CN103429621B - 抗微生物融合化合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种融合蛋白，其包含至少一种1型核糖体失活蛋白，多肽B；以及至少一种能抑制病毒进入的多肽A；和/或至少一种阳离子抗微生物肽，多肽C。

Description

抗微生物融合化合物及其用途

技术领域

本发明涉及抗微生物融合化合物，特别是多肽，及其片段，并涉及其在微生物感染中作为治疗剂的用途。

背景技术

微生物感染会影响人类和动物并在全世界导致高水平的发病。微生物感染物包括原生动物寄生虫，细菌和真菌，对此通常可用抗微生物药剂。然而，某些抗微生物药剂附有不良副作用，且这类药剂的微生物抗性问题是日益严重的问题。

微生物感染物也包括病毒，其是困扰人类以及人类伴侣动物还有专门饲养用作人类食物的动物的许多广泛传播疾病的起因。大多数目前可用的用于人治疗应用的抗病毒药物性质上是单功能的并仅阻碍一个特定的病毒途径，例如，病毒进入宿主细胞，病毒基因组融合或整合入宿主细胞基因组，以适合整合入感染的宿主细胞基因组的形式的病毒ssRNA至dsDNA的翻译或反转录。因此，一旦病毒获得对单功能抗病毒药物的抗性，药物就失去其效用。

而且，目前没有对多种动物病毒有效的疗法，包括例如白斑综合症病毒（WSSV），猪流行性腹泻病毒（PEDV），猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）等。已知这些动物病毒特别影响对虾和猪产业。每年这些病毒中每种造成的损失相信超过10亿美元。

由于其高突变率，对这些病毒和大多数其他病毒的有效疫苗难以开发。而且，对一个地理小种起作用的疫苗也经常对相同病毒的其他地理小种的作用不佳。

抗病毒药物的例子包括恩夫韦地（罗氏以的商品名销售），其为HIV-1融合抑制剂。恩夫韦地是合成生产的修饰蛋白，并被报道指其是每年每人花费在25000美元区间中的昂贵治疗方式。由于其是每天两次以皮下注射引入体内，其施用方式也非常不便。

抗病毒药物的另外例子包括奥司他韦（也以其商品名公知），其能通过阻止病毒化学切割与其宿主细胞连接，来减缓流感（流感）病毒在体内细胞间的传播。自1999年已在超过5千万人身上被用于治疗和防止甲型流感病毒和乙型流感病毒感染并且其是以胶囊或者作为悬液口服的。然而，现在有许多抗的甲型流感病毒和乙型流感病毒的毒株。扎那米韦（也以其商品名公知），作为神经氨酸酶抑制剂作用的另一种抗病毒药物被用于治疗和预防甲型流感病毒和乙型流感病毒。为通过吸入施用。本领域公知抗病毒药物和生产依赖于不能被经济合成的原料莽草酸。事实上，之前罗氏已经做出数个抗病毒药物和产量可能严重受限于莽草酸的供应的新闻稿。

发明内容

本发明在所附独立权利要求中限定。本发明的某些可选特征在所附从属权利要求中限定。

根据本发明的一个方面，提供了一种融合蛋白，其包含至少一种1型核糖体失活蛋白或其片段，多肽B；以及

（i）至少一种能抑制病毒进入的多肽A；和/或

（ii）至少一种阳离子抗微生物肽（CAP）或其片段，多肽C。

所述多肽A可以为θ防御素，其类似物，或其片段。

特别地，根据本发明任一方面的融合蛋白可以是适合口服施用的。

根据本发明的另一个方面，提供了一种药物组合物，其包含根据本发明任一方面的融合蛋白。

根据本发明的再一个方面，提供了在有需要的脊椎动物，无脊椎动物或植物中治疗和/或预防微生物感染的方法，包括给脊椎动物，无脊椎动物或植物施用有效量的根据本发明任一方面的融合蛋白或药物组合物的步骤。特别地，所述微生物感染可以是病毒感染。所述脊椎动物可以为哺乳动物，鱼类或鸟类。甚至更特别地，哺乳动物可以为非人动物。

从下面的说明中显而易见，本发明优选实施方式融合蛋白具有最佳效果和广谱治疗，和/或如一些应用，允许蛋白质的口服递送。

附图说明

现在将参考附图通过举例的方式描述所述融合蛋白的优选实施方式，其中：

图1为RetroMAD1的翻译图（SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2）。

图2的图显示了大肠杆菌BL21（DE3）细胞中A）时间过程表达和B）RetroMAD1表达溶解度。在诱导前（0h）收获容有pRMD的细胞，且诱导后1h，2h，3h代表沉淀相，带星号（*）的小时数代表上清液相。在15%SDS-PAGE中分析蛋白。M：PageRuler^TM Fermentas蛋白梯，U：未诱导的，IND：诱导的，和IB：纯化的包含体。箭头指示大肠杆菌生产的RetroMAD1（41.2kDa）。

图3的图显示了经过以RetroMAD1孵育24和48小时的孵育期，（A）在MOI=0.1时对HSV-1，（B）在MOI=0.5时对HSV-1的每个处理中病毒拷贝体的数量降低。

图4的图显示了经过以RetroMAD1孵育24和48小时的孵育期，（A）在MOI=0.1时对HSV-2，（B）在MOI=0.5时对HSV-1的每个处理中病毒拷贝体的数量降低。

图5的图显示了经过以RetroMAD1孵育24和48小时的孵育期，（A）对DENV1，（B）在MOI0.1时对DENV2，和在MOI0.5时对DENV2，（C）对DENV3以及（D）对DENV4的每个处理中病毒拷贝体的数量降低。

图6的图显示了在以RetroMAD1经72小时孵育后同时处理PBMC的正常细胞数。

图7的图显示了在72小时孵育后同时处理非霍奇金淋巴瘤PBMC的细胞数。

图8的图显示了在24小时，48小时和96小时终点时测量的RetroMAD1细胞毒性。所有的值被表示为三个重复试验的平均值±标准偏差。哺乳动物细胞系：（A）Vero，（B）LLC-MK2，和（C）BHK-21细胞系的最大非毒性剂量为100μg/ml。

图9的图显示了在24小时，48小时和96小时终点时测量的RetroMAD1细胞毒性。所有的值被表示为三个重复试验的平均值±标准偏差。人细胞系：（A）RWPE-1，（B）张氏肝细胞系，（C）NL-20，（D）184B5和（E）CCD-1127SK细胞系的最大非毒性剂量为100μg/ml。

图10（A）显示了凝胶图，其中441bp大小的条带显示感染了HPV的对照个体对虾。22/23为HPV阳性。

图10B显示了凝胶图，其中处理过的个体虾仅仅2/24感染了HPV。22/24的个体虾为HPV阴性。

图11的图显示了试验感染WSSV虾的存活百分数，左边为对照而右边为处理过的。

图12A和B为使用捕获ELISA测定猫血清中RetroMAD1浓度的标准曲线。

图13A的图显示了从捕获ELISA得到的对照和处理的小鼠血清中RetroMAD1的浓度。

图13B的图显示了用于导出图13（A）中血清RetroMAD1浓度的三份数据，其确认了结果有极好的一致性。

图14为显示RetroMAD1热稳定性的SDS-page结果。

图15为使用HPLC的层析图，显示（A）PBS对照，（B）50μg/ml，（C）100μg/ml，（D）200μg/ml，（E）400μg/ml和（F）500μg/ml的RetroMAD1峰。

图16为凝胶图，其显示了诱导前后AB，BA，BC和CB的表达。在15%SDS-PAGE上分析蛋白。M：未染色蛋白标记物（Fermentas）。

图17的图显示了有A-B，B-A，B-C和C-B结构的肽的抗单纯疱疹病毒-2（HSV-2）抗病毒活性。

图18的图显示了使用噬菌斑减少试验测定Amatilin药物对HSV-2的抑制活性（如实施例19中所述）。

图19为四幅图，每幅显示了用如实施例17中所述的Amatilin，Catadarcin，Kudapan和RetroMAD1处理的病毒DNA减少百分数。

具体实施方式

定义

为方便起见，这里收集了说明书，实施例和所附权利要求中使用的某些术语。

本发明上下文中使用的术语“佐剂”是指免疫佐剂。这样，佐剂是指能增强或促进对所考虑组分的免疫系统反应，由此在对象中诱导免疫反应或免疫反应系列的化合物。佐剂可以通过形成存储库（延长组分的半衰期）来促进治疗组合物的效果，提供额外的T细胞辅助并刺激细胞因子的产生。如果抗原分子只是弱抗原性的或者与免疫系统的化合物，分子，或细胞仅发生弱到中度的相互作用，在某些情况下，可能需要通过佐剂的抗原存活和非特异性刺激辅助。

本发明上下文中使用的术语“类似物”是指可以通过改变氨基酸序列来修饰以包含一个或多个天然存在的和/或非天然存在氨基酸的肽，只要该肽类似物能够减少或防止微生物生长或杀死微生物。例如，术语“类似物”涵盖有一个或多个保守氨基酸改变的抑制肽。术语“类似物”也涵盖有包含，例如一个或多个D-氨基酸的肽。这样的类似物具有例如蛋白酶抗性的特性。类似物也包括肽模拟物，如其中一个或多个肽键已被修饰的。优选的类似物包括根据本发明任意实施方式描述的，含有一个或多个非天然存在的氨基酸类似物的肽类似物。

本发明上下文中使用的术语“抗微生物”是指本发明的肽或其类似物或衍生物的生物活性，并表示本发明的蛋白有杀死微生物，干扰繁殖或以别的方式使微生物不能生长的能力。本发明的肽或其类似物或衍生物能够杀死微生物和/或减少或防止微生物生长，即，肽具有杀微生物活性和/或抑微生物活性。肽可以是用于治疗或防止微生物感染的药物，化合物或分子，包括根据本发明任意实施方式的融合蛋白。测定肽或其类似物或衍生物抗微生物活性的方法对本领域技术人员显而易见和/或在本发明中描述。例如，将肽或类似物或衍生物施加到微生物之前已经生长其上的平板上，并在适合的时间段之后，测定微生物的生长抑制和/或细胞死亡水平。

本发明上下文中使用的术语“包括”是指在实践本发明时可以被相连使用的各种成分，组分，或步骤。因此，术语“包括”涵盖了更严格的术语“基本由......组成”和“由......组成”。对术语“基本由......组成”，理解为本发明的表位/抗原“大体上”包括所示的序列作为“基本”的要素。其他的序列可以被包含在5’端和/或3’端。因此，对于偶然含有序列X的已知多肽，基本由序列X组成的多肽会是新颖的。对术语“由......组成”，理解为根据本发明的多肽，多核苷酸和/或抗原对应所示序列中的至少一个（例如以SEQ ID号表示的特定序列或其同源序列或片段）。

本发明上下文中使用的术语“衍生物”包括，如所述肽的片段或被加工的形式，相对所述肽包含一个或多个氨基酸取代，缺失或添加的变体或突变体，包含所述肽的融合蛋白，或相对所述肽包含一种或多种其他非肽成分，如化学成分如聚乙二醇（PEG）的肽。术语“衍生物”也涵盖了包括根据本发明的融合蛋白的多肽。例如，该多肽包括标签，如，例如，表位，如FLAG表位或V5表位或HA表位。例如，表位为FLAG表位。这样的标签可用于，例如，纯化多肽。本发明抗微生物融合蛋白的优选衍生物具有增强的稳定性。例如，在融合蛋白要施用的对象中有活性的蛋白酶的切割位点被突变和/或缺失，以产生本发明抗微生物融合蛋白的稳定衍生物。术语“衍生物”也涵盖被衍生的肽，如，例如被修饰以含有一个或多个非氨基酸化学基团的肽。所述化学基团可以通过氨基末端氨基酸残基，羧基末端氨基酸残基，或者在内部氨基酸残基上被共价连接到肽。这样的修饰包括在肽的活性基团上添加保护性或封端基团，添加可检测标记，和不会不利破坏肽化合物活性的其他变化。

因此，可接受的氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性，亲水性，电荷，大小等。考虑前面数个特征的示例性的取代是本领域技术人员公知的，其包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸。可以以本领域已知的多种适合方法制备本发明的分离的多肽，包括制备多肽序列的典型化学合成方法。

本发明上下文中使用的术语“片段”是指根据本发明任意方面融合蛋白的全序列中的不完整的或分离的部分，其包含将蛋白的特征和功能赋予序列的活性位点。特别是，其可以为更短到至少一个氨基酸。例如根据本发明融合蛋白的片段包含能使蛋白识别微生物的活性位点。片段可以为至少10个氨基酸长。例如，RIP的非限制性片段可以至少包含大小可约为5kDa的RIP核心或生物活性位点。

本发明上下文中使用的术语“融合蛋白”是指通过将两个或更多个原来编码每个蛋白的基因联合而产生的蛋白。这样融合基因的翻译得到了具有源自每个初始蛋白的功能特性的单一多肽。重组融合蛋白通过重组DNA技术人工产生，用于生物研究和治疗。例如，根据本发明任意方面的融合蛋白可以包括1型RIP，多肽B；以及能够抑制病毒进入的多肽A和/或CAP，多肽C。融合蛋白的结构可以是A-B-C，A-C-B，C-A-B，C-B-A，B-A-C，B-C-A，A-B-C-C，A-B，B-C，B-C-C或C-C-B-C-C。特别是，融合蛋白可以包含二聚体和/或串联重复序列。更特别地是，根据本发明任意方面的融合蛋白可以是上述结构的重复体。例如，结构可以是A-A-B-C-C，C-C-B-C-C，A-A-B-A-A等。当重复时，每种融合蛋白中的多肽A，B或C可以是相同的蛋白或者可以是不同的蛋白。多肽A可以为θ防御素，其类似物，或其片段。根据本发明的融合蛋白可以包括SEQ ID NO：1，其变体、衍生物或片段。用于本发明中的术语“RetroMAD1”是指有A-B-C结构并且氨基酸序列为SEQ ID NO：1的融合蛋白。特别是，在RetroMAD1中多肽A可以为Retrocyclin101，多肽B可以为MAP30而多肽C可以为皮抑菌肽（Dermaseptin）1。这些肽可以被直接相互融合或者通过连接肽相互连接。

