CN104356219B - 一种印鼠客蚤抗心律失常的多肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种印鼠客蚤抗心律失常多肽，该多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列。本发明所述多肽由以下方法制备得：原核表达印鼠客蚤抗心律失常多肽，然后采用四步柱层析分离纯化后得到。本发明的印鼠客蚤抗心律失常多肽具有特异性抑制Nav1.5钠离子通道和能解救BaCl₂诱导的心律失常作用及无溶血活性的优点，可作为制备抗心律失常的药物和研究离子通道结构与功能关系的工具试剂。

Description

一种印鼠客蚤抗心律失常的多肽及其制备方法

技术领域：

本发明涉及具有多于20个氨基酸的肽，具体涉及一种从动物组织得到的蛋白，该蛋白具有抗心律失常作用。

背景技术：

心律失常是指心博频率和节律的异常。其发生率和致死率随着我国心血管疾病发病率的增加而日益增长，一些抗心律失常药，如奎尼丁、普鲁卡胺、利多卡因、氟卡尼却有致心律失常作用、金鸡纳反应、血管神经性水肿、血小板减少等不良反应。因此，寻找疗效确定但无明显心脏副作用的抗心律失常新药成为研究的焦点。

有毒动物，如蝎、蛇、蜘蛛、蟾蜍、蜈蚣等的毒素是我国传统医药中治疗疑难杂症重要源泉。动物多肽毒素已成为全球研发/治疗相关疾病药物的重要资源。目前许多国内外科研工作者从动物多肽毒素中研发了治疗疼痛与心血管相关疾病的重要药物，例如，中国科学院、军事医学科学院、湖南师范大学等单位的研究人员分别从眼镜蛇、芋螺、蜘蛛的毒素中发现的cobra toxin、SO-3和HWAP-I作为镇痛药物被广泛应用于临床(Expert Opin BiolTher.2011,11(11):1469-84)；而美国FDA已批准来源于蜥蜴和芋螺毒素的Exenatide和Ziconotide用于临床(Methods Find Exp Clin Pharmacol.2009，31(7):463-93)。另外，上海大学相关实验室针对东亚钳蝎多肽毒素的系统动物疼痛或镇痛行为模型研究表明我国蝎毒中含有多种致痛/镇痛或癫痫/抗癫痫的膜钠或钾通道活性成份(J Neurooncol,2005,73(1):53-56；J Clin Oncol.2006,24(22):3644-3650)。因此，动物毒素将是研发新药的有效途径。

我国对蝎、蛇、蜘蛛、蟾蜍、蜈蚣等的毒素的药用研究有悠久的历史，但对跳蚤等吸血节肢动物体内药理活性组分研究不多。吸血节肢动物通常需要在生命周期内的一定时期吸血以完成生命循环。在长期的吸血进化过程中，吸血节肢动物在其唾液内形成了众多的药理活性物质以克服宿主的防御。如，牛虻的唾液腺中含有许多血小板聚集抑制因子、抗血浆凝集因子、血管舒张剂和免疫调节肽等。因此牛虻成为活血化瘀中药材(Mol CellProteomics.2008,7(3):582-90)。

印鼠客蚤(Xenopsyla cheopis)是我国常见的吸血昆虫，分布于除新疆、西藏和宁夏外的广大地区。它们只有从小家鼠、褐家鼠、黄胸鼠和人身上吸血后才能产卵完成生命周期。

发明人将本发明的印鼠客蚤抗心律失常多肽在pubmed数据库进行搜寻比较，未发现有任何关于该蛋白功能的报道。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是提供一种印鼠客蚤抗心律失常的多肽，该多肽具有特异性强，疗效好和制作成本低的优点。

本发明解决上述技术问题的方案如下：

一种印鼠客蚤抗心律失常多肽，该多肽的氨基酸序列为MWKVSERCIKGHGKFQADQELGNGLATAKGQCKGTDSDQKKAGKCDKHCTGVCIGSGGSCGDGSSQKPNKEDCYCKSK(SEQ ID NO：1)

