KR20180054029A

KR20180054029A - 웨이셀라 시바리아로부터 유래한 세포외 다당류를 포함하는 면역력 증강을 위한 조성물

Info

Publication number: KR20180054029A
Application number: KR1020160151313A
Authority: KR
Inventors: 이상명; 오은영
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2016-11-14
Filing date: 2016-11-14
Publication date: 2018-05-24

Abstract

웨이셀라 시바리아, 특히 웨이셀라 시바리아 JW15 균주로부터 유래한 세포외 다당류는 면역력 증강을 위한 식품 조성물, 약학적 조성물 및 사료용 조성물에 유용하게 이용될 수 있다. 상기 조성물은 MERS 바이러스, 지카바이러스, 뎅기열 바이러스, 및 신종플루 등 신·변종 바이러스에 의한 감염병을 예방, 개선, 또는 치료하는데 효과적이다.

Description

웨이셀라 시바리아로부터 유래한 세포외 다당류를 포함하는 면역력 증강을 위한 조성물{Composition for improving immunity comprising exopolysaccharide derived from Weissella cibaria}

웨이셀라 시바리아 (Weissella cibaria: W. cibaria)로부터 유래한 세포외 다당류(exopolysaccharide: EPS)를 유효 성분으로 포함하는 면역력 증강을 위한 건강기능식품용 조성물, 약학적 조성물 및 사료용 조성물에 관한 것이다.

웨이셀라 시바리아 균주는 유산균에 포함되는 그람 양성, 무포자 형성, 카탈라아제 음성 간균으로, 김치를 포함한 여러 발효식품에서 분리된다. 유산균 등 발효 중에 축적되는 미생물들은 세포외 다당류 (exopolysaccharide: EPS)를 생합성 하는데, 세포외 다당류는 세포벽의 일부로서 세포벽 주위에 협막을 형성하거나 세포벽 외부에 점질 형태로 생성되는 다당류이다.

유산균에 의해 생성된 EPS는 식용 다당류로서 유제품의 점도를 높이고 안정성 및 보습력 등에 다양하게 작용하여, EPS 생성 유산균에 대한 관심이 커지고 있다. 유산균 중 비피도박테리아 (Bifidobacteria) 유래 EPS, 락토바실루스 델브류키 아종 불가리쿠스 (Lactobacillus delbrueckii subsp . bulgalicus), 및 락토바실루스 헬베르티쿠스 변종 주구르티 (Lac . helverticus var . jugurti) 유래 EPS가 항암효과를 가지고 있다고 보고된바 있다. 스트렙토코시 (Streptococci)의 EPS는 항궤양 효과가 있는 것으로 보고되었다. 그러나 아직까지 W. cibaria JW15 균주의 EPS의 효과에 대해서는 보고된 적이 없다.

일 양상은 웨이셀라 시바리아로부터 유래한 세포외 다당류를 유효 성분으로 포함하는 면역력 증강을 위한 건강기능식품용 조성물을 제공한다.

다른 양상은 웨이셀라 시바리아로부터 유래한 세포외 다당류를 유효 성분으로 포함하는 면역력 증강을 위한 약학적 조성물을 제공한다.

다른 양상은 웨이셀라 시바리아로부터 유래한 세포외 다당류를 유효 성분으로 포함하는 면역력 증강을 위한 사료용 조성물을 제공한다.

일 양상은 웨이셀라 시바리아로부터 유래한 세포외 다당류를 유효 성분으로 포함하는 면역력 증강을 위한 식품용 조성물을 제공한다.

상기 웨이셀라 시바리아는 유산균에 포함되는 그람 양성, 무포자 형성, 카탈라아제 음성 간균으로, 일반적으로 김치를 포함한 여러 발효식품에서 분리된다. 상기 웨이셀라 시바리아는 JW15 균주를 포함한다.

상기 "JW15"는 김치에서 분리한 웨이셀라 시바리아에 속하는 균주 (strain)의 하나로서, 국립농업과학원 농업유전자원센터 기탁번호 KACC 91811P의 균주를 포함한다. JW15는 그람양성의 구상 (coccoid) 또는 막대 (rod) 형태의 균으로 혐기와 호기 상태에서 모두 증식할 수 있다. 내산성과 담즙내성의 특징을 가지고 있으며 Caco-2세포에 대한 부착성도 우수하다.