本发明上下文中使用的术语“连接肽”在本发明中与术语“连接物”可交替的使用。连接肽是共价或非共价连接两个或更多个分子或肽，从而产生由包括连接肽在内的全部分子或肽组成的更大复合体的肽。连接肽的非限制性例子可以为SEQ ID NO：11。

本发明上下文中使用的术语“微生物感染”是指微生物在其他生物中或上的侵入，生长和/或增殖。微生物感染可以局限于生物或全身的特定区域。本发明的融合肽，类似物和/或衍生物用于治疗的感染包括由任何微生物例如但不限于细菌，真菌，酵母菌，原生动物和病毒引起的，影响哺乳动物，无脊椎动物，脊椎动物和/或植物的任何感染。技术人员应理解什么被认为是微生物感染。特别是，本发明的融合蛋白或类似物或衍生物或制剂可用于治疗病毒感染。所述病毒的例子包括但不限于麻疹病毒，单纯疱疹病毒（HSV-1和-2），疱疹病毒家族成员（HIV，丙型肝炎，水泡性口膜炎病毒（VSV），绵羊髓鞘脱落病毒，巨细胞病毒（CMV）等。

本发明上下文中使用的术语“微生物”涵盖了任何微小的生物或微生物。例如，但不限于，微生物包括细菌，古细菌，病毒，酵母菌，真菌或原生动物。特别地，微生物为病毒。病毒可以包括但不限于巨细胞病毒（CMV）肺炎，肠炎和视网膜炎；埃泼斯坦-巴尔（Epstein-Barr）病毒（EBV）淋巴增殖疾病；水痘/带状疱疹（由水痘-带状疱疹病毒，VZV引起）；HSV-1和-2黏膜炎；HSV-6脑炎；BK病毒出血性膀胱炎；病毒性流感；呼吸道合胞病毒（RSV）肺炎；AIDS（由HIV引起）；以及甲型，乙型或丙型肝炎。其他病毒例子包括但不限于逆转录病毒科；小核糖核酸病毒科（例如，脊髓灰质炎病毒，甲型肝炎病毒，肠道病毒，人柯萨奇病毒，鼻病毒，艾柯病毒）；杯状病毒科（Calciviridae）（如引起肠胃炎的毒株）；披膜病毒科（例如，马脑炎病毒，风疹病毒）；黄病毒科（Flaviridae）（例如，登革热病毒，脑炎病毒，黄热病毒）；冠状病毒科（例如，冠状病毒）；弹状病毒（例如，水疱性口炎病毒，狂犬病毒）；丝状病毒科（例如，埃博拉病毒）；副粘病毒科（例如，副流感病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞体病毒）；正粘病毒（如流感病毒）；布尼亚病毒科（Bungaviridae）（例如，汉坦病毒，布尼亚病毒（bunga viruses），白蛉热和内罗病毒）；沙粒病毒科（出血热病毒）；呼肠孤病毒科（例如，呼肠孤病毒，环状病毒和轮状病毒）;双RNA病毒科；肝DNA病毒科（乙肝病毒），细小病毒科（细小病毒）；乳多空病毒科（乳头状瘤病毒，多瘤病毒）；腺病毒科（多数腺病毒）；疱疹病毒科（单纯疱疹病毒（HSV）1和HSV-2，水痘-带状疱疹病毒，巨细胞病毒（CMV），疱疹病毒）；痘病毒科（天花病毒，牛痘病毒，痘病毒）；和虹彩病毒科（如非洲猪瘟病毒）；以及未分类的病毒（例如，海绵状脑病病原因子，丁型肝炎因子（被认为是乙型肝炎病毒的缺陷卫星病毒），非甲型非乙型肝炎因子（I类=体内传播；2类=非肠道传播（即，丙型肝炎）；诺沃克及相关病毒，星状病毒）。

例如，病毒可以是特异对水产养殖业的，如但不限于如甲壳类病毒如WSSV，HPV，MBV，IHHNV，YHV，TSV，GAV，LSNV，IMNV，MoV，KHV1，KHV2，KHV3，VNN。特异对水产养殖业的病毒可以包括来自双RNA病毒科，疱疹病毒科，虹彩病毒科，逆转录病毒科或弹状病毒科家族中的任意一种鱼类病毒。特别地，鱼类病毒可以是来自双RNA病毒科家族的胰腺坏死病毒（IPNV），来自疱疹病毒科家族的水道猫鱼病毒（CCV），来自虹彩病毒科家族的淋巴囊肿病毒（FLDV），属于弹状病毒科家族的造血组织坏死病毒（IHNV）和病毒性出血败血症病毒（VHSV）等。鲍鱼病毒包括：AVG，AMAV等。

例如，病毒可以是特异对家禽的，如但不限于引起禽痘，鸡新城疫，传染性支气管炎，鹌鹑支气管炎，鸡马立克氏病（内脏白血病），淋巴白血病，传染性法氏囊病，禽流感，流行性震颤等的病毒。

例如，病毒可以是特异对猪的，如但不限于猪戊型肝炎病毒，圆环病毒，疱疹病毒等。特别地，病毒可以是猪巨细胞病毒，伪狂犬病毒。

对猫重要的病毒包括但不限于猫泛白细胞减少症病毒（FPV），猫疱疹病毒，猫杯状病毒，猫白血病病毒（FeLV），猫免疫缺陷病毒（FIV）等。病毒可以是特异对狗的，且其可以包括但不限于狂犬病病毒，犬细小病毒，犬冠状病毒，犬瘟热病毒，犬流感病毒，犬肝炎病毒，犬疱疹病毒，导致伪狂犬病的病毒，犬极小病毒等。

本发明上下文中使用的术语“多肽”是指长的，连续的，无分枝的肽并包括环状多肽。蛋白由一个或多个按生物功能方式排列的多肽组成并经常可以与辅助因子，或其他蛋白连接。特别地，根据本发明任意方面的蛋白可以是天然存在的，从头和/或合成的。

本发明上下文中使用的术语“对象”是指可能被微生物感染的任何动物，包括人，非人动物，植物或昆虫。特别地，对象为可能被微生物感染的任何动物，包括人，植物或昆虫，本发明的融合蛋白或类似物或衍生物对该微生物有活性。

本发明上下文中使用的术语“治疗”是指防止，缓解，治疗性或治愈性治疗。

本发明上下文中使用的术语“变体”交替或附加的以对其衍生来源母多肽一定程度的序列同一性为特征。更准确的，本发明上下文中的变体显示至少30%的序列同一性，特别地，至少40％，50％，60％，70％，80％或90％的序列同一性。更特别地，本发明的上下文中的变体显示与其母多肽至少95％的序列同一性。本发明的变体显示所示的序列同一性，而优选的序列同一性在超过100，150，200，300，315，320，330，340，344个或更多个氨基酸的连续延伸上。核苷酸和氨基酸序列的相似性，即序列同一性百分数可以通过序列比对确定。可以以多种本领域已知的算法进行这样的比对，优选用Karlin和Altschul的数学算法（Karlin&Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.ScL USA90:5873-5877），用hmmalign（HMMER包，http://hmmer.wustl.edu/）或用如在http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/上可用的CLUSTAL。优选使用的参数为如http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/或http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html上设置的默认参数。可以使用如BLAST，BLAT或BlastZ（或BlastX）来计算序列同一性级别（序列匹配）。优选的，序列匹配分析由有已建立的同源绘图技术如Shuffle-LAGAN（Brudno M.，Bioinformatics2003b，19Suppl1:154-162）或Markov随机场补充。当本申请中提及序列同一性百分数时，如果没有特别指出其他的方式，这些百分数是对于更长序列的全长计算。

本领域技术人员会理解根据本发明给出的方法可以无需过多试验来实践本发明。方法，技术和化学药品如给出的参考文献中所描述或来自标准生物技术和分子生物学教科书的方案。

在本发明的一个方面，提供了至少一种融合蛋白，其包含1型RIP或其片段，多肽B；以及

（i）至少一种能抑制病毒进入的多肽A；和/或

（ii）至少一种CAP或其片段，多肽C。

根据本发明第一方面的融合蛋白也可以包括变体或衍生物。术语“变体”和“衍生物”如上定义。多肽A可以是θ防御素，其类似物或片段。

阳离子抗微生物肽（CAP）可以是在病毒融合抑制，病毒基因抑制，病毒膜中断和/或病毒进入抑制中起关键作用的抗病毒CAP。CAP最大可以100个氨基酸长。CAP可以大多为动物来源。然而，也有来源于植物的CAP，包括但不限于环肽（cyclotides）。例如可以作为融合抑制物作用的细菌CAP可以包括但不限于Siamycin，NP-06和短杆菌肽（Gramicidin）A。可以作为融合抑制物作用的植物CAP可以包括环状杆菌素（Circulin）A、B，Kalata B1和B8；可以作为进入抑制物作用的植物CAP可以包括Kalata B8；可以作为病毒基因抑制物作用的植物CAP可以包括银杏抗菌蛋白基因（Ginkbilobin），α-Basrubin，Lunatusin和防御蛋白样蛋白（Sesquin）。可以作为病毒膜中断物作用的植物CAP可以包括环状杆菌素（Circulin）A、C和D，Tricyclon A和环紫菌素（cycloviolacin）H4。可以作为融合抑制物作用的动物CAP可以包括鲎肽（Polyphemusin）I和II，hfl-B5，内源性抗微生物多肽（Protegrins）(猪Cathelicidin)，大鼠防御素NP1，NP2，NP3和NP4，人β-防御素I和II，Temporin A，Temporin-LTc，Temporin-Pta，Caerin1.1，Ranatuerin6和9，爬行动物防御素以及毒鱼豆素（Piscidin）1和2；可以作为进入抑制物作用的动物CAP可以包括乳铁素B，兔中性粒细胞肽-1，皮质稳定素IIIa，兔中性粒细胞肽-3A，兔α-防御素，Retrocyclin-1，Retrocyclin-2，Retrocyclin-3，人α-防御素HNP-1，2，3，4，5和6，人β-防御素III（HBD3），恒河猴小防御素（minidefensin）（RTD-1，θ防御素），RTD-2恒河猴θ防御素，RTD-3恒河猴θ防御素，人中性粒细胞肽-2，人中性粒细胞肽-3和人中性粒细胞肽-4；可以作为病毒基因抑制物作用的动物CAP：杀菌肽（Cecropin）A，蜂毒肽（Melittin），EP5-1，马加宁（Magainin）2，hepcidin TH1-5和Epinecidin-1；可以作为病毒膜中断物作用的动物CAP可以包括吲哚菌肽（Indolicidin），Cathelicidin-4，人中性粒细胞肽-1，LL-37Cathelicidin，皮抑菌肽（Dermaseptin）S1，S4和S9，Maximin1，3，4和5，Brevinin1，Ranatuerin2P，6和9，Esculentin2P，Esculentin-1Arb，Caerin1.1，1.9和4.1，Brevinin-2-相关，Maculatin1.3，Maximin H5以及毒鱼豆素（Piscidin）1和2。其他CAP可以包括Mundticin KS恩特洛霉素（Enterocin）CRL-35，Lunatusin，FK-13(GI-20为衍生物)，速普肽（Tachyplesin）I，α-MSH，抗病毒蛋白Y3，毒鱼豆素3，Palustrin-3AR，Ponericin L2，Spinigerin，Melectin，Clavanin B，牛cathelicidin BMAP-27，BMAP-28，豚鼠cathelicidin CAP11，沙克乳杆菌细菌素（Sakacin）5X，菌丝霉素（Plectasin），真菌防御素，GLK-19，乳铁蛋白（Lf）肽2，KalataB8，Tricyclon A，丽蝇抗病毒肽（Alloferon）1，Uperin3.6，Dahlein5.6，Ascaphin-8，人富组蛋白（Histatin）5，豚鼠中性粒细胞CAP2和CAP1，厚壳贻贝抗菌肽（Mytilin）B和C，EP5-1和六肽（合成）皮质稳定素（Corticostatin）IV兔中性粒细胞肽2。

1型RIP可以：

（i）作为RNA N-糖苷酶作用，该酶水解真核生物核糖体中28S-rRNA普遍保守的八叠球菌（sarcin）/蓖麻毒蛋白（ricin）结构域（S/R结构域）4324位置处的腺苷N-C糖苷键并使其不能进行蛋白合成，由此功能性阻断翻译，

