KR20200084829A

KR20200084829A - 나노화된 김치 유산균을 함유하는 항바이러스용 약학조성물

Info

Publication number: KR20200084829A
Application number: KR1020200078596A
Authority: KR
Inventors: 김기태; 강인영
Original assignee: 바이오제닉스코리아 주식회사
Priority date: 2020-06-26
Filing date: 2020-06-26
Publication date: 2020-07-13

Abstract

본 발명은 김치 유산균을 이용한 항-인플루엔자 바이러스 약학 조성물 및 인플루엔자 바이러스 감염질환의 개선 및 예방을 위한 건강기능성 식품에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 바이러스의 억제 효과가 뛰어난 락토바실러스 플란타룸 (L.plantarum) 유산균의 나노화된 사균체를 이용한 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

나노화된 김치 유산균을 함유하는 항바이러스용 약학조성물{Composition for anti-virus Comprising Nano-Sized Lactic Acid Bacteria from Kimchi}

본 발명은 김치 유산균을 이용한 항바이러스 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 인플루엔자 바이러스를 효과적으로 제어하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 (L.plantarum) 유산균의 나노화된 사균체를 이용한 약학조성물 및 건강기능성 식품에 관한 것이다.

김치는 유산균에 의하여 발효되는 한국 전통 식품으로, 김치에서 분류된 유산균으로는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 덱스트라니쿰(Leuconostoc dextranicum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 페디오코코스 펜토사쿠스(Pediococcus pentosacues) 등이 있다.

유산균(lactic acid bacteria, lactobacillus)은 글루코오스 등 당류를 분해하여 젖산을 생성하는 세균으로 젖산균이라고도 불리며, 젖산발효에 의해 생성되는 젖산에 의해서 병원균과 유해세균의 생육이 저지되는 성질이 있어 유제품, 김치류, 양조식품 등의 식품제조에 이용하고 있다. 또한, 유산균은 포유류의 장내에 서식하여 잡균에 의한 이상발효를 방지하여 정장제(整腸劑)로도 이용되고 있다. 상기 유산균은 그람양성균으로, 통성혐기성 또는 혐기성을 성질을 지니며, 락토바실러스 속과 스트렙토코쿠스 속에 여러 종류가 알려져 있다.

김치에서 분리한 유산균에 관한 특허로는 항균 펩타이드 물질을 생산하는 유산균 락토코커스 락티스 BH5 (대한민국 특허 제413335호), 항산화 활성이 우수한 락토바실러스 플랜타럼 NC (대한민국 특허 제771209호), 박테이로신을 생산하는 유산균주 (대한민국 특허 제1068531호) 등이 있다.

그러나 종래 공개된 김치 유산균은 모두 생균제(Probiotics)에 관한 것으로서, 일정 부피의 배양액 내에서 생육할 수 있는 균주가 제한되어 있고, 균의 활성화에 의하여 형태변화를 일으켜 관리 보관이 까다로운 문제가 있었다.

한편, 인플루엔자 바이러스는 학교 생활이나 직장에서 심각한 질병에 이르는 심각한 공중 보건 문제를 야기한다. 인플루엔자 A 형 H1N1 형 (A / H1N1) 및 H3N2 형 (A / H3N2) 아형과 인플루엔자 B 야마가타 (B / Yamagata) 및 빅토리아 (B / 빅토리아) 계통 바이러스의 A, B, C 및 D 형 인플루엔자 바이러스는 인간의 계절성 호흡기 질환등을 유발한다. 이러한 인플루엔자 바이러스에 대한 백신이 제공되지만 백신은 효과가 10 ~ 60 % (CDC, 2017)에 불과하기 때문에 많은 청소년들에게 예방 조치가 필요하다(Palese and Shaw, 2013). (WHO, 2012). 인플루엔자 대유행 (예 : 2009 년 돼지 기생 H1N1 유행병)의 경우 새로 출현하고 항원 전이된 균주에 대해 백신 접종을 받기까지 최소 6 개월의 지연 시간이 있다(Partridge 외., 2010 ). 이러한 상황에서 항 바이러스 제제 (Park et al., 2012) 및/또는 식이 조치 (Park et al., 2013a)는 바이러스 확산을 억제하고 이후 인플루엔자의 유병율 및 사망률을 감소시키는 잇점이 있다. 인플루엔자에 대한 식이요법은 인플루엔자 시즌동안 알레르기로 인해 예방 접종이나 약물에 대한 대안을 요구하는 사람들에게 유익하다.

