KR102581570B1 - 신규 바실러스 벨레젠시스 균주를 포함하는 면역증강용 조성물 - Google Patents

신규 바실러스 벨레젠시스 균주를 포함하는 면역증강용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 기탁번호 KCTC 15222BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) GV1 균주를 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 조성물 에 관한 것으로,
본 발명의 기탁번호 KCTC 15222BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) GV1 균주를 포함하는 조성물은 면역세포에서 사이토카인 촉진능 및 비장세포 증식 촉진능 등의 효과를 나타낼 수 있으므로, 면역력 증진용 제제, 면역 항암용 제제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

신규 바실러스 벨레젠시스 균주를 포함하는 면역증강용 조성물{Compositions for enhancing immunity comprising novel strain of Bacillus velezensis}
본 발명은 기탁번호 KCTC 15222BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) GV1 균주를 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 조성물에 관한 것이다.
생균제 (probiotics)는 일반적으로 건강에 유익한 생균 식품 첨가제로 정의되었으나 (Lilly and Stillwell, Science 147:747-748, 1965), 최근 들어 Salminen 등 (Int. J. Food Microbiol. 44:93-106, 1998)에 의해 인체나 동물의 건강을 증진시키기 위하여 고안된 식품 및 사료 또는 식이 첨가제에 들어있는 살아있는 미생물 제제라고 정의되고 있다. 생균제로 가장 많이 이용되고 있는 세균은 유산균으로서 락토바실러스 (Lactobacillus)와 스트렙토코쿠스 (Streptococcus) 등이 있다.
유산균 사균체는 생균과 비교하여 다양한 차이점을 가지고 있다. 사균체는 생균과 같이 장내에 정착하여 활성을 나타내는 것이 아니라 면역세포와 직접적인 접촉을 함으로써 면역조절에 기여하며, 살아있는 생균이 아니므로 위장관 내 가혹 환경(물리, 화학적 소화과정)에 영향을 받지 않으며, 열에 안정하여 보관 및 배송 기간 동안 일정한 기능성을 유지하고, 살균처리 공정이 포함된 제품에 다양하게 적용할 수 있다. 이러한 소재 안정성의 특성 덕분에 생균 뿐만 아니라 사균도 건강기능식품, 일반식품, 의약품, 동물사료, 화장품 원료 등에 적용되고 있으며(미국 등록특허 제8361481호), 유산균 사균체 시장은 일본의 경우 전체 유산균 시장의 25% 이상을 유산균 사균체 즉 파라바이오틱스가 차지하고 있다. 락토바실러스 (Lactobacillus), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 장내구균(Enterococcus)속에 한하여 사균체로 이용되고 있고, 바실러스 (Bacillus) 는 내생포자를 형성하기 때문에 사균화가 매우 어려우며, 현재 사균체 제작하는 방법, 면역세포에서의 사균체 활성 및 임상 결과 등은 널리 알려져 있지 않다. 또한, 타균주와의 교차오염이 문제가 되고 있어 실제 산업계에서 바실러스 균주 배양과 사균화 공정은 꺼려하고 있어 상용화가 어려운 실정이다.
