KR101182606B1 - 신규한 면역증강 효과가 있는 바이셀라 속 균주 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 면역기능 증진 활성이 있는 바이셀라 속 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 면역증강 효과가 있는 바이셀라 비리데센스(Weissella viridescens) K040708(기탁번호 : KCCM11224P), 이의 파쇄물 및 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 식품 조성물, 약학적 조성물, 정장용 조성물, 생균제 조성물, 사료용 조성물, 발효 제품에 관한 것이다.
본 발명의 바이셀라 속 균주는 대식세포의 NO 생성능 및 T-세포 활성을 증가시켜 면역능력을 높여주고 세포 독성이 없기 때문에, 이를 이용한 식품, 약학적, 정장용, 생균제, 사료용 조성물과 발효제품 제조에 효과적이다.

Description

신규한 면역증강 효과가 있는 바이셀라 속 균주 및 이의 용도{Novel Weissella sp. with immune-enhancing activity and its use}
본 발명은 신규한 면역기능 증진 활성이 있는 바이셀라 속 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 면역증강 효과가 있는 바이셀라 비리데센스(Weissella viridescens) K040708(기탁번호 : KCCM11224P), 이 균주와 이의 파쇄물 및 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 식품 조성물, 약학적 조성물, 정장용 조성물, 생균제 조성물, 사료용 조성물, 발효 제품에 관한 것이다.
Weissella 속 균들은 김치와 같은 발효 소채류, 발효식품, 사람과 동물의 소화관, 소시지 등 다양한 자연 환경에서 검출된다.
Weissella 속 균들은 유산균에 포함되는 그램 양성 무포자 형성균이다. 그 대표적 형태는 단간균(short rod)으로 길이는 1.5-2.0 μm 폭은 0.8-1.0 μm 정도 이다. 발효에 의해 에너지를 얻으며 포도당과 같은 당을 기질로 생육하면 이상유산 발효(heterolactic fermentation)를 수행해서 유산과 함께 이산화탄소를 생성하며 균주에 따라 초산 혹은 알코올을 생성한다. Weissella 속은 1993년 Collins 등이 Leuconostoc 속의 다른 종들과 차이를 보이는 Leuconostoc paramesenteroides와 Lactobacillus 속 5종을 모아서 6종으로 새로운 속을 제안함으로써 만들어졌다. (Collins, et al.1993. J. Appl. Bacteriol. 75: 595-603.) 그 후 새로운 종들이 추가되어 현재 14종이 미국 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 에 등재되어 있다. 2010년에 2종이 새롭게 보고되었고(De Bruyne,K. et al. 2010. Microbiol. 60: 1999-2005. / Padonou, et al. 2010. Microbiol. 60: 2193-2198.) 앞으로도 새로운 종들의 발견이 예상되어 그 수는 계속 증가할 것이다.
바이셀라 속 균주에 관한 선행기술에는 바이셀라 속 신균주 바이셀라 코리엔 시스 및 이를 이용한 김치제조방법에 관한 특허(한국공개특허 10-2003-0000638), 건강기능활성을 가지는 바이셀라 시바리아 신균주에 관한 특허(한국등록특허 10- 1014317), 조류 인플루엔자 바이러스 감염억제 효과를 가지는 신균주 바이셀라 시바리아 BLS13에 관한 특허(한국등록특허 10-0954882), 바이셀라 코리엔시스 신균 주에 관한 특허(한국등록특허 10-0860784)등이 있다.
