CN111073906A - 光遗传与脑啡肽酶基因的结合方法 - Google Patents

光遗传与脑啡肽酶基因的结合方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开光遗传与脑啡肽酶基因的结合方法，主要步骤：1)以哺乳动物表达质粒VR1012为基因载体，分别将脑啡肽酶基因及光激活神经元通道蛋白ChR2基因通过PCR、酶切、连接和挑取单克隆的方法重组到真核表达质粒上，并在ChR2前加上hSyn的神经特异性启动子，得到可在体内外同时表达脑啡肽酶及光激活神经元通道蛋白ChR2的重组质粒；2)脑啡肽酶后连接EGFP绿色标签，在ChR2后连接mCherry红色标签；3)将得到的重组质粒DNA进行基因测序，在核酸分子水平上验证脑啡肽酶和ChR2的基因是否正确的插入到VR1012的真核表达质粒中。NEP是脑内最主要的降解Aβ蛋白的酶，利用NEP可以降低危险性。

Description

光遗传与脑啡肽酶基因的结合方法
技术领域
本发明属于生物医学材料领域，主要设计了一种针对基因降解Aβ蛋白的脑啡肽酶(neprilysin，NEP)及一种在蓝光照射下可以使阳离子通道打开促进细胞兴奋的光敏蛋白，使光遗传技术与基因技术结合起来。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)亦称老年性痴呆症，是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，主要临床表现为进行性记忆力减退、认知功能障碍以及人格和行为改变等症状，具体病因迄今未明。由于AD与增龄有密切关系，随着人均寿命的普遍延长和人口老龄化程度的加剧，AD的发病率也随之增加，给人民的健康造成了极大的危害，也进一步增加了医疗成本并加重了社会负担。
针对AD的治疗也开发出了诸如促智类药、抗焦虑类药、抗抑郁类药、抗精神病类药等各种新型药物，很多药物也已经进入了临床应用。在治疗过程中，针对治疗AD的药物多以控制伴发的精神病理症状为主，而不同患者是否存在AD以及AD的分级和分期均具有显著差异，需采取个性化治疗方案。然而，目前针对AD的常规治疗药物本身毒副作用大，且无法实现对治疗药物进行精准靶向投递，对于病情差异巨大的患者直接使用可能无治疗效果甚至适得其反，这些缺陷最终导致治疗环节成本高、毒副作用大、治疗效果不理想。由于AD的病因复杂，目前临床上除了药物控制病情外，并无更好的治疗方法，而单一药物的治疗效果又欠佳。所以药物治疗后，往往需要家人和医务人员对病人给予更加细致、科学的护理并帮助患者持久地矫正行为和恢复记忆，以提高治疗效果，这严重延长了AD愈后的康复周期，也带来了沉重的社会负担。
鉴于脑啡肽酶(neprilysin，NEP)是脑内最主要的有降解β-淀粉样蛋白活性的肽酶，其数量改变或活性变化在AD病理发展的Aβ沉积中扮演重要角色。基因治疗具有特异性高、靶向性强毒副作用小、成本低、效率高、效果好等优势，本项目可采用构建脑啡肽酶基因的真核重组表达质粒的方法来特异性地降解β-淀粉样蛋白。鉴于光遗传操控技术具有较高的时间和空间分辨率以及细胞类型特异的优势，已被广泛应用于神经生物学中。在很多研究中，研究人员将光敏离子通道蛋白表达至海马神经元中，利用适当波长的可见光照射这些细胞，激发神经元产生动作电位，通过这种方法反复刺激，可恢复神经元的功能，并大幅改善AD患者的行为和记忆能力。但是，这些方法均需在脑内植入光纤，给机体带来了一定的创伤。本项目借助稀土上转换纳米晶(UCN)可将组织穿透性较好的近红外光转换为激活光遗传通道蛋白的可见光，用于活化神经元并有望实现Aβ被降解后的记忆康复的联合治疗。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种光遗传与脑啡肽酶基因的结合方法。
本发明设计一种可特异性降解Aβ蛋白的脑啡肽酶，使其在脑内表达并对AD的缓解有较大的帮助。
本发明一种光遗传与脑啡肽酶基因的结合方法，具体方法如下：
1)以哺乳动物表达质粒VR1012为基因载体，分别将脑啡肽酶基因及光激活神经元通道蛋白ChR2基因通过PCR、酶切、连接和挑取单克隆的方法重组到真核表达质粒上，并在ChR2前加上hSyn的神经特异性启动子，得到可在体内外同时表达脑啡肽酶及光激活神经元通道蛋白ChR2的重组质粒。
2)将构建好的脑啡肽酶基因及光激活神经元通道蛋白ChR2基因重组质粒转染293T细胞。
