CN111328285B - 乳酸菌、来源于该乳酸菌的天然免疫活化剂、感染症预防/治疗剂和饮食品 - Google Patents

乳酸菌、来源于该乳酸菌的天然免疫活化剂、感染症预防/治疗剂和饮食品 Download PDF

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Abstract

本发明的课题在于提供以具有高天然免疫活化能力的乳酸菌、该乳酸菌的产生物、处理物等作为有效成分的天然免疫活化剂、含有其的感染症预防/治疗剂、饮食品，还在于提供含有来源于该乳酸菌的有效成分的感染症预防/治疗剂、使用该乳酸菌发酵得到的饮食品，通过下述方案解决了课题：一种天然免疫活化剂，其是以属于希腊魏斯氏菌(Weissella hellenica)的乳酸菌、该乳酸菌的死菌、该乳酸菌的产生物或该乳酸菌的处理物作为有效成分的天然免疫活化剂，上述乳酸菌的处理物为乳酸菌的培养物、培养上清、浓缩物、糊化物、干燥物、液化物、稀释物、破碎物、杀菌加工物或者来自培养物的提取物；以及一种感染症预防/治疗剂，其特征在于，含有该天然免疫活化剂，用于预防或治疗与病原菌或病毒有关的感染症。

Description

乳酸菌、来源于该乳酸菌的天然免疫活化剂、感染症预防/治 疗剂和饮食品
技术领域
本发明涉及乳酸菌、来源于该乳酸菌的天然免疫活化剂、来源于该乳酸菌的感染症预防/治疗剂和饮食品，更详细地说，涉及以“属于希腊魏斯氏菌(Weissella hellenica)的乳酸菌、该乳酸菌的死菌、该乳酸菌的产生物或该乳酸菌的处理物”作为有效成分的天然免疫活化剂；来源于该乳酸菌的饮食品；新型乳酸菌；等等。
背景技术
乳酸菌是通过代谢产生乳酸的细菌类的总称，从很早开始就被用于发酵食品，用于饮食品、药品、益生菌等的生产，属于希腊魏斯氏菌(Weissella hellenica)的乳酸菌也被用于各种用途。
例如，专利文献1中记载了一种以包含来源于乳酸菌的蛋白酶耐性细菌素为特征的家畜用抗菌剂，作为该乳酸菌，举出了属于希腊魏斯氏菌的乳酸菌。
另外，专利文献2中记载了一种含有特定的抗菌性肽的食品，作为产生该抗菌性肽的菌，举出了属于希腊魏斯氏菌的特定菌株。
专利文献3中记载了：由原汁盐渍墨鱼分离出的属于希腊魏斯氏菌的特定乳酸菌株的培养物具有血管紧张素转换酶抑制活性能力、DPPH自由基消除能力、或者由L-谷氨酸向γ-氨基丁酸的转换能力。
专利文献4中记载了：属于魏斯氏菌属的消炎性乳酸菌的破碎物被认为对作为自身免疫疾病之一的关节炎具有预防/改善作用，还列举了希腊魏斯氏菌种。并且记载了，利用该属于魏斯氏菌属的乳酸菌的破碎物，抑制了天然免疫的活化。
由此可见，属于希腊魏斯氏菌的乳酸菌通常有助于天然免疫活化这一点几乎不为人所知，何况更不知道属于希腊魏斯氏菌的特定亚种(特定菌株)的乳酸菌的产生物、培养上清等可提供在天然免疫的活化方面特别优异的试剂。
已知在天然免疫反应中，例如树突细胞、巨噬细胞这样的免疫细胞对来自细菌或病毒的天然免疫活化物质发生应答而产生细胞因子，引起之后的免疫反应。天然免疫机制是生物所共同具有的感染防御机制，该机制通常为非特异性的，因而具有反应迅速、并且对多种感染源有效地发挥功能的特征。
乳酸菌被认为对健康有益，但多数情况下并未提供科学依据。为了揭示科学依据，需要在治疗效果明确的体系中进行证实、并且进行分子水平上的机理分析，但对于乳酸菌，几乎没有达成这些目标的实例。
迄今为止，本发明人已开发出了在仅具有天然免疫机制的蚕中能够简便地测定天然免疫活化反应的评价方法(专利文献5、非专利文献1)。进而确认了，利用该方法能够进行对人等脊椎动物具有天然免疫活化作用的天然免疫活化剂的评价(筛选方法)(专利文献5等)。即，确立了该“蚕感染模型”。
另外，本发明人确认了蚕作为对感染症的抵抗性评价的模型动物是有用的(专利文献6、7等)。
天然免疫的活化在与病原菌或病毒有关的感染症的预防或治疗中是有效的，此外，对于(多药)耐药性菌是极为有效的，并且对于存在多种类型的机会感染症的预防或治疗是极为有效的。
但是，几乎没有案例显示出乳酸菌具有上述效果存在科学依据，希望开发出优异的天然免疫活化剂、基于活化天然免疫的活化的感染症预防治疗剂。
另外，还希望开发出含有来源于乳酸菌的物质或天然免疫活化剂的饮食品、利用了上述性能优异的乳酸菌的饮食品。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2006-169197号公报
专利文献2：日本特开2010-222271号公报
专利文献3：日本特开2013-048586号公报
专利文献4：日本特开2012-158568号公报
专利文献5：国际公开第2008/126905号
专利文献6：日本特开2007-327964号公报
专利文献7：日本特开2012-006917号公报
非专利文献
非专利文献1：Ishii K,Hamamoto H,Kamimura M,Sekimizu K.Activation ofthe silkworm cytokine by bacterial and fungal cell wall components via areactive oxygen species-triggered mechanism.J Biol Chem.2008Jan 25；283(4)：2185-91.
