KR20150031922A - 신규한 와이셀라 시바리아 jw15 균주 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주 및 이를 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 면역 증강 활성이 있는 배양물을 생산하는 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 KACC91811P 균주, 이의 파쇄물 및 배양물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 식품, 정장용 조성물, 생균제, 사료용 조성물, 발효제품에 관한 것이다.
본 발명의 신균주를 유효성분으로 포함하는 조성물은 면역관련 세포들의 NO, NF-kB, IL-1β 및 TNF-α의 생성량을 증가시켜줌으로써 면역기능을 증진시키는 효과가 있고, 세포 독성도 없어서 새로운 기능성 식품 및 면역기능 증강용 의약품 제조에 효과적이다.

Description

신규한 와이셀라 시바리아 JW15 균주 및 이의 용도{Novel Weissella cibaria JW15 strain and use the same}

본 발명은 면역활성 능력을 가지고 있는 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 KACC91811P 신균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

항생제를 가축의 사료에 혼합하여 축산업에 사용하면서 설사와 같은 가축 질병의 예방과 치료, 성장 촉진 및 사료효율 개선 등의 생산성이 향상되었으며 축산농가의 소득 증가에 기여하였다.

그러나 항생제의 이러한 효과에도 불구하고 내성 균주의 출현, 축산물 내 잔류 항생제의 확인 및 동물에서 사람으로 세균의 내성 전이로 인한 인체 안전성 문제로 논란이 일기 시작했으며, 이로 인해 항생제의 사용을 제한하는 추세이며, 축산물에 대한 항생제 잔류검사도 강화되고 있다. 최근 EU 집행위원회(European commission)는 동물의 성장 촉진제로 사료에 첨가되는 항생제의 사용을 금지하였다. 한국에서는 축산업에서의 항생제 총사용량이 2001년에는 1,595톤, 2008년에는 1,211톤 및 2009년에는 999톤으로 감소하고 있는 추세이며 (국립수의과학검역원), 특히 2009년에는 고도 내성을 일으키는 인수공통 항생제 (e.g. 바시트라신, 클로르테트라사이클린, 콜리스틴, 린코마이신, 네오마이신, 옥시테트라사이클린 및 페니실린)를 동물사료로 사용하는 것을 금지하였다. 또한, 구충제와 항콕시디움을 제외한 항생제는 2012년부터 동물사료로 전면 사용 금지될 예정이다.

이러한 항생제 사용의 제한 및 금지 조치에 따라 항생제의 사용이 줄어들면서, 항생제를 대체할 물질에 대한 관심이 높아지고 있다. 현재 사용 중인 항생제 대체제는 유기산제 (산성화제, acidifiers), 생균제 (probiotics), 프리바이오틱스 (prebiotics), 사료 첨가용 복합효소제 (enzymes), 면역 조절제 (immunomodulators ), 식물 추출물질 (plant extracts) 및 광물질 등이 있으나, 이 중 생균제 (probiotics)가 가장 주목을 받고 있다.

생균제 (probiotics)는 일반적으로 건강에 유익한 생균 식품 첨가제로 정의되었으나 (Lilly and Stillwell, Science 147:747-748, 1965), 최근 들어 Salminen 등 (Int. J. Food Microbiol. 44:93-106, 1998)에 의해 인체나 동물의 건강을 증진시키기 위하여 고안된 식품 및 사료 또는 식이 첨가제에 들어있는 살아있는 미생물 제제라고 정의되고 있다. 생균제로 가장 많이 이용되고 있는 세균은 유산균으로서 락토바실러스 (Lactobacillus)와 스트렙토코쿠스 (Streptococcus) 등이 있다.

생균제로서 갖추어야 할 바람직한 조건은 안전해야 하고, 산과 담즙에 대한 내성이 있어야 하며, 장관 상피에 부착능이 있어야 한다. 또한, 병원성균에 대하여 길항활성이 있어야 하고 면역 증강 효과가 있어야할 뿐만 아니라 내성 유전자를 가지고 있다 하더라도 항생제 내성의 전이가 되지 말아야 한다.

유산균은 장내 미생물 균형에 도움을 주고 항균 활성, 면역 활성 및 항암 활성 등 많은 유용한 점이 있음에도 불구하고, 현재 생균제로서 사용되고 있는 유산균의 대부분은 정확한 생균제로서의 평가가 이루어지지 않은 경우가 다수이며, 타 유산균의 도용을 억제할 수 있는 시스템 개발도 전무한 실정이다. 또한, 가축용 생균제는 가축의 장내에서 분리하여 개발하는 것이 가장 이상적이나 많은 생균제로 사용되는 균주가 그러하지 못하다.

한국등록특허 제936,015호 한국등록특허 제954,882호

이에 본 발명자들은 면역기능을 증진시킬 수 있는 새로운 방법을 연구하던 중 본 발명의 와이셀라 시바리아 JW15 균주에 면역 기능을 증진시키는 효과가 있을 뿐만 아니라 내산성 및 내담즙성을 나타내며 장내 유해 미생물 생육 억제 활성이 있어 생균제로서도 적합하다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 면역활성능을 가지고 있는 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 KACC91811P 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 KACC91811P 균주, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 KACC91811P 균주, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역활성을 가지고 있는 식품 첨가용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 KACC91811P 균주, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역활성을 가지고 있는 정장용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 KACC91811P 균주, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역활성을 가지고 있는 생균제 조성물을 제공하는 것이다.

