CN107849551A - 新型胰蛋白酶同功异型物和其用途 - Google Patents

新型胰蛋白酶同功异型物和其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及新型胰蛋白酶ZT同功异型物。具体地说，本发明涉及胰蛋白酶ZT同功异型物在医疗装置、药品以及化妆品中的用途。

Description

新型胰蛋白酶同功异型物和其用途
技术领域
本发明涉及新型胰蛋白酶ZT同功异型物。具体地说，本发明涉及胰蛋白酶ZT同功异型物在医疗装置、药品以及化妆品中的用途。
背景技术
蛋白酶是由其裂解蛋白质的能力定义的酶。蛋白酶可在蛋白质序列内的不同氨基残基处裂解受质，显示衬底特异性的差异。胰蛋白酶是蛋白酶并且部分由其使C端裂解成精氨酸或赖氨酸残基的优先级指定(Olsen，Ong等人，2004，《分子细胞蛋白质组研究(MolCell Proteomics)》3：608-614)。多元受质分析方法揭露蛋白酶的裂解位点并且公开其裂解位点周围的残基对其特异性的至关重要性(O′Donoghue，Eroy-Reveles等人，2012，《自然方法(Nat Methods)》9：1095-1100)。
美国专利案第4,801,451号和第4,963,491号公开从南极磷虾(Antarctic krill)分离的肽链外切酶和肽链内切酶的混合物(南极虾(Euphasia superba))和这种混合物作为清洁溶液的用途。4,801,451公开这类酶类从伤口去除异物和坏死组织的用途。WO 85/04809公开磷虾酶作为消化促进剂的用途。EP-A1-0170115公开磷虾酶溶解血块的用途。然而，所有这些参考文献公开不纯或未充分表征的材料。需要纯肽酶或纯肽酶的混合物以提供医药学适用产品。
WO 96/24371公开磷虾衍生的多功能蛋白水解酶以及甲壳纲动物和鱼类衍生的与来源于南极磷虾的多功能酶具有结构类似性的蛋白水解酶家族的用途。所述文献还涉及纯化多功能酶的方法以及多功能酶的医药学、化妆品和其它用途。所述文献中将与来源于南极磷虾的多功能酶的结构类似性定义为与磷虾衍生的多功能水解酶具有至少70％同源性。
WO 2000078332公开鳕鱼衍生胰蛋白酶和糜蛋白酶在医药组合物或药剂中的用途以及这类酶类的化妆品用途，所述医药组合物或药剂用于局部和体表应用以治疗内部疾病和病症。发现在酶无需穿过开放性伤口或粘液组织的情况下，用于治疗局部、内部病症的体表使用是有效的。WO 2000078332中公开的丝氨酸蛋白酶是与来源于大西洋鳕鱼(Atlanticcod)的胰蛋白酶I、胰蛋白酶II、胰蛋白酶III、胰蛋白酶IV具有至少90％氨基酸序列同源性的蛋白酶，和满足以下条件的蛋白酶：与从大西洋鳕鱼分离的胰凝乳蛋白酶A和胰凝乳蛋白酶B中的任一种具有至少90％氨基酸序列同源性的胰凝乳蛋白酶。
编码胰蛋白酶Y的互补DNA(cDNA)是从大西洋鳕鱼cDNA文库分离(Spilliaert和Gudmundsdottir，1999，《海洋与淡水生物学(Mar Biotechnol)》(NY)1：598-607)。鳕鱼胰蛋白酶Y与两种大西洋鳕鱼胰蛋白酶I和X具有约45％一致性(WO 2000078332)。先前已经简单地描述原生胰蛋白酶Y和胰蛋白酶Y的重组形式(Palsdottir和Gudmundsdottir，2007，《蛋白表达与纯化(Protein Expr Purif)》51∶243-252，Palsdottir和Gudmundsdottir，2008，《食品化学(Food Chemistry)》111：408-414)。
发明内容
本发明提供新型胰蛋白酶同功异型物，称为胰蛋白酶ZT同功异型物。这类同功异型物可从鱼获得，如大西洋鳕鱼，或可使用蛋白质表达系统以重组形式获得。本发明进一步提供组合物，其包含至少一种根据本发明的经分离的鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物以及适合的赋形剂和载剂。
本发明人意外发现，新型胰蛋白酶ZT同功异型物与先前已知的胰蛋白酶相比有利且独特的特征。这些特征提供在医疗装置、药品和化妆品的各种应用中使用胰蛋白酶ZT同功异型物的优势。本发明提供所述胰蛋白酶ZT同功异型物本身以及用于治疗或预防由病原性生物体引起的疾病。这与用于治疗或预防由病原性微生物引起的上呼吸道疾病尤其相关。出于所述目的，胰蛋白酶ZT同功异型物可例如用于医疗装置中，或用作药物中的活性成分。又，本发明提供所述胰蛋白酶ZT同功异型物用于治疗由烧伤引起的伤口感染和伤口、用于从其它健康皮肤去除坏死或剥落皮肤(例如在医学装置中)、用作药物或用作化妆品。本发明进一步提供制备本发明的鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物的方法。
·基于多元受质分布，与胰蛋白酶I相比，胰蛋白酶ZT同功异型物偏好在Arg残基处裂解。与胰蛋白酶ZT同功异型物相比，胰蛋白酶I偏好在Lys残基处裂解。
·多元受质分布显示裂解位点周围的受质中的不同氨基酸残基对裂解具有较大影响(N端侧面上的约四个氨基酸残基和C端侧面上的约四个氨基酸残基)。与胰蛋白酶I相比，胰蛋白酶ZT同功异型物偏好裂解位点周围的某些氨基酸残基。
·常常在与感染相关联的病毒、细菌以及寄生虫序列中发现富含精氨酸和赖氨酸的氨基酸序列。
·基于标准分数(Z分数)比率的数值(多元受质分布数据)显示与胰蛋白酶I相比，胰蛋白酶ZT同功异型物显著更好地适于裂解含有若干连续碱性氨基酸残基(Arg和Lys)的肽。基于数据，胰蛋白酶ZT同功异型物可充当针对病毒和细菌的抗微生物剂，因为其可在丛集碱性氨基酸残基(如赖氨酸和精氨酸)处裂解。
具体实施方式
本发明提供新型胰蛋白酶同功异型物，称为胰蛋白酶ZT同功异型物。这类同功异型物可从鱼(如大西洋鳕鱼)获得，或可使用蛋白质表达系统以重组形式获得。本发明涉及使用这类胰蛋白酶ZT同功异型物治疗和预防疾病以及用于化妆品领域。具体地说，本发明涉及新型大西洋鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物，其适用作药品、医疗装置和化妆品。
附图简要说明
图1显示用阴离子交换色谱进行的胰蛋白酶ZT同功异型物的分离。相对于洗提体积，来自用苯甲脒纯化的鳕鱼胰蛋白酶同功异型物的MonoQ分离的色谱图显示在280nm下的吸光度。将鳕鱼胰蛋白酶同功异型物装载到MonoQ管柱上并且用盐梯度(点线)洗提蛋白质。箭头显示含有胰蛋白酶ZT同功异型物的峰。管柱用缓冲液(20mM Tris、10mM CaCl2，pH8.0)平衡，并且酶在1mL/min的流动速率下，以40倍管柱体积用线性0-150mM NaCl梯度、以6倍管柱体积用线性150-620mM NaCl、以10倍管柱体积用620-850mM NaCl洗提。
图2显示鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物的SDS-PAGE。来自图1的阴离子交换色谱峰标记的胰蛋白酶ZT的SDS-PAGE分析。胰蛋白酶1、胰蛋白酶5以及胰蛋白酶7是经纯化和分离的鳕鱼胰蛋白酶X同功异型物。鳕鱼胰蛋白酶X与鳕鱼胰蛋白酶I紧密相关，相差约八个氨基酸残基。通过SDS-PAGE解析蛋白质并且用凝胶银染色。左侧的条柱和数字显示凝胶上分离的标准蛋白质(道尔顿标记(Dalton Mark)Vll-L)的迁移和分子量(kDa)。
图3显示鳕鱼胰蛋白酶X(胰蛋白酶1、胰蛋白酶5以及胰蛋白酶7)和胰蛋白酶ZT同功异型物的西方印迹分析。鳕鱼胰蛋白酶X和胰蛋白酶ZT同功异型物经历SDS-PAGE。在转移之后，样品用胰蛋白酶l/X(上图)和胰蛋白酶ZT同功异型物(下图)反应抗体进行免疫印迹。这证实使用阴离子交换分离胰蛋白酶ZT同功异型物与胰蛋白酶l/X。如图3中可见，针对胰蛋白酶ZT同功异型物反应的多克隆抗体不与胰蛋白酶l/X交叉反应并且针对胰蛋白酶l/X升高的肽抗体不与胰蛋白酶ZT同功异型物交叉反应。
图4显示文氏图(Venn diagram)，其说明在多元受质分布分析中，三个不同时间点时由胰蛋白酶ZT和胰蛋白酶I产生的共有和独特裂解。在培育5分钟之后，由胰蛋白酶ZT(左侧白色)和胰蛋白酶I(右侧白色)进行的共有(黑色)和独特裂解位点的数目。(A)，15分钟。(B)和60分钟(C)。图显示在所有时间点，在文库内124个既定肽(各自含有14个氨基酸残基)中存在胰蛋白酶ZT和胰蛋白酶I的共有裂解位点和独特裂解位点。数据表明胰蛋白酶ZT的受质特异性与胰蛋白酶I不同。
图5显示针对肠病毒的胰蛋白酶ZT的抗病毒活性(柯萨奇病毒(Coxsackievirus)B2)。
Y轴显示与对照物相比，受感染的孔的百分比，并且X轴显示对照物(左侧条柱)和用胰蛋白酶ZT同功异型物进行的治疗(右侧条柱)。
本发明人发现新型胰蛋白酶同功异型物，称为胰蛋白酶ZT同功异型物。
胰蛋白酶ZT至少包括以下同功异型物：大西洋鳕鱼胰蛋白酶ZT-1同功异型物、大西洋鳕鱼胰蛋白酶ZT-2同功异型物、大西洋鳕鱼胰蛋白酶ZT-3同功异型物以及大西洋鳕鱼胰蛋白酶ZT-4同功异型物。所有四种大西洋鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物具有约25kDa的类似分子量。本发明的大西洋鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物是由以下氨基酸序列表示：
SEQ ID NO：1
IX1GGX2X3CEPX4SRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHEX5YDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVEX6VX7CX8AX9YPGMISPRMX10CX11GX12MDGGRDX13CNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGX14GCAX15PNX16PGVYVKVYEX1 7LSWIQTTLDANP
其中
X1选自I和V；
X2选自Q和H；
X3选自D和E；
X4选自R和N；
X5是L；
X6选自T和P；
X7选自D和A；
X8选自E和Q；
X9选自A和S；
X10选自V和M；
X11选自A和V；
X12选自Y和F；
X13选自A和V；
X14选自Q和R；
X15选自L和E；
X16选自Y和S；并且
X17选自Y和F。
SEQ ID NO：2大西洋鳕鱼胰蛋白酶ZT-1同功异型物
IVGGHECEPNSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVEPVACQASYPGMISPRMMCVGFMDGGRDVCNGDS GSPLVCEGVLTGLVSWGRGC AEPNSPGVYVKVYEFLSWIQTTLDANP
SEQ ID NO：3大西洋鳕鱼胰蛋白酶ZT-2同功异型物
IVGGHECEPNSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVETVDCEAAYPGMISPRMVCAGYMDGGRDACNGDS GSPLVCEGVLTGLVSWGQGC ALPNYPGVYVKVYEYLSWIQTTLDANP
SEQ ID NO：4大西洋鳕鱼胰蛋白酶ZT-3同功异型物
IIGGQDCEPRSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVEPVACQASYPGMISPRMMCVGFMDGGRDVCNGDS GSPLVCEGVLTGLVSWGRGCAEPNSPGVYV KVYEFLSWIQTTLDANP
SEQ ID NO：5大西洋鳕鱼胰蛋白酶ZT-4同功异型物
IIGGQDCEPRSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVETVDCEAAYPGMISPRMVCAGYMDGGRDACNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGQGC ALPNYPGVYVKVYEYLSWIQTTLDANP
本发明的胰蛋白酶ZT同功异型物与WO 2000078332中所公开的胰蛋白酶具有小于50％的氨基酸同源性，并且与WO 2000078332中所公开的糜蛋白酶具有小于45％的同源性。
以上胰蛋白酶ZT同功异型物表示这些胰蛋白酶的活性变异体，即当胰蛋白酶的N端裂解时已经活化的变异体。这些胰蛋白酶是幽门垂(鱼中的胰腺组织)中表达的蛋白质，其中N端上的许多氨基酸对于细胞分泌和保持酶失活是重要的。本文还公开全长胰蛋白酶ZT同功异型物，如
SEQ ID NO：19未裂解的大西洋鳕鱼胰蛋白酶ZT-1同功异型物
MIGLALLMLLGAAAAAVPRDVGKIVGGHECEPNSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVEPVACQASYPGMISPRMMCVGFMDGGRDVCNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGRGCAEPNSPGVYVKVYEFLSWIQTTLDANP
SEQ ID NO：20未裂解的大西洋鳕鱼胰蛋白酶ZT-2同功异型物
MIGLALLMLLGAAAAAVPRDVGKIVGGHECEPNSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVETVDCEAAYPGMISPRMVCAGYMDGGRDACNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGQGCALPNYPGVYVKVYEYLSWIQTTLDANP
SEQ ID NO：21未裂解的大西洋鳕鱼胰蛋白酶ZT-3同功异型物
MIGLALLMLLGAAAAVPREDGRIIGGQDCEPRSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVEPVACQASYPGMISPRMMCVGFMDGGRDVCNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGRGCAEPNSPGVYVKVYEFLSWIQTTLDANP
SEQ ID NO：22未裂解的大西洋鳕鱼胰蛋白酶ZT-4同功异型物
MIGLALLMLLGAAAAVPREDGRIIGGQDCEPRSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVETVDCEAAYPGMISPRMVCAGYMDGGRDACNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGQGCALPNYPGVYVKVYEYLSWIQTTLDANP
使用多元受质分布分析酶(蛋白酶)的受质特异性(O′Donoghue，Eroy-Reveles等人，2012，《自然方法(NatMethods)》9：1095-1100)。蛋白酶可在肽序列内的不同氨基残基处裂解受质，表明受质特异性的差异。胰蛋白酶是由其在使C端裂解成精氨酸或赖氨酸残基时的偏好指定。意外的是，胰蛋白酶ZT同功异型物上的多元受质分布表明与胰蛋白酶I相比，受质中精氨酸或赖氨酸周围的氨基酸对其裂解具有不同作用。简单地说，将胰蛋白酶ZT同功异型物或胰蛋白酶I与具有广泛生理化学多样性的肽文库(124个既定肽，14聚体序列，总共1612个肽键)一起培育(5、15和60分钟)(O′Donoghue，Eroy-Reveles等人，2012，《自然方法》9∶1095-1100)。在培育之后，通过质谱分析鉴别裂解位点。结果呈现于以下实例中并且证实与胰蛋白酶I相比，存在大量胰蛋白酶ZT独有的裂解位点。并且，鉴别显示与胰蛋白酶I相比，优先由胰蛋白酶ZT同功异型物裂解的裂解位点。此外，与WO 2000078332中所公开的胰蛋白酶I相比，新型胰蛋白酶ZT同功异型物具有不同受质特异性。这些发现是意外的。基于来自多元受质分布分析的结果，产生含有基于受质中P4-P4′位置处的标准分数(Z分数)比率的数值的表，其中比较胰蛋白酶ZT与胰蛋白酶I的受质特异性。正值(Z分数)反映与胰蛋白酶I相比，某一P位置中氨基酸残基的偏好有利于胰蛋白酶ZT同功异型物。
胰蛋白酶ZT同功异型物具有特定抗微生物特性。基于实例中产生和呈现的值，可发现与胰蛋白酶I相比，胰蛋白酶ZT同功异型物显著更适于裂解含有若干连续带正电残基(精氨酸或赖氨酸)的肽。常常在病毒蛋白质中发现这些类型的序列(富含赖氨酸和精氨酸的氨基酸序列)(Suzuki，Orba等人，2010，《公共科学图书馆·病原体(PLoS Pathog)》6：e1000801，Jiang，Cun等人，2012，《病毒学杂志(J Virol)》86：7256-7267，Gallaher和Garry，2015，《病毒(Viruses)》7：285-305)。
病毒孔蛋白是与修饰渗透性的质膜相互作用的蛋白质群体并且可促进病毒粒子的释放。聚集的赖氨酸和/或精氨酸残基对病毒孔蛋白的活性是重要的。基于多元受质分布分析，胰蛋白酶ZT同功异型物可充当针对RNA病毒的抗病毒剂，因为其可裂解这些聚集的碱性氨基酸残基。已描述病毒孔蛋白存在于许多病毒科中，包括黄病毒科(Flaviviridae)、小RNA病毒科(Picornaviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)以及副黏病毒科(Paramyxoviridae)(Royle，Dobson等人，2015，《病毒》7：5375-5387)。研究表明病毒孔蛋白中的碱性残基，赖氨酸或精氨酸，对其功能来说是重要必须品。已在RNA病毒中发现大部分病毒孔蛋白。含有富含赖氨酸和精氨酸的病毒孔蛋白的病毒将成为胰蛋白酶ZT同功异型物的目标，所述病毒包括人类免疫缺陷病毒(HIV)、轮状病毒、埃博拉病毒(Ebola)、莱斯顿病毒(Reston virus；RESTV)、罗氏病毒(Lloviu virus；LLOV)、苏丹病毒(Sudan virus；SUDV)、本迪布焦病毒(Bundibugyo；BDBV)、泰伊森林病毒(Tai Forest virus；TAFV)(Suzuki，Orba等人，2010，《公共科学图书馆·病原体》6：e1000801，Gallaher和Garry，2015，《病毒》7：285-305)。
在广泛多种DNA和RNA病毒中发现病毒孔蛋白，如小球藻病毒1型(Parameciumbursaria chlorella virus 1)、猴病毒40(SV40)、人类多瘤病毒JC(JCV)、严重急性呼吸道综合症冠状病毒(SARS-CoV)(Kang，Moroni等人，2004，《美国国家科学院院刊(Proc NatlAcad Sci USA)》101：5318-5324，Liao，Tam等人，2006，《实验医学与生物学进展(Adv ExpMed Biol)》581∶199-202，Daniels，Sadowicz等人，2007，《公共科学图书馆·病原体》3：e98)。
最近已经从DNA病毒发现强碱性病毒蛋白质，称为未知蛋白，如从多瘤病毒科(Polyomaviridae)和乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)(Royle，Dobson等人，2015，《病毒》7：5375-5387)。这些蛋白质显示许多病毒孔蛋白特征。已经在未知蛋白中发现含有许多聚集碱性氨基酸残基的保守性序列(Royle，Dobson等人，2015，《病毒》7：5375-5387)。基于多元受质分布分析，胰蛋白酶ZT同功异型物可充当针对DNA病毒的抗病毒剂，因为其可使这些聚集碱性氨基酸残基裂解(Royle，Dobson等人，2015，《病毒》7：5375-5387)。
许多病毒和细菌已经发展出使用细胞穿透肽或蛋白质实现细胞进入的机制(Milletti，2012，《今日药物发现(Drug Discov Today)》17：850-860)。病毒包括黄病毒科的瘟病毒、疱疹病毒(HSV-1)、人类免疫缺乏病毒(HIV-1、B型肝炎以及人类呼吸道合胞体病毒(RSV)(Elliott和O′Hare，1997，《细胞(Cell)》88：223-233，Oess和Hildt，2000，《基因疗法(Gene Ther)》7∶750-758，Langedijk，2002，《生物化学杂志(JBiol Chem)》277：5308-5314，Langedijk，Olijhoek等人，2005，《国际会议系列(International CongressSeries)》1277：95-107，Lu，Tager等人，2006，《分析生物化学(Anal Biochem)》353∶7-14，Godet，Guergnon等人，2010，《科学公共图书馆综合卷(PLoS One)》5：e13760)。此外，已经在细菌，如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中发现这些类型的蛋白质(Lu，Tager等人，2006，《分析生物化学》353：7-14)。细胞穿透肽(CPP)的共同点是其富含于碱性氨基酸残基，尤其精氨酸中(Milletti，2012，《今日药物发现》17：850-860)。孔蛋白是外膜蛋白质，其对于细菌致病性和保护起关键作用，并且由于这一原因，是治疗剂的合适目标(Galdiero，Falanga等人，2012，《当前蛋白质与肽科学(Curr Protein Pept Sci)》13：843-854)。这些蛋白质通常含有连续精氨酸氨基酸残基。基于多元受质分布分析，胰蛋白酶ZT同功异型物可充当针对病毒和细菌的抗菌剂，因为其可使聚集碱性氨基酸残基裂解。
寄生虫取决于毒性决定因素，如含有富含精氨酸的结构域的蛋白质，例如刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)(Fentress，Steinfeldt等人，2012，《细胞微生物学(CellMicrobiol)》14：1921-1933)。多元受质分布分析表明胰蛋白酶ZT同功异型物通过对这类蛋白质起作用而有利地对抗寄生虫。
