JP2015070855A - 発酵乳および抗ウイルス剤の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】安全性が高く、予防的な摂取で効果を発揮し、服用によってどのようなウイルスに対しても効果を発揮する発酵乳の製造方法を提供する。
【解決手段】（ｉ）乳酸菌である Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓが産生する中性多糖体であること、（ｉｉ）ＩＦＮ−αによる刺激に応答して、中性多糖体を与えない場合に比べてｔ検定においてＰ＜０．００１で有意に大きくＮＫ細胞の活性を上昇させることができる中性多糖体であること、および（ｉｉｉ）下記式（１）：

に示す構造単位を有する中性多糖体であること、の条件を満たす中性多糖体を含む発酵乳の製造方法であって、前記乳酸菌を使用して、原料乳を発酵させて、発酵乳を得る、発酵乳の製造方法。
【選択図】図２

Description

本発明は、発酵乳および抗ウイルス剤の製造方法に関し、特に、特定の乳酸菌が産生する中性多糖体を含む発酵乳および抗ウイルス剤の製造方法に関する。

現在、世界中で猛威を振るっている新型インフルエンザを始めとして、人類は常に新たなウイルスの脅威にさらされている。特に、季節性のものを含めたインフルエンザなどの呼吸器感染症は、日常生活の中で罹患者が周囲に存在する状況が生じ易いため、高齢者など免疫力が低下している者にとっては罹患しやすい。また、重篤に陥る可能性も高く、合併症を併発しての死亡率は非常に高い。

現在、こうしたウイルス性の呼吸器感染症に対しては、ウイルス自体に作用して効果を示す抗ウイルス薬が用いられている。これらの抗ウイルス薬は、それぞれのウイルス性感染症に対して極めて有効なものであり、発病後早期に服用することで症状を速やかに緩和することができる。近年、ウイルス表面のノイラミニダーゼ蛋白質を阻害し、体内でのウイルスの増殖を防止するノイラミニダーゼ阻害薬が開発されている。その中でもＡ型及びＢ型インフルエンザに有効なものとして、カプセル内服薬として処方されるオセタミビル（商品名：タミフル；タミフルは登録商標である。）や粉末性吸入薬のザナミビル（商品名：リレンザ；リレンザは登録商標である。）といった薬剤が実用されている。しかし、これらの薬剤は、ウイルスの増殖を抑制する薬剤であり、感染後早期に服用する必要がある。例えば、症状が出現して４８時間程度以内に服用しなければならない。また、これらの薬剤は、一定期間一定量を継続して服用しなければならない。

また、ワクチン接種による予防も行われている。しかし、ワクチンは、対象となるウイルス種を事前に特定して製造しなければならず、また、大量生産には非常に時間がかかる。また、ワクチン接種は、あくまで感染後の重症化のリスクを下げる効果しかない。さらに、ワクチン接種は、抗体が定着するまで一定期間を必要とすること、流行する前に予防接種をしなければならないこと、接種したワクチンの種類と実際に感染したウイルスの種類が異なれば、全く効果を発揮することができないこと、といった問題もある。

このような状況の中、安全性が高いことはもちろん、予防的な摂取で効果を発揮し、しかも服用によってどのようなウイルスに対しても効果を発揮する抗ウイルス剤の開発が急務となっている。

一方、ウイルスの脅威に対処するためには、生体内へのウイルスの侵入及び増殖を最前線で防ぐ自然免疫を、普段から高めておくことも重要である。自然免疫において、白血球は特に重要な役割を果たす。白血球の中でもＮＫ細胞（ナチュラルキラー細胞ともいう。）は、ウイルス感染が小規模なうちに自発的に感染細胞を攻撃し、ウイルスの増殖及び感染の拡大を抑制する。