이러한 배경 하에 본 발명자들은 안전하면서도 효과적으로 면역력을 증진시킬 수 있는 제제를 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 신규 바실러스 벨레젠시스 균주가 효과적으로 면역력을 증진시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 기탁번호 KCTC 15222BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) GV1 균주 또는 배양액을 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 기탁번호 KCTC 15222BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) GV1 균주 또는 배양액을 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 약학 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역력 증진 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 탁번호 KCTC 15222BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) GV1 균주 또는 배양액을 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 사료 조성물을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 발명의 하나의 양태는 기탁번호 KCTC 15222BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) GV1 균주 또는 배양액을 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 용어 "바실러스(Bacillus) 속"은 간균으로도 명명되는 자연계에 널리 분포하는 막대 모양의 호기성, 또는 통성 혐기성의 그람 양성 세균을 총칭한다. 자연에서 흔히 발견되는 바실러스 균주는, 독립 생활을 하는 종류와 병원균의 종류를 포함한다. 스트레스가 많은 환경 조건에서는 계란형의 내성포자들을 생성하여 연장된 기간 동안 휴면기로 머물 수 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 용어, "균주(strain)"은 한 개의 세포에서 유래한, 무성생식을 통해 증식하여 동질의 유전적 특징을 갖는 개체들의 집합을 의미하며, 하나의 종(species) 안에는 유전적 특징이 서로 다른 여러 개의 균주들(genetic variants)이 존재한다. 본 발명에서 균주는 바실러스 벨레젠시스를 의미하며, 구체적으로 기탁번호 KCTC 15222BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 GV1 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바실러스 벨레젠시스 GV1는 서열번호 1로 표시되는 16s rDNA 염기서열을 갖는다. 본 발명의 바실러스 벨레젠시스는 인삼 식초에서 유래한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서 용어 "사균체"는, 균주를 배양한 생균체의 열처리를 통해 제조되는 형태를 의미하는 것으로, 균주의 활성이 일어나지 못하도록 한 형태로서, 세포질, 박테리오신 등의 항균 활성 물질, 유기산 등을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사균체는 기탁번호 KCTC 15222BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 GV1 균주 또는 상기 균주의 배양물을 100℃내지 150℃, 구체적으로 105℃내지 140℃, 보다 구체적으로 110℃내지 130℃에서 5분 내지 30분, 구체적으로 7분 내지 25분, 보다 구체적으로 10분 내지 20분동안 열처리를 통해 제조되는 것일 수 있다.
본 발명의 "배양물"은 상기 균주를 배지에서 배양하여 수득한 산물을 의미한다. 그 예로 본 발명의 배양물은 바실러스 벨레젠시스의 배양 배지에서 상기 균주를 수확한 후 남은 배지에 잔존한 성분을 포함할 수 있다.
상기 배양물은 상기 바실러스 벨레젠시스 균주의 전체 배양물, 배양상등액, 파쇄물, 이들의 분획물 등이 될 수 있다. 이때, 상기 배양상등액은 상기 균주의 배양물을 원심분리하여 수득할 수 있고, 상기 파쇄물은 상기 균주를 물리적으로 또는 초음파처리하여 수득할 수 있으며, 상기 분획물은 상기 배양물, 배양상등액, 파쇄물 등을 원심분리, 크로마토그래피 등의 방법에 적용하여 수득할 수 있다.
본 발명의 균주의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 바실러스 속 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용될 수 있으며, 구체적으로는 본 발명의 균주를 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 또는 혐기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 발명에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루타메이트, 메티오닌, 라이신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있고, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다.
그 외에 상기 배지에는 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 균주의 배양 배지에는 L-아미노산 등이 첨가될 수 있다. 구체적으로는 글리신(glycine), 글루타메이트(glutamate), 및/또는 시스테인(cysteine) 등이 첨가될 수 있고, 필요에 따라서는 라이신(lysine) 등의 L-아미노산 이 더 첨가될 수 있으나 반드시 이에 제한되지 않는다.
상기 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 균주의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다.
본 발명에 있어서 용어 "면역 증강"은, 항원에 대한 생체 방어능을 증진시키는 것으로 구체적으로는 항원에 대한 세포성 및 체액성 면역능을 상승시키는 것으로서, 면역 조절 효과를 포함한다. 본 발명에서 면역 증강은 면역 관련 질병을 예방하는 효과를 내는 것이고, 특히 대식세포의 활성을 높여 외부 병원균에 대한 방어, 사멸세포 제거 및 면역매개체의 분비 등의 효과를 나타내는 것을 의미한다.
