KR101473475B1

KR101473475B1 - 신규한 락토바실러스 속 미생물 및 이를 이용한 풍미가 향상된 대추발효물의 제조 방법

Info

Publication number: KR101473475B1
Application number: KR1020140127644A
Authority: KR
Inventors: 이영경; 홍희도; 조장원; 김영찬; 윤보라; 홍성미
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2014-09-24
Filing date: 2014-09-24
Publication date: 2014-12-18
Also published as: KR20140143121A

Abstract

본 발명은 신규한 락토바실러스 커바투스 K031101 균주 및 신규한 락토바실러스 사케이 K040701 균주 및 이 균주들을 이용하여 만든 대추 발효물을 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것이다. 좀 더 상세하게는 풍미 향상 및 면역세포 활성화 효과가 있는 대추 발효물을 생산하는 락토바실러스 커바투스 K031101(기탁번호 :KCCM11311P), 락토바실러스 사케이 K040701 (기탁번호 : KCCM11310P) 및 상기 균주들을 이용하여 만든 대추 발효물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 식품, 약학적 조성물, 정장용, 생균제, 사료용 조성물, 발효제품에 관한 것이다.
본 발명의 상기 균주가 생성하는 대추 발효물은 면역관련 세포들의 NO 생성량을 증가시켜줌으로서, 면역기능을 증진시키는 효과가 있고, 세포 독성도 없어서, 새로운 기능성 식품 및 면역기능 증강용 의약품 제조에 효과적이다.

Description

신규한 락토바실러스 속 미생물 및 이를 이용한 풍미가 향상된 대추발효물의 제조 방법{Novel Lactobacillus sp. microorganism and the manufacturing method of a flavor improved jujube fermentation product using the same}

본 발명은 신규한 락토바실러스 속 미생물 및 이를 이용한 풍미가 향상된 대추발효물의 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 풍미 향상 및 면역세포 활성화 효과가 있는 대추 발효물을 생산하는 락토바실러스 커바투스 K0301101(기탁번호 :KCCM11311P), 락토바실러스 사케이 K040701 (기탁번호 : KCCM11310P), 이 두 균주를 이용하여 만든 대추 발효물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 식품, 약학적 조성물, 정장용, 생균제, 사료용 조성물,발효제품에 관한 것이다.

발효는 미생물이 가지고 있는 효소를 이용하여 유기물을 분해시켜서 인간 생활에 유용하게 사용되는 물질을 제조하는 과정으로서, 인체에 유용한 물질을 만들어내는 대표적인 발효 미생물로는 유산균, 효모 등이 있고, 다양한 식품들이 발효 과정에 의해서 생산된다. 또한, 발효는 유용 물질을 만들어 내는 것 이외에도 발효에 관여하는 유산균이 장 내에서 면역 및 독소제거 (Detoxification)의 역할을 담당하기도 한다. 더 나아가, 장내 미생물에 의한 발효를 통해 섭취된 성분은 분해되어 인체 세포에 흡수가 용이한 저분자 물질로 전환되거나, 불안정하거나 불활성인 형태에서 활성 형태로 전환되어 흡수되기도 하며, 이러한 결과는 장내 미생물에 의한 생물전환의 중요성을 단적으로 보여주는 것이라 볼 수 있다. 따라서, 유산균 및 효모 등의 미생물 발효에 의해서 천연 식물소재 및 한약재의 효능을 극대화시키거나, 안전성 문제를 해결하기 위한 시도는 다양한 식품, 화장품, 약품 등의 개발에 있어서 중요한 의미를 갖는다 하겠다. 특히, 우수한 항암 효과, 항염증 효과, 항노화 효과, 면역력 증강 효과 등을 갖는 것으로 보고되는 김치나 된장등의 한국전통식품에서 번식하는 미생물은 생물학적 활성이 뛰어난 것으로 보고되고 있어, 전통 발효 식품에서 분리한 미생물을 이용하려는 많은 연구가 진행되고 있다(대한민국 등록특허 10-0962587).