나아가 본 발명의 목적은 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 KACC91811P 균주, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역활성을 가지고 있는 사료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 면역활성능을 가지고 있는 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 KACC91811P 균주를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균주는 면역활성능력의 지표가 되는 산화질소(NO), NF-kB, IL-1β 및/또는 TNF-α의 활성을 촉진 또는 증가시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 KACC91811P 균주, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 KACC91811P 균주, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역활성을 가지고 있는 식품 첨가용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 KACC91811P 균주, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역활성을 가지고 있는 정장용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 KACC91811P 균주, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역활성을 가지고 있는 생균제 조성물을 제공한다.

나아가 본 발명은 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 KACC91811P 균주, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역활성을 가지고 있는 사료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 신규한 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주 및 이를 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 면역 증강 활성이 있는 배양물을 생산하는 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 KACC91811P 균주, 이의 파쇄물 및 배양물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 식품, 정장용 조성물, 생균제, 사료용 조성물, 발효제품에 관한 것이다.

본 발명의 신균주를 유효성분으로 포함하는 조성물은 면역관련 세포들의 NO, NF-kB, IL-1β 및 TNF-α의 생성량을 증가시켜줌으로써 면역기능을 증진시키는 효과가 있고, 세포 독성도 없어서 새로운 기능성 식품 및 면역기능 증강용 의약품 제조에 효과적이다.

도 1은 본 발명의 신균주인 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15의 전자현미경 사진을 나타낸 것이다(10,000배)
도 2는 본 발명 신균주의 내산성시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명 신균주의 내담즙성시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명 신균주의 내열성시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명 신균주의 산화질소(NO) 생성량을 분석한 결과이다.
도 6은 본 발명 신균주의 NFκ-B 생성량을 분석한 결과이다.
도 7은 본 발명 신균주의 IL-1β 생성량을 분석한 결과이다.
도 8은 본 발명 신균주의 TNF-α 생성량을 분석한 결과이다.
도 9는 동물실험에서 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes )정맥주사 후 3일째의 체중증가율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 10은 동물실험에서 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes )정맥주사 후 3일째의 간장내로 이행한 세균수를 측정한 그래프이다.
도 11은 동물실험에서 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes )정맥주사 후 3일째의 혈청내 TNF-α를 측정한 그래프이다.

본 발명은 면역증강 효과가 있는 신규한 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주를 제공한다는데 그 특징이 있다.

면역이란 생물체 내에서 병원체와 종양 세포 등을 탐지한 다음 죽임으로써 질병으로부터 생명체를 보호하는 기작을 말한다.

면역기능은 내재면역(Innate immune)과 적응면역(adaptive immune) 기능이 있으며, 내재면역은 미생물들과 독소들이 체내로 진입하는데 성공하였을 때 곧바로 작용하는 면역 기능으로 패턴 인식 수용체가 미생물들 사이에 널리 보존되어 있는 부분을 인지하여 외부의 미생물을 감지하는 방식으로 작용하거나 손상된 세포들이 방출되는 경고성 신호를 같은 종류의 수용체가 이를 인지하여 미생물의 존재 사실을 감지하는 방식으로 작용한다.

적응면역은 항원의 표식을 기억하는 기능을 의미하는 면역기억(immunological memory)을 비롯한 보다 강력한 면역 반응을 말하며 항원에 특이적인 항원제시(antigen presentation) 과정을 통한 비자기항원의 인지를 필요로 한다.

한편, 본 발명자들은 이러한 면역활성을 증진시킬 수 있는 새로운 제품을 찾기 위해 연구를 진행하던 중 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주가 면역활성능력의 지표가 되는 산화질소(NO), NF-kB, IL-1β 및 TNF-α의 활성을 촉진 또는 증가시킬 수 있으며, 내산성, 내담즙성, 장내 정착능, 병원성 억제능도 있어 생균제로도 유용한 특징이 있다는 사실을 확인하였다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15균주가 생균제로서 적합한지 알아보기 위하여 내산성, 내담즙성, 내열성, 장내 정착능 및 병원성 억제능이 있는지를 확인한 결과, 본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주는 pH 3, pH 4에서도 우수한 내산성의 특성을 나타내었으며, 0.3%의 oxgall에서도 우수한 내담즙성 결과를 나타내었다.

또한, 본 발명의 JW15균주를 70℃에서 5분, 10분간 열처리 후 생존성을 비교한 결과 우수한 내열성을 가지고 있음을 알 수 있었고, Caco-2 cell을 이용한 장관내 정착능 검사에서도 상업용 균주인 LGG균보다는 미흡하지만, 우수한 장관내 정착능을 보였으며, 다양한 병원성 세균에 대하여 병원성 세균의 억제능이 있음을 알 수 있었다(도 2 내지 4 및 표 2 내지 3 참조).

본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주에 면역활성 기능이 있는지 여부를 알아보기 위하여 in vitro 상에서 산화질소(NO), NF-κB, IL-1β 및 TNF-α를 측정한 결과, 본 발명의 신균주는 상업용 균주인 LGG보다 6배 이상 높은 NO생성량을 보였으며, NFκB, IL-1β, TNF-α 측정결과에서도 모두 LGG균에 비해 월등히 뛰어난 면역활성 능력을 보임을 알 수 있었다(도 6 내지 8 참조).