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于提供以具有高天然免疫活化能力的乳酸菌、该乳酸菌的死菌、该乳酸菌的产生物、该乳酸菌的处理物等作为有效成分的天然免疫活化剂，并且还在于提供含有该乳酸菌或来源于该乳酸菌的天然免疫活化剂的感染症预防/治疗剂、饮食品。
另外还在于提供具有高天然免疫活化能力的新乳酸菌(亚种/菌株)；含有来源于该新乳酸菌的有效成分的感染症预防/治疗剂；使用该乳酸菌发酵(天然免疫活化用发酵)得到的饮食品。
用于解决课题的手段
本发明人为了解决上述课题反复进行了深入研究，结果发现，属于希腊魏斯氏菌(Weissella hellenica)的乳酸菌、该乳酸菌的死菌/产生物/处理物的天然免疫活化能力高于其他属的乳酸菌、而且也高于同一属(魏斯氏菌属)的其他种的乳酸菌。
即，本发明人使用以蚕作为实验动物的感染模型，发现了能够预防或治疗与多种病原菌有关的感染症的“乳酸菌(来源物)”、“含有该乳酸菌(来源物)作为有效成分的天然免疫活化剂”、“利用该乳酸菌发酵得到的具有天然免疫能力的饮食品”等，从而完成了本发明。
即，本发明提供一种天然免疫活化剂，其是以属于希腊魏斯氏菌(Weissellahellenica)的乳酸菌、该乳酸菌的死菌、该乳酸菌的产生物或该乳酸菌的处理物作为有效成分的天然免疫活化剂，其特征在于，
上述乳酸菌的处理物为选自由乳酸菌的培养物、培养上清、浓缩物、糊化物、干燥物、液化物、稀释物、破碎物、杀菌加工物以及来自培养物的提取物组成的组中的至少1种处理物。
另外，本发明提供一种感染症预防/治疗剂，其特征在于，含有上述的天然免疫活化剂，用于预防或治疗与病原菌或病毒有关的感染症。
另外，本发明提供一种饮食品，其特征在于，含有上述的天然免疫活化剂。
另外，本发明提供一种天然免疫活化用发酵饮食品，其特征在于，使用属于希腊魏斯氏菌(Weissella hellenica)的乳酸菌进行发酵而得到。
另外，本发明提供上述的天然免疫活化剂，其中，上述属于希腊魏斯氏菌(Weissella hellenica)的乳酸菌是保藏号为NITE BP-02710的乳酸菌或者该乳酸菌经天然或人工变异而得到的乳酸菌。
另外，本发明提供一种保藏号为NITE BP-02710的属于魏斯氏菌(Weissella)属的乳酸菌或者该乳酸菌经天然或人工变异而得到的乳酸菌。另外，本发明提供上述乳酸菌经分离或精制而得到的乳酸菌。
另外，本发明提供上述的乳酸菌，其具有序列表的序列号1所表示的16SrDNA区域的碱基序列。
另外，本发明提供一种饮食品，其含有上述乳酸菌；提供一种发酵饮食品，其特征在于，使用上述乳酸菌进行发酵而得到。
发明的效果
根据本发明，能够提供对人等具有天然免疫活化能力的天然免疫活化剂。该天然免疫活化剂作为用于预防或治疗与病原菌或病毒有关的感染症的感染症预防/治疗剂是有用的。
此外，本发明中，由于能够活化天然免疫，因此在上述病原菌为(多药)耐药性菌时特别有用，并且对于据称在天然免疫能力降低时(或者天然免疫能力降低的人)会发病的多种(多种菌作为其病原菌)机会感染症的预防或治疗特别有用。
另外，本发明中，本发明人利用蚕感染模型(通过如个体的生死来进行确认)研究并发现了，属于希腊魏斯氏菌(Weissella hellenica)的乳酸菌的天然免疫活性能力高、属于特定希腊魏斯氏菌种的乳酸菌亚种的天然免疫活性能力特别高，因此其中也涵盖了治疗效果(也取决于试剂在个体内的体内动态)的优劣。因此，本发明的天然免疫活化剂对于与菌或病毒有关的感染症的治疗效果优异。
即，本发明中，对于蚕，将“属于希腊魏斯氏菌(Weissella hellenica)的乳酸菌(活菌)、该乳酸菌的死菌、该乳酸菌的产生物或该乳酸菌的处理物”(下文中，有时将引号(“”)内简称为“来源于希腊魏斯氏菌乳酸菌的物质”)根据这些来源物的性质通过混合到饵食中、注射到蚕的肠道内、注射到蚕的血液内等方法给药于蚕，之后将病原菌分别给药于蚕时，预先给药了该乳酸菌(来源物)的蚕的个体存活率以显著差异高于未预先给药该乳酸菌(来源物)的蚕(参照实施例)。
另外，根据另外的实验，来源于希腊魏斯氏菌乳酸菌的物质并未抑制病原菌的增殖(实施例6)。即，可知来源于希腊魏斯氏菌乳酸菌的物质不具有抗菌活性。
而且，在将来源于希腊魏斯氏菌乳酸菌的物质与病原菌同时给药于蚕的情况下，该蚕的存活率未观察到显著差异(未观察到存活率的上升)。即，为了利用来源于希腊魏斯氏菌乳酸菌的物质赋予对于病原菌感染的抵抗性，需要在之前进行给药(参照实施例、特别是实施例6)。
如上所述，已确认蚕感染模型对于人等哺乳类的感染症也可适用(有用)。需要说明的是，蚕的免疫机制不是获得性免疫机制而仅为天然免疫机制。并且，如上所述，来源于希腊魏斯氏菌乳酸菌的物质不具有抗菌活性，并且为了提高个体存活率需要先行给药，因此本发明中的来源于希腊魏斯氏菌乳酸菌的物质具有活化“人等哺乳类”的天然免疫的性质。
而且，在绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎杆菌(克雷伯氏肺炎菌，Klebsiella pneumoniae)等多种病原菌中确认了来源于希腊魏斯氏菌乳酸菌的物质对于病原菌的抵抗性(参见实施例7、表8)。基于此，来源于希腊魏斯氏菌乳酸菌的物质不仅可以说对特定的病原菌有效，而且还可以说具有活化天然免疫机制本身的性质。
上述性质在属于魏斯氏菌(Weissella)属希腊(hellenica)种的乳酸菌的4种不同亚种中全部得以确认(实施例1表1～3的No.18、27、48、75)。
另一方面，表1～3的不属于魏斯氏菌(Weissella)属的乳酸菌的亚种以及属于魏斯氏菌(Weissella)属但不属于希腊(hellenica)种的乳酸菌的亚种不能说具有上述性质，确认到这些乳酸菌(来源物)的天然免疫活化能力极低(或者没有天然免疫活化能力)(参照实施例1～4、表1～6、图1)。