유산균은 자연계에 널리 존재하며 탄수화물을 혐기적으로 이용하여 유산을 생산한다. 이러한 유산균으로는 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 페디오코커스 속(Pediococcus sp.), 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 스포로락토바실러스 속(Sporolactobacilus sp.),비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.) 등이 있다. 이들 유산균은 장내로 유입된 후 장내 상피세포에 착생하게 되어 유해 미생물의 장 정착을 방지하고 항균 물질을 분비함으로써 유해 미생물의 생육을 억제하고 설사와 변비를 개선할 뿐 만 아니라, 면역활성 증진, 항암 작용, 혈청 콜레스테롤 저하 등의 작용을 수행한다(대한민국 등록특허 10-1192765. 유산균은 식품분야를 포함한 다양한 산업분야에서 이용되고 있는 미생물로서 축산분야에서는 가축의 사료에 첨가되어 가축의 성장에 필요한 소화효소의 분비를 촉진하고, 장내 세균수를 안정화시키며, 대사성 질병을 예방(대한민국 등록특허 10-1292714)하는 역할을 하여 가축의 생산성을 향상시키는데 효과가 있는 생균제(probiotics)로 널리 이용되고 있다.

대추는 우리나라 기후풍토에 적합하여 재배가 용이하고 생산물의 저장성이 좋아서 널리 재배된 과수 중에 하나이다. 대추는 단백질, 지방 등의 영양소와 36종의 다양한 무기원소가 함유되어 있으며, 특히 비타민 C, 비타민 B군, 칼슘, 인 등의 영양분이 천연 비타민제라고 할 정도로 많이 함유되어 있다. 또한 비교적 수분이 낮아서 풋대추의 수분함량은 74%이고, 붉은 대추 생것의 수분함량은 60%이며, 건조대추의 수분함량은 30%이다. 대추의 주성분인 포도당과 과당의 함량은 28%이고, 단백질의 함량은 1.5%이다. 한방에서는 대추를 완화강장제로 사용하고, 잘 익은 대추를 증숙 및 건조시켜 달여 먹으면 열을 내리게 하고, 변을 묽게 하여 변비를 없애며, 기침도 멎게 하는 것으로 알려져 있다(대한민국 등록특허 10-0905288).

본 발명자들은 면역기능을 증진시키고, 발효를 통해 텁텁한 후미를 감소시키는 동시에 적절한 산미를 주어 기호도를 증가시킬 수 있는 소재 생산이 가능한 발효 균주를 개발코자 연구하던 중, 본 발명의 락토바실러스 커바투스 K031101 균주 및 락토바실러스 사케이 K040701 균주가 생산하는 대추 발효물이 면역기능을 매우 증진시키고, 세포독성이 없으며 풍미가 향상된 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 면역 증강효과가 있고 풍미가 향상된 대추 발효물을 생산하는 락토바실러스 커바투스 K031101(기탁번호:KCCM11311P)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 면역 증강효과가 있고 풍미가 향상된 대추 발효물을 생산하는 락토바실러스 사케이 K040701(기탁번호: KCCM11310P)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주들을 이용하여 만든 대추 발효물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주들을 이용하여 만든 대추 발효물을 포함하는 면역 증강용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주들을 이용하여 만든 대추 발효물을 유효성분으로 포함하는 정장용,생균제,사료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주들을 이용하여 만든 대추 발효물을 유효성분으로 포함하는 발효제품을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 이용하여 대추를 발효시키는 단계를 포함하는 풍미가 향상된 대추 발효물의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 면역 증강효과가 있고 풍미가 향상된 대추 발효물을 생산하는 락토바실러스 커바투스 K031101(기탁번호:KCCM11311P)를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 면역 증강효과가 있고 풍미가 향상된 대추 발효물을 생산하는 락토바실러스 사케이 K040701(기탁번호: KCCM11310P)를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 상기 균주들을 이용하여 만든 대추 발효물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 상기 균주들을 이용하여 만든 대추 발효물을 포함하는 면역 증강용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 상기 균주들을 이용하여 만든 대추 발효물을 유효성분으로 포함하는 정장용,생균제,사료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 상기 균주들을 이용하여 만든 대추 발효물을 유효성분으로 포함하는 발효제품을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 상기 균주를 이용하여 대추를 발효시키는 단계를 포함하는 풍미가 향상된 대추 발효물의 제조방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 면역 증강효과가 있고 풍미가 향상된 대추 발효물을 생산하는 락토바실러스 커바투스 K031101(기탁번호:KCCM11311P)과 락토바실러스 사케이 K040701(기탁번호: KCCM11310P)를 제공한다.

