KR20220091427A - 락토바실러스 사케아이 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 락토바실러스 사케아이(Lactobacillus sakei) 유래 세포밖 소포체(extracellular vesicles)를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다. 이에 의하여 본 발명의 조성물은 수지상 세포로부터 tolDC 유도를 촉진하여 CD4 T 세포의 증식을 직접 억제하고, DC-SIGN 및 DCIR과 같은 면역 억제활성 유도 유전자의 발현을 촉진함으로써 류마티스 관절염 등의 자가면역질환을 예방, 치료 또는 개선할 수 있다.

Description

락토바실러스 사케아이 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물{A composition for improving, preventing and treating autoimmune diseases comprising extracellular vesicles from Lactobacillus sakei}

본 발명은 류마티스 관절염 등의 자가면역질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

면역체계는 외부로부터 침입한 항원(antigen)으로부터 신체를 보호하는 역할을 한다. 항원의 종류로는 박테리아, 바이러스, 독소, 암세포, 타인이나 동물의 혈액과 조직이 이에 해당된다. 면역체계는 이와 같은 해로운 물질들을 파괴하기 위하여 항체를 생산한다. 그러나 자가 면역에 이상이 생긴 경우 면역체계는 자신의 건강한 신체의 장기와 해로운 항원을 구분하지 못하여, 정상적인 조직을 파괴하게 되는데 이러한 반응을 통해 유발되는 질환이 자가면역질환(autoimmune disease)이다.

자가면역질환 중 대표적인 류마티스 관절염은 여러 관절에 다발성으로 나타나는 염증성 자가면역질환이다. 류마티스성 관절염 증상을 가진 환자의 활막조직과 활액은 염증성 세포인 대식세포, T-세포, B 세포, 수지상 세포(dendritic cells) 등이 과도하게 작용하여 만성염증을 일으키고, 관절 및 연골 손상을 야기하고 통증을 유발하는 것을 특징으로 한다.

자가 면역 반응의 치료는 자가 면역 반응을 조절하고, 신체의 손상된 면역기능을 회복시키는 것을 목적으로 이루어지며, 이는 다양한 자가 면역 질환의 종류에 따라 치료의 방법에 차이가 있다. 예를 들어, 혈액에 문제가 생긴 경우에는 수혈을 해야하며, 뼈, 관절 혹은 근육에 문제가 생긴 경우에는 운동이나 다른 기능적인 치료를 받아야 한다. 또한 면역 체계의 반응을 조절하기 위해서 약물이 처방된다. 이에 따라 처방되는 면역억제제(immunosuppressive medicine)로는 코르티코스테로이드(corticosteroids) 약물인 프레드니손(prednisone), 비스테로이드성(nonsteroid) 약물인 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 아자티오프린(azathioprine), 및 타크로리무스(tacrolimus) 등이 알려져 있다.

그러나 이러한 치료제들은 체내 부작용을 유발할 수 있으며 치료 효과도 충분하지 못하므로 안전성이 보장되면서도 치료 효과가 우수한 새로운 류마티스 관절염 등 자가면역질환 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

한국등록특허 제10-1300086호

본 발명의 목적은 수지상 세포로부터 tolDC 유도를 촉진하여 CD4 T 세포의 증식을 직접 억제하고, DC-SIGN 및 DCIR과 같은 면역 억제활성 유도 유전자의 발현을 촉진함으로써 류마티스 관절염 등의 자가면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 수지상 세포로부터 tolDC 유도를 촉진하여 CD4 T 세포의 증식을 직접 억제하고, DC-SIGN 및 DCIR과 같은 면역 억제활성 유도 유전자의 발현을 촉진함으로써 류마티스 관절염 등의 자가면역질환을 예방 또는 개선할 수 있는 식품 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면,

락토바실러스 사케아이(Lactobacillus sakei) 유래 세포밖 소포체(extracellular vesicles)를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.