使用基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool；BLAST)搜索由胰蛋白酶ZT同功异型物裂解的一些独特和优先氨基酸序列。搜索结果表明在许多病原体中发现这些类型的序列，包括病毒(例如从病毒的副黏病毒科和冠状病毒科)、细菌(例如嗜血杆菌属(Haemophilus genus))以及寄生虫(例如疟原虫属(Plasmodium genus))。副黏病毒科包括如呼吸道合胞体病毒(RSV)和人类副流感病毒等病毒，以及引起流行性腮腺炎和麻疹的病毒。冠状病毒科包括引起严重急性呼吸道综合症(SARS)的病毒。细菌的嗜血杆菌属包括与心内膜炎、脑膜炎以及菌血症相关联的副流感嗜血杆菌(Haemophilusparainfluenzae)。疟原虫属包括引起疟疾的恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)。
短语“医疗装置”意指(但不限于)用于诊断、预防、监测、治疗或缓解疾病目的的任何仪器、设备、器具、软件、材料或其它物品，如诊断、监测、治疗、缓解或补偿；用于受伤或障碍，如解剖结构或生理学过程的研究、置换或改变；概念控制；包括不未通过药理学、免疫或代谢手段在人体中或对人体实现其主要所欲作用，但可通过这类手段辅助其功能的装置。
本发明涉及新型胰蛋白酶ZT同功异型物。本发明描述胰蛋白酶ZT同功异型物的意外和独特的蛋白质裂解特性，使其在医学应用中有价值。具体地说，本发明涉及新型大西洋鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物，其适用作药品、医疗装置和化妆品。
在本发明的一个方面中，提供经分离的鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物，其包含根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或与其具有80％或更高的序列同源性的氨基酸序列。通常，这类序列同源性与SEQ ID NO：1的氨基酸序列85、90、95或99％同源。
在这个方面的一个实施例中，提供经分离的鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物，选自胰蛋白酶ZT-1，其包含根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列；胰蛋白酶ZT-2，其包含根据SEQ IDNO：3的氨基酸序列；胰蛋白酶ZT-3，其包含根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列；以及胰蛋白酶ZT-4，其包含根据SEQ ID NO：5的氨基酸序列，或与其具有80％或更高序列同源性的氨基酸序列。还包括与SEQ ID NO：2-5中阐述的氨基酸序列具有80％或更高的序列同源性的氨基酸序列。通常，这类序列同源性与SEQ ID NO：2-5的氨基酸序列85、90、95或99％同源。
在本发明的一个方面中，提供一种组合物，其包含至少一种根据本发明的鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物以及适合的赋形剂和载剂。所述鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物可选自鳕鱼胰蛋白酶ZT-1，其包含根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列；鳕鱼胰蛋白酶ZT-2，其包含根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列；鳕鱼胰蛋白酶ZT-3，其包含根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列；以及鳕鱼胰蛋白酶ZT-4，其包含根据SEQ ID NO：5的氨基酸序列。还包括与SEQ ID NO：2-5中阐述的氨基酸序列具有80％或更高的序列同源性的氨基酸序列。通常，这类序列同源性与SEQ ID NO：2-5的氨基酸序列85、90、95或99％同源。
通常，所述组合物包含所述鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物与其它鳕鱼胰蛋白酶的混杂物。优选地，所述鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物占所述组合物中鳕鱼胰蛋白酶的总含量的至少5％(w/w)，如所述组合物中鳕鱼胰蛋白酶的总含量的至少10、15、20、25、30、35、40、45或50％或更高(w/w)。
所述组合物通常以洗剂、水凝胶、口腔喷雾或鼻用喷雾形式局部给药。所述组合物可进一步包含多价醇，如甘油。
在这个方面的一个实施例中，提供所述组合物用于疗法。
在这个方面的一个实施例中，提供所述组合物用于治疗或预防由选自以下组成的组的病原性生物体引起的疾病：病毒、细菌、真菌、寄生虫和原虫。
在这个方面的一个实施例中，提供所述组合物用于治疗或预防由如病毒、细菌以及真菌等病原性生物体引起的上呼吸道疾病。
在这个方面的一个实施例中，提供所述组合物用于治疗或预防疼痛；急性炎症；慢性炎症；关节炎；关节发炎；滑囊炎；骨关节炎；类风湿性关节炎；青少年类风湿性关节炎；败血性关节炎；肌肉纤维疼痛；全身性红斑性狼疮症；静脉炎；肌腱炎；皮疹；牛皮癣；痤疮；湿疹；脸部脂溢性湿疹；手部、脸部或颈部湿疹；包皮感染；足癣；瘘感染；局部溃疡感染；新生儿中的脐部感染；皱纹；疤痕；瘢痕瘤；疖；疣以及过敏性瘙痒；痔疮；真菌感染和免疫病症，包括自体免疫疾病。
在这个方面的一个实施例中，提供所述组合物用于治疗伤口感染和烧伤伤口。
在这个方面的一个实施例中，提供所述组合物用于从其它健康皮肤去除坏死或脱落皮肤。
在这个方面的一个实施例中，提供所述组合物用于化妆品用途。所述组合物可进一步包含其它化妆学上的活性化合物。
在本发明的一个方面中，提供治疗疾病的方法，包含向有需要的患者给予治疗有效量的根据本发明的组合物。
在这个方面的一个实施例中，所述疾病是由选自以下组成的组的病原性生物体引起：病毒、细菌、真菌、寄生虫以及原虫。
在这个方面的一个实施例中，所述疾病由如病毒和细菌等病原性生物体引起的上呼吸道疾病。
在这个方面的一个实施例中，所述疾病选自疼痛；急性炎症；慢性炎症；关节炎；关节发炎；滑囊炎；骨关节炎；类风湿性关节炎；青少年类风湿性关节炎；败血性关节炎；肌肉纤维疼痛；全身性红斑性狼疮症；静脉炎；肌腱炎；皮疹；牛皮癣；痤疮；湿疹；脸部脂溢性湿疹；手部、脸部或颈部湿疹；包皮感染；足癣；瘘感染；局部溃疡感染；新生儿中的脐部感染；皱纹；疤痕；瘢痕瘤；疖；疣以及过敏性瘙痒；痔疮；真菌感染和免疫病症，包括自体免疫疾病。
在这个方面的一个实施例中，所述疾病是伤口感染或烧伤伤口。
在本发明的一个方面中，提供经分离的鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物，选自全长胰蛋白酶ZT-1，其包含根据SEQ ID NO：19的氨基酸序列；全长胰蛋白酶ZT-2，其包含根据SEQID NO：20的氨基酸序列；全长胰蛋白酶ZT-3，包含根据SEQ ID NO：21的氨基酸序列；以及全长胰蛋白酶ZT-4，其包含根据SEQ ID NO：22的氨基酸序列。
在本发明的一个方面中，提供制备包含根据SEQ ID NO：2到SEQ ID NO：5中的任一个的氨基酸序列的鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物的方法，包含
(i)从鳕鱼内脏提取胰蛋白酶ZT，
(ii)将提取物应用于至少一个或多个色谱步骤，包括使用对氨基苯甲脒亲和配位体进行的亲和色谱步骤，和
(iii)解吸附和洗提与对氨基苯甲脒亲和配位体结合的鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物。
在这个方面的一个实施例中，所述方法进一步包含至少一个在所述亲和色谱步骤(ii)之后使用阴离子交换树脂的步骤。
在这个方面的一个实施例中，所述鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物选自胰蛋白酶ZT-1，其包含根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列；胰蛋白酶ZT-2，其包含根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列；胰蛋白酶ZT-3，其包含根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列；以及胰蛋白酶ZT-4，其包含根据SEQ ID NO：5的氨基酸序列，或其混合物。
通常使用鳕鱼内脏纯化和分离胰蛋白酶ZT同功异型物。本发明人发现下文所描述的新型方法，其适用于胰蛋白酶ZT同功异型物的商业规模生产。在低于10℃的温度下，在pH6-8下进行提取。以1：6到1：20的比率(w/w)混合鳕鱼内脏与水。从残余下水分离提取物并且通过沉淀和过滤进一步澄清。接着进行微过滤和超滤，产生含有胰蛋白酶ZT同功异型物的溶液，其用于可包括若干个步骤的色谱分离。
进行亲和色谱，优选通过氨基苯甲脒亲和色谱，以纯化胰蛋白酶ZT同功异型物。接着可通过阴离子交换色谱进一步纯化胰蛋白酶ZT同功异型物。
一种应用胰蛋白酶ZT同功异型物或含有胰蛋白酶ZT同功异型物的经纯化的鳕鱼胰蛋白酶的混合物的方法是在含有0到90％(体积/体积)多价醇(多元醇)(如甘油)的水凝胶或洗剂和水的制剂中。胰蛋白酶ZT同功异型物的适合的浓度占至少1到100蛋白质浓度比(相对于其它胰蛋白酶形式)，优选是鳕鱼胰蛋白酶的总含量的5％或更高(w/w)。对于CBZ-Gly-Pro-Arg-DNA(苄氧羰基Gly-Pro-Arg-对硝基苯胺)，胰蛋白酶活性是每100毫升最终水凝胶/洗剂制剂0.1到10，000个酶活性单元。
本发明进一步提供(a)与某些病状相关的方法，其使用有效量的上述经纯化的胰蛋白酶ZT同功异型物，(b)用于这类方法的组合物或物质，(c)含有有效量的用于这类方法的胰蛋白酶ZT同功异型物的医药学或医疗装置组合物，以及(d)使用酶或酶组合物制造用于这类方法的药剂(医药学和医疗装置)。
所述方法尤其用于：
治疗或预防由病毒、细菌和真菌引起的病原性疾病，所述病毒、细菌和真菌例如存在于上呼吸道、下呼吸道和肺中；
治疗或预防性预防皮肤病状，如例如痤疮、皮疹、牛皮癣或湿疹，包括脸部脂溢性湿疹或手部、脸部、头皮或颈部湿疹、痔疮等，其中所给予的胰蛋白酶ZT同功异型物和其它胰蛋白酶的量优选是皮肤病状治疗或预防有效量；
治疗肺病，其中胰蛋白酶ZT同功异型物和其它胰蛋白酶(或不存在其它胰蛋白酶)是以例如加压定剂量高效吸入剂形式，以治疗有效剂量使用；
