CN1919870B

CN1919870B - 一种猫α干扰素及其编码基因与其应用

Info

Publication number: CN1919870B
Application number: CN2006101129636A
Authority: CN
Inventors: 刘文军; 杨利敏
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2006-09-13
Filing date: 2006-09-13
Publication date: 2010-11-24
Anticipated expiration: 2026-09-13
Also published as: CN1919870A

Abstract

本发明公开了一种猫α干扰素及其编码基因与其应用。该猫α干扰素，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：1；2)将序列表中SEQID №：1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有α干扰素相关功能的蛋白质。本发明猫α干扰素可作为活性成分，制备抗猫白血病病毒、猫爱滋病毒以及狗细小病毒的抗感染药物。本发明的设计合成的在大肠杆菌和毕赤酵母中均能高效表达猫α干扰素编码基因，在大肠杆菌和毕赤酵母中高效表达，表达量达菌体总蛋白的50％以上，周期短，成本低。

Description

一种猫α干扰素及其编码基因与其应用

技术领域

本发明涉及一种猫α干扰素及其编码基因与其应用。

背景技术

干扰素是细胞对病毒感染或各种合成及生物诱生作用反应，而产生并分泌的一类天然生成的蛋白分子，分子量为15,000-21,000道尔顿。已经确定的干扰素有两大类：I型和II型。I型干扰素包括IFN-α、IFN-β、IFN-ω和IFN-τ四个亚型，II型干扰素主要有IFN-γ。

1992年，日本东丽株式会社(Toray Industries，Inc.)的Nakamura等人首次分离到了猫干扰素基因(Molecular cloning of feline interferon cDNA by directexpression.Biosci Biotechnol Biochem.1992，56(2)：211-4)，并于1993年将其归类于ω型干扰素(Homogenous production of feline interferon in silkwormby replacing single amino acid code in signal peptide region in recombinantbaculovirus and characterization of the product.J.Vet.Med.Sci.1993，55(2)：251-8)。1994年，以其为基础的Intercat

重组干扰素药物在日本上市，并被用于治疗猫calicivirus感染和狗细小病毒感染。

发明内容

本发明的目的是提供一种猫α干扰素及其编码基因与其表达方法。

本发明所提供的猫α干扰素，名称为FeIFN-α，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有α干扰素功能的由(a)衍生的蛋白质。

其中，序列表中的序列1由171个氨基酸残基组成。

为了使(a)中的FeIFN-α分泌到细胞周质或培养基中或使其功能稳定，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端连接上信号肽序列，为了(a)中的FeIFN-α便于纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签

残基

序列

Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR	Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
FLAG	8	DYKDDDDK	Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
FLAG	8	DYKDDDDK	Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	11	EQKLISEEDL	Strep-tag II	8	WSHPQFEK

上述(b)中的FeIFN-α可人工合成，也可先合成其编码基因，再按照下述方法进行生物表达得到。上述(b)中的FeIFN-α的编码基因可通过将序列表中SEQID №：2的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端连上信号肽的编码序列，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述α干扰素编码基因(FeIFN-α)也属于本发明的保护范围。

所述猫α干扰素编码基因，是优化的猫α干扰素基因，具体可为如下1)、2)或3)的基因：：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：1蛋白质序列的多核苷酸；

3)在严格条件下与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

序列表中序列2是由516个脱氧核苷酸组成，自5′端第1-516位核苷酸序列为编码序列，编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列。

含有上述基因的重组表达载体、工程菌和转基因细胞系也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的表达猫α干扰素的方法，是将上述FeIFN-α通过表达载体导入宿主细胞，筛选得到表达猫α干扰素的工程细胞，培养工程细胞，表达得到猫α干扰素。

所述表达载体可为pBV220、pPICZαA、pET载体系列、pQE载体系列、pPIC9K或pPICZ；优选为pBV220或pPICZαA。

所述宿主细胞为任一可表达外源基因的原核或真核细胞；所述原核细胞可为大肠肝菌，如E.coli DH5α、E.coli TB1或E.coli BL21(DE3)等；所述真核细胞可为酵母细胞、哺乳动物细胞和植物细胞等，包括酵母菌SMD1168H、酵母菌GS115、酵母菌X-33、酵母菌KM71H、COS-7、CHO或BHK-21等。

