CN1978466A - 转导肽－人脑源性神经营养因子融合蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及转导肽－人脑源性神经营养因子融合蛋白，以及编码该融合蛋白的核酸。本申请也涉及所述融合蛋白的原核可溶性表达方法。本申请也提供含有所述转导肽－人脑源性神经营养因子融合蛋白的药物组合物，所述组合物可以用于治疗神经退行性疾病，糖尿病，治疗脑损伤、听神经视神经损伤以及镇痛。

Description

转导肽-人脑源性神经营养因子融合蛋白及其应用

技术领域：

本发明涉及基因工程和药学领域。具体地，本发明提供了转导肽-人脑源性神经营养因子融合蛋白，以及编码该融合蛋白的核酸。本申请也提供所述融合蛋白的原核可溶性表达方法。本发明还提供含有所述转导肽-人脑源性神经营养因子融合蛋白的药物组合物，所述组合物可以用于治疗神经退行性疾病，糖尿病，治疗脑损伤、听神经视神经损伤以及镇痛。

背景情况：

1982年德国学者Barde YA等从猪的大脑中分离出脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)，其具有促进背根神经节细胞生存的功能。人BDNF基因位于11号染色体，基因全长744bp，成熟段基因全长为360bp。BDNF前体蛋白由252个氨基酸组成，分子量约为30kD，经加工后形成119个氨基酸残基的成熟蛋白，分子量约为14kD。等电点为9.99。BDNF广泛地存在于中枢神经系统和外周组织，尤以上丘脑、大脑皮层和海马部位表达最高。它通过与酪氨酸蛋白激酶受体trKB结合引起trKB同源二聚体形成，激活酪氨酸激酶，受体自身酪氨酸残基磷酸化，从而导致一系列级联反应将信号传递到胞内而发挥生物学作用。BDNF能促进各种神经元的生长及存活，包括海马神经元，皮层神经元等，并促进神经修复和再生，减少神经元的正常死亡以及学习记忆能力的下降。神经营养因子均不能通过血脑屏障，从而限制了静脉给药途径，这是临床应用神经营养因子的一大障碍。目前开展的一些细胞移植和基因治疗方面的研究虽然在动物实验中取得了一些进展，由于这些治疗方案都采取手术和脑室注射等创伤性手段，离临床应用尚有很大的距离。

1.BDNF与疾病

1.1 BDNF与神经退行性病变(Neurodegenerative Diseases)

神经退行性病变的发生与神经营养因子供应不足密切相关，这是BDNF治疗神经退行性疾病的理论基础。阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种渐进性中枢神经系统退行性疾病，主要症状为进行性记忆力和认知力减退、言语障碍、精神运动异常等症状，病情呈进行性加重，逐渐丧失独立生活能力，发病后多因并发症而死亡。中国阿尔茨海默病协会2001年报道我国痴呆患者已有500万人，已占世界总病例数的1/4，每年平均还有30万老年人加入这个行列，阿尔茨海默病已成为威胁中国老年人健康的重要问题。所以寻找治疗和预防AD的药物具有重要意义。AD早期最主要的症状是胆碱能功能缺乏。目前治疗AD的药物主要为抗胆碱能胆碱能药物，只能缓解其症状。BDNF缺乏可以导致学习和记忆障碍，与AD的发病密切相关。BDNF能够提高AD患者脑区主要受损的几类神经元功能和存活率，例如海马、皮质和基底前脑的胆碱能神经元、多巴胺能、5-羟色胺能及含神经肽神经元。

帕金森病(Parkinson)是多发生于中老年人群的中枢神经变性疾病。黑质，苍白球区的多巴胺能神经元的变性、缺失，导致脑内多巴胺能神经递质相对减少，患者表现为震颤、肌强直及运动减少。多巴胺能神经元丧失和神经递质相对发生变化是帕金森病主要发病原因。BDNF能增加多巴胺能神经元数目，增加多巴胺释放及保护神经元。BDNF还对黑质退行性病变、多系统萎缩症和亨延顿(Huntington)舞蹈症、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、脊髓性肌萎缩(SMA)和灰质炎后综合症等有治疗作用。