본 발명자들은 면역기능을 증진시킬 수 있는 새로운 방법을 연구하던 중, 본 발명의 바이셀라 속 균주의 면역기능을 매우 증진시키는 효과와 세포 독성이 없는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 면역증강 효과가 있는 바이셀라 비리데센스(Weissella viridescens) K040708(기탁번호 : KCCM11224P)을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바이셀라 비리데센스 K040708, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바이셀라 비리데센스 K040708, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바이셀라 비리데센스 K040708, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 정장용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바이셀라 비리데센스 K040708, 이의 파쇄물 및 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 생균제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바이셀라 비리데센스 K040708, 이의 파쇄물 및 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 사료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바이셀라 비리데센스 K040708, 이의 파쇄물 및 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 발효제품을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 면역증강 효과가 있는 바이셀라 비리데센스(Weissella viridescens) K040708(기탁번호 : KCCM11224P)을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 바이셀라 비리데센스 K040708 , 이의 파쇄물 및 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 바이셀라 비리데센스 K040708, 이의 파쇄물 및 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 바이셀라 비리데센스 K040708, 이의 파쇄물 및 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 정장용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 바이셀라 비리데센스 K040708, 이의 파쇄물 및 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 생균제 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 바이셀라 비리데센스 K040708, 이의 파쇄물 및 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 사료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 바이셀라 비리데센스 K040708, 이의 파쇄물 및 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 발효제품을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 면역증강 효과가 있는 바이셀라 비리데센스(Weissella viridescens) K040708(기탁번호 : KCCM11224P)을 제공한다.
면역이란 생물체 내에서 병원체와 종양 세포 등을 탐지한 다음 죽임으로써 질병으로부터 생명체를 보호하는 기작을 말한다.
면역기능은 내재면역(Innate immune)과 적응면역(adaptive immune) 기능이 있으며, 내재면역은 미생물들과 독소들이 체내로 진입하는 데 성공하였을 때 곧바로 작용하는 면역 기능으로 패턴 인식 수용체가 미생물들 사이에 널리 보존되어 있는 부분을 인지하여 외부의 미생물을 감지하는 방식으로 작용하거나, 손상된 세포들이 방출하는 경고성 신호를 같은 종류의 수용체가 이를 인지하여 미생물의 존재 사실을 감지하는 방식으로 작용한다.
적응면역은 항원의 표식을 기억하는 기능을 의미하는 면역기억(immunological memory)을 비롯한 보다 강력한 면역 반응을 말하며 항원에 특이적이며 항원제시(antigen presentation) 과정을 통한 비자기항원의 인지를 필요로 한다.
본 발명의 바이셀라 비리데센스 K040708는 대식세포의 NO 생성량 및 T-세포 활성 을 증강시켜, 내재면역과 적응면역을 모두 증진시키는 효능이 있다.
이와 같은 본 발명의 효과는 본 발명의 실시예에 잘 나타나 있다.
[표 1]에 나열된 각 균주들을 대식세포에 처리하여, 생성된 NO 량을 측정한 결과, [도 1]에서 볼 수 있듯이 본 발명의 바이셀라 비리데센스 K040708가 다른 균주들에 비해 NO 생성량이 우수한 것을 확인하였다.(실시예 3 참조)
또한 본 발명의 균주와 Lactobacillus casei K071105을 T-세포 활성을 가진 Molt-4 cell(ATCC에서 분양 (cell no. CRL-1582))에 처리한 결과, Lactobacillus casei K071105의 경우, 균주를 처리했을 때 T cell 증식효과가 없었고, 이 균주의 파쇄물을 처리한 실험군 역시 증식효과가 없었다.
반면, 본 발명의 균주를 처리한 경우, 균주 자체를 넣었을 때는 세포 증식 효과가 거의 없었지만, 이 균주의 파쇄물을 처리한 결과, 세포 증식 효과를 관찰할 수 있었다.(실시예 4 및 도 2 참조)
또한 본 발명의 바이셀라 비리데센스 K040708는 세포 독성이 없기 때문에, 식품 또는 의약품에 활용이 용이하다.
이와 같은 본 발명의 효과는 본 발명의 <실시예 5>에 잘 나타나 있다.
MTT essay로 세포 독성을 조사한 결과, [도 3]에 나온 것처럼, LPS와 다른 균주들에 비해서 세포 사멸률이 월등히 낮은 것을 확인하였다. 이로서 본 발명의 바이셀라 비리데센스 K040708 는 다른 균주들에 비하여 면역증강을 위해 사람 또는 동물에게 한 번에 많은 양을 적용할 수 있으므로, 상대적 효과가 월등히 우수함을 확인하였다.
따라서 본 발명의 바이셀라 비리데센스 K040708 , 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 바이셀라 속 균주 자체, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물 군 중 하나 이상을 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화 하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 바이셀라 속 균주 자체,이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물 군 중 하나 이상을 면역기능 증진의 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 바이셀라 속 균주 자체, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물 군 중 하나 이상을 를 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 상기 본 발명의 바이셀라 속 균주 자체, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물 등의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 50 중량%이다.