김치의 젖산균 (LAB)은 면역 반응 관련 효과를 비롯한 많은 건강상의 이점과 관련되어 알려져 있다 (Jung et al., 2014).여러 종의 락토바실러스 (Lactobacillus)가 인플루엔자 바이러스에 대한 보호 효과를 입증한 것으로 보고되었다. 구강 내 투여 된 Lactobacillus brevis KB290의 방어 효과는 마우스 및 백신 접종을 받지 않은 인간에서 입증된 바 있다. (Waki 등, 2014), Lactobacillus pentosus 균주는 인플루엔자 바이러스에 대한 효능으로 잘 알려져 있으나 (Izumo et al., 2010; Kobayashi et al ., 2011; Kiso et al., 2013), 락토바실러스 플란타럼 균주의 항 바이러스 효능에 대해서는 아직 많은 연구가 필요하다.

1. 한국등록특허 제10-1287120호

이에, 본 발명은 김치로부터 분리한 유산균의 나노화된 사균체를 이용하여 바이러스 억제능이 뛰어난 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 하며, 김치로부터 분리한 유산균의 나노화된 사균체를 이용하여 항 바이러스 효능이 뛰어난 건강기능성 식품을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 나노화된 김치 유산균 사균체를 유효성분으로 함유하며, 상기 나노화된 김치 유산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) nF1 균주(수탁번호 NITE P-1462)이고, 상기 나노화된 김치 유산균 사균체는 구균형태인 것을 특징으로 하는 항인플루엔자 바이러스용 약학 조성물을 제공한다.

상기 인플루엔자 바이러스는 H1N1 아형 및 H3N2 아형의 A형 인플루엔자 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 A형 인플루엔자 바이러스 또는 Victoria lineage 및 Yamagata lineage로 이루어진 B형 인플루엔자 바이러스 군으로부터 선택되는 1종의 B형 인플루엔자 바이러스인 것이 바람직하다

더욱 바람직하게는, 상기 인플루엔자 바이러스는 A/Korea/01/2009 (2009 pandemic A/H1N1; provided by Korean Centers for Disease Control and Prevention, KCDC, Osong, Republic of Korea), A/Philippines/02/1982 (A/H3N2; previously generated by reverse genetics using commercially constructed genetic plasmids) 또는 B/Wisconsin/01/2010 (B/Yamagata; provided by KCDC)일 수 있다.

상기 나노화된 김치 유산균 사균체는 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) nF1 균주(수탁번호 NITE P-1462)를 pH 5~6의 조건에서 배양하는 단계; 상기 균주의 배양액을 75℃~85℃에서 8~10분간 가열 멸균 처리하는 단계; 상기 배양액에 균체 중량과 동일한 양의 덱스트린을 첨가하여 140~ 160kgf/cm²고압 호모지나이저로 분산시키는 단계; 및 분산된 배양액을 동결건조하여 분말화하는 단계;를 통해 제조될 수 있다.

또한, 상기 나노화된 김치 유산균 사균체는 균주 입도 분포의 최빈값이 0.5 ~ 1.0 ㎛ 될 수 있다.

또한, 상기 나노화된 김치 유산균 사균체는 동결건조된 분말 1g 당 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) nF1 균주가 1억 ~ 5조 마리 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 나노화된 김치 유산균 사균체를 유효성분으로 함유하며, 상기 나노화된 김치 유산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) nF1 균주(수탁번호 NITE P-1462)이고, 상기 나노화된 김치 유산균 사균체는 구균형태인 것을 특징으로 하는 바이러스감염질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.

바이러스 감염으로 인한 질환으로는 예를 들면, 독감, 감기, 인후염, 기관지염, 폐렴, 조류독감, 돼지독감, 염소독감 등의 인플루엔자 바이러스 감염으로 인한 질환을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 나노화된 김치 유산균 사균체를 유효성분으로 함유하는 항바이러스 조성물은 규칙적인 경구투여시, 인플루엔자 A (H1N1 및 H3N2 아형) 및 인플루엔자 B (야마가타 Yamagata 계통) 바이러스의 복제를 감소시키는 효과가 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은 상기 나노화된 김치 유산균 사균체의 형태가 구균형태, 즉 구형의 형태를 가지게 됨으로써 화장료 조성물의 응집현상이 억제될 수 있고, 흡수율이 향상될 수 있는 이점이 있으며, 상기 사균체의 형태가 구균형태인 경우 보다 향상된 항바이러스 효과를 가지는 조성물을 제공할 수 있는 이점이 있다.