生体内では、ウイルス感染を感知すると、インターフェロン（ＩＦＮ）−αをはじめとするI型ＩＦＮが産生される。ＮＫ細胞の活性化には、このI型ＩＦＮによる刺激が必須である。ウイルス感染細胞から放出されたI型ＩＦＮによって、ＮＫ細胞の活性化がなされることが明らかにされている。したがって、ウイルス感知によるＮＫ細胞の活性の度合いを増強することで、その後のウイルスの増殖を抑制し、感染の拡大を防ぐことが可能である。また、ＮＫ細胞は、ウイルス感染細胞を攻撃することが知られている。したがって、ＮＫ細胞は、ワクチンのように特定のウイルスに対して効果があるのみならず、広く様々なウイルス感染に対して効果があると言える。

上述の事情下において、ＮＫ細胞の活性化を促進する物質が、様々な分野において探索されている。これまでにある程度効果があるとして知られているものの例としては、多糖（例えば、レンチナン、キチン、キトサン、マイタケＤ−フラクション、ニゲロオリゴ糖等）および菌体（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ｓｈｉｒｏｔａ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ ＨＮ０１９等）が知られている（非特許文献１〜６、特許文献１）。

また、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＯＬＬ１０７３Ｒ−１（以下、「１０７３Ｒ−１株」と略すことがある。）は、中性多糖体（ＮＰＳ：Ｎｅｕｔｒａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）と、中性多糖体にリン酸基が付加した酸性多糖体（ＡＰＳ：Ａｃｉｄｉｃ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）とを産生することが明らかにされている。本発明者等は、これまでに酸性多糖体（ＡＰＳ）がＮＫ細胞の活性の増強効果を有することを明らかにしている（特許文献２）。酸性多糖体（ＡＰＳ）については、脾臓細胞をエフェクター細胞とし、ＹＡＣ−１細胞をターゲット細胞として、ＮＫ細胞の活性（以下、ＮＫ活性と略すことがある。）をＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）により評価している。しかし、中性多糖体（ＮＰＳ）については、上記のＮＫ細胞の活性についても、ウイルス感染に相当するＩＦＮ−αによる刺激時のＮＫ細胞の活性についても、評価していない。したがって、中性多糖体（ＮＰＳ）によるＮＫ細胞の活性の増強効果等の免疫賦活効果は、確認されていなかった。
なお、中性多糖体（ＮＰＳ）の単離方法は、種々の文献の中で報告されている（特許文献３）。

特開２００１−３１５７３号公報 特開２００５−１９４２５９号公報 特開２０００−２４７８９５号公報

秋山由紀雄，羽室淳爾，蛋白質 核酸 酵素，２６（３），２０８−２２４（１９８１） Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｋ，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｓ，Ｎｉｓｈｉ Ｎ，Ｎｕｍａｔａ Ｆ，Ｔｏｎｅ Ｙ，Ｔｏｋｕｒａ Ｓ，Ａｚｕｍａ Ｉ，Ｖａｃｃｉｎｅ，３（５），３７９−８４（１９８５） Ｋｏｄａｍａ Ｎ，Ｋｏｍｕｔａ Ｋ，Ｓａｋａｉ Ｎ，Ｎａｎｂａ Ｈ，Ｂｉｏｌ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ，２５（１２），１６４７−５０（２００２） Ｍｕｒｏｓａｋ Ｓ，Ｍｕｒｏｙａｍａ Ｋ，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｙ，Ｌｉｕ Ｔ，Ｙｏｓｈｉｋａｉ Ｙ，Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，２（１），１５１−９（２００２） Ｈｏｒｉ Ｔ，Ｋｉｙｏｓｈｉｍａ Ｊ，Ｙａｓｕｉ Ｈ，Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，６７（２），４２０−２（２００３） Ｇｉｌｌ ＨＳ，Ｒｕｔｈｅｒｆｕｒｄ ＫＪ，Ｃｒｏｓｓ ＭＬ，Ｇｏｐａｌ ＰＫ，Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ，７４（６），８３３−９（２００１）