나아가 본 발명자들은 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주가 실제로 동물에서 면역활성 기능이 있는지를 알아보기 위하여 NC(Negative control; 음성대조군), PC(Positive control; 양성대조군), JW15(Weissella cibaria JW15균주 투여군), LGG(Lactobacillus rhamnosus GG균주 투여군)의 4군으로 나눈 후 2주간 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주를 경구투여한 후, 대표적인 병원성 세균인 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)를 정맥주사하고 3일째 체중과 투여전 체중과의 체중증가율(weight gain, %)을 비교한 결과, 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes) 단독주사군인 PC군(90.7%)에 비해 JW15 투여군은 93.9%를 나타내어 LGG균보다도 우수한 체중증가율을 나타냄을 알 수 있었다(도 9 참조).

부검 후 측정한 마우스 간장과 비장의 무게 측정결과, 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes) 감염에 의해 현저히 증가된 PC군의 간장무게(58.751 ± 2.990)에 비해, JW15 투여군은 유의적인 무게감소(54.557 ± 0.769)를 나타냄을 알 수 있었다(표 4 참조).

또 간장조직을 무균적으로 homogenizer로 균질화시켜 간장조직으로 이행된 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes) 균수를 측정한 결과, JW15투여군은 5.52 Log cfu/g의 세균수를 나타내어 PC군의 6.45 Log cfu/g에 비해 약 1/10의 낮은 세균수를 나타내었다. 이것은 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주의 병원성세균에 대한 높은 면역활성결과, 간장으로의 병원성 세균 체내이행을 억제한 것으로 판단되었다(도 10 참조). 부검 후 채혈한 혈액으로부터 면역활성지표인 사이토카인 TNF-α를 측정한 결과에서도, JW15균주 투여군은 2178.45 pg/ml로서, PC군이나 LGG투여군에 비해서도 매우 높은 유의적인 면역활성결과를 보임을 알 수 있었다(도 11 참조).

이러한 결과를 통해 본 발명자들은 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주에 면역활성능력의 지표가 되는 산화질소(NO), NF-kB, IL-1β 및 TNF-α의 활성을 촉진 또는 증가시킬 수 있어 면역증강 효과가 있음을 알 수 있었다.

본 발명에서 상기 “활성”이란 생체 내에서 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg), 즉, 자연성(natural) Treg 와 적응성(adaptive) Treg 세포를 모두 포함하는 Treg 세포가 가지는 모든 기작이 촉진 또는 증진되는 것을 말하며, 생체 내의 면역반응이 정상상태를 유지하도록 면역조절작용, 예컨대 면역억제반응이 촉진 또는 증진되는 것을 말한다.

그러므로 본 발명은 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 상기 “면역질환”은 포유류 면역계의 구성성분들이 포유류의 병리상태를 야기하거나, 매개하거나 또는 기타 공헌하는 질환을 의미한다. 또한, 면역 반응의 자극 또는 중단이 그 질병의 진행에 보상적인 효과를 갖는 질환을 모두 포함할 수 있는데, 본 발명에서는 과민성 면역반응으로 인해 야기되는 질환들을 포함할 수 있다. 이러한 면역질환의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 자가면역질환; 염증성질환; 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection)질환 등을 모두 포함할 수 있다.

또한, 모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 비자기(non-self) 항원들에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라고 한다.

그러나 이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 이러한 과정에 의해 발생되는 질환을 “자가면역질환“이라고 한다.

또한, “염증성 질환”이란 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 말한다.

한편, 성공적인 장기 이식을 위해서는 이식할 세포 및 장기에 대한 수혜자의 면역 거부반응을 극복해야 한다. 이식면역거부반응의 주요 매개체는 T 세포로서, 이식편(graft)에 발현되어져 있는 주조직적합성분자(major histocompatibility complex, MHC)를 T 세포 수용체(T cell receptor)가 인지함으로써 면역반응이 유도되어 이식거부반응이 발생되게 된다. 따라서 이러한 이식면역거부반응을 감소시키기 위해 면역억제제들이 사용되고 있는데 이러한 면역억제제들의 공통된 목적은 이식편에 대한 T 세포-매개 면역반응을 억제하는 것이며, 최근에는 조절 T 세포를 이용하여 면역반응을 억제함으로써 이식거부질환을 치료하려는 방법이 시도되고 있다.

구체적으로 본 발명에서 적용할 수 있는 상기 면역질환의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 베체트병, 다발성 근육염/피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루프스, 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 류마티스 관절염, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈, 궤양성 대장염 등을 포함할 수 있다.

또한 본 발명에서 상기 “치료”란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 “치료”란 용어는“치료하는”이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 면역질환의 “치료”또는 “치료요법”은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 면역질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,

(2) 면역질환의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,

(3) 면역질환을 경감시킴.

(4) 면역질환의 재발을 예방함, 및

(5) 면역질환의 증상을 완화함(palliating)

본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주 자체, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물 등의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 제조된 약품 총 중량 대비 0.01 내지 50 중량%로 포함될 수 있으며, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주 자체, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다.

또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 ‘경피 투여'란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 본 발명 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말하다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의 정제물를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다.

나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주 자체, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물 등의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.01ug 내지 1,000 mg, 가장 바람직하게는 0.1 ug 내지 100 mg일 수 있다. 그러나 상기 본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주 자체, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물 등의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물을 면역기능 증진제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명은 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.

예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주 자체, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물 군 중 하나 이상을 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주 자체, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물 군 중 하나 이상을 면역기능 증진의 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.

또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주 자체, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물 군 중 하나 이상을 첨가하여 제조할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물 중 상기 본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주 자체, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물 등의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 50 중량%이다.