도 1은 본 발명의 김치 유산균의 (a) 콜로니 관찰 이미지 및 (b) 그람 염색 결과 이미지이다.
도 2는 본 발명의 김치 유산균(SIID11558)의 16S rRNA 서열을 분석하여 나타낸 분자계통도이다 (왼쪽 아래의 선은 스케일바, 계통기 분기에 위치하는 숫자는 부트스트렙 값, 주명 말미의 T는 그 종의 기준주(Type strain)를 나타낸다.)
도 3은 본 발명의 김치 유산균을 나노화 처리 전후로 관찰한 현미경 사진이다. (a) 나노화 처리 전: 막대모양, (b) 나노화 처리 후: 구형.
도 4는 항바이러스 효능을 확인하기 위한 마우스 실험 개요이다.
도 5는 마우스의 몸무게 및 생존율 분석결과이다.
도 6은 H1N1 접종시의 마우스 몸무게 및 생존율을 실험한 결과이다.
도 7은 B/yamagata 접종시의 마우스 몸무게 및 생존율을 실험한 결과이다.
도 8은 마우스 폐에서의 바이러스 역가분석에 대한 것으로, (a)는 H1N1,(b)는 B/yamagata에 대한 실험 결과값이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 한 양태는, 나노화된 김치 유산균 사균체를 유효성분으로 함유하며, 상기 나노화된 김치 유산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) nF1 균주(수탁번호 NITE P-1462)이고, 상기 나노화된 김치 유산균 사균체는 구균형태인 것을 특징으로 하는 항바이러스용 약학 조성물이다.

본 발명의 다른 양태는, 나노화된 김치 유산균 사균체를 유효성분으로 함유하며, 상기 나노화된 김치 유산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) nF1 균주(수탁번호 NITE P-1462)이고, 상기 나노화된 김치 유산균 사균체는 구균형태인 것을 특징으로 하는 항바이러스용 약학 조성물이다.

본 발명자들은 김치에서 유산균을 분리하여 미생물을 선별하였으며, 이를 동정한 결과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)인 것으로 밝혀졌다. 상기 락토바실러스 플란타룸 균주는 일본 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터(National Institute of Technology and Evaluation, NITE; International Patent Organism Depositary, IPOD)에 2012년 11월 8일자로 "nF1"으로 기탁하였다 (NITE P-1462).

본 발명에 따른 나노화된 김치 유산균 사균체는 구균형태인 것이 바람직하다. 일반적으로 유산균은 배양시의 생육 환경이 일정하지 않거나 열악해지면, 그 스트레스로 인하여 형태가 변화되는 것으로 알려져 있다. 그래서 본 발명에서는, 배양 및 가공조건을 일정하게 제어함으로써 유산균의 구균형태가 일정하게 유지되도록 유산균을 증식시킨다. 즉 나노화처리 전에는 유산균의 형태가 간균형태(막대모양)이었으나, 나노화 처리를 통해 구균형태(구형)을 갖게 되며, 이로 인하여 응집현상이 억제될 수 있고, 흡수율이 향상될 수 있게 된다.

본 발명에 따른 나노화된 김치 유산균 사균체는 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) nF1 균주(수탁번호 NITE P-1462)를 pH 5~6의 조건에서 배양하는 단계; 상기 균주의 배양액을 75℃~85℃에서 8~10분간 가열 멸균 처리하는 단계; 상기 배양액에 균체 중량과 동일한 양의 덱스트린을 첨가하여 140~ 160kgf/cm²고압 호모지나이저로 분산시키는 단계; 및 분산된 배양액을 동결건조하여 분말화하는 단계;를 통해 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 일 구체예로서, 나노화된 김치 유산균 사균체는 사균화를 위해 생균을 75℃~85℃에서 8~10분간 가열사균처리한다. 생균의 경우 제품 제조 이후의 배송 또는 진열 시에 형태변화를 일으킬 가능성이 있기 때문에, 그 이상 형태 변화를 일으키지 않는 사균인 것이 바람직하다.

