KR101379404B1

KR101379404B1 - 황금 발효물 및 이를 포함하는 항균 및 면역 증강 조성물

Info

Publication number: KR101379404B1
Application number: KR1020120005820A
Authority: KR
Inventors: 김홍익; 이종수; 유기종
Original assignee: (주)비타바이오
Priority date: 2012-01-18
Filing date: 2012-01-18
Publication date: 2014-03-28
Also published as: KR20130084891A

Abstract

본 발명은 황금 추출물을 유산균으로 발효시킨 황금 발효물, 그 제조방법 및 이를 함유하는 항균 및 면역 증강용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 황금 발효물은 동물 사료 조성물뿐만 아니라, 식품 조성물이나 약학 조성물 등의 다양한 분야에 적용되어 체내 흡수율 및 다양한 생리 작용의 상승 효과를 통하여 우수한 면역 증강 효능 및 항균 효능을 발휘함으로써 질병을 효율적으로 예방하고, 면역력 증진에 기여할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 황금 발효물을 포함하는 항균 및 면역 증강 조성물은 독성이나 내성 문제를 일으키지 않는 생약 발효 조성물로 안전성이 확보되어 있으므로, 기존 항생제의 대체 물질로써 적용될 수 있다.

Description

황금 발효물 및 이를 포함하는 항균 및 면역 증강 조성물{FERMENTATION PRODUCT OF SCUTELLARIA BAICALENSIS AND ANTIBACTERIAL AND IMMUNE ENHANCING COMPOSITION COMPRISING THE SAME}

본 발명은 황금의 발효물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 유산균을 이용한 황금 발효물 및 이를 포함하는 항균 또는 면역 증강 조성물에 관한 것이다.

의약 및 축산업 분야에서 항생제 오남용으로 인한 항생제 내성균의 급격한 증가는 사람이나 가축에 심각한 문제를 야기하고 있다. 이에 따라, 국내에서는 2011년 7월 1일부터 배합 사료 내 항생제 첨가가 전면적으로 금지되는 등 강력한 규제가 이어지고 있다. 그러나, 항생제를 사용하지 않을 경우, 질병에 그대로 노출되게 되어 폐사율 급증이나 성적 부진 등의 부작용이 발생할 수 있어, 항생제 대체 물질의 개발이 시급히 요구되는 실정이다.

항생제 대체 물질의 하나로서 장내 미생물의 균총을 개선하여 숙주 동물에게 유익한 작용을 하는 미생물제인 생균제가 이용되고 있다. 이러한 생균제는 각종 질병에 대한 면역력을 증가시키고, 설사 발생을 감소시키며, 혈청 내 콜레스테롤 함량 감소 및 백혈구에 의한 식균 작용을 증강시키는 것으로 알려져 있으며, 장내에서 다른 유해성 미생물의 성장을 억제하고, 섭취한 사료의 소화 흡수를 도와주는 장점을 가지고 있다. 그러나, 동물의 소화관 내에서 이러한 효능을 발휘하기 위해서는 장관 내에 성공적으로 정착해야 하는데 이에 대한 명확한 증거가 불명확하고, 따라서, 지속적인 효과를 위하여 연속적으로 투여하여야 한다는 문제가 있다. 또한, 기존의 항생제보다는 그 효능이 떨어지며, 즉각적으로 효능을 볼 수 없다는 단점을 가지고 있다.

이에 대하여, 한방 생약 등 식물 추출물은 오랜 역사를 지닌 우리나라의 전통 의약으로 인체 감염성 질환의 치료에 효율적으로 사용되어 왔으며, 임상적으로 이미 안전성이 확보된 소재이다. 또한, 즉각적인 효과를 나타낸다는 점에서 높은 장점을 가지고 있다. 그러나, 현재 식물에서 추출한 항생제 대체 물질로써는 사포닌, 허브, 향신료 추출물 등이 일부 사용되고 있을 뿐이며, 체계적이고 과학적인 연구 결과가 미흡한 실정이다. 또한, 생약 특성상 보관상의 문제점이 보고되고 있으며, 쓴 맛이나 아린 맛 등으로 기호성이 떨어진다는 단점도 있다.

한편, 황금(Scutellaria baicalensis)은 한약재로 사용되는 쌍떡잎식물 통화식물목 꿀풀과의 여러해살이풀로, 한의학적으로는 위열을 다스리고, 소장을 통하게 하며, 소담을 이기게 하고, 가슴의 열을 맑게 하고, 두통과 기침을 치료하는 효능 등을 지니는 것으로 알려져 있다. 주요 유효성분으로는, 바이칼린, 바이칼레린, 워고닌, 워고니시드, 7-메톡시-바이칼레인 등이 있고, 이 유효성분이 항박테리아, 항바이러스, 항염 및 항암 효과 등을 나타내는 것으로 알려져 있다.