또한, 본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주 자체, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물 군 등을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액의 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

본 발명은 상기 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주, 이의 파쇄물 및 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 정장용, 생균제, 사료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주는 면역기능 증진 활성이 있는 균주로 인간 및 동물의 건강 증진을 위한 용도, 즉 정장용, 생균제 또는 사료용 조성물로 사용될 수 있다. 상기 조성물은 상기 균주 자체, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물 등을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 조성물은 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(원심분리한 상등액) 등을 포함한다. 조성물 내 상기 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주의 함량은 조성물의 용도 및 제형에 따라 달라질 수 있다. 본 발명에 따른 정장용 또는 생균제 조성물은 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를들어, 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주, 이의 파쇄물 및 이의 배양물을 약제학적 분야에서 통상적으로 사용하는 담체 및 향료와 혼합하여 정제 (tablet), 트로키(troche), 캡슐(capsule), 엘릭실(elixir), 시럽(syrup), 산제(powder), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조 및 투여될 수 있다.

담체로는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제 등을 사용할 수 있다. 투여방식은 경구, 비경구 또는 도포법을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 경구투여하는 것이 바람직하다. 또한, 투여용량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불확성율 및 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 상태 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 사료용 조성물은 발효사료, 배합사료, 펠렛형태 및 사일리지 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료는 본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주와 여러 가지 미생물 균 또는 효소들을 첨가함으로써 유기물을 발효시켜 제조될 수 있으며, 상기 배합사료는 여러 종류의 일반 사료와 본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 를 혼합하여 제조될 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 발효사료 또는 배합사료를 펠렛형으로 제형화하여 제조될 수 있으며, 사일리지는 청예사료를 본 발명에 따른 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주로 발효시킴으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주, 이의 파쇄물 및 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 발효제품을 제공한다.

발효제품의 제조방법은 통상적으로 원료의 준비, 유산균의 첨가, 발효, 완성된 제품의 회수 등의 과정으로 이루어진다.

원료의 준비 단계는 발효 대상이 되는 재료를 준비하고, 발효가 잘 이루어지도록 발효 조건을 준비하는 단계이다. 유산균의 첨가는 발효 대상의 양에 따라 적량의 균을 첨가하는 것으로, 본 발명에서는 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주를 사용하는 것을 특징으로 한다. 발효는 통상의 발효균의 발효조건에 따라 수행되는 것으로 바람직하게는 25 내지 40℃에서 4 내지 168시간동안 수행된다. 완성된 제품의 회수는 발효물에서 불필요한 부산물이나 미발효된 재료를 제거하는 것에서부터 저장, 운반을 용이하게 하기 위한 모든 후처리과정 및 포장 등을 포함한다.

상기의 방법에 따라 제조하는 발효제품은 바람직하게는 음료일 수 있으며, 이 음료는 예를들어, 이 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주를 배양하여 젖산 발효시킨 것에 살균수를 가해서 희석하고 당분, 향료 등을 가한 다음 용기에 충전한 제품을 나타낸다. 이 음료에는 일반적으로 유산균이 살아있는 채로 함유되어 있으므로 음용 후 장(腸) 안에서의 정장작용을 기대할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

신균주인 와이셀라 시바리아 JW15 의 분리

<1-1> 본 발명의 신균주 분리 및 사용한 배지

본 발명의 신균주인 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15는 충북 청원군 소재의 ㈜지수농산 업체에서 공급 받은 김치에서 분리하였다. 멸균된 거즈에 멸균된 가위로 100g 정량한 김치를 잘게 잘라 김치즙을 내어 시료를 준비하였다. 김치로부터 다양한 유산균의 분리를 위해 MRS, m-enterococcus, PES 배지를 사용하여 준비한 김치즙 1ml를 희석액A 9ml에 10-fold dilution을 하여 37℃에서 48시간 배양하여 유산균을 선발하였다.

병원성억제능과 박테리오신 실험에 사용된 지시균은 KCTC(The Korean Collection for Type Cultures)와 KCCM(Korean Culture Center of Microorganisms)에서 분양 받아 사용하였으며, 대장균(E. coli), 장염균(Salmonella enteritidis), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)는 BHI medium(brain heart infusion, Difico, USA)를 이용하였고, 락토바실러스 사케(Lactobacillus sake)는 MRS 배지(Difco, USA)에서 37℃로 배양하였다.

<1-2> 본 발명 신균주의 형태학적 동정

본 발명자들은 실시예 <1-1>에서 분리한 균주의 형태학적 특징을 확인하기 위하여, 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope)을 사용하여 10,000배에서 관찰하였다.

그 결과, 본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15는 표 1과 같이 무아포 단간균의 그램양성세균으로 통성혐기성세균이었으며, 운동성, 카타라제, 가스생성능을 갖고 있지 않았다. 또한, 본 발명의 신균주는 갈락토오즈(Galactose), 글루코오즈(Glucose), 프럭토오즈(Fructose), 만노즈(Mannose) 등의 당분해 능력을 갖고 있었으며, 아라비노오스(Arabinose), 만니톨(Mannitol), 솔비톨(Sorbitol), 락토오즈(Lactose) 등의 당분해 능력을 갖고 있지 않음을 알 수 있었다(표 1 및 도 1 참조).

<1-3> 본 발명 신균주의 분자생물학적 동정

실시예 <1-1>에서 분리한 균주를 동정하기 위하여 생화학적 형태 및 특성을 Bergey's Manual of Determinative bacteriology에 따라 조사하였으며, API 50 CHL kit(Biom, Lyan, France)를 사용하여, 탄수화물 이용성 등을 조사하였다. 그리고 최종적인 미생물학적 균주 동정을 위하여, 본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주의 16S rRNA 염기서열을 분석하여 기존에 알려진 미생물과의 상동성을 분석하였다.