면역증강의 기작은 제한되지 않으나 예를 들어 대식세포 등 항원 제공 세포의 활성을 촉진하거나, 림프구에 대한 특이적인 활성을 촉진하여 이루어지는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에서 면역 증강은 면역세포에서 NO 생성 촉진, 전염증 사이토카인(pro-inflammatory cytokine) 구체적으로, 종양괴사인자-α (tumor necrosis factor;TNF-α), 인터루킨-6 (interleukin; IL-6) 또는 인터루킨-1β(interleukin; IL-1β) 생성 또는 분비 촉진능을 나타내거나, 비장세포에서 면역세포 증식 촉진능, 면역세포 생육 증진 효과를 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 면역 증강용 조성물은 대식세포 및 비장세포의 활성화를 통해 면역 억제를 개선할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 사균체를 처리하였을 때 대식세포에서 NO 생성량이 유의적으로 증가하였고 (도 2), TNF-α, IL-6, IL-1β, iNOS의 발현 또한 유의적으로 증가함을 확인하였다 (도 3, 도 4)
본 발명에서 사균체는 면역 항암 활성을 추가로 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 용어 "항암"은 암세포의 증식을 억제하거나 암세포를 사멸시키는 모든 활성을 의미한다. 항암은 일반적으로 암의 예방, 치료 또는 개선을 의미한다. 본 발명에서 "면역 항암"은 인체의 면역체계를 활성화 또는 강화 시켜서 암세포를 효과적으로 공격할 수 있도록 도와주는 것을 의미한다. 단독으로 사용되거나, 기존의 일반항암제나 표적치료제와 병행해 사용될 수도 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 사균체를 처리한 경우 주요 면역 기관인 비장 세포가 증진됨을 확인하였으며 (도 5), 면역세포인 NK 세포 활성을 증가시킴을 확인하였는 바 (도 6), 본 발명의 바실러스 벨레젠시스 GV-1 균주는 면역 항암 활성 또한 우수함을 알 수 있었다.
본 발명의 용어 "식품"이란, 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품, 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
본 발명의 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 높은 면역 증강 효과를 기대할 수 있으므로, 건강 증진 목적으로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
상기 건강 기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 '기능(성)'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나므로, 본 발명의 식품은 면역 증강 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용된다.
구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 본 발명의 화합물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄; 및 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강음료 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 내지 0.04 g, 구체적으로 약 0.02 내지 0.03 g이 될 수 있다.
상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강음료 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 기탁번호 KCTC 15222BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) GV1 균주 또는 배양액을 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 약학 조성물을 제공한다.
상기 "바실러스", "균주", "사균체", "면역 증강"은 전술한 바와 같다.
본 발명의 "약학적 조성물"은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 희석제는 비자연적으로 발생된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 액제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함된 상기 사균체의 함량은 약학 조성물이 면역 증강 효과를 가지는 한 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9 중량%, 보다 구체적으로는 0.01 내지 80 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 동물에 하루 동안 0.1 내지 500 mg/체중 kg으로 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 조성물의 투여 빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 약학 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역력 증진 방법을 제공한다.
상기 "약학 조성물"은 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어, "개체"는 면역력 증진이 요구되는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
본 발명의 용어, "투여"는 적절한 방법으로 개체에게 상기 약학 조성물을 도입하는 행위를 의미한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 기탁번호 KCTC 15222BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) GV1 균주 또는 배양액을 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 사료 조성물을 제공한다.
상기 "바실러스", "균주", "사균체", "면역 증강"은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미한다.
상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박 류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 기탁번호 KCTC 15222BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) GV1 균주를 포함하는 조성물은 면역세포에서 사이토카인 촉진능 및 비장세포 증식 촉진능 등의 효과를 나타낼 수 있으므로, 면역력 증진용 제제, 면역 항암용 제제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 균주의 마우스 면역세포에서의 세포독성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 균주의 마우스 면역세포에서의 Nitric oxide 발생량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 균주의 마우스 면역세포에서 면역 사이토카인 관련 유전자의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 균주의 마우스 면역세포에서 사이토카인 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 5은 균주의 마우스 비장세포에서 면역세포 증진능 (Ex-vivo)을 나타낸 그래프이다.