当所述表达载体为pBV220，所述FeIFN-α插入pBV220的BamHI和EcoRI的酶切位点间，所述宿主为大肠杆菌DH5α。

当所述表达载体为pPICZαA，所述FeIFN-α插入pPICZαA的XhoI和XbaI的酶切位点间，所述宿主为酵母菌SMD1168H。

当所述宿主为大肠肝菌时，需42℃进行诱导表达，诱导时间优选为6小时。

当所述宿主为酵母菌时，需加入甲醇进行诱导表达，所加入甲醇的终浓度为0.1-1.0％，优选为0.5％；所述百分含量为质量百分含量。

本发明所提供的猫α干扰素，其氨基酸序列具备α干扰素应具有的保守半胱氨酸和脯氨酸氨基酸序列，具备α型干扰素的特征。该蛋白质对猫白血病病毒、FIV以及狗细小病毒具有抗感染作用。本发明的猫α干扰素编码基因在大肠杆菌和毕赤酵母中均能高效表达猫α干扰素编码基因，表达量达菌体总蛋白的50％以上，周期短，成本低。

本发明猫α干扰素可作为活性成分制备抗猫白血病病毒、猫爱滋病毒以及狗细小病毒的抗感染药物。以本发明的猫α干扰素作为活性成分制备的药物也属于本发明的保护范围。

需要的时候，在所述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体等。

本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

所述药物的用量一般为1-2.5mU/kg体重，连续给药或隔天给药，疗程为3-7天。

附图说明

图1为SDS-PAGE检测猫α型干扰素基因在大肠杆菌中的表达产物结果

图2为SDS-PAGE检测猫α型干扰素基因在酵母中的表达产物结果

图3为经纯化的大肠杆菌表达的重组猫α型干扰素的SDS-PAGE检测结果

图4为经纯化的酵母菌表达的重组猫α型干扰素的SDS-PAGE检测结果

图5为经纯化的重组猫α型干扰素的高效液相色谱检测结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

所有引物合成及测序工作均由北京三博远志生物公司完成。

下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、猫α干扰素基因的合成及其表达

一、猫α干扰素基因的合成

参照猫α干扰素基因序列(GENBANK号：AB094996)，重新优化序列，替换稀有密码子，调节AT含量，使其可在大肠杆菌和毕赤酵母中均可高效表达，交由北京三博远志生物公司采用重叠PCR的方法合成优化后目的序列，合成的序列具有序列表中序列2的核苷酸序列，将其命名为FeIFN-α，其编码序列表中序列1的氨基酸残基序列，与人的α型干扰素的氨基酸残基序列的同源性为50％。

二、猫α型干扰素基因的表达及其表达产物的纯化

1、猫α型干扰素基因在大肠杆菌中的表达及发酵生产

1)含猫α型干扰素基因的大肠杆菌表达载体FeIFN-α/pBV220的构建

将FeIFN-α基因通过PCR引入限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切位点(其中PCR的模板为步骤一合成的FeIFN-α基因，引物为：pBVfeIFNαfor：5’GCAGAATTCATGTGTG ATTTGCCTCAAACTC 3’(EcoRI)；pBVfeIFNαrev：5’GTGGATCCTTATTTCTCAGATCTTAATCT TTT 3’(BamHI))，亚克隆入pMD18-T载体(Takara)，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性单克隆进行基因测序，将测序表明含有FeIFN-α基因的载体命名为pMD18-FeIFN-αI。

将上述构建的pMD18-FeIFN-αI用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切后插入载体pBV220的BamHI和EcoRI酶切位点之间，转化大肠杆菌DH5α。经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组菌，将经鉴定表明含有FeIFN-α的正确的重组载体命名为FeIFN-α/pBV220，将FeIFN-α/pBV220转化大肠杆菌获得的含有FeIFN-α/pBV220的阳性克隆命名为DH5α-FeIFN-α/pBV220。扩增培养工程菌DH5α-FeIFN-α/pBV220，30℃，200转/分(旋转半径为13mm)振摇培养菌液OD₆₀₀至1，在42℃下诱导6小时。培养结束后，进行如下处理：10000g、离心10分钟收集菌体经TE缓冲液洗涤后，超声破菌，PBS洗涤包涵体，6M盐酸胍溶解包涵体，PBS复性得到表达产物，进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果如图1所示(泳道M为低分子量蛋白Marker，泳道1为表达产物)，在20kD左右处出现一条蛋白条带，与猫α型干扰素蛋白大小相符，表明重组猫α型干扰素基因(FeIFN-α)在大肠杆菌中正确表达。