上述印鼠客蚤抗心律失常多肽的分子量为8200.3道尔顿，等电点为8.472。

本发明所述的印鼠客蚤抗心律失常多肽是利用从吸血的印鼠客蚤唾液腺基因重组表达得到，其具体制备方法由以下步骤组成：

(1)提取印鼠客蚤唾液腺总mRNA，并采用SEQ ID NO：2所示的上游引物和SEQ IDNO：3所示的下游引物扩增编码SEQ ID NO：4所示的印鼠客蚤抗心律失常多肽的基因，然后先将该基因克隆到pET-17b表达载体中，再转化到BL₂₁(DE₃)pLysS大肠杆菌中重组表达，并收集目的条带在6-14kDa间的蛋白；

(2)将所收集的上清透析后依次上Hiprep SP阳离子交换色谱柱、Sephadex SR-100凝胶过滤柱、Hiprep SP阳离子交换色谱柱和Sephadex G75凝胶过滤柱层析，得到如SEQID NO：1所示的印鼠客蚤唾液腺基因重组表达蛋白，即印鼠客蚤抗心律失常多肽。

本发明所述的印鼠客蚤抗心律失常多肽能特异性抑制Nav1.5钠离子通道，IC₅₀是1.5μM，在体内能治疗BaCl₂诱导的心律失常，且无毒副作用。

附图说明：

图1为本发明印鼠客蚤抗心律失常多肽大肠杆菌表达电泳图，图中，箭头所示为目的蛋白，带1为不加阴性菌对照，带2、3为阳性菌诱导结果。带4为蛋白质标准。

图2为本发明印鼠客蚤抗心律失常多肽的分离纯化图，图中，箭头所示为目的峰，A、B、C和D分别是利用Hiprep SP阳离子交换、Sephadex SR-100凝胶过滤、Hiprep SP阳离子交换和Sephadex G75凝胶过滤色谱柱层析后得到的图，图2D中电泳图是Sephadex G75凝胶过滤层析后得到的纯蛋白电泳结果，图中条带为目的蛋白，其被转膜用于N末端测序。

图3为本发明印鼠客蚤抗心律失常多肽膜片钳分析结果图，其中，图3-1为多肽抑制Nav1.5钠离子通道，其中，图3-1中A图为多肽抑制Nav1.5钠离子通道；图3-1中B图为多肽抑制Nav1.5钠离子通道的IC₅₀曲线；图3-1中C图为多肽抑制Nav1.5钠离子通道的洗脱曲线；图3-1中D图为多肽抑制Nav1.5钠离子通道的电流-电压曲线；

图3-2为多肽对大鼠DRG细胞上的钠、钙和钾离子通道的作用，其中，图3-2中A图为多肽对大鼠DRG细胞上TTX-R钠离子通道的作用；图3-2中B图为多肽对大鼠DRG细胞 上TTX-S钠离子通道的作用；图3-2中C图为多肽对大鼠DRG细胞上钙离子通道的作用；图3-2中D图为多肽对大鼠DRG细胞上钾离子通道的作用；

图3-3为多肽对不同钾离子亚型的抑制情况，其中，图3-3中A-E图分别为多肽对Kv1.1、Kv2.1、Kv2.2、Kv4.1和Kv4.2的作用。

图4为本发明印鼠客蚤抗心律失常多肽对BaCl₂诱导的心律失调救援前后的典型心电图，从上到下一次为0.1mg/100g BaCl₂注射前大鼠典型心律图、0.1mg/100g BaCl₂注射后大鼠典型心律图、0.1mg/100g BaCl₂注射后0.5mg/100g FS50解救大鼠典型心律图和0.1mg/100gBaCl₂注射后1.5mg/100g利多卡因解救大鼠典型心律图。

具体实施方式：

印鼠客蚤抗心律失常多肽注射液的制备：

一)印鼠客蚤抗心律失常多肽基因克隆：

I、印鼠客蚤唾液腺总RNA提取：

A.活体印鼠客蚤放在冰上30-60min冰冻麻醉，在显微镜下解剖50只印鼠客蚤得到唾液腺，加入1mL总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国GIBCOBRL公司产品)，于5m1玻璃匀浆器中匀浆1分钟。

B.加入等体积酚/氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置1分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。

C.上清加入等体积的异丙醇，室温放置4分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为印鼠客蚤唾液腺总RNA。

II、印鼠客蚤唾液腺mRNA的纯化：

印鼠客蚤唾液腺mRNA分离纯化采用美国PROMEGA公司的mRNAIsolation Systems试剂盒。

A.取印鼠客蚤唾液腺总RNA 500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分钟，加人3μl的Oligo(dT)探针和13μl 20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。