그러나, 아직까지 황금을 이용하여 안전성을 확보하면서, 체내 흡수율 및 그 효능을 최대화하고, 다양한 생리 작용의 상승 효과를 통하여 질병을 효율적으로 예방하고, 면역력 증진에 기여할 수 있는 생약 조성물에 대한 연구는 실질적으로 미미한 상태이다.

본 발명은 유산균을 활용한 발효 기술을 통하여 안전성을 확보하면서, 체내 흡수율 및 효능을 최대화하고, 다양한 생리 작용의 상승 효과를 통하여 질병을 효율적으로 예방하고, 우수한 항균 및 면역 증강 효과를 갖는 황금 발효물 및 이를 포함하는 항균 및 면역 증강 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 측면은 황금 추출물을 유산균으로 발효시킨 황금 발효물을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 일 측면은 황금을 추출하여, 추출물을 형성하는 단계; 및 상기 황금 추출물에 유산균을 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는 황금 발효물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 측면에서, 상기 유산균은 L. plantarum VITA-L02(KCTC 12030BP)인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 또 다른 일 측면은 본 발명의 황금 발효물을 함유하는 항균 및 면역 증강용 사료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 일 측면은 본 발명의 황금 발효물을 함유하는 항균 및 면역 증강용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 일 측면은 본 발명의 황금 발효물을 함유하는 항균 및 면역 증강용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면 항균 활성이 우수한 유산균주를 선정하고, 황금의 최적 발효 조건을 설계함으로써 항균 및 면역 활성이 현저하게 향상되고, 체내 흡수율이 증가된 황금 발효물을 얻을 수 있다.

따라서, 이러한 황금 발효물은 동물 사료 조성물뿐만 아니라, 식품 조성물이나 약학 조성물 등의 다양한 분야에 적용되어 체내 흡수율 및 다양한 생리 작용의 상승 효과를 통하여 우수한 면역 증강 효능 및 항균 효능을 발휘함으로써 질병을 효율적으로 예방하고, 면역력 증진에 기여할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 황금 발효물을 포함하는 항균 및 면역 증강 조성물은 독성이나 내성 문제를 일으키지 않는 생약 발효 조성물로 안전성이 확보되어 있으므로, 기존 항생제의 대체 물질로써 적용될 수 있다.

도 1은 실시예 1에서 선정된 균주의 16S rDNA를 이용한 계통분석 결과를 나타내는 도이다.
도 2는 황금 발효 전후의 면역 활성 시험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명에 이용된 균주인 L. plantarum VITA-L02(KCTC 12030BP)의 면역 활성 시험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 실시예 4에 따른 기간중 평균 증체량 측정결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 실시예 4에 따른 기간중 사료 요구율 측정결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 실시예 4에 따른 분변내 유산균군의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 7은 실시예 4에 따른 분변내 대장균군의 변화를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명의 기술적 사상을 용이하게 실시할 수 있을 정도로 상세히 설명하기 위하여, 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하기로 한다.

본 발명의 일 측면은 황금 추출물을 유산균으로 발효시킨 황금 발효물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서는 유산균을 이용하여 황금 추출물을 발효시킴으로써 항균 활성 및 면역 활성을 갖는 황금 발효물을 얻을 수 있다.

일 형태에서, 황금 발효에 이용되는 유산균은 L. plantarum VITA-L02(KCTC 12030BP)이다.

본 발명자들은 전국 각지의 전통발효식품으로부터 항균 활성이 우수한 L. plantarum VITA-L02(KCTC 12030BP) 유산균주를 선별하여 황금 발효에 이용하였다. 선별된 L. plantarum VITA-L02(KCTC 12030BP)는 병원균 9 종 (E. coli , S. typhimurium, S. aureus , S. enteritidis, S. epidermidis, C. freundii, E. cloacae, K. pneumoniae, S. flexneri)에 대한 항균 활성 시험결과 다른 균주에 비하여 우수한 항균 활성을 갖는 것으로 나타났다.

또한, L. plantarum VITA-L02(KCTC 12030BP) 유산균주는 그 자체로서는 면역 증강 효능을 나타내지 않지만, 이 유산균주를 이용한 황금 발효물은 면역 활성의 지표인 TNF-α의 분비가 농도의존적으로 증가하여 면역 증강 효능을 나타낸다.

본 발명에 있어서는 이와 같이 선정된 항균 활성이 우수한 유산균주를 이용하여 황금 추출물을 발효시킴으로써, 발효의 일반적 이점, 예를 들어, 미생물의 분해작용에 의한 새로운 활성성분의 생성, 독성의 감소, 저장성 향상, 흡수가 용이한 저분자 물질로의 전환 효과와 함께 우수한 항균 및 면역 증강 효능을 동시에 발휘할 수 있다.