또한, 본 발명의 바이셀라 속 균주 자체, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물 군 등을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 면역기능 저하로 기인되는 질환의 예방 및 개선에 효과 가 있으며, 상기 면역기능 저하로 기인되는 질환으로는 감기 등의 감염성 질환 및 염증성 질환, 아토피 등의 알러지 질환, 만성피로, 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 알려 진 면역기능 저하로 기인되는 질환은 모두 본 발명에 포함된다.
본 발명은 상기 바이셀라 비리데센스 K040708 , 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 바이셀라 비리데센스 K040708, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 면역기능 증진용 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 경피 투여'란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 본 발명 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말하다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의 정제물를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.
본 발명의 바이셀라 속 균주 자체, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물 등의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 바이셀라 비리데센스 K040708 , 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.01ug 내지 1,000 mg, 가장 바람직하게는 0.1 ug 내지 100 mg일 수 있다. 그러나 상기 본 발명의 바이셀라 속 균주 자체, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물 등의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 바이셀라 비리데센스 K040708 , 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물을 면역기능 증진제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 조성물은 면역기능 저하로 기인되는 질환의 예방 및 치료에 효과가 있으며, 상기 면역기능 저하로 기인되는 질환으로는 감기 등의 감염성 질환 및 염증성 질환, 아토피 등의 알러지 질환, 만성피로, 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 알려진 면역기능 저하로 기인되는 질환은 모두 본 발명에 포함된다.
상기의 면역 증강용 식품, 약학적 조성물은 상기 바이셀라 비리데센스 균주의 기탁번호가 KCCM11224P인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 바이셀라 비리데센스 K040708, 이의 파쇄물 및 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 정장용, 생균제, 사료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바이셀라 속 균주는 면역기능 증진 활성이 있는 균주로 인간 및 동물의 건강 증진을 위한 용도, 즉, 정장용, 생균제 또는 사료용 조성물로 사용될 수 있다. 상기 조성물은 상기 균주 자체, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물 등을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 조성물은 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리 하 여 균주를 제거한 여액(원심분리한 상등액) 등을 포함한다. 조성물 내 상기 바이셀 라 비리데센스 균주의 함량은 조성물의 용도 및 제형에 따라 달라질 수 있다. 본 발명에 따른 정장용 또는 생균제 조성물은 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 바이셀라 비리데센스 K040708, 이의 파쇄물 및 이의 배양물을 약제학적 분야에서 통상적으로 사용하는 담체 및 향료와 혼합하여 정제 (tablet), 트로키(troche), 캡슐(capsule), 엘릭실(elixir), 시럽(syrup), 산제 (powder), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조 및 투여될 수 있다.
담체로는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제 등을 사용할 수 있다. 투여방식은 경구, 비경구 또는 도포법을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 경구투여하는 것이 바람직하다. 또한, 투여용량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 상태 등에 따 라 적절히 선택할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 사료용 조성물은 발효사료, 배합 사료, 펠렛형태 및 사일레지(silage) 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료 는 본 발명의 바이셀라 비리데센스 K040708와 여러 가지 미생물 균 또는 효소들을 첨가함 으로써 유기물을 발효시켜 제조될 수 있으며, 상기 배합사료는 여러 종류의 일반 사료와 본 발명의 바이셀라 비리데센스 K040708를 혼합 하여 제조될 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 발효사료 또는 배합사료를 펠렛형으로 제형화하여 제조될 수 있으며, 사일레지는 청예사료를 본 발명에 따른 바이셀라 비리데센스 K040708로 발효시킴으로서 제조될 수 있다.
본 발명의 바이셀라 비리데센스 K040708, 이의 파쇄물 및 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 발효제품을 제공한다.
발효제품의 제조방법은 통상적으로 원료의 준비, 유산균의 첨가, 발효, 완성된 제품의 회수 등의 과정으로 이루어진다.
