细胞发育，且提升及维持Th1细胞性免疫反应的免疫强度；因此，植物乳杆菌LP28系可以有效提升与IL-12相关之免疫反应。 

如图3d所示，植物乳杆菌LP28系可以有效促进IFN-γ之分泌，IFN-γ主要由自然杀手细胞及自然杀手T细胞所分泌，亦为参与先天免疫及后天免疫之重要细胞激素，且可以活化巨噬细胞，提升与巨噬细胞相关之免疫机制；因此，植物乳杆菌LP28系可以有效提升与IFN-γ相关之免疫反应。 

如图3e所示，植物乳杆菌LP28系可以有效促进TNF-α之分泌，TNF-α系参与系统性发炎反应，分泌下游IL-1及IL-6，可以抑制肿瘤发生及病毒的复制；因此，植物乳杆菌LP28系可以有效提升与TNF-α相关之免疫反应。 

(E)植物乳杆菌LP28之促进鸡只细胞激素分泌活性 

本试验另选用鸡只周边血液细胞进行试验，系自鸡只静脉抽取全血加至葡聚糖─泛影葡胺溶剂中，其中，全血与葡聚糖─泛影葡胺溶剂体积比为1：1，然后以2250rpm之转速离心30分钟后，即可以获得周边血液细胞；以PBS清洗所得周边血液细胞二次，并将细胞分装至24孔盘中(浓度为以1×10⁷cells/well)，于37℃、5％CO₂之环境下静置4小时，续加入1×10⁸CFU/well之植物乳杆菌LP28，共同培养24小时(表7为对此处所得的处理条件)，以分析该植物乳杆菌LP28促进鸡只周边血液细胞分泌细胞激素之活性。 

如表7所示，本试验系以ELISA方式侦测IFN-γ之分泌量，其中，第E1组系处理磷酸盐缓冲生理盐水之对比组、第E2组为处理刀豆球蛋白A(concanavalinA，简称ConA)之对比组，第E3组则为处理植物乳杆菌LP28之实验组，其结果如图4所示。 

第7表、本试验各组之处理条件 

组别	处理条件(施用剂量)
		第E1组	PBS
第E2组	Con A(5μg/well)
		第E3组	LP28(1×108CFU/well)

如图4所示，植物乳杆菌LP28系可以有效提升IFN-γ之分泌，IFN-γ属于第二型干扰素，由免疫系统中的淋巴细胞产生，具有活化巨噬细胞(macrophage)以及嗜中性白血球(leukocyte)的能力，帮助吞噬细胞去抵御病原菌的感染；此外，亦可以提升自然杀手细胞(natural killer，简称NK)活化以及调节B细胞的功能使其生产免疫球蛋白(immunoglobulin，简称Ig)以及抗体种类转移(class switching)，因此在临床上，可作用于先天性以及后天性免疫反应来对抗病毒以及病原菌的感染，以及一定的抗癌作用。 

(F)植物乳杆菌LP28之抑菌效力 

为证实本申请植物乳杆菌LP28具有抑制有害菌生长之能力，本试验系选用肠道沙门氏菌(S.typhimurium，生合公司菌种库编号STCC510177)及大肠杆菌(E.coli，生合公司菌种库编号STCC510178)作为有害菌模型；将上述有害菌模型菌株隔夜培养于NB液态培养基中(浓度为10⁹CFU/mL，NB液态培养基配方请参照表8)，将培养菌液与15mL灭菌之营养琼脂(nutrient agar)于培养皿中混合均匀，待培养基凝固后，于培养基上形成孔洞

表8、NB液态培养基配方(1L) 

将活化之植物乳杆菌LP28接种于MRS液态培养基中培养24小时，以5000rpm离心10分钟，将100μL的上清液体注入孔中，置于4℃两小时使菌液扩散后，以37℃培养14～15小时后测量抑菌圈直径；本试验另以2％乳酸作为对比组，各组处理条件系如表9所示。 