1.2 BDNF与缺血性脑损伤

BDNF对不同脑损伤均有保护作用。体外实验结果表明，BDNF能减轻低糖低氧导致的神经元损伤。动物实验结果也表明，BDNF可抵抗海马区缺血细胞死亡，大脑中动脉闭塞，在缺血前和缺血后持续向脑室内注入BDNF均可使梗死体积缩小并可改善神经功能评分。局灶性脑缺血后脑室内注入BDNF对神经元同样具有神经保护作用。

1.3 BDNF的其它作用

BDNF能通过5-HT能神经元和阿片能神经元产生镇痛作用，长期给予不形成耐受，作用持久而稳定。它对听神经视神经也有一定保护作用。

2.重组人BDNF的研究现状

BDNF在人体内自然产量极低，依靠提取及纯化天然BDNF的方法达不到应用的需求，基因工程是获得大量高纯度BDNF的可靠手段。目前，外源基因表达主要有真核表达系统和原核表达系统。真核表达系统如酵母表达系统等对外源蛋白能进行翻译后修饰，构象和生物学活性较为接近天然蛋白，但由于真核表达系统生产条件要求严格，成本很高，产量低，而且存在过度糖基化，应用到人体容易产生免疫原性。目前大多数商业生产的目的基因都是在原核表达系统大肠杆菌中表达。大肠杆菌的遗传学背景和分子生物学和生理生化等研究较为清楚，大多数目的基因能迅速而高效的表达，且培养条件简单，费用低廉，容易工业生产，目前得到了广泛的应用。但是大部分大肠杆菌表达产物为难溶的包涵体，包涵体一般没有生物学活性，复性困难且工艺复杂，大大增加了工业化生产难度和成本。BDNF在大肠杆菌中的表达产物大部分为包涵体，国外学者用大肠杆菌表达BDNF，经纯化复性后得率约为180μg/L菌液。国内也有报道利用大肠杆菌表达BDNF，产物为包涵体，复性后得率较低。最近有人用硫氧还蛋白基因偶联表达的大肠杆菌表达载体得到部分可溶的重组BDNF，但是可溶部分只占全菌蛋白的15％，产量较低，而且纯化工艺较复杂，不利于工业化生产。

3.BDNF与血脑屏障

血脑屏障(BBB)是存在于血液和脑组织之间的屏障系统，由毛细血管内皮细胞、内皮细胞紧密连接、星形细胞、神经胶质细胞和基膜组成。它们当中毛细血管内皮细胞与细胞间的紧密连接是BBB的基本构成成分。在正常生理情况下只允许气体分子及相对质量小于0.6kD的脂溶性小分子通过。从神经生长因子发现以来，神经营养因子(NTFs)已有20余种。但半个世纪以来，由于血脑屏障的作用，NTFs的临床应用仍很有限。目前临床上仍缺乏一条合理有效的中枢给药途径。已报道的给药途径主要包括外周系统给药、大脑实质直接注射、侧脑室给药、鞘内注射及经鼻给药几种。外周给药，创伤性小，但受到BBB的严重影响，进入大脑实质的量非常有限。大脑实质直接注射、侧脑室给药、鞘内注射给药量容易控制，作用部位直接，但创伤性给药风险大，应用困难。BDNF成熟片段分子量约14KD，很难穿透血脑屏障，将BDNF与转铁蛋白结合，利用CNS血管壁富含的转铁蛋白受体，通过静脉注射可以使BDNF越过血脑屏障进入CNS，这种方法复杂，进入血脑屏障的药物浓度低，难以达到治疗有效浓度，且生产成本巨大，工业化困难，离应用尚远。

因此，还需要开发新的技术来克服上述现有技术中的缺陷。

发明内容：

在一方面，本发明提供一种转导肽-人脑源性神经营养因子融合蛋白，其中的转导肽能引导人脑源性神经营养因子通过血脑屏障，从而克服了现有技术中神经营养因子无法到达脑部的缺陷。

满足这一要求的转导肽可以是HIV-1反式激活蛋白(trans-activator transcription，TAT)中的蛋白转导区(proteintransduction domain，PTD)、果蝇触角蛋白同源结构域(ANTP)和单纯疱疹病毒(HSV)VP22蛋白的蛋白转导序列。特别是具有序列：YGRKKRRQRRR(SEQ ID N0：1)或其功能性片段的PTD。在本领域中，确定SEQ ID NO：1的某一片段是否仍具有转导肽的功能只需常规的技术。