（ii）通过其多核苷酸：腺苷糖苷酶活性的方式直接作用于病毒颗粒或病毒核酸，和/或

（iii）作为DNA糖基化酶/嘌呤（AP）裂解酶作用，该酶能够不可逆放松HIV-1超螺旋DNA并催化双链的断裂，形成无活性产物。

特别地，1型RIP可以选自由α-Ebulitin，β-Ebulitin，γ-Ebulitin，Nigritin f1，Nigritin f2，Amarandin-S，苋抗病毒/RIP，Amarandin-1，Amarandin-2，苋色素（Amaranthin），滨藜（Atriplex patens）RIP，甜菜RIP，β-vulgin，鸡冠花RIP，藜RIP，CAP30B，菠菜（Spinacea oleracea）RIP，Quinqueginsin，Asparin-1，Asparin-2，麦仙翁毒蛋白（Agrostin），石竹素（Dianthin）29，DAP-30，DAP-32，石竹素30，石竹（Dianthuschinensis）RIP1，石竹RIP2，石竹RIP3，剪秋罗苷（Lychnin），Petroglaucin，Petrograndin，岩生肥皂草（Saponaria ocymoides）RIP，Vacuolas皂草素（saporin），皂草素-1，皂草素-2，皂草素-3，皂草素-5，皂草素-6，皂草素-7，皂草素-9，麦蓝菜（Vaccaria hispanica）RIP，Benincasin，α-Benincasin，β-Benincasin，Hispin，Byrodin I，Byrodin II，大肠杆菌素（Colocin）1，大肠杆菌素2，黄瓜（Cucumis figarei）RIP，Melonin，南瓜（C.moschata）RIP，Cucurmosin，麝香蛸素（Moschatin），麝香蛸素I，麝香蛸素II，麝香蛸素III，麝香蛸素IV，麝香蛸素V，Pepocin，绞股蓝毒蛋白（Gynostemmin）I，绞股蓝毒蛋白II，绞股蓝毒蛋白III，绞股蓝毒蛋白IV，绞股蓝毒蛋白V，绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum）RIP，Gypsophilin，Lagenin，Luffaculin，Luffangulin，丝瓜素（Luffin）-α，丝瓜素-B，MOR-I，MOR-II，木鳖子苷（Momordin）II，α-苦瓜素（Momorcharin），β-苦瓜素，γδ-苦瓜素，γ-苦瓜素，木鳖根蛋白（Momorcochin），木鳖根蛋白-S，佛手瓜蛋白（Sechiumin），Momorgrosvin，蛇瓜毒蛋白（Trichoanguin），α-Kirilowin，β-Kirilowin，α-天花粉蛋白（trichosanthin），TAP-29，括楼素（Trichokirin），Trichomislin，天花粉蛋白，Karasurin-A，Karasurin-B，马干铃蛋白（Trichomaglin），Trichobakin，巴豆毒蛋白（Crotin）2，巴豆毒蛋白3，Euserratin1，Euserratin2，抗病毒蛋白GAP-31，白树毒素（Gelonin），沙盒树（Hura crepitans）RIP，麻疯树毒蛋白（Curcin），麻疯树（Jathropa curcas）RIP，Mapalmin，Manutin1，Manutin2，α-pisavin，Charibdin，风信子（Hyacinthus orientalis）RIP，Musamin1，Musamin2，Musamin3，Musamin4，荷兰鸢尾（Iris hollandica）RIP，Cleroendrum aculeatum RIP，CIP-29，CIP-34，Crip-31，Bouganin，三角梅（Bougainvilla spectbilis）RIP，杂交（红）叶子花（Bougainvillea x buttiana）抗病毒蛋白1（BBAP1），苹果酸酶（ME1），ME2，MAP-S，美洲商陆抗病毒蛋白（PAPa-1），PAPa-2，PAP-α，PAP-I，PAP-II，PAP-S，PD-S1，DP-S2，Dodecandrin，抗病毒蛋白PAP，PIP，PIP2，八蕊商陆（Phytolacca octandra）抗病毒蛋白，八蕊商陆抗病毒蛋白II，大麦（Hordeum vulgare）RIP-I，大麦RIP-II，大麦亚种大麦翻译抑制剂II，黑麦（Secale cereale）RIP，麦芽凝集素（Tritin），二倍体多年生大刍草（Zea diploperemis）RIP I，二倍体多年生大刍草RIP II，苹果（Malus x domestica）RIP，苦瓜抗HIV蛋白（MAP30），大戟科多花白树蛋白（Gelonium multiflorum）（GAP31），美洲商陆抗病毒蛋白（PAP），阔叶寄芋蛋白（Mirabilis expansa）1（ME1），苹果酸酶（ME2），杂交（红）叶子花抗病毒蛋白1（BBAP1），噬菌体MU1，betavulgin（Bvg），麻疯树毒蛋白2，皂草素6，玉米RIP（B-32），烟草RIP（TRIP），Beetin（BE），BE27，紫茉莉抗病毒蛋白（MAP），天花粉蛋白（TCS），α-丝瓜素，α-苦瓜素（α-MMC），β-MMC丝瓜素，Ocymoidin，Bryodin，Pepopsin，β-天花粉蛋白，樟脑水杨酸钠（Camphorin），YLP，岛藤碱（Insularin），大麦RIP，麦芽凝集素，Lamjarin，和草菇（Volvariella volvacea）RIP组成的组。

根据本发明任一方面的融合蛋白可以是能够广谱应用的抗微生物化合物，并且不像本领域已知的某些化合物，其可以不受原料供应的任何限制来经济地生产。根据本发明任一方面的融合蛋白因此可以不受原料供应的任何限制来经济地大规模生产。

为了获得广谱的活性，根据本发明任一方面的融合蛋白可以能以多种不同途径，这就是说，以病毒进入抑制，病毒融合抑制，病毒整合酶抑制和病毒翻译抑制来干扰病毒感染和传播过程。融合肽因此可以具有多功能性能。由此可以从根据本发明任一方面的融合蛋白来生产全新类型的抗病毒药物。可以从作为融合抗病毒蛋白表达的多肽A，B和C获得的组合和排列的数量潜在的数以万计。

特别地，融合蛋白可以包括选自式I-XIII组成的组的至少一种结构式：

式I：A-B-C，

式II：A-B-C-C，

式III：A-B，

式IV：A-C-B，

式V：C-A-B，

式VI：C-B-A

式VII：C-B，

式VIII：B-A-C，

式IX：B-A-C-C，

式X：B-C-A，

式XI：B-A-C，

式XII：B-C，

式XIII：B-A，

式XIV：C-C-B-C-C，

式XV：C-B-C。

其中多肽A可以为θ防御素，其类似物或片段，多肽B可以为1型RIP，或其片段，而多肽C可以为CAP，或其片段；而-可以为直接连接或连接肽。

特别地，连接肽可以包括多肽序列：[VPXVG]_n，（SEQ ID NO：11），其中X为未知的或其他氨基酸而n为每个连接肽中SEQ ID NO：11的重复数。例如，n可以是1，2，3，4或5。更特别地，SEQ ID NO：11中X为G而n为2。

特别地，融合蛋白可以包括式I：

A-B-C-

其中多肽A为θ防御素，其类似物或片段，多肽B可以为1型RIP，或其片段，而多肽C可以为CAP，或其片段，而-可以为直接连接或连接肽。

更特别地，多肽A可以通过至少一个SEQ ID NO：11的第一连接肽与多肽B融合。甚至更特别地，多肽A可以通过SEQ ID NO：11的肽与多肽B融合，其中X为G而n为2。多肽B可以不用中间的连接肽直接连接到多肽C。式I中的多肽C可以在不连接B的游离段包括第二连接肽。第二连接肽可以包括式SEQ ID NO：11。甚至更具体的，在第二连接肽中X为G而n为2。

多肽A可以是脊椎动物或无脊椎动物来源的θ防御素。特别地，θ防御素可以来自细菌，真菌，哺乳动物，两栖类或爬行动物。哺乳动物可以是非人灵长类动物和/或无脊椎动物可以是鲎和/或昆虫。θ防御素可以选自由来自猕猴的分别为SEQ ID NOs：15-20的恒河猴小防御素（minidefensin）（RTD-1），RTD-2，RTD-3，Retrocyclin-1，Retrocyclin-2，Retrocyclin-3等组成的组（Tang YQ，1999;Leonava L，2001;Wang W，2004）。

θ防御素可以是合成的并可以选自由序列分别为SEQ ID NOs：21-33的retrocyclin同源物RC100-RC108和RC110-RC114组成的组（Cole等人，2002:PNAS，V99(4):1813-1818;Wang等人，2003:J.lmmunol.170:4708-4716）。Retrocyclin（RC）100-108和RC110-114的序列示于下面表1a中。

SEQ ID NO：	序列
		15	GFCRCLCRRGVCRCICIR
16	RCLCRRGVCRCLCRRGVC
		17	RCICTRGFCRCICTRGFC
18	GICRCICGRGICRCICGR
		19	GICRCICGRGICRCICGR
20	RICRCICGRRICRCICGR
		21	GICRCICGRGICRCICGR
22	CICRCICGKGICRCICGR
		23	GICRCYCGRGICRCICGR
24	GICRCICGRGICRCYCGR
		25	GYCRGICGRGICRCICGR
26	GICRCICGRGYCRCICGR
		27	GICYCICGRGICRCICGR
28	GICICICCYGICRCICGR
		29	GICICICGRGICYCICGR
30	GICICCCGRGICYCICGR
		31	RGCICRCIGRGCICRCIG
32	RGCICRCIGRGCICRCIG
		33	GICRCICGRGICRCICGR
34	GICRCICGKGICRCYCGR

表1a.天然存在的和合成的θ防御素蛋白的多肽序列。

多肽B可以是选自由Ebulitins，Nigritins，Amarandins，苋抗病毒/RIP，苋色素，滨藜RIP，甜菜RIP，β-vulgin，鸡冠花RIP，藜RIP，CAP30B，菠菜RIP，Quinqueginsin，Asparins，麦仙翁毒蛋白，石竹素，DAPs，石竹的，剪秋罗苷，Petroglaucin，Petrograndin，岩生肥皂草RIP，Vacuolas 皂草素，皂草素，麦蓝菜RIP，Benincasins，Hispin，Byrodins，大肠杆菌素，Cucumis figarei RIP，Melonin，南瓜RIP，Cucurmosin，麝香蛸素s，Pepocin，绞股蓝毒蛋白，绞股蓝RIP，Gypsophilin，Lagenin，Luffaculin，Luffangulin，丝瓜素，MORs，木鳖子苷II，苦瓜素，木鳖根蛋白，木鳖根蛋白-S，佛手瓜蛋白，Momorgrosvin，蛇瓜毒蛋白，Kirilowin，α-天花粉蛋白，TAP-29，括楼素，Trichomislin，天花粉蛋白，Karasurin，马干铃蛋白，Trichobakin，巴豆毒蛋白，Euserratin抗病毒蛋白GAP-31，白树毒素，沙盒树RIP，麻疯树毒蛋白，麻疯树（）RIP，Mapalmin，Manutins，α-pisavin，Charibdin，风信子RIP，Musamin，荷兰鸢尾RIP，Cleroendrum aculeatum RIP，CIPs)，Crip-31，Bouganin，三角梅RIP，杂交（红）叶子花抗病毒蛋白1（BBAP1），苹果酸酶，MAP-S，美洲商陆抗病毒蛋白（PAP），PD-S1，DP-S2，Dodecandrin，PIP，PIP2，八蕊商陆抗病毒蛋白，大麦RIP，大麦亚种大麦翻译抑制剂II，黑麦RIP，麦芽凝集素，二倍体多年生大刍草RIPs，苹果RIP，苦瓜抗HIV蛋白，大戟科多花白树蛋白，阔叶寄芋蛋白1，噬菌体MU1，betavulgin（Bvg），麻疯树毒蛋白2，皂草素6，玉米RIP（B-32），烟草RIP（TRIP），Beetins，紫茉莉抗病毒蛋白（MAP），天花粉蛋白（TCS），丝瓜素，苦瓜素，Ocymoidin，Bryodin，Pepopsin，β-天花粉蛋白，樟脑水杨酸钠，YLP，岛藤碱，大麦RIP，麦芽凝集素，Lamjarin，和草菇RIP组成的组的1型核糖体失活蛋白。

多肽C可以选自由环肽，Siamycins，NP-06，短杆菌肽A，环状杆菌素，Kalatas，银杏抗菌蛋白基因，α-Basrubin，Lunatusin，防御蛋白样蛋白，Tricyclon A，Cycloviolacins，鲎肽，hfl-B5，内源性抗微生物多肽(猪Cathelicidin)，大鼠防御素，人β-防御素，Temporins，Caerins，Ranatuerins，爬行动物防御素，毒鱼豆素，乳铁素B，兔中性粒细胞肽，兔α-防御素，Retrocyclins，人α-防御素，人β-防御素III（HBD3），恒河猴minidefensin（RTD-1，θ防御素），恒河猴θ防御素，人中性粒细胞肽，杀菌肽As，蜂毒肽，EP5-1，马加宁2s，杂种(CE-MA)，hepcidin TH1-5，Epinecidin-1，吲哚菌肽，Cathelicidin-4，LL-37Cathelicidin，皮抑菌肽，Maximins，Brevinins，Ranatuerins，Esculentins，Maculatin1.3，Maximin H5和毒鱼豆素，Mundticin KS恩特洛霉素CRL-35，Lunatusin，FK-13(GI-20为衍生物)，速普肽，α-MSH，抗病毒蛋白Y3，Palustrin-3AR，Ponericin L2，Spinigerin，Melectin，Clavanin B，牛cathelicidins，豚鼠cathelicidin CAP11，沙克乳杆菌细菌素5X，菌丝霉素（Plectasin），真菌防御素，GLK-19，乳铁蛋白（Lf）肽2，丽蝇抗病毒肽1，Uperin3.6，Dahlein5.6，Ascaphin-8，人富组蛋白5，豚鼠中性粒细胞肽，厚壳贻贝抗菌肽（Mytilins），EP5-1，六肽（合成）皮质稳定素IV兔中性粒细胞肽2，Aureins，Latarcin，菌丝霉素，Cycloviolins，Varv肽E，Palicourein，VHL-1组成的组。

所有引用的参考文献以引用的方式纳入本发明。

特别地，多肽A可以为Retrocyclin，多肽B可以为MAP-30而多肽C可以为皮抑菌肽。更特别地，多肽A可以为Retrocyclin101（RC101），而多肽C可以为皮抑菌肽1。包含RC101，MAP-30和皮抑菌肽1分别作为多肽A，B和C的多肽在本发明中被称为RetroMAD1。按RT-PCR所确定的，HSV1，HSV2，DEN1，DEN2，DEN3和DEN4的细胞激惹测试中RetroMAD1可以在前处理，同时处理和后处理中显示显著的病毒拷贝减少。

特别地，多肽A可以包括SEQ ID NO：12的氨基酸序列，其片段或变体，多肽B可以包括SEQ ID NO：13的氨基酸序列，其片段或变体，而多肽C可以包括SEQ ID NO：14的氨基酸序列，其片段或变体。