即，天然免疫活化能力是属于希腊魏斯氏菌的乳酸菌或其所有来源物所特有的性质。因此，作为本发明的天然免疫活化剂的来源的乳酸菌(来源物)的外延极为明确，只要是属于希腊魏斯氏菌的乳酸菌(来源物)，均包含在本发明中，不属于希腊魏斯氏菌的乳酸菌(来源物)则排除在本发明之外。
进而，在发挥出效果的上述属于希腊魏斯氏菌种的乳酸菌中，在独立行政法人日本国家技术评估学会(NITE)的专利微生物保藏中心(NPMD)中的保藏号为NITE BP-02710的属于魏斯氏菌(Weissella)属的乳酸菌亚种(以下将该乳酸菌亚种(株)简称为“乳酸菌Wh0916-4-2”)或该菌株的来源物中，上述天然免疫活化效果特别显著(参见实施例5、表7)。
根据上述来源于希腊魏斯氏菌乳酸菌的物质的形态(方式)，本发明的天然免疫活化剂可以通过各种方法被人等所摄取，可应用于医疗用药品、药房制造销售药品等药房用药品；需要指导的药品；一般用药品；等药品等中。另外，由于口服也可发挥出效果，因此还可应用于明显的食品、健康食品等一般食品；保健功能食品；等食品中，并且还可应用于益生菌、发酵饮食品、动物用的化学药品、饵食等中。
本发明的天然免疫活化剂被“人等哺乳类”所摄取的方法没有特别限定，由于口服摄取也可显示出效果，因此口服摄取由于简单易行而特别优选。
并且，作为含有本发明的天然免疫活化剂的(发酵)饮食品，可以举出发酵(豆)乳、乳酸菌饮料、酸奶、酱菜等，该(发酵)饮食品除了具有天然免疫活化能力以外，还具有风味也可称优异的效果。即，本发明的乳酸菌在作为上述产品制造用乳酸菌发酵剂等的用途中有用。
本发明中，属于希腊魏斯氏菌的乳酸菌能够发挥作为乳酸菌的性质使食品发酵而得到天然免疫活化用发酵饮食品，也能够作为饮食品在日常生活中常用，还能够始终提高天然免疫。
另外，利用乳酸菌Wh0916-4-2发酵得到的饮食品很美味，能够提供新味道的饮食品组。
附图说明
图1是示出蚕的存活率随时间的推移、特别是示出由本发明的乳酸菌(来源物)的口服给药所致的对于绿脓杆菌的耐性的上升的图(实施例1)。
图2是示出由绿脓杆菌给药所致的蚕的状态的照片。(A)由于先行给药本发明的乳酸菌(来源物)而存活的蚕(B)由于未先行给药本发明的乳酸菌(来源物)而死亡的蚕
具体实施方式
以下对本发明进行说明，但本发明并不限于以下的具体方式，可以在技术构思的范围内任意进行变形。
本发明的天然免疫活化剂以属于希腊魏斯氏菌(Weissella hellenica)的乳酸菌、该乳酸菌的死菌、该乳酸菌的产生物或者该乳酸菌的处理物作为有效成分。
如实施例1～4所示，属于魏斯氏菌(Weissella)属、希腊(hellenica)种的乳酸菌在进行评价的全部乳酸菌中天然免疫活化能力高，不属于魏斯氏菌属的乳酸菌以及属于魏斯氏菌属但不属于希腊(hellenica)种的乳酸菌在进行评价的全部乳酸菌中天然免疫活化能力低。
由上述可知，本发明的天然免疫活化剂中，有效成分通过宿主介导的机制发挥出预防/治疗效果。
蚕这样的无脊椎动物中没有抗体，因此不存在获得性免疫机制。在感染防御中起作用的是被称为天然免疫的机制。根据近年来的研究可知，哺乳类中也存在天然免疫机制，其分子机制与无脊椎动物共通。本发明在于活化人等哺乳类的天然免疫。
天然免疫活化的评价使用本发明人已经确立的上述蚕感染模型来进行。本发明中的评价方法具体而言如下进行：将评价试样通过饵食、肠道内注射、血液内注射等方法给药于蚕，之后将病原菌等给药于蚕，将此时的存活率与未给药评价试样时的存活率比较，由此进行评价。
还测定了同时给药评价试样和病原菌等时的存活率，确认到只有在给药该评价试样后进行该病原菌等的给药时存活率才显著上升，明确了该存活率的上升是由于天然免疫的活化而引起的。
本发明的天然免疫活化剂中含有属于希腊魏斯氏菌的乳酸菌本身(乳酸菌的活菌)、乳酸菌的死菌、乳酸菌的产生物或者乳酸菌的处理物，也可以含有它们的混合物。另外，可以以各种状态包含这些物质，例如可以举出包括混悬液、乳酸菌体、培养上清液、培养基成分在内的状态等。
上述“乳酸菌的处理物”为选自由乳酸菌的培养物、培养上清、浓缩物、糊化物、干燥物、液化物、稀释物、破碎物、杀菌加工物以及来自培养物的提取物组成的组中的至少1种处理物。需要说明的是，上述表述中，也存在作为部分“物质”重叠的情况。
此处，作为上述乳酸菌的活菌或死菌，可以举出活菌体、湿菌、干菌等，还可以举出实施了加热杀菌处理、放射线杀菌处理、破碎处理等的菌体。另外，上述产生物可以是包含在乳酸菌的活菌或死菌中的物质，也可以是分离出的物质。另外，作为上述干燥物，可以举出喷雾干燥物、冷冻干燥物、真空干燥物、转鼓干燥物等。
本发明的天然免疫活化剂中的作为有效成分的乳酸菌、该乳酸菌的死菌、该乳酸菌的产生物或者该乳酸菌的处理物相对于天然免疫活化剂整体的含量没有特别限制，可以根据目的适当选择，将天然免疫活化剂整体设为100质量份时，以“乳酸菌、该乳酸菌的死菌、该乳酸菌的产生物或者该乳酸菌的处理物的总量”计，优选含有0.001～100质量份、更优选含有0.01～99质量份、特别优选含有0.1～95质量份、进一步优选含有1～90质量份。
另外，上述有效成分可以单独使用任意1种，也可以合用2种以上。关于合用2种以上的情况下的上述天然免疫活化剂中的各有效成分的含有比没有特别限制，可以根据目的适当选择。
本发明的天然免疫活化剂含有上述成分作为有效成分，除了这些有效成分以外，还可以含有“其他成分”。
作为上述天然免疫活化剂中的上述“其他成分”没有特别限制，可以在无损于本发明效果的范围内根据目的适当选择，可以举出药学上可接受的载体等。作为该载体没有特别限制，例如也可以举出与后述的“根据剂型等进行混配来使用的载体”同样的载体。