上記のように、ＮＫ細胞の活性化を促進するための様々な物質が探索されている。しかし、必ずしも十分な活性促進効果を得ることができなかったり、ＩＦＮ−αによる刺激後のＮＫ細胞の活性の上昇について、まったく評価検討がなされていなかった。

そこで、本発明の目的は、安全かつ簡便に摂取することができ、自然免疫の一部を担うＮＫ細胞がウイルス性の刺激を得た場合に起こる活性の上昇を増強させる発酵乳および抗ウイルス剤の製造方法を提供することにある。

上記従来の問題点に鑑み、本発明者らは鋭意研究を進めたところ、食品として利用されている素材由来であれば、日常生活において安全かつ簡便に摂取することができると考えた。特に、ヨーグルトの発酵に用いられる食品用の微生物は、様々な有用物質を産生しうることが知られている。本発明者らは、これら食品用の微生物に着目し、ある種の菌が産生する多糖体を単離して、この多糖体の構造を明らかにするとともに、この多糖体に抗ウイルス活性があることを見いだした。すなわち、本発明者らは、この多糖体をマウスに、ＩＦＮ−αによる刺激前に経口投与しておくことによって、ＩＦＮ−αによる刺激後のＮＫ細胞の活性の上昇が増強されることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明の一態様は、乳酸菌が産生する中性多糖体を有効成分として含む抗ウイルス剤（以下、本発明の抗ウイルス剤ともいう。）の製造方法である。

本発明の抗ウイルス剤の調製のために用いられる前記乳酸菌の好ましい例としては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓが挙げられる。前記乳酸菌の特に好ましい例としては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＯＬＬ１０７３Ｒ−１が挙げられる。

本発明の抗ウイルス剤は、乳酸菌が産生する中性多糖体であって、ＩＦＮ−αによる刺激に応答してＮＫ細胞の活性を上昇させることができる中性多糖体を有効成分として含む抗ウイルス剤である。

前記中性多糖体は、以下の式（１）で示される構造単位を有する。

また、本発明の別の態様によれば、乳酸菌が産生する有効量の中性多糖体を含む抗ウイルス用飲食品組成物（以下、本発明の抗ウイルス用飲食品組成物ともいう。）の製造方法（特に、抗ウイルス用発酵乳）が提供される。

本発明の抗ウイルス用飲食品組成物の調製のために用いられる前記乳酸菌の好ましい例としては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓが挙げられる。前記乳酸菌の特に好ましい例としては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＯＬＬ１０７３Ｒ−１（本明細書中、「１０７３Ｒ−１株」と略すことがある。）が挙げられる。

本発明の抗ウイルス用飲食品組成物は、乳酸菌が産生する中性多糖体であって、ＩＦＮ−αによる刺激に応答してＮＫ細胞の活性を上昇させることができる中性多糖体を有効量含む抗ウイルス用飲食品組成物である。

本発明の抗ウイルス用飲食品組成物は、発酵乳飲食品であることが好ましい。発酵乳飲食品の中でも、ヨーグルト、ヨーグルト飲料等のヨーグルト飲食品が特に好ましい。

本発明の抗ウイルス用飲食品組成物は、前記中性多糖体が、当該組成物の全体量に対して０．００２〜０．０１４％（ｗ／ｗ）、特に０．００２〜０．００４％（ｗ／ｗ）の量で含まれていることが好ましい。

本発明の抗ウイルス用飲食品組成物に含まれる前記中性多糖体は、前記式（１）で示される構造単位を有する。

本発明の抗ウイルス剤及び抗ウイルス用飲食品組成物は、安全かつ簡便に摂取することができ、自然免疫の一部を担うＮＫ細胞がウイルス性の刺激を得た場合に、ＮＫ細胞の活性の度合いの上昇を増強させる。