상기 "세포외 다당류(exopolysaccharide: EPS)"는 미생물로부터 주변환경에 분비되는 당 잔기로 구성된 폴리머를 의미한다. EPS는 그 점액성 특성으로 인하여 세균의 막 형태의 집합체인 바이오 필름을 구성하는데 주요한 기능을 가지며, 바이오 필름의 물리 화학적 특성을 결정한다. EPS는 주로 다당류와 단백질로 구성될 수 있으나, DNA, 지질 및 부식물질(humic substance) 등의 다른 거대 분자 또한 포함하여 구성될 수 있다. 일반적으로 미생물은 광범위한 다기능성 다당류를 합성할 수 있으며, 그에 따라 미생물로부터 생산된 EPS의 기능 내지 종류 또한 매우 다양할 수 있다.

상기 EPS는 웨이셀라 시바리아를 포함하는 특정 미생물로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 "유래"의 의미는 해당 미생물로부터 생합성된 EPS를 미생물로부터 직접적으로 분리 또는 정제한 것뿐만 아니라, 당업계의 통상적인 유전자 조작 기술 상식에 따라 해당 미생물의 유전자가 삽입된 다른 미생물로부터 생산된 EPS, 및 해당 미생물로부터 직접적으로 분리 또는 정제된 EPS를 참조하여 이와 동등하거나 유사한 특성을 갖는 EPS를 인공적으로 제조한 것 모두를 포함하는 의미로 해석되어야 한다.

상기 "면역력 증강"은 면역에 관련된 세포 및 인자들의 활성을 증가시켜 개체의 면역력을 증가시키는 것을 의미한다. 상기 면역에 관련된 세포는 CD4+ T 세포, 대식세포, 수지상세포, 및 자연살해세포를 포함한다. 상기 면역에 관련된 인자는 TNF-α, IL-6, IFN-γ, 및 IL-17를 포함한다.

상기 "유효 성분"은 그 성분이 활성을 나타내기에 유효한 양으로서 조성물에 포함되는 것을 의미한다. 상기 유효한 양은 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환의 중증도, 개체의 연령, 체중, 건강, 성별, 개체의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 상기 세포외 다당류와 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 식품 또는 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

상기 식품용 조성물은 건강기능식품용 조성물을 포함하며, 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능식품의 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 건강기능식품은 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 환제, 캅셀제, 현탁액, 유제, 시럽제, 침제, 액제, 엑스제 등의 일반적인 제형으로 제조될 수도 있고, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 젤리, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등의 임의의 건강식품 형태로 제조될 수도 있다. 상기 건강식품의 제제화를 위해 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 사용할 수 있으며, 제조하고자 하는 제형의 제조에 당해 기술분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다. 상기 첨가제로서 각종 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 이외에도 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 첨가제 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 ~ 10 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.

상기 건강기능식품용 조성물 중의 상기 다당류의 함량은 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 포함할 수 있으며, 음료로서 제조될 경우 100 mL를 기준으로 0.02 내지 10 g의 비율로 함유할 수 있다.

상기 음료는 상기 와이셀라 시바리아에서 분리한 EPS 이외의 다른 성분을 더 포함할 수 있으며, 통상적으로 음료에 사용되는 다양한 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 더 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물로는 단당류(예: 포도당, 과당 등), 이당류(예: 말토즈, 수크로즈 등), 다당류(예: 덱스트린, 시클로덱스트린 등)와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 함유될 수 있다. 또한, 향미제로서 천연 향미제(예: 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예: 사카린, 아스파탐 등)를 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 음료 100 mL 당 일반적으로 약 1 내지 20g으로 함유될 수 있다.

본 발명자들은 상기 와이셀라 시바리아에서 분리한 EPS를 이용한 실험에서, EPS를 처리한 여러 면역세포의 활성이 증가하고, 면역과 관련한 사이토카인의 농도가 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 상기 와이셀라 시바리아에서 유래한 EPS는 개체의 면역력을 증가시키고, 면역력 저하 또는 면역 불균형에 기인한 면역관련 질환, 암, 및 세균성 및 바이러스성 질환에 대한 예방 및 개선효과를 갖는 건강기능식품에 이용될 수 있다.