도 6은 환자 유래 위암세포주 (YAC-1 세포)에 대한 NK세포 활성도 측정한 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실험예 1. 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) GV1 분리 동정
인삼 식초로부터 분리 동정하였다.
인삼 식초 유래 유산균인 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) GV1 균주를 확보하였다.
상기 Bacillus velezensis GV1 균주는 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2022년 12월 5일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 15222BP를 부여받았다. 상기 균주는 서열번호 1의 rDNA 염기서열을 갖는 것으로 확인되었다.
실험예 2. 사균체 제조
바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) GV1을 MRS (Man Rogosa Sharpe) 배지에 24시간 동안 진탕배양기 (Shaking incubator, RPM180, 37℃를 이용하여 배양 후 원심분리기를 이용하여 (8000 x g, 4℃의 조건에서 10분 동안 원심분리를 실시하였다. 원심분리 후 상등액을 제거하고 PBS(phosphate buffer saline)를 이용하여 남아있는 잔여물을 2회 반복하여 세척하였다. 그 후, PBS를 사용하여 바실러스 벨레젠시스 GV1를 600nm에서 OD value 1로 설정한 후 121℃에서 15분간 열처리를 실시하고, 동결건조하였다. 동결건조된 시료를 10mg/mL로 현탁 후 sonication을 30분 동안 적용하여 사균체를 얻었다.
비교군으로 바실러스 벨레젠시스 kh2-2 균주를 이용하였으며, kh2-2는 오징어 젓갈에서 분리 동정하였고, 구체적으로 논문(Food Research International Volume 152)의 방법으로 사균체를 제조하였다.
실시예 1. 세포 생존율 확인 (MTT Assay)
DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)+10% FBS(Fetal bovine serum)+1% Antibiotics를 사용하여 마우스의 대식세포인 RAW264.7 (Seoul National University, Seoul, Korean) 세포를 96 well plates에 1X104well 농도로 처리한 후 인큐베이터(37℃, 5% CO)에서 24시간 동안 배양하였다. 실험예 1.에서 제조한 사균체 (2, 1, 0.5)μg/ml를 농도별로 처리하였고, 대조군으로 LPS (Lipopolysaccharide, 1μg/ml)를 처리하여 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 상등액을 제거하고, MTT 시약을 처리하고 3시간 후 분광광도계 (microplate reader, Molecular Devices Filter Max F5)를 이용하여 570nm에서 측정하였다 (도 1).
그 결과, RAW264.7세포에 사균체를 처리한 경우 90%이상의 세포 생존율을 나나내었고, 이를 통해 본 발명의 사균체는 세포 독성이 없음을 알 수 있었다.
실시예 2. NO(Nitric oxide) 측정
DMEM+10% FBS+1% Antibiotics를 사용하여 RAW264.7 (Seoul National University, Seoul, Korean) 세포를 96 well plates에 1X104well 농도로 처리한 후 (37℃, 5% CO2)에서 24시간 동안 배양하였다. 실험예 1.에서 제조한 사균체 (2, 1, 0.5)μg/ml 를 농도별로 처리하였고, 대조군으로 LPS (Lipopolysaccharide, 1μg/ml)를 처리하여 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, Griess 시약을 100μL와 상등액 100μL를 사용하여 분광광도계 (Molecular Devices Filter Max F5)를 이용하여 570nm에서 측정하였다 (도 2).
그 결과, 사균체를 처리했을 때 RAW264.7세포에서 NO의 생성을 농도의존적으로 유의하게 증가시킴을 확인하였고, 특히 대조군 (control) 대비 NO 생성량이 유의적으로 높은 활성을 나타내어, 사균체는 면역증진 지표 중 하나인 NO 생성을 활성화시킴을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 사균체는 면역증강 효과가 우수함을 알 수 있었다.