ＩＦＮ−αによる刺激前の、脾臓細胞におけるＮＫ細胞の活性の度合いの指標としての、ガン細胞全体に占める死滅したガン細胞の割合（％）を示すグラフである。 ＩＦＮ−αによる刺激後の、脾臓細胞におけるＮＫ細胞の活性の度合いの指標としての、ガン細胞全体に占める死滅したガン細胞の割合（％）を示すグラフである。

以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は以下に述べる個々の形態には限定されない。

本発明に用いられる乳酸菌としては、中性多糖体を生産する乳酸菌であれば、種類を問わない。乳酸菌は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
中性多糖体を生産する乳酸菌の例としては、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ）等が挙げられる。これらの中でも、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＯＬＬ１０７３Ｒ−１（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７４１）が好ましい。
本発明の抗ウイルス剤または抗ウイルス用飲食品組成物中の中性多糖体は、１種が単独で含まれていてもよいし、種類の異なる２種以上が含まれていてもよい。

本発明に用いられる中性多糖体としては、中性多糖体を含む乳酸菌の培養物をそのまま精製せずに用いてもよいし、特開２０００−２４７８９５号公報に記載された方法等を用いて、中性多糖体を含む乳酸菌の培養物から単離もしくは必要に応じて更に精製された中性多糖体を用いてもよい。

単離方法または精製方法としては、特に限定されず、例えば、以下の手順による単離及び精製方法が挙げられる。
１．培地にトリクロロ酢酸を最終濃度が１０％になるように加えて、タンパク質を変性させ、変性タンパク質を含む培養物を得る。
２．遠心分離によって、前記培養物から変性タンパク質と菌体を除去し、多糖体含有物を得る。
３．エタノール沈殿によって、前記多糖体含有物中の高分子量の多糖体を沈殿させ、沈殿物を回収する。
４．陰イオン交換樹脂によって、前記３で得られた液分中の酸性多糖体を吸着させ、残りの溶出液から中性多糖体含有物を回収する。
５．前記中性多糖体含有物に対して、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ処理を行い、核酸を分解する。
６．前記５の処理後の中性多糖体含有物に対して、プロテイナーゼ処理を行い、タンパク質を分解する。
７．前記６の処理後の中性多糖体含有物を９０℃、１０分間加熱して、酵素を失活させる。
８．前記７の処理後の中性多糖体含有物に対して、エタノール沈殿及び透析を行い、中性多糖体を精製する。

上記単離及び精製方法によって１０７３Ｒ−１株の培養物から得られる中性多糖体は、下記式（１）に示す構造単位を有する推定分子量が約４．３ＭＤａの多糖体である。

本発明で用いられる中性多糖体は、前記乳酸菌の培養物としてそのまま用いる以外に、該培養物の濃縮物、ペースト状に加工したペースト化物、噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物、媒体に分散させた液状物、希釈剤で希釈した希釈物、乾燥物をミルなどで破砕してなる破砕物などの、処理工程を経た被処理物として用いることができる。前記処理工程は、単独であっても複数を併用してもよい。

中性多糖体を有効成分とする本発明の抗ウイルス剤の投与量は、投与経路、ヒトを含む投与対象動物の年齢、体重、症状など、種々の要因を考慮して、適宜設定することができる。本発明の抗ウイルス剤の投与量は、特に限定されないが、有効成分である中性多糖体の量として、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ／日（ｄａｙ）以上、より好ましくは５ｍｇ／ｋｇ／日以上、特に好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ／日以上である。しかしながら、長期間に亘って予防及び／または治療の目的で摂取する場合には、抗ウイルス剤の投与量は、上記の好ましい量よりも少量であってもよい。また、本発明で用いられる有効成分は、食品であるヨーグルトに含まれるものであって、安全性の点で問題がないので、抗ウイルス剤の投与量は、有効成分である中性多糖体の量として、例えば、上記の量（１ｍｇ／ｋｇ／日）を大きく超える量（例えば、１００ｍｇ／ｋｇ／日）でもよい。
なお、前記の中性多糖体の量に関する各値（例えば、１ｍｇ／ｋｇ／日以上）は、抗ウイルス剤のみならず、後述の飲食品組成物においても適用される。
また、本発明の抗ウイルス剤は、経口投与と非経口投与（筋肉内、皮下、静脈内、坐薬、経皮等）のいずれでも投与できる。