治疗或预防性预防伤口感染和清创伤口，通过在具有或不具有其它胰蛋白酶情况下向伤口施用微生物感染预防有效量的胰蛋白酶ZT同功异型物，或通过在具有或不具有其它胰蛋白酶情况下给予微生物抑制有效量的胰蛋白酶ZT同功异型物来增强伤口愈合，当所处理的伤口可基本上不含坏死组织时；治疗烧伤，其中优选在具有或不具有其它胰蛋白酶情况下给予的胰蛋白酶ZT同功异型物的量是足以促进愈合的量；
治疗，其中在具有或不具有其它胰蛋白酶情况下给予的胰蛋白酶ZT同功异型物的量优选是足以促进愈合的量；
治疗放射烧伤，其中在具有或不具有其它胰蛋白酶情况下给予的胰蛋白酶ZT同功异型物的量优选是足以促进愈合的量；
从其它健康皮肤去除坏死或脱落皮肤以改良皮肤的外观，其中在具有或不具有其它胰蛋白酶情况下给予的胰蛋白酶ZT同功异型物的量优选是足以促进愈合的量；
治疗脚跟龟裂，其中在具有或不具有其它胰蛋白酶情况下给予的胰蛋白酶ZT同功异型物的量优选是足以促进愈合的量；
用于管理受刺激的皮肤，如干斑、发痒、发红和瑕疵，其中在具有或不具有其它胰蛋白酶情况下给予的胰蛋白酶ZT同功异型物的量优选是足以促进愈合的量；
治疗或预防性预防囊肿性纤维化、癌症(例如通过给予肿瘤治疗有效量或肿瘤转移预防或抑制量的胰蛋白酶ZT同功异型物)、动脉粥样硬化、哮喘、败血性休克、中毒性休克综合症、组织粘连(如腱鞘、腹部术后或关节粘连)、再灌注损伤、疟疾、免疫病症(如自体免疫疾病)、细胞凋亡、结肠炎和肠炎(如克罗恩氏病(Crohn′s disease))，其中优选所给予的胰蛋白酶ZT同功异型物和相关肽酶的量是有效的；
治疗或预防性预防微生物感染，例如病毒感染，如鼻病毒(RV)、呼吸道合胞体病毒(RSV)、流感、疱疹病毒感染(例如HSV-1、HSV-2、带状疱疹或生殖器疱疹感染)、HIV、肝炎、冠状病毒、巨细胞病毒或乳头瘤病毒感染；引起胃肠道疾病的感染，如溃疡或腹泻；真菌感染，如全身性、皮肤、口腔、阴道或食道真菌感染，包括例如酵母感染，包括指甲真菌感染和假丝酵母感染；眼部微生物感染，优选用眼部给药治疗；细菌感染，包括由幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus；MRSA)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、轻型链球菌(Streptococcusmitis)、链球菌属(Streptococcus spp.)、克雷伯氏菌属(Klebsiella spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、奈瑟淋球菌(Neisseria gonorrheae)、嗜血杆菌属(Haemophilusspp.)、衣原体属(Chlamydia spp.)、梅毒(syphilis)和大肠杆菌(E.coli)感染，和引起软下疳的细菌感染；免疫功能不全患者中的机会性微生物感染，其中优选所给予的鳕鱼胰蛋白酶的量是微生物感染治疗或预防有效量，或具有针对细胞-细胞或细胞-病毒粘着的抑制活性；
治疗或预防性预防选自以下组成的组的适应症：疼痛、炎症、急性或慢性炎症、关节炎、关节发炎、滑囊炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、败血性关节炎、肌肉纤维疼痛、全身性红斑性狼疮症和静脉炎，其中优选量是治疗或预防有效量；
去除牙斑，其中在具有或不具有其它胰蛋白酶情况下给予的胰蛋白酶ZT同功异型物的量优选是牙斑去除有效量；以及使血块溶解，其中胰蛋白酶ZT同功异型物的量优选是凝血溶解有效量。
所述方法包含给予包含如上文所描述的胰蛋白酶ZT同功异型物的组合物。
本发明提供局部化妆品和医学组合物，其包含上述胰蛋白酶ZT同功异型物；和凝胶、乳膏或栓剂组合物。
本发明进一步提供通过在具有或不具有其它胰蛋白酶情况下给予胰蛋白酶ZT同功异型物来抑制或预防性预防病原性微生物传染的方法。优选地，在具有或不具有其它胰蛋白酶情况下，向包含所讨论的微生物的主要传染通道的身体部分施用胰蛋白酶ZT。在一个实施例中，向涉及性活动的体孔施用喷雾、软膏或洗涤剂，例如以预防HIV或肝炎传染。在另一实施例中，向上气道施用胰蛋白酶ZT同功异型物或相关肽酶，例如经由气雾剂，以抑制或预防常见冷病毒(如鼻病毒或冠状病毒)传染。
体外治疗细胞的组织、体液或组合物以去除细胞粘着组分的方法可降低从一个个体移植到另一个个体的细胞的组织、体液或组合物的免疫排斥。在另一个方面中，这类治疗去除在所治疗的涉及微生物感染的细胞的组织、体液或组合物中发现的细胞粘着组分或使其失活。
在通过给予胰蛋白酶ZT同功异型物或相关肽酶来治疗或预防性预防败血性休克或中毒性休克综合症时，适合的给药途径包括全身给药。对于与休克相关联的阴道感染，可使用阴道冲洗剂、乳膏、凝胶或栓剂作为给药方法。
在通过给予胰蛋白酶ZT同功异型物或相关肽酶来治疗或预防性预防疼痛、炎症、急性或慢性炎症、关节炎、关节发炎、滑囊炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、败血性关节炎、肌肉纤维疼痛、全身性红斑性狼疮症、静脉炎时，适合的给药途径包括(但不限于)乳膏、凝胶或栓剂，尤其(但不限于)含有甘油或其它多元醇的水凝胶。
在通过在具有或不具有其它胰蛋白酶情况下给予胰蛋白酶ZT同功异型物来治疗或预防性预防皮疹；牛皮癣；痤疮；湿疹，包括脸部脂溢性湿疹或手部、脸部或颈部湿疹；包皮感染；足癣；瘘感染；局部溃疡感染；新生儿中的脐部感染；皱纹；疤痕和瘢痕瘤；疖；疣以及过敏性瘙痒；痔疮等；伤口；伤口感染；烧伤伤口；从其它健康皮肤去除坏死或脱落皮肤以改良皮肤外观；真菌感染，如全身性、皮肤、口腔、阴道或食道真菌，包括例如酵母感染，包括指甲真菌感染和假丝酵母感染；以及免疫病症，包括自体免疫疾病时，适合的给药途径包括乳膏、凝胶或栓剂，尤其(但不限于)含有甘油或其它多元醇的水凝胶。
以上目标是通过使用含有有效量的胰蛋白酶ZT同功异型物和(或不具有)其它胰蛋白酶的组合物获得，所述组合物能够缓解疼痛、炎症、关节炎、肿胀、水肿、牛皮癣湿疹、皮肤炎、皮疹和/或引言部分中提及的疾病的其它症状。胰蛋白酶ZT同功异型物可以高产量和相对简单的方式从鳕鱼内脏获得。已发现可在合理的产率下，以相对简单的方式，以商业规模纯化胰蛋白酶ZT同功异型物。单独的胰蛋白酶ZT同功异型物或其连同其它大西洋丝氨酸蛋白酶可用于本发明的目的。
本公开中呈现的胰蛋白酶ZT同功异型物可通过施加将使酶与亲和配位体之间的相互作用去稳定化的条件从亲和力基质解吸附。这类条件包括高盐，接着低pH值，优选在30％或更高的甘油中。在酸洗提步骤之后，使管柱洗提剂流入中和缓冲液以是鳕鱼胰蛋白酶稳定。接着，可使用阴离子交换进一步纯化胰蛋白酶ZT同功异型物并且在增加的盐浓度下洗提。通过这些方法，可分离具有超过约90％的纯度的胰蛋白酶ZT同功异型物。因此，所得鳕鱼胰蛋白酶部分含有2-3种主要同功异型物，如由SDS电泳(其产生两条色带)和MALDI-TOF质谱分析体现。胰蛋白酶ZT同功异型物的分子量是约25kDa，而取决于同功异型物，所计算的等电点是4.35-4.49。
视既定用途而定，呈具有或不具有其它胰蛋白酶的特定配制物形式的胰蛋白酶ZT同功异型物可用作药物、用于医疗装置(如化学配制物)中或用于化妆品中。本发明的胰蛋白酶ZT同功异型物(具有或不具有其它胰蛋白酶)是通过以下方式给予：局部、经口、经直肠、经阴道、滴注(例如滴入尿道或瘘)、通过肺途径(例如通过使用气雾剂(例如通过使用加压定剂量吸入剂(pMDI)))、通过向眼部施用液滴或全身性，如非经肠，包括例如肌肉内、皮下、腹膜内、动脉内或静脉内。根据标准医药学实践，胰蛋白酶ZT同功异型物是在溶液中或与药学上可接受的载剂或赋形剂组合给予。对于经口给药模式，胰蛋白酶ZT同功异型物是以片剂、胶囊、口含片、口嚼片、糖衣片、粉末、糖浆剂、酏剂、水性溶液和悬浮液等形式使用。对于非经肠给药，通常制备胰蛋白酶ZT同功异型物的无菌溶液，并且适当地调节和缓冲溶液的pH值。对于静脉内使用，应控制溶解物的总浓度以使制剂等渗。对于眼部给药，可通过所属领域中已知的眼部递送系统(如敷抹器或眼滴管)递送软膏或可滴注液体。对于肺部给药，将选择适合的稀释剂和/或载剂以允许形成气雾剂。对于局部给药，通常以含有0到85％甘油(如约20％到30％甘油并且可能多达85％甘油)的水凝胶形式给予胰蛋白酶ZT同功异型物。
对于局部治疗，在具有或不具有其它胰蛋白酶情况下每次施用的胰蛋白酶ZT同功异型物的适合的剂量在约0.01μg/cm2到约1mg/cm2，优选约0.1μg/cm2到约0.01mg/cm2范围内(使用例如约0.01mg/ml酶凝胶)。对于全身治疗，将通常选择剂量以保持在具有或不具有其它胰蛋白酶情况下，胰蛋白酶ZT同功异型物的血清含量在约0.1mg/100ml与约100mg/100ml之间，优选在约0.5mg/100ml与约2.0mg/100ml之间。在优选全身给药量的替代测量中，将使用优选约0.1mg/kg到约10mg/kg，更优选约1mg/kg。对于阴道和尿道治疗，胰蛋白酶ZT同功异型物的适合的冲洗/滴注溶液将通常具有约1μg/ml到约15mg/ml，优选约100μg/ml到约3mg/ml的浓度。对于所有治疗，酶组合物将通常每天施用约1到约10次，优选每天约2到约5次。当然，这些值将视许多因素而变化，包括疾病的类型和严重度，以及患者的年龄、体重和医学病状，如医学技术领域的技术人员将认识到。相信可在无显著不良影响的情况下使用显著更高的剂量。
对于伤口愈合，与仅在首次修整伤口时施用相比，优选更频率地施用胰蛋白酶ZT同功异型物(具有或不具有其它胰蛋白酶)。优选地，至少约在每次伤口敷料变化时施用胰蛋白酶ZT同功异型物。还可以至少约每隔一天，更优选每天或每天数次施用胰蛋白酶ZT同功异型物。对于皮肤情形，如湿疹、牛皮癣等，优选每天，更优选每天两次施用胰蛋白酶ZT同功异型物(具有或不具有其它胰蛋白酶)水凝胶。对于急性或慢性炎症、关节炎、关节发炎、滑囊炎、骨关节炎等，优选每天，更优选每天两次施用胰蛋白酶ZT同功异型物。
所属领域中已知许多用于测定蛋白质同源性百分比的方法。当进行序列比对时，使用ClustalW2(Clustal2.1版本)计算一致性百分比(EMBL-EBI网址http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/date 4th of May 2015)。
现将通过许多非限制性实例描述本发明。
实例1.
从鳕鱼制备蛋白酶混合物
将约100kg冷冻的大西洋鳕鱼内脏解冻并且添加到提取箱中四倍体积的冷生活饮用水中，并且用氢氧化钠溶液将pH值调节到约pH 6。在0到5℃下搅拌混合物约10小时。在短时间的粗物质沉淀(约30分钟)之后，用泵从剩余的不可溶内脏移出水性提取物并且收集在沉淀箱中。使水性提取物在经冷却的沉淀箱中静置，以沉淀约40到80小时。使用泵将上清液从上清液箱倾析到储料槽。通过超滤和透滤将上清液浓缩10到20倍，达到可接受的离子强度程度，其中传导性低于约2.5mS/cm。获得约10-15升经超滤和透滤的蛋白质浓缩物。
实例2.