유산균은 황금 추출물 중량에 대하여 0.001~15 중량%, 바람직하게는 0.01~10 중량%, 더욱 바람직하게는 약 1 중량%의 양으로 접종될 수 있다.

일 실시예에서, 황금 추출물은 일반적으로 천연물 추출에 사용되는 다양한 용매를 이용한 추출에 의하여 형성될 수 있으며, 예를 들어, 열수추출, 메탄올 추출 및 주정 추출로 이루어진 군으로부터 선택되는 일 이상의 방법에 의하여 형성될 수 있다.

황금 추출물의 농도는 30~100 중량%, 바람직하게는 50~100 중량% 또는 50~99 중량%, 더욱 바람직하게는 약 100 중량% 또는 약 99 중량%일 수 있다. 황금 추출물의 농도가 30 중량% 미만인 경우에는 면역 활성 및 항균 활성을 보장할 수 없다.

일 실시예에서, 황금 추출물은 일 이상의 탄소원 및 일 이상의 질소원을 더 포함할 수 있다.

탄소원 및 질소원은 각각 황금 추출물 중량에 대하여 1~20 중량%, 바람직하게는 3~10 중량%의 양으로 포함될 수 있다. 탄소원 및 질소원의 첨가량이 각각 황금 추출물 중량에 대하여 1 중량% 미만인 경우에는 유산균의 기본 생장이 저하되어 충분한 발효가 제한될 수 있으며, 20 중량%를 초과하는 경우에는 첨가된 탄소원 및 질소원이 주로 이용되어 황금 내에 함유된 유효성분을 이용한 발효의 효율이 저하될 수 있다.

탄소원은 글루코오스, 말토오스, 수크로오스, 프럭토오스, 만노오스, 락토오스, 크실로스, 갈락토오스, 옥수수 전분 및 가용성 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 일 이상일 수 있다.

이 중, 유산균의 생장 효율 증가와 항균 활성 측면에서 글루코오스가 특히 바람직하다.

질소원은 트립톤, 맥아 추출물, 질산칼륨, 황산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄, 카제인, 콩 단백질 및 효모 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 일 이상일 수 있다.

이 중, 유산균의 생장 효율 증가와 항균 활성 측면에서 황산암모늄, 콩 단백질 및 효모 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 일 이상이 특히 바람직하다.

본 발명의 다른 일 측면은 황금을 추출하여, 추출물을 형성하는 단계; 및 상기 황금 추출물에 유산균을 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는 황금 발효물의 제조방법에 관한 것이다.

황금 추출물의 형성 단계는 일반적으로 천연물 추출에 사용되는 다양한 용매를 이용한 추출에 의하여 이루어질 수 있으며, 예를 들어, 열수추출, 메탄올 추출 및 주정 추출로 이루어진 군으로부터 선택되는 일 이상의 방법에 의하여 이루어질 수 있다.

일 형태에서, 황금 추출물의 형성 단계는 황금에 증류수를 첨가하는 단계; 60~130℃의 온도에서 30~240분 동안 열수추출하는 단계; 및 여과하는 단계를 포함한다.

일 실시예에서, 황금 추출물 형성 후에, 황금 추출물의 농도를 30~100중량%, 바람직하게는 50~100 중량% 또는 50~99 중량%, 더욱 바람직하게는 약 100중량% 또는 약 99 중량%로 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다.

또한, 전술한 바와 같이 황금 추출물에 일 이상의 탄소원 및 일 이상의 질소원을 첨가함으로써, 발효 조건을 더욱 최적화할 수 있다.

발효 단계는 25~37℃의 온도에서 6~60시간 동안 이루어지는 것이 바람직하다.

발효 단계에 있어서, 유산균은 황금 추출물 중량에 대하여 0.001~15 중량%, 바람직하게는 0.01~10 중량%, 더욱 바람직하게는 약 1 중량%의 양으로 접종될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시예는 본 발명에 따른 유산균으로 발효시킨 황금 발효물을 함유하는 항균 및 면역 증강용 사료 조성물에 관한 것이다.

사료 조성물 중의 황금 발효물의 함량은 급여 가축의 종, 주령, 체중, 및 사육 조건 등에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 사료 전체 중량에 대하여 0.01~10 중량%의 비율일 수 있다.

본 발명의 항균 및 면역 증강용 사료 조성물은 기술분야에 공지된 사료 제조방법에 따라 제조될 수 있으며, 예를 들어, 각종 사료 원료 또는 배합사료와 본 발명의 황금 발효물을 혼합한 후, 추가적인 가공 공정, 예를 들어 펠렛 형태로의 성형 또는 과립 등의 형태로의 절단 단계 등을 더 수행함으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 항균 및 면역 증강용 사료 조성물의 구성성분, 조성, 제조방법, 급여방법 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있음이 통상의 기술자에게 명백하다.