表9、本试验各组之处理条件 

组别	处理条件
		第F1组	2％乳酸
第F2组	LP28

如5图所示，植物乳杆菌LP28(第F2组)对大肠杆菌及肠道沙门氏菌之抑菌 圈直径均达到约16mm，效果都较2％乳酸(第F1组)更好；因此，植物乳杆菌LP28具有良好之抑菌效果，可以有效杀死肠道之有害菌。 

综合上述试验结果，植物乳杆菌LP28系具有良好耐酸及耐胆盐能力，不易受到胃部之低pH值环境及肠道之胆盐作用而死亡，在完整通过胃部，进入肠道后，该植物乳杆菌LP28可以发挥其良好上皮细胞吸附能力，持久吸附于上皮细胞，并藉由其良好抑菌效力，以抑制肠道之有害菌之生长，另外更由于该植物乳杆菌LP28更可以有效促进IL-10、TNF-α、IL-12p40及IFN-γ等细胞激素的分泌、抑制IL-4之分泌，以调节与上述细胞激素相关之免疫反应；因此，该植物乳杆菌LP28系可以单独或混合其他成份，以形成一饲料添加物，混参于陆生经济动物之饲料中，以给予一陆生经济动物，以有效提升该陆生经济动物之免疫及抗病能力。 

为使本申请之植物乳杆菌LP28可以发挥较佳功效，每克饲料中系可以混参10⁴～10⁸CFU之该植物乳杆菌LP28，较佳则系以每克饲料中混参10⁶CFU之该植物乳杆菌LP28。 

综合上述，本申请之植物乳杆菌LP28系能够耐受胃酸及胆盐，能完整通过胃部，长时间存活于肠道之中，并可以吸附于肠道上皮细胞，同时产生并释放乳酸盐，降低肠道环境酸硷值，以促使肠道环境达到菌相平衡，且促进IL-10、TNF-α、IL-12p40及IFN-γ等细胞激素的分泌、抑制IL-4之分泌，以调节与上述细胞激素相关之免疫反应，进而达到提升经济动物免疫及抗病能力之功效。 

再者，本申请之植物乳杆菌LP28系凭借平衡肠道环境之菌相平衡，降低肠道内之有害菌过度消耗饲料，可以提升经济动物之饲料转换率，使经济动物所摄取之饲料可以有效转换为具有经济价值之初级畜产品，进而能够达到提升经济动物之经济价值的功效。 

实施例中提到的液体培养基，无特别说明的均参照标1；固态培养基均系于上述MRS液态培养基中另添加质量用量为MRS液态培养基质量的1.5％的琼脂。 

虽然本申请已利用上述较佳实施例揭示，然其并非用以限定本申请，本领域技术人 员在不脱离本申请之精神和范围之内，相对上述实施例进行各种更动与修改仍属本申请所保护之技术范畴。 

Claims (8)

1.一种植物乳杆菌LP28的用途，其特征在于：系用以制备饲料添加物，该植物乳杆菌LP28寄存于中国普通微生物保藏管理中心，其寄存编号为CGMCCNo.3346。

2.如权利要求1所述的植物乳杆菌LP28的用途，其特征在于：植物乳杆菌LP28的用量为每克饲料10⁴～10⁸CFU。

3.如权利要求2所述的植物乳杆菌LP28的用途，其特征在于：植物乳杆菌LP28的用量为每克饲料10⁶CFU。

4.如权利要求1-3任意一项所述的植物乳杆菌LP28的用途，其特征在于：系用以促进IL-10、TNF-α、IL-12p40和IFN-γ细胞激素的分泌。

5.如权利要求1-3任意一项所述的植物乳杆菌LP28的用途，其特征在于：系用以抑制IL-4之分泌。

6.如权利要求1-3任意一项所述的植物乳杆菌LP28的用途，其特征在于：系用以抑制肠道之有害菌之生长。

7.如权利要求6所述的植物乳杆菌LP28的用途，其特征在于：系用以抑制大肠杆菌和肠道沙门氏菌。

8.如权利要求1-3任意一项所述的植物乳杆菌LP28的用途，其特征在于：植物乳杆菌LP28的16SrDNA序列为：