원료의 준비 단계는 발효 대상이 되는 재료를 준비하고, 발효가 잘 이루어 지도록 발효 조건을 준비하는 단계이다. 유산균의 첨가는 발효 대상의 양에 따라 적량의 균을 첨가하는 것으로, 본 발명에서는 바이셀라 비리데센스 K040708를 사용 하는 것을 특징으로 한다. 발효는 통상의 발효균의 발효조건에 따라 수행되는 것으로 바람직하게는 25 내지 40℃에서 4 내지 168시간동안 수행된다. 완성된 제품 의 회수는 발효물에서 불필요한 부산물이나 미발효된 재료를 제거하는 것에서부터 저장, 운반을 용이하게 하기 위한 모든 후처리과정 및 포장 등을 포함한다.
상기의 방법에 따라 제조하는 발효제품은 바람직하게는 음료일 수 있으며, 이 음료는 예를 들어, 이 발명의 바이셀라 속 균주를 배양하여 젖산 발효시킨 것에 살균수를 가해서 희석하고 당분, 향료 등을 가한 다음 용기에 충전한 제품을 나타 낸다. 이 음료에는 일반적으로 유산균이 살아 있는 채로 함유되어 있으므로, 음용 후 장(腸) 안에서의 정장작용을 기대할 수 있다.
본 발명은 면역증강 효과가 있는 바이셀라 비리데센스(Weissella viridescens) K040708, 이 균주의 파쇄물 및 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 식품, 약학적 조성물, 정장용, 생균제, 사료용 조성물, 발효 제품 등을 제공한다. 본 발명의 바이셀라 속 균주는 대식세포의 NO 생성능 및 T-세포 활성을 증가시켜 면역능력을 높여주고 세포 독성이 없기 때문에, 이를 이용한 면역 증강용 식품, 약학적 조성물과 정장용, 생균제, 사료용 조성물 그리고 발효제품 제조에 효과적이다.
도 1은 균체에 의한 Raw 264.7 세포의 NO 생성량을 측정한 결과이다. (IFN-γ+ LPS : 대조군)
도 2는 균체에 의한 T세포 활성을 가진 Molt-4 세포의 증식효능을 측정한 결과이다. A는 Lactobacillus casei K071105 및 이의 파쇄물, B는 본 발명의 바이셀라 균(K040708) 및 이의 파쇄물로 처리하여 측정한 결과이다.
도 3은 균체에 의한 Raw 264.7 세포의 세포 사멸률을 측정한 결과이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
본 발명의 균주 스크리닝
<1-1> 시료의 준비
일반 가정에서 채집한 김치 5종, 된장류 3종, 청국장 2종, 지역 막걸리 2종을 취하여 멸균된 식염수에 십진법으로 희석하였다. 희석액을 비엘 평판(BL agar)배지에 도말하여 30℃ 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 여기서 자란 콜로니 중 초콜렛색 환을 내포하는 150여종의 유산균 특이 콜로니를 분리하였다.
<1-2> 시료의 형태학적 분류
분리된 150여종의 균주를 MRS broth에 접종하여 30℃에서 24시간 배양한 후, pH 미터기로 산생성능을 확인하였고, Gram 염색을 하여 Gram 양성의 균을 현미경 상의 형태로 관찰하여 연쇄상구균의 형태를 분류하였다.
<1-3> 선발 균주의 동정
균주의 동정은 (주) 마크로젠 의뢰하였다.
PCR 반응을 위한 primer 는 세균의 염기보존 서열인 16S rDNA를 증폭하기 위하여 27F (5 AGAGTTTGATCMTGGCTCAG - 3) 와 1492R(5-TACGGYTACCTTGTTACGACTT - 3)를 사용하였다. 염기서열 분석 결과 1491개의 염기서열 중 Weissella viridescens 표준균주와 1484개의 염기서열이 동일하여 99% 유사도를 확인할 수 있었다. 그러므로 상기 균주는 Weissella viridescens 균주로 동정되었다.
본 발명자들은 상기 균주를 "Weissella viridescens K040708"으로 명명하였고, 이를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganism)에 2011년 11월 14일자로 기탁하였다(기탁번호: KCCM11224P).