본 발명의 또 다른 일 실시예는 본 발명에 따른 유산균으로 발효시킨 황금 발효물을 함유하는 항균 및 면역 증강용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 항균 및 면역 증강용 약학 조성물은 기술분야에 공지된 통상의 방법에 따라, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제와 같은 고형 제제, 및 현탁제, 유제, 시럽제와 같은 액상 제제, 주사제, 외용제, 좌제 등의 형태로 제제화되어 경구 또는 비경구 투여될 수 있다.

제제화 방법은 기술분야에 공지된 통상의 방법에 따라 수행될 수 있으며, 예를 들어, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 부형제, 희석제 등을 사용하여 적절하게 이루어질 수 있다.

본 발명의 황금 발효물의 투여량은 투여 대상의 연령, 성별, 체중, 상태, 질병의 정도, 약물의 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 예를 들어 0.1~2000 ㎎, 바람직하게는 1~500 ㎎이다.

본 발명의 항균 및 면역 증강용 약학 조성물의 제제화 방법, 투여량, 투여 경로, 구성성분 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있음이 통상의 기술자에게 명백하다.

또한, 본 발명의 또 다른 일 측면은 본 발명에 따른 유산균으로 발효시킨 황금 발효물을 함유하는 항균 및 면역 증강용 식품 조성물에 관한 것이다.

유산균, 특히 L. plantarum VITA-L02(KCTC 12030BP)을 이용하여 발효시킨 황금 발효물은 인체 및 동물에 안전한 유산균을 이용하여 독성이나 부작용이 없고 안전성이 확보될 수 있으므로, 다양한 형태의 식품 조성물에 첨가될 수 있다.

본 발명에 따른 항균 및 면역 증강용 식품 조성물은 기술분야에 공지된 통상의 방법에 따라 각종 소스나 양념류, 우유, 버터, 요구르트 등의 유제품, 빵, 케이크, 쿠키, 면류 등의 밀가루 제품, 음료 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.

식품 조성물 중의 황금 발효물의 함량은 식품의 형태, 풍미, 맛 등을 고려하여 적절하게 선택될 수 있으며, 예를 들어 식품 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~10 중량%의 범위일 수 있다.

본 발명의 항균 및 면역 증강용 식품 조성물의 형태, 조성 및 제조방법 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있음이 통상의 기술자에게 명백하다.

이와 같이, 본 발명에 따른 유산균을 이용하여 발효시킨 황금 발효물은 사료 조성물뿐만 아니라, 식품 조성물이나 약학 조성물 등의 다양한 분야에 적용되어 체내 흡수율 및 다양한 생리 작용의 상승 효과를 통하여 우수한 면역 증강 효능 및 항균 효능을 발휘함으로써 질병을 효율적으로 예방하고, 면역력 증진에 기여할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

1. 유산균의 분리 및 선발

(1) 실험 방법

1) 시료의 수집

전국 각지에서 제조된 전통발효식품으로부터 시료를 수집하였다. 확보된 전통발효식품 시료는 호모게나이저(homogenizer)를 이용하여 파쇄하고, 균질하게 혼합한 후 -20℃에서 냉동 보관하며 사용하였다.

2) 식물유래 유산균의 분리

① 인공 위산 및 인공 담즙액으로부터 내성을 갖는 균주의 분리

사용하고자 하는 시료를 호모게나이저를 이용하여 파쇄하고 균질하게 혼합하였다. 이를 멸균된 PBS 완충액과 혼합한 후, 원심분리를 통해 펠렛을 회수하였다. 회수된 펠렛에 10 ㎖의 인공 위산(0.3% 펩신을 함유하는 MRS 브로스 용액(broth solution), pH 2.5)을 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 방치하였다. 원심분리를 통하여 펠렛을 최수하고, 1 ㎖의 인공 담즙액(0.3% 돼지 담즙을 함유하는 MRS 브로스 용액)을 첨가하여, 37℃에서 1시간 동안 방치하였다. 원심분리를 통하여 펠렛을 회수하고, 1 ㎖의 PBS 완충액으로 현탁한 후, 10진 희석하여 MRS 한천 배지에 도말하였다. 도말된 배지를 37℃에서 36~48시간 동안 배양한 후, 형성된 콜로니를 인공 위산 및 인공 담즙액에 내성을 갖는 균주로 판단하여 선별하였다.

② 유산균 유사 균주의 선별

인공 위산 및 인공 담즙액 내성 균주를 BCP 한천 배지에 피킹한 후, 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 콜로니 주위의 색 변화로 산생성의 유무를 판단하여 콜로니 주변이 노란색으로 변한 것을 유산균으로 선별하였다.