更特别地，根据本发明任意方面的融合蛋白可以包括氨基酸序列SEQ ID NO：1。融合蛋白或融合蛋白的基本单元可以有约10-50kDa的分子量。特别地，融合蛋白的分子量可以为36.5，37，37.5，37.8，38，39，40，41，41.2，43或48kDa。融合蛋白可以包含基本单元的重复。技术人员应理解融合蛋白的分子量取决于存在于蛋白中的基本单元的重复数。序列在下面表1b中提供。

在本发明另一个方面，提供有至少一种分离的核酸分子，其能表达根据本发明任意方面的融合蛋白。

本发明的核酸分子可以是DNA，cDNA，PNA，CNA，RNA，cDNA，基因组DNA，合成DNA，或其组合，并可以是双链的或单链，有义和/或反义链。这些分子的片段也被考虑在本发明的范围中，并可以通过例如聚合酶链式反应（PCR）产生或通过以一种或多种限制性核酸内切酶处理生成。核糖核酸（RNA）分子可以通过体外转录产生。

根据本发明的核酸分子可以包含天然存在的序列，或者与天然存在序列不同，但由于遗传密码子的简并性编码相同肽的序列（例如，SEQ ID NOs：1，12，13和14的肽）。这些核酸分子不限于编码序列并可以包括某些或全部位于编码序列上游或下游的非编码序列。

根据本发明任意方面的核酸分子可以在体外合成（例如，通过基于亚磷酰胺的合成）或从细胞，如细菌或哺乳动物细胞中获得。核酸可以是脊椎动物，无脊椎动物，或较高等或较低等植物的核酸。特别地，脊椎动物可以是哺乳动物，两栖动物，爬行动物，鸟类或鱼类而较低等植物可以是真菌。哺乳动物可以是人或非人的。特别地，只要其满足上述标准，非人的哺乳动物可以是非人灵长类，小鼠，大鼠，豚鼠，牛，羊，马，猪，兔，狗或猫。这些类型核酸中核苷酸的组合或修饰也被涵盖。

特别地，根据本发明的核酸包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列，其片段，变体或衍生物。特别地，核苷酸序列可以与SEQ ID NO：2至少50％，55％，65％，75％，85％，95％，或98％相同。更特别地，核苷酸序列可以能编码SEQ ID NO：1的多肽。

序列在下面的表1b中提供。

表1b.本发明的多肽和多核苷酸序列

可以在本发明多肽和编码它们的DNA片段的结构中做修饰和改变，而这些片段仍然能得到编码有所需特性的蛋白或肽的功能分子。可以通过改变DNA序列密码子来实现氨基酸改变。例如，蛋白结构中的某些氨基酸可以被其他氨基酸所取代，而没有明显损失结构，如，例如融合蛋白微生物结合区域的相互结合能力。由于蛋白的相互结合能力和性质限定了蛋白的生物功能活性，可以在蛋白序列，和某些包括其底层DNA编码序列中进行某些氨基酸序列取代，仍然得到有类似性质的蛋白。可以在公开化合物的肽序列中或者在对应DNA序列中（这些DNA序列编码没有明显损失其生物效用或活性的所述蛋白）进行各种改变。如果取代所提供的氨基酸具有与初始序列氨基酸足够相似的属性，根据本发明融合蛋白的氨基酸取代可以不影响本发明分离多肽的抗微生物效果。

根据本发明的分离核酸分子涵盖了就其自身而言在自然状态下没有发现的片段。因此，本发明涵盖了纳入载体（例如，质粒或病毒载体）或异源细胞基因组（或同源细胞基因组，在非天然染色体定位的位置处）之中的重组核酸分子。

在本发明再另一个方面中，提供了包含根据本发明任一方面的核酸分子的至少一种质粒或载体。

在本发明一个方面中，提供了包含根据本发明任一方面的核酸分子和/或质粒或载体的至少一种宿主细胞。

可以在适合的宿主中表达DNA（在逆转录病毒载体的情况下为RNA）以产生包含根据本发明任一方面的融合蛋白的多肽。因此，可以根据已知的技术使用编码组成本发明融合肽的多肽的DNA，来构建表达载体，其随后被用于转化适合的宿主细胞以表达和生产根据本发明的融合蛋白。

编码组成本发明融合蛋白的多肽的DNA（在逆转录病毒载体的情况下为RNA）可以与许多种其他DNA序列连接以导入适合的宿主。伴侣DNA会取决于宿主的性质，将DNA导入宿主的方式，以及是否需要游离型保持或整合。

通常，DNA以适合的方向和正确的表达阅读框被插入表达载体，如质粒。如果需要，DNA可以被连接到被所需宿主识别的适合的转录和翻译调控核苷酸序列上，尽管这样的控制通常在表达载体中可用。载体随后可以通过标准技术被导入宿主中。宿主细胞可以是原核或真核的。特别地，在某些情况下细菌细胞是优选的原核宿主细胞，而通常是大肠杆菌菌株如，例如从BethesdaResearch Laboratories公司，Bethesda，MD，USA可获得的大肠杆菌菌株DH5，或从美国Rockville，MD，的美国模式培养物收集中心（ATCC）可获得的RRI（编号ATCC31343）。优选的真核宿主细胞包括酵母，昆虫和哺乳动物细胞，特别是，脊椎动物细胞，如来自小鼠，大鼠，猴子或人成纤维细胞和肾细胞系的细胞。酵母宿主细胞包括YPH499，YPH500和YPH501，其通常可从Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA92037，USA获得。优选的哺乳动物宿主细胞包括可从ATCC以CCL61获得的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，可从ATCC以CRL1658获得的NIH瑞士小鼠胚胎细胞NIH/3T3，可从ATCC以CRL1650获得的源自猴肾的COS-I细胞以及为人胚肾细胞的293细胞。优选的昆虫细胞为Sf9细胞，其可以被杆状病毒表达载体转染。

通过通常取决于使用的载体类型的公知方法来完成带有本发明的DNA构建体、核酸分子和/或质粒或载体的适合细胞宿主的转化。电穿孔、基因枪转化、农杆菌介导的和逆转录病毒介导的转化也可以用于转化和/或转染细胞，并在本领域中公知可用于转化酵母细胞、细菌细胞、昆虫细胞和脊椎动物细胞。

通常，不是所有的细胞都会被载体转化。因此，需要选择转化的宿主细胞。一种选择技术包括将DNA序列纳入表达载体，所述DNA序列带有在被转化细胞中编码可选择性状，如抗生素抗性的任何所需控制元件。可选的，这样可选择性状的基因可以在用于共转化所需宿主细胞的另一个载体上。

许多表达系统已知，包括如上述的细菌（例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌）、酵母（例如酿酒酵母和毕赤酵母）、丝状真菌（例如曲霉菌）、植物细胞、动物细胞和昆虫细胞。

启动子是由DNA序列形成的表达控制元件，其允许RNA聚合酶结合和转录的发生。与示例性细菌宿主相容的启动子序列通常在质粒中提供，质粒中含插入本发明DNA片段的方便酶切位点。典型的原核载体质粒为可从Biorad Laboratories.（Richmond，CA.USA）获得的pUC18，pUC19，pBR322和pBR329以及可从Pharmacia，Piscataway，NJ，USA获得的pTrc99A和pKK223-3。

在本发明另一个方面，提供了通过在表达融合蛋白的条件下培养根据本发明的宿主细胞来生产根据本发明任一方面的融合蛋白的方法。相比复杂的合成小分子药物（其需要常与多功能基团化学合成相关的非常高成本投资），考虑根据本发明任一方面的融合蛋白的生产成本花费为低的。由于融合蛋白是生物的，相对小的成本投资可能有能力产生大量产品。

特别地，已经被本发明的重组DNA转化的宿主细胞随后在本领域技术人员按本发明公开的教导已知的适合条件下被培养足够的时间，来允许组成依根据本发明的融合蛋白的多肽的表达，多肽随后可以被回收。

在本发明又一个方面，提供了包含根据本发明任一方面的融合蛋白的药物组合物。药物组合物可以进一步包含药学可接受载体、赋形剂、佐剂、稀释剂和/或表面活性剂。因此这样的制剂除了融合蛋白之外包括，生理上可接受的载体或稀释剂，可能与一种或多种其他药剂如抗体或药物，如抗生素混合。适合的载体包括，但不限于，生理盐水、磷酸缓冲盐水、磷酸缓冲葡萄糖盐水和缓冲的盐水。或者，当需要时，融合蛋白可以通过加入上述水缓冲溶液被冻干（冷冻干燥）并重建来使用。施用的途径为常规肠外的途径，包括静脉注射、肌肉注射、皮下和腹膜内注射或口服给药。施用可以是全身的和/或局部的。

特别地，根据本发明的药物组合物包括配体，其为至少一种根据本发明的融合蛋白，根据本发明的核酸或根据本发明的表达载体，以及上述药学可接受的载体。

药物组合物可以被局部或非肠道施用来使用，如皮下、皮内、腹膜内、静脉内、肌内或口服施用。为此，配体可以被溶解或悬浮于药学可接受的，优选水性载体中。药物组合物可以包含赋形剂，如缓冲液、结合剂、崩解剂（blasting agents）、稀释剂、矫味剂、润滑剂等。组合物可以被用做抗微生物剂来防止、预防和/或治疗。

特别地，根据本发明任意方面的药物组合物可以适合口服施用。药物组合物可以进一步包括表面活性剂。表面活性剂可以选自由熊去氧胆酸钠，甘氨酰熊去氧胆酸钠，熊去氧胆酸钾，甘氨酰熊去氧胆酸钾，熊去氧胆酸亚铁，甘氨酰熊去氧胆酸亚铁，熊去氧胆酸铵，甘氨酰熊去氧胆酸铵，牛磺熊去氧胆酸钠，N-甲基甘氨酰熊去氧胆酸钠，牛磺熊去氧胆酸钾，N-甲基甘氨酰熊去氧胆酸钾，牛磺熊去氧胆酸亚铁，N-甲基甘氨酰熊去氧胆酸亚铁，牛磺熊去氧胆酸铵，N-甲基甘氨酰熊去氧胆酸铵，N-甲基牛磺熊去氧胆酸钠，N-甲基牛磺熊去氧胆酸钾，N-甲基牛磺熊去氧胆酸亚铁，N-甲基牛磺熊去氧胆酸铵，胆酸钠，去氧胆酸钠，胆酸钾，去氧胆酸钾，胆酸亚铁，去氧胆酸亚铁，胆酸铵，去氧胆酸铵，鹅去氧胆酸钠，甘氨酰胆酸钠，鹅去氧胆酸钾，甘氨酰胆酸钾，鹅去氧胆酸亚铁，甘氨酰胆酸亚铁，鹅去氧胆酸铵，甘氨酰胆酸铵，牛磺胆酸钠，N-甲基甘氨酰胆酸钠，牛磺胆酸钾，N-甲基甘氨酰胆酸钾，牛磺胆酸亚铁，N-甲基甘氨酰胆酸亚铁，牛磺胆酸铵，N-甲基甘氨酰胆酸铵，N-甲基牛磺胆酸钠，甘氨酰去氧胆酸钠，N-甲基牛磺胆酸钾，甘氨酰去氧胆酸钾，N-甲基牛磺胆酸亚铁，甘氨酰去氧胆酸亚铁，N-甲基牛磺胆酸铵，甘氨酰去氧胆酸铵，牛磺去氧胆酸钠，N-甲基甘氨酰去氧胆酸钠，牛磺去氧胆酸钾，N-甲基甘氨酰去氧胆酸钾，牛磺去氧胆酸亚铁，N-甲基甘氨酰去氧胆酸亚铁，牛磺去氧胆酸铵，N-甲基甘氨酰去氧胆酸铵，N-甲基牛磺去氧胆酸钠，N-甲基甘氨酰鹅去氧胆酸钠，N-甲基牛磺去氧胆酸钾，N-甲基甘氨酰鹅去氧胆酸钾，N-甲基牛磺去氧胆酸亚铁，N-甲基甘氨酰鹅去氧胆酸亚铁，N-甲基牛磺去氧胆酸铵，N-甲基甘氨酰鹅去氧胆酸铵，N-甲基牛磺鹅去氧胆酸钠，N-甲基牛磺鹅去氧胆酸钾，N-甲基牛磺鹅去氧胆酸亚铁，N-甲基牛磺鹅去氧胆酸铵，熊去氧胆酸乙酯，熊去氧胆酸丙酯，甘氨酰鹅去氧胆酸钠，甘氨酰鹅去氧胆酸钾，甘氨酰鹅去氧胆酸亚铁，甘氨酰鹅去氧胆酸铵，牛磺鹅去氧胆酸钠，牛磺鹅去氧胆酸钾，牛磺鹅去氧胆酸亚铁，牛磺鹅去氧胆酸铵，和去氧胆酸钠组成的组。特别地，表面活性剂可以是去氧胆酸钠，由于去氧胆酸钠使得蛋白当消耗时不在胃肠道中消化其能允许口服施用。这是方便的施用模式。

表面活性剂存在的浓度可以是按重量0.003-5%。特别地，浓度可以是0.01-4.5wt%，0.05-4wt%，0.1-3.5wt%，0.5-2wt%，1-1.5wt%等。特别地，表面活性剂的浓度为约0.05wt%。

根据本发明的药物组合物包含至少一种配体，所述配体可以包括至少一种根据本发明的融合蛋白、根据本发明的核酸、或根据本发明的表达载体，根据本发明的药物组合物可以被施用给患有微生物，和特别是病毒感染的患者。

施用给患有微生物感染的患者的根据本发明配体的剂量随所治疗疾病和治疗接受者的确切性质而变化。通常对成人患者剂量在约0.005到约1000mg的范围中，经常是1到30日之间的时段中每日施用。优选的每日剂量为0.5到50mg每日。特别地，每日剂量可以是约每日0.8，1，1.2，1.5，2，2.5，3.2，4，4.5mg。剂量可以被以这样的方式施用，配体存在于药物中的浓度可以在要治疗的患者中提供0.001mg/kg/日到5mg/kg/日之间的所述配体体内浓度。在一个实施方式中，根据本发明的药物组合物，肽或配体存在的量能实现1μg/ml以上，最大浓度100μg/ml的体内浓度。本发明的药物制剂可以进一步包括至少一种宿主防御分子，如溶菌酶，乳铁蛋白和/或逆转录酶抑制剂。