本发明融合蛋白中的人脑源性神经营养因子优选具有序列：MHSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR(SEQ ID NO：2)或其功能性片段。

更优选的，本发明的融合蛋白具有下述序列：YGRKKRRQRRRGGGTMHSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR(SEQ ID NO：3)。

另一方面，本发明提供了编码所述融合蛋白的核酸序列。在上述公开的氨基酸序列基础上，本领域普通技术人员能很容易地确定编码本发明融合蛋白的核酸序列。此外，本发明也提供了含有上述核酸序列的表达载体。

本发明还涉及所述融合蛋白的可溶性表达方法，包括：将编码所述融合蛋白和谷胱甘肽S-转移酶的表达质粒如pGEX质粒转化宿主菌BL21(DE3)pLysS(基因型：F-，ompT，hsdSB(r B-mB-)，dcm，gal(DE3)，pLysS)，培养在5℃～25℃之间的低温，取出活化菌液，以5％～20％的比例在新鲜培养基中培养至OD550值为0.5～2.0，加入浓度为0.1～1mM的诱导剂IPTG，诱导时间为3～24h，收集诱导表达的菌体，PBS洗净，用pH7.5～8.5的10mmol/L Tris缓冲液重悬菌体，加入溶菌酶，振荡混匀，置冰上30min，超声10～15min破菌，然后回收目的融合蛋白。

还在另一方面，本发明提供了所述融合蛋白用于制备治疗神经退行性疾病(包括阿尔茨海默病、帕金森病、黑质退行性病变、多系统萎缩症和亨延顿(Huntington)舞蹈症、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、脊髓性肌萎缩(SMA)和灰质炎后综合症等)的药物中的用途，用于制备治疗脑损伤、镇痛、听神经视神经损伤的药物中的用途，以及用于制备治疗糖尿病的药物中的用途。本发明特别涉及含有所述融合蛋白的药物组合物，其呈选自可穿越皮肤、粘膜、角膜、浆膜、肌膜、血管及淋巴膜、脉络膜、神经膜、血脑屏障等一切细胞膜及生物膜的剂型，为选自适于注射、舌下含服、肺吸入、鼻腔粘膜及肛栓或皮肤吸收方式施用的剂型及滴眼液剂型。

附图说明：

图1：实施例1中从人基因组DNA中PCR扩增hBDNF基因，对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，获得电泳图谱。

图2：对实施例1中的菌落B1-B9提取质粒，进行PCR鉴定。显示鉴定结果。

图3：对实施例1中菌落B2所提取质粒中的hBDNF基因进行测序，发现其序列与Genebank中的序列完全一致。

图4：PCR扩增后，电泳鉴定pGEX-PTD-rhBDNF中的PTD-rhBDNF融合基因为400bp左右。

图5：pGEX-PTD-rhBDNF重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，进行原核可溶性表达，然后用SDS-PAGE对PTD-rhBDNF的表达进行分析。1表示不含PTD-rhBDNF融合基因的空载体：无目的蛋白；2表示培养物离心后的菌体沉淀：无目的蛋白；3表示可溶表达后的全菌(即包括培养液和菌体)：含目的蛋白GST-PTD-rhBDNF；4表示培养物离心后的上清：含目的蛋白GST-PTD-rhBDNF；5表示纯化的GST-PTD-rhBDNF；6表示凝血酶切后纯化的PTD-rhBDNF；7表示蛋白Marker，分子量分别为：14.4KDa、28.5KDa、45.0KDa、66.2KDa、94.0KDa。

图6：用抗PTD-rhBDNF的抗体对原核可溶性表达的目的蛋白进行Western印迹分析。1～6分别表示诱导时间为4、6、12、16、20、24小时的PTD-rhBDNF。

图7：无PTD-rhBDNF时，培养12天的大鼠海马神经元(20×)。照片显示神经元细胞胞体逐渐萎缩、退化，突起淡化、解离。

图8：无PTD-rhBDNF时，培养18天的大鼠海马神经元(20×)。照片显示神经元细胞解离，死亡。

图9：加入PTD-rhBDNF时，培养12天的大鼠海马神经元(20×)。照片显示神经元生长良好，胞体较大，其突起形成稠密的神经网络。

图10：加入PTD-rhBDNF时，培养18天的大鼠海马神经元(20×)。照片显示：神经元胞浆更丰富，细胞轮廓界线不清，折光性变差，胞浆内颗粒物增多，突起形成网络状。