从浓缩的鳕鱼内脏提取物纯化鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物
将约12升如实例1中获得的经超滤和透滤的浓缩物施用于连续、串联连接的约1升封装色谱柱中，第一个管柱含有羧基甲基(CM)快速流动阳离子交换树脂(GE healthcare)，并且第二个管柱含有与琼脂糖树脂偶合的对氨基苯甲脒亲和配位体(GE healthcare)。CM和对氨基苯甲脒管柱预先用约10倍管柱体积的含有2.5mM氯化钙的25mM Tris缓冲液(pH7.8)(缓冲液A)平衡。将浓缩物以每分钟约100ml的流动速率泵送到CM和对氨基苯甲脒管柱上。当将浓缩溶液施用到管柱上完成时，用约8升缓冲液A从连续管柱系统洗去残余物质。在这一洗涤完成之后，从CM管柱断开对氨基苯甲脒亲和管柱并且用约5倍管柱体积的含有0.5M NaCl和2.5mM氯化钙的25mM Tris缓冲液(pH 7.5)的高盐溶液洗涤。接着，从亲和配位体解吸附鳕鱼胰蛋白酶并且用含有10mM氯化钙和30％甘油的25mM乙酸(pH 3.2)的酸溶液从管柱洗提。
通过SDS PAGE电泳，发现经纯化的含有鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物的制剂是均质的。经纯化的制剂经由0.22微米过滤器进行过滤器灭菌并且在约-20℃下冷冻储存。含有鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物的制剂经由0.22微米过滤器进行过滤器灭菌并且在约-20℃下冷冻储存。将含有鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物的制剂施用于阴离子交换色谱柱(MonoQ)并且用盐梯度洗提蛋白质(图1)。管柱用缓冲液(20mM Tris、10mM CaCl2，pH 8.0)平衡，并且酶在1mL/min的流动速率下，以40倍管柱体积用线性0-150mM NaCl梯度、以6倍管柱体积用线性150-620mM NaCl、以10倍管柱体积用620-850mM NaCl洗提。来自图1的峰标记的胰蛋白酶ZT中的蛋白质经历SDS-PAGE分析(图2)。从凝胶分离来自胰蛋白酶ZT峰的凝胶上的蛋白质色带并且使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析。质谱(MS)分析显示与胰蛋白酶ZT-1、胰蛋白酶ZT-2、胰蛋白酶ZT-3以及胰蛋白酶ZT-4的一致性(表1和表2)。针对对应于鳕鱼胰蛋白酶I和鳕鱼胰蛋白酶X的最远C端处的残基228-239的肽((NH2-)CVLSGWVRDTMA(-COOH))(SEQ ID NO：23)，在兔中制备针对胰蛋白酶I和胰蛋白酶X的抗体。使用与凝胶珠粒负载物偶合的肽，从兔血清亲和纯化抗体。在小鼠腹水体液中制备针对胰蛋白酶ZT同功异型物的多克隆抗体，如Overkamp等人(Overkamp，Mohammed-Ali等人，1988，《免疫分析杂志(J Immunoassay)》9：51-68)中所描述。将重组型胰蛋白酶ZT-4的纯化形式腹膜内(i.p.)注射到Balb/C2小鼠中。在第34天处死小鼠并且收集腹水体液。使用各别抗体进行西方印迹分析。对来自图1的峰标记的胰蛋白酶ZT中的蛋白质进行西方印迹分析(图3)。胰蛋白酶ZT同功异型物抗体针对来自峰标记的胰蛋白酶ZT的蛋白质反应，而针对胰蛋白酶I和胰蛋白酶X的抗体不反应(图3)。
表1显示由对来自图2中的SDS-PAGE凝胶的蛋白质色带的MS分析获得的肽质量(非胍化样品)，参见管柱1Mr(实验)。Mr表示相对分子量(Da)。管柱2、3以及4显示来自氨基酸序列胰蛋白酶ZT-1、胰蛋白酶ZT-2、胰蛋白酶ZT-3以及胰蛋白酶ZT-4的电子杂交胰蛋白酶消化物的计算值(与管柱1中的质量匹配的质量)。管柱5显示产生来自电子杂交消化物的质量值的肽的序列。管柱6显示基于电子杂交消化物的不同肽的修饰。
表1.
表1中的序列如下：
Seq ID NO 氨基酸序列
SEQ ID NO 6 IIGGQDCEPR
SEQ ID NO 7 VFEGTEQLVK
SEQ ID NO 8 LQCLDVPIVEPVACQASYPGMISPR
SEQ ID NO 8 LQCLDVPIVEPVACQASYPGMISPR
SEQ ID NO 8 LQCLDVPIVEPVACQASYPGMISPR
SEQ ID NO 9 LQCLDVPIVETVDCEAAYPGMISPR
SEQ ID NO 10 MVCAGYMDGGR
SEQ ID NO 11 MMCVGFMDGGR
SEQ ID NO 10 MVCAGYMDGGR
SEQ ID NO 11 MMCVGFMDGGR
SEQ ID NO 12 GCAEPNSPGVYVK
SEQ ID NO 12 GCAEPNSPGVYVK
表2显示由对来自图2中的SDS-PAGE凝胶的蛋白质色带的MS分析获得的肽质量(胍化样品)，参见管柱1Mr(实验)。Mr表示相对分子量(Da)。管柱2、3以及4显示来自胰蛋白酶ZT-1、胰蛋白酶ZT-2、胰蛋白酶ZT-3以及胰蛋白酶ZT-4的氨基酸序列的电子杂交胰蛋白酶消化物的计算值(与管柱1中的质量匹配的质量)。管柱5显示产生来自电子杂交消化物的质量值的肽的序列。管柱6显示基于电子杂交消化物的不同肽的修饰。
表2.
表2中的序列如下：
Seq ID No 氨基酸序列
SEQ ID NO 6 IIGGQDCEPR
SEQ ID NO 7 VFEGTEQLVK
SEQ ID NO 9 LQCLDVPIVETVDCEAAYPGMISPR
SEQ ID NO 8 LQCLDVPIVEPVACQASYPGMISPR
SEQ ID NO 8 LQCLDVPIVEPVACQASYPGMISPR
SEQ ID NO 8 LQCLDVPIVEPVACQASYPGMISPR
SEQ ID NO 9 LQCLDVPIVETVDCEAAYPGMISPR
SEQ ID NO 9 LQCLDVPIVETVDCEAAYPGMISPR
SEQ ID NO 10 MVCAGYMDGGR
SEQ ID NO 11 MMCVGFMDGGR
SEQ ID NO 11 MMCVGFMDGGR
SEQ ID NO 13 DVCNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGR
SEQ ID NO 13 DVCNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGR
实例３.
胰蛋白酶ZT同功异型物的多元受质分布
使用多元受质分布分析酶(蛋白酶)的受质特异性(O′Donoghue，Eroy-Reveles等人，2012，《自然方法》9：1095-1100)。蛋白酶可在肽序列内的不同氨基残基处裂解受质，表明受质特异性的差异。胰蛋白酶是由其在使C端裂解成精氨酸或赖氨酸残基时的偏好指定。
酶同功异型物
通过将经苯甲脒纯化的鳕鱼胰蛋白酶施用于MoHoQ HR 5/5离子交换柱来分离鳕鱼胰蛋白酶异构酶。对于胰蛋白酶I的分离，管柱用20mM Tris、5mM乙醇胺、10mM CaCl2，pH9.1平衡，并且酶在1mL/min的流动速率下以80倍管柱体积用线性0-200mM NaCl梯度，以10倍管柱体积用线性200-1000mM NaCl梯度洗提。在施用之前，用1M NaOH将样品pH值调节到pH 9.1。
对于胰蛋白酶ZT同功异型物的分离，管柱用25mM Tris、25mM CaCl2、15％(体积/体积)甘油，pH 7.5平衡，并且酶在1mL/min的流动速率下以5倍管柱体积用线性0-150mMNaCl梯度，以20倍管柱体积用线性150-550NaCl梯度，以1倍管柱体积用线性500-1000mMNaCl梯度洗提。
调节两种酶样品(胰蛋白酶ZT和胰蛋白酶I)的组合物，使得Tris的最终浓度是60mM，CaCl2的最终浓度是30mM并且甘油的最终浓度是15％(体积/体积)，其中pH值是8.5。
多元受质分布分析
用具有广泛生理化学多样性的肽文库(124个既定肽，14聚体序列，总共1612个肽键)培育经纯化的胰蛋白酶ZT同功异型物或胰蛋白酶I(5、15和60分钟)，如O′Donoghue，Eroy-Reveles等人(O′Donoghue，Eroy-Reveles等人，2012，《自然方法》9：1095-1100)中所描述。在培育之后，通过质谱分析鉴别裂解位点(O′Donoghue，Eroy-Reveles等人，2012，《自然方法》9：1095-1100)。
结果
多元受质分布分析意外显示与WO 2000078332中所公开的胰蛋白酶I相比，存在胰蛋白酶ZT同功异型物独有的大量裂解位点(图4和表4)。并且，鉴别显示与胰蛋白酶I相比，优先由胰蛋白酶ZT同功异型物裂解的裂解位点(表4)。基于来自多元受质分布分析的结果，产生含有基于受质中P4-P4′位置处的标准分数(Z分数)比率的数值的表，其中比较胰蛋白酶ZT与胰蛋白酶I的受质特异性(表3)。正值(Z分数)反映与胰蛋白酶I相比，某一P位置中氨基酸残基的偏好有利于胰蛋白酶ZT同功异型物。意外的是，胰蛋白酶ZT同功异型物上的多元受质分布表明与胰蛋白酶I相比，受质中精氨酸或赖氨酸周围的氨基酸对其裂解具有不同作用。
表3显示在培育5、15和60分钟之后，基于受质中P4-P4′位置处标准分数(Z分数)比率的数值，比较胰蛋白酶ZT与胰蛋白酶I的受质特异性。经历裂解的受质中的氨基酸残基从裂解的开始沿N端方向称为P1、P2、P3、P4(Schechter和Berger，1967，《生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem Biophys Res Commun)》27：157-162，Schechter和Berger，1968，《生物化学与生物物理学研究通讯》32：898-902)。C端方向上的残基称为P1′、P2′、P3′、P4′。在管柱中提供P位置并且各行显示不同P位置中的氨基酸。表中的正值(Z分数)反映与胰蛋白酶I相比，某一P位置中氨基酸残基的偏好有利于胰蛋白酶ZT同功异型物。负值(Z分数)反映与胰蛋白酶ZT相比，偏好有利于胰蛋白酶I。举例来说，基于来自表3的值，可发现与胰蛋白酶I相比，胰蛋白酶ZT显著更好地适于裂解含有若干个连续带正电残基(精氨酸或赖氨酸)的肽。并且，这些类型的序列，即富含赖氨酸和精氨酸的氨基酸序列，常常在蛋白质毒素、涉及发病机理的蛋白质和肽中发现(Suzuki，Orba等人，2010，《公共科学图书馆·病原体》6：e1000801，Fentress，Steinfeldt等人，2012，《细胞微生物学》14：1921-1933，Jiang，Cun等人，2012，《病毒学杂志》86：7256-7267，Milletti，2012，《今日药物发现》17：850-860，Gallaher和Garry，2015，《病毒》7：285-305)。如先前所提及，因此胰蛋白酶ZT同功异型物具有有利的针对引起许多微生物的致病性的蛋白质的特性。
表3.