면역은 크게, 선천면역(innate immunity)과 획득면역(acquired immunity)으로 구분된다. 선천면역은 항원에 대해 특별한 기억 작용이 없이 비특이적으로 반응하여 항원의 침입으로부터 보호하는 기능을 한다. 상기 선천면역에는 피부, 점액 조직, 강산성의 위산, 혈액에 존재하는 보체(complement)등 많은 해부학적 방어 작용 및 생물학적 작용이 이에 속하며, 상기 선천면역을 담당하는 세포로 식균 작용을 하는 대식세포(macrophage)와 다형핵 백혈구(polymorpho nuclear leukocyte), 감염세포 및 암세포를 사멸시키는 자연살해세포(NK cell)등을 들 수 있다. 획득면역은 항원의 표식을 기억하는 기능을 의미하는 면역기억(immunological memory)을 비롯한 보다 강력한 면역 반응을 말하며 항원에 특이적이며 항원제시(antigen presentation) 과정을 통한 비자기항원의 인지를 필요로 한다.

본 발명의 락토바실러스 커바투스 K031101(기탁번호:KCCM11311P)과 락토바실러스 사케이 K040701(기탁번호: KCCM11310P)들이 생산하는 각각의 대추 발효물은 다른 균주들의 경우와 비교해 볼 때, 대식세포에서의 NO의 생성량, IL-6, IL-12, TNF-α 의 생성량이 월등이 우수하기 때문에 선천면역과 획득면역 기능을 증진시키는 효과가 있다.

이와 같은 본 발명의 효과는 본 발명의 일실시예에 잘 나타나 있다.

대식 세포 배양 시에 락토바실러스 커바투스 K031101 또는 락토바실러스 사케이 K040701로 발효시킨 대추 발효물을 첨가한 경우가, 다른 균주들의 대추발효물을 첨가했을 때보다 NO 생성량이 우수했다. 또한 상기 균주들로 발효시킨 대추발효물이 IL-6 , IL-12 및 TNF-α 생성량이 다른 균주들에 비해 월등히 우수했다.

NO 생성량이 많다는 것은 대식세포의 활성이 좋다는 것을 의미한다. 인터루킨(IL)-6는 B세포의 항체생산세포로의 최종 분화를 유도하는 B세포자극인자2(BSF-2)로 분리한 분자량이 210,000인 당단백질로서, T림프구, B림프구, 대식세포, 섬유아세포 등 여러 세포에서 생산되는 시토카인이다. IL-12는 B세포 및 단구, 대식세포에서 생산되는 분자량이 약 70,000인 당단백질로 정지기의 T세포와 자연살생(NK)세포에서 인터페론γ생산의 유도, NK세포의 활성유도, 정지기 T세포의 렉틴 자극에의한 세포증식능의 항진, 나이브세포에서 TH1세포로의 분화촉진, 인터류킨3 존재 하에서 조혈간세포의 증식 촉진, 이식종양에 대한 생체 내 항종양효과 등의 면역활성 증강에 중요한 역할을 수행하는 시토카인이다. TNF-α(tumor necrosis factor-alpha)는 주로 활성화된 대식세포에 의해 분비되는데. 가장 중요한 역할은 면역 세포의 조절로, 종양생성과 바이러스 복제를 억제하는 능력을 갖는다. 이들 물질이 많이 생산된다는 것은 면역기능이 우수하다는 의미이므로, 상기 균주들이 만들어내는 각각의 대추 발효물은 면역기능을 증진시키는 효과가 있다.

또한 상기 균주들에 의한 대추 발효물은 세포 독성이 없어, 각종 식품 및 의약품의 제조에 이용할 수 있다.

이와 같은 효과는 본 발명의 일실시예에 나타나 있다.

MTT essay 방법에 따라 세포활성을 측정한 결과, 상기 균주의 대추발효물들은 세포 독성이 없는 것으로 확인 되었다.

따라서 본 발명의 락토바실러스 커바투스 K031101(기탁번호:KCCM11311P)과 락토바실러스 사케이 K040701(기탁번호: KCCM11310P)균주들을 이용하여 만든 대추 발효물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 식품, 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 대추 발효물은 대추 추출물을 기질로 포함하는 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(원심분리한 상등액) 등을 포함한다.

본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.