2)重组猫α干扰素的发酵生产

挑取步骤1)获得阳性克隆单菌落DH5α-FeIFN-α/pBV220，将其接种于100毫升含有100毫克/毫升氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇瓶培养12小时，作为一级种子液；再以1％(体积比)接种量将一级种子液转接于含6升LB液体培养基的发酵罐中，在与步骤1)相同的条件下培养至OD₆₀₀值为1.0，快速升温至42℃，诱导6小时。

2、猫α型干扰素基因在酵母中的表达及发酵生产

1)含猫α型干扰素基因的酵母表达载体FeIFN-α/pPICZαA的构建

将FeIFN-α基因通过PCR引入限制性内切酶XhoI和XbaI酶切位点(其中PCR的模板为步骤一合成的FeIFN-α基因，引物为：pICfeIFNαfor：5’TCTCTCGAGAAAAGAT GTGATTTGCCTCAAACTC 3’(XhoI)；pICfeIFNαrev：5’GGATCCTTATTTCTCAGATCTTAATC TTTT 3’(XbaI)，亚克隆入pMD18-T载体(Takara)，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性单克隆进行基因测序，将测序表明含有FeIFN-α基因的载体命名为pMD18-FeIFN-αII。

分别将pMD18-FeIFN-αII用限制性内切酶XhoI和XbaI双酶切后插入载体pPICZαA(购自美国invitrogen公司)的XhoI和XbaI酶切位点之间，将得到的质粒电转化酵母菌株SMD1168H(invitrogen公司)，将转化子铺于含zeocin(Invitrogen公司)100μg/mL的YPDS(含1％酵母提取物，2％酵母培养用胰化蛋白胨，2％葡萄糖，1M山梨醇，2％琼脂)平板，30℃培养2-3天，直至长出单菌落，经PCR鉴定后获得阳性重组菌，将经鉴定表明含有FeIFN-α的正确的重组载体命名为FeIFN-α/pPICZαA。将FeIFN-α/pPICZαA转化酵母菌株SMD1168H获得的含有FeIFN-α/pPICZαA的阳性转化子命名为SMD-FeIFN-α/pPICZαA。将SMD-FeIFN-α/pPICZαA先接种于BMGY(含1％酵母提取物，2％酵母培养用胰化蛋白胨，100mM磷酸钾(pH6.0)，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，1％甘油)培养基中，30℃培养18h-20h，待OD₆₀₀值为2-6时，1500g离心5min收集菌体，再换成BMMY培养基(含1％酵母提取物，2％酵母培养用胰化蛋白胨，100mM磷酸钾(pH 6.0)，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，0.5％甲醇)，在相同条件下继续培养使其OD₆₀₀达到1，然后每24小时加入终浓度为0.5％的甲醇诱导表达，每24小时收集一次样品，30℃诱导48小时。培养结束后，对发酵产物10000g、离心10分钟，取上清进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果如图2所示(泳道M为低分子量蛋白Marker，泳道1为表达产物)，在24kD左右处出现一条蛋白条带，与预期结果相符，表明猫α型干扰素基因在酵母菌中正确表达。

2)重组猫α干扰素的发酵生产

发酵罐为B.Braun公司的Biostat B.，容量为5升。具体的发酵过程为，挑取步骤1)获得的阳性克隆SMD-FeIFN-α/pPICZαA单菌落，将其接种于20mL含0.1μg/mL zeocin的YPD培养基(含1％酵母提取物，2％酵母培养用胰化蛋白胨，2％葡萄糖)中，30℃、250rpm(旋转半径为13mm)培养30小时，再接入200mL无zeocin的YPD培养基中，30℃、250rpm(旋转半径为13mm)培养24h。培养结束后，离心收集菌体，将菌体接种到2升BMGY培养基(含1％酵母提取物，2％酵母培养用胰化蛋白胨，100mM磷酸钾(pH 6.0)，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，1％甘油)中，在30℃、溶氧30％以上、pH为5.5下，培养15h后，补加50％甘油，流速20mL甘油/L菌液/小时，当细胞湿重达240g/L时停补甘油，当溶氧大幅上升，pH值上升，培养基中甘油耗尽，开始滴加24％甲醇诱导表达，流速3.6mL甲醇/L菌液/hr，在8小时内，将甲醇浓度增加到70％，共诱导表达5天，使猫α干扰素基因获得表达。