상기 자가면역질환은 류마티스성 관절염 (rheumatoid arthritis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 루프스(lupus), 아토피 피부염, 비염, 원형탈모증(alopecia areata), 건선(psoriasis), 천포창, 천식， 아프타 구내염， 만성 갑상선염， 후천성 재생불량성 빈혈， 베체트병(Behcet's disease), 크론병， 규소 폐증, 연쇄상구균감염후 사구체신염(PSGN), 피부근염(dermatomyosit is)， 다발성 근염(polymyositis), 자가면역성 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 자가면역성 뇌척수염， 중증 근무력증(myasthenia gravis), 그레이브병(Grave's disease) 및 결절성 다발성 동맥염(polyarteritis nodosa) 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

상기 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 수지상 세포로부터 tolDC(Autologous tolerogenic dendritic cell)의 유도 촉진용일 수 있다.

상기 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 CD4 T 세포의 증식 억제용일 수 있다.

상기 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 DC-SIGN 및 DCIR 중에서 선택된 1종 이상의 면역 억제활성 유도 유전자의 발현 촉진용일 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 측면에 따르면,

락토바실러스 사케아이(Lactobacillus sakei) 유래 세포밖 소포체(extracellular vesicles)를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 예방 또는 개선용 식품 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 또 하나의 측면에 따르면,

(a) 락토바실러스 사케아이(Lactobacillus sakei)를 배양하는 단계;

(b) 상기 락토바실러스 사케아이가 배양된 배양액을 원심분리하여 배양 상층액을 회수하는 단계; 및

(c) 상기 배양 상층액을 염화나트륨을 포함하는 유기용매와 혼합하여 반응시킨 후 원심분리하여 세포밖 소포체 펠릿을 수득하는 단계; 및

(d) 상기 세포밖 소포체 펠릿을 세포밖 소포체 추출 버퍼에 재현탁시켜 현탁액을 제조하고, 상기 현탁액으로부터 세포밖 소포체를 분리하는 단계;를 포함하는 자가면역질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 락토바실러스 사케아이(Lactobacillus sakei) 유래 세포밖 소포체(extracellular vesicles)를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 수지상 세포로부터 tolDC 유도를 촉진하여 CD4 T 세포의 증식을 직접 억제하고, DC-SIGN 및 DCIR과 같은 면역 억제활성 유도 유전자의 발현을 촉진함으로써 류마티스 관절염 등의 자가면역질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 락토바실러스 사케아이(Lactobacillus sakei) 유래 세포밖 소포체(extracellular vesicles)를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 예방 또는 개선용 식품 조성물은 수지상 세포로부터 tolDC 유도를 촉진하여 CD4 T 세포의 증식을 직접 억제하고, DC-SIGN 및 DCIR과 같은 면역 억제활성 유도 유전자의 발현을 촉진함으로써 류마티스 관절염 등의 자가면역질환을 예방 또는 개선할 수 있다.

도 1은 실시예 1에 따라 분리된 락토바실러스 사케아이 유래 세포밖 소포체의 전자현미경 사진이다.
도 2는 실험예 1에 따른 성숙 수시상 세포에서 tolDC 유도 분석 결과이다.
도 3은 실험예 2에 따른 DC-SIGN의 발현에 대한 qPCR 분석 결과이다.
도 4는 실험예 2에 따른 DCIR의 발현에 대한 qPCR 분석 결과이다.
도 5는 실험예 3에 따른 CD4 T 세포 활성 억제능 분석 결과이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하도록 한다. 그러나, 이하의 설명은 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다. 본원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 락토바실러스 사케아이(Lactobacillus sakei) 유래 세포밖 소포체(extracellular vesicles)를 유효성분으로 포함한다.

본 명세서에서, 락토바실러스 사케아이는 제한되지 않으나, 바람직하게는 김치 유래의 락토바실러스 사케아이, 보다 바람직하게는 수탁번호 KCTC13818BP로 기탁된 락토바실러스 사케아이이다.