针对机会感染症的病原菌、特别是绿脓杆菌的抗菌治疗药的种类是有限的。特别是经口服显示出效果的抗菌药的发现被认为是非常困难的。作为其理由之一，可以举出用于评价治疗效果的方法有限这一点。
蚕感染模型具有不仅成本低廉，而且还能够避免在以往所使用的小鼠系中成为问题的、从动物保护的观点出发的伦理问题的优点。本发明是如下进行的：对于在小鼠系中从动物保护的观点出发成为问题的多种乳酸菌进行筛选，不论抗菌效果如何均进行了包括治疗效果在内的评价(具体而言对存活率进行测定)。
因此，由于本发明的天然免疫活化剂在各种病原菌或病毒的感染症的预防、治疗中发挥出效果，因而本发明还涉及一种感染症预防/治疗剂，其特征在于，用于预防或治疗与病原菌或病毒有关的感染症。
另外，由于本发明的天然免疫活化剂既不依赖于获得性免疫、也不依赖于抗菌效果，因此在感染症的病原菌为耐药性菌的情况下也是有效的。因此，本发明还涉及上述的感染症预防/治疗剂，其中，上述病原菌为耐药性菌。
另外，本发明中，通过活化天然免疫，对所有种类的菌、病毒均有效，因此对于在天然免疫功能降低的情况下变得严重的各种机会感染症特别有效。因此，本发明还涉及上述的感染症预防/治疗剂，其中，上述感染症为机会感染症。
如上所述，在进行评价的全部乳酸菌中，属于希腊魏斯氏菌种的乳酸菌的天然免疫活化高于属于其他种的乳酸菌。因此认为，含有属于希腊魏斯氏菌的乳酸菌的所有相关的上述“来源于希腊魏斯氏菌乳酸菌的物质”作为有效成分的饮食品通常会活化天然免疫。
因此，本发明还涉及一种饮食品，其特征在于，含有天然免疫活化剂，另外还涉及一种天然免疫活化用发酵饮食品，其特征在于，使用属于希腊魏斯氏菌(Weissellahellenica)的乳酸菌进行发酵而得到。
如实施例1～5、表1～7所示，在124种乳酸菌的亚种中，作为属于希腊魏斯氏菌种的乳酸菌的No.18(株名(亚种名)0916-4-2)、No.27(株名(亚种名)0928-7-2)、No.48(株名(亚种名)1026-04-2)以及No.75(株名(亚种名)1109-7-1)全部显示出对于绿脓杆菌的耐性，天然免疫活化能力高。
其中，如实施例5所示，在上述4种乳酸菌的亚种中，No.18(株名(亚种名)0916-4-2)对于绿脓杆菌显示出最强的耐性，特异性提高了天然免疫活化能力(参见表7)。
本发明中，将上述本发明的效果最高的、表1中的上述“No.18(株名(亚种名)0916-4-2)”的菌株(乳酸菌亚种)命名为“乳酸菌Wh0916-4-2”。
下面对于该属于希腊魏斯氏菌(Weissella hellenica)的乳酸菌亚种乳酸菌Wh0916-4-2进行详细说明。
形态：本发明的乳酸菌Wh0916-4-2是首次分离出的。
生理学性质：本发明的乳酸菌Wh0916-4-2的生理学、化学分类学性质如下。
(a)革兰氏染色结果：阳性
(b)菌体的形状：球形
(c)对于氧的性质(需氧/厌氧)：厌氧
(d)乳酸产生能力：有
(1)过氧化氢酶：－
(2)碱性磷酸酶：－
(3)酯酶(C4)：－
(4)酯酶脂肪酶(C8)：－
(5)脂肪酶(C14)：－
(6)亮氨酸氨基肽酶：－
(7)缬氨酸氨基肽酶：－
(8)胱氨酸氨基肽酶：－
(9)胰蛋白酶：－
(10)α-胰凝乳蛋白酶：－
(11)酸性磷酸酶：+
(12)萘酚-AS-BI-磷酸水解酶：+
(13)α-半乳糖苷酶：－
(14)β-半乳糖苷酶：－
(15)β-葡萄糖醛酸苷酶：－
(16)α-葡糖苷酶：－
(17)β-葡糖苷酶：－
(18)N-乙酰基-β-氨基葡萄糖苷酶：－
(19)α-甘露糖苷酶：－
(20)α-岩藻糖苷酶：－
将上述乳酸菌Wh0916-4-2的生理学/化学分类学的性质与基于伯杰氏系统细菌学手册(Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology,vol.3 1989)的分类及其他文献的记载内容对照来进行判断，结果本发明的乳酸菌Wh0916-4-2为属于魏斯氏菌(Weissella)属的微生物，进而为属于希腊魏斯氏菌(Weissella hellenica)种的微生物。
另外，作为乳酸菌Wh0916-4-2的分子生物学系统分类的指标使用的相当于16SrDNA的大致全长的碱基序列如序列表的序列号1所记载。利用NCBI的BLAST分析对该碱基序列进行同源性检索时，显示出99％的同源性，因此乳酸菌Wh0916-4-2是属于希腊魏斯氏菌(Weissella hellenica)种的微生物。
通过基于酸和气体的生成能力的糖代谢检查的结果进行鉴定的结果(参照后述的“培养基中的碳源”项)与乳酸菌Wh0916-4-2是属于希腊魏斯氏菌(Weissella hellenica)种的微生物的上述判断不矛盾。
进而，根据包括与属于希腊魏斯氏菌(Weissella hellenica)种的已知菌株(亚种)等相比显示出最高的天然免疫活化能力等的综合研究的结果判断出，乳酸菌Wh0916-4-2为(分离出的)新微生物株(乳酸菌的亚种)。
“乳酸菌Wh0916-4-2”在千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号室、独立行政法人日本国家技术评估学会(National Institute of Technology and Evaluation；以下简称为“NITE”)的专利微生物保藏中心(NPMD)进行了日本国内保藏，是以保藏号：NITE P-02710(接受日(保藏日)：2018年5月14日)进行了保藏的微生物。