3、重组猫α干扰素的纯化

取5L步骤1得到的DH5α-FeIFN-α/pBV220发酵液，10000g、离心10min收集菌体，经TE缓冲液洗涤后，超声破菌，PBS洗涤包涵体，6M盐酸胍溶解包涵体，PBS复性。透析去除盐酸胍后，离心取上清。将步骤2得到的1.5L SMD-FeIFN-α/pPICZαA发酵液，10000g、离心10min沉淀菌体，取上清。将获得的两种蛋白上清溶液分别用醋酸调节pH值为4.8，过阳离子交换层析柱(HiTrap SP FF，AmershamBiosciences)，收集目标洗脱峰，再过阴离子交换层析柱(HiTrap Q FF，AmershamBiosciences)，收集目标洗脱峰，过Sephacry1分子筛层析柱(AmershamBiosciences)，收集目标洗脱峰，过滤除菌后分别得到100ml纯化的DH5α-FeIFN-α/pBV220表达的重组猫α干扰素和50ml纯化的SMD-FeIFN-α/pPICZαA表达的重组猫α干扰素。以Lowry法测定蛋白含量。

采用细胞病变抑制法对表达并纯化的猫α干扰素进行活性测定，采用猫胚成纤维细胞和水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)(ATCC公司)测定，具体方法为：取怀孕15天的猫胚，去头、四肢及内脏，无菌状态下用PBS洗三遍后，剪碎。吹打成单个细胞后上96孔板，培养至全部贴壁生长后，去除培养液，分三组，一组将日本产intercat猫干扰素(日本东丽株式会社，货号CL01)稀释成10⁷U/ml，每孔加入0.1ml 4倍(4⁰、4¹、4²、4³直到4¹¹)倍比稀释，一组每孔加入0.1ml 4倍(4⁰、4¹、4²、4³直到4¹¹)倍比稀释的步骤1获得的DH5α-FeIFN-α/pBV220表达并经纯化的重组猫α干扰素，另一组每孔加入4倍倍比(4⁰、4¹、4²、4³直到4¹¹)稀释的步骤2获得的SMD-FeIFN-α/pPICZαA表达并经纯化的重组猫α干扰素0.1ml，用100 TCID₅₀剂量的水疱性口炎病毒(VSV)进行攻毒，对照孔加无病毒的培养液，同时设立阴性对照(只加经倍比稀释的重组猫α干扰素，不加病毒)、阳性对照(不加干扰素，只加病毒)、空白对照(不加干扰素，不加病毒)，在倒置显微镜下观察日本产intercat猫干扰素1U/ml的孔出现50％病变的时候判断结果。染色后在波长570nm处测定吸光度，采用四参数回归计算法进行处理，并按下式计算干扰素生物学活性。

供试品生物学活性＝Pr×[(Ds×Es)÷(Dr×Er)]

式中Pr为日本产intercat猫干扰素生物学活性；

Ds为供试品预稀释倍数；

Dr为日本产intercat猫干扰素预稀释倍数；

Es为供试品相当于日本产intercat猫干扰素半效量的稀释倍数；

Er日本产intercat猫干扰素半效稀释倍数。

结果表明步骤1得到的DH5α-FeIFN-α/pBV220发酵的重组猫α干扰素活性为5.9×10⁷U/ml发酵液，经微量蛋白测量仪测得，其表达量为120μg/ml发酵液，6000μg/ml纯化液，比活为9.8×10⁶U/mg；步骤2得到的SMD-FeIFN-α/pPICZαA发酵的重组猫α干扰素活性为2.9×10⁷U/ml发酵液，经微量蛋白测量仪测得，其表达量为80μg/ml发酵液，比活为1.2×10⁷U/mg。

对纯化的蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，结果表明，纯化的样品电泳在20kD(大肠杆菌表达)和24kD(毕赤酵母表达)附近处均出现一条蛋白条带，与预期结果相符，表明获得了纯度较高的猫α型干扰素，部分检测结果如图3和图4所示(泳道M为低分子量蛋白Marker，泳道1为纯化产物)。

对纯化的两种重组猫α干扰素进行液相色谱分析，结果如图5所示，目的蛋白峰达98％以上(图5中横坐标表示保留时间(分钟)，纵坐标表示蛋白紫外吸收峰)。

实施例2、安全性实验

1、取200只9个月到两岁龄的猫(雌雄各半)，每只按10⁷U/kg体重的剂量静脉注射实施例1获得的酵母菌表达并经纯化的重组猫α干扰素，结果43只猫出现轻微嗜睡，5-6小时后症状消失。18只猫体温略有升高，但在正常范围之内。体液中电解质指标未见异常。