B.磁珠(SA-PMP)的洗涤：将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5×SSC 0.3m1，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml 0.5×SSC悬浮，称之为B液。

C.将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次，最后弃上清，加0.l ml DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入0.15m1DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，则上清中为纯化的印鼠客蚤唾液腺mRNA。

D.加入1/10体积3M乙酸钠，pH 5.2，等体积异丙醇，于-70℃放置30分钟，4℃，12000 rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。

III、印鼠客蚤唾液腺总cDNA扩增：

采用CLONTECH公司Creator^TM SMART ^TM cDNA Library Construction Kit质粒cDNA文库构建试剂盒扩增。

A.cDNA第一链合成(mRNA反转录)：

1.在0.5ml无菌的离心管加入1μl印鼠客蚤唾液腺mRNA、1μl SMART IV寡聚核苷酸、1μl CDS III/3’PCR引物，加2μl去离子水使总体积达到5μl。

2.混匀离心管中的试剂并以12000rpm离心15秒，72℃保温2分钟。

3.将离心管在冰上孵育2分钟。

4.在离心管中加入2.0μl 5×第一链缓冲、1.0μl 20mM二硫苏糖醇、1.0μl 10mMdNTP混合物、1.0μl PowerScript反转录酶。

5.混合离心管中试剂并以12000rpm离心15秒，在42℃保温1小时。

6.将离心管置于冰上中止第一链的合成。

7.从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。

B.采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链

1.95℃预热PCR仪。

2.将2μl cDNA第一链(mRNA反转录)、80μl去离子水、10μl 10×Advantage2PCR缓冲、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大肠杆菌聚合酶离心管进行反应。

3.在PCR仪中按以下程序扩增：①95℃，20秒钟；②22个循环：95℃，5秒钟；68℃，6分钟

4.循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链进行抽提。

C.PCR产物用PROMEGA公司的SV Gel and PCR Clean-Up System试剂盒进行抽提回收，步骤如下：

1.将通过PCR得到的cDNA双链加入等体积的膜结合缓冲颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱，室温静置5分钟，使DNA充分与硅胶膜结合。以12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。

2.加入700μl的洗脱液(含乙醇)于离心纯化柱中，以12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。

3.重复步骤2，12000rpm离心5分钟。

4.将离心纯化柱置于新的离心管中，加入30μl超纯水，在室温下静置5分钟，以12000 rpm离心30秒，管底溶液即为所纯化过的印鼠客蚤唾液腺总cDNA。

Ⅳ、印鼠客蚤唾液腺抗心律失常多肽基因的克隆：

依据报道的印鼠客蚤唾液腺核苷酸序列(GenBank:EF179446.1)为参考设计引物，正向引物序列为5’GGCATATGTGGAAAGTCAGTGAGAG 3’(SEQ ID NO：2)，反向引物序列为5’CCCTCGAGTTATTTTGATTTACAATAAC 3’(SEQ ID NO：3)。以100倍稀释纯化过的印鼠客蚤唾液腺总cDNA为模板扩增印鼠客蚤唾液腺抗心律失常多肽的基因。PCR反应程序为：①95℃，4分钟；②35个循环：94℃，30秒钟；56℃，30秒钟；72℃，45秒钟；③72℃，10分钟。将扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳，切取目的条带，用DNA纯化试剂盒进行纯化。将纯化的目的片段连接到pMD19-T载体中，即得连接产物。将连接产物转化进Takara公司的大肠杆菌DH5α感受态细胞。取适量转化产物涂布至含Amp的LB平板上，经37℃培养16小时形成的单菌落即为含目的基因的阳性克隆，提取质粒酶切鉴定并送到英伟创津公司测序。测序结果显示基因自5’端至3’端序列为(SEQ ID NO：4):

catatgtggaaagtcagtgagagatgtattaaaggacacggaaaattccaagcagatcaagaactgggcaatggcttagctacggcaaagggtcaatgcaaaggtacagatagtgaccaaaagaaggcaggcaagtgtgataagcactgcacaggcgtttgtattggaagtggcggtagttgtggagatggttcctctcaaaaaccaaataaagaagattgttattgtaaatcaaaataactcgag