图11：对无PTD-rhBDNF时的对照组用抗PTD-rhBDNF的抗体进行免疫组织化学染色。照片显示细胞无着色(20×)。

图12：对有PTD-rhBDNF时的实验组用抗PTD-rhBDNF的抗体进行免疫组织化学染色。照片显示细胞着棕色(20×)。

图13：实施例4的实验组，显示海马部位PTD-rhBDNF阳性(40×)。

图14：实施例4的对照组，显示海马部位PTD-rhBDNF阴性(40×)。

图15：实施例4的实验组，显示髓质部PTD-rhBDNF阳性(40×)。

图16：实施例4的对照组，显示髓质部PTD-rhBDNF阴性(20×)。

实施例

本发明将通过下列实施例得到更清楚的说明。这些实施例只是说明性的，不应当理解成限制本发明的范围。

实施例1：hBDNF基因克隆

抽取健康成人静脉血5mL，抗凝，离心分离白细胞，提取基因组DNA。以此基因组DNA为模板，设计一对引物：上游引物：5’-CGGAATTCATGACCATCCTTTTCCTTAC-3’(SEQ ID NO：4)，下游引物：5’-CGGGATCCACTATCTTCCCCTTTTAATG-3’(SEQ ID NO：5)。PCR扩增全长约740bp左右的目的基因。

PCR反应体系：

Taq酶         1μl

模板DNA       4μl

dNTP          4μl

缓冲液        5μl

上游引物      1μl

下游引物      1μl

无菌水        34μl

上述PCR反应体系充分混匀后短暂离心，加入30μL石蜡油封顶，PCR循环参数为：94℃预变性5min，然后按94℃ 40s，58℃ 40s，72℃ 3min进行30个循环，最后72℃延伸10min，扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(见图1)，结果显示扩增产物约为700bp左右，与hBDNF基因的理论值相符。接着回收扩增产物。

用T4 DNA连接酶连接质粒pGEM-T和上面PCT反应的回收产物反应体系如下：

回收产物        4μl

pGEM-T          1μl

T4连接酶        1μl

连接酶缓冲液    1μl

H₂O             3μl

总的反应体系为10μl，于4℃过夜。

用连接产物转化DH5α。挑取单个菌落(B1-B9)，提取质粒，进行PCR鉴定(见图2)。对B2菌落中质粒的hBDNF基因进行测序(见图3)，结果表明其与Genebank中的序列完全一致。表明通过上述方法，获得了人的BDNF基因序列。

实施例2：人源BDNF融合蛋白的克隆与表达

以实施例1中连接反应得到的pGEM-T-hBDNF质粒为模板，设计一对引物：上游引物：5’-CGGAATTCATGCACTCTGACCCTGCCCGC-3’(SEQ IDNO：6)，下游引物：5’-CGGGATCCACTATCTTCCCCTTTTAATG-3’(SEQID NO：7)，PCR扩增出BDNF成熟肽的编码序列，测序表明其编码MHSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR(SEQ ID NO：2)。凝胶电泳回收PCR产物后双酶切，同时双酶切pGEX载体，回收产物进行酶连，得到pGEX-hmBDNF重组质粒，与编码PTD(SEQID NO：1)的核苷酸序列酶连，转化，构建pGEX-PTD-rhBDNF质粒。PCR扩增，电泳鉴定获得的pGEX-PTD-rhBDNF质粒(图4)。对该质粒进行序列测定，发现其中的PTD-rhBDNF融合基因具有下列序列：TATGGTCGTAAAAAGCGACGCCAACGTAGACGTGGTGGTGGTACCATGCACTCTGACCCTGCCCGCCGAGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGTGAGTGGGTAACGGCGGCAGACAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCGGGCGGGACGGTCACAGTCCTTGAAAAGGTCCCTGTATCAAAAGGCCAACTGAAGCAATACTTCTACGAGACCAAGTGCAATCCCATGGGTTACACAAAAGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCATTGGAACTCCCAGTGCCGAACTACCCAGTCGTACGTGCGGGCCCTTACCATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCTTGTGTATGTACATTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG(SEQID NO：8)，其编码的PTD-rhBDNF融合蛋白具有SEQ ID NO：3的序列。