2、取200只一岁到7岁龄的比格犬(雌雄各半)，每只按10⁷U/kg体重的剂量静脉注射实施例1获得的大肠杆菌表达并经纯化的重组猫α干扰素，结果7只犬出现轻微嗜睡，5-6小时后症状消失。体液中电解质指标未见异常。

实施例3、重组猫α干扰素的临床试用效果

取经临床鉴定为患有急性腹膜炎的猫30只，分为给药组和对照组，每组15只。给药组每天按2.5×10⁶U/kg体重剂量静脉注射实施例1获得的酵母菌表达的重组猫α干扰素，对照组只注射等量安慰剂(生理盐水)，连续注射三天，每天一次。每天观察试验动物，对临床症状进行评分，具体评分规则如表2所示，结果表明给药组和对照组临床症状评分统计学上存在明显差异(表3)，注射重组猫α干扰素的患有急性腹膜炎的猫，病情明显好转，具体表现为炎症减轻或消失，发热症状消失，表明实施例1获得的酵母菌表达的重组猫α干扰素可以有效地治疗猫腹膜炎病毒感染；而注射安慰剂的对照组症状无改善。

临床症状观察项目——有无食欲、是否呕吐、腹泻状况、精神状态、脱水情况、粪便性状、肛温、体重等。

临床症状评分标准——按照下表给患病犬只进行打分，分数越高，体况越差，满分20分时，代表患犬死亡。

评分时间和频率——对试验动物从第一天开始每天评分一次。

表2.临床症状进行评分标准

症状	分数
症状	分数	死亡	20
肛温≥39.5℃37.1-39.4℃≤37℃	123	死亡	20
肛温≥39.5℃37.1-39.4℃≤37℃	123	精神状况疲惫(有意识，有活力的)萎靡(有意识，但无活力的)昏迷(无意识的)	134
脱水5％(轻微——皮肤开始出现褶皱)8％(中等——皮肤已存在褶皱)12％(严重——休克)	134	精神状况疲惫(有意识，有活力的)萎靡(有意识，但无活力的)昏迷(无意识的)	134
脱水5％(轻微——皮肤开始出现褶皱)8％(中等——皮肤已存在褶皱)12％(严重——休克)	134	粪便性状液态(腹泻)血便	24
腹痛轻微严重	12	粪便性状液态(腹泻)血便	24
腹痛轻微严重	12	呕吐	3

表3.临床症状评分统计结果

组别	给药组分数		对照组分数
组别	给药组分数		对照组分数		给药前	给药后	给药前	给药后
1	15	6	14	15	给药前	给药后	给药前	给药后

组别	给药组分数		对照组分数
组别	给药组分数		对照组分数		2	17	4	13	13
3	14	5	15	14	2	17	4	13	13

4	18	11	12	15
4	18	11	12	15	5	19	20	16	18
6	18	12	18	19	5	19	20	16	18
6	18	12	18	19	7	17	6	17	18
8	13	9	16	16	7	17	6	17	18
8	13	9	16	16	9	16	3	18	20
10	12	1	14	17	9	16	3	18	20
10	12	1	14	17	11	15	4	16	15
12	17	5	17	18	11	15	4	16	15
12	17	5	17	18	13	16	3	16	17
14	14	2	15	17	13	16	3	16	17
14	14	2	15	17	15	13	0	19	20

2、取经临床鉴定为患有肠炎型犬细小病毒病的犬30只，分为给药组和对照组，每组15只。将给药组每天静脉注射1.5×10⁶U/kg的实施例1获得的大肠杆菌表达的重组猫α干扰素，对照组只注射安慰剂(生理盐水)，连续注射三天。每天观察试验动物，对临床症状进行评分，具体评分规则如表2所示，结果表明给药组和对照组临床症状评分统计学上存在明显差异(表4)大肠杆菌表达的重组猫α干扰素可以有效地治疗犬细小病毒感染，发病犬病情明显好转，具体表现为白细胞数目上升至正常或接近正常，发热、呕吐、腹泻症状消失；而注射安慰剂的对照组症状无改善。