本発明の抗ウイルス剤の投与形態としては、治療目的や投与経路等に応じて選択することができ、例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、注射剤、坐剤、浸剤、煎剤、チンキ剤等が挙げられる。これらの各種製剤は、常法に従って、主薬に対して必要に応じて充填剤、増量剤、賦形剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。また、この医薬製剤中に着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有させてもよい。

本発明の飲食品組成物は、乳酸菌が産生する中性多糖体を有効量含むものである。
飲食品組成物の形態としては、ヨーグルトのような発酵乳や、飲料や、保健機能食品や、病者用食品等が挙げられる。我国の保健機能食品制度は、国内外の動向、及び、従来からの特定保健用食品制度との整合性を踏まえて、通常の食品のみならず、錠剤、カプセル等の形状を有する食品を対象として設けられたものであり、特定保健用食品（個別許可型）と栄養機能食品（規格基準型）の２種類の類型からなる。本発明においては、ＮＫ細胞を活性化する中性多糖体を含有する飲食品を、特定保健用食品または栄養機能食品として直接摂取することによって、ウイルス感染に対する予防および／または治療が可能となる。

本発明の飲食品組成物としては、各種飲食品（例えば、牛乳、清涼飲料、発酵乳、ヨーグルト、チーズ、パン、ビスケット、クラッカー、ピッツァクラスト、調製粉乳、流動食、病者用食品、幼児用粉乳等食品、授乳婦用粉乳等食品、栄養食品等）に、ＮＫ細胞を活性化する中性多糖体を添加したものが挙げられる。この場合、有効成分である中性多糖体は、そのまま添加してもよいし、他の食品もしくは食品成分と混合した後に、添加してもよい。中性多糖体は、通常の食品組成物における常法にしたがって使用できる。また、本発明の飲食品組成物の性状は、飲食品の通常の性状、例えば、固体状（粉末、顆粒状、その他）、ペースト状、液状、懸濁状のいずれでもよい。

本発明の飲食品組成物の主成分としては、特に限定されないが、水、タンパク質（分解物を含む。）、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類等を使用することができる。
タンパク質またはその分解物としては、例えば、全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、ホエイ粉、ホエイタンパク質、ホエイタンパク質濃縮物、ホエイタンパク質分離物、α―カゼイン、β―カゼイン、κ−カゼイン、β―ラクトグロブリン、α―ラクトアルブミン、ラクトフェリン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、これら加水分解物；ホエイ、クリーム、非タンパク態窒素等の各種乳由来成分等が挙げられる。
糖類としては、加工澱粉（テキストリンのほか、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維、乳糖などが挙げられる。
脂質としては、例えば、バター、クリーム、リン脂質等の各種乳由来成分；ラード、魚油等、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の動物性油脂；パーム油、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂などが挙げられる。
ビタミン類としては、例えば、ビタミンＡ、カロチン類、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＤ群、ビタミンＥ、ビタミンＫ群、ビタミンＰ、ビタミンＱ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸などが挙げられる。
ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレン、乳清ミネラルなどが挙げられる。
有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸などが挙げられる。
これらの成分は、２種以上を組み合わせて使用することができる。また、本発明の飲食品組成物の主成分は、合成品でもよいし、合成品を多く含むものでもよい。

本発明において、中性多糖体の含有割合は、その目的、用途（抗ウイルス剤、飲食品組成物）等に応じて任意に定めることができ、特に限定されないが、抗ウイルス剤または飲食品組成物の全体量に対して、好ましくは０．００２〜０．０１４％（ｗ／ｗ）、より好ましくは０．００２〜０．００４％（ｗ／ｗ）である。