본 발명의 나노화된 김치 유산균 사균체는 분산 처리단계를 거친다. 분산 처리를 위해 사균처리된 배양액을 습식으로 150 kgf/cm²(1.5 MPa)정도의 고압 호모지나이저로 분산한다. 이 경우, 미리 공지의 분산제 또는 부형제를 배양액에 첨가해 두는 것이 바람직하며, 이것에 의해, 균체의 재응집을 효율적으로 방지할 수 있다. 적합한 분산제 및 부형제로서는 덱스트린뿐만 아니라 트레할로스, 덱스트린, 스킴 밀크 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 나노화된 김치 유산균 사균체를 최종적으로 분말로서 얻기 위해서는, 배양액에 공지의 분산제, 부형제 등을 첨가하여 균체가 재응집하지 않도록 분산 처리한 후, 동결건조하는 것이 바람직하다. 이에 따라 물에 대한 분산성이 우수한 균체 분말을 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 나노화된 김치 유산균 사균체의 균주 입도 분포의 최빈값이 0.5 ~ 1.0 ㎛ 인 것이 바람직하다. "입도 분포에서의 최빈값"은 균의 크기를 나타내는 지표가 되는 값으로, 균체의 입자직경을 측정했을 때의 입도 분포에서의 상대빈도가 최대가 되는 입자직경을 말한다. 본 발명의 나노화된 김치 유산균 사균체는, 입도가 1.0 ㎛ 이하의 나노미터(nm) 사이즈로까지 미세화된 것이다. 나노화된 김치 유산균 사균체의 균주 입도 분포의 최빈값이 상기 범위를 만족하는 경우, 보다 우수한 항 바이러스 효과를 가질 수 있다.

상기 나노화된 김치 유산균 사균체는 동결건조된 분말 1g 당 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) nF1 균주가 1억 ~ 5조 마리 포함할 수 있다.

본 발명의 나노화된 김치 유산균 사균체 제조시 첨가되는 분산제 또는 부형제의 양에 따라 건조 분말 1 g 당 김치 유산균 락토바실러스 플란타룸 균주의 농도를 조절할 수 있다. 본 발명은 나노화된 김치 유산균 사균체 분말 1g 당 김치 유산균 균주가 1억 내지 5조 마리가 포함되는 것을 특징으로 한다.

상기 약학 조성물은 바람직하게는 경구 제형으로 제제화될 수 있으며, 예를 들어 액제, 현탁제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제 또는 엑스제와 같은 경구 투여용 제형으로 제제화될 수 있다. 그리고, 각각의 제형으로 제제화할 때에는, 각각의 제형의 제조에 필요한 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 부가하여 제조할 수 있다. 대표적으로 경구 투여용 제형으로 제제화시 담체로서 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제 및 방부제 중에서 1종 이상을 선택하여 사용할 수 있으며, 첨가제로는 향료, 비타민류 및 항산화제 중에서 1종 이상을 선택하여 사용할 수 있다.

상기 담체 및 첨가제는 약제학적으로 허용 가능한 것은 모두 가능하며, 구체적으로 희석제로는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘 또는 탈크, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필셀룰로오스가 바람직하다. 또한, 붕해제로는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산나트륨, 폴라크릴린칼륨, 또는 크로스포비돈, 감미제로는 백당, 과당, 솔비톨, 또는 아스파탐, 안정제로는 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 베타-사이클로덱스트린, 백납, 또는 잔탄검, 방부제로는 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 또는 솔빈산칼륨이 바람직하다.

또한, 상기 성분 이외에도 공지의 첨가제로서 미각을 돋구기 위하여, 매실향, 레몬향, 파인애플향, 허브향 등의 천연향료, 천연과즙, 클로로필린, 플라보노이드 등의 천연색소, 과당, 벌꿀, 당알코올, 설탕과 같은 감미성분, 또는 구연산, 구연산 나트륨과 같은 산미제를 혼합하여 사용할 수도 있다. 이러한 제제화 방법 및 제제화시 필요한 담체 및 첨가제에 대해서는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세하게 기재되어 있다.

본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서 본 발명의 락토바실러스 플란타륨 DSR M2를 1일 0.01mg/kg 내지 10g/kg으로, 바람직하게는 1mg/kg 내지 1g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다

본 발명의 일 구현 예에 있어서 항바이러스용 기능성 식품은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 과자류, 스낵류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함하는 유제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 건강음료, 알코올 음료 및 비타민 복합제중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항바이러스용 기능성 식품을 제공한다.