之后，“乳酸菌Wh0916-4-2”向千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号室、独立行政法人日本国家技术评估学会(NITE)的专利微生物保藏中心(NPMD)提交了原保藏申请书，进行了由日本国内保藏(原保藏日：2018年5月14日)转移为基于布达佩斯条约的保藏的转移请求(转移日(国际保藏日)：2018年10月1日)，并证明其存活，向基于布达佩斯条约的保藏(国际保藏)的转移请求被接受，结果获得了保藏号“NITE BP-02710”。
作为细菌的一般性状，由于其作为菌株的性质容易发生变异，因而乳酸菌Wh0916-4-2也具有不限于前面示出的生理学性状的范围内的可能性。另外，该“变异”当然包括天然变异和人工变异这两种情况。
下面对乳酸菌Wh0916-4-2的培养方法进行记载。乳酸菌Wh0916-4-2的培养方法依据对魏斯氏菌属微生物进行的一般培养方法来进行即可。
培养优选在厌氧条件下进行。作为培养基中的碳源，例如可以使用D-核糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-甘露醇、N-乙酰基葡萄糖胺、扁桃苷、熊果苷、七叶苷、水杨苷、D-纤维素二糖、D-麦芽糖、蔗糖、D-海藻糖、龙胆二糖、糖蜜、水饴、油脂类等有机碳化合物，作为氮源，可以使用肉提取物、酪蛋白、蛋白胨、酵母提取物、干燥酵母、胚芽、大豆粉、尿素、氨基酸、铵盐等有机/无机氮化合物。
另外，关于盐类，根据需要适当添加钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、磷酸盐、铁盐、铜盐、锌盐、钴盐等无机盐类。此外，从增加目标物的产生量的方面出发，优选添加生物素、维生素B1、胱氨酸、油酸甲酯、猪油等生长促进物质。
另外，可以添加硅油、表面活性剂等消泡剂。作为制备完毕的培养基，优选使用例如MRS培养基、GAM培养基等。
关于培养条件，如上文所述，依据对魏斯氏菌属的微生物进行的一般培养条件来进行即可。若为液体培养法，则优选静置培养。若为小规模培养，则可以使用利用带盖玻璃瓶的静置培养法。
培养温度优选保持在25℃～37℃之间，更优选在28℃～32℃进行。关于培养pH，优选在7附近进行。培养时间是根据所使用的培养基组成、培养温度等而变动的因素，在乳酸菌Wh0916-4-2的情况下，以优选12～72小时、更优选24～48小时能够确保充分量的目标物。
还优选挑取培养得到的菌落，再次在培养基上进行单个菌落形成。
本发明还涉及上述的天然免疫活化剂，其中，上述属于希腊魏斯氏菌(Weissellahellenica)的乳酸菌特别地是保藏号为NITE BP-02710的乳酸菌或者该乳酸菌经天然或人工变异而得到的乳酸菌。
另外，本发明还涉及一种保藏号为NITE BP-02710的属于魏斯氏菌(Weissella)属的乳酸菌或者该乳酸菌经天然或人工变异而得到的乳酸菌。
另外，本发明还涉及上述的乳酸菌，其具有序列表的序列号1所示的16SrDNA区域的碱基序列。保藏号为NITE BP-02710的乳酸菌是上述的“乳酸菌Wh0916-4-2”。
本发明还特别涉及一种饮食品，其含有上述乳酸菌Wh0916-4-2(保藏号为NITEBP-02710乳酸菌)；还涉及一种发酵饮食品，其特征在于，使用该乳酸菌(的菌株)(亚种)进行发酵而得到。
以本发明的乳酸菌、该乳酸菌的死菌、该乳酸菌的产生物或者该乳酸菌的处理物作为有效成分的天然免疫活化剂可以混配在药品；一般饮食品；健康食品等中，不论它们的形态如何，均可应用于各种药品、饮食品等中。
另外，上述本发明中的采用利用属于希腊魏斯氏菌的乳酸菌进行发酵的工序而制造出的饮食品除了发挥出乳酸菌的常见效果以外，还容易发挥出本发明所特有的天然免疫活化效果，因而优选。
作为本发明的天然免疫活化剂、感染症预防/治疗剂的剂型没有特别限制，可以根据乳酸菌、乳酸菌的死菌、乳酸菌的产生物、上述各种乳酸菌的处理物等的形态(方式)适当选择。另外，例如可以根据后述的所期望的给药方法来适当选择。
具体而言，例如可以举出口服固形剂(片剂、包覆片剂、颗粒剂、散剂、硬胶囊剂、软胶囊剂等)、口服液剂(内服液剂、糖浆剂、酏剂等)、注射剂(溶剂、混悬剂等)、凝胶剂、乳膏剂、外用散剂、喷雾剂、吸入散布剂等。
作为上述口服固形剂，例如可以在上述有效成分中加入赋形剂，进一步根据需要加入粘结剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、矫味/矫臭剂等添加剂，通过常规方法进行制造。
作为上述赋形剂，例如可以举出乳糖、白糖、氯化钠、葡萄糖、淀粉、碳酸钙、高岭土、微晶纤维素、硅酸等。
作为上述粘结剂，例如可以举出水、乙醇、丙醇、单糖浆、葡萄糖液、淀粉液、明胶液、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基淀粉、甲基纤维素、乙基纤维素、虫胶、磷酸钙、聚乙烯吡咯烷酮等。
作为上述崩解剂，例如可以举出干燥淀粉、藻酸钠、琼脂粉末、碳酸氢钠、碳酸钙、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、乳糖等。
作为上述润滑剂，例如可以举出精制滑石、硬脂酸盐、硼砂、聚乙二醇等。
作为上述着色剂，例如可以举出氧化钛、氧化铁等。
作为上述矫味/矫臭剂，例如可以举出白糖、橙皮、柠檬酸、酒石酸等。
作为上述口服液剂，例如可以在上述有效成分中加入矫味/矫臭剂、缓冲剂、稳定剂等添加剂，通过常规方法进行制造。
作为上述矫味/矫臭剂，例如可以举出白糖、橙皮、柠檬酸、酒石酸等。作为上述缓冲剂，例如可以举出柠檬酸钠等。作为上述稳定剂，例如可以举出黄芪胶、阿拉伯胶、明胶等。
作为上述注射剂，例如可以在上述有效成分中添加pH调节剂、缓冲剂、稳定剂、等渗剂、局麻剂等，通过常规方法制造皮下用、肌肉内用、静脉内用等的注射剂。