以下、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。なお、本明細書において、「％」の表示は、明示しない場合には「重量％」を示す。

［中性多糖体（ＮＰＳ）の製造例］
脱脂粉乳を１０％（ｗ／ｖ）でＭｉｌｌｉＱ水に溶解し、１２０℃、７分間滅菌して、培地を作製した。本培地を用いて、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＯＬＬ１０７３Ｒ−１（１０７３Ｒ−１株）を３７℃、１８時間、好気条件下で静置培養した。
培養液に１００％トリクロロ酢酸（和光純薬工業社製）を最終濃度が１０％となるように加え、粘性が無くなるまで、よくかき混ぜた。得られた培養液を遠心分離（１２０００ｇ、４℃、２０分間）することにより、上清を回収した。上清をよくかき混ぜながら、等量の冷エタノールを加えた。その後、得られた液体を４℃で一晩静置することで、中性多糖体（ＮＰＳ）と酸性多糖体（ＡＰＳ）の混合物を沈澱させた。この沈殿物含有物を遠心分離することによって、沈殿した混合物を回収した。回収した混合物は、ＭｉｌｌｉＱ水に溶解した。得られた水溶液を、透析膜（ＭＷＣＯ３５００、ＳＰＥＣＴＲＡＭ社製）を用いて、ＭｉｌｌｉＱ水に対して透析を行った。さらに、透析後の水溶液を、０．０２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）溶液とした。
この水溶液を、陰イオン交換樹脂ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（商品名；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を充填したカラムにチャージして、酸性多糖体（ＡＰＳ）をカラムに吸着させた。この時カラムを通過した水溶液には、中性多糖体（ＮＰＳ）が含まれており、この中性多糖体（ＮＰＳ）を含む水溶液を回収した。回収した中性多糖体（ＮＰＳ）を含む水溶液を、透析膜を用いて、ＭｉｌｌｉＱ水に対して透析を行った。透析終了後、中性多糖体（ＮＰＳ）を含む水溶液を、１ｍＭのＭｇＣｌ₂を含む０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）の溶液とした。この溶液に、最終濃度が２μｇ／ｍｌとなるように、ＤＮaｓｅＩ（ＴｙｐｅII、Ｓｉｇｍａ社製）、及び、ＲＮaｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を加えて、３７℃、６時間インキュベートすることで、核酸の消化を行った。その後、最終濃度が０．１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（Ｓｉｇｍａ社製）を加えて、３７℃、１６時間インキュベートすることで、タンパク質の消化を行った。酵素処理の終了後、この溶液を９０℃、１０分間加熱することで、酵素を失活させた。得られた中性多糖体（ＮＰＳ）を含む水溶液を、４℃まで冷却後、よくかき混ぜながら、等量の冷エタノールを加え、その後４℃で一晩静置することで、中性多糖体（ＮＰＳ）を沈澱させた。遠心分離によって、中性多糖体（ＮＰＳ）を沈澱として回収し、回収した中性多糖体（ＮＰＳ）をＭｉｌｌｉＱ水に溶解し、中性多糖体（ＮＰＳ）水溶液とした。中性多糖体（ＮＰＳ）水溶液を、透析膜を用いて、ＭｉｌｌｉＱ水に対して透析を行った後、凍結乾燥させた。

＜実施例１＞
［マウスへの経口投与によるＮＫ活性の評価例］
２０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、７週齢）を１週間馴化後、体重を測定し、ｎ＝１０で平均体重がほぼ同じとなる２群（平均体重：約２１ｇ）に群分けした。一方の群はコントロール群として、蒸留水を各個体に０．４ｍｌ／ｄａｙ投与し、他方の群には各個体に中性多糖体（ＮＰＳ）を２０μｇ（０．４ｍｌ）／ｄａｙの用量で３週間経口投与を行った。その後、マウスを頸椎脱臼にて安楽死させ、脾臓細胞を採取し調製した。
調製した脾臓細胞について、ＹＡＣ−１細胞をターゲット細胞として、ＦＡＣＳを用いてＮＫ活性の測定を行った。脾臓細胞とＹＡＣ−１細胞の比率は５０：１になるように設定した。また、脾臓細胞のＮＫ活性の測定は、ＩＦＮ−αによる刺激前と刺激後の各時点で行った。ＩＦＮ−αによる刺激は、９６穴（丸底）のマイクロプレートに播種した脾臓細胞を、ＩＦＮ−αを１０００ｕｎｉｔ／ｍｌで添加した培地で４時間インキュベートすることにより行った。