< 실시예 2>
면역 증강 효능이 있는 균체 선별을 위한 유산균 배양
<2-1> 기본배양조건 시험
-72℃의 deep freezer에 보관된 Weissella viridescens K040708 stock 1ml을 급속 해동시켜서 5ml MRS 액체배지에 접종한 후, 37℃ 항온기에서 24시간 배양하였다.
<2-2> 균체 제조 공정
기본배양조건으로 MRS 고체배지에서 37℃ 항온기에서 48시간 배양한 균체를 스크래퍼를 이용하여 회수하고, 이것을 멸균수 30 ml에 모은 후, 원심분리(5,000 rpm, 15 min, 4℃), 하여 균체를 세척한 후 상등액과 침전물을 분리한 후, 이것을 동결건조하여 효능평가에 사용하였다. 효능 평가에 사용된 균주는 상기 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 분리, 동정된 균주 중에서 본 발명의 바이셀라 비리데센스와 동일한 속과 종으로 동정된 다른 균주를 선별하여 NO 생성량 비교를 위한 대조군으로 사용하였다. 또한 생명공학연구소 유전자은행에서 분양받은Lactobacillus reuteri(KCTC 3594)도 NO 생성량 비교를 위한 대조군으로 사용하였다. 또한, T-림프구 증식 효과 측정을 위한 대조균주로는 상기 실시예 1에 기재된 방법과 동일하게 분리, 동정된 균주 중에서 Lactobacillus casei K071105을 대조균주로 사용하였다. 본 발명에서 사용된 균주는 하기 [표 1]에 나타내었다.
전통발효식품으로부터 분리?동정한 Weissella viridescens 와 비교 평가 균주
식별 번호 균주명
KCTC 3594 Lactobacillus reuteri
K040702 Weissella viridescens
K040703 Weissella viridescens
K040708 Weissella viridescens
K060403 Weissella viridescens
K060402 Weissella viridescens
K060501 Weissella viridescens
K070906 Weissella viridescens
K110201 Weissella viridescens
K110202 Weissella viridescens
K071105 Lactobacillus casei
<2-3> 균주 세포벽 수집
수집한 균체를 멸균수 30ml에 풀어주고, 초음파 분쇄기로 균체를 파쇄하였다. 초음파 분쇄기의 조건은 분쇄 조건은 10분간 (on 1s, off 2s), 30% 강도로 실시하였으며, 현미경으로 분쇄 정도를 확인하였다. 이것을 원심분리(5,000 rpm, 15분, 4℃)하여 상등액과 침전물을 분리하여 상등액을 취하여, -72℃의 deep freezer에 얼린 후 동결건조기(-45℃, vaccum gage5)로 동결건조 시켰다.
< 실시예 3>
균체의 NO 생성량 측정
본 실험에 사용된 RAW 264.7 세포는 ATCC로부터 분양받았으며, 10% FBS, 1% Anti-anti를 포함한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)을 배양액으로 사용하여 5% CO2, 37℃ incubator에서 배양하였다. 모든 실험에 사용한 세포는 9~12회 이내의 세포 stock을 이용하여 3회 계대배양 후 실험에 사용하였다.
Nitrite oxide(NO) 측정은 Griess assay법(kiemer&Vollmar, 1997)을 따라 RAW 264.7 세포와 IFN-γ, LPS, sample이 24시간 반응한 상층액을 이용해 측정하였다. 즉 96 well tissue culture palte(TPP)에 배지 100μL와 Griess reagent(Sigma) 100μL를 혼합하여 10분간 shaking 후 ELISA reader로 540nm에서 흡광도를 측정하여 NaNO2(0~200μM/mL) standard curved의 흡광도에 준하여 Nitrite oxide(NO)의 생성능을 측정하였다.
그 결과 [도 1]에서 보는 바와 같이, 본 발명의 Weissella viridescens K040708의 NO 생성량이 다른 균주에 비하여 우수한 것을 확인하였다.
< 실시예 4>
T-림프구 증식 효과 측정
인간 T 세포주인 Molt-4 cell은 ATCC로부터 분양(cell no. CRL-1582)받았으며, 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin이 첨가된 RPM1 1640에서 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한다. 모든 실험에 사용한 세포는 stock을 이용하여 3회 계대배양 후 실험에 사용하였다.