表4.临床症状评分统计结果

组别	给药组分数		对照组分数
组别	给药组分数		对照组分数			给药前	给药后	给药前	给药后
1	14	4	17	17		给药前	给药后	给药前	给药后
1	14	4	17	17	2	16	2	15	15
3	17	3	16	17	2	16	2	15	15
3	17	3	16	17	4	15	2	14	16
5	13	1	13	16	4	15	2	14	16
5	13	1	13	16	6	18	6	19	20
7	17	4	12	13	6	18	6	19	20
7	17	4	12	13	8	15	4	16	17

9	14	3	18	17
9	14	3	18	17	10	12	2	12	10
11	15	3	16	17	10	12	2	12	10
11	15	3	16	17	12	11	2	14	14
13	10	0	12	13	12	11	2	14	14
13	10	0	12	13	14	12	0	11	15
15	13	3	19	20	14	12	0	11	15

序列表

<160>2

<210>1

<211>171

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Gly Leu Leu Asn Arg Arg Ala Leu Thr

1 5 10 15

Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Pro Ala Ser Ser Cys Gln Lys Asp

20 25 30

Arg Asn Asp Phe Ala Phe Pro Gln Asp Val Phe Gly Gly Asp Gln Ser

35 40 45

His Lys Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Val Thr Asn Gln Lys Ile

50 55 60

Phe His Phe Phe Cys Thr Glu Ala Ser Ser Ser Ala Ala Trp Asn Thr

65 70 75 80

Thr Leu Leu Glu Glu Phe Cys Thr Gly Leu Asp Arg Gln Leu Thr Arg

85 90 95

Leu Glu Ala Cys Val Leu Gln Glu Val Glu Glu Gly Glu Ala Pro Leu

100 105 110

Thr Asn Glu Asp Ile His Pro Glu Asp Ser Ile Leu Arg Asn Tyr Phe

115 120 125

Gln Arg Leu Ser Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala

130 135 140

Trp Glu Ile Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Tyr Tyr Ser Ser

145 150 155 160

Thr Ala Leu Gln Lys Arg Leu Arg Ser Glu Lys

165 170

<210>2

<211>516

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

tgtgatttgc ctcaaactca tggtttgttg aatagaagag ccttgacttt gttgggtcaa 60

atgagaagat tgcctgcctc ttcctgtcaa aaggacagaa atgacttcgc cttcccacaa 120

gacgttttcg gtggtgacca atcccacaag gcccaagcct tgtctgttgt tcacgttact 180

aaccaaaaga tcttccactt cttctgtaca gaggcttcct cttctgctgc ttggaacacc 240

accttgttgg aggagttctg tactggtttg gatagacaat tgaccagatt ggaggcctgt 300

gtcctgcaag aggttgagga gggtgaggct ccattaacaa acgaggacat tcatcccgag 360

gactccatct taagaaacta cttccaaaga ttatccttat acttacaaga gaagaaatac 420

tctccttgtg cctgggagat cgtcagagca gagatcatga gatccttgta ttattcatca 480

acagccttgc aaaaaagatt aagatctgag aaataa 516

Claims

1.一种猫α干扰素基因，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID №：2所示的DNA序列。

2.含有权利要求1所述猫α干扰素基因的重组表达载体。

3.含有权利要求1所述猫α干扰素基因的工程菌。

4.含有权利要求1所述猫α干扰素基因的转基因细胞系。

5.一种表达猫α干扰素的方法，是将权利要求1所述的猫α干扰素基因通过表达载体导入宿主细胞，筛选得到表达猫α干扰素的工程细胞，培养工程细胞，表达得到猫α干扰素。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述宿主为大肠杆菌或酵母菌；当所述宿主为大肠杆菌时，所述表达载体为pBV220；当所述宿主为酵母菌时，所述表达载体为pPICZ αA。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述大肠杆菌为大肠杆菌DH5α；所述酵母菌为酵母菌SMD1168H；所述猫α干扰素基因插入到pBV220的BamHI和EcoRI的酶切位点间或插入pPICZαA的XhoI和XbaI的酶切位点间。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法中，所述宿主为大肠肝菌时，所述工程细胞42℃进行诱导表达，诱导时间为6小时；当所述宿主为酵母菌时，所述工程细胞用甲醇进行诱导表达，所述甲醇的终浓度为0.1-1.0％；所述百分含量为质量百分含量。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述甲醇的终浓度为0.5％；所述百分含量为质量百分含量。