상기 수탁번호 KCTC13818BP의 락토바실러스 사케아이는 생물자원센터에 2019년 03월 07일자로 기탁되었다.

상기 자가면역질환은 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 루프스(lupus), 아토피 피부염, 비염, 원형탈모증(alopecia areata), 건선(psoriasis), 천포창, 천식， 아프타 구내염， 만성 갑상선염， 후천성 재생불량성 빈혈， 베체트병(Behcet's disease), 크론병， 규소 폐증, 연쇄상구균감염후 사구체신염(PSGN), 피부근염(dermatomyosit is)， 다발성 근염(polymyositis), 자가면역성 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 자가면역성 뇌척수염， 중증 근무력증(myasthenia gravis), 그레이브병(Grave's disease) 및 결절성 다발성 동맥염(polyarteritis nodosa) 중에서 선택된 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 또는 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome)일 수 있고, 더욱 바람직하게는 류마티스 관절염 일 수 있다.

상기 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 수지상 세포로부터 tolDC(Autologous tolerogenic dendritic cell)의 유도 촉진용일 수 있다.

상기 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 CD4 T 세포의 증식 억제용일 수 있다.

CD4 T 세포는 헬퍼 T 세포로 다양한 면역 세포를 활성화 시키는 세포군을 뜻한다. CD4 T 세포라는 집합체 안에 Tfh2세포를 포함한 다양한 Th1, Th2, Th1 7등의 CD4 T 세포들이 존재한다

상기 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 DC-SIGN(Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin) 및 수지상 세포 면역수용체(dendritic cell immunoreceptor, DCIR) 중에서 선택된 1종 이상의 면역 억제활성 유도 유전자의 발현 촉진용일 수 있다.

DC-SIGN은 보체 수용체의 일종으로, C1q를 리간드로 하여 작용한다. C형 렉틴(C-type lectin, CLEC)의 수용체인 C형 렉틴 수용체(C-type lectin receptor, CLR)에 속하고, 큰포식세포(macrophage)와 수지상세포(dendritic cell)에서 주로 발현되는 수용체이다. 큰포식세포 중에서도 림프절(lymph node)이나 비장의 가장자리(marginal zone)에 존재하는 큰포식세포들에서 DC-SIGN과 그에 유사한 수용체들이 자주 발견된다. 한편, 수지상세포는 T 세포에게 항원제시(antigen presentation)를 담당하는데, 이 과정에서 DC-SIGN을 포함한 수지상 세포 표면의 CLR들이 관여할 수 있다. DC-SIGN은 CLR 중에서도 효율적으로 CD4 T 세포에 항원 제시가 가능하다.

한편, 수지상 세포 면역수용체(DCIR)는 수지상 세포와 골세포 표면에 있는 당단백질인 NA2(asialo-biantennary N-glycan)와의 상호작용으로 염증반응을 억제할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "세포밖 소포체(extracellular vesicle)"는 다양한 세포에서 다낭체와 원형질막의 융합을 통해 세포 밖 환경으로 분비되는 20 내지 1,000 nm 범위 직경의 지질 이중막 구조의 소낭을 의미한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 방법으로 제조되는 세포밖 소포체의 평균직경은 20 내지 500 nm 일 수 있고, 바람직하게는 50 내지 300 nm, 더욱 바람직하게는 150 내지 200nm 범위일 수 있다. 이와 같은 범위의 미세 직경을 갖는 세포밖 소포체를 엑소좀(exosome)이라고 한다.

이하, 락토바실러스 사케아이(Lactobacillus sakei) 유래 세포밖 소포체(extracellular vesicles)를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조방법에 대해 설명하도록 한다.

먼저, 락토바실러스 사케아이(Lactobacillus sakei)를 배양한다(단계 a).

락토바실러스 사케아이는 김치 추출물의 원액으로부터 수득될 수 있다.