다른 양상은 웨이셀라 시바리아로부터 유래한 EPS를 유효 성분으로 포함하는 면역력 증강을 위한 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 면역력 증강 효과를 갖는 바이러스성 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 약제학적 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적 제형은 경구 투여제제, 주사제, 좌제, 경피 투여제제, 및 경비 투여제제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 임의의 제형으로 제제화되어 투여될 수도 있고, 액제, 유제, 현탁제, 엑스제, 또는 시럽제와 같은 액상 제제 및 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 또는 환제와 같은 고형 제제를 포함한 경구 투여용 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 각각의 제형으로 제제화 시, 각각의 제형의 제조에 필요한 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 첨가제를 부가하여 제조할 수 있다. 대표적으로 경구 투여용 고형 제제로 제제화 시 상기 부형제로서 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 및 방부제 중에서 1 종 이상을 선택하여 사용할 수 있다. 상기 부형제는 약제학적으로 허용 가능한 것은 모두 가능하며, 구체적으로 희석제로는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘 또는 탈크, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필셀룰로오스를 포함한다. 또한, 붕해제로는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산나트륨, 폴라크릴린칼륨, 또는 크로스포비돈을 포함한다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 경구 투여용 액상 제제로 제제화 시 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 상기 감미제로는 백당, 과당, 솔비톨, 또는 아스파탐, 안정제로는 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 베타-사이클로덱스트린, 백납, 또는 잔탄검, 보존제로는 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 또는 솔빈산칼륨이 바람직하다. 또한, 고형 및 액상 경구제제의 첨가제로는 향료, 비타민류, 및 항산화제 중에서 1 종 이상을 선택하여 사용할 수 있다. 상기 성분 이외에도 공지의 첨가제로서 미각을 돋구기 위하여, 매실향, 레몬향, 파인애플향, 허브향 등의 천연향료, 천연과즙, 클로로필린, 플라보노이드 등의 천연색소, 과당, 벌꿀, 당알코올, 설탕과 같은 감미성분, 또는 구연산, 구연산 나트륨과 같은 산미제를 혼합하여 사용할 수도 있다. 상기 통상적인 약제학적 제형은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 방법에 따라 당업자가 적절하게 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분으로서 성인을 기준으로 1일 총 투여량이 상기 EPS가 약 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg, 바람직하게는 약 1 mg/kg 내지 1 g/kg이 되도록 임의로 수회 나누어서 투여할 수 있다. 상기 투여량은 투여 경로, 질병의 진행 정도, 성별, 나이, 체중 등에 따라, 또는 전문가의 임상적 판단에 따라 적절히 증감될 수 있다. 상기 본 발명에 따른 약학 조성물은 면역력 증강 효과를 위해 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명자들은 상기 와이셀라 시바리아에서 분리한 EPS를 이용한 실험에서, EPS를 처리한 여러 면역세포의 활성이 증가하고, 면역과 관련한 사이토카인의 농도가 증가하는 것을 확인하였다. 구체적으로, 상기 와이셀라 시바리아에서 분리한 EPS가 수지상세포를 활성화 시켜 항원제시세포의 기능을 향상시키는 것을 확인하였다. 수지상세포는 체내에 침입한 병원체 (세균, 바이러스 등)를 분해하여 그 일부분을 조력 T 세포에 제시함으로써 세포매개성 면역반응과 체액성 면역반응을 유도하는 매우 중요한 세포이다. 또한 수지상세포는 암세포에 대한 면역 치료 백신으로의 기능을 가지고 있음이 알려져 있다 (Banchereau et al., Nature Reviews Immunology 5, 296-306 (April 2005)). 따라서 상기 와이셀라 시바리아에서 유래한 EPS는 수지상세포를 활성화 시키는 백신 (세균, 바이러스, 암세포)의 면역활성 보조제 (adjuvant) 또는 수지상세포 활성화 유도 배지 조성물에 이용될 수 있다.