실시예 3. 사이토카인 발현 분석 (Quantitative Real-time PCR, qRT-PCR)
Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)시약을 사용해서 RNA를 추출하고 500ng으로 설정 후, Superscript First-Strand Synthesis Kit (Invitrogen, Carls-bad, CA, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 그 후, SYBR®Premix Ex TaqII RT-PCR Kit (TaKaRa, Japan)를 이용하여 CFX96TM Real-Time RT-PCR System으로 측정하였다. 합성된 cDNA를 Q-PCR Master Mix (GenDEOT, TX, USA)와 하기 표 1의 프라이머를 사용하여 TNF-α, IL-6, IL-1β, Inos 발현 수준을 분석하였다 (도 3).
TNF-α Forward; Reverse 5'-AGCCCACGTCGTAGCAAACCAC-3';
5'-AACACCCATTCCCTTCACAG-3'		 서열번호 2
서열번호 3
IL-6 Forward; Reverse 5'-GTTCTCTGGGAAATCGTGGA-3';
5'-TGTACTCCAGGTAGCTATGG-3'		 서열번호 4
서열번호 5
IL-1β Forward; Reverse 5'-TGCAGAGTTCCCCAACTGGTAC-3';
5'-GTGCTGCCTAATGTCCCCTT-3'		 서열번호 6
서열번호 7
iNOS Forward; Reverse 5'-AATGGCAACATCAGGTCGGCCA-3';
5'-GCTGTGTGTCACAGAAGTCT-3'		 서열번호 8
서열번호 9
GAPDH Forward; Reverse 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3';
5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'		 서열번호 10
서열번호 11
그 결과, 면역 관련 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β mRNA 발현량은 모두 사균체 처리 농도에 의존적으로 유전자 발현이 증가함을 확인하였고, 또한 NO 생산에 관여하는 iNOS의 유전자 발현 또한 증가함을 확인하였다.
이를 통해 본 발명의 사균체는 면역 증진 효능이 우수할 뿐만 아니라, 면역세포를 활성화시킨다는 점을 알 수 있었다.
실시예 4. 사이토카인 생성량 측정 (ELISA, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
사균체 (2,1,0.5)μg/ml를 농도별로 처리하였고, 대조군으로 LPS (Lipopolysaccharide, 1μg/ml)를 처리하여 인큐베이터에서 24시간 동안 배양한 후, 상등액을 이용하여 ELISA kits (R&D Systems, MN, USA)를 이용하여 TNF-α, IL-6를 측정하였다 (도 4).
그 결과, TNF-α, IL-6 사이토카인 모두 사균체 처리 농도에 의존적인 증가를 보이며, 특히 사균체를 처리한 경우 대조군(con) 대비 사이토카인 생성량이 현저히 증가함을 확인하였다.
이를 통해 본 발명의 사균체는 면역기능을 증진시킨다는 점을 알 수 있었다.
실시예 5. Ex vivo 비장세포 증식률 확인
실험동물(ICR mice)에서 비장을 적출한 후, lysis 버퍼(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 이용하여 적혈구를 제거하였다.
그 다음, RPMI 1640 culture medium+10% FBS+1% Antibiotics를 사용하여 인큐베이터에서 3시간 동안 배양한 후 비장세포 (2X105/well)를 96-well plate에 사균체 (2,1,0.5)μg/ml와 함께 처리하였다. 24시간이 지난 후, WST-8 kit를 사용하여 분광광도계 (Molecular Devices Filter Max F5)를 통해 값을 측정하였다 (도 5). 비장은 림프구를 만들고 적혈구를 파괴하는 조직이며, 비장은 혈액에서 유래되는 항원에 대해 반응하는 주요 면역 반응 기관으로, 특히 T 및 B 림프구의 성숙과 항원 자극에 의한 림프구의 분화가 이루어지기 때문에 비장 내 림프구의 증식은 면역 시스템에서 중요한 의미를 가진다. 비장세포가 증가함에 따라 면역기능이 개선됨을 나타낸다. 본 발명에서는 사균체를 처리한 경우 비장세포 증식률을 확인한 결과, 비장세포가 증가됨을 확인하였고, 특히 2μg/mL 농도에서 대조군 대비 약 30%이상 비장세포가 증가됨을 확인하였다. 또한, 24시간 후 비장세포 생육이 35~40% 이상 향상되었고, 36시간 후 비장 세포의 증진효과가 80% 이상 촉진되는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해, 본 발명의 사균체를 처리한 경우 면역기능을 개선 및 강화시킴을 알 수 있었다.