다음으로, 상기 락토바실러스 사케아이가 배양된 배양액을 원심분리하여 배양 상층액을 회수한다(단계 b).

이후, 상기 배양 상층액을 염화나트륨와 유기용매를 포함하는 용액과 혼합하여 반응시킨 후 원심분리하여 세포밖 소포체 펠릿을 수득한다(단계 c).

상기 배양 상층액과, 염화나트륨와 유기용매를 포함하는 용액는 1:0.5 내지 1:1.5 부피비로 혼합할 수 있고, 바람직하게는 1:0.8 내지 1:1.2의 부피비로 혼합할 수 있고, 더욱 바람직하게는 동량으로 혼합할 수 있다.

상기 유기용매는 폴리에틸렌글리콜일 수 있다.

상기 염화나트륨와 유기용매를 포함하는 용액은 염화나트륨 농도가 0.5 내지 1 M 인 것이 바람직하다.

상기 염화나트륨와 유기용매를 포함하는 용액과 혼합하여 반응시킨 후 원심분리한 후 상기 혼합 및 원심분리를 반복 수행할 수 있다.

마지막으로, 상기 세포밖 소포체 펠릿을 세포밖 소포체 추출 버퍼에 재현탁시켜 현탁액을 제조하고, 상기 현탁액으로부터 세포밖 소포체를 분리한다(단계 d).

상기 세포밖 소포체 추출 버퍼는 PBS(Phosphate-buffered saline)를 사용하는 것이 바람직하다.

한편, 본 명세서에서 용어 ‘유효성분으로 포함하는’이란 락토바실러스 사케아이 유래 세포밖 소포체의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 조성물 내에서 락토바실러스 사케아이 유래 세포밖 소포체는 예를 들어, 0.001 mg/kg 이상, 바람직하게는 0.1 mg/kg 이상, 보다 바람직하게는 10 mg/kg 이상, 보다 더 바람직하게는 100 mg/kg 이상, 보다 더욱 더 바람직하게는 250 mg/kg 이상, 가장 바람직하게는 1 g/kg 이상 포함된다. 락토바실러스 사케아이 유래 세포밖 소포체는 천연물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 락토바실러스 사케아이 유래 세포밖 소포체의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약학 조성물의 1일 투여량은 0.001-10g/㎏이다.

본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명은 락토바실러스 사케아이(Lactobacillus sakei) 유래 세포밖 소포체(extracellular vesicles)를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

상기 락토바실러스 사케아이는 제한되지 않으나, 바람직하게는 김치 유래의 락토바실러스 사케아이, 보다 바람직하게는 수탁번호 KCTC13818BP로 기탁된 락토바실러스 사케아이이다.

상기 락토바실러스 사케아이 유래 세포밖 소포체에 관한 내용은 상술한 락토바실러스 사케아이 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에서의 설명과 동일하므로 상세한 내용은 그 부분을 참조하기로 한다.

본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약학 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 알코올 음료류, 과자류, 다이어트바, 유제품, 육류, 초코렛, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 유효성분뿐 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명은 상기 락토바실러스 사케아이 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 건강기능식품이란, 락토바실러스 사케아이 유래 세포밖 소포체를 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 락토바실러스 사케아이 유래 세포밖 소포체의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 환제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 한 구체예에서, 본 발명의 건강기능식품은 환제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태일 수 있다.

상기 본 발명에 따른 락토바실러스 사케아이 유래 세포밖 소포체 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물은 사료첨가제 또는 사료로써 이용될 수 있다.

사료 첨가제로써 이용될 경우, 상기 조성물은 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립 형태로 제조될 수 있다. 상기 사료첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산등의 유기산이나 인산 나트륨, 인산 칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 사료로써 이용될 경우, 상기 조성물은 통상의 사료 형태로 제제화 될 수 있으며, 통상의 사료성분을 함께 포함할 수 있다.