또한, 본 발명자들은 상기 와이셀라 시바리아에서 분리한 EPS를 이용한 실험에서 EPS가 자연살해세포를 활성화 시키고 암세포에 대한 세포독성 활성을 증가시키는 것을 확인하였다. 자연살해세포는 바이러스와 같은 세포내 기생 병원체가 감염된 세포를 찾아내 죽이는 기능뿐만 아니라 체내에서 발생하는 비정상적인 암세포를 찾아내어 제거하는 항암활성이 뛰어난 선천성 면역 세포이다. 또한 이러한 특성을 활용한 자연살해세포 항암치료에 대한 가능성이 활발히 연구되어 왔다 (Smyth et al., Nature Reviews Cancer 2, 850-861 (November 2002)). 암환자의 자체적인 면역력을 증강시키는 것을 목적으로 하는 치료를 종양 면역 요법 (cancer immunotherapy)이라 하며, 최근 이를 위한 면역 항암제가 많이 연구되고 있다. 면역 항암제는 특정 암에 국한되지 않고 다양한 암에 치료 효과를 발휘할 수 있으며, 기존 항암제에 비해 부작용이 현저히 낮아질 수 있다는 것이 장점이다. 현재 면역 항암제로서 시중에 키트루다, 옵디보 등 여러 의약품이 출시되어 있으며, 이들 약품은 T세포, NK 세포 등 면역 세포의 활성을 높여 암세포를 공격하게 하는 작용을 한다. 따라서 상기 와이셀라 시바리아에서 유래한 EPS는 개체의 면역력을 증가시키고, 암의 예방 및 치료효과를 갖는 약학적 조성물, 자연살해세포를 활성화 시키는 면역활성 보조제 (adjuvant) 또는 자연살해세포 활성화 유도 배지 조성물에 이용될 수 있다.

아울러, 현재 바이러스성 질병에 대한 특이적 예방 및 치료 수단은 일부 바이러스성 질병을 제외하면 없는 실정이며, 특히 신종 바이러스에 대한 특이적인 예방 및 치료법 개발은 매우 오랜 시간과 노력이 소요된다. 따라서 현재 바이러스성 질환을 예방 치료하기 위한 가장 효율적인 수단은 개체의 면역력을 증가시키는 것이며, 면역력을 증가시키는 것으로 바이러스성 질병을 포함한 여러 면역관련질병을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다. 따라서 상기 와이셀라 시바리아에서 유래한 EPS는 개체의 면역력을 증가시키고, 면역 관련 질환 및 바이러스성 질환에 대한 예방 및 치료효과를 갖는 약학적 조성물에 이용될 수 있다.

다른 양상은 웨이셀라 시바리아로부터 유래한 EPS를 유효 성분으로 포함하는 면역력 증강을 위한 사료용 조성물을 제공한다.

상기 사료용 조성물이 사료용 첨가제로서 이용될 경우, 상기 조성물은 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립형태로 제조될 수 있다. 상기 사료 첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 상기 사료용 조성물이 사료로서 이용될 경우, 상기 조성물은 통상의 사료 형태로 제제화될 수 있으며, 통상의 사료 성분을 함께 포함할 수 있다. 상기 사료 첨가제 및 사료는 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩, 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양 보충제, 소화 및 흡수 향상제, 성장 촉진제 등을 더 포함할 수 있다.

상기 사료 첨가제는 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 사료 첨가제는 탑 드레싱으로서 또는 이들을 동물 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구 제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 사료 첨가제를 동물 사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용 가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토오스, 수크로오스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 사료 첨가제는 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 사료 첨가제는 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.

상기 사료는 동물의 식이 욕구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기 곡분을 포함할 수 있다. 이러한 단백질-함유 곡분은 통상적으로 옥수수, 콩 곡분, 또는 옥수수/콩 곡분 믹스로 주로 구성되어 있다.

또한, 상기 사료 첨가제 및 사료는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다. 상기 사료 첨가제는 침주, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.

본 발명의 사료 또는 사료 첨가제는 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있다. 상기 포유류로서 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치 동물, 및 실험용 설치 동물 뿐만 아니라, 애완 동물(예: 개, 고양이) 등에게 사용할 수 있으며, 상기 가금류로서 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 및 메추라기 등에도 사용할 수 있고, 상기 어류로서 송어 등에 이용될 수 있다.

상기 설명에서 이미 언급된 용어 또는 요소에 대해서는 따로 언급하는 것이 없는한 이미 상술한 바와 같다.