본 발명의 나노화된 김치 유산균 사균체을 식품에 첨가하는 경우, 상기 김치 유래 유산균을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 이 경우 나노화된 김치 유산균은 종래의 유산균 첨가제와 달리 식품 본래의 풍미를 해치지 아니하므로 소량 뿐만 아니라 필요에 따라 다량을 첨가하는 것이 가능하여 소비자의 기호를 다양하게 충족시킬 수 있다.

본 발명의 나노화된 김치 유산균 사균체는 그대로 제품화 할 수도 있으나, 일반적으로는, 각종 첨가제 또는 향미료(flavor)를 첨가, 배합함으로써 풍미를 높이거나, 필요한 형상으로 제조하여 최종 제품을 만들 수 있다.

구체적으로, 본 발명은 상기 나노화된 김치 유산균 사균체를 포함하는 식품 첨가제 또는 식품을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 나노화된 김치 유산균 사균체에 첨가, 혼합되는 성분으로는 각종 당질이나 유화제, 감미료, 산미료, 과즙 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는 글루코스, 수크로스, 프룩토스, 벌꿀 등의 당류; 소르비톨, 크실리톨, 에리트리톨, 락티톨, 파라티니트 등의 당 알코올; 수크로스 지방산 에스테르, 글리세린당 지방산 에스테르, 레시틴 등의 유화제 등을 들 수 있다. 그 밖에도, 비타민 A, 비타민 B류, 비타민 C, 비타민 E 등의 각종 비타민류나 허브 추출물, 곡물 성분, 야채 성분, 젖 성분 등을 배합해도, 우수한 풍미의 나노화된 김치 유산균 사균체 조성물을 얻을 수 있다.

또한, 향미료로서는 요구르트계, 베리계, 오렌지계, 모과계, 자소계, 시트러스계, 애플계, 민트계, 그레이프계, 페어, 카스타드 크림, 피치, 멜론, 바나나, 트로피컬, 허브계, 홍차, 커피계 등의 향미료를 들 수 있고, 이것들을 1종 또는 2종 이상 조합하여 사용할 수 있다. 향미료의 첨가량은 특별히 한정되지 않지만, 풍미면에서 균체 내에 0.05∼0.5질량%, 특히 0.1∼0.3질량% 정도가 바람직하다.

또, 본 발명의 나노화된 김치 유산균 사균체는 식품 조성물로 이용할 수 있으며, 특히 건강식품에 이용할 수 있다. 건강식품이란 통상의 식품보다도 적극적인 의미로, 보건, 건강유지·증진 등을 목적으로 한 식품을 의미한다. 그 형태는 액체, 반고형, 고형의 어떤 것이어도 되고, 구체적으로는, 쿠키, 전병, 젤리, 양갱, 과자, 빵, 케익 등의 과자류; 요구르트, 청량음료, 영양음료, 식혜, 과일음료 등의 음료류; 스프, 아이스크림, 분유, 김치, 라면 등을 들 수 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

실시예 1. 신규 김치 유산균의 동정

신규한 김치 유산균 개발을 위하여 본 발명자들은 김치 추출물을 희석하여 MRS 아가(Oxoid, Hampshire, 영국) 배지에서 30℃, 호기조건으로 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 전형적인 유산균 형태로 광택이 흐르는 유백색의 콜로니를 선별하여 분리한 후, 선별된 콜로니를 3차에 걸쳐 새로운 배지에 옮겨 배양하는 방법으로 순수 분리하였다. 순수 배양된 유산균 중 장내 환경 개선 효과가 가장 뛰어난 균주(SIID11558)을 최종 선발하여 동정 분석하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, SIID11558 균주는 유백색의 콜로니를 형성하며, 형태적으로 그람 양성이며, 0.8~0.9 × 1.2~1.5 ㎛ 크기의 간균임을 확인하였다.