상기 사료첨가제 및 사료는 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩, 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제 등을 더 포함할 수 있다.

상기 사료첨가제는 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 사료첨가제는 탑드레싱으로서 또는 이들을 동물사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 사료첨가제를 동물사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수전분, 락토오스, 수크로오스, 콩플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 사료첨가제는 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 사료첨가제는 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.

또한, 상기 사료첨가제 및 사료는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액촉진제 등을 함유할 수 있다. 상기 사료첨가제는 침주, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.

본 발명의 사료 또는 사료첨가제는 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물식이에 적용할 수 있다.

상기 포유류로서 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치동물, 및 실험용 설치동물뿐만 아니라, 애완동물(예: 개, 고양이) 등에게 사용할 수 있으며, 상기 가금류로서 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 및 메추라기 등에도 사용할 수 있고, 상기 어류로서 송어 등에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 자가면역질환 예방, 치료 또는 개선용 의약 또는 식품의 제조를 위한 락토바실러스 사케아이 유래 세포밖 소포체의 용도를 제공한다. 상기한 바와 같이 락토바실러스 사케아이 유래 세포밖 소포체는 자가면역질환의 치료 또는 개선을 위한 용도로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 포유동물에게 유효량의 락토바실러스 사케아이 유래 세포밖 소포체를 투여하는 것을 포함하는 자가면역질환의 개선, 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상(subject)인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

여기에서 사용된 용어 "유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 해당 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 유효량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 수 있다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 예방, 치료 또는 개선 방법에 있어서, 성인의 경우, 추출물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.001 g/kg 내지 10 g/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치료방법에서 락토바실러스 사케아이 유래 세포밖 소포체를 유효 성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하의 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.

또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실 험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.

[실시예]

실시예 1: 락토바실러스 사케아이 유래 세포밖 소포체(P12E) 분리

(1) 균주의 분리 및 동정

김치 추출물의 원액을 MRS 배지에 도말하여 얻은 균단일집락을 루프로 수거하여 MRS broth에 배양하였다. DNA 추출은 QIAamp DNA Mini Kit(QIAgen, Germany)를 사용하여 추출하였다. 추출된 DNA는 1% 아가로스 겔을 이용하여 확인하였으며, 16S rRNA gene을 증폭하기 위하여 추출된 genomic DNA를 주형으로 하여 PCR을 진행하였고, PCR 조건은 denaturation 95℃에서 1분, annealing 45℃에서 1 분, extension 72℃에서 1 분 30초로 30 사이클을 수행하였다. 얻어진 PCR 산물은 마크로젠(Seoul, Korea)에 의뢰하여 서열을 분석하였다. 세균의 동정은 16SrRNA 서열을 National Center for Biotechnology Information(NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 검색엔진의 유사도 분석을 통해 수행하였다.

상기 미생물을 락토바실러스 사케아이 WIKIM0109 (Lactobacillus sakei WIKIM0109)으로 명명하였으며, 생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호 KCTC13818BP).

(2) 세포밖 소포체 분리

락토바실러스 사케아이(수탁번호 KCTC13818BP)를 MRS 액체배지 30 ㎖에 0.1% 접종하여 30℃에서 18시간 동안 배양하였다. 배양 후, 3500 rpm, 4℃에서 10분간 1차 원심분리 후 10,000 x g, 4℃에서 20분간 2차 원심분리하여 배양 상층액을 회수하고, 최종 0.22 ㎛ 필터로 여과하여 균체가 제거된 배양 상층액을 회수하였다. 이후, 배양 상층액과 16% PEG 6000에 용해된 1 M NaCl 용액을 동량으로 섞어 4℃에서 15시간 반응시킨 후, 10,000 xg, 4℃에서 20분간 원심분리하여 세포밖 소포체(EV) 펠릿(pellet)을 얻었다. 세포밖 소포체 펠릿은 5% PEG 6000에 용해된 0.5 M NaCl 용액으로 재현탁(resuspension)시켜 세척 후, 11,000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리를 수행하였다. 원심분리 후 수득한 세포밖 소포체 펠릿을 PBS(Phosphate-buffered saline)에 재현탁시켜 최종적으로 락토바실러스 사케아이 유래 세포밖 소포체를 분리하였다. 락토바실러스 사케아이와 분리된 세포밖 소포체(화살표 표시)의 전자현미경 이미지를 도 1에 나타내었다.