예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 락토바실러스 커바투스 K031101(기탁번호:KCCM11311P)과 락토바실러스 사케이 K040701(기탁번호: KCCM11310P)균주들을 이용하여 만든 대추 발효물을 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화 하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 락토바실러스 커바투스 K031101(기탁번호:KCCM11311P)과 락토바실러스 사케이 K040701(기탁번호: KCCM11310P)균주들을 이용하여 만든 대추 발효물을 면역기능 증진의 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.

또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 락토바실러스 커바투스 K031101(기탁번호:KCCM11311P)과 락토바실러스 사케이 K040701(기탁번호: KCCM11310P)균주들을 이용하여 만든 대추 발효물을 첨가하여 제조할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물 중 상기 본 발명의 락토바실러스 커바투스 K031101(기탁번호:KCCM11311P)과 락토바실러스 사케이 K040701(기탁번호: KCCM11310P)균주들을 이용하여 만든 대추 발효물의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 고형물 함량 0.01 내지 50 중량%이다.

또한, 본 발명의 락토바실러스 커바투스 K031101(기탁번호:KCCM11311P)과 락토바실러스 사케이 K040701(기탁번호: KCCM11310P)균주들을 이용하여 만든 대추 발효물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 면역기능 저하로 기인되는 질환의 예방 및 개선에 효과 가 있으며, 상기 면역기능 저하로 기인되는 질환으로는 감기 등의 감염성 질환 및 염증성 질환, 아토피 등의 알러지 질환, 만성피로, 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 알려 진 면역기능 저하로 기인되는 질환은 모두 본 발명에 포함된다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 락토바실러스 커바투스 K031101(기탁번호:KCCM11311P)과 락토바실러스 사케이 K040701(기탁번호: KCCM11310P)균주들을 이용하여 만든 대추 발효물 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 면역기능 증진용 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 '경피 투여'란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 본 발명 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말하다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의 정제물를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

본 발명의 락토바실러스 커바투스 K031101(기탁번호:KCCM11311P)과 락토바실러스 사케이 K040701(기탁번호: KCCM11310P)균주들을 이용하여 만든 대추 발효물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게는 락토바실러스 커바투스 K031101(기탁번호:KCCM11311P)과 락토바실러스 사케이 K040701(기탁번호: KCCM11310P)균주들을 이용하여 만든 대추 발효물의 바람직한 전체 용량은 고형분 함량 기준으로 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.01ug 내지 1,000 mg, 가장 바람직하게는 0.1 ug 내지 100 mg일 수 있다. 그러나 상기 본 발명의 락토바실러스 커바투스 K031101(기탁번호:KCCM11311P)과 락토바실러스 사케이 K040701(기탁번호: KCCM11310P)균주들을 이용하여 만든 대추 발효물의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 해당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 대추 발효물을 면역기능 증진제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명의 조성물은 면역기능 저하로 기인되는 질환의 예방 및 치료에 효과가 있으며, 상기 면역기능 저하로 기인되는 질환으로는 감기 등의 감염성 질환 및 염증성 질환, 아토피 등의 알러지 질환, 만성피로, 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 알려진 면역기능 저하로 기인되는 질환은 모두 본 발명에 포함된다.