根据本发明任一方面的融合蛋白和药物组合物可以有广谱的抗病毒特性。特别地，根据本发明任一方面的融合蛋白和药物组合物可以被用于开发广谱的口服给药抗病毒疗法。这对在病毒流行病威胁压力下的许多畜牧业特别有益。由于在世界人口增长时，对于食物产出的多产性也有更大的压力，因此这也是特别重要的。

根据本发明的一个方面，提供了在有需要的脊椎动物、无脊椎动物或植物中治疗和/或防止微生物感染的方法，包括给脊椎动物、无脊椎动物或植物施用有效量的根据本发明任一方面的融合蛋白或药物组合物。

在本发明另一个方面，提供了用于医药的、根据本发明任一方面的融合蛋白或药物组合物。

在本发明又一个方面，提供了用于在脊椎动物、无脊椎动物或植物中治疗和/或防止微生物感染的、根据本发明任一方面的融合蛋白或药物组合物。

在本发明再一个方面，提供了根据本发明任一方面的融合蛋白或药物组合物，在制备用于在脊椎动物、无脊椎动物或植物中治疗和/或防止微生物感染的药物中的用途。

特别地，所述微生物感染可以为病毒感染。脊椎动物可以为哺乳动物，鱼类或鸟类。甚至更特别地，哺乳动物可以为非人动物。

本领域技术人员会理解可以根据本发明给出的方法不用过多试验来实践本发明。方法，技术和化学品如给出的参考文献中描述或来自标准生物技术和分子生物学教科书中的方案。

当被对象摄入时，根据本发明任一方面的融合蛋白和/或药物组合物可以不导致或基本不导致毒性副作用。

现在已一般描述了本发明，通过参考下列实例例将会更容易地理解本发明，提供这些实施例是为了解释说明本发明，而不是为了限制本发明。

实施例

本领域已知并且不做具体描述的标准分子生物学技术通常按照如Sambrook和Russel Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratory，New York(2001)中所描述。

实施例1

表达载体的构建与设计

通过合约服务（GeneArt AG，Germany）编码SEQ ID NO：1的RetroMAD1A-B-C的基因被合成并在Kpnl/Sacl位点克隆入pGA4载体骨架。预期的产物大小为1140bp，其编码有379个氨基酸并且预期大小为41.2kDa的肽。多核苷酸序列和翻译的多肽序列在图1中显示。基因在Ncol/HindIII位点被亚克隆入pET表达载体（Novagen），pET-26（b）。使用卡那霉素作为选择和保持培养物目的的标记物。该载体是添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导的。质粒，pRMD1随后被转入BL21（DE23）细胞（Novagen）并接种于有卡那霉素的选择性培养基上。

从大肠杆菌表达RetroMAD1

一个重组克隆在添加有30μg/ml卡那霉素的10ml LB Bertani（DIFCO）培养基上37℃培养过夜。该培养物被用于接种添加有30μg/ml卡那霉素的100ml LB Bertani，并在37℃培养直至600nm的光学读数为0.4-0.6。以1.0mM的终浓度加入IPTG。培养期继续3小时。对电泳上样缓冲液中所提取细胞里的RetroMAD1片段的SDS-PAGE分析显示蛋白具有约37.5kDa的分子量，RetroMAD1预期分子量仅在诱导的细胞中产生（图2A）。通过SDS-PAGE进一步的溶解分析显示RetroMAD1在大肠杆菌的沉淀部分而不是在上清部分发现，表明如图2B所示，蛋白被作为包涵体表达并产生。

RetroMAD1的分离和纯化

通过在15℃5000x g离心10min来从100ml诱导的培养物中收获细胞。细胞被悬浮于含20mM Tris-HCl（pH7.5），10mM EDTA和1%Triton-X100的裂解缓冲液中。超声破碎细胞。通过在8000xg离心20min来从可溶部分中分离不溶部分，弃掉上清并通过重复相同的步骤来进一步清洗沉淀。通过以超声重悬浮并以离心分离来用RO水进一步清洗沉淀两次。

RetroMAD1的溶解

不溶物在添加有2-5%月桂酰肌氨酸钠和100mMβ-巯基乙醇的10ml5-8尿素或6M盐酸胍中被溶解并超声处理，溶解进行过夜。通过8000x g离心20分钟来从细菌细胞壁分离溶解的蛋白。

RetroMAD1的复性

通过使用透析来进行蛋白的复性。在15kDa分子量截止透析膜（Spectra/Por Lab）之中透析蛋白（10ml）。蛋白在以NaOH调节至11.0pH的5L的RO水中透析。在室温下进行孵育15-20小时。复性的蛋白被转到50ml管中并在8000x g离心以分离任何不溶物。复兴蛋白被储存在-20℃下直至进一步使用。下面实施例中RetroMAD1的生物活性是蛋白复性成功的证明。

实施例2

病毒储备物

从Malaya大学医学系医学微生物部门获得单纯疱疹病毒1型（HSV-1）和2型（HSV-2）。通过将25-cm²组织培养瓶中的单层vero细胞，以在1ml含2%胎牛血清（FBS）（HyClone）的Dulbecco改良鹰培养基（Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM）（HyClone）中1:5到1:10稀释的病毒孵育来制备病毒储备物。将瓶置于在37℃的孵育器中以允许病毒吸收。1小时后，加入4ml添加2%FBS的DMEM，而允许细胞在37℃继续增殖6到7天直至细胞病变效应（CPE）被确认。通过在1500x g离心5分钟去除细胞碎片。以每份1ml的等份收集病毒上清并将其储存在-80℃下直至进一步使用。

通过噬菌斑测试的病毒滴定

通过使用从Malaya大学医学系医学微生物部门获得的Vero细胞的噬菌斑测试来滴定每种HSV类型的表示为每毫升噬菌斑形成单位（PFU/ml）的毒力。Vero细胞在添加10%FBS的DMEM6孔板（5×10⁵细胞/孔）中37℃增殖24小时。24小时后，培养基被有2%FBS的DMEM中的病毒上清系列稀释所替代，且细胞被在37℃进一步孵育1小时以允许病毒吸收。随后加入琼脂覆盖层，且板在37℃被孵育5天（或直至噬菌斑形成）。一旦噬菌斑形成，去除琼脂覆盖层，并以6%冰醋酸中的0.1萘黑溶液染色噬菌斑。

体外病毒抑制测试

前处理测试：Vero细胞被以每孔1×10⁵细胞的浓度接种于24孔培养板上并孵育24h。在病毒接种前，最大非毒剂量的RetroMAD1被加入到细胞中并孵育24h。与肽孵育24h后，在0.1MOI的单纯疱疹病毒-2（HSV-2）被接种到Vero细胞上1h，同时偶尔摇动。病毒被去除而细胞以新鲜的DMEM替换。培养物在37℃，5%的CO₂气氛中被孵育24、48和72h。

同时处理测试：Vero细胞被以每孔1×10⁵细胞的浓度接种于24孔培养板上并孵育24h。将RetroMAD1与病毒混合并在37℃孵育1h。随后混合物被接种到24孔培养板中的Vero细胞上1h，同时偶尔摇动。去除溶液并以DMEM替换培养基。培养物在37℃，5%的CO₂气氛中被孵育24，48和72h。

后处理测试：Vero细胞被以每孔1×10⁵细胞的浓度接种于24孔培养板上并孵育24h。在0.1MOI的HSV-2被接种到24孔培养板中的Vero细胞上1h，同时偶尔摇动。去除培养基并以含RetroMAD1的DMEM替换。培养物在37℃，5%的CO₂气氛中被孵育24，48和72h。

在所有抗病毒测试中时间段的末尾，板被冷冻在-80℃下。在两次冷冻和解冻的循环后收集上清和贴壁细胞。通过提取试剂盒（Bioneer，韩国）提取病毒DNA。洗脱的DNA随后被用于RT-PCR中。

病毒DNA提取与使用实时PCR分析

使用200μl培养基按照制造商说明以基因组DNA提取试剂盒（BioNeer）来分离病毒DNA。以分光光度测量分离的总DNA的纯度。使用BoiRad CFX98（Biorad）进行扩增和病毒载量检测。每份25μl的Green PCR Master Mix含1X终浓度的12.5μl的Green（Biorad），0.5μl（0.2μM）的正向（HSV-1：5'TGG GAC ACA TGCCTT CTT GG3'（SEQ ID NO：3），HSV-2：5'GTA CAG ACC TTC GGA GG'3（SEQ ID NO：4）和反向引物（HSV-1：5'ACC CTT AGT CAG ACT CTG TTA CTT ACC C3'（SEQ ID NO：5），HSV-2：5'CGCTTC ATC ATG GGC'3（SEQ ID NO：6）以及5μl的模板DNA。以95℃，15分钟的初始步骤开始热循环，随后进行34个95℃下的30秒的变性步骤，60℃下的30秒的退火和72℃下的1分钟的延伸的循环以及72℃下的5分钟的最终延伸。使用HSV-1引物的结果列于表2和图3而使用HSV-2的结果列于表3和图4。发现RetroMAD1对抑制HSV感染进展高度有效，如图3和4所示在所有处理条件下得到大于90%的病毒拷贝的减少。该研究中显示的结果表明RetroMAD1对HSV的显著抑制，得到了新类型的抗病毒化合物。

(A)

(B)

表2.以RetroMAD1孵育24和48小时后的病毒减少百分数：（A）在MOI=0.1的HSV-1（B）在MOI0.5的HSV-1。

(A)

(B)

表3.以RetroMAD1孵育24和48小时后的病毒减少百分数：（A）在MOI=0.1的HSV-2（B）在MOI0.5的HSV-2。

实施例3

病毒储备物

本研究中使用的登革病毒1型（DENV-1），2型（DENV-2），3型（DENV-3），4型（DENV-4）毒株分别为夏威夷，新几内亚C，H87和H241毒株原型（承蒙Malaya大学医学系医学微生物部门馈赠）。通过将25-cm²组织培养瓶中的单层C6/36细胞，以在1ml含2%FBS的Leibovitz’L-15中1:5到1:10稀释的病毒孵育来制备病毒储备物。将瓶置于在28℃的孵育器中以允许病毒吸收。1小时后，加入4ml含2%FBS的Leibovitz’L15，且允许细胞在28℃继续增殖6到7天直至细胞病变效应（CPE）被确认。通过在1500x g离心5分钟去除细胞碎片。以每份1ml的等份收集病毒上清并将其储存在-80℃下直至进一步使用。

通过噬菌斑测试的病毒滴定

通过使用从Malaya大学医学系医学微生物部门获得的HepG2（人肝癌细胞系）细胞的噬菌斑测试来滴定每种登革类型的表示为每毫升噬菌斑形成单位（PFU/ml）的毒力（Phoolcharoen和Smith，2004）。HepG2细胞在有10%胎牛血清（FBS）的DMEM6孔板（5×10⁵细胞/孔）中37℃增殖24小时。24小时后，培养基被有2%FBS的DMEM中的病毒上清系列稀释所替代，且细胞在37℃被进一步孵育1小时以允许病毒吸收。随后加入琼脂覆盖层，且板被在37℃孵育5天（或直至噬菌斑形成）。一旦噬菌斑形成，去除琼脂覆盖层，并以6%冰醋酸中的0.1萘黑溶液染色噬菌斑。

体外病毒抑制测试

在100μg/ml的化合物MNTD和0.1与0.5的病毒感染复数下一式两份进行RetroMAD1的体外病毒抑制测试。预制的单层C6/36细胞在24孔板上的Leibovitz’L-15（HyClone）中制备（5×10⁵细胞/孔）。细胞被用于三种处理：感染前处理，同时处理和感染后处理。对感染前处理和感染后处理，细胞分别被与RetroMAD1预孵育24小时和与稀释的病毒储备物预孵育1小时，且对同时处理，RetroMAD1和稀释的病毒储备物都被同时孵育。24小时和28小时孵育时间后，培养基被收集并等分入标记的1.5ml微量管中并被保存在-80℃直至进一步使用。

病毒RNA提取与使用实时PCR分析

使用200μl培养基按照制造商说明以病毒RNA提取试剂盒（BioNeer）来分离病毒RNA。以分光光度测量分离的总RNA的纯度。使用BoiRad CFX98（Biorad）进行扩增和病毒载量检测。每份25μl的PCR混合物含有1X终浓度的12.5μl Green（Biorad），1μl iScript^TM一步RT-PCR（Biorad），0.25μl（10μM）的正向（5'GGA AGG AGA AGGACT GCA CA3'）（SEQ ID NO：7）和反向引物（5'ATT CTT GTG TCC CAT CCT GCT3'）（SEQ IDNO：8）以及5μl的模板RNA。以在50℃下，30分钟的初始步骤和在95℃下15分钟的初始变性步骤开始热循环，随后进行40个95℃下的30秒变性，60℃下的40秒退火和72℃下的5秒延伸的循环以及72℃下的10分钟最终延伸。DENV1、DENV2、DENV3和DENV4的结果分别示于表4-7和图5中。

发现RetroMAD1在感染前治疗条件下经过24小时和48小时的孵育期，对在0.1MOI的所有四种登革血清型有效。在血清型中，确定以RetroMAD1感染前治疗对在MOI0.1和0.5的登革血清型2给出了最好的病毒抑制效果。感染前治疗和同时感染的治疗条件给出了50-90%减少范围内的满意抑制效果。

表4.以RetroMAD1孵育24和48小时后DENV1的减少百分数（MOI=0.1）。

(A)

(B)