비교예 1: 락토바실러스 사케아이 배양배지(P12 media)

실시예 1의 (1)에서 락토바실러스 사케아이를 배양한 배지를 준비하였다.

비교예 2: 락토바실러스 사케아이(P12)

실시예 1에서 세포밖 소포체를 분리하지 않고 (1)의 락토바실러스 사케아이를 준비하였다.

[실험예: 생체 외 실험]

수지상 세포 분화

(1) 골수로부터 미성숙 수지상 세포 분화

마우스의 대퇴골(femur)과 경골(tibia)의 골수세포(bone marrow cells)로부터 단핵구(monocytes)를 Ficoll-Paque® 밀도구배원심법(density gradient centrifugation)에 따라 원심분리하였다. 분리된 단핵구는 2 x 10⁶/well의 농도로 6 웰플레이트에 준비하였으며, 태아 소 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)이 포함된 배지(RPMI)에 GM-CSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) 20 ng/㎖, IL-4(interleukin 4) 10 ng/㎖를 함께 처리하였다. 그 후 6일 동안 배양하였으며 3일이 경과하였을 때, 신선한 배지와 사이토카인으로 교체해주어 분화된 미성숙 수지상 세포를 수득하였다.

(2) 성숙 수지상 세포의 분화

상술한 바와 같이 수득된 미성숙 수지상 세포(Immature DC)를 성숙 수지상 세포(mature DC)로 분화시키기 위해 양성 대조군 LPS(Lipopolysaccharide)를 2시간 동안 처리하여 성숙 수지상 세포로의 분화 및 활성을 유도하였다. 이후, 2차 자극원으로 비교예 2의 락토바실러스 사케아이, 실시예 1의 락토바실러스 사케아이 유래 세포밖 소포체(EV)를 각각 MOI(multiplicity of infection) 1로 접종하여 24시간 공동배양하였다.

실험예 1: 성숙 수시상 세포에서 tolDC 유도 분석

상술한 바와 같이 배양이 종료된 후 tolDC(Autologous tolerogenic dendritic cell)로의 분화가 유도되었는지 확인하기 위해 tolDC의 대표적인 마커인 PD-L1(Programmed Death-Ligand 1)의 발현정도를 유세포 분석(Flow cytometry)을 통해 확인하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 이에 따르면, 성숙 수지상 세포군(LPS 군)과 비교했을 때 실시예 1의 락토바실러스 사케아이 유래 세포밖 소포체 처리군(LPS+P12E 군)의 성숙 수지상 세포의 PD-L1 발현의 정도가 유의미하게 증가한 것으로 나타났다((**p<0.0445 vs LPS).

실험예 2: 수지상 세포의 면역 억제신호전달 유도 유전자 발현 분석

수지상 세포는 면역 활성신호와 면역 억제신호를 가지고 있으며 면역반응의 항상성을 위해 다양한 인자에 의해 각 신호가 전달된다. 가장 대표적인 활성신호 전달을 유도하는 유전자로 톨유사수용체 4(Toll-like receptor 4, TLR4)는 LPS를 인식하여 활성화되는 것이고, 대표적인 억제신호 전달 유도 유전자로 DC-SIGN(dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin), 수지상세포 면역수용체(dendritic cell immunoreceptor, DCIR)이 있다. DC-SIGN은 C-형 렉틴(lectin) 수용체로 많은 리간드가 존재하고, 톨유사수용체(TLR)와 동시 자극되면 면역반응을 억제할 수 있다.