본 발명은 락토바실러스 커바투스 K031101(기탁번호:KCCM11311P)과 락토바실러스 사케이 K040701(기탁번호: KCCM11310P)균주들을 이용하여 만든 대추 발효물을 유효성분으로 포함하는 정장용, 생균제, 사료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 락토바실러스 커바투스 K031101(기탁번호:KCCM11311P)과 락토바실러스 사케이 K040701(기탁번호: KCCM11310P)균주들을 이용하여 만든 대추 발효물은 면역기능 증진 활성이 있어 인간 및 동물의 건강 증진을 위한 용도, 즉, 정장용, 생균제 또는 사료용 조성물로 사용될 수 있다. 상기 조성물은 상기 균주의 대추발효물을 유효성분으로 포함며, 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 조성물 내 상기 균주들과 균주를 이용하여 생산한 대추발효물의 함량은 조성물의 용도 및 제형에 따라 달라질 수 있다. 본 발명에 따른 정장용 또는 생균제 조성물은 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 락토바실러스 커바투스 K031101 과 락토바실러스 사케이 K040701 균주, 상기 균주들을 이용하여 만든 대추 발효물을 약제학적 분야에서 통상적으로 사용하는 담체 및 향료와 혼합하여 정제 (tablet), 트로키(troche), 캡슐(capsule), 엘릭실(elixir), 시럽(syrup), 산제 (powder), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조 및 투여될 수 있다.담체로는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제 등을 사용할 수 있다. 투여방식은 경구, 비경구 또는 도포법을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 경구투여하는 것이 바람직하다. 또한, 투여용량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 상태 등에 따 라 적절히 선택할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 사료용 조성물은 발효사료, 배합 사료, 펠렛형태 및 사일레지(silage) 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료 는 본 발명의 락토바실러스 커바투스 K031101 균주, 락토바실러스 사케이 K040701 균주 및 상기 균주들을 이용하여 만든 대추 발효물을 포함하고, 추가적으로 여러 가지 미생물 균 또는 효소들을 첨가함으로써 유기물을 발효시켜 제조될 수 있다. 상기 배합사료는 여러 종류의 일반 사료와 본 발명의 락토바실러스 커바투스 K031101 균주, 락토바실러스 사케이 K040701 균주, 상기 균주들을 이용하여 만든 대추 발효물을 혼합 하여 제조될 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 발효사료 또는 배합사료를 펠렛기로 제형화하여 제조될 수 있다. 사일레지는 청예사료와 대추 추출물을 혼합하여 락토바실러스 커바투스 K031101 균주, 락토바실러스 사케이 K040701 균주로 발효시킴으로서 제조되거나, 유산균 발효된 청예사료에 상기 균주들을 이용하여 만든 대추 발효물을 혼합하여 제조될 수 있다.

본 발명은 락토바실러스 커바투스 K031101(기탁번호:KCCM11311P)과 락토바실러스 사케이 K040701(기탁번호: KCCM11310P)균주들을 이용하여 만든 대추 발효물을 유효성분으로 포함하는 발효제품을 제공한다.

상기 발효제품이란 미생물이 자신이 가지고 있는 효소를 이용해 유기물을 분해시키면서 생산되는 성분들을 포함하는 식품,화장품,약품,청소용품,생활용품 및 그 밖의 모든 형태의 제품을 의미한다. 상기 발효제품은 락토바실러스 커바투스 K031101 균주와 락토바실러스 사케이 K040701 균주들을 이용하여 만든 대추 발효물을 포함하며, 제품의 특성에 따라 추가적인 구성물들이 포함되어 제조될 수 있다.

본 발명은 락토바실러스 커바투스 K031101(기탁번호:KCCM11311P)과 락토바실러스 사케이 K040701(기탁번호: KCCM11310P) 균주를 이용하여 대추를 발효시키는 단계를 포함하는 풍미가 향상된 대추 발효물의 제조방법을 제공한다.

*본 발명의 대추 발효물 제조는 대추 추출물에 락토바실러스 커투스 K031101 균주와 락토바실러스 사케이 K040701 균주를 사용하여 발효하는 것을 특징으로 한다. 일반적인 유산균 발효물 제조방법은 다음과 같다. 발효 대상이 되는 재료를 준비하고, 발효가 잘 이루어 지도록 발효 조건을 준비한다. 유산균의 첨가는 발효 대상의 양에 따라 적량의 균주을 첨가하며 본 발명에서는 락토바실러스 커바투스 K031101 균주, 락토바실러스 사케이 K040701 균주를 사용 하는 것을 특징으로 한다. 발효는 통상의 발효균의 발효조건에 따라 수행되는 것으로 바람직하게는 30 내지 43℃에서 4 내지 168시간동안 수행된다. 추가적으로 완성된 제품의 회수는 발효물에서 불필요한 부산물이나 미발효된 재료를 제거하는 것에서부터 저장, 운반을 용이하게 하기 위한 모든 후처리과정 및 포장 등을 포함할 수 있다.

본 발명은 신규한 락토바실러스 커바투스 K031101 균주 및 신규한 락토바실러스 사케이 K040701 균주 및 이 균주들을 이용하여 만든 대추 발효물을 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것이다. 좀 더 상세하게는 풍미 향상 및 면역세포 활성화 효과가 있는 대추 발효물을 생산하는 락토바실러스 커바투스 K031101(기탁번호 :KCCM11311P), 락토바실러스 사케이 K040701 (기탁번호 : KCCM11310P)및 이 두 균주를 이용하여 만든 대추 발효물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 식품, 약학적 조성물, 정장용, 생균제, 사료용 조성물, 발효제품에 관한 것이다.