3) 항균 활성 실험: 프로바이오틱 ( probiotic ) 유산균의 배양 대사산물(균체가 제거된 배양상징액)에 대한 항균 활성 측정

밀러-힌톤 한천(Muller-Hinton Agar(MHA)) 스퀘어 디쉬 (12×12 ㎝)에 1×10⁹cfu/㎖로 배양된 다양한 병원성 세균 (E. coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis , Staphylococcus epidermidis, Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Shigella flexneri) 배양액을 접종한 후, 멸균된 면봉을 이용해 고르게 도말하였다.

병원성 세균이 도말된 스퀘어 디쉬 위에 페이퍼 디스크 (직경 8 ㎜, 두께 1.5 ㎜)를 올린 후, 선별된 프로바이오틱 유산균의 배양상징액 (MRS 브로스에서 배양된 프로바이오틱 유산균 배양액을 4℃에서, 7,000 rpm으로, 10분 동안 원심분리 하여 상등액을 회수한 후 0.2 ㎛ 실린지 필터를 이용하여 제균)을 페이퍼 디스크 위에 적하하였다. 37℃에서 투명환이 관찰될 때까지 적정 시간 배양한 후, 생성된 투명환의 크기로 항균 활성을 비교하였다.

4) 계통학적 분석 - 16S rDNA 염기서열을 이용한 계통분석

균체를 회수하고 100 ㎕ STES 완충액 (0.4 M NaCl, 0.2 M Tris-HCl (pH 7.6), 0.01 M EDTA, 1% SDS)에 현탁하였다. 현탁액에 글래스 비드를 첨가하고 세포를 파쇄하기 위하여 마이크로 튜브 믹서(Micro tube mixer) MT-360 (TOMY) 를 이용하여 5분간 강하게 교반하였다. 세포 파쇄 후, 페놀 추출(Phenol extraction)을 실시하고, 상등액에 RNase A 5 ㎕를 첨가한 다음, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 페놀 추출을 다시 실시하고, 에탄올 침전을 실시하여 DNA를 회수하였다.

16S rDNA는 PCR 방법을 통하여 증폭하였으며 사용된 프라이머는 아래와 같다:

포워드 프라이머; 5'-GA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3' (E. coli numbering system, positions 9 - 27)

리버스 프라이머: 5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3' (E. coli numbering system, positions 1,492 - 1,510)

PCR 반응의 조건은 아래와 같이 실시하였다:

총 30 사이클로, 각 사이클은 변성(Denaturation)을 위하여 94℃에서 60초, 어닐링(Annealing)을 위하여 50℃에서 60초, 확장(Extension)을 위하여 72℃에서 90초로 실시하였다.

분리균주의 16S rDNA 염기서열은 관련된 Genus를 대표하는 비교균주의 염기서열과 함께 CLUSTAL W Software Program을 이용하여 정렬하였다.

Evolutionary Distance Materices는 Kimura Two Parameter 방법에 근거하여 작성하였고, PHYLIP Package version 3.572가 제공하는 Neighbour - Joining Method Tool을 이용하여 계통수를 작성하였다.

(2) 실험결과

1) 우수 항균 활성 보유 유산균의 선별

유산균주 페이퍼 디스크 항균 활성 실험 결과를 하기 표 1에 나타낸다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 병원균 9 종 (E. coli , S. typhimurium , S. aureus , S. enteritidis, S. epidermidis, C. freundii, E. cloacae, K. pneumoniae, S. flexneri)을 대상으로 디스크 확산법(Disc Diffusion Method) (8 ㎜ 페이퍼 디스크 사용)를 이용하여 우수 항균 활성을 보유한 1 균주(VITA-L02)를 선별하였다.

2) 선발된 유산균의 계통분석

16S rDNA를 이용한 계통분석 결과를 도 1에 나타낸다. 도 1에 도시된 바와 같이, 16S rDNA를 이용한 계통분석 결과 최종선정된 균주(VITA-L02)는 Lactobacillus plantarum과 근연관계를 형성하고 있음을 알 수 있었다.

2. 황금 발효물의 제조

(1) 실험방법

1) 황금 열수추출물의 제조

황금 100 g에 10배의 증류수를 첨가하여 105℃에서 150분간 열수추출한 후, 0.25 ㎛ 필터를 이용하여 여과하여 제조하였다.

2) 발효조건 설계

① 유산균 발효를 위한 황금 열수추출물 적정 농도 설정

황금 열수추출물을 멸균 증류수와 희석하여 각각 100%, 75%, 50%의 희석액을 제조하였다. 항균 활성 시험결과 활성이 가장 뛰어난 것으로 나타난 L. plantarum VITA-L02 균주를 MRS 브로스에 2% 접종하고 37℃ 배양기에서 12시간 동안 정치배양하여 접종액을 제조하였다.