성숙 수지상 세포의 활성을 감소시키는 락토바실러스 사케아이 유래 세포밖 소포체가 면역억제활성 유도 유전자 DC-SIGN 또는 DCIR을 인식하여 신호를 전달하는지 알아보기 위해 DC-SIGN의 발현을 qPCR을 통해 확인한 결과를 도 3에 나타내었고, DCIR의 발현을 qPCR을 통해 확인한 결과를 도 4에 나타내었다.

프라이머 정보와 qPCR 조건은 아래와 같다.

DC-SIGN:

(F) GCTCTGGTCCACCTTTGACA

(R) GGGTCCCATAAAAAGGTGTGC

DCIR

(F) TCC TGG CTT TGG ATC ACC AC

(R) TTG GCA CCT GAG GAC AAA GT

β-actin

(F) CACTGTCGAGTCGCGTCC

(R) TCATCCATGGCGAACTGGTG

PCR 조건

Denaturation 95 ℃/ 15 sec;

Annealing 60 ℃/30 sec

Extension 72 ℃/30 sec)

40 cycle

이에 따르면, 성숙 수지상 세포 처리군(LPS 군)에서 DC-SIGN 발현은 강하게 억제되는 것으로 나타났고, 비교예 1의 락토바실러스 사케아이 배양배지 처리군(LPS+P12 media)와 비교예 2의 락토바실러스 사케아이 처리군(LPS+P12)에서는 DC-SIGN 발현이 무처리군과 비슷한 수준으로 약간 증가였으며, 실시예 1의 락토바실러스 사케아이 유래 세포밖 소포체 처리군(LPS+P12E)에서는 DC-SIGN 발현이 현저히 증가하는 것으로 나타났다.

또한, 성숙 수지상 세포 처리군(LPS 군)에서 DC-IR 발현 또한 강하게 억제되는 것으로 나타났고, 비교예 1의 락토바실러스 사케아이 배양배지 처리군(LPS+P12 media)와 비교예 2의 락토바실러스 사케아이 처리군(LPS+P12)에서는 DC-SIGN 발현이 약간 증가하였으며, 실시예 1의 락토바실러스 사케아이 유래 세포밖 소포체 처리군(LPS+P12E)에서는 DC-IR 발현이 현저히 증가하는 것으로 나타났다.

실험예 3: CD4 T 세포 활성 억제능 분석

CD4 T 세포의 분열 증가는 T 세포가 활성화 되어 다양한 염증반응에 관여한다고 알려져 있다. 락토바실러스 사케아이 유래 세포밖 소포체에 의해 유도된 tolDC가 CD4 T 세포의 활성을 직접 억제할 수 있는지 분석하였다.

구체적으로, 상술한 바와 같이 비교예 2의 락토바실러스 사케아이와 24시간 배양된 수지상 세포, 실시예 1의 사케아이 유래 세포밖 소포체에 의해 24시간 배양된 수지상 세포를 준비하고, 마우스로부터 CD4 T 세포를 분리하고 셀 라벨링을 위해 CFSE(carboxyfluorescein succinimidyl ester) 염색하였다. 이후, tolDC로 유도된 배양된 수지상 세포: CFSE 염색된 CD4 T 세포를 1:1의 비율로 3일 동안 공동배양 하고, 3일 후 공동배양된 세포를 수거하여 CFSE의 감소 정도를 측정하였다. 이에 따른 CD4 T 세포 활성 억제능 분석 결과를 도 5에 나타내었다.

이에 따르면, LPS를 처리한 수지상 세포와 공동배양한 T 세포(LPS 처리군)은 약 90%의 증식율을 나타낸 것에 반해, 실시예 1의 락토바실러스 사케아이 유래 세포밖 소포체와 24시간 배양된 수지상 세포 처리군(LPS+P12E DCs)에서 CD4 T 세포의 증식이 LPS 처리군에 비하여 현저히 감소하여 약 60%의 증식율을 보여, 수지상 세포 무처리군(Non-DCs)에 가까운 수준으로 억제된 것을 확인할 수 있었다.