NCBI의 BLAST program을 이용하여 16S ribosomal RNA sequence 분석결과, 본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15균주는 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria)와 1465개의 염기서열 중 1462개가 동일하여 99%의 상동성을 나타냄을 알 수 있었으며, 상기 균주는 기존에 존재하지 않는 신규한 균주임을 확인함으로써, 2013년 7월 11일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하여 기탁번호 KACC 918111P를 부여받았다.

이하 본 발명에서는 상기 동정한 신균주를 “와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15”로 명명하였다.

< 실시예 2>

본 발명에서 분리 동정한 와이셀라 시바리아 ( Weissella cibaria ) JW15 균주의 생균제로서의 특성 조사

<2-1> 내산성

본 발명자들은 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주가 생균제로서 적합한지 알아보기 위하여 먼저 균주를 MRS배지에서 접종한 다음 37℃에서 17시간 배양한 후, 0.05M 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer)를 HCl로 보정하여 만든 pH 7.0, 3.0, 2.5, 2.3, 2.0 완충용액 속에 각각 10⁷ cfu/ml 정도로 접종하였다.

상기 용액을 37℃에서 2시간 정치배양한 후, 각 농도별로 1ml 희석액을 MRS에 도말 다음 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 나타난 집락수를 계수함으로써 각각의 산성 pH에 대한 내성을 확인하였다.

그 결과, 본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주는 pH 3, pH 4에서도 우수한 내산성의 특성을 나타냄을 알 수 있었다(도 2 참조).

<2-2> 내담즙성

본 발명자들은 담즙산(bile acid)에 대한 분리균주의 내성여부를 확인하기 위하여, 분리된 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주를 MRS 배지에 접종하고, 37℃에서 17시간 배양한 후, 10진 희석을 하여 생균수를 측정하였다. 이것을 담즙산인 Oxgall이 0%, 0.3%씩 첨가된 MRS 한천배지에 도말하여 37℃에서 48시간 동안 배양하고, 생존한 집락을 계수하여 내담즙성을 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주는 0.3%의 oxgall이 포함된 배지에서도 견딜 수 있는 우수한 내담즙성이 있음을 알 수 있었다(도 3 참조).

<2-3> 내열성

또한, 본 발명자들은 본 발명의 신균주에 내열성이 있는지 여부를 알아보기 위하여 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주를 MRS 배지에 접종하여 37℃에서 17시간 배양 한 후 10진 희석을 하여 생균수를 측정하고, 배양액을 70℃에 각각 5, 10분간 노출시킨 후 MRS배지에 도말하여 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 초기 생균수와 열 처리 후 형성된 집락 수의 차이를 분석하여 내열성 균주 여부를 확인하였다.

그 결과, 70℃의 온도에서 5분, 10분간 열처리 후 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주의 생존성을 측정한 결과 10분간 열처리 하였을 때에도 약 4 Log CFU/ml의 생존률을 보여 본 발명의 신규주에 우수한 내열 효과가 있음을 알 수 있었다(도 4 참조).

<2-4> 장내 정착능

본 발명자들은 본 발명의 신균주가 장관내에 정착하는 능력이 있는지를 알아보기 위하여, 장관세포 유래인 Caco-2 세포를 사용하여 장관 정착능 시험을 실시하였다. 대조군으로는 상업용 균주인 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) GG를 사용하였다. Caco-2 세포는 한국세포주은행에서 분양받았으며, FBS와 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하고 5%의 CO₂를 공급해주면서, 37℃에서 배양하였다.

T75 플라스크에 세포를 분주하고 격일마다 배지를 교환해주었다. 배양한 세포를 37℃에서 트립신(trypsin)을 10분간 처리한 후, 혈구계산판 (hemocytometer)으로 세포 수를 계측하여 Caco-2 세포 농도를 계산하였다. 멸균된 커버글라스를 하나씩 깔아둔 6-well에 세포의 농도가 1.0× 10⁵cell/ml가 되도록 분주 후 완전한 단일 분자막(monolayer)이 형성될 때까지 배양하였다. Phosphate-buffered saline (PBS; pH 7.2)으로 Caco-2 세포 단일 분자막이 형성된 6-웰을 3번 세척하였다.

본 발명의 실험에 사용한 균주를 PBS로 3회 세척하여 배지성분을 제거하였다. DMEM 0.5ml와 혼합한 균주(0.5ml; 1.0 X 10⁹ CFU/ml in PBS)를 6-웰에 접종하고 CO₂ incubator에서 37℃, 3시간 배양하였다. 3시간 배양 후 멸균된 PBS로 5회 세척하고 커버글라스를 메탄올(Methanol)로 5분간 고정 후 그람염색(Gram stain)을 하였다. 그람염색 후 커버글라스를 1,000배에서 광학현미경으로 관찰한 후, 10개의 Caco-2 세포에 부착한 균주의 평균 값을 계산하였다.

그 결과, 본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주는 시중 판매되고 있는 상업용 균주인 LGG균보다는 미흡하지만, 우수한 장관내 정착능을 보임을 알 수 있었다(표 2 참조).