본 발명의 상기 균주가 생성하는 대추 발효물은 면역관련 세포들의 NO, IL-6, IL-12, TNF-α 생성량을 증가시켜줌으로서, 면역기능을 증진시키는 효과가 있고, 세포 독성도 없어서, 새로운 기능성 식품 및 면역기능 증강용 의약품 제조에 효과적이다.

도 1은 본 발명의 대추 발효물의 제조 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 8가지 선발 균주로 만든 대추 발효물에 대한 기호도 평가 결과이다.
(가로축: 균주별 식별번호, 세로축 : 기호도 7점 척도법. 1-매우 싫음, 4- 보통, 7-매우 좋음)
도 3은 8가지 선발 균주로 만든 대추 발효물에의한 대식세포(Raw 264.7 cell)의 아질산염 생성량을 나타낸 결과이다.
(가로축: 균주별 식별번호, 세로축 : 아질산염 생성량)
도 4는 8가지 선발 균주로 만든 대추 발효물에의한 대식세포(Raw 264.7 cell)의 세포독성률을 나타낸 결과이다.
(가로축: 균주별 식별번호, 세로축 : 세포 생존율)
도 5는 8가지 선발 균주로 만든 대추 발효물에의한 대식세포(Raw 264.7 cell)의 IL-6 생성량을 나타낸 결과이다.
(가로축: 균주별 식별번호, 세로축 : IL-6 농도)
도 6는 8가지 선발 균주로 만든 대추 발효물에의한 대식세포(Raw 264.7 cell)의 IL-12 생성량을 나타낸 결과이다.
(가로축: 균주별 식별번호, 세로축 : IL-12 농도)
도 7은 8가지 선발 균주로 만든 대추 발효물에의한 대식세포(Raw 264.7 cell)의 TNF-α 생성량을 나타낸 결과이다.
(가로축: 균주별 식별번호, 세로축 : TNF-α 농도)

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

본 발명의 균주 스크리닝

<1-1> 시료의 준비

한국식품연구원에서 분리 보관 중인 전통 발효식품 유래 유산균 중 식품 발효에 적용 가능한 30여종의 Lactobacillus sp.(락토바실러스 속) 균주를 각각 MRS broth 배지에서 배양하였다. MRS broth에서 배양한 균액은 대추 추출액에 1% 농도로 접종하여 48시간 30℃에서 대추 추출물을 발효 시켰다. 1차로 발효 경제성을 고려해 7 °Brix 고농도에서 발효가능한 균주여야 한다는 조건과 발효 후 풍미의 변화를 가질 수 있는 균주 8종을 우선 선별하였다.

선발된 8가지 균주

식별 번호	균주명
1	Lactobacillus reuteri
2	Lactobacillus sakei
3	Lactobacillus sakei
4	Lactobacillus plantarum
5 (K031101)	Lactobacillus curvatus
6 (K040701)	Lactobacillus sakei
7	Lactobacillus curvatus
8	Lactobacillus curvatus

<1-2> 선발 균주의 동정

균주의 동정은 (주) 마크로젠 의뢰하였다. PCR 반응을 위한 primer 는 세균의 염기보존 서열인 16S rDNA를 증폭하기 위하여 27F (5’ AGAGTTTGATCMTGGCTCAG - 3’) 와 1492R(5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT - 3’)를 사용하였다. K031101 균주의 염기서열 분석 결과 1491개의 염기서열 중 Lactobacillus curvatus 표준균주와 1485개의 염기서열이 동일하여 99.6% 유사도를 확인할 수 있었다. 그러므로 상기 균주는 Lactobacillus curvatus 균주로 동정되었다. 또한, K040701 균주의 염기서열 분석 결과 1491개의 염기서열 중 Lactobacillus sakei 표준균주와 1481개의 염기서열이 동일하여 99.3% 유사도를 확인할 수 있었다. 그러므로 상기 균주는 Lactobacillus sakei 균주로 동정되었다.

본 발명자들은 상기 균주를 "Lactobacillus curvatus K031101 (기탁번호:KCCM11311P"과 “Lactobacillus sakei K040701 (기탁번호:KCCM11310P)"로 명명하였고, 이를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganism)에 2012년 10월 17일자로 기탁하였다.