得られた結果をＩＦＮ−αによる刺激の前後で比較した。その結果、脾臓細胞をＩＦＮ−αによって刺激しなかった場合には、ＮＰＳ投与群のＮＫ活性は、蒸留水投与群（コントロール群）に比べてほとんど変化しなかった（図１）。一方、脾臓細胞をＩＦＮ−αによって刺激した後のＮＫ活性については、ＮＰＳ投与群のＮＫ活性は、蒸留水投与群（コントロール群）に比べて有意に上昇した（図２）。なお、図１及び図２中、「蒸留水」は、蒸留水投与群（コントロール群）を意味する。また、「ＮＰＳ」は、ＮＰＳ投与群を意味する。

＜実施例２＞
実施例１にてＩＦＮ−αによる刺激後のＮＫ活性の増強効果が認められたＮＰＳを産生する乳酸菌である１０７３Ｒ−１株を用いて、常法により、乳酸菌飲食品としてヨーグルトを製造したところ、本発明の飲食品組成物に該当する、中性多糖体（ＮＰＳ）を含有する所望の抗ウイルス用のヨーグルト食品を得ることができた。

＜実施例３＞
実施例１にてＩＦＮ−αによる刺激後のＮＫ活性の増強効果が認められたＮＰＳを産生する乳酸菌である１０７３Ｒ−１株を用いて、常法により乳酸菌濃縮物を作製し、この乳酸菌濃縮物を用いて、常法により適宜の医薬品用添加剤を併用して錠剤を製造して、本発明の抗ウイルス剤に該当する、中性多糖体（ＮＰＳ）を含有する所望の抗ウイルス用の錠剤を得た。
なお、上記乳酸菌濃縮物の代わりに乳酸菌乾燥物を用いてもよい。また、上記錠剤の代わりにカプセル剤またはシロップ剤として製剤することもできる。

以上のように、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＯＬＬ１０７３Ｒ−１（１０７３Ｒ−１株）の脱脂粉乳培地培養物から精製した中性多糖体を投与した群では、ＩＦＮ−αによって刺激した際の脾臓細胞のＮＫ活性が、蒸留水投与群に比べて有意に上昇した。したがって、１０７３Ｒ−１株が産生する中性多糖体は、生体がウイルスに感染した際に産生されるＩＦＮ−αに応答したＮＫ活性の上昇を増強することで、抗ウイルス活性を示すことが示唆される。また、１０７３Ｒ−１株を発酵に使用したヨーグルトは、前記の中性多糖体を含有することから、このヨーグルトについても、抗ウイルス活性が得られる。すなわち、安全で安価な食品を毎日摂取することで、平素から自然免疫を高め、ワクチンのようなウイルス特異性がない、ウイルス感染前から可能な予防的効果が期待できる。

Claims (6)

1. （ｉ）乳酸菌である Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓが産生する中性多糖体であること、（ｉｉ）ＩＦＮ−αによる刺激に応答して、中性多糖体を与えない場合に比べてｔ検定においてＰ＜０．００１で有意に大きくＮＫ細胞の活性を上昇させることができる中性多糖体であること、および（ｉｉｉ）下記式（１）：
   

   