作为上述pH调节剂和上述缓冲剂，例如可以举出柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钠等。
作为上述稳定剂，例如可以举出焦亚硫酸钠、EDTA、巯基乙酸、硫代乳酸等。
作为上述等渗剂，例如可以举出氯化钠、葡萄糖等。作为上述局麻剂，例如可以举出盐酸普鲁卡因、盐酸利多卡因等。
本发明的天然免疫活化剂、感染症预防/治疗剂例如可以适合用于需要活化天然免疫机制的个体、对于细菌等恰好希望得到获得性免疫的个体等。
具体而言，例如可以通过对需要进行健康维持或疲劳恢复的个体；需要进行癌或生活习惯病的预防或治疗的个体；感染了细菌、真菌、病毒等的个体；等等进行给药来使用。
作为本发明的天然免疫活化剂、感染症预防/治疗剂的给药对象动物没有特别限制，例如可以举出：人；小鼠、大鼠等实验动物；猴；马；牛、猪、山羊、鸡等家畜；猫、狗等宠物；等等。
另外，作为上述天然免疫活化剂的给药方法没有特别限制，例如可以根据上述乳酸(死)菌或其处理物的形态、并且根据上述剂型等适当选择，可以举出口服给药、腹腔内给药、向血液中注射、向肠内注入等。其中，从简便地发挥出上述效果的方面出发，优选口服给药。
作为本发明的天然免疫活化剂或本发明的感染症预防/治疗剂的给药量没有特别限制，可以根据作为给药对象的个体的年龄、体重、所期望的效果的程度等来适当选择，例如，对成人1天的给药量以有效成分的量计优选1mg～30g、更优选10mg～10g、特别优选100mg～3g。
另外，作为给药时期也没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可以预防性地给药，也可以治疗性地给药。
含有本发明的天然免疫活化剂的饮食品、发酵饮食品、天然免疫活化用发酵饮食品(下文中有时将它们简称为“本发明的饮食品”)中的天然免疫活化剂的含量没有特别限制，可以根据目的、饮食品的方式(种类)来适当选择，在将饮食品整体设为100质量份时，优选含有0.001～100质量份，更优选为0.01～95质量份、特别优选为0.1～90质量份。
本发明的饮食品具有天然免疫活化能力、感染症预防/治疗能力。
本发明的饮食品除了含有上述本发明的天然免疫活化剂以外，还可以进一步含有“其他成分”。
作为上述“其他成分”没有特别限制，可以在无损于本发明效果的范围内根据目的适当选择，例如可以举出各种食品原料等。另外，“其他成分”的含量没有特别限制，可以根据目的适当选择。
另外，在使用属于希腊魏斯氏菌(Weissella hellenica)的乳酸菌进行发酵而得到的天然免疫活化用发酵饮食品的情况下，也可以包含伴随着该发酵而生成的各种物质。
本发明的乳酸菌还可应用于明显的食品、健康食品等一般食品；保健功能食品；等食品，还可应用于益生菌、发酵饮食品、动物用化学药品/饵食等。作为该发酵饮食品，特别适合于作为发酵乳、发酵豆乳、乳酸菌饮料、酸奶、酱菜、酱菜制造用乳酸菌发酵剂等的用途。
作为上述食品的种类没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如可以举出：果冻、糖果、巧克力、饼干、橡皮糖等点心类；绿茶、红茶、咖啡、软饮等嗜好饮料；发酵乳、发酵豆乳、酸奶、冰激凌、乳冰等(豆)乳制品；蔬菜饮料、果实饮料、果酱类等蔬菜/果实加工品；汤等液体食品；面包类、面类等谷物加工品；各种调味料；等等。其中优选酸奶、发酵乳、发酵豆乳等(豆)乳制品。
另外，上述食品除了上述明显的食品以外，还可以为健康食品、保健功能食品，例如还优选为片剂、颗粒剂、胶囊剂等口服固形剂、内服液剂、糖浆等口服液剂。
本发明的饮食品作为以活化天然免疫机制、赋予对感染症的抵抗力等为目的的功能性显示食品等健康食品等特别有用。
在将本发明的乳酸菌、其死菌或者处理物等用于饮食品的制造的情况下，制造方法可以利用本领域技术人员公知的方法来进行。本领域技术人员可以将使本发明的乳酸菌的(死)菌体或处理物与其他成分混合的工序、成形工序、杀菌工序、发酵工序、烧制工序、干燥工序、冷却工序、造粒工序、包装工序等适当组合来制作目标饮食品。
另外，在将本发明的乳酸菌用于各种发酵乳的制造的情况下，可以使用本领域技术人员公知的方法来制造。例如可以举出采用在发酵乳中以死菌的形式添加需要量的本发明的乳酸菌的工序而制造的饮食品、采用使用本发明中的乳酸菌作为乳酸菌发酵剂进行发酵的工序而制造的饮食品。
在使用本发明的乳酸菌作为乳酸菌发酵剂进行发酵的情况下，可以利用与本发明的乳酸菌的培养条件同样的条件等来进行。
实施例
下面基于实施例和研究例进一步详细地说明本发明，但本发明并不限定于下述实施例等的具体范围。
实施例1
如下述表1～3所示，分离出124株乳酸菌，确认乳酸产生能力并制作文库。根据该文库(表1～3)找出对于蚕的绿脓杆菌PAO1株的感染赋予耐性的乳酸菌。
[表1]
Figure GDA0002415708820000161
[表2]
Figure GDA0002415708820000171
[表3]
Figure GDA0002415708820000181
将乳酸菌的成熟体(フルグロース)80μL与蚕人工饵食1g混合，在1天内给饵于蚕。之后将绿脓杆菌PAO1株的过夜培养液利用生理盐水稀释至10-6倍，将该稀释液50μL对蚕进行血中注射，观察蚕的存活个体数的经时性减少。
存活的蚕例如如图2(A)所示，死亡的蚕例如如图2(B)所示。将蚕的存活率的推移的结果示于图1。
如图1所示，与基于生理盐水的对照相比，进行试验的任一种乳酸菌均显示出延命效果。其中，特别是只有口服给药了表1的No18即“乳酸菌Wh0916-4-2”(保藏号：NITE BP-02710)的蚕即使在绿脓杆菌注射115小时后仍大多数存活。即，乳酸菌Wh0916-4-2的活性显著高于其他乳酸菌。
实施例2