< 실시예 2>

대추 발효물 준비

<2-1> 대추 추출액의 제조

대추 1: 물 9의 중량비율로 100℃에서 환류냉각으로 4시간 추출한 추출액(5~7 °Brix)을 유산균 배양 기질로 한다.

<2-2> 대추 발효물의 제조

선발된 8 개의 Lactobacillus sp.(락토바실러스 속) 균주를 각각 MRS broth 배지에서 배양하였다. MRS broth에서 배양한 균액은 대추 추출액에 1% 농도로 접종하여 48시간 30℃에서 대추 추출물을 발효 시켰다. 8종의 유산균으로 각기 발효된 대추 발효액을 4℃ 냉장 보관 후, 기호평가와 효능평가에 사용하였다.

이상의 발효공정은 모든 실시예에서 동일하게 적용되었다.

< 실시예 3>

균주에 따른 대추 발효물의 기호도 평가

8종의 유산균으로 각기 발효된 대추 발효액을 4℃ 냉장 보관 후, 20인의 패널을 대상으로 발효 전 대추 추출물을 대조구로 하여 선호도를 조사하였다. (7점 척도법. 1-매우 싫음, 4- 보통, 7-매우 좋음)

기호도 평가 결과 추출물의 풍미에 영향을 주는 8가지 선발 균주 중 Lactobacillus sakei K040701, Lactobacillus curvatus K031101로 발효 시킨 대추 추출물의 풍미가 발효 전은 물론 다른 6가지 균주에 비해서도 크게 향상된 것을 확인할 수 있었다. 이는 [도 2]에서 잘 보여준다.

< 실시예 4>

* 균주에 따른 대추 발효물의 효능평가

<4-1> 대식 세포의 준비

본 실험에서 대식세포는 Raw 264.7 cell 이 사용되었다. 해당 실험 세포는 100 mL cell culture dish에 70% 정도 자란 cell의 media를 제거한 뒤, cell scrapper를 이용하여 떼어낸 cell을 media를 이용해 모으고 원심분리하였다(1000 rpm, 5 min). 상등액을 제거하여 pallet만 남기고 media를 넣어준 뒤, 새 100 mL cell culture dish로 옮긴 후, incubator (37℃, 5% CO₂)에서 배양하였다.

<4-2> NO 생산량 측정

상기 실시예 2에서 수득한, 균주에 의한 대추발효물을 대식세포 배양시 첨가하여 배양한 후 NO 생산량을 측정하였다.

배양액에서의 산화질소 생성은 산화질소의 산화물인 아질산의 측정을 통해 평가하였다. Griess 분석 방법을 이용하였으며 Raw 264.7 cell 세포를 96 well plate에 2 x 10⁵ cells/mL 농도로 분주하고 24 시간 배양한 뒤, Raw 264.7 cell에 500 μg/mL으로 제조해 놓은 시료를 각각 50 μg/mL 농도로 처리한 다음, 20 시간 배양하였다. 배양 후 상등액 100 μL를 새로운 96-well plate에 옮긴 후 griess reagent (Sigma-Aldrich Co.)와 1:1로 혼합하여 넣고 shaker에서 10분 동안 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. standard curve는 sodium nitrite를 이용하여 측정하였다.

측정결과 [도 3]에서 보는 바와 같이 Lactobacillus curvatus K031101균주로 발효한 대추 발효물은 발효전 추출물에 비해 3.4배, Lactobacillus sakei K040701균주로 발효 시킨 발효물은 발효전에 비해 아질산염 생성량이 5.9배 증가하였다. 반면 다른 6가지 균주 발효물에 의한 활성화 효능은 0.9~1.5배에 그쳤다.

<4-3> 면역세포 독성평가

세포활성은 MTT assay에 방법에 따라 측정하였다. 상기 실시예 2에서 수득한, 균주에 의한 대추발효물을 대식세포 배양시 첨가하여 배양한 후 세포생존율을 측정하였다. plate의 상등액을 조심스럽게 제거한 후, MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma)) 0.5mg/mL 용액을 200μL씩 첨가하여 4시간 동안 배양하여 formazan을 형성시켰다. 그 후, 상등액을 제거하고 DMSO 200μL를 각 well에 첨가하여 formazan을 녹인 후 540nm에서 흡광도를 측청하였다.