表5.对DENV2（a）MOI=0.1和（b）MOI=0.5，以RetroMAD1孵育24和48小时后DENV2的减少百分数

表6.以RetroMAD1孵育24和48小时后DENV3的减少百分数

表7.以RetroMAD1孵育24和48小时后DENV4的减少百分数

具有猫免疫缺陷病毒（FIV）的典型症状如开放性创伤以及牙龈炎的野猫在常规药物缓解症状失败后用RetroMAD1治疗。使用ELISA PCR该猫已经显示具有FIV（结果未显示）。由于观察到Sporotrix感染，免疫抑制显而易见。以0.68mg/ml浓度的RetroMAD1的口服剂量（可以与表面活性剂，去氧胆酸钠联合，其中表面活性剂的浓度为约0.05wt%）0.6ml3x每日混入其食物中来治疗猫。早期以头孢氨苄和伊曲康唑的治疗使得创口缩小了50%，但那之后，这些开放的伤口没有继续愈合。在14天RetroMAD1治疗之后，伤口开始愈合，而在2个月内，其已完全消失。在这段时间期间，猫有良好的食欲且其体重从4.5kg增加到7.5kg。尽管使用PCR其仍然为FIV阳性，这是由于已经整合入猫基因组的前病毒DNA而不是病毒活动或存在的标志。猫已经在各种RetroMAD1治疗方案中累积进行8个月治疗而且没有明显的行为变化，并且没有明显的副作用。

类似的，以口服施用0.68mg/ml的RetroMAD1（可以与表面活性剂，去氧胆酸钠联合，其中表面活性剂的浓度为约0.05wt%）0.1ml3x每日每1kg体重，来治疗总数25只有FIV，FeLV，FPV或共感染的，体重范围从2-4.6kg初始重的猫。所有病例使用ELISA为FIV阳性并明显有症状（结果未显示）。在2个病例中，FIV和FeLV共感染引起猫从鼻、嘴和肛门流血并使猫不能自立。除了一个猫死亡的病例，在所有病例中，相比如果仅用常规药物，对象动物更快的完全康复。在动物死亡的单独病例中，由于主人要求将其带回，猫不能完成其剂量方案。这些结果是从2010年7月22日至2011年12月12日由在马拉西亚吉隆坡Puchong动物诊所和柔佛的两个其他诊所的注册兽医得到。

以0.68mg/ml的RetroMAD1（可以与表面活性剂，去氧胆酸钠联合，其中表面活性剂的浓度为约0.05wt%）0.1ml3x每日每1kg体重，来治疗有犬细小病毒2型（CPV2）的典型症状的五只幼犬。一只为来自10只一窝的6周大的金毛巡回猎犬幼犬，其中所有10只都有CPV2。该幼犬是一窝中唯一以RetroMAD1治疗的（可以与表面活性剂，去氧胆酸钠联合，其中表面活性剂的浓度为约0.05wt%）。全部其他9只幼犬死于CPV2而RetroMAD1治疗的幼犬存活。另一只是有严重CPV2并在打点滴的玩具贵宾犬。在以RetroMAD1治疗7天后，贵宾犬完全康复。三只半同胞的德国牧羊犬有严重的CPV2症状。在以相同的RetroMAD1方案治疗7天后所有三只幼犬完全康复。大多数另外的病例在2011年10月24日至2011年12月16日间马来西亚柔佛CPV2爆发期间测试。

尽管上面的结果是无对照的并不能以任何方式组成科学实验，其确实显示了RetroMAD1作为抗病毒药物在200μg/kg体重每日时的有效性。

所测试的分别为FIV、FeLV、FPV、猫杯状病毒、CPV、TVT、犬冠状病毒、犬瘟热病毒阳性的猫和狗已显示出显著的康复率。FIV、FeLV和CPV已经分别显示出有说服力的82%、73%和76%的症状康复率。被带到诊所的患病动物首先被筛查疾病。一旦确认，在征得主人同意后医生开始RetroMAD1治疗方案。这些病例中大多数已经被随访6-12个月并尚未反复到其之前的症状状态。然而，RetroMAD1显示对FIPV的零效果。无对照实验结果有三位兽医执业医师提供，即：

（i）Tan Thiam Khoon医生（实验从2010年7月22日-2011年10月1日）

Klinik Haiwan&Surgeri Wawasan

27，Jalan Wawasan2/22，47100Puchong，马来西亚.

电话：03-58826422

（ii）B.P.M.Mohanakrishnan医生（试验从2011年10月24日-12月3日）

Pet Clinic&Surgery

No45，Jalan Chengal，Taman Batu Pahat，

8300Batu Pahat，Johor，马来西亚

电话：07-4349699

（iii）V.C.Vasavan医生（试验从2011年8月5日-12月16日）

Jalan Hj.Abdul Aziz Awab，

Kluang Baru，

86000Kluang，Johor，马来西亚

电话：07-7745000

表8.结果总结

如上所示，来自马来西亚三位兽医执业医师的，对11例FIV，11例FeLV和34例CPV的无对照证据给出了当以RetroMAD1治疗时分别有81.8%，73%和76.47%的症状恢复率，按兽医的专业意见来说，基于他们数十年的兽医实践经验，这是超过非治疗病例的非常显著的改善。

实施例4

外周血单核细胞（PBMCs）的制备

通过密度梯度离心方法从收集在10ml乙二胺四乙酸（EDTA）覆盖管中的血液样品里分离PBMC。其被用RPMI-1640（HyClone）以1:3的比率稀释，铺于Lymphoprep（Axis-Shield）上并在2000rmp离心30分钟。离心期间，PBMC从血浆中移出并悬浮在密度梯度中。PBMCs被以RPMI-1640清洗两次并随后加入RPMI-1640培养基。通过台盼蓝排斥方法确定细胞存活率。用于本研究中的PBMC细胞密度为96孔组织培养板上1×10⁶细胞/孔。将非霍奇金淋巴瘤患者的PBMC与12种不同浓度的RetroMAD1孵育72小时时间。发现随着药物浓度范围从0.05μg/ml增加到3.13μg/ml细胞存活率降低。发现在6.25μg/ml到50μg/ml之间的药物浓度范围中细胞最能存活（表9）。

浓度(μg/ml)细胞计数细胞活力(%)

表9.以12种稀释的RetroMAD1同时处理及其各自的细胞存活率百分数。

体外病毒抑制测试

在一式三份96孔板孔中进行同时处理细胞的RetroMAD1的体外病毒抑制测试。12种稀释的RetroMAD1（储备物浓度100μg/ml）被用于同时处理正常的和被感染的PBMC，并将板孵育72小时。在72小时孵育时间之后，收集培养物。结果显示于图6和7中。显示RetroMAD1不影响从相同性别和相似年龄组的正常捐献者中分离的PBMC存活率（图7）。因此，这显示，由于其被报导的靶向超微结构被病毒感染或癌症或两者所改变细胞的能力，RetroMAD1能选择性导致异常PBMC下降。这是由于RetroMAD1的MAP30部分已经显示具有相比对正常PBMCs而言，对特定白血病细胞10倍以上的更有选择性的毒性（Lee-Huang，S等人，2000）。

实施例5

细胞培养

包括Vero（源自非洲绿猴的肾）、LLC-MK2（源自恒河猴的肾）和BHK21（源自仓鼠幼鼠的肾脏）细胞系在内的哺乳动物细胞系（来自马来西亚吉隆坡，Malaya大学医学系医学微生物部门），在添加有2%胎牛血清（FBS）和44.04mmol/L碳酸氢钠的1X浓缩DMEM培养基（HyClone）中，在存在5%CO₂的潮湿孵育器里中在37℃培养。普通人细胞系（来自马来西亚吉隆坡，Malaya大学医学系医学微生物部门）包括在添加有2%FBS和44.04mmol/L碳酸氢钠的1X浓缩DMEM培养基（HyClone）中培养的张氏肝细胞系（源自人肝），和分别在添加有2%FBS的DMEM/F-12培养基（Gibco）和哺乳动物上皮细胞培养基（MEGM）中培养的NL20（源自正常人肺）和184B5（源自人乳腺），且在添加有2%FBS的角质形成细胞无血清培养基（Gibco）中保持RWPE-1（源自人前列腺）。CCD-1127SK（源自人皮肤）在添加有2%FBS的鹰最低必须培养基（EMEM）上培养。这些细胞系在存在5%CO₂的潮湿孵育器里中被保持在37℃。C6/36（来自马来西亚吉隆坡，Malaya大学医学系医学微生物部门）在添加有10%FBS的1X浓缩Leibovitz’sL-15培养基（HyClone）中在28℃无CO₂培养。

RetroMAD1的细胞毒性

通过评价化合物对细胞形态、存活率和生长的效果来监测RetroMAD1的细胞毒性。存在或不存在RetroMAD1时以最优条件于96孔板上一式三份接种每孔1×10⁵个细胞，每天观察板的任何变化。

RetroMAD1的最大非毒性剂量（MNTD）

进行RetroMAD1的体外毒性分析以确定对所有本试验中所用细胞系的最大非毒性剂量（MNTD）。在加入到96孔板中预制的单层细胞之前，浓缩的RetroMAD1储备物被以各自的培养基（取决于施用的细胞系）稀释到6种浓度（200μg/ml，100μg/ml，50μg/ml，25μg/ml，12.5μg/ml和6.25μg/ml）。体外MNTD测定用的一系列适合对照被包括在每个板中，而板在被在最优条件下孵育。结果显示于图8中。

细胞存活率评估

在三个时间点：24小时48小时和96小时依照制造商的方案用AQ_ueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay（Promega，美国）来分析细胞培养物（Malich et al.，2004）。结果显示于图9中。

发现RetroMAD1在高于100μg/ml的浓度下对各种细胞系具有抑制效果。RetroMAD1的MNTD被测定为100μg/ml。

实施例6

口服给药证据

使用总数47只的、被通过PCR确定自然感染了肝胰腺细小病毒（HPV）的虾（小长臂虾）。在生物安全实验室中设两个水箱：第一个水箱用于对照目的而第二个用于以RetroMAD1治疗。治疗组被给予RetroMAD1（与表面活性剂，去氧胆酸钠联合，其中表面活性剂的浓度为约0.05wt%）100ng/g饲料，每日3次4天。RetroMAD1通过虾饲料被吸收并口服给予。

使用“盐析”方法来进行DNA提取。使用特异性引物进行PCR以检测HPV。使用的引物fHPV：5'-ACA-CTC-AGC-CTC-TAC-CTT-GT3'（SEQ ID NO：9）和rHPV：5'-GCA-TTA-CAA-GAG-CCA-AGC-AG-3'（SEQ ID NO：10）。阳性检测会产生有441bp大小的PCR产物。

琼脂糖凝胶电泳结果显示在对照水箱中（图10A），22/23的虾被感染了HPV而在治疗的水箱中（图10B），22/24为HPV阴性。这显示了口服施用的RetroMAD1似乎已经从测试动物中完全消除了HPV。

实施例7

口服给药的进一步证据

使用从获自商业孵化的SPF（无特定病原体）仔虾池塘养殖而来的、有8g±0.5g平均体重的白肢虾（南美白对虾）（White Leg Shrimp Penaeus vannamei）。在从池塘转入充氧容器后，这些动物首先在生物安全实验室水箱中适应14天时间。每箱由饲养于100L水箱中的20只虾组成。这些虾接收对应约3.5%体重的每日4餐。最后，通过饲喂约4%体重的，获自最近被白斑综合症病毒（WSSV）所杀死池塘的PCR阳性虾冻肉，来口服激发将其感染。感染24小时后，施用0.1mg/g RetroMAD1（与表面活性剂、去氧胆酸钠联合，其中表面活性剂的浓度为约0.05wt%）饲料，在饲喂前饲料被放置15分钟以吸收RetroMAD1。

在未治疗对照中，死亡在激发后第3日开始，而到第8日，几乎所有20只动物死亡。到激发后第9日，在对照水箱中观察到100%的死亡率，显示所用的WSSV感染尸体在口服感染后9日内非常能够引起100%的死亡率。结果表明RetroMAD1成功的保护了被激发的动物免于由WSSV引起的急性死亡（图11）。

实施例8

印迹控制区（ICR）小鼠中的急性毒性测试

从吉隆坡，Malaya大学医学系动物舍获得成年雄性和雌性ICR小鼠（6-8周龄）（Ethics No.PM07/05/2008MAA（a）（R））。小鼠体重在25-35g之间。给予动物标准的鼠饲料颗粒和自来水。使用急性毒性研究来确定RetroMAD1的安全剂量。36只小鼠（18只雄性和18只雌性）被分为3组，而每组被口服饲喂一次：（a）仅载体（生理盐水，5ml/kg）;（b）在生理盐水中制备的0.105mg/kg的RetroMAD1和在生理盐水中制备的1.05mg/kg的RetroMAD1。给予药剂前动物禁食过夜（禁食物，但不是水）。给予药剂后再禁止食物3到4小时。施用后在30min和2、4、8、24和48h观察动物的临床或毒性学症状发病。如果在2周时间中观察到任何死亡，也观察死亡率。动物在第14天被禁食并在第15天通过过量氯胺酮麻醉处死。按标准方法确定组织学，血液学和血清生化参数（Bergmeyer，1980;Tietz et aI.，1983）。结果示于表10中。

本研究由马来西亚，Malaya大学医学系动物实验伦理委员会批准。所有动物接受按照美国国家科学院编写和国家卫生研究所出版的“实验室动物护理和使用指南”中所列标准的人文关怀。

表10.获自对对照和测试的ICR小鼠身上所进行实验中测量的组织学，血液学和血清生化参数结果。

表9的结果显示在雄性，雌性之间以及在处理的（低和高剂量）与对照之间没有显著的差异。ICR小鼠肝脏和肾脏的组织学结果也显示在雄性，雌性之间以及在处理的（低和高剂量）与对照之间没有显著的差异。这些结果证实了RetroMAD1的施用可以被认为对ICR小鼠是非毒性的或者至少是最小毒性的，对ICR小鼠施用的药物是用于治疗猫和狗（表B）剂量的50x和500x，治疗猫和狗时三位独立的兽医执业医师观察到显著的症状恢复。