将培养至成熟的乳酸菌的成熟体20mL进行离心来收集菌体，与不含抗生素的蚕人工饵食1g混合，在1天内给饵于蚕。之后将绿脓杆菌PAO1株的过夜培养液利用生理盐水稀释至10-5倍，将该稀释液50μL对蚕进行血中注射，观察蚕的存活个体数的经时性减少。利用这样的方法进行实验1和实验2。
将实验1的结果示于下述表4、实验2的结果示于下述表5。
将1组蚕设为6只，将直至半数(3只)死亡为止的时间(hrs)作为“LT50”。对于所评价的乳酸菌，将与无乳酸菌的对照的LT50之比示于表4和表5。
[表4]
Figure GDA0002415708820000191
[表5]
Figure GDA0002415708820000201
其结果，在实验1和实验2中，无乳酸菌的对照中的LT50分别为27小时和31小时。大部分乳酸菌向饵食中的添加显示出了延命效果。
本发明人已经在论文中报告的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)11/19-B1株所得到的延命效果在实验1和实验2中均为1.1倍。与之相对，属于希腊魏斯氏菌(Weissellahellenica)的乳酸菌Wh0916-4-2显示出3.6倍以上的延命效果。
本发明人已经在论文中报告的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)11/19-B1株所得到的延命效果(Nishida,Ono,Sekimizu；Drug Discoveries&Therapeutics.2016；10(1):49-56.)在实验1和实验2中均较小，但确认到了再现性。
与之相对，属于希腊魏斯氏菌(Weissella hellenica)的乳酸菌Wh0916-4-2显示出2.9倍以上的延命效果。该效果在所调查的乳酸菌中很突出。
实施例3
对于表1～3中记载的乳酸菌124株中的属于魏斯氏菌属希腊种的4种乳酸菌(表1～3的No.18、27、48、75)，在实施例1中，使试验试样不是乳酸菌而是乳酸菌培养上清的67％乙醇可溶性级分，将绿脓杆菌PAO1株的过夜培养液利用生理盐水稀释至10-6倍，除此以外与实施例1同样地观察蚕的存活个体数的经时性减少，确认1～3天后的存活情况。
其结果，在给予属于魏斯氏菌属希腊种的4种乳酸菌(表1～3的No.18、27、48、75)的情况下，蚕在34小时全部存活。另一方面，不属于魏斯氏菌属希腊种的乳酸菌一般没有天然免疫活化能力或者天然免疫活化能力极低。
与属于其他属的乳酸菌或属于魏斯氏菌属但不属于希腊种的乳酸菌相比，属于希腊魏斯氏菌种的乳酸菌特异性地具有绿脓杆菌耐性赋予活性，天然免疫活性能力高。
实施例4
将乳酸菌利用MRS液体培养基培养2天，与蚕的人工饵食6g混合，投喂给5龄蚕6只。21小时后，将利用生理盐水稀释至10-5倍的绿脓杆菌的菌液注射至蚕的血液内，调查51小时后蚕的存活数。将结果示于表6。
[表6]
Figure GDA0002415708820000211
其结果，给饵了表1中的No.18的“希腊魏斯氏菌(W.hellnica)0916-4-2”、即“乳酸菌Wh0916-4-2(保藏号：NITE BP-02710)”的蚕在绿脓杆菌注射51小时后有半数存活，但在给饵了No.27的希腊魏斯氏菌种的“希腊魏斯氏菌(W.hellnica)0928-7-2”以及No.24、30、33、35的“属于魏斯氏菌属但为其他种的菌”的蚕中未确认到存活。
乳酸菌Wh0916-4-2的治疗效果是特异性的，在其他魏斯氏菌属的菌中未观察到该活性。另外暗示出，属于希腊魏斯氏菌种但不是乳酸菌Wh0916-4-2的菌(No.27“希腊魏斯氏菌(W.hellnica)0928-7-2”)的天然免疫活化能力劣于乳酸菌Wh0916-4-2。
实施例5
对5龄蚕投喂1g的人工饵食1天后，将表1～3中的4种属于希腊魏斯氏菌(Weissella hellenica)的乳酸菌(No.18、27、48、75)的培养上清用生理盐水分别稀释至10-4倍和10-3倍，将其50μL注射至5龄蚕的血液内。
进一步在该注射6小时后，将用生理盐水稀释至1000倍的绿脓杆菌PAO1株50μL注射至蚕的血液内。
计数该注射34小时后蚕的存活数(1组3只)。将结果示于表7。
[表7]
Figure GDA0002415708820000221
其结果，在34小时后，在乳酸菌Wh0916-4-2(希腊魏斯氏菌(Weissellahellenica)0916-4-2)中蚕全部存活，但在其他3株(其他亚种)中，投喂了10-4倍稀释液的蚕中观察到死亡个体。
4株希腊魏斯氏菌均显示出治疗效果，其中乳酸菌Wh0916-4-2显示出最显著的效果。
实施例6
将乳酸菌Wh0916-4-2的培养上清与蚕的人工饵食混合，进行1天经口摄取，也与活菌同样地对蚕赋予了对于绿脓杆菌感染的抵抗性。
另外，在乳酸菌Wh0916-4-2的培养上清中未确认到抑制绿脓杆菌增殖的活性。即，可知其不是抗菌素。
此外，在将乳酸菌Wh0916-4-2的培养上清与绿脓杆菌同时给药于蚕的情况下，未确认到赋予了对于绿脓杆菌感染的抵抗性。即可知，为了赋予对于绿脓杆菌感染的抵抗性，需要先行给药乳酸菌的培养上清(来源物)。
另外，若使从该先行给药起到绿脓杆菌给药为止的时间为2天以上，则乳酸菌Wh0916-4-2的培养上清的活性丧失。因此认为，乳酸菌Wh0916-4-2的培养上清中包含的活性成分从蚕的体内消失，该活性丧失。
这些结果暗示出，乳酸菌Wh0916-4-2的培养上清(中包含的活性成分)的作用不是对于绿脓杆菌的直接效果，而是由宿主的免疫系统介导的。
实施例7
对5龄蚕投喂浸有乳酸菌Wh0916-4-2的培养上清的乙醇级分的人工饵食1g。17小时后，将表8所示的菌液50μL注射至蚕的血液内。