经鉴定构建正确的pGEX-PTD-rhBDNF重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态的细胞，挑取转化的阳性菌落置3ml LB培养液中(含Amp 100μg/ml)，37℃摇床培养过夜，取活化菌液以10％比例接种于10ml LB(Amp 100)培养液中，培养至OD550为0.6时，加入1mM IPTG诱导表达。

收集诱导表达6h的菌体，PBS洗净。用pH8.0的10mmol/L Tris缓冲液重悬菌体。加入溶菌酶，振荡混匀，置冰上30min，超声破菌。

经诱导表达获得的融合蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表明：沉淀中无目的蛋白，全菌及上清中含有目的蛋白，上清中蛋白经纯化后获得的目的蛋白分子量与理论值相符。纯化后约得到融合蛋白8mg/L菌液。经Western印迹(使用抗PTD-rhBDNF的抗体)分析为PTD-rhBDNF(图5、图6)。

实施例3：纯化的人源PTD-rhBDNF对培养的海马神经元生长的促进作用

取新生12h内Wistar大鼠，75％酒精浸泡消毒后断头、分离出全脑并将其放入盛有解剖液的平皿中。

将平皿置于解剖显微镜下分离出海马，放入盛有解剖液的培养皿中。用剪刀将海马分成小块后放入0.25％的胰蛋白酶中，9.5％CO2、36.5℃孵育箱中消化30min。

消化好的海马置离心管中，去除含胰蛋白酶的液体并用含马血清的DMEM培养液洗2-3遍以终止酶的消化作用。加2-3mL培养液，用口径递减的吸管吹打数次。吸出的上清再加培养液使终体积成为10mL，200目金属网过滤。将上述过滤的液体混匀后加入涂有多聚赖氨酸的培养板中。

培养24h后加阿糖胞苷以抑制胶质细胞的分裂生长。实验组在培养3d后加入实施例2中获得的PTD-rhBDNF融合蛋白，浓度分别为10、20、40、80、160、320ng/mL，对照组以等量DMEM培养液替代。

实验证明纯化的PTD-rhBDNF对组织培养12-18天的大鼠海马神经元有显著的促进生长的作用(图9、10)，而无PTD-rhBDNF存在时，神经元大部分死亡(图7、8)。用抗PTD-rhBDNF的抗体进行免疫组织化学染色，实验组细胞着色明显比对照组多，显示PTD-rhBDNF进入海马神经元细胞(图11、12)。

实施例4：人源PTD-rhBDNF穿越血脑屏障入脑实验

将实施例2中获得的PTD-rhBDNF融合蛋白静脉注入小鼠后2小时，处死小鼠，取脑组织进行冰冻切片，以抗BDNF的抗体为一抗做免疫组织化学检测，对照组以生理盐水代替抗BDNF的抗体。大脑皮层及海马切片显示有BDNF棕色斑点分布(图13～16)，结果表明PTD-rhBDNF进入脑内。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所