웨이셀라 시바리아로부터 유래한 세포외 다당류는 면역력 증강을 위한 조성물에 유용하게 이용될 수 있으며, 특히 MERS 바이러스, 지카바이러스, 뎅기열 바이러스, 및 신종플루 등 신·변종 바이러스에 의한 감염병을 예방, 개선, 또는 치료하는데 효과적이다.

도 1은 웨이셀라 시바리아 JW15 균주로부터 분비된 EPS로 인하여 점액성 콜로니가 형성된 것을 나타낸다.
도 2는 웨이셀라 시바리아 JW15 균주로부터 EPS를 정제하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 3은 웨이셀라 시바리아 JW15 균주로부터 정제된 EPS의 세포 독성을 실험한 결과를 나타낸다.
도 4는 CD4⁺T 세포, 대식세포(CD11b⁺), 수지상세포(CD11c⁺), 및 NK 세포에 웨이셀라 시바리아 JW15 균주로부터 정제된 EPS를 처리하였을 때의 세포 활성화를 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는 세포 배양액에 웨이셀라 시바리아 JW15 균주로부터 정제된 EPS를 처리한 경우 TNF-α, IL-6, IFN-γ, IL-17의 생성을 확인한 결과이다.
도 6은 NK 세포에 웨이셀라 시바리아 JW15 균주로부터 정제된 EPS를 처리하였을 때의 NK 세포의 활성의 증가를 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 웨이셀라 시바리아 ( Weissella cibaria : W. cibaria ) JW15 균주로 부터 세포외 다당류 (exopolysaccharide: EPS)의 분리

1. W. cibaria JW15에 의한 EPS 생성 확인

수크로스 한천 배지 (1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% 다이포타슘 포스페이트, 0.5% 다이암모늄 시트레이트, 5% 수크로스, 1.5% 한천, pH 7.0)에 W. cibaria JW15 균주를 획선 도말한 후 37℃에서 36시간 동안 배양하였다. 그 결과, 도 1과 같이 점액성 콜로니를 통해 EPS의 생성을 확인할 수 있었다. 이렇게 확인된 EPS는 프로테이네이즈 및 뉴클리에이즈를 처리하여 추출하였다.

2. W. cibaria JW15로부터 EPS의 분리

수크로스 브로스에 W. cibaria JW15의 단일 콜로니를 접종하고 37℃ 진탕배양기에서 48시간 동안 배양하여 EPS를 생성시켰다. 트리클로로아세트산 (Trichloroacetic acid: TCA)을 4% (w/v)가 되도록 첨가하고 4℃에서 2시간 배양하였다. 10,000×g, 25분, 4℃로 원심분리하였다. 상층액을 회수하고 상층액에 냉각된 95% EtOH를 2배 부피로 첨가한 후, 4℃에서 15시간 동안 침전시켰다. 심분리 (10,000×g, 25분, 4℃)를 하고, 상층액은 버리고 펠렛을 3차 증류수로 풀어주었다. DNase와 RNase를 50 μg/ml로 처리하고 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 프로테이네이즈 K (Proteinase K)를 200 μg/ml로 처리 후 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 배양 후 냉각된 95% EtOH을 2배 부피로 첨가하여 4℃에서 15시간 동안 침전시키고 원심분리 (10,000×g, 25분, 4℃)하였다. 상층액은 버리고 펠렛을 3차 증류수로 풀고, 얼린 후 동결건조 하여 정제된 EPS를 얻었다. 도 2는 상기와 같이 EPS를 정제하는 과정을 나타내는 모식도이다.

실시예 2. W. cibaria JW15 유래 EPS에 의한 마우스 면역세포 활성화 측정

1. 세포독성 평가

Balb/c 마우스에서 비장을 분리한 후 비장에서 비장세포를 분리하여 96 웰 플레이트에 1.0 X 10⁶/200 μl씩 분주하였다. W. cibaria JW15에서 분리한 EPS를 50, 100, 200, 400 μg/ml로 처리하고 LPS를 200 ng/ml로 처리한 후 37℃, CO₂5% 인큐베이터에서 24시간, 48시간동안 배양하였다. 프로피디움 아이오다이드(PI) 염색을 하고 유세포 분석기를 통하여 세포의 형광을 측정하였다. 그 결과 도 3과 같이 400μg/ml까지 세포에 독성이 없음을 확인할 수 있었다.