E.印鼠客蚤抗心律失常多肽的基因克隆到pET-17b表达载体：

1.在微量离心管中加入1μg含抗心律失常多肽基因的pMD19-T载体、2μl H缓冲液，0.5μl Nde Ⅰ和0.5μl Xhol Ⅰ限制性内切酶，加入水致使最终体积为20μl；1μg pET-17b质粒采用同样的酶切体系。酶切条件为：37℃反应2小时；

2.将酶切产物分别用1％琼脂糖凝胶电泳，切取目的条带，用DNA纯化试剂盒进行纯化。

3.将纯化的目的片段按照摩尔3:1(多肽基因：pET-17b载体)的比例混合加入到等量的连接酶缓冲液混合物中进行连接。连接调节为16℃反应8小时；

4.将连接产物转化进Takara公司的大肠杆菌DH5α感受态细胞。取适量转化产物涂布至含Amp的LB平板上，经37℃培养16小时形成的单菌落即为含目的片段的阳性克隆进行酶切和测序鉴定。

二)印鼠客蚤抗心律失常多肽的大肠杆菌表达：

将含印鼠客蚤抗心律失常多肽的基因的表达载体质粒化学转化到BL21(DE3)pLysS大肠杆菌中重组表达，1L LB培养基中接入10ml过夜培养种子菌液，37℃培养3小时，当细菌吸光值OD₆₀₀达到0.8左右时加入IPTG终浓度为1mM，继续培养3小时，8000rpm 10分钟离心收集菌体，用100ml pH 8.0的25mM Tris-HCl溶液悬浮沉淀，然后离心8000rpm离心10分钟收集菌体，去掉上清，向沉淀中加入40ml pH 8.0的25mM Tris-HCl溶液，4℃超声 波破碎细胞，超30s停30s连续4次，然后12000rpm离心30分钟收集上清，用3kDa透析袋透析，在10L pH 6.0的PBS溶液中透析24小时。SDS-PAGE检测蛋白的表达，得到图1，目的条带应该在9kDa附近。

三)印鼠客蚤抗心律失常多肽大肠杆菌表达产物的分离纯化：

第一步，Hiprep SP阳离子交换色谱柱层析。按上述方法透析印鼠客蚤抗心律失常多肽的大肠杆菌表达产物后14000rpm 4℃离心60min去除沉淀，上清液上样于GE公司的Hiprep SP阳离子交换色谱柱。Hiprep SP阳离子交换色谱柱用20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH6.0的缓冲液平衡，用含1M NaCl的同样缓冲液从0％至100％的线性梯度洗脱得到图2A，收集如图所示活性峰。

第二步，Sephadex SR-100凝胶过滤柱层析。Hiprep SP阳离子交换色谱柱层析得到的活性峰经3kDa超滤管浓缩后上样于25mM Tris-HCl 0.15M NaCl pH 8.0的溶液平衡的Sephadex SR-100凝胶过滤柱。用同样缓冲液洗脱得到图2B，收集如图所示活性峰。

第三步，Hiprep SP阳离子交换色谱柱层析。GE公司的Hiprep SP阳离子交换色谱柱用20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH 6.0的缓冲液平衡。第二步得到的活性峰用超滤管更换缓冲液为20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH 6.0后上样于Hiprep SP阳离子交换色谱柱。用含1M NaCl的同样缓冲液从0％至100％的线性梯度洗脱得到图2C，收集如图所示活性峰。

第四步，Sephadex G75凝胶过滤柱层析。第三步得到的活性峰经3kDa超滤管浓缩后上样于生理盐水或PBS平衡的Sephadex G75凝胶过滤层析柱。用同样缓冲液洗脱得到图2D，收集如图所示活性峰。

第五步，纯化得到的印鼠客蚤抗心律失常多肽电泳后得到图2D电泳图，然后切胶用自动氨基酸测序仪测定N末端氨基酸序列。

通过上述方法制备的印鼠客蚤抗心律失常多肽是利用印鼠客蚤唾液腺基因重组表达的一种多肽，分子量为8200.3道尔顿，等电点为8.472，具体序列如SEQ ID NO：1所示。