   に示す構造単位を有する中性多糖体であること、の条件を満たす中性多糖体を有効成分として含む抗ウイルス剤を有効量で含む発酵乳を製造するための方法であって、前記乳酸菌である Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓを使用して、原料乳を発酵させて、前記抗ウイルス剤の有効成分である前記中性多糖体を有効量で含む発酵乳を得ることを特徴とする発酵乳の製造方法。
2. 前記乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＯＬＬ１０７３Ｒ−１（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７４１）である請求項１に記載の発酵乳の製造方法。
3. 下記の工程１〜８からなる精製方法によって、前記中性多糖体を得る請求項１又は２に記載の発酵乳の製造方法。
   １．前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓを使用して得られた前記中性多糖体を含む乳酸菌の培養物に、トリクロロ酢酸を加えて、タンパク質を変性させ、変性タンパク質を含む培養物を得る工程
   ２．工程１で得られた培養物から、遠心分離によって、変性タンパク質と菌体を除去し、多糖体含有物を得る工程
   ３．エタノール沈殿によって、工程２で得られた前記多糖体含有物中の高分子量の多糖体を沈殿させ、沈殿物を回収し、液分を得る工程
   ４．陰イオン交換樹脂によって、工程３で得られた液分中の酸性多糖体を吸着させ、残りの溶出液から中性多糖体含有物を回収する工程
   ５．工程４で得られた前記中性多糖体含有物に対して、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ処理を行い、核酸を分解する工程
   ６．工程５の処理後の中性多糖体含有物に対して、プロテイナーゼ処理を行い、タンパク質を分解する工程
   ７．工程６の処理後の中性多糖体含有物を加熱して、酵素を失活させる工程
   ８．工程７の処理後の中性多糖体含有物に対して、エタノール沈殿及び透析を行い、中性多糖体を精製する工程
4. （ｉ）乳酸菌である Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓが産生する中性多糖体であること、（ｉｉ）ＩＦＮ−αによる刺激に応答して、中性多糖体を与えない場合に比べてｔ検定においてＰ＜０．００１で有意に大きくＮＫ細胞の活性を上昇させることができる中性多糖体であること、および（ｉｉｉ）下記式（１）：
   

   

   に示す構造単位を有する中性多糖体であること、の条件を満たす中性多糖体を有効成分として含む抗ウイルス剤を製造するための方法であって、前記乳酸菌である Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓを使用して、原料乳を発酵させて、前記抗ウイルス剤の有効成分である前記中性多糖体を有効量で含む発酵乳を得る発酵工程を含むことを特徴とする抗ウイルス剤の製造方法。
5. 前記乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＯＬＬ１０７３Ｒ−１（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７４１）である請求項４に記載の抗ウイルス剤の製造方法。
6. 下記の工程１〜８からなる精製方法によって、前記中性多糖体を得る請求項４又は５に記載の抗ウイルス剤の製造方法。
   １．前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓを使用して得られた前記中性多糖体を含む乳酸菌の培養物に、トリクロロ酢酸を加えて、タンパク質を変性させ、変性タンパク質を含む培養物を得る工程
   ２．工程１で得られた培養物から、遠心分離によって、変性タンパク質と菌体を除去し、多糖体含有物を得る工程
   ３．エタノール沈殿によって、工程２で得られた前記多糖体含有物中の高分子量の多糖体を沈殿させ、沈殿物を回収し、液分を得る工程
   ４．陰イオン交換樹脂によって、工程３で得られた液分中の酸性多糖体を吸着させ、残りの溶出液から中性多糖体含有物を回収する工程
   ５．工程４で得られた前記中性多糖体含有物に対して、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ処理を行い、核酸を分解する工程
   ６．工程５の処理後の中性多糖体含有物に対して、プロテイナーゼ処理を行い、タンパク質を分解する工程
   ７．工程６の処理後の中性多糖体含有物を加熱して、酵素を失活させる工程
   ８．工程７の処理後の中性多糖体含有物に対して、エタノール沈殿及び透析を行い、中性多糖体を精製する工程

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