즉, 락토바실러스 사케아이 유래 세포밖 소포체의 면역 억제능은 락토바실러스 사케아이 유래 세포밖 소포체에 의해 유도된 tolDC가 CD4 T 세포의 활성을 직접 억제함으로써 구현됨을 확인하였다. 다시 말해, 본원발명의 락토바실러스 사케아이 유래 세포밖 소포체는 수지상 세포의 tolDC 유도를 촉진하고, tolDC는 CD4 T세포의 활성을 억제하여 류마티스 관절염을 개선시킬 수 있다.

하기에 본 발명의 분말을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

실시예 1의 세포밖 소포체 500 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

실시예 1의 세포밖 소포체 300 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

실시예 1의 세포밖 소포체 200 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

실시예 1의 세포밖 소포체 600 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO_4,12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

실시예 1의 세포밖 소포체 4 g

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100g으로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 과립제의 제조

실시예 1의 세포밖 소포체 1,000 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 mg

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 과립제에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 과립제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 기능성 음료의 제조

실시예 1의 세포밖 소포체 1,000 mg

구연산 1,000 mg

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 mL

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

생물자원센터(국제) KCTC13818BP 20190307

Claims (9)

1. 락토바실러스 사케아이(Lactobacillus sakei) 유래 세포밖 소포체(extracellular vesicles)를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 자가면역질환은 류마티스성 관절염 (rheumatoid arthritis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 루프스(lupus), 아토피 피부염, 비염, 원형탈모증(alopecia areata), 건선(psoriasis), 천포창, 천식， 아프타 구내염， 만성 갑상선염， 후천성 재생불량성 빈혈， 베체트병(Behcet's disease), 크론병， 규소 폐증, 연쇄상구균감염후 사구체신염(PSGN), 피부근염(dermatomyosit is)， 다발성 근염(polymyositis), 자가면역성 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 자가면역성 뇌척수염， 중증 근무력증(myasthenia gravis), 그레이브병(Grave's disease) 및 결절성 다발성 동맥염(polyarteritis nodosa) 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 수지상 세포로부터 tolDC(Autologous tolerogenic dendritic cell)의 유도 촉진용인 것을 특징으로 하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 CD4 T 세포의 증식 억제용인 것을 특징으로 하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 DC-SIGN 및 DCIR 중에서 선택된 1종 이상의 면역 억제활성 유도 유전자의 발현 촉진용인 것을 특징으로 하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
6. 제1항에 있어서,
   상기 락토바실러스 사케아이는 수탁번호 KCTC13818BP로 기탁된 락토바실러스 사케아이 WIKIM0109 (Lactobacillus sakei WIKIM0109)인 것을 특징으로 하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
7. 락토바실러스 사케아이(Lactobacillus sakei) 유래 세포밖 소포체(extracellular vesicles)를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
8. 락토바실러스 사케아이(Lactobacillus sakei) 유래 세포밖 소포체(extracellular vesicles)를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 예방 또는 개선용 사료 또는 사료첨가제.
9. (a) 락토바실러스 사케아이(Lactobacillus sakei)를 배양하는 단계;
   (b) 상기 락토바실러스 사케아이가 배양된 배양액을 원심분리하여 배양 상층액을 회수하는 단계; 및
   (c) 상기 배양 상층액을 염화나트륨와 유기용매를 포함하는 용액와 혼합하여 반응시킨 후 원심분리하여 세포밖 소포체 펠릿을 수득하는 단계; 및
   (d) 상기 세포밖 소포체 펠릿을 세포밖 소포체 추출 버퍼에 재현탁시켜 현탁액을 제조하고, 상기 현탁액으로부터 세포밖 소포체를 분리하는 단계;를 포함하는 자가면역질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물의 제조방법.

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