준비된 농도별 열수추출물에 VITA-L02 배양액을 1% 접종하여 37℃ 배양기에서 24시간까지 발효를 실시하였다. 0h, 12h, 24h 각 단계별로 pH 미터를 이용하여 pH를 측정하고 10진 희석법을 이용하여 생균수를 측정하였다.

② 최적 발효조건 탐색

다양한 탄소원 및 질소원이 발효에 미치는 영향을 조사하여 최적의 발효조건을 탐색하였다.

황금 열수추출물에 글루코오스, 말토오스, 수크로오스, 프럭토오스, 만노오스, 락토오스, 크실로스, 갈락토오스, 옥수수 전분, 가용성 전분 등을 탄소원으로 하여 각각의 탄소원을 농도별로 첨가하였다.

황금 열수추출물에 트립톤, 맥아 추출물, 질산칼륨, 황산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄, 카제인, 콩 단백질(Hydrolyzed Soy Peptone 304, Hydrolyzed Soy Peptone 309), 효모 추출물(Yeast Extract Springer 0202, Yeast Extract Springer 0250, Yeast Extract Pronal 5001) 등을 질소원으로 하여 각각의 질소원을 농도별로 첨가하였다.

각각의 질소원 및 탄소원이 첨가된 황금 열수추출물에 VITA-L02 배양액을 1% 접종하여 37℃ 배양기에서 24시간까지 발효를 실시하였다.

생균수 측정: 0h, 12h, 24h 각 단계별로 pH 미터를 이용하여 pH를 측정하고, 10진 희석법을 이용하여 생균수를 측정하였다.

발효 중 항균 활성 패턴분석 : 밀러 힌톤 한천 (MHA) 스퀘어 디쉬 (12×12 ㎝)에 1×10⁹cfu/㎖로 배양된 다양한 병원성 세균 (E. coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae) 배양액을 접종한 후, 멸균된 면봉을 이용해 고르게 도말하였다. 병원성 세균이 도말된 MHA 스퀘어 디쉬 위에 페이퍼 디스크 (직경 8 ㎜, 두께 1.5 ㎜)를 올린 후, 발효경과 중 각 조건별로 2시간 단위로 샘플을 취하여 페이퍼 디스크 위에 적하하였다. 37℃에서 투명환이 관찰될 때까지 적정 시간 배양한 후, 생성된 투명환의 크기로 항균 활성을 비교하였다.

(2) 실험결과

가장 뛰어난 생장 효율 증가와 항균 활성을 나타낸 100% 열수추출물에 글루코오스 2%, 아세트산나트륨 0.5%, 황산암모늄 0.2%, 콩 단백질 1%, 효모 추출물 1% 첨가 조건으로 발효조건을 설계하였다.

3. 발효 전, 후의 항균 활성 및 면역증강효능 ( in - vitro )

(1) 실험방법

1) 항균 활성 실험

밀러 힌톤 한천 (MHA) 스퀘어 디쉬 (12×12 ㎝)에 1×10⁹cfu/㎖로 배양된 다양한 병원성 세균 (E. coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae , Salmonella enteritidis) 배양액을 접종한 후, 멸균된 면봉을 이용해 고르게 도말하였다. 병원성 세균이 도말된 MHA 스퀘어 디쉬 위에 페이퍼 디스크 (직경 8 ㎜, 두께 1.5 ㎜)를 올린 후, 발효 전, 후 샘플을 취하여 페이퍼 디스크 위에 적하하였다. 37℃에서 투명환이 관찰될 때까지 적정 시간 배양한 후, 생성된 투명환의 크기로 항균 활성을 비교하였다.

2) 면역 활성 실험( TNF -α 측정)

TNF-α는 주로 활성화된 대식세포(macrophage)에 의하여 생성되는 염증성 사이토카인으로서 세포성 면역반응에 중요한 역할을 하고, 숙주의 다른 사이토카인의 생성을 증가시킨다.

면역 활성 실험에서 마우스 대식세포주인 RAW 264.7를 이용하였으며, 세포주는 10% FBS와 100 unit의 페니실린과 스트렙토마이신이 함유된 RPMI 1640 배지를 사용하여 5%의 CO₂를 포함한 37℃의 포화 습도 공기 조건 하에서 배양하였다.

96웰 플레이트의 각각의 웰에 RAW 264.7 세포를 1×10⁵ cells/㎖를 분주하고 RAW264.7 배양세포에 발효전 황금 샘플 및 발효 샘플(황금+VITA-L02)을 0.1%, 0.5%, 1%로 각각 희석하여 처리하였다. 유산균 샘플(VITA-L02)은 0.1%, 0.5%, 1%로 처리하였다(Control-normal media, LPS-E.coli Lipopolysaccaride).