四)印鼠客蚤抗心律失常多肽注射液制备：

(1)取纯化鉴定的印鼠客蚤抗心律失常多肽纯品经3kDa超滤管浓缩后将缓冲液更换为生理盐水或PH值7～8的PBS缓冲液，采用Lowry氏法测定印鼠客蚤抗心律失常多肽含量，调整浓度为10mg/ml注射液母液，分装、-20℃保存。

(2)向注射液母液中加入终浓度为1％的Triton X-114立即剧烈振荡混匀冰育10min后，20℃孵育10min，10000g室温离心10分钟，于超净工作台内小心吸取上清液至无热源器皿中，经鲎试剂检测内毒素小于10EU/mL后将注射液母液调整浓度回10mg/ml待用。

(3)去内毒素的10mg/ml注射液母液用生理盐水或pH值7～8的PBS缓冲稀释成0.5mg/ml的使用液后过滤除菌，-20℃保存分装待用。

印鼠客蚤抗心律失常多肽注射液的药理学效果证实：

一)印鼠客蚤抗心律失常多肽注射液对Nav1.5钠离子通道的抑制作用

1)膜片钳分析印鼠客蚤抗心律失常多肽注射液对大鼠背根神经元的作用

挑选出生4周左右、体重约140～200g的SD大鼠，麻醉后断颈处死，迅速挑出脊椎并将其剪成2～4段，将椎管沿与肋骨垂直的方向剪开，然后在盛有少量培养液的烧杯中浸泡椎管；仔细撕破附在椎管内壁上的无色黏膜，暴露椎管和肋骨交汇处的背根神经纤维。在胸椎和腰椎部分，挑选10～15个较好的背根神经节放入装有2mL临时培养液的培养皿中。分离出神经节以及神经纤维后，用维娜斯剪切除神经节外的絮状物和轴索，放入盛有约0.5mL临时培养液的培养皿中。倒去临时培养液，用维娜斯剪将分离的神经节剪碎。然后将剪碎后神经细胞转入含有15mL消化液的指管中，在34℃下、110rpm的环境中用消化液酶解20～30min。酶解期间每隔8～10min取出指管吹打细胞以防止细胞成团；酶解终止后向消化液中加入胰蛋白酶抑制剂，终止酶解反应。将酶解后的溶液转入离心管中离心(1000rpm、2-5min)，去除上清。用含10％小牛血清的培养液重悬细胞，重悬后的细胞分成3～4皿，每皿加入2mL培养液，放入37℃恒温培养箱(5％CO₂、95％空气)中，培养3～4小时后用于记录电流。

实验前必须将细胞外液置于室温下平衡后再更换培养皿内的培养液，以防止溶液温度的剧烈变化。更换溶液时要防止细胞从培养皿底部脱落。倒置显微镜下选择细胞膜较为光滑、细胞质均匀的细胞，在室温20～25℃条件下进行膜片钳实验。选用100μl硼硅酸盐玻璃毛细管为玻璃电极材料，玻璃电极在拉制仪(PC-10，Narishige)上经两步拉制而成，玻璃电极热抛光后电极尖端口径为1.5～3.0μm，拉制完成后在玻璃电极内灌细胞内液。玻璃电极初始电阻为1.5～2.5MΩ比较好。待电极与细胞膜之间形成高阻抗的京欧(GΩ)封接后，补电极快电容。然后将细胞钳制在-60mV，给予一短而有力的负压，将钳制在电极中的细胞膜迅速打破，再补偿细胞慢电容。形成全细胞记录模式后将细胞钳制为-80mV，细胞稳定4～6min开始记录电流。Ca²⁺、Na⁺和K⁺电流被记录用全细胞膜片钳模式，用EPC-10放大器(HEKA,Lambrecht/Pfalz,德国)，P/4实验方法被运用减去线性电容和漏电电流。实验数据用(version8.31；HEKA)脉冲程序获取和用Sigmaplot(Sigma)分析。