측정 결과 [도 4]에서 보는 바와 같이, 본 발명의 대추발효물은 세포 독성이 없는 것을 확인하였다.

<4-4> cytokine 생산량 측정

상기 실시예 2에서 수득한, 균주에 의한 대추발효물을 대식세포 배양시 첨가하여 배양한 후, 세포배양 상등액 시료를 vortexing하고 원심 분리하여 상층액을 희석없이 적용하였다.

시료와 bead-Ab Mixture의 반응은 4℃ overnight으로 수행하였으며 IL-6, IL-12, TNF-α의 생성량을 측정하기위해 MILLIPLEX MAP Mouse Magnetic Bead Panel 1 kit를 사용하였다. standard, blank 및 control은 matrix로 culture media를 첨가하였다. 반응 결과는 Luminex 100 (Luminex, Austin, TX, USA) 기기로 측정하였다.

[도 5]에서 보는 바와 같이 Lactobacillus curvatus K031101균주로 발효한 대추 발효물은 발효전 추출물에 비해 2.9배, Lactobacillus sakei K040701균주로 발효 시킨 발효물은 발효 전 추출물에 비해 IL-6 생성량이 3.0배 증가하였다. 반면 다른 6가지 균주 발효물에 의한 활성화 효능은 0.5~1.6배에 그쳤다.

[도 6]에서 보는 바와 같이 Lactobacillus curvatus K031101균주 또는 Lactobacillus sakei K040701균주로 발효한 대추 발효물은 발효전 추출물에 비해 IL-12 생성량이 2.0배 증가하였다. 반면 다른 6가지 균주 발효물에 의한 활성화 효능은 1.1~1.7배에 그쳤다.

[도 7]에서 보는 바와 같이 Lactobacillus curvatus K031101균주로 발효한 대추 발효물은 발효전 추출물에 비해 4.6배, Lactobacillus sakei K040701균주로 발효 시킨 발효물은 발효 전 추출물에 비해 TNF-α 생성량이 3.0배 증가하였다. 반면 다른 6가지 균주 발효물에 의한 활성화 효능은 0.9~1.9배에 그쳤다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 신규한 락토바실러스 커바투스 K031101 균주 및 신규한 락토바실러스 사케이 K040701 균주 및 이 균주들을 이용하여 만든 대추 발효물을 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것이다. 좀 더 상세하게는 풍미 향상 및 면역세포 활성화 효과가 있는 대추 발효물을 생산하는 락토바실러스 커바투스 K031101(기탁번호 :KCCM11311P), 락토바실러스 사케이 K040701 (기탁번호 : KCCM11310P) 및 상기 균주들을 이용하여 만든 대추 발효물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 식품, 약학적 조성물, 정장용, 생균제, 사료용 조성물, 발효제품에 관한 것이다.

본 발명의 상기 균주가 생성하는 대추 발효물은 면역관련 세포들의 NO, IL-6, IL-12, TNF-α 생성량을 증가시켜줌으로서, 면역기능을 증진시키는 효과가 있고, 세포 독성도 없어서, 새로운 기능성 식품 및 면역기능 증강용 의약품 제조에 이용할 수 있어, 산업상 이용가능성이 높다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11310P

20100730

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11311P

20100730

Claims

면역 증강효과가 있고 풍미가 향상된 대추 발효물을 생산하는 락토바실러스 사케이 K040701(lactobacillus sakei K040701) KCCM 11310P.
제1항의 균주를 이용하여 만든 대추 발효물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 식품 조성물.
제1항의 균주를 이용하여 만든 대추 발효물을 포함하는 면역 증강용 약학적 조성물.
제1항의 균주를 이용하여 만든 대추 발효물을 유효성분으로 포함하는 정장용 조성물.
제1항의 균주를 이용하여 만든 대추 발효물을 유효성분으로 포함하는 생균제 조성물.
제1항의 균주를 이용하여 만든 대추 발효물을 유효성분으로 포함하는 사료용 조성물.
제1항의 균주를 이용하여 만든 대추 발효물을 유효성분으로 포함하는 발효제품.
제1항의 균주를 이용하여 대추를 발효시키는 단계를 포함하는 풍미가 향상된 대추 발효물의 제조방법.