주식회사 테크노스루가랩(TechnoSuruga Laboratory Co., Ltd.)에서 분리된 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열 결정 및 분석을 수행하였으며, 이를 통하여 분리된 균주는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)과 99.9%의 높은 상동성을 가지는 신규한 미생물로 동정되었다. 분리된 균주의 분석된 16S rRNA 염기서열은 서열번호 1과 같으며, 분자계통학적 위치를 나타내는 계통 발생적 분지도(phylogenetics tree)는 도 2와 같다. 16S rDNA의 PCR 증폭에는 정방향 프라이머(5'- ga gtt tga tcc tgg ctc ag - 3': 서열번호 2)와 역방향 프라이머 (5'- tcg taa caa ggt agc c - 3': 서열번호 3)를 사용하였으며, PCR 증폭으로부터 사이클시퀀스까지의 조작은 하기 각 프로토콜에 근거하였다.

- DNA 추출: 아크로모벱티다아제 (와코준야쿠, 오사카)

- PCR: PrimeSTAR HS DNA Polymerase (다카라바이오, 시가)

- 사이클시퀀싱: BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Life Technologies, CA, USA)

- 시퀀싱: ABI PRISM 3130 x1 Genetic Analyzer System (Life Technologies, CA, USA)

- 염기서열결정: Chromas Pro 1.5 (Technelysium Pty Ltd., Tewantin, AUS)

- BLAST 상동성 검색 및 간이분자계통 해석 : 아폴론 2.0 소프트웨어 (테크노스루가랩, 시즈오카)

- 데이터베이스: 아폴론 DB-BA 7.0 데이터베이스 (테크노스루가랩, 시즈오카), 국제염기서열 데이터베이스(GeneBank/DDBJ/EMBL)

상기와 같은 방법으로 동정된 본 발명의 신규 미생물은 일본 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터(National Institute of Technology and Evaluation, NITE; International Patent Organism Depositary, IPOD)에 2012년 11월 8일자로 "nF1"으로 기탁하였다 (NITE P-1462).

실시예 2. 나노화된 김치 유산균 nF1 사균체 분말의 제조

상기 실시예 1에서 분리 및 동정한 nF1 균주를 5질량% 포도당을 첨가한 공지의 영양 배지에서, 20 질랑% 수산화나트륨 수용액으로 배양하되 pH가 중성이고, 온도가 36.5℃인 조건에서 배양하였으며, 포도당이 소비된 시점을 배양 종점으로 하였다. 본 발명의 나노화된 김치 유산균 사균체 분말 제조시 pH의 범위는 pH 5~7의 중성 영역인 것이 바람직하며, pH 6.5인 것이 가장 좋다.

배양 종료 후, 배양액을 80℃에서 10분간 가열 멸균 처리한 후, 균체를 PBS로 세정하고, 균체 중량에 대하여 동일한 양의 덱스트린을 부형제로서 첨가한 후 믹서로 분산하였다. 다음으로 이를 동결 분무건조하여 분말 시료를 조제하였으며, 제조한 분말 1g당 본 발명의 김치 유산균 nF1 균주가 1억 마리 이상 포함되어 있음을 확인하였다.

상기 nF1 분말을 다시 균체 농도로 10mg/ml가 되도록 조정하면서 PBS에 현탁하였다. 가공공정 시의 pH는 6.5로 유지하였다. 상기와 같이 균주의 나노화 처리 결과를 현미경으로 촬영하여 확인하였으며, 도 3에 나타난 바와 같이 김치에서 추출한 nF1 균주는 나노화 처리 전 막대모양의 간균이었으나, 상기 나노화 처리 후는 구균에 가까운 형태를 나타냄으로써 군체끼리 재응집하지 않는 성질을 갖게 되었음을 알 수 있다. 나노화 처리된 nF1 균주는 입도 분포의 최빈값이 0.5 ~ 1.0 ㎛로 나타났으며, 재응집하지 않는 성질이 있어 물 또는 기타 용매에 대한 분산성이 뛰어난 유산균을 얻을 수 있다.

한편, 균체 중량과 동일한 양의 덱스트린을 부형제로 첨가하여 제조한 경우, 제조된 분말 1g 당 김치 유산균 5조 마리가 포함되는 것을 확인하였다.