T-세포 활성을 가진 Molt-4 cell을 96 well plate에 2ｘ106cells/ml로 세포를 동일하게 분주하여 2~4시간 동안 배양한 후 여러 농도의 본 발명의 바이셀라 비리데센스 K040708을 배지에 희석하여 첨가하였다. 또한 대조군으로 본 발명자들이 24시간이 지난 후 MTS시약을 넣고 1~4시간 동안 차광된 곳에서 배양하여 수용성인 MTS formazan을 형성하게 한 뒤 ELISA reader로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 균 자체로 처리한 실험은 차이가 별로 없었으나, 균들의 파쇄물로 처리한 결과에서는 [도 2]에 도시된 것처럼, Lactobacillus casei K071105보다 본 발명의 바이셀라 균주 K040708을 첨가하여 배양한 실험군에서 T-림프구의 증식도가 더 높았다.
< 실시예 5>
세포독성 평가
세포독성은 MTT assay를 이용한 세포 사멸율을 측정하였다. 즉 96 well tissue culture palte(TPP)에 RAW 264.7 세포를 1X105cell/well로 분주하여 5% CO2,37℃ 항온기에서 12시간이상 배양 후 IFN-γ를 50ng/mL 처리한 후 다시 5% CO2,37℃ 항온기에서 1시간 반응하였다. 여기에 LPS(1μg/mL)와 121℃에서 15분간 멸균처리한 시료(50μg/mL)를 첨가한 후, 5% CO2, 37℃ 항온기에서 24시간 배양하였다. IFN-γ, LPS, 시료는 10% FBS, 1% Anti-anti를 포함한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)을 이용해 희석하여 사용하였다. 이후 상층액은 Nitrite oxide(NO) 생성능 측정에 사용하였고 96 well tissue culture palte에서 배지는 모두 제거한 후 MTT(5mg/mL)로 제조하여 1% Anti-anti를 포함한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)에 10%로 희석하여 호일로 plate를 감싼 후 5% CO2, 37℃ 항온기 에서 4시간 반응 시킨 후 형성된 formazan을 DMSO 200μL로 녹여 10분간 진탕 후 ELISA reader로 540nm에서 흡광도를 읽어 세포 사멸율을 측정하였다.
그 결과 [도 3]에서 보는 바와 같이, 본 발명의 Weissella viridescens K040708는 균체에 의한 세포 독성이 LPS 및 다른 균주에 비하여 월등히 낮은 것을 확인하였다. 이로서 본 발명의 Weissella viridescens K040708는 LPS 및 다른 균주에 비하여 면역증강을 위하여 사람 또는 동물에 한 번에 많은 양을 적용할 수 있으므로, 상대적 효과가 월등히 우수함을 확인하였다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 면역증강 효과가 있는 바이셀라 비리데센스(Weissella viridescens) K040708, 이 균주의 파쇄물 및 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 식품 조성물, 약학적 조성물, 정장용 조성물, 생균제 조성물, 사료용 조성물, 발효 제품 등을 제공한다. 본 발명의 바이셀라 속 균주는 대식세포의 NO 생성능 및 T-세포 활성을 증가시켜 면역능력을 높여주고 세포 독성이 없기 때문에, 이를 이용한 식품, 약학적, 정장용, 생균제, 사료용 조성물과 발효제품 제조에 효과적이다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11224P 20111116

Claims (8)

  1. 면역증강 효과가 있는 바이셀라 비리데센스(Weissella viridescens) K040708(기탁번호 : KCCM11224P).
  2. 제1항의 바이셀라 비리데센스 균주, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 식품 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항의 바이셀라 비리데센스 균주, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 정장용 조성물.
  6. 제1항의 바이셀라 비리데센스 균주, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 생균제 조성물.
  7. 제1항의 바이셀라 비리데센스 균주, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 사료용 조성물.
  8. 제1항의 바이셀라 비리데센스 균주, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 발효제품.
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KR20180054029A (ko) * 2016-11-14 2018-05-24 전북대학교산학협력단 웨이셀라 시바리아로부터 유래한 세포외 다당류를 포함하는 면역력 증강을 위한 조성물

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