12시간 및 24시간 후에 세포의 상층액을 얻고, TNF-α ELISA 키트로 분비된 TNF-α를 측정하였다.

(2) 실험결과

1) 항균 활성 실험결과

황금 발효 전후 페이퍼 디스크 항균 활성 실험 결과를 하기 표 2에 나타낸다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 발효 전 황금의 항균 활성은 미미한 수준이었으나, 황금 발효물에서는 유산균주와 동등한 수준으로 증가되었으며, 특히 L. plantarum VITA-L02를 이용하여 발효된 황금 발효물에서 더 높은 항균 활성을 나타내었다.

2) 면역 활성 실험 결과

각 샘플에 대한 TNF-α 측정결과를 도 2 및 3에 도시한다. 도 2 및 3에 도시된 바와 같이, 유산균주(L. plantarum VITA-L02)에서는 염증성 사이토카인인 TNF-α의 분비가 유도되지 않았으나 L. plantarum VITA-L02을 이용하여 발효된 황금 발효물에서는 발효 후에도 TNF-α의 분비가 유도되어 면역 증진 효능이 유지되는 것을 알 수 있었다.

4. 사양시험( iv - vivo )

(1) 실험방법

1) 사양시험설계

① 시험군은 비처리군(대조군), 황금 열수 추출물 급여군(황금), 본 발명에 따른 황금 발효물 급여군(황금 발효물) 3개의 군으로 실험을 실시하였다.

② 실험은 이유자돈(약 28일령)으로 각 돈방당 10두씩 3반복하여 실험하였다.

③ 제형은 액상으로, 급여는 음수 투약기를 이용하여 음수의 1% 혼합급여방법을 사용하였다.

④ 처리기간은 총 5주간 실험하였다.

⑤ 측정항목은 증체율, 사료섭취량, 사료요구율, 분변미생물총의 변화 등을 측정하였다.

⑥ 통계처리는 SPSS ver.18을 이용하여 분석하였다. 평균값의 유의적인 차이는 던칸 다중 검정(Duncan's multiple test)에 의하여 검증하였고, p<0.05 수준에서의 유의차를 확인하였다.

(2) 실험결과

1) 기간중 평균 증체량

각 시험군에 대하여 측정된 평균 증체량 결과를 도 4에 도시한다. 도 4에 도시된 바와 같이, 평균 두당 증체량은 황금 발효물 급여군이 가장 높았으며, 통계처리결과 p<0.05 수준에서 황금 발효물 급여군은 대조군과의 유의차가 인정되었다(SPSS ver. 18, 던칸 다중 검정).

2) 사료 요구율

각 시험군에 대하여 측정된 사료 요구율 결과를 도 5에 도시한다. 도 5에 도시된 바와 같이, 사료 요구율은 본 발명에 따른 황금 발효물 급여군의 경우 1.74로 대조군 및 황금 급여군과 비교하여 개선되었다.

3) 분변내 미생물 총의 변화

각 시험군에 대하여 측정된 분변내 미생물 총의 변화 결과를 도 6 및 7에 도시한다. 도 6에 도시된 바와 같이, 유산균군의 경우, 황금 급여군에서는 조금 증가하는 양상을 보였으나 뚜렷한 차이를 나타내지는 않았다. 그러나, 본 발명에 따른 황금 발효물 급여군에 있어서는, 높은 상승곡선을 그리는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 대조군에서는 유산균의 상승을 확인할 수 없었다.

또한, 도 7에 도시된 바와 같이, 대장균군의 경우, 대조군은 점차 증가하는 양상을 보였으나, 황금 급여군은 다소 감소하였다. 그러나, 본 발명의 황금 발효물 급여군에 있어서는 1주차에 현저히 감소한 후, 시험 종료시까지 이를 유지하는 것을 확인할 수 있었다.

4) 이와 같이 본 발명에 따른 황금 발효물의 사양시험에서 우수한 사양성적이 도출된 것은 in-vitro실험에서 나타난 면역증강 효능 및 항균 활성에 기인한 것으로 사료된다.

5. 제조예

(1) 사료 조성물

동물용 배합 사료에 상기 2.에서 제조된 황금 발효물을 약 0.01~10 중량%의 양으로 혼합하여 사료 조성물을 제조한 후, 펠렛화 및 과립화하였다.

(2) 주사제

상기 2.에서 제조된 황금 발효물: 100 ㎎

소듐 메타비설파이트: 3.0 ㎎

메틸파라벤: 0.8 ㎎

프로필파라벤: 0.1 ㎎

주사용 멸균증류수: 적량

상기 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 최종 부피가 2 ㎖가 되도록 제조하여, 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.