2)膜片钳分析印鼠客蚤抗心律失常多肽注射液对表达离子通道细胞系的作用

脂质体将离子通道质粒和绿色荧光蛋白质粒共转染进HEK 293细胞，细胞用含10％胎牛血清的DMEM中在5％CO₂，37℃条件下培养。将1.7mm软质玻璃毛坯(VWR,WestChester,PA)用P-97拉制仪拉制抛光后形成电极尖端口径为1.5～2.0μm玻璃电极。膜片钳分析多肽对Nav1.5钠通道作用的离子通道内外液分别为：140mM CsF,1mM EGTA,10mMNaCl,10mM HEPES,pH 7.3溶液和140mM NaCl,3mM KCl,1mM MgCl₂,1mM CaCl₂,10mM HEPES,pH7.3溶液。将附有细胞的载玻片加入到灌流槽中，放在倒置显微镜工作台上，用含100％饱和氧细胞外液灌流装置灌流，选取纹理清晰，表面无颗粒，无收缩的细胞作为实验对象。钳制电极充灌细胞内液后用注射器加入少许正压，使得电极尖端形成一向外凸的液面以便有助于电极入水时保持干净。在液面上选择干净处让电极入水，在入水后所测电阻为0.8-1.4MΩ时补偿消除电极液与细胞外液之间的液结电位。当调动微操让电极不断靠近细胞时，电极电阻会逐渐增大，当增大0.2MΩ时，停止电极继续靠近细胞并释放正压，然后轻轻给予一定负压，电极与细胞膜之间就可形成京欧封接。补偿快电容并吸破细胞膜形成全细胞记录模式。形成全细胞记录模式后，-100mV稳定5min，让电极内液和细胞膜内成分之间相互平衡，再把细胞电位改钳制为-80mV。调节慢电容补偿和串联电阻补偿以减少瞬时充放电流和钳制电位误差，系统串联电阻一般补偿在30～60％之间。实验过程中系统电阻始终保持在5～10MΩ的范围之内。记录电流信号经EPC-10膜片钳放大器以3kHz和10kHZ双重滤波过滤。线性漏电流和电容电流用P/4程序予以删除。实验数据用(version 8.31；HEKA)脉冲程序获取和用Sigmaplot分析。由图3可见，印鼠客蚤抗心律失常多肽能特异性抑制Nav1.5钠离子通道。

二)印鼠客蚤抗心律失常多肽注射液体内抗心律失常效果

取大鼠27只标记称重，随机分成生理盐水对照组、利多卡因实验组(1.5mg/100g)、印鼠客蚤抗心律失常多肽注射液组(0.5mg/100g)，每组9只。所有药物均用生理盐水配制，大鼠腹腔注射10％水合氯醛0.3ml/100g,待麻醉后仰卧固定，四肢联接导联电极，采集正常心电图舌下静脉注射0.1ml/100g的0.1％BaCl₂，观察3min后，待BaCl₂引起明显的心律失常，分别静脉注射待试药物或等量生理盐水快速推注，继续观察心电图的变化，并持续60min以上。

结果：通过上述实验我们得到本发明印鼠客蚤抗心律失常多肽对BaCl₂诱导的心律失调救援前后的典型心电图(图4)。生理盐水组注射BaCl₂后立即出现典型室性心律失常，持续60min以上。与生理盐水组比，利多卡因和印鼠客蚤抗心律失常多肽均可立即纠正心律失常(P<0.05)，但利多卡因的效果要强于印鼠客蚤抗心律失常多肽，利多卡因大鼠比多肽组出现心率失常要晚，持续时间要长。

表1.利多卡因和印鼠客蚤抗心律失常多肽对BaCl₂引起的室性心律失常的治疗作用(min)

注：*对照组与空白组比，P<0.05；**药物组与空白组及对照组比，P<0.01 。

Claims (2)

1.氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的印鼠客蚤多肽在制备抗心律失常的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的印鼠客蚤多肽由以下方法制得：

(1)提取印鼠客蚤唾液腺总mRNA，并采用SEQ ID NO：2所示的上游引物和SEQ ID NO：3所示的下游引物扩增编码SEQ ID NO：4所示的印鼠客蚤抗心律失常的基因，然后先将该基因克隆到pET-17b表达载体中，再转化到BL21(DE3)pLysS大肠杆菌中重组表达，并收集目的条带在6-14kDa间的蛋白；

(2)将所收集的上清透析后依次上Hiprep SP阳离子交换色谱柱、Sephadex SR-100凝胶过滤柱、Hiprep SP阳离子交换色谱柱和Sephadex G75凝胶过滤柱层析，得到如SEQ IDNO：1所示的印鼠客蚤唾液腺基因重组表达蛋白，即印鼠客蚤抗心律失常多肽。