表3续.
表3续.
表4显示在与胰蛋白酶ZT或胰蛋白酶I一起培育之后，来自多元分布的所选择的肽的前驱体离子强度。前驱体离子强度是在片段化之前的肽峰值强度(MS)，其表示既定物种的相对丰度的测量值。肽序列中的X表示占位符，其表示肽序列中不存在的氨基酸。数据显示与胰蛋白酶I相比，胰蛋白酶ZT同功异型物独特地能够裂解三种肽序列(QGKKAPXX、WGNRSPLE以及QAVRPNGM)。此外，数据显示与胰蛋白酶I相比，胰蛋白酶ZT同功异型物优先裂解两种肽。胰蛋白酶ZT同功异型物能够在5分钟内裂解XIARQPWN并且在15分钟内裂解FDNRVGKW，而在胰蛋白酶I情况下，仅在培育60分钟之后检测到这两种肽内的裂解。
表4.
实例4.
从浓缩的鳕鱼内脏提取物纯化鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物
将约12升如实例1中获得的经超滤和透滤的浓缩物施用于连续串联连接的约1升封装色谱柱，第一个管柱含有CM快速流动阳离子交换树脂(GE healthcare)，第二个管柱含有与琼脂糖树脂偶合的对氨基苯甲脒亲和配位体(GE healthcare)，并且第三个管柱含有DEAE快速流动阴离子交换树脂(GE healthcare)。CM和对氨基苯甲脒管柱预先用约10倍管柱体积的含有2.5mM氯化钙的25mM Tris缓冲液(pH 7.8)平衡。将浓缩物以每分钟约100ml的流动速率泵送到CM和对氨基苯甲脒管柱上。当将浓缩溶液施用到管柱上完成时，用约8升缓冲液A从连续管柱系统洗去残余物质。在这一洗涤完成之后，从CM管柱断开对氨基苯甲脒亲和管柱并且用约5倍管柱体积的含有0.5M NaCI和2.5mM氯化钙的25mM Tris缓冲液(pH7.5)的高盐溶液洗涤。接着，从亲和配位体解吸附鳕鱼胰蛋白酶并且用含有10mM氯化钙和30％甘油的25mM乙酸(pH 3.2)的酸溶液从管柱洗提。将鳕鱼胰蛋白酶部分收集到含有30％甘油的200mM Tris(pH 8.5)的中和缓冲液中。DEAE阴离子交换管柱预先用约10倍管柱体积的含有2.5mM氯化钙的25mM Tris缓冲液(pH 7.8)平衡。将鳕鱼胰蛋白酶部分施用于DEAE阴离子交换树脂并且用约5倍管柱体积的平衡缓冲液洗涤。接着，使用多达0.9M NaCI梯度盐溶液使胰蛋白酶ZT同功异型物从管柱解吸附。通过SDS PAGE电泳和FPLC Mono Q色谱，发现经纯化的鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物制剂是均质的。经纯化的制剂经由0.22微米过滤器进行过滤器灭菌并且在约-20℃下冷冻储存。
实例5.
制备包括鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物的鳕鱼胰蛋白酶的水凝胶制剂
将实例2的含有经纯化的鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物的制剂与包含含有0.8％w/vCarbomer 940和40％甘油的水性凝胶的亲水胶体凝胶混合。以1∶1比率鳕鱼胰蛋白酶制剂与水凝胶，得到每毫克最终凝胶-酶混合物(酶水凝胶软膏)4个酶单元的最终浓度(U/mg)，酶单元是如先前描述使用Cbz-GPR-pNA作为受质测定。因此，所得酶水凝胶软膏含有约0.01ma/ml，或1U/ml的鳕鱼胰蛋白酶酶、0.4％Carbomer 940、20％甘油以及0.04％对羟基苯甲酸酯。
实例6.
胰蛋白酶ZT同功异型物针对作为鼻病毒模型的肠病毒的抗病毒活性
小核糖核酸病毒是小型单股阳性有义RNA病毒，其不含脂质包膜。肠病毒和鼻病毒是小RNA病毒科的两个属。肠病毒最初在口咽中复制并且在胃的酸性环境中存活。小肠是肠病毒的主要侵袭位点。鼻病毒在鼻通道中复制，但在胃的酸性环境被破坏。鼻病毒和肠病毒具有相同形态，但可基于临床、生物物理学和流行病研究来区分。在细胞培养物中操作鼻病毒存在问题(Racaniello，2007，《病毒学领域(Fields virology)》，第5版，795-838)。因此，使用肠病毒作为鼻病毒的模型以分析胰蛋白酶ZT同功异型物的抗病毒特性。
材料和方法
肠病毒储备溶液
在冰岛大学医院的病毒学部门(University Hospital of Iceland，departmentof Virology)从患者分离肠病毒(柯萨奇病毒B2)，并且在MA-104细胞(非洲绿猴肾细胞)或Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)中生长。根据里穆两氏法(Reed-Muench)(REED和MUENCH，1938，《美国流行病学杂志(American Journal ofEpidemiology)》27：493-497)滴定柯萨奇病毒B2(TCID50＝8，23)。
酶同功异型物
通过将经苯甲脒纯化的鳕鱼胰蛋白酶施用于MonoQ HR 5/5离子交换柱来分离鳕鱼胰蛋白酶异构酶。对于分离胰蛋白酶ZT同功异型物，管柱用25mM Tris、25mM CaCl2，pH7.5平衡，并且酶在1mL/min的流动速率下以5倍管柱体积用线性0-400mM NaCl梯度，以20倍管柱体积用线性400-1000mM NaCI洗提。
处理
MA-104细胞在96孔微量滴定盘中生长到95％汇合。肠病毒使用最低必需培养基(MEM)从储备溶液稀释到10-6，并且将1.5mL经稀释的溶液置放于两个不同小瓶中。小瓶用1.5mL胰蛋白酶ZT同功异型物和作为阳性对照的1.5mL MEM处理。阴性对照是无病毒的MEM(3mL)。所有小瓶在34℃和5％CO2下培育90分钟，随后添加100μL苯甲脒琼脂糖溶液以去除残余胰蛋白酶并且再培育30分钟。溶液在5500rpm下离心3分钟，随后将2mL上清液置放于埃彭道夫小瓶(Eppendorf vial)中。将200μL溶液置放于各孔中，微量滴定盘中总共10个孔。培育盘30分钟。在培育之后，丢弃培养基并且将具有1％新生牛血清(NCS)的MEM添加到所有孔中。使用显微镜监测是否存在感染。
结果
胰蛋白酶ZT同功异型物作为针对用作鼻病毒模型的肠病毒(柯萨奇病毒B2)的抗病毒药剂极有效。结果呈现于图5中。
序列表
<110> Zymetech EHF
<120> 新型胰蛋白酶同功异型物和其用途
<130> 21083149
<150> EP15178208.3
<151> 2015-07-24
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 227
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 通用序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是I或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是Q或H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可以是D或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa可以是R或N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (77)..(77)
<223> Xaa是L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (148)..(148)
<223> Xaa可以是T或P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (150)..(150)
<223> Xaa可以是D或A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (152)..(152)
<223> Xaa可以是E或Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (154)..(154)
<223> Xaa可以是A或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (164)..(164)
<223> Xaa可以是V或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (166)..(166)
<223> Xaa可以是A或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (168)..(168)
<223> Xaa可以是Y或F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (175)..(175)
<223> Xaa可以是A或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (198)..(198)
<223> Xaa可以是Q或R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (202)..(202)
<223> Xaa可以是L或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (205)..(205)
<223> Xaa可以是Y或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (215)..(215)
<223> Xaa可以是Y或F
<400> 1
Ile Xaa Gly Gly Xaa Xaa Cys Glu Pro Xaa Ser Arg Pro Phe Met Ala
1 5 10 15
Ser Leu Asn Tyr Gly Tyr His Phe Cys Gly Gly Val Leu Ile Asn Asp
20 25 30
Gln Trp Val Leu Ser Val Ala His Cys Trp Tyr Asn Pro Tyr Tyr Met
35 40 45
Gln Val Met Leu Gly Glu His Asp Leu Arg Val Phe Glu Gly Thr Glu
50 55 60
Gln Leu Val Lys Thr Asn Thr Ile Phe Trp His Glu Xaa Tyr Asp Tyr
65 70 75 80
Gln Thr Leu Asp Tyr Asp Met Met Met Ile Lys Leu Tyr His Pro Val
85 90 95
Glu Val Thr Gln Ser Val Ala Pro Ile Ser Leu Pro Thr Gly Pro Pro
100 105 110
Asp Gly Gly Met Leu Cys Ser Val Ser Gly Trp Gly Asn Met Ala Met
115 120 125
Gly Glu Glu Val Asn Leu Pro Thr Arg Leu Gln Cys Leu Asp Val Pro
130 135 140
Ile Val Glu Xaa Val Xaa Cys Xaa Ala Xaa Tyr Pro Gly Met Ile Ser
145 150 155 160
Pro Arg Met Xaa Cys Xaa Gly Xaa Met Asp Gly Gly Arg Asp Xaa Cys
165 170 175
Asn Gly Asp Ser Gly Ser Pro Leu Val Cys Glu Gly Val Leu Thr Gly
180 185 190
Leu Val Ser Trp Gly Xaa Gly Cys Ala Xaa Pro Asn Xaa Pro Gly Val
195 200 205
Tyr Val Lys Val Tyr Glu Xaa Leu Ser Trp Ile Gln Thr Thr Leu Asp
210 215 220
Ala Asn Pro
225
<210> 2
<211> 227
<212> PRT
<213> 大西洋鳕鱼
<400> 2
Ile Val Gly Gly His Glu Cys Glu Pro Asn Ser Arg Pro Phe Met Ala
1 5 10 15
Ser Leu Asn Tyr Gly Tyr His Phe Cys Gly Gly Val Leu Ile Asn Asp
20 25 30
Gln Trp Val Leu Ser Val Ala His Cys Trp Tyr Asn Pro Tyr Tyr Met
35 40 45
Gln Val Met Leu Gly Glu His Asp Leu Arg Val Phe Glu Gly Thr Glu
50 55 60
Gln Leu Val Lys Thr Asn Thr Ile Phe Trp His Glu Leu Tyr Asp Tyr
65 70 75 80
Gln Thr Leu Asp Tyr Asp Met Met Met Ile Lys Leu Tyr His Pro Val
85 90 95
Glu Val Thr Gln Ser Val Ala Pro Ile Ser Leu Pro Thr Gly Pro Pro
100 105 110
Asp Gly Gly Met Leu Cys Ser Val Ser Gly Trp Gly Asn Met Ala Met
115 120 125
Gly Glu Glu Val Asn Leu Pro Thr Arg Leu Gln Cys Leu Asp Val Pro
130 135 140
Ile Val Glu Pro Val Ala Cys Gln Ala Ser Tyr Pro Gly Met Ile Ser
145 150 155 160
Pro Arg Met Met Cys Val Gly Phe Met Asp Gly Gly Arg Asp Val Cys
165 170 175
Asn Gly Asp Ser Gly Ser Pro Leu Val Cys Glu Gly Val Leu Thr Gly
180 185 190
Leu Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala Glu Pro Asn Ser Pro Gly Val
195 200 205
Tyr Val Lys Val Tyr Glu Phe Leu Ser Trp Ile Gln Thr Thr Leu Asp
210 215 220
Ala Asn Pro
225
<210> 3
<211> 227
<212> PRT
<213> 大西洋鳕鱼
<400> 3
Ile Val Gly Gly His Glu Cys Glu Pro Asn Ser Arg Pro Phe Met Ala