(3) 정제

상기 2.에서 제조된 황금 발효물: 200 ㎎

감자 전분: 100 ㎎

락토오스: 100 ㎎

콜로이드성 규산: 16 ㎎

스테아린산 마그네슘: 적량

통상의 정제 제조방법에 따라 상기 성분을 혼합하고 타정하고 정제를 제조하였다.

(4) 캡슐제

상기 2.에서 제조된 황금 발효물: 100 ㎎

유당: 50 ㎎

전분: 50 ㎎

탈크: 2 ㎎

스테아린산 마그네슘: 적량

통상의 캡슐 제조방법에 따라 상기 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

(5) 환제

상기 2.에서 제조된 황금 발효물: 120 ㎎

옥수수 전분: 100 ㎎

멸균 증류수: 적량

상기 성분을 혼합하고, 통상의 환제 제조방법에 따라 적절한 크기를 갖는 구형으로 제환하여 환제를 제조하였다.

(6) 식품

1) 각종 소스 및 양념류

상기 2.에서 제조된 황금 발효물 0.1~10.0 중량%을 각종 소스 및 양념에 첨가하여 황금 발효물이 함유된 소스 및 양념류를 제조하였다.

2) 유제품 제조

상기 2.에서 제조된 황금 발효물 5~10 중량%가 첨가된 우유를 이용하여 버터, 아이스크림과 같은 유제품을 제조하였다.

3) 밀가루 식품의 제조

상기 2.에서 제조된 황금 발효물 0.5~5.0 중량%가 첨가된 밀가루를 이용하여 빵, 케이크, 쿠키 및 면류와 같은 식품을 제조하였다.

4) 음료의 제조

올리고당(2%), 액상과당(0.5%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%) 등의 음료 재료에 상기 2.에서 제조된 황금 발효물을 적량 혼합하여, 살균함으로써 음료를 제조하였다.

상기 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능하다는 것이 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC12030BP

20111012

Claims

황금 추출물을 L. plantarum VITA-L02(KCTC 12030BP)로 발효시킨 황금 발효물.
제1항에 있어서,
상기 L. plantarum VITA-L02(KCTC 12030BP)는 상기 황금 추출물 중량에 대하여 0.001~15 중량%의 양으로 접종되는 것을 특징으로 하는
황금 발효물.
제1항에 있어서,
상기 황금 추출물은 열수추출, 메탄올 추출 또는 주정 추출로 이루어진 군으로부터 선택되는 일 이상의 방법에 의하여 형성된 것을 특징으로 하는
황금 발효물.
제1항에 있어서,
상기 황금 추출물은 30~100 중량%의 농도를 갖는 것을 특징으로 하는
황금 발효물.
제1항에 있어서,
상기 황금 추출물은 일 이상의 탄소원 및 일 이상의 질소원을 더 포함하는 것을 특징으로 하는
황금 발효물.
제5항에 있어서,
상기 탄소원 및 질소원은 각각 황금 추출물 중량에 대하여 1~20 중량%의 양으로 포함되는
황금 발효물.
제5항에 있어서,
상기 탄소원은 글루코오스, 말토오스, 수크로오스, 프럭토오스, 만노오스, 락토오스, 크실로스, 갈락토오스, 옥수수 전분 및 가용성 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 일 이상인 것을 특징으로 하는
황금 발효물.
제5항에 있어서,
상기 질소원은 트립톤, 맥아 추출물, 질산칼륨, 황산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄, 카제인, 콩 단백질 및 효모 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 일 이상인 것을 특징으로 하는
황금 발효물.
황금을 추출하여, 추출물을 형성하는 단계; 및
상기 황금 추출물에 L. plantarum VITA-L02(KCTC 12030BP)을 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는
황금 발효물의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 추출물 형성 단계는,
열수추출, 메탄올 추출 및 주정 추출로 이루어진 군으로부터 선택되는 일 이상의 방법에 의하여 이루어지는 것을 특징으로 하는
황금 발효물의 제조방법.
제10항에 있어서,
상기 추출물 형성 단계는,
황금에 증류수를 첨가하는 단계;
60~130℃의 온도에서 30~240분 동안 열수추출하는 단계; 및
여과하는 단계를 포함하는
황금 발효물의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 발효 단계는 25~37℃의 온도에서 6~60시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는
황금 발효물의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 추출물 형성 단계 이후, 황금 추출물의 농도를 30~100 중량%로 조절하는 단계를 더 포함하는
황금 발효물의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 L. plantarum VITA-L02(KCTC 12030BP)은 상기 황금 추출물 중량에 대하여 0.001~15 중량%의 양으로 접종되는 것을 특징으로 하는
황금 발효물의 제조방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 황금 발효물을 함유하는 항균 및 면역 증강용 사료 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 황금 발효물을 함유하는 항균 및 면역 증강용 약학 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 황금 발효물을 함유하는 항균 및 면역 증강용 식품 조성물.
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