纳米递送系统在细胞水平光控细胞膜去极化实验：诊疗一体纳米递送系统通过光控激活ChR2离子通道蛋白，进而改变细胞膜内外离子分布形成动作电位，实现活化神经细胞的目的。当诊疗一体纳米递送系统同海马神经元共培养48h后,首先利用膜片钳和共聚焦显微镜研究470nm蓝光和808nm近红外光及550nm绿光照射前后细胞的电位和形态变化情况。接着进一步研究不同光照频率、强度和光照时长对神经元活化性能的影响，为后续多模态诊疗一体纳米递送系统体内动物实验提供重要的参数依据。
本发明的优势在于：1)NEP是脑内最主要的降解Aβ蛋白的酶，利用NEP可以降低危险性；2)NEP属于一种蛋白质，避免了其他药物对神经有害的缺陷；3)可实现对Aβ蛋白的高效降解；4)NEP可使Aβ降解的更彻底。
具体实施方式
以下结合实施例来对本发明作进一步的说明。
实施例1：
本发明主要涉及到质粒的构建，具体方法如下：
1)脑啡肽酶基因和光控用离子通道蛋白基因ChR2的构建：以哺乳动物表达质粒VR1012为基因载体，分别将脑啡肽酶基因及光激活神经元通道蛋白ChR2基因通过PCR、酶切、连接和挑取单克隆的方法重组到真核表达质粒上，并在ChR2前加上hSyn的神经特异性启动子，得到可在体内外同时表达脑啡肽酶及光激活神经元通道蛋白ChR2的重组质粒；同时为了方便示踪脑啡肽酶和ChR2的表达和分布情况，在脑啡肽酶后连接EGFP绿色标签，在ChR2后连接mCherry红色标签。最后将得到的重组质粒DNA进行基因测序，在核酸分子水平上验证脑啡肽酶和ChR2的基因是否正确的插入到VR1012的真核表达质粒中。
2)脑啡肽酶基因和光控用离子通道蛋白基因ChR2功能的验证：首先将构建好的脑啡肽酶基因及光激活神经元通道蛋白ChR2基因重组质粒转染293T细胞48h后，通过荧光显微镜、蛋白质免疫印迹(Western blot)和免疫荧光来验证其是否能够成功表达，并通过流式细胞术对表达效果进行定量分析。当转染海马神经元48h后，给予不同频率的470nm的蓝光照射，通过膜片钳技术检测细胞膜电位变化及去极化效果，并通过细胞染色和流式细胞术等实验来验证该光控神经元活化系统是否构建成功。
实施例2：
本发明主要涉及到质粒的构建，具体方法如下：
1)脑啡肽酶基因和光控用离子通道蛋白基因ChR2的构建：以哺乳动物表达质粒VR1012为基因载体，分别将脑啡肽酶基因及光激活神经元通道蛋白ChR2基因通过PCR、酶切、连接和挑取单克隆的方法重组到真核表达质粒上，并在ChR2前加上hSyn的神经特异性启动子，得到可在体内外同时表达脑啡肽酶及光激活神经元通道蛋白ChR2的重组质粒；同时为了方便示踪脑啡肽酶和ChR2的表达和分布情况，在脑啡肽酶后连接EGFP绿色标签，在ChR2后连接mCherry红色标签。最后将得到的重组质粒DNA进行基因测序，在核酸分子水平上验证脑啡肽酶和ChR2的基因是否正确的插入到VR1012的真核表达质粒中。
2)脑啡肽酶基因和光控用离子通道蛋白基因ChR2功能的验证：首先将构建好的脑啡肽酶基因及光激活神经元通道蛋白ChR2基因重组质粒转染293T细胞48h后，通过荧光显微镜、蛋白质免疫印迹(Western blot)和免疫荧光来验证其是否能够成功表达，并通过流式细胞术对表达效果进行定量分析。当转染海马神经元48h后，给予不同频率的550nm的绿光照射，通过膜片钳技术检测细胞膜电位变化及去极化效果，并通过细胞染色和流式细胞术等实验来验证该光控神经元活化系统是否构建成功。
实施例3：
本发明主要涉及到质粒的构建，具体方法如下：
1)脑啡肽酶基因和光控用离子通道蛋白基因ChR2的构建：以哺乳动物表达质粒VR1012为基因载体，分别将脑啡肽酶基因及光激活神经元通道蛋白ChR2基因通过PCR、酶切、连接和挑取单克隆的方法重组到真核表达质粒上，并在ChR2前加上hSyn的神经特异性启动子，得到可在体内外同时表达脑啡肽酶及光激活神经元通道蛋白ChR2的重组质粒；同时为了方便示踪脑啡肽酶和ChR2的表达和分布情况，在脑啡肽酶后连接EGFP绿色标签，在ChR2后连接mCherry红色标签。最后将得到的重组质粒DNA进行基因测序，在核酸分子水平上验证脑啡肽酶和ChR2的基因是否正确的插入到VR1012的真核表达质粒中。
2)脑啡肽酶基因和光控用离子通道蛋白基因ChR2功能的验证：首先将构建好的脑啡肽酶基因及光激活神经元通道蛋白ChR2基因重组质粒转染293T细胞48h后，通过荧光显微镜、蛋白质免疫印迹(Western blot)和免疫荧光来验证其是否能够成功表达，并通过流式细胞术对表达效果进行定量分析。当转染海马神经元48h后，给予不同频率的808nm的红光照射，通过膜片钳技术检测细胞膜电位变化及去极化效果，并通过细胞染色和流式细胞术等实验来验证该光控神经元活化系统是否构建成功。