2. 면역세포 활성화 평가

Balb/c 마우스에서 분리한 비장세포를 96 웰 플레이트에 1.0 X 10⁶/200 μl씩 분주한 후 EPS를 10, 50, 100 μg/ml로, LPS를 200 ng/ml로 처리하였다. 24시간동안 비장세포를 배양한 후 CD4⁺ T 세포, 대식세포, 수지상세포, 자연살해세포의 표면 마커인 CD4, CD11b, CD11c, CD3, CD49b, CD69, CD86, CD80 항체를 비장세포에 염색하였다. 그리고 자연살해세포의 표면 마커인 CD3와 CD49b 항체를 비장세포에 염색한 후 IC Fixation buffer을 통해 세포를 고정시키고 자연살해세포 내 그랜자임 B(Granzyme B)와 퍼포린(Perforin) 항체를 염색하였다. 염색이 끝난 비장세포는 유세포 분석기를 통하여 확인하였다.

그 결과, 도 4와 같이 CD4⁺T 세포의 표면 마커인 CD69, 대식세포에서의 CD86, 수지상세포에서의 CD80와 CD86, NK 세포에서의 CD69, 세포 내 그랜자임 B(Granzyme B)와 퍼포린(Perforin)이 증가함을 확인하였다

3. 면역 사이토카인 생성 평가

Balb/c 마우스의 비장세포에 EPS를 10, 50, 100 μg/ml로, LPS를 200 ng/ml로 처리한 후 24시간동안 배양하고 그 세포배양액을 회수하였다. 이후 ELISA 키트를 이용하여 회수한 세포배양액에서의 TNF-α, IL-6, IFN-γ, IL-17의 생성을 확인하였다.

그 결과, 도 5에서와 같이 EPS의 농도가 증가함에 따른 TNF-α, IL-6, IFN-γ, IL-17의 생성을 확인할 수 있었다.

4. 자연살해세포 활성 실험

Balb/c 마우스에서 분리한 비장세포를 96 웰 플레이트에 1.0 X 10⁶/200μl씩 분주한 후 EPS를 10, 50, 100μg/ml로, LPS를 200ng/ml로 처리하였고 22시간동안 배양하였다. 자연살해세포의 표적세포인 Yac-1 세포를 칼복시플루오레세인 숙시니미딜 에스터 (CFSE) 염색을 하고 비장세포와 5:1 비율이 되도록 2.0 X 10⁵/100μl씩 비장세포에 추가하였다. EPS를 22시간 처리한 비장세포와 CFSE 염색을 한 Yac-1 세포를 2시간 동안 공동배양을 한 후, PI 염색을 하고 유세포 분석기를 통해 Yac-1 세포의 사멸을 확인하였다.

그 결과, 도 6에서와 같이, EPS에 의해 자연살해세포의 표적세포인 Yac-1 세포의 사멸이 증가하였고 이 결과로 EPS가 자연살해세포를 활성화 시킴을 알 수 있었다.

Claims

웨이셀라 시바리아 (Weissella cibaria : W. cibaria)로부터 유래한 세포외 다당류(exopolysaccharide: EPS)를 유효 성분으로 포함하는 면역력 증강을 위한 건강기능식품용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 웨이셀라 시바리아는 JW15 균주인 건강기능식품용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 면역력 증강은 CD4+ T 세포, 대식세포, 수지상세포, 또는 자연살해세포의 활성을 증가시키는 것을 포함하는 건강기능식품용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 면역력 증강은 TNF-α, IL-6, IFN-γ, 또는 IL-17의 생성을 증가시키는 것을 포함하는 건강기능식품용 조성물.
웨이셀라 시바리아 (Weissella cibaria : W. cibaria)로부터 유래한 세포외 다당류(exopolysaccharide: EPS)를 유효 성분으로 포함하는 면역력 증강을 위한 약학적 조성물.
청구항 5에 있어서, 바이러스성 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
청구항 5에 있어서, 암의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
웨이셀라 시바리아 (Weissella cibaria : W. cibaria)로부터 유래한 세포외 다당류(exopolysaccharide: EPS)를 유효 성분으로 포함하는 면역력 증강을 위한 사료용 조성물.