<120>转导肽-人脑源性神经营养因子融合蛋白及其应用

<160>8

<210>1

<211>11

<212>氨基酸序列

<213>PTD

<400>1

YGRKKRRQRR R

<210>2

<211>120

<212>氨基酸序列

<213>人脑源性神经营养因子

<400>2

MHSDPARRGE LSVCDSISEW

VTAADKKTAV DMSGGTVTVL

EKVPVSKGQL KQYFYETKCN

PMGYTKEGCR GIDKRHWNSQ

CRTTQSYVRA LTMDSKKRIG

WRFIRIDTSC VCTLTIKRGR

<210>3

<211>135

<212>氨基酸序列

<213>转导肽-人脑源性神经营养因子融合蛋白

<400>3

YGRKKRRQRR RGGGTMHSDP

ARRGELSVCD SISEWVTAAD

KKTAVDMSGG TVTVLEKVPV

SKGQLKQYFY ETKCNPMGYT

KEGCRGIDKR HWNSQCRTTQ

SYVRALTMDS KKRIGWRFIR

IDTSCVCTLT IKRGR

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>引物

<400>4

CGGAATTCAT GACCATCCTT

TTCCTTAC

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>引物

<400>5

CGGGATCCAC TATCTTCCCC

TTTTAATG

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>引物

<400>6

CGGAATTCAT GCACTCTGAC

CCTGCCCGC

<210>7

<211>28

<212>DNA

<213>引物

<400>7

CGGGATCCAC TATCTTCCCC

TTTTAATG

<210>8

<211>408

<212>DNA

<213>PTD-rhBDNF融合基因

<400>8

TATGGTCGTA AAAAGCGACG

CCAACGTAGA CGTGGTGGTG

GTACCATGCA CTCTGACCCT

GCCCGCCGAG GGGAGCTGAG

CGTGTGTGAC AGTATTAGTG

AGTGGGTAAC GGCGGCAGAC

AAAAAGACTG CAGTGGACAT

GTCGGGCGGG ACGGTCACAG

TCCTTGAAAA GGTCCCTGTA

TCAAAAGGCC AACTGAAGCA

ATACTTCTAC GAGACCAAGT

GCAATCCCAT GGGTTACACA

AAAGAAGGCT GCAGGGGCAT

AGACAAAAGG CATTGGAACT

CCCAGTGCCG AACTACCCAG

TCGTACGTGC GGGCCCTTAC

CATGGATAGC AAAAAGAGAA

TTGGCTGGCG ATTCATAAGG

ATAGACACTT CTTGTGTATG

TACATTGACC ATTAAAAGGG

GAAGATAG

Claims (11)

1.一种转导肽-人脑源性神经营养因子融合蛋白，其中所述转导肽选自HIV-1反式激活蛋白中的蛋白转导区、果蝇触角蛋白同源结构域和单纯疱疹病毒VP22蛋白的蛋白转导序列，并且其中所述人脑源性神经营养因子具有人脑源性神经营养因子的氨基酸序列或其功能性片段。

2.权利要求1的融合蛋白，其中所述转导肽序列由氨基酸序列YGRKKRRQRRR或其功能性片段组成。

3.权利要求1的融合蛋白，其中所述人脑源性神经营养因子由MHSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR氨基酸序列或其功能性片段组成。

4.权利要求1的融合蛋白，其由YGRKKRRQRRRGGGTMHSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR氨基酸序列组成。

5.一种编码权利要求1-4中任一项的融合蛋白的核酸分子。

6.含有权利要求5所述核酸分子的表达载体。

7.权利要求1所述融合蛋白的原核可溶性表达方法，包括：将编码所述融合蛋白和谷胱甘肽S-转移酶的表达质粒如pGEX质粒转化宿主菌BL21(DE3)pLysS(基因型：F-，ompT，hsdSB(r B-mB-)，dcm，gal(DE3)，pLysS)，培养在5℃～25℃之间的低温，取出活化菌液，以5％～20％的比例在新鲜培养基中培养至OD550值为0.5～2.0，加入浓度为0.1～1mM的诱导剂IPTG，诱导时间为3～24h，收集诱导表达的菌体，PBS洗净，用pH7.5～8.5的10mmol/L Tris缓冲液重悬菌体，加入溶菌酶，振荡混匀，置冰上30min，超声10～15min破菌，然后回收目的融合蛋白。

8.权利要求1-4中任一项的融合蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于治疗神经退行性疾病或用于治疗脑损伤、镇痛、听神经视神经损伤或用于治疗糖尿病。

9.权利要求8的用途，其中所述神经退行性疾病为阿尔茨海默病、帕金森病、黑质退行性病变、多系统萎缩症和亨延顿舞蹈症、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓性肌萎缩和灰质炎后综合症。

10.一种药物组合物，其含有权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白以及药学可接受的载体或赋形剂。

11.权利要求10的药物组合物，其呈选自可穿越皮肤、粘膜、角膜、浆膜、肌膜、血管及淋巴膜、脉络膜、神经膜、血脑屏障等一切细胞膜及生物膜的剂型，或者为选自适于注射、舌下含服、肺吸入、鼻腔粘膜及肛栓或皮肤吸收方式施用的剂型或滴眼液剂型。

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