Claims (2)

1.光遗传与脑啡肽酶基因的结合方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)脑啡肽酶基因和光控用离子通道蛋白基因ChR2的构建：以哺乳动物表达质粒VR1012为基因载体，分别将脑啡肽酶基因及光激活神经元通道蛋白ChR2基因通过PCR、酶切、连接和挑取单克隆的方法重组到真核表达质粒上，并在ChR2前加上hSyn的神经特异性启动子，得到可在体内外同时表达脑啡肽酶及光激活神经元通道蛋白ChR2的重组质粒；
2)脑啡肽酶后连接EGFP绿色标签，在ChR2后连接mCherry红色标签；
3)将得到的重组质粒DNA进行基因测序，在核酸分子水平上验证脑啡肽酶和ChR2的基因是否正确的插入到VR1012的真核表达质粒中。
2.根据权利要求1所述的光遗传与脑啡肽酶基因的结合方法，其特征在于，脑啡肽酶基因和光控用离子通道蛋白基因ChR2功能的验证：
首先将构建好的脑啡肽酶基因及光激活神经元通道蛋白ChR2基因重组质粒转染293T细胞48h后，通过荧光显微镜、蛋白质免疫印迹和免疫荧光来验证其是否能够成功表达，并通过流式细胞术对表达效果进行定量分析；
当转染海马神经元48h后，给予不同频率的光照射，通过膜片钳技术检测细胞膜电位变化及去极化效果，并通过细胞染色和流式细胞术实验来验证该光控神经元活化系统是否构建成功。
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