1 5 10 15
Ser Leu Asn Tyr Gly Tyr His Phe Cys Gly Gly Val Leu Ile Asn Asp
20 25 30
Gln Trp Val Leu Ser Val Ala His Cys Trp Tyr Asn Pro Tyr Tyr Met
35 40 45
Gln Val Met Leu Gly Glu His Asp Leu Arg Val Phe Glu Gly Thr Glu
50 55 60
Gln Leu Val Lys Thr Asn Thr Ile Phe Trp His Glu Leu Tyr Asp Tyr
65 70 75 80
Gln Thr Leu Asp Tyr Asp Met Met Met Ile Lys Leu Tyr His Pro Val
85 90 95
Glu Val Thr Gln Ser Val Ala Pro Ile Ser Leu Pro Thr Gly Pro Pro
100 105 110
Asp Gly Gly Met Leu Cys Ser Val Ser Gly Trp Gly Asn Met Ala Met
115 120 125
Gly Glu Glu Val Asn Leu Pro Thr Arg Leu Gln Cys Leu Asp Val Pro
130 135 140
Ile Val Glu Thr Val Asp Cys Glu Ala Ala Tyr Pro Gly Met Ile Ser
145 150 155 160
Pro Arg Met Val Cys Ala Gly Tyr Met Asp Gly Gly Arg Asp Ala Cys
165 170 175
Asn Gly Asp Ser Gly Ser Pro Leu Val Cys Glu Gly Val Leu Thr Gly
180 185 190
Leu Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Leu Pro Asn Tyr Pro Gly Val
195 200 205
Tyr Val Lys Val Tyr Glu Tyr Leu Ser Trp Ile Gln Thr Thr Leu Asp
210 215 220
Ala Asn Pro
225
<210> 4
<211> 227
<212> PRT
<213> 大西洋鳕鱼
<400> 4
Ile Ile Gly Gly Gln Asp Cys Glu Pro Arg Ser Arg Pro Phe Met Ala
1 5 10 15
Ser Leu Asn Tyr Gly Tyr His Phe Cys Gly Gly Val Leu Ile Asn Asp
20 25 30
Gln Trp Val Leu Ser Val Ala His Cys Trp Tyr Asn Pro Tyr Tyr Met
35 40 45
Gln Val Met Leu Gly Glu His Asp Leu Arg Val Phe Glu Gly Thr Glu
50 55 60
Gln Leu Val Lys Thr Asn Thr Ile Phe Trp His Glu Leu Tyr Asp Tyr
65 70 75 80
Gln Thr Leu Asp Tyr Asp Met Met Met Ile Lys Leu Tyr His Pro Val
85 90 95
Glu Val Thr Gln Ser Val Ala Pro Ile Ser Leu Pro Thr Gly Pro Pro
100 105 110
Asp Gly Gly Met Leu Cys Ser Val Ser Gly Trp Gly Asn Met Ala Met
115 120 125
Gly Glu Glu Val Asn Leu Pro Thr Arg Leu Gln Cys Leu Asp Val Pro
130 135 140
Ile Val Glu Pro Val Ala Cys Gln Ala Ser Tyr Pro Gly Met Ile Ser
145 150 155 160
Pro Arg Met Met Cys Val Gly Phe Met Asp Gly Gly Arg Asp Val Cys
165 170 175
Asn Gly Asp Ser Gly Ser Pro Leu Val Cys Glu Gly Val Leu Thr Gly
180 185 190
Leu Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala Glu Pro Asn Ser Pro Gly Val
195 200 205
Tyr Val Lys Val Tyr Glu Phe Leu Ser Trp Ile Gln Thr Thr Leu Asp
210 215 220
Ala Asn Pro
225
<210> 5
<211> 227
<212> PRT
<213> 大西洋鳕鱼
<400> 5
Ile Ile Gly Gly Gln Asp Cys Glu Pro Arg Ser Arg Pro Phe Met Ala
1 5 10 15
Ser Leu Asn Tyr Gly Tyr His Phe Cys Gly Gly Val Leu Ile Asn Asp
20 25 30
Gln Trp Val Leu Ser Val Ala His Cys Trp Tyr Asn Pro Tyr Tyr Met
35 40 45
Gln Val Met Leu Gly Glu His Asp Leu Arg Val Phe Glu Gly Thr Glu
50 55 60
Gln Leu Val Lys Thr Asn Thr Ile Phe Trp His Glu Leu Tyr Asp Tyr
65 70 75 80
Gln Thr Leu Asp Tyr Asp Met Met Met Ile Lys Leu Tyr His Pro Val
85 90 95
Glu Val Thr Gln Ser Val Ala Pro Ile Ser Leu Pro Thr Gly Pro Pro
100 105 110
Asp Gly Gly Met Leu Cys Ser Val Ser Gly Trp Gly Asn Met Ala Met
115 120 125
Gly Glu Glu Val Asn Leu Pro Thr Arg Leu Gln Cys Leu Asp Val Pro
130 135 140
Ile Val Glu Thr Val Asp Cys Glu Ala Ala Tyr Pro Gly Met Ile Ser
145 150 155 160
Pro Arg Met Val Cys Ala Gly Tyr Met Asp Gly Gly Arg Asp Ala Cys
165 170 175
Asn Gly Asp Ser Gly Ser Pro Leu Val Cys Glu Gly Val Leu Thr Gly
180 185 190
Leu Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Leu Pro Asn Tyr Pro Gly Val
195 200 205
Tyr Val Lys Val Tyr Glu Tyr Leu Ser Trp Ile Gln Thr Thr Leu Asp
210 215 220
Ala Asn Pro
225
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 片段1
<400> 6
Ile Ile Gly Gly Gln Asp Cys Glu Pro Arg
1 5 10
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 片段2
<400> 7
Val Phe Glu Gly Thr Glu Gln Leu Val Lys
1 5 10
<210> 8
<211> 25
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 片段3
<400> 8
Leu Gln Cys Leu Asp Val Pro Ile Val Glu Pro Val Ala Cys Gln Ala
1 5 10 15
Ser Tyr Pro Gly Met Ile Ser Pro Arg
20 25
<210> 9
<211> 25
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 片段4
<400> 9
Leu Gln Cys Leu Asp Val Pro Ile Val Glu Thr Val Asp Cys Glu Ala
1 5 10 15
Ala Tyr Pro Gly Met Ile Ser Pro Arg
20 25
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 片段5
<400> 10
Met Val Cys Ala Gly Tyr Met Asp Gly Gly Arg
1 5 10
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 片段6
<400> 11
Met Met Cys Val Gly Phe Met Asp Gly Gly Arg
1 5 10
<210> 12
<211> 13
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 片段7
<400> 12
Gly Cys Ala Glu Pro Asn Ser Pro Gly Val Tyr Val Lys
1 5 10
<210> 13
<211> 25
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 片段8
<400> 13
Asp Val Cys Asn Gly Asp Ser Gly Ser Pro Leu Val Cys Glu Gly Val
1 5 10 15
Leu Thr Gly Leu Val Ser Trp Gly Arg
20 25
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 片段9
<400> 14
Gln Gly Lys Lys Ala Pro
1 5
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 片段10
<400> 15
Trp Gly Asn Arg Ser Pro Leu Glu
1 5
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 片段11
<400> 16
Gln Ala Val Arg Pro Asn Gly Met
1 5
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 片段12
<400> 17
Phe Asp Asn Arg Val Gly Lys Trp
1 5
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 片段13
<400> 18
Ile Ala Arg Gln Pro Trp Asn
1 5
<210> 19
<211> 250
<212> PRT
<213> 大西洋鳕鱼
<400> 19
Met Ile Gly Leu Ala Leu Leu Met Leu Leu Gly Ala Ala Ala Ala Ala
1 5 10 15
Val Pro Arg Asp Val Gly Lys Ile Val Gly Gly His Glu Cys Glu Pro
20 25 30
Asn Ser Arg Pro Phe Met Ala Ser Leu Asn Tyr Gly Tyr His Phe Cys
35 40 45
Gly Gly Val Leu Ile Asn Asp Gln Trp Val Leu Ser Val Ala His Cys
50 55 60
Trp Tyr Asn Pro Tyr Tyr Met Gln Val Met Leu Gly Glu His Asp Leu
65 70 75 80
Arg Val Phe Glu Gly Thr Glu Gln Leu Val Lys Thr Asn Thr Ile Phe
85 90 95
Trp His Glu Leu Tyr Asp Tyr Gln Thr Leu Asp Tyr Asp Met Met Met
100 105 110
Ile Lys Leu Tyr His Pro Val Glu Val Thr Gln Ser Val Ala Pro Ile
115 120 125
Ser Leu Pro Thr Gly Pro Pro Asp Gly Gly Met Leu Cys Ser Val Ser
130 135 140
Gly Trp Gly Asn Met Ala Met Gly Glu Glu Val Asn Leu Pro Thr Arg
145 150 155 160
Leu Gln Cys Leu Asp Val Pro Ile Val Glu Pro Val Ala Cys Gln Ala
165 170 175
Ser Tyr Pro Gly Met Ile Ser Pro Arg Met Met Cys Val Gly Phe Met
180 185 190
Asp Gly Gly Arg Asp Val Cys Asn Gly Asp Ser Gly Ser Pro Leu Val
195 200 205
Cys Glu Gly Val Leu Thr Gly Leu Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala
210 215 220
Glu Pro Asn Ser Pro Gly Val Tyr Val Lys Val Tyr Glu Phe Leu Ser
225 230 235 240
Trp Ile Gln Thr Thr Leu Asp Ala Asn Pro
245 250
<210> 20
<211> 250
<212> PRT
<213> 大西洋鳕鱼
<400> 20
Met Ile Gly Leu Ala Leu Leu Met Leu Leu Gly Ala Ala Ala Ala Ala
1 5 10 15
Val Pro Arg Asp Val Gly Lys Ile Val Gly Gly His Glu Cys Glu Pro