실시예 3. 항바이러스 효과 실험

1. 시험물질

(1) 시험물질: 한국산 숙성김치에서 추출되어 가열살균 나노화 처리된 유산균 nF1 농도: 10㎎/㎏/day, 0.05㎎/㎏/day

(2) 대조물질I: Phosphate buffer saline(PBS) 구입처: Lonza

(3) 대조물질II: Oseltamivir phosphate 농도: 10㎎/㎏/day 구입처: Toronto Research Chemicals Inc, Canada(Cat No. O701000)

2. 시험방법

2.1 경구투여

인플루엔자바이러스 감염 2주 전부터 시험·대조물질을 존대(Zonde)로 마우스(BALB/c, 6weeks, female; Nara-Biotec, Korea)에 투여하였다. 감염 후 2주를 포함하여 총 4주 동안 하루 에 한 번(quaque die)씩 동일한 시간대에 200㎕의 용량으로 투여하였다(도 4 참조).

2.2 바이러스접종

계절성 인플루엔자바이러스 A/H1N1 그리고 B/Yamagata lineage 바이러스를 마우스 비강 내로 접종하기 위해서 근육 내 마취제를 주사함. 각각의 바이러스는 마우스 당 30㎕의 용량으로 접종하였다.

2.3 마우스 폐에서의 바이러스 역가 분석

인플루엔자바이러스 감염 후, 1, 3, 6일째에 마우스의 복강을 개복하여 폐 조직을 분리함. 분리한 폐 조직은 본 연구실에서는 바이러스 역가를 분석하는 최적의 방법인 plaque assay를 수행하였다.

실험예

(1) 몸무게 변화및 생존율 분석

1) 비감염 그룹

바이러스를 감염시키지 않고 nF1만 투여된 실험군의 병원성 여부 분석하였다. 그 결과, nF1이 마우스에 미치는 영향은 전혀 없는 것으로 분석되었다. 따라서 바이러스 감염 후 관찰되는 병원성은 바이러스에 의한 것으로 판단할 수 있다(도 5 참조)

2) A/H1N1 접종

H1N1 아형의 인플루엔자 바이러스를 공격접종하여 nF1 유산균의 항바이러스 효능을 평가하였다. nF1 유산균을 0.05mg/kg/day로 투여한 실험군 생존율은 nF1을 전혀 투여하지 않은 실험 군의 생존율과 차이가 없었다. 그러나 nF1 유산균 투여량을 10mg/kg/day로 증가시킨 실험군의 경우 생존율이 30%로 상승하는 결과가 관찰되었다. 즉 nF1의 투여농도가 증가함에 따라 생존률도 상승하는 결과로 미뤄 nF1 유산균은 H1N1 아형 인플루엔자 바이러스를 억제하는 효능을 갖고 있는 것으로 판단된다. 그리고 대조군인 타미플루와 비교시 nF1 유산균은 치료제가 아닌 건강 보조식품임에도 불구하고 마우스 생존률이 30% 정도 나타난 결과는 nF1 유산균의 지속적인 투여로 감염질환을 어느 정도 억제할 수 있다고 볼 수 있다(도 6 참조).

3) B/Yamagata 접종

B형 인플루엔자 바이러스를 공격접종하여 nF1 유산균의 항바이러스 효능을 평가하였다. nF1 유산균을 0.05mg/kg/day로 투여한 실험군의 경우, 대조군에 비해 생존률은 10%, 그리고 투여량을 10mg/kg/day로 증가시킨 실험군의 경우, 대조군에 비해 생존률이 20% 상승 하는 결과가 관찰되었다. nF1의 투여농도가 증가함에 따라 생존률도 상승하는 결과로 미뤄 nF1 유산균은 B형 인플루엔자 바이러스를 억제하는 효능을 갖는 것으로 판단된다(도 7 참조).

(2) 바이러스 역가 분석 (마우스의 폐)

H1N1 아형의 바이러스를 공격접종한 실험군의 폐(lung)를 적출하여 바이러스 역가를 분석하였다. nF1 유산균을 투여한 실험군의 폐 바이러스 역가는 투여하지 않은 실험군의 폐 바이러스 역가보다 더 감소하는 현상이 관찰되었다(도8a 참조)

B형 인플루엔자 바이러스를 공격접종한 실험군 역시, 바이러스 감염 후 6일째에는 nF1 유 산균을 투여한 실험군의 폐 바이러스 역가가 nF1을 투여하지 않은 실험군에 비해 더 감소 되는 결과가 도출되었다(도 8b 참조)

그러므로 nF1 유산균 투여에 의한 마우스의 생존률 증가는 nF1 유산균 투여군의 폐에 존재하는 바이러스 역가 감소에 의한 것으로 판단된다. 폐에 존재하는 바이러스 역가가 감소한 다는 것은 바이러스 감염에 의한 질환으로부터 마우스가 회복되고 있다는 증거로 볼 수 있다

위 결과를 종합하여 볼 때, nF1 유산균은 인플루엔자 바이러스 공격접종으로부터 마우스를 방어하는 효능을 갖고 있는 것으로 판단된다.