<2-5> 병원성 억제능 검사

본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주가 잘 알려진 병원성 세균의 성장을 억제할 수 있는지 알아보기 위하여, Agar spot assay를 변형하여 병원성 억제능을 검사하였다. 병원성 억제능에 사용한 지시균으로는 대장균(E. coli) KCTC 1682, 장염균(Salmonella enteritidis) KCCM 12021, 포도상구균(Staphylococcus aureus) KCTC 1621, 리스테리아 모노사이토제니스( Listeria monocytogens) KCTC 3569의 4균주를 사용하였다.

각 지시균을 10ml Brain heart infusion broth(BBL, USA)에 접종한 후, 37℃에서 24시간 호기 배양하였으며, 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주는 MRS broth에서 37℃, 17시간 배양하였다.

MRS agar에 페이퍼디스크를 멸균된 핀셋으로 떨어뜨린 후, 그 위에 배양된 유산균들을 20㎕ 점적하고, 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양된 유산균 각 agar에 7ml BHI agar(0.7%) 또는 MRS agar(0.7%)에 혼합된 병원균을 푸어링(pouring)하여 37℃에서 24시간 혐기배양 한 후 억제환을 측정하였다. Spot 주위의 형성된 억제환의 직경을 mm 단위로 측정하여 병원균의 억제정도를 평가하였다.

그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이 장염균(Salmonella enteritidis) KCCM 12021 균주(+++), 리스테리아 모노사이토제니스( Listeria monocytogens) KCTC 3569 균주(++)에 대해 높은 억제능력을 나타내었으며, 대장균(E. coli) KCTC 1682(+), 포도상구균(Staphylococcus aureus) KCTC 1621(+) 균주에 대해서도 억제능력을 나타냄을 알 수 있었다.

따라서 상기의 결과로 보아 본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15균주는 생균제용 균주로서 매우 적합한 우수균주임을 확인할 수 있었다.

< 실시예 3>

본 발명에서 분리 동정한 와이셀라 시바리아 ( Weissella cibaria ) JW15 균주의 면역활성 분석

<3-1> 실험을 위한 세포 배양 및 시료 처리

본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주의 면역활성을 측정하기 위하여 먼저 한국세포주은행으로부터 분양 받은 RAW 264.7 macrophage cell은 10% fetal bovine serum(FBS; Gibco Laboratories)과, 100unit/mL의 스트렙토마이신, 페니실린(Gibco Laboratories)이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM; PAA, Austria) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였다.

와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주에 의한 마크로파지(macrophage)의 사이토카인(cytokine) 및 nitrite oxide(NO) 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 세포를 12 well plate의 각 well당 5.0 X 10⁵cell/ml가 되도록 분주하여 2시간 안정화 시킨 후, 새 배지로 교체하여 주었다. 그 후 1.0 X 10⁸ cfu/mL 농도로 맞춘 유산균 시료를 100 μl 첨가해 최종 1.0 X 10⁷cfu/mL 농도로 48시간 배양하였다. 염증 반응 모델은 각 well 당 1㎍/mL lipopolysaccharide(LPS; Sigma, USA)를 처리하였으며, 음성 대조군(Negative control)은 phosphate buffered saline(PBS; pH 7.2)을 처리하였다. 면역활성의 비교균주로는 상업용균주로 잘 알려진 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) GG를 사용하였다.

NF-κB 측정을 위한 RAW BLUE cell은 10% fetal bovine serum(FBS; Gibco Laboratories)와, 100 unit/mL의 스트렙토마이신과 페니실린(Gibco Laboratories)이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM; PAA, Austria) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였다. 4 ~ 5회 계대 배양 후 Zeocin 100mg/mL (invivogen, USA)을 처리하여 배양 하였다.

염증 반응 모델은 각 well 당 100ng/mL lipopolysaccharide (LPS; Sigma, USA)를 처리하였으며, 비교균주로 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) GG를 사용하였다.

<3-2> Nitric oxide ( NO ) 분석

RAW 264.7 세포를 5.0 X 10⁵cell/ml로 접종하여 유산균과 양성대조군으로 처리한 LPS, 음성대조군으로 처리한 PBS 배양액을 각각 회수하여 Griess reagent system (Promega, USA)을 사용하여 NO를 측정하였다.

96-웰 플레이트에 배양액 50㎕를 넣고 Griess reagentⅠ(NED solution)과 Griess reagentⅡ (Sulfaniliamide solution)을 동량으로 섞어 넣고, 10분간 반응 후 30분 이내에 microplate reader(Molecular Devices, USA)를 이용하여 광밀도(optical density) 540nm에서 측정하였다. 산화질소(NO)의 농도는 아질산나트륨의 표준곡선 (0-100μM)을 이용하여 계산하였다.

그 결과, 본 발명의 신균주인 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 는 상업용 균주인 LGG보다 6배 이상 높은 NO 생성량을 보임을 알 수 있었다(도 5 참조).

<3-3> NF -κB 분석

본 발명의 신균주인 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15에 의한 마크로파지의 NF-κB 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 먼저, 세포를 96 웰 플레이트의 각 웰당 5.0 X 10⁴cell/ml가 되도록 분주하여 2시간 안정화 시킨 후, 새 배지로 교체하여 주었다. 그 후 1.0 X 10⁷cfu/mL 농도로 맞춘 본 발명의 신균주 시료를 100 μl 첨가해 최종 1.0 X 10⁶cfu/mL 농도로 24시간 배양하였다. 양성대조군(Positive control)은 웰 당 100ng/mL의 lipopolysaccharide (LPS; Sigma, USA)를 처리한 뒤 NF-κB 생성량을 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주는 상업용 균주인 LGG균에 비해 약 17 배 정도 높은 면역활성을 보임을 알 수 있었다(도 6 참조).