实施例9

灵长动物毒理学

使用15只体重1.5-1.7kg的，健康的雄性和雌性食蟹猴（12-18月龄）。猴被分组为每组5只：对照组（无RetroMAD1处理），低剂量组（0.2mg/kg体重）和高剂量组（2.4mg/kg体重）。本研究中设为低和高剂量的剂量实际上为从等效表面积剂量转换因子计算的鼠剂量的4x和48x。每组动物被施以纳入在其日常食物中的对应剂量水平的RetroMAD1并被每日两次给予，持续4周时间。

研究持续期间和施用药剂两个月后观察到所有动物是活跃的。所有血液参数在正常范围内。尽管在所有三组中血细胞比容，平均红细胞体积，血小板压积，单核细胞和某些嗜酸性粒细胞显示正常范围之外的值，但差异很小（容许值）（表11A和11B）。

而血液化学测试中唯一不在正常范围内的参数是球蛋白，但差异仅是极小的（容许值）。然而，最明显的区别在氯上。这预计是由于动物稳态中取血关于离子功能的效果（表12）。

将每组中的一只动物安乐死以进行病理组织学观察。病理组织学结果强烈表明了高剂量的RetroMAD1可能能引起对所检测特定器官的毒性效果。肺、肝、肠和肾在高剂量组显示显著病变的器官之中。在属于对照（未处理）和低剂量组的代表动物中发现的病变可以归因于其他起因。施用的低剂量和高剂量分别相当于正常剂量的4倍和48倍。因此，尽管50x和500x的单次剂量似乎在ICR小鼠中没有显示出任何明显的毒性，在猴中48x的多次剂量显示出器官中的显著病变，这表明人治疗用剂量应该在用于猫和狗的剂量的1-4x左右、该研究在由AAALAC认证的菲律宾Simian Conservation Breeding &Research Centre Inc.（SICONBREC）中进行。移交的解释由来自菲律宾Los Banos大学兽医学学院的兽医专家提供。

表11A.平均血液学数据-毒性

表11B.平均血液学数据-毒性

表12.平均血液化学数据-毒性

这些结果证明了RetroMAD1是安全的药物，其毒性剂量非常高。实施例10和11中使用的缩略词和参考值总结在下面的表13中提供。

表13.血液学实验中使用的示例。

实施例10

在灵长动物模型中使用RetroMAD1治疗

挑选10只体重1-1.7kg的，确认被猴轮状病毒A感染的患病猕猴来进行本实验。从其粪便样品中提取RNA来PCR测试轮状病毒。猴被分组为5头每组：对照组（无RetroMAD1治疗）和治疗组（0.2mg/kg体重）。RetroMAD1被纳入每份也包含20ml Cerelac的其每日食物，持续4周时间。对照组有发生在研究期第11日和第14日的3例死亡（60%死亡率）。观察到此批次中的动物为差到一般的状态。而治疗组是活跃的。所有被治疗的动物存活（0%死亡率）。该实验在菲律宾SICONBREC设施中进行。移交的解释由来自菲律宾Los Banos大学兽医学学院的兽医专家提供。

被影响的血液学参数为HGB、HCT、RDWc、PLT和PCT。PLT显示最具可比性的数据。对照未治疗的以及患病治疗的显示出相比所获值的正常范围明显更高的值。正常值的较高端为586.0（10³/μl），然而在对照组中末段取血的一份为596.0（10³/μl）而在治疗组中末段取血的一份为627.4（10³/μl）。专家提供的理由是这些参数的较高值是由于身体响应来对抗感染的防御机制（表14A和B）。

患病批猴的血液化学测试在对照组和治疗组中有变化的结果，这是猴对所做治疗自然反应的良好迹象。对照组中BUN、CREA和TP均低于从病理生理学相关的每个参数所获值的范围的最小值。有正常的白蛋白对球蛋白比例。如果一种蛋白变低，另一种蛋白会试图弥补以平衡血液的胶体渗透压。这作为对照和治疗组中白蛋白的低值而在对照和治疗组中球蛋白的较高值被看到。氯、K和Na离子同样被影响。如这些离子变化的结果中所见，取血加腹泻可以很大的影响液体电解质平衡。(表15)

表14A.平均血液学数据-患病

表14B.平均血液学数据-患病

表15.平均血液化学数据-患病

实施例11

致畸性研究

将30只怀孕第1日的Sprague Dawley（SD）成年雌性大鼠随机分为3组，每组口服饲喂（a）无菌蒸馏水（1ml/kg体重，0.2ml/200g的鼠）；（b）5mg/kg在生理盐水中制备的RetroMAD1和（c）10mg/kg在生理盐水中制备的RetroMAD1。对成年雌性大鼠从怀孕第1日到第20日进行上述方案并在分娩后继续21日。

在10mg药物/kg体重剂量从第1日到第20日处理怀孕大鼠，没有母体毒性或胚胎原性毒性迹象。没有外部的胎儿畸形，没有生长延迟，也没有胎儿死亡。给药低和高剂量药物（妊娠第1至20日）后雌亲（母鼠）的体重增加可与正常对照组相比。没有怀孕的大鼠早产。妊娠持续期不受RetroMAD1影响。

在药物处理组和正常对照组之间没有观察到雌亲-幼崽相互作用的差别。每只雌亲能哺乳，而每只幼崽能吮吸。在组间没有观察到关于后代开始长毛、爬、坐、或断奶时间的区别。由于在药物处理组和正常对照组中主动和被动哺乳以及幼崽梳毛的频率仍然相当，产前药物处理没有明显改变母体对幼崽的行为。药物处理雌亲中雌亲相关行为（自梳毛、进食和饮水、以及主动或被动游逛）的频率也与正常对照雌亲相当。筑巢活动的频率在药物处理的母鼠和正常对照母鼠中相似。

以药物处理的雌亲在分娩后正常继续进行并在第21日终止。整个妊娠期间药物处理的雌亲没有表现出任何异常类型的行为，其不能与正常对照雌亲物理区分开。正常对照和药物处理后代的总体外貌健康，而且没有注意到每窝产仔数和后代中的差别。没有发现对照和药物处理组妊娠期长度的差别，也没有观察到每窝产仔数和流产幼崽数的差别。

在幼崽中没有检测到外部畸形迹象。与正常对照组相比，药物处理组中没有幼崽死亡。从PND1到PND21药物处理组和对照组之间在幼崽平均体重上没有差别。在母体组之间每窝幼崽数量上没有差别。各组在流产数、活力指数和哺乳指数上并无差别。药物处理组和对照组之间在后代体重，身长或生长速率上没有明显差别（PND1到21），这表示正常的后天生长不受产前药物处理的影响。

身体发育指标没有显示药物处理的效果。所有组显示门齿萌发（出生后第9日）和睁眼（出生后第14日）。药物处理组的幼崽与其正常对照同类在耳廓分离时间上没有差别。到PND4，所有组中的所有幼崽其耳廓均分离。由药物处理母鼠所生的幼崽与正常对照幼崽在门齿萌发和睁眼时间上没有差别。药物处理组中幼崽的自主活动力与正常对照组的相当。

实施例12

生物利用度的证据

RetroMAD1的药代动力学数据从6-8周龄的雌性ICR小鼠中得出。小鼠（48）被施以每小鼠70μl的RetroMAD1单次剂量10日，该单次剂量为口服给予0.2mg/kg体重剂量的50X。每天从三只小鼠和一只对照的心脏中抽取血液样品。饲喂后第1日，在口服施用30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时和12小时后收集血液，而在下面的日子里（到第10日）仅在施用后30min收集血液。每个时间点由3只口服饲喂药物的小鼠和1只给予PBS的对照组成。使用自开发的ELISA来测定RetroMAD1的血浆浓度。

检测小鼠血清中RetroMAD1的ELISA：自开发的用抗人-IgG-HRP的捕获ELISA

为制备捕获抗体，以RetroMAD1每日饲喂猫（参考实施例4的1X猫剂量），在6个月后收集血液并提取血清。该血清被用作捕获抗体。在包被缓冲液（0.2M碳酸-碳酸氢钠，pH9.6）中1:80稀释的，100μl/孔的该多克隆猫抗-RetroMAD1抗体被吸附到96孔聚苯乙烯ELISA板上。以PBS1x中0.05%的Tween-20清洗板3次。100μl/孔的小鼠血清在PBS中0.05%BSA里1:2稀释并被加入孔中。37℃孵育1h后，同样地清洗板并加入100μl在PBS中0.05%BSA里1:2000稀释的，抗RetroMAD1阳性人血清。该抗体从马来西亚Malaya大学医学系医学微生物部门获得。37℃孵育1h后，清洗板并加入100μl/孔在PBS中0.05%BSA里1:6000稀释的，兔抗人IgGHRP结合物。黑暗中37℃孵育1h后，清洗板并向每个孔中加入100μl/孔OPD。室温下在黑暗中孵育板30min并以50μl/孔的4N H2SO4终止反应。在490nm和600nm测量光密度（OD）作为背景。随后所有OD读数被转换为Log值以获得以μg/ml计的浓度和图12中提供的标准曲线。测试的结果在表16以及图13A和B中提供。PK/PD数据显示早至饲喂后30min在血清中检测到约0.2μg/ml的RetroMAD1，其在4hrs时再次降到约0.2μg/ml之前，于1-2hrs时达到1-1.1μg/ml的最大值。到饲喂后12小时，水平与未饲喂对照几乎相同，这表示该蛋白已经被完全代谢。随后每日在饲喂后30min的取样显示约0.2μg/ml的水平。这些数据显示了药物的生物利用度。

表16.生物利用度测试结果

实施例13

热稳定性试验

通过将多个Eppendorf管中的RetroMAD1在传统冰箱里保持在4℃，在具有能保持窄温度范围的24小时空气调节的实验室中保持在27℃±1℃，保持在设置为37℃的传统培养温箱中和在设置在50℃的实验室烘箱中来测定不同温度下的蛋白稳定性。由于RetroMAD1是41.2kDa的蛋白，将其在SDS-PAGE凝胶上电泳并将储存在4℃样品的胶条带与保持在其他温度下的样品胶条带相比较会显示其稳定性。到第7日，无论高至50℃的温度，胶的强度仍然相同。到第30日，储存在4℃、27℃±1℃和37℃样品的强度类似。不幸的是，50℃的样品没能保存到第30日。基于图14中显示的结果。RetroMAD1能在高至50℃稳定一周而在37℃能稳定一个月。

实施例14

HPLC检测方法

通过使用HPLC以优化检测方法并确定RetroMAD1检测限度。

通过以miliQ水稀释3.5mg/ml的RetroMAD1储备溶液来制备范围从1μg/ml到500μg/ml的不同浓度药物。10μl的RetroMAD1被注入并在等度洗脱中被洗脱过柱，等度洗脱中在整个洗脱期间流动相的组成保持恒定。通过280nm处的UV吸收来检测RetroMAD1。从层析图分析数据。重复优化直至峰被解析出来。

层析参数的变化

调整层析参数以得到解析出的峰。调节的参数为流动相浓度和比率，UV吸收范围，运行时间和温度。通过使用Eclipse XDB-C₈柱（4.6×250mm）5um作为固定相，用含0.01MpH7.2的磷酸盐缓冲液和乙腈（50:50）的流动相，在1.0ml/min的流速和280nm处UV检测，在15分钟的运行时间来进行RetroMAD1的层析检测。

如图15中所示的层析图是使用HPLC检测RetroMAD1的结果。在1.2分钟的第一个峰是在未连接的化合物被首先洗脱时出现的；在1.4分钟的第二个峰是UV引起的背景。在6.8分钟的峰是RetroMAD1被检测时出现的。目前优化的HPLC检测条件是通过使用EclipseXDB-C₈柱（4.6×250mm）5um作为固定相，以A：0.01M磷酸盐缓冲液（50%）和B：乙腈（50%）在15分钟内等度洗脱，柱温度为30℃，流速1.0mL/min；280nmUV检测。而目前的RetroMAD1检测限度为50μg/ml。

实施例15

A-B和B-C组合的抗病毒活性。

发现RetroMAD1显示显著的抗病毒活性之后，决定测试以A-B；B-A以及B-C；C-B配合的合成多肽的抗病毒活性。按与早先制备RetroMAD1时所做相同的方式将多肽A（Retrocyclin101）与多肽B（苦瓜抗HIV蛋白30）融合。随后按与之前用RetroMAD1时所做相同的方式将多肽B与多肽C（皮抑菌肽1）融合，并比较后处理抗HSV-2活性。为确定N和C末端连接的效果，A-B也被表达为B-A且B-C也被表达为C-B。在包涵体中表达的这些蛋白的证据可在图16中找到。

在所有病例中观察到剂量依赖的病毒减少。仅A-B融合蛋白给出了可以与用RetroMAD1（A-B-C）对HSV-2后处理的早先测试相比的结果。也显示了A-B优于B-A，表明N或C末端连接有区别。结果显示于表17和图17中。

明显在150μg/ml，A-B一直给出非常高的抗病毒活性，甚至在72h也没有减弱，而对B-A，抗病毒活性以线性方式随时间下降。对B-C也注意到类似的趋势，而对C-B，在最高剂量下在72h的抗病毒活性可忽略不计。

当仅多肽A（Retrocyclin101）和B（MAP30）被用于HSV2的抗病毒测试时，后处理结果显示A在B的N或C末端的位置在肽的抗病毒活性上差别明显。

表17.包涵体中的药物，仅后处理

实施例16

多肽A、B和C其他组合的试验

决定测试另外4种融合蛋白组合以研究在RetroMAD1后开发第二种潜在先导药物的难易。这些是：

AVBD103-MAP30-MYTILlNC10C（Amatilin）

RETEROCYCLIN-GAP31-皮抑菌肽1（RetroGAD1）

HKABF-PAP1-V1（Kudapan）

CAD-TAP29-DAP30-LATARCIN2A（Catadarcin）

Amatilin由作为多肽A的禽β防御素103（AVBD103），来自企鹅的一种非-θ-防御素，作为多肽B的如RetroMAD1中使用的MAP30，作为多肽C的厚壳贻贝抗菌肽C10C，来自贝类的一种阳离子抗微生物肽组成。