(3) 소결

나노화된 nF1 유산균을 매일 투여한 실험군의 경우, 대조군에 비해 생존률이 상승하는 결과가 관찰 되었다. 그리고 nF1의 투여농도가 증가함에 따라 생존률도 상승하는 결과로 미뤄 nF1 유산균은 H1N1 아형 및 B형 인플루엔자 바이러스를 억제하는 효능을 갖고 있는 것으로 판단된다. nF1 유산균을 투여한 실험군의 폐 바이러스 역가가 nF1을 투여하지 않은 실험군에 비해 더 감소되는 결과가 도출되었다. 그러므로 nF1 유산균 투여에 의한 마우스의 생존률 증가는 nF1 유산균 투여군의 폐에 존재하는 바이러스 역가 감소에 의한 것으로 판단된다.

독립행정법인제품평가기술기반기구특허미생물기탁센터

NITEP-1462

20121108

Claims

나노화된 김치 유산균 사균체를 유효성분으로 함유하며, 상기 나노화된 김치 유산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) nF1 균주(수탁번호 NITE P-1462)이고, 상기 나노화된 김치 유산균 사균체는 구균형태인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스에 대한 항인플루엔자 바이러스용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 나노화된 김치 유산균 사균체는 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillusplantarum) nF1 균주(수탁번호 NITE P-1462)를 pH 5~6의 조건에서 배양하는 단계;
상기 균주의 배양액을 75℃~85℃에서 8~10분간 가열 멸균 처리하는 단계;
상기 배양액에 부형제를 첨가하여 140~ 160kgf/cm²고압 호모지나이저로 분산시키는 단계; 및
분산된 배양액을 동결건조하여 분말화하는 단계;를 통해 제조된 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스에 대한 항인플루엔자 바이러스용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 나노화된 김치 유산균 사균체는 균주 입도 분포의 최빈값이 0.5 ~ 1.0 ㎛ 되는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스에 대한 항인플루엔자 바이러스용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 나노화된 김치 유산균 사균체는 동결건조된 분말 1g 당 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) nF1 균주가 1억 ~ 5조 마리 포함되는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스에 대한 항인플루엔자 바이러스용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 인플루엔자 A 바이러스는 H1N1 또는 H3N2 아형인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스에 대한 항인플루엔자 바이러스용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 인플루엔자 B 바이러스는 B/Yamagata lineage 인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스에 대한 항인플루엔자 바이러스용 약학 조성물.
나노화된 김치 유산균 사균체를 유효성분으로 함유하며, 상기 나노화된 김치 유산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) nF1 균주(수탁번호 NITE P-1462)이고, 상기 나노화된 김치 유산균 사균체는 구균형태인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스 감염질환의 예방 또는 개선용건강기능성 식품.
제7항에 있어서,
상기 나노화된 김치 유산균 사균체는 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) nF1 균주(수탁번호 NITE P-1462)를 pH 5~6의 조건에서 배양하는 단계;
상기 균주의 배양액을 75℃~85℃에서 8~10분간 가열 멸균 처리하는 단계;
상기 배양액에 부형제를 첨가하여 140~ 160kgf/cm²고압 호모지나이저로 분산시키는 단계; 및
분산된 배양액을 동결건조하여 분말화하는 단계;를 통해 제조된 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스 감염질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품.
제7항에 있어서,
상기 나노화된 김치 유산균 사균체는 균주 입도 분포의 최빈값이 0.5 ~ 1.0 ㎛ 되는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스 감염질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품.
제7항에 있어서,
상기 나노화된 김치 유산균 사균체는 동결건조된 분말 1g 당 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillusplantarum) nF1 균주가 1억 ~ 5조 마리 포함되는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스 감염질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품.
제7항에 있어서,
상기 인플루엔자 A 바이러스는 H1N1 또는 H3N2 아형인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스 감염질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품.
제7항에 있어서,
상기 인플루엔자 B 바이러스는 B/Yamagata lineage 인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스 감염질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품.