<3-4> IL -1β 및 TNF -α 분석

본 발명자들은 IL-1β 및 TNF-α를 측정하기 위하여 먼저 RAW 264.7 세포를 5.0 X 10⁵cell/ml로 접종한 후 세포가 안정되면 본 발명의 신균주와 LPS 처리 후 48시간 후에 배양액을 회수하였다. IL-1β와 TNF-α 생산량은 IL-1β, TNF-α ELISA kit (eBioscience, San Diego)를 이용하여 측정하였다. Sandwich ELISA 방법으로 측정하였으며, 각 시료는 3회 반복으로 시행하였다.

측정 대상에 따라 각 1차 항체 원액을 coating 완충용액에 해당 농도가 되도록 희석하여, 96-웰 마이크로플레이트(microplate)에 웰당 100㎕씩 분주 한 후, 4℃에서 밤새(overnight) 반응하였다. 5회 세척 후 Assay Diluent 200㎕씩 넣고 1시간 동안 상온에 두어 블로킹(blocking)하였다. 각 웰을 세척용 완충용액으로 5회 세척한 후 시료 및 스탠다드(Standard)를 적당량 희석하여 100㎕씩 분주하였다.

4℃에서 밤새 반응 시킨 후 세척용 완충용액으로 5회 세척 후 아비딘(Avidin)이 결합된 2차 항체를 Assay Diluent에 희석하여 웰당 100㎕씩 처리하여 1시간 동안 상온에서 반응하였다. 5회 세척 후에 Avidin-HRP 용액을 100㎕씩 분주하여 30분간 상온에서 반응시킨 후 7회 세척하였다. TMB 용액을 웰당 100㎕씩 처리 한 후 15분 동안 상온에서 반응 후 2N H₂SO₄용액을 웰당 50㎕씩 첨가함으로써 완료하였으며 흡광도는 450nm 파장에서 흡광기(microplate reader)를 사용하여 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주는 IL-1β, TNF-α 측정 결과에서 모두 시중 판매되고 있는 LGG균에 비해 월등히 뛰어난 면역활성 능력을 보임을 알 수 있었다(도 7 및 8 참조).

따라서 본 발명의 신균주인 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15는 생균제로서 적합함은 물론이고 면역활성 능력이 매우 우수한 유산균주임을 알 수 있었다.

< 실시예 4>

본 발명에서 분리 동정한 와이셀라 시바리아 ( Weissella cibaria ) JW15 균주의 동물실험을 통한 면역활성 분석

<4-1> 실험동물 및 실험군 편성

본 발명자들은 실시예 3의 결과를 통해 본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주가 in vitro 상에서 면역활성이 뛰어남을 확인하였고 이러한 효과가 실제 동물에서도 있는지를 알아보기 위하여 in vivo 동물실험을 통한 면역활성 실험을 준비하였다.

동물실험에 사용한 실험동물은 7주령의 암컷 BALB/c 마우스(나라바이오텍)를 구입하여, 1주일 동안 사육시설에서 순화과정을 거친 후 본 실험에 사용하였다. 12시간 간격으로 명암의 환경을 제공해주었으며, 물과 사료(나라바이오텍, 설치류 사료)는 전 실험기간 동안 자유급식하였다.

총 4개의 군으로 실험군을 편성하였는데, NC(Negative control; 음성대조군), PC(Positive control; 양성대조군), JW15(Weissella cibaria JW15균주투여군), LGG(Lactobacillus rhamnosus GG균주 투여군)의 4군으로 편성하였으며, 동물수는 각 군당 5마리를 사용하였다.

<4-2> 실험용 유산균 및 리스테리아 모노사이토제니스 ( Listeria monocytogenes ) 균주 배양

본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주와 LGG균은 MRS broth에서 17~18 h 37℃에서 배양 후, 계대배양을 거쳐, 균수를 측정한 후 희석하여 경구투여용 시료를 제작하였다. 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes )는 BHI broth에 24h 37℃, 24시간 배양 후 1 ~ 2 번 계대배양 하고 균수를 측정한 후 희석하여 정맥주사용 접종시료를 제작하였다.

<4-3> 리스테리아 모노사이토제니스 접종 모델 동물모델에서의 면역활성 분석

리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes) 균을 접종하기 전에, NC, PC군은 10% 탈지유(skim milk)를 포함하는 PBS 200㎕를, JW15군, LGG군은 10% 탈지유(skim milk)를 포함하는 유산균 200㎕(1.0×10⁹)를 매일 2주동안 경구투여하였다. 그 후 PC, JW15, LGG군은 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes) 배양액 (3.0 × 10⁶ cfu/ml) 100μl를 꼬리정맥에 정맥주입하였다. 그러나 음성대조군인 NC는 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes) 대신에 PBS 100㎕를 정맥주입하였다. 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)를 정맥주입 후 3일째에 체중을 측정한 후, 투여전 체중과 비교하여 체중증가율(weight gain, %)을 계산하였으며, 모든 마우스를 안락사시켜, 부검을 실시하였다. 그 후 복대정맥을 통해 혈액을 채취한 후, 간장과 비장의 무게를 측정하였다. 또 간장조직은 무균적으로 homogenizer로 균질화시켜 희석한 후 BHI agar에 도말하여 간장조직으로 이행된 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes) 균수를 측정하였다. 채혈한 혈액은 원심분리후 혈청을 분리하여, 면역활성지표인 사이토카인 TNF-α를 측정하였다.