对于绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)，将过夜培养液稀释至10-6倍进行使用；对于肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)，将菌的过夜培养液5mL进行离心(8000rpm、5分钟)来集菌，悬浮在5mL的生理盐水中进行使用。
之后经时地观察蚕的存活数。将结果示于表8。
[表8]
Figure GDA0002415708820000231
绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa PAO1株)以及2种肺炎杆菌(Klebsiellapneumoniae 8140,8705)株在22小时以内将蚕杀伤，但乳酸菌Wh0916-4-2的培养物、培养上清(来自其的提取物)显示出治疗效果。
不仅对由绿脓杆菌引起的感染显示出治疗效果，而且对由肺炎杆菌引起的感染也显示出治疗效果。因此，本发明的该药剂可以说是天然免疫活化剂。
实施例8
在实施例6中，将菌替换成多药耐药性绿脓杆菌(MDRP)并同样地进行评价。
乳酸菌Wh0916-4-2的培养上清(中包含的活性成分)对于临床分离出的MDRP也显示出效果。
在人临床上，被称为MDRP的多药耐药性绿脓杆菌成为问题，但本发明的天然免疫活化剂对于多药耐药性绿脓杆菌(MDRP)也有效，这暗示出其在院内感染对策等方面也是有效的。
实施例9
使用乳酸菌Wh0916-4-2制作豆乳酸奶。属于希腊魏斯氏菌的乳酸菌通常作为植物性乳酸菌而为人所知。
乳酸菌Wh0916-4-2在牛奶中由于氨基酸不足而难以增殖，但在豆乳中增殖而形成酸性状态。即，通过将乳酸菌Wh0916-4-2在豆乳中进行培养，能够制作出酸奶。该酸奶味道类似豆腐，很美味。
已知属于希腊魏斯氏菌(Weissella hellenica)的乳酸菌是植物性乳酸菌，在各种植物中增殖。因此，使用乳酸菌Wh0916-4-2发酵后的蔬菜可期待广泛用作一般食品、健康食品。
工业实用性
本发明的天然免疫活化剂具有高天然免疫活化能力，含有该天然免疫活化剂还具有感染症预防/治疗效果。因此，利用本发明中的特定乳酸菌，能够提供天然免疫活化剂、感染症预防/治疗剂、含有它们的饮食品等，能够在药品业界、健康食品业界、一般食品业界等中广泛使用。
保藏号
NITE BP-02710
序列表自由文本
序列号1是属于魏斯氏菌(Weissella)属的未知菌株的、相当于16SrDNA的大致全长的碱基序列。
序列表
<110> 株式公司染色体创药研究所(Genome Pharmaceuticals Institute Co., Ltd.)
学校法人帝京大学(Teikyo University)
<120> 乳酸菌、来源于该乳酸菌的天然免疫活化剂、感染症预防/治疗剂和饮食品(Lactic acid bacterium, innate immunity activator derivedtherefrom, agent forpreventing or treating infection, and food and drink)
<130> PF-061095-WO
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1503
<212> DNA
<213> 希腊魏斯氏菌(Weissella hellenica)
<400> 1
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atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatggc atatacaacg agtcgctaac 1260
ccgcgagggt acgctaatct cttaaagtat gtctcagttc ggattgtagg ctgcaactcg 1320
cctacatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagaa cgccgcggtg aatacgttcc 1380
cgggtcttgt acacaccgcc cgtcacacca tgagagtttg taacacccaa agccggtggg 1440
gtaacctttt aggagccagc cgtctaaggt gggacagatg attagggtga agtcgtaaca 1500
agg 1503

Claims (8)

1.一种天然免疫活化剂，其是以属于希腊魏斯氏菌(Weissella hellenica)的乳酸菌或该乳酸菌的处理物作为有效成分的天然免疫活化剂，其特征在于，
所述乳酸菌的处理物为选自由乳酸菌的整体培养物、整体培养上清以及培养上清的整体乙醇可溶性级分组成的组中的至少1种处理物，
该属于希腊魏斯氏菌(Weissella hellenica)的乳酸菌是保藏号为NITE BP-02710的乳酸菌。
2.一种感染症预防/治疗剂，其特征在于，含有权利要求1所述的天然免疫活化剂，用于预防或治疗与病原菌或病毒有关的感染症。
3.如权利要求2所述的感染症预防/治疗剂，其中，所述病原菌为耐药性菌。
4.如权利要求2或权利要求3所述的感染症预防/治疗剂，其中，所述感染症为机会感染症。
5.一种饮食品，其特征在于，含有权利要求1所述的天然免疫活化剂。
6.一种保藏号为NITE BP-02710的属于魏斯氏菌(Weissella)属的乳酸菌。
7.一种饮食品，其含有权利要求6所述的乳酸菌。
8.一种发酵饮食品，其特征在于，使用权利要求6所述的乳酸菌进行发酵而得到。
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