除了由GAP31替代MAP30作为多肽B以外，RetroGAD1与RetroMAD1类似。

Kudapan由作为CAP的多肽A，Hippocampus Kuda抗菌因子HKABF，作为多肽B的美洲商陆抗病毒蛋白1，RIP以及作为多肽C的仅已知为V2的从头合成序列（V2在‘De Novodesign of potent antimicrobial peptides’-Antimicrobial Agents andChemotherapy(2004)pg3349-3357中展示）组成。

Catadarcin由作为多肽A1和A2的2个CAP异源重复组成，其中CAD为Cercropin A和Cercropin D串联序列。多肽B由与整个DAP30RIP序列融合的TAP29RIP活性核心片段组成，而Latarcin2A是蜘蛛抗微生物肽Latarcin的同源串联重复。

细胞和病毒

Vero细胞（非洲绿猴肾细胞系）从Rockville，MD的美国模式培养物收集中心获得。其被用作HSV-2的宿主细胞。使用添加有10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良鹰（Eagle）培养基（DMEM）来培养细胞。

通过将含2%FBS的维持培养基中的病毒接种于75cm²组织培养瓶中的单层Vero细胞上，并允许细胞在37℃继续增殖4天直至确认了细胞病变效应（CPE）来获得单纯疱疹病毒2（HSV-2）储备物。随后通过轻柔移液来收获细胞和上清。通过1500rpm离心10分钟来去除细胞碎片。病毒上清被等分到1.5mL管中并储存在-80℃下直至进一步使用。

通过噬菌斑测试的病毒滴定

通过使用Vero细胞的噬菌斑测试来滴定HSV-2毒力。简单的说，Vero细胞被接种在24孔板上（2×10⁵细胞/孔）500μl有2%FBS的DMEN中，并向孔中加入100μl有1%FBS的DMEN中的病毒上清系列稀释。进一步孵育接种的细胞4h以允许细胞增殖和病毒吸收。随后加入琼脂覆盖层的混合物并将板在37℃孵育4天或直至形成噬菌斑。去除琼脂填充并以6%冰醋酸中的0.1%萘黑溶液染色后目视观察噬菌斑。病毒滴度表示为每毫升的噬菌斑形成单位（PFU）。

细胞毒性测试

在筛选多肽的抗病毒特性之前，所有八种多肽（Amatilin、Catadarcin、Kudapan、RetroGA01）被进行细胞毒性测试以找出可以对Vero细胞无毒的最大浓度。使用基于MTS的细胞滴定96非放射性细胞增殖测试（Non-Radioactive Cell Proliferation Assay）来定量肽的细胞毒性活性，其由新的四唑盐化合物3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺酰基)-2H-四唑盐、内盐、MTS和电子耦合试剂（吩嗪硫酸甲酯;PMS）组成（Promega，Madison，WI）。依照制造商（Promega）提供的说明进行MTS生长测试。每个试验之前，来自多个瓶中的细胞被以磷酸盐缓冲液（PBS）（1X）充分清洗，通过在37℃以胰蛋白酶-EDTA溶液（1X）处理并在培养基中重悬浮来收获。细胞随后被计数并被以1×10⁴细胞/孔的浓度接种在96孔平底板的孔中。在37℃、湿润的CO₂气氛（5%CO₂）中孵育24小时后，细胞被暴露于递增浓度的肽中。在培养基中制备100μg/ml起的肽系列稀释并将其加入培养物。每种稀释总是一式三份的测试而在所进行的每个实验中，包括了3个对照孔。对照孔含细胞与培养基而没有提取物，而阴性对照孔仅含培养基与不同浓度的提取物而没有细胞（为减去由于培养基中药物的背景值）。在24、48和72小时孵育后，使用MTS测试确定不产生毒性效果的提取物最大浓度，其被认定为最大非毒性浓度（MNTD）。在每个时间点末尾，加入MTS溶液并进一步孵育1h。使用96孔微量板读取器（GLOMAX，Promega）在490nm测定吸收。吸收与培养物中活细胞数量成正比。使用每个样品的至少3次重复以确定抗增殖活性。结果被计为平均值±标准差（S.D.）

细胞存活率的百分数

=[测试组的平均OD-阴性对照组的平均值]/[对照组的平均OD-阴性对照组的平均值]×100%

从剂量-反应曲线来计算MNTD。既不改变形态也不改变细胞存活率的MNTD被认定为MNTD。

抗病毒生物测试

前处理测试：Vero细胞被以每孔1×10⁵细胞的浓度接种于24孔培养板上并孵育24h。在病毒接种前，最大非毒剂量的肽被加入到细胞中并孵育24h。以肽孵育24h后，在0.1MOI的单纯疱疹病毒-2（HSV-2）被接种到Vero细胞上1h，同时偶尔摇动。病毒被去除而且细胞被替换上新鲜的DMEM。培养物在37℃、5%的CO₂气氛中被孵育24、48和72h。

同时处理测试：Vero细胞被以每孔1×10⁵细胞的浓度接种于24孔培养板上并孵育24h。将肽与病毒混合并在37℃孵育1h。随后混合物被接种到24孔培养板中的Vero细胞上1h，同时偶尔摇动。去除溶液并以DMEM替换培养基。培养物在37℃、5%的CO₂气氛中被孵育24、48和72h。

后处理测试：Vero细胞被以每孔1×10⁵细胞的浓度接种于24孔培养板上并孵育24h。在0.1MOI的HSV-2被接种到24孔培养板中的Vero细胞上1h，同时偶尔摇动。去除培养基并以含肽的DMEM替换。培养物在37℃、5%的CO₂气氛中被孵育24、48和72h。

在所有抗病毒测试中时间段的末尾，板被冷冻在-80℃下。在两次冷冻和解冻的循环后收集上清和贴壁细胞。通过提取试剂盒（Bioneer，韩国）提取病毒DNA。洗脱的DNA随后被用于RT-PCR中。

实时定量PCR

为显示以肽处理后，被感染的Vero细胞中病毒RNA存在与否，进行实时PCR。使用iQSYBR Green Supermix（Bio-Rad，美国），利用HSV-2组特异性引物来进行RT-PCR。在优化每个引物对之后，在10μl反应混合物中测试样品，10μl反应混合物含2.5μl样品DNA，每种引物0.125μl、5.0μl SYBR Green mix和2.25μl水。PCR扩增如下进行：在95℃下15min的初始变性步骤，随后35个循环的交变变性（95℃下30sec）、引物退火（60℃下30sec）和引物延伸（72℃下30sec）。还包括72℃下5min的最终延伸步骤。

所测试肽对Vero细胞的细胞毒性

检测了所有四种肽对Vero细胞生长的效果以排除任何直接的细胞毒性。将Vero单层细胞培养物暴露于递增浓度的Amatilin，Catadarcin，Kudapan和RetroGAD1中，在24，48和72h孵育后，使用MTS测试确定细胞存活率。如表1中所示的结果表明四种肽对Vero细胞的可接受最大非毒性浓度为小于30μg/ml。在所选的MNTD，相对未处理的对照组，肽不损害细胞存活率。

表18.肽对Vero细胞的最大非毒性剂量。

肽抗HSV-2的抗病毒活性

通过前、同时、和后处理来评价所有四种肽的抗病毒活性。进行这三种不同模式的处理以确定肽显示抑制活性的阶段。进行前和同时处理测试以测试肽防止HSV-2贴附到宿主细胞上的能力。同时处理也用于检测肽可能的杀病毒效果。另一方面，进行后处理测试以评价肽是否可能作为翻译抑制剂来抑制宿主细胞内HSV-2的复制（Barakat等人，2010;Kwon等人，2010）。

获得的结果表明在四种肽中，Amatilin对HSV-2有最强的抑制活性，在后处理中以30μg/ml的最大非毒性剂量（MNTD）在24、48和72h后分别得到了94.35％、92.92％和96.33％的抑制（表19）。该结果以噬菌斑减少测试确认，其中其在后处理中在48和72h分别显示90.00％和98.57％的减少（图18）。然而，在同时处理中，Amatilin仅显示43.47％、57.14％和44.97％的抑制。在前处理中，Amatilin仅在24h引起抑制。这些观察表明Amatilin可能影响进入后的病毒复制，而对病毒吸附到宿主细胞无干扰。同时处理中的轻度抑制效果表明Amatilin可能有中等的直接杀病毒效果。所述肽、Catadarcin、Kudapan和RetroGAD1在后处理中在24、48和72h显示出中等的抑制活性。

后处理期间显示的抑制活性表明了肽可能有的抑制病毒复制的能力，而同时处理期间的抑制活性显示了其直接杀病毒效果。肽在前处理中不显示活性或显示弱的抑制效果，表明其不能阻断病毒吸附到细胞上。结果的总结在图19中显示。

四分之一的“命中率”在抗病毒药物发现中可以被认为是非常好的成功率，所以其显示了通过剪切和粘贴其他序列，从该类RIP-CAP融合蛋白制造更多的抗病毒药物会相对简单

表19.PCR测定的前、同时和后处理中由Amatilin、Catadarcin、Kudapan和RetroGAD1引起的病毒减少百分数。

总之，抗HSV-2测试结果显示了在4个实验序列中，一种，即Amatilin在后处理中给出了非常显著的，可与RetroMAD1的相比的病毒减少结果。由于四分之一的“命中率”在药物发现中特别是对抗病毒药物来说被认为是非常高的，这意味着开发更多的该提出类型的药物相对简单。当测试4种包含其他基因的其他组合时，特别的一种，Amatilin给出了可与RetroMAD1相比的结果，但这仅是在后治疗中。该组合包括了作为多肽A的禽β防御素，与RetroMAD1中相同的RIP（多肽B）和作为多肽C的贝类抗微生物肽。随后进行了Amatilin的噬菌斑减少测试，以用目视方式复查所获同时和后处理效果的RT-PCR结果，而这些数据强烈支持了RT-PCR数据。

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Claims (15)

1.一种融合蛋白，其包含至少一种1型核糖体失活蛋白(RIP)，多肽B；以及

(i)至少一种能抑制病毒进入的多肽A；和

(ii)至少一种阳离子抗微生物肽(CAP)，多肽C，

其中，所述融合蛋白是重组的，且在所述多肽A、B和C每个之间包括至少一个连接肽，

其中，所述的融合蛋白由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其适合口服施用。

3.一种分离的核酸分子，其能够表达根据权利要求1所述的融合蛋白。

4.一种质粒或载体，其包含根据权利要求3所述的核酸分子。

5.一种宿主细胞，其包含根据权利要求3所述的核酸分子和/或根据权利要求4所述的质粒或载体。

6.一种生产根据权利要求1所述的融合蛋白的方法，包括在表达融合蛋白的条件下培养根据权利要求5所述的宿主细胞。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，在表达之后，多肽A被再折叠。

8.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的融合蛋白。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述组合物适合口服施用。

10.根据权利要求8或权利要求9所述的药物组合物，其进一步包括至少一种药学可接受载体。

11.用于在制备用于在脊椎动物或无脊椎动物中治疗和/或防止病毒感染的药物中的用途的根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中，所述病毒感染由选自单纯疱疹病毒1型(HSV-1)和2型(HSV-2)，登革病毒1型(DENV-1)、2型(DENV-2)、3型(DENV-3)和4型(DENV-4)，猫免疫缺陷病毒(FIV)，FeLV，FPV，杯状病毒，犬细小病毒2型(CPV2)，TVT，犬冠状病毒，肝胰腺细小病毒(HPV)，白斑综合症病毒(WSSV)以及猴轮状病毒A的病毒引起。

12.用于在制备用于在脊椎动物或无脊椎动物中治疗和/或防止病毒感染的药物中的用途的根据权利要求8到10任一项所述的药物组合物，其中，所述病毒感染由选自单纯疱疹病毒1型(HSV-1)和2型(HSV-2)，登革病毒1型(DENV-1)、2型(DENV-2)、3型(DENV-3)和4型(DENV-4)，猫免疫缺陷病毒(FIV)，FeLV，FPV，杯状病毒，犬细小病毒2型(CPV2)，TVT，犬冠状病毒，肝胰腺细小病毒(HPV)，白斑综合症病毒(WSSV)以及猴轮状病毒A的病毒引起。

13.根据权利要求1或2所述的融合蛋白在制备用于在脊椎动物或无脊椎动物中治疗和/或防止病毒感染的药物中的用途，其中，所述病毒感染由选自单纯疱疹病毒1型(HSV-1)和2型(HSV-2)，登革病毒1型(DENV-1)、2型(DENV-2)、3型(DENV-3)和4型(DENV-4)，猫免疫缺陷病毒(FIV)，FeLV，FPV，杯状病毒，犬细小病毒2型(CPV2)，TVT，犬冠状病毒，肝胰腺细小病毒(HPV)，白斑综合症病毒(WSSV)以及猴轮状病毒A的病毒引起。

14.根据权利要求8到10任一项所述的药物组合物在制备用于在脊椎动物或无脊椎动物中治疗和/或防止病毒感染的药物中的用途，其中，所述病毒感染由选自单纯疱疹病毒1型(HSV-1)和2型(HSV-2)，登革病毒1型(DENV-1)、2型(DENV-2)、3型(DENV-3)和4型(DENV-4)，猫免疫缺陷病毒(FIV)，FeLV，FPV，杯状病毒，犬细小病毒2型(CPV2)，TVT，犬冠状病毒，肝胰腺细小病毒(HPV)，白斑综合症病毒(WSSV)以及猴轮状病毒A的病毒引起。

15.根据权利要求13或14所述的用途，其中所述脊椎动物为哺乳动物、鱼类或鸟类，所述无脊椎动物是甲壳动物。