실시예 6. 환자 유래 위암세포주 (YAC-1 세포)에 대한 NK세포 활성도 측정
미생물 감염을 조절하고 면역 조절 역할을 하는 선천 면역 시스템의 효과기 림프구인 NK 세포 활성에도 영향을 미칠 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 실험을 수행하였다. 시료에 의한 NK-cell 활성화 조사는 시료가 주사된 마우스의 비장세포와 NK-sensitive 세포로 알려진 YAC-1 세포를 동시 배양 후, YAC-1의 살해 정도를 측정하였다.
구체적으로, ICR 마우스에 12.5 내지 100 ㎍/mL의 바실러스 벨레젠시스 GV-1를 처리하고, 마우스의 비장을 멸균적으로 취하여 비장을 추출 후 비장 세포를 5ml 주사 주사기의 플런저를 사용하여 4-6겹의 깨끗한 거즈에 통과시켜 각 비장 50ml 원추형 튜브에 단일 세포 현탁액을 얻은 후, 현탁액을 2-8°C에서 원심분리(300 - 400 x g)하여 세포를 취하여 5ml의 1X RBC Lysis Buffer로 재현탁하였다. 가끔 흔들면서 현탁액을 RT에서 4~5분 동안 배양 후 1X PBS 20~30ml를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 8°C에서 원심분리 (300 - 400 x g)하고 펠릿을 RPMI 1640 완전 성장 배지로 재현탁하였다. 암세포생육 억제능을 조사하기 위해 NK-sensitive 세포로 알려진 YAC-1 세포(target cell; 2 x 105 cells/well)[T]를 96-well plate에서 비장세포(effector cell; 2 x 106 cells/well)[E]와 함께 24 시간 배양하였다.
NK세포 생존율은 WST-8 assay kit를 이용하여 측정하였으며, 30분 배양 후 450 nm에서 흡광도를 측정하여, 아래의 계산식으로 NK세포 활성도를 측정하였다.
(%) NK cell activity = (OD target control - (OD sample - OD effector control))/ OD target control x 100
그 결과, 자연 살해 세포의(NK cell) 활성을 조사한 결과, 사균체 처리시 NK 세포의 활성화가 농도의존적으로 증가되었고, 구체적으로 NK 세포 활성이 약 40%이상 증가함을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명의 바실러스 벨레젠시스 GV-1는 NK 활성을 증가시켜 종양 세포의 증식을 억제할 수 있음을 확인하여, 면역 항암 활성에 유용하게 활용될 수 있음을 알 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC) KCTC15222BP 20221205

Claims (8)

  1. 기탁번호 KCTC 15222BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) GV1 균주 또는 배양액을 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 사균체인 것인, 면역 증강용 식품 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 사균체는 면역 항암 활성을 추가로 가지는 것을 특징으로 하는 것인, 면역 증강용 식품 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 면역세포의 NO 생성 촉진, 전염증 사이토카인(pro-inflammatory cytokine) 분비 증가 또는 면역세포 생육 증진시키는 것인, 면역 증강용 식품 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 전염증 사이토카인은 TNF-α, IL-6 및 IL-1β로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는, 면역 증강용 식품 조성물.
  6. 기탁번호 KCTC 15222BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) GV1 균주 또는 배양액을 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 약학 조성물.
  7. 제6항의 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역력 증진 방법.
  8. 기탁번호 KCTC 15222BP로 기탁된 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) GV1 균주 또는 배양액을 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 사료 조성물.
KR1020230002940A 2022-10-18 2023-01-09 신규 바실러스 벨레젠시스 균주를 포함하는 면역증강용 조성물 KR102581570B1 (ko)

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