20 25 30
Asn Ser Arg Pro Phe Met Ala Ser Leu Asn Tyr Gly Tyr His Phe Cys
35 40 45
Gly Gly Val Leu Ile Asn Asp Gln Trp Val Leu Ser Val Ala His Cys
50 55 60
Trp Tyr Asn Pro Tyr Tyr Met Gln Val Met Leu Gly Glu His Asp Leu
65 70 75 80
Arg Val Phe Glu Gly Thr Glu Gln Leu Val Lys Thr Asn Thr Ile Phe
85 90 95
Trp His Glu Leu Tyr Asp Tyr Gln Thr Leu Asp Tyr Asp Met Met Met
100 105 110
Ile Lys Leu Tyr His Pro Val Glu Val Thr Gln Ser Val Ala Pro Ile
115 120 125
Ser Leu Pro Thr Gly Pro Pro Asp Gly Gly Met Leu Cys Ser Val Ser
130 135 140
Gly Trp Gly Asn Met Ala Met Gly Glu Glu Val Asn Leu Pro Thr Arg
145 150 155 160
Leu Gln Cys Leu Asp Val Pro Ile Val Glu Thr Val Asp Cys Glu Ala
165 170 175
Ala Tyr Pro Gly Met Ile Ser Pro Arg Met Val Cys Ala Gly Tyr Met
180 185 190
Asp Gly Gly Arg Asp Ala Cys Asn Gly Asp Ser Gly Ser Pro Leu Val
195 200 205
Cys Glu Gly Val Leu Thr Gly Leu Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala
210 215 220
Leu Pro Asn Tyr Pro Gly Val Tyr Val Lys Val Tyr Glu Tyr Leu Ser
225 230 235 240
Trp Ile Gln Thr Thr Leu Asp Ala Asn Pro
245 250
<210> 21
<211> 249
<212> PRT
<213> 大西洋鳕鱼
<400> 21
Met Ile Gly Leu Ala Leu Leu Met Leu Leu Gly Ala Ala Ala Ala Val
1 5 10 15
Pro Arg Glu Asp Gly Arg Ile Ile Gly Gly Gln Asp Cys Glu Pro Arg
20 25 30
Ser Arg Pro Phe Met Ala Ser Leu Asn Tyr Gly Tyr His Phe Cys Gly
35 40 45
Gly Val Leu Ile Asn Asp Gln Trp Val Leu Ser Val Ala His Cys Trp
50 55 60
Tyr Asn Pro Tyr Tyr Met Gln Val Met Leu Gly Glu His Asp Leu Arg
65 70 75 80
Val Phe Glu Gly Thr Glu Gln Leu Val Lys Thr Asn Thr Ile Phe Trp
85 90 95
His Glu Leu Tyr Asp Tyr Gln Thr Leu Asp Tyr Asp Met Met Met Ile
100 105 110
Lys Leu Tyr His Pro Val Glu Val Thr Gln Ser Val Ala Pro Ile Ser
115 120 125
Leu Pro Thr Gly Pro Pro Asp Gly Gly Met Leu Cys Ser Val Ser Gly
130 135 140
Trp Gly Asn Met Ala Met Gly Glu Glu Val Asn Leu Pro Thr Arg Leu
145 150 155 160
Gln Cys Leu Asp Val Pro Ile Val Glu Pro Val Ala Cys Gln Ala Ser
165 170 175
Tyr Pro Gly Met Ile Ser Pro Arg Met Met Cys Val Gly Phe Met Asp
180 185 190
Gly Gly Arg Asp Val Cys Asn Gly Asp Ser Gly Ser Pro Leu Val Cys
195 200 205
Glu Gly Val Leu Thr Gly Leu Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala Glu
210 215 220
Pro Asn Ser Pro Gly Val Tyr Val Lys Val Tyr Glu Phe Leu Ser Trp
225 230 235 240
Ile Gln Thr Thr Leu Asp Ala Asn Pro
245
<210> 22
<211> 249
<212> PRT
<213> 大西洋鳕鱼
<400> 22
Met Ile Gly Leu Ala Leu Leu Met Leu Leu Gly Ala Ala Ala Ala Val
1 5 10 15
Pro Arg Glu Asp Gly Arg Ile Ile Gly Gly Gln Asp Cys Glu Pro Arg
20 25 30
Ser Arg Pro Phe Met Ala Ser Leu Asn Tyr Gly Tyr His Phe Cys Gly
35 40 45
Gly Val Leu Ile Asn Asp Gln Trp Val Leu Ser Val Ala His Cys Trp
50 55 60
Tyr Asn Pro Tyr Tyr Met Gln Val Met Leu Gly Glu His Asp Leu Arg
65 70 75 80
Val Phe Glu Gly Thr Glu Gln Leu Val Lys Thr Asn Thr Ile Phe Trp
85 90 95
His Glu Leu Tyr Asp Tyr Gln Thr Leu Asp Tyr Asp Met Met Met Ile
100 105 110
Lys Leu Tyr His Pro Val Glu Val Thr Gln Ser Val Ala Pro Ile Ser
115 120 125
Leu Pro Thr Gly Pro Pro Asp Gly Gly Met Leu Cys Ser Val Ser Gly
130 135 140
Trp Gly Asn Met Ala Met Gly Glu Glu Val Asn Leu Pro Thr Arg Leu
145 150 155 160
Gln Cys Leu Asp Val Pro Ile Val Glu Thr Val Asp Cys Glu Ala Ala
165 170 175
Tyr Pro Gly Met Ile Ser Pro Arg Met Val Cys Ala Gly Tyr Met Asp
180 185 190
Gly Gly Arg Asp Ala Cys Asn Gly Asp Ser Gly Ser Pro Leu Val Cys
195 200 205
Glu Gly Val Leu Thr Gly Leu Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Leu
210 215 220
Pro Asn Tyr Pro Gly Val Tyr Val Lys Val Tyr Glu Tyr Leu Ser Trp
225 230 235 240
Ile Gln Thr Thr Leu Asp Ala Asn Pro
245
<210> 23
<211> 12
<212> PRT
<213> 大西洋鳕鱼
<400> 23
Cys Val Leu Ser Gly Trp Val Arg Asp Thr Met Ala
1 5 10

Claims (25)

1.一种经分离的鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物，包含根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有80％或更高的序列同源性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的经分离的鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物，选自鳕鱼胰蛋白酶ZT-1，包含根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列；鳕鱼胰蛋白酶ZT-2，包含根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列；鳕鱼胰蛋白酶ZT-3，包含根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列；以及鳕鱼胰蛋白酶ZT-4，包含根据SEQ ID NO：5的氨基酸序列，或与这些氨基酸序列具有80％或更高的序列同源性的氨基酸序列。
3.一种组合物，包含至少一种根据权利要求1或2所述的鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物，以及适合的赋形剂和载剂。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物以与其它鳕鱼胰蛋白酶的混杂物形式存在。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物占所述组合物中鳕鱼胰蛋白酶的总含量的至少5％(w/w)。
6.根据权利要求3到5中任一权利要求所述的组合物，其是以洗剂、水凝胶、口腔喷雾或鼻用喷雾形式局部给予。
7.根据权利要求3到6中任一权利要求所述的组合物，进一步包含多价醇，如甘油。
8.根据权利要求3到7中任一权利要求所述的组合物，其用于疗法。
9.根据权利要求3到7中任一权利要求所述的组合物，其用于治疗或预防由选自以下组成的组的病原性生物体引起的疾病：病毒、细菌、真菌、寄生虫以及原虫。
10.根据权利要求3到7中任一权利要求所述的组合物，其用于治疗或预防由如病毒、细菌以及真菌等病原性生物体引起的上呼吸道疾病。
11.根据权利要求3到7中任一权利要求所述的组合物，其用于治疗或预防疼痛；急性炎症；慢性炎症；关节炎；关节发炎；滑囊炎；骨关节炎；类风湿性关节炎；青少年类风湿性关节炎；败血性关节炎；肌肉纤维疼痛；全身性红斑性狼疮症；静脉炎；肌腱炎；皮疹；牛皮癣；痤疮；湿疹；脸部脂溢性湿疹；手部、脸部或颈部湿疹；包皮感染；足癣；瘘感染；局部溃疡感染；新生儿中的脐部感染；皱纹；疤痕；瘢痕瘤；疖；疣以及过敏性瘙痒；痔疮；真菌感染和免疫病症，包括自体免疫疾病。
12.根据权利要求3到7中任一权利要求所述的组合物，其用于治疗伤口感染和烧伤伤口。
13.根据权利要求3到7中任一权利要求所述的组合物，其用于从其它健康皮肤去除坏死或脱落的皮肤。
14.根据权利要求3到7中任一权利要求所述的组合物，其用于化妆品用途。
15.根据权利要求14所述的用于化妆品用途的组合物，所述组合物进一步包含其它化妆学上的活性化合物。
16.一种治疗疾病的方法，包含给予有需要的患者治疗有效量的根据权利要求3到7中任一权利要求所述的组合物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述疾病是由选自以下组成的组的病原性生物体引起：病毒、细菌、真菌、寄生虫以及原虫。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述疾病是由如病毒和细菌等病原性生物体引起的上呼吸道疾病。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述疾病选自疼痛；急性炎症；慢性炎症；关节炎；关节发炎；滑囊炎；骨关节炎；类风湿性关节炎；青少年类风湿性关节炎；败血性关节炎；肌肉纤维疼痛；全身性红斑性狼疮症；静脉炎；肌腱炎；皮疹；牛皮癣；痤疮；湿疹；脸部脂溢性湿疹；手部、脸部或颈部湿疹；包皮感染；足癣；瘘感染；局部溃疡感染；新生儿中的脐部感染；皱纹；疤痕；瘢痕瘤；疖；疣以及过敏性瘙痒；痔疮；真菌感染和免疫病症，包括自体免疫疾病。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述疾病是伤口感染或烧伤伤口。
21.一种制备包含根据SEQ ID NO：2到SEQ ID NO：5中的任一个的氨基酸序列的鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物的方法，包含
(i)制备鳕鱼内脏的水性提取物，
(ii)使所述水性提取物经历至少一个或色谱步骤，包括使用对氨基苯甲脒亲和配位体进行的亲和色谱步骤，和
(iii)解吸附和洗提与所述对氨基苯甲脒亲和配位体结合的鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物。
22.根据权利要求21所述的方法，进一步包含至少一个在所述亲和色谱步骤(ii)之后使用阴离子交换树脂的步骤。
23.根据权利要求21所述的方法，进一步包含至少一个在所述亲和色谱步骤(ii)之前使用阳离子交换树脂的步骤。
24.根据权利要求21到23中任一权利要求所述的方法，其中使用具有0.45μm或更小的孔径的过滤器无菌过滤所述经解吸附和洗提的鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物。
25.根据权利要求21到24中任一权利要求所述的方法，其中所述鳕鱼胰蛋白酶ZT同功异型物选自胰蛋白酶ZT-1，包含根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列；胰蛋白酶ZT-2，包含根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列；胰蛋白酶ZT-3，包含根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列；以及胰蛋白酶ZT-4，包含根据SEQ ID NO：5的氨基酸序列，或其混合物。
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