2주간 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주를 경구투여한 후, 대표적인 병원성 세균인 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)를 정맥주사하고 3일째 체중과 투여전 체중과의 체중증가율(weight gain, %)을 비교한 결과, 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes) 단독주사군인 PC군(90.7%)에 비해 JW15 투여군은 93.9%를 나타내어 LGG균보다도 우수한 체중증가율을 나타냄을 알 수 있었다(도 9 참조).

부검 후 측정한 마우스 간장과 비장의 무게 측정결과, 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes) 감염에 의해 현저히 증가된 PC군의 간장무게(58.751 ± 2.990)에 비해, JW15 투여군은 유의적인 무게감소(54.557 ± 0.769)를 나타냄을 알 수 있었다(표 4 참조).

또 간장조직은 무균적으로 homogenizer로 균질화시켜 간장조직으로 이행된 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes) 균수를 측정한 결과, JW15투여군은 5.52 Log cfu/g의 세균수를 나타내어 PC군의 6.45 Log cfu/g에 비해 약 1/10의 낮은 세균수를 나타내었다. 이것은 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주의 병원성세균에 대한 높은 면역활성결과, 간장으로의 병원성 세균 체내이행을 억제한 것으로 판단되었다(도 10 참조).

부검 후 채혈한 혈액으로부터 면역활성지표인 사이토카인 TNF-α를 측정한 결과에서도, JW15균주 투여군은 2178.45 pg/ml로서, PC군이나 LGG투여군에 비해서도 매우 높은 유의적인 면역활성결과를 보임을 알 수 있었다(도 11 참조).

따라서 이상의 모든 실험결과를 종합적으로 판단한 결과, 김치로부터 분리된 본 발명의 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 균주는 생균제(probiotics)용 균주로서의 특성을 보유한 것 이외에도, 매우 우수한 면역활성 균주임을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

농업생명공학연구원 KACC91811 20130711

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel Weissella cibaria JM15 strain and use the same <130> PN1307-248 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1474 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Weissella cibaria JW15 16S RNA sequence <400> 1 ttctgtcaca ttagacggct ggctcccgaa ggttacccca ccggctttgg gtgttacaaa 60 ctctcatggt gtgacgggcg gtgtgtacaa gacccgggaa cgtattcacc gcggcgtgct 120 gatccgcgat tactagcgat tccgacttca tgtaggcgag ttgcagccta caatccgaac 180 tgagacgtac tttaagagat tagctcaccc tcgcgggttg gcaactcgtt gtatacgcca 240 ttgtagcacg tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct 300 tcctccggtt tgtcaccggc agtctcacta gagtgcccaa ctgaatgctg gcaactagta 360 ataagggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa 420 ccatgcacca cctgtcacct tgtccccgaa gggaacgctc catctctgga gttgtcaagg 480 gatgtcaaga cctggtaagg gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg 540 cttgtgcggg tccccgtcaa ttcctttgag tttcaacctt gcggtcgtac tccccaggcg 600 gagtgcttaa tgcgttagct gcggcactta agggcggaaa ccctcaaaca cctagcactc 660 atcgtttacg gtgtggacta ccagggtatc taatcctgtt tgctacccac actttcgagc 720 ctcaacgtca gttacagtcc agaaagccgc cttcgccact ggtgttcttc catatatcta 780 cgcatttcac cgctacacat ggagttccac tttcctctac tgcactcaag tcatccagtt 840 tccaaagcaa ttcctcagtt gagctgaggg ctttcacttc agacttaaat aaccgtctgc 900 gctcgcttta cgcccaataa atccggataa cgcttggaac atacgtatta ccgcggctgc 960 tggcacgtat ttagccgttc ctttctggta agataccgtc acacattgaa cagttactct 1020 caatgtcatt cttctcttac aacagtgttt tacgagccga aacccttcat cacacacgcg 1080 gcgttgctcc atcaggcttt cgcccattgt ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg 1140 agtatgggcc gtgtctcagt cccattgtgg ccgatcagtc tctcaactcg gctatgcatc 1200 atcgtcttgg tgagccatta cctcaccaac taactaatgc accgcgggac catctcttag 1260 tgatagcaga accatctttt aagtagcaac catgcggttg ctattgttat acggtattag 1320 catctgtttc caaatgttat cccctgctaa gaggtaggtt tcccacgtgt tactcacccg 1380 ttcgccactc tttgcaatgt ccatcgtcat atctgagcaa gctcttcaaa tcagttgaac 1440 cacaaagcgt tcgactgcat gtatagctgc cgca 1474

Claims (7)

1. 면역활성능을 가지고 있는 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 KACC91811P 균주.
2. 제1항에 있어서,
   상기 균주는 면역활성능력의 지표가 되는 산화질소(NO), NF-kB, IL-1β 및/또는 TNF-α의 활성을 촉진 또는 증가시키는 것을 특징으로 하는 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 KACC91811P 균주.
3. 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 KACC91811P 균주, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
4. 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 KACC91811P 균주, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역활성을 가지고 있는 식품 첨가용 조성물.
5. 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 KACC91811P 균주, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역활성을 가지고 있는 정장용 조성물.
6. 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 KACC91811P 균주, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역활성을 가지고 있는 생균제 조성물.
7. 와이셀라 시바리아(Weissella cibaria) JW15 KACC91811P 균주, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역활성을 가